JP3860601B2 - タム−ホースフォール・グリコプロテインもしくはウロモジュリンの精製法 - Google Patents

Description

本発明はヒト尿由来のタム−ホースフォール・グリコプロテイン（Ｔａｍｍ−ＨｏｒｓｆａｌｌＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（以後ＴＨＧと略称する）およびウロモジュリン（Ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）の精製法に関するものである。

ＴＨＧは当初、ウリナリ・ムコプロテイン（ｕｒｉｎａｒｙｍｕｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）として発見され（Ｍｏｒｎｅｒ ＫＡＨ，１８９５ Ｓｋａｎｄ．Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６：３３２）、ウィルスによる赤血球凝集反応を尿中で阻害する因子であると報告された（ＴａｍｍＩ ａｎｄ ＨｏｒｓｆａｌｌＦＬ．１９５０Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７４：１０８）。具体的な精製法としては、尿を集め、４℃で一晩保存した後上清を一部廃棄し、その残部に０．５８ＭになるようにＮａＣｌを加え攪拌する。その後遠心分離し沈澱を集め、水で溶かし再び遠心しその上清を集めて凍結乾燥したものがＴＨＧであるとされている。以後多くの研究者によってＴＨＧは部分的改良を施された様々な方法で精製されているが、基本的には上記の方法に沿って精製されている（ＭｏｏｎｅｎＰ ｅｔ ａｌ，１９８８ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２６：３１４、Ｔｏｍａ Ｇ ｅｔ ａｌ，１９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００：２７５）。

一方、妊婦尿からＴＨＧと同じアミノ酸配列を持つ糖タンパク質ウロモジュリン（Ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）が精製された（ＭｕｃｈｍｏｒｅＡＶ ａｎｄＤｅｃｋｅｒ ＪＭ，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：４７９）。ウロモジュリンは妊婦尿をレクチンカラム（Ｃｏｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｏｌｏｍｎ）にかけた後、α−メチルマンノースによって溶出した液を水に対し透析し凍結乾燥する。これをリン酸緩衝食塩水に再溶解しゲル濾過、等電点電気泳動によって再度分離し、限外濾過膜にて濃縮して精製される。当初、ウロモジュリンの糖鎖部位には多くの機能がありＩＬ−１，ＩＬ−２，腸瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインの特異的なリガンドとされてきた（ＨｅｓｓｉｏｎＣ ｅｔ ａｌ，１９８７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１４９７、ＳｈｅｒｂｌｏｍＡＰ ｅｔ ａｌ，１９８９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：９３９、ＢｒｏｗｎＫＭ ｅｔ ａｌ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９１１９、Ｗｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ａ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０：２０１）。しかし最近では単に尿から塩析法によって精製されたものをＴＨＧ、妊婦尿を原料として塩析法によって精製されたものをウロモジュリンと呼んでいる。

ＴＨＧには分子量の約３０％の糖が含まれており、ＧｌｕＮａ₂ Ｍａｎ（５−７）（ＧｌｕＮａ：Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎ：マンノース）で示されるマンノースを豊富に含む糖鎖構造を有している。そしてＭａｎ５，Ｍａｎ６の糖鎖残基がＩＬ−１やＩＬ−２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むサイトカインと特異的に結合していることが判明している。これらのことはＴＨＧが免疫調節機構に関与している可能性を示唆しているが、アミノ酸配列が同一であるウロモジュリンのほうが免疫抑制作用が１０倍以上高いとされている。また、最近羊由来のＴＨＧが羊ＩｇＧと結合し、ヒト由来ＴＨＧも同様にヒトＩｇＧと結合することが報告されている（ＲｈｏｄｅｓＤＣＪ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４４：１０１４）。したがって、ＴＨＧはサイトカインを介した免疫調節機構以外にも、細尿管内での新しい免疫制御または免疫防衛に重要な役割をしているものと考えられる。しかし、現在ＴＨＧとウロモジュリンの識別を正確に把握し、定量する方法は確立されていない。
Ｍｏｒｎｅｒ ＫＡＨ，１８９５ Ｓｋａｎｄ．Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６：３３２ ＴａｍｍＩ ａｎｄ ＨｏｒｓｆａｌｌＦＬ．１９５０Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７４：１０８ ＭｏｏｎｅｎＰ ｅｔ ａｌ，１９８８ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２６：３１４、Ｔｏｍａ Ｇ ｅｔ ａｌ，１９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００：２７５ ＭｕｃｈｍｏｒｅＡＶ ａｎｄＤｅｃｋｅｒ ＪＭ，１９８５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：４７９ ＨｅｓｓｉｏｎＣ ｅｔ ａｌ，１９８７ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１４９７、ＳｈｅｒｂｌｏｍＡＰ ｅｔ ａｌ，１９８９ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：９３９、ＢｒｏｗｎＫＭ ｅｔ ａｌ，１９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９１１９、Ｗｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ａ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０：２０１ ＲｈｏｄｅｓＤＣＪ ｅｔ ａｌ，１９９３ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４４：１０１４

ＴＨＧ及びウロモジュリンの精製を行うに当たり多くの研究者は上記の塩析法を用いている。しかしこの方法では目的タンパク質は勿論のこと、それ以外にも多くの不純物を巻き込んで沈澱させる恐れがあり、後の精製過程において不純物を除く過程を多く取り入れなければならない。この問題点を克服するためにはもっと穏やかな方法でタンパク沈澱を得る必要がある。また、ＴＨＧ及びウロモジュリンは金属イオン（Ｎａ⁺ 、Ｃａ²⁺など）がその溶液中に存在すると容易にゲル化するため、凍結乾燥したＴＨＧを生理的食塩水で溶解するのは容易ではない。このため、ＴＨＧの精製過程において、凍結乾燥の過程を取り入れずに初めから生理的条件下において精製することが望ましい。更に、ＴＨＧとウロモジュリンが正確に測定でき、その定量法が確立されれば、その生理的および臨床的意義がより有効に解明されるものと考えられる。

本発明者らは一般尿、妊婦尿に関わらず尿を一度凍結し解凍したときに多くの沈澱物が生じており、その沈澱に多量のＴＨＧが含まれていることを見いだし、塩析法を用いずに凍結融解の１過程において、多量のＴＨＧを沈澱させることに成功した。また、塩析法とは違って急激に沈澱を生じさせる方法ではないため不純物を巻き込みにくいという利点も持っていた。次に、多くの精製過程を簡素化した結果、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する）を用いてゲル濾過を行えば、効率よく不純物（主に色素）を取り除くことができ、また、集めたフラクションは凍結乾燥することなく、たとえば孔径約０．２μmのフィルターを通すことにより、４℃で保存できることを知った。ウロモジュリンは妊婦尿から凍結融解沈澱法以外にも安息香酸沈澱法で精製できる方法を確立した。更に、精製ＴＨＧはヒト免疫グロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）とＩｇＧのサブクラスの全て（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、およびＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片と結合する。しかしウロモジュリンはヒト免疫グロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ）およびＩｇＧのサブクラス（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ４）と結合するがＩｇＭ、ＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ３およびＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片とは結合しにくいことを見いだした。

本発明によれば、ＴＨＧおよびウロモジュリンを簡易な操作で高効率で精製することができ、特有の性質を示す精製物が得られる。

本発明はこれらの新知見を基礎としてさらに発展させたもので、人尿に安息香酸ナトリウムもしくはアンモニウムを溶解したのち溶液を安息香酸の析出する酸性にして生成する沈澱分画を採取することを特徴とするＴＨＧもしくはウロモジュリンの精製法、および特定の性質を有するＴＨＧもしくはウロモジュリンの精製物に関する。

安息香酸ナトリウムもしくはアンモニウムは尿に約２％（Ｗ／Ｖ）加えれば充分である。その溶液に、たとえば塩酸を加えてｐＨ３〜４の酸性にすれば安息香酸は析出し、所望の糖タンパクを吸着して沈澱する。この沈澱分画にエタノールを添加、攪拌することにより沈澱中の安息香酸は溶解し除去した沈澱分画が得られる。

上記で得られる沈澱分画を、たとえばリン酸緩衝食塩水に溶解してゲル濾過すれば色素などを含む不純物を除去してさらに精製することができる。

かくして得られる精製物が精製ＴＨＧの場合にはヒトの免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片、ＩｇＡ（モノマー）とＩｇＭおよびＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のすべてと結合する特性を有し、精製ウロモジュリンの場合は、ヒトの免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧとＩｇＡ（モノマー）およびＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２とＩｇＧ４と結合するが、ヒトの免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片、ＩｇＭ、およびＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ３とは結合しにくい特性を有する。

それで精製物を公知の手段によってそれぞれ固定化しておき、これにヒト免疫グロブリンのクラスＩｇＭまたはＩｇＧのサブクラスＩｇＧ３を作用させ、その作用量を酵素標識−プロテインＧで測定するか、または直接酵素標識したＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片を作用させ、その作用量を測定することによりＴＨＧとウロモジュリンを識別することができる。

エンドトキシンショックや敗血症等炎症に関係するサイトカインＩＬ−１やＴＮＦによって引き起こされていると考えられており、ヒト尿由来のＴＨＧまたはウロモジュリンはサイトカインＩＬ−１に阻害作用があるからこれらの病気にたいする治療薬として有効であり、また、ＴＨＧまたはウロモジュリンは免疫グロブリンと反応するから感染抵抗性増強作用も保持すると考えられる。更に、免疫グロブリンを用いたＴＨＧとウロモジュリン識別法が確立されたので、これら蛋白の生理的および臨床的意義を開明するために有用である。

以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

妊婦尿（妊娠２ケ月半〜６ケ月）に尿量の２％の安息香酸ナトリウムを添加し３０分攪拌し溶解させた。その後１６％塩酸にて溶液のｐＨを３．９に合わせ６０分攪拌しタンパク質の沈澱を安息香酸の微粒子沈澱に効率よく吸着させた。これを濾過し、沈澱を集め沈澱の２０倍量の安息香酸飽和冷水（０．３％（ｗ／ｖ））で洗浄した。これを圧搾濾過し沈澱を得た。沈澱の３倍量の冷エタノールを添加し２２％アンモニア水でｐＨを５．５に合わせた後３０分攪拌した。これを４℃で３時間放置し上清の２／３を廃棄した。残りの沈澱液をセライトプレコート〔ＧＥＭＬＩＴＥ ＳｕｐｅｒＭ（商標）白山工業（株）製〕中に添加し濾過した。沈澱物を回収し、−３０℃にて保存した。このｗｅｔｃａｋｅを溶解し、ＰＢＳに対し透析をし、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、ＨＰＬＣを用いて移動相をＰＢＳの条件でゲル濾過（ＴＳＫ３０００−ＳＷ：東ソー）を行った（図１）。ボイド・ボリューム（ｖｏｉｄｖｏｌｕｍｅ）に溶出されるフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ分子量と純度を確認した（図２）。ウロモジュリンが主に含まれるフラクションを集め、０．２２μmのフィルターに通して４℃で保存した。健常人尿を用いた場合ＴＨＧを上記の方法で精製出来た。

実施例１で得られた精製ＴＨＧまたはウロモジュリンを５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（以下、ＳＣＢ：シグマ社）（ｐＨ９．６）で希釈し、９６穴プレート（ヌンク社）の各穴に５０μｌずつ分注して４℃で一晩静置した。プレートをＳＣＢで洗った後、１％ＢＳＡ−ＳＣＢ溶液３００μｌを各穴に加え４℃で一晩静置した。これを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（以下、ＴＴＢＳ）（ｐＨ７．４）で洗い、１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳで３ｍｇ／ｍｌから２倍の段階希釈をしたヒトＩｇＧ（カッペル社）を５０μｌずつ加え４℃で一晩静置し反応させた。これをＴＴＢＳで洗った後、ペルオキシダーゼ標識ＥＩＡ ｇｒａｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ（バイオラッド社）を１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳで３０００倍に希釈したものを各穴に５０μｌずつ加え３７℃で２時間反応させた。これをＴＴＢＳで洗った後ＳＣＢですすぎ、ＴＭＢパーオキシダーゼＥＩＡサブメトレート・キット（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＥＩＡ ＳｕｂｓｔｒａｔｅＫｉｔ；バイオラッド社）にて発色させ、プレートリーダーによって４５０ｎｍの吸光度を計測した。図３ａ）に示したように、ＴＨＧとウロモジュリンはヒト免疫グロブリンＩｇＧに対して用量依存的に反応するという結果を得た。

実施例１で得られた精製ＴＨＧまたはウロモジュリンをＭＳＣＢで希釈し、９６穴プレートの各穴に５０μｌずつ分注して４℃で一晩静置した。プレートをＳＣＢで洗った後、１％ＢＳＡ−ＳＣＢ溶液３００μｌを各穴に加え４℃で一晩静した。これをＴＴＢＳで洗い、１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳで３ｍｇ／ｍｌから２倍の段階希釈をしたペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片（ロックランド社）を５０μｌずつ加え４℃で一晩静置し反応させた。これをＴＴＢＳで洗った後ＳＣＢですすぎ、ＴＭＢｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＥＩＡ ＳｕｂｓｔｒａｔｅＫｉｔにて反応させ、プレートリーダーによって４５０ｎｍの吸光度を計測した。図３ｂ）に示したように、ＴＨＧはヒト１ｇＧ Ｆ（ａｂ’）₂ 断片に対して用量依存的に反応するがウロモジュリンは反応しにくいという結果を得た。

人尿または妊婦尿を試料として５０ｍＭＳＣＢで希釈し、９６穴プレートの各穴に５０μｌずつ分注して４℃で一晩静置した。プレートをＳＣＢで洗った後、１％ＢＳＡ−ＳＣＢ溶液３００μｌを各穴に加え４℃で一晩静置した。これを２０ｍＭ ＴＴＢＳで洗い、１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳで３ｍｇ／ｍｌから２倍の段階希釈をしたヒトＩｇＧを５０μｌずつ加え４℃で一晩静置し反応させた。これをＴＴＢＳで洗った後、ペルオキシダーゼ標識ＥＩＡ ｇｒａｄｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳで３０００倍に希釈したものを各穴に５０μｌずつ加え３７℃で２時間反応させた。これをＴＴＢＳで洗った後ＳＣＢですすぎ、ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅＥＩＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔにて発色させ、プレートリーダーによって４５０ｎｍの吸光度を測定したところ実施例３と同様の結果を得た。

人尿または妊婦尿を試料として５０ｍＭＳＣＢで希釈し、９６穴プレートの各穴に５０μｌずつ分注して４℃で一晩静置した。プレートをＳＣＢで洗った後、１％ＢＳＡ−ＳＣＢ溶液３００μｌを各穴に加え４℃で一晩静置した。これを２０ｍＭ ＴＴＢＳで洗い、１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳで３ｍｇ／ｍｌから２倍の段階希釈をしたペルオキシダーゼ標識ヒト１ｇＧＦ（ａｂ’）₂ 断片５０μｌずつ加え４℃で一晩静置し反応させた。これをＴＴＢＳで洗った後ＳＣＢですすぎ、ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅＥＩＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔにて発色させ、プレートリーダーによって４５０ｎｍの吸光度を計測してところ実施例３と同様の結果を得た。

実施例１において、妊婦尿を安息香酸吸着沈殿法で精製した試料をゲル濾過したときの溶出パターンである。 実施例１で精製されたウロモジュリンの還元および非還元下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動写真である。 実施例２および３において、マイクロプレート上に固定化したＴＨＧおよびウロモジュリンにひと免疫グロブリンまたはＩｇＧのＦ（ａｂ’）_２断片との反応を示すグラフである。ａ，ｂ共に○はＴＨＧを示し、●はウロモジュリンを示す。本図によりＴＨＧとウロモジュリンはヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ）′_２断片との親和性により識別が可能であることが示されている。

Claims (6)

1. 人尿に安息香酸ナトリウムを溶解したのち溶液を安息香酸の析出する酸性にして生成する沈殿分画を採取することを特徴とするタム−ホースフォール・グリコプロテインもしくはウロモジュリンの精製法。
2. 沈澱分画をさらにゲル濾過により精製する請求項１記載の精製法。
3. 人尿が正常尿であり、タム−ホースフォール・グリコプロテインが精製される請求項１または２記載の精製法。
4. 人尿が妊婦尿であり、ウロモジュリンが精製される請求項１または２記載の精製法。
5. 精製物がヒトの免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片、ＩｇＡ（モノマー）とＩｇＭおよびＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のすべてと結合する特性を有するタム−ホースフォール・グリコプロテインである請求項１または２記載の精製法。
6. 精製物がヒトの免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧとＩｇＡ（モノマー）およびＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２とＩｇＧ４と結合するが、ヒトの免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂ 断片、ＩｇＭ、およびＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ３とは結合しにくい特性を有するウロモジュリンである請求項１または２記載の精製法。