JP3917021B2 - ７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドおよびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、式（Ｉ）
【０００２】
【化１】
【０００３】
で示される７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドおよびその製造方法に関する。本発明により提供される７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは、例えば、下式で示されるスクアラミン（ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ）などの医薬の合成中間体として有用である。
【０００４】
【化２】
【０００５】
スクアラミンは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌などに対する強力な抗菌活性を有するとともに、抗ガン活性を有することが報告され、新たな抗生物質として注目されている化合物である［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、３７８６頁（１９９８年）；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、８５９９頁（１９９８年）；ＷＯ ９８／２４８００など参照］。
【０００６】
【従来の技術】
従来、スクアラミンはサメの肝臓から抽出されていたが、その抽出効率が０．００１〜０．００２重量％と極めて低いため、化学的合成方法の検討が行われてきた。スクアラミンの化学的合成方法としては、１）３β−アセトキシ−５−コラン酸を出発原料とする方法［テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、３５巻、８１０３頁（１９９４年）参照］、２）３β−ヒドロキシ−５−コラン酸を出発原料とする方法［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６０巻、５１２１頁（１９９５年）；ＷＯ ９４／１９３６６参照］、３）２１−ヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンを出発原料とする方法［ＷＯ ９８／２４８００；オルガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２巻、２９２１頁（２０００年）参照］、４）スティグマステロールを出発原料とする方法［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、３７８６頁（１９９８年）；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、８５９９頁（１９９８年）；ＷＯ ９８／２４８００参照］が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記１）、２）および３）の方法でそれぞれ出発原料として用いる３β−アセトキシ−５−コラン酸、３β−ヒドロキシ−５−コラン酸、２１−ヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンはいずれも高価である。また、上記１）の方法ではスクアラミンを得るまでに１７工程を要し、２）の方法では１９工程を要するなど反応操作が煩雑である。したがって、これらの方法はスクアラミンの工業的に有利な製造方法とは言い難い。
【０００８】
一方、上記４）の方法では、出発原料として用いるスティグマステロールは安価に入手可能であるが、スクアラミンの合成までには２０工程を要する。また、４）の方法では、３位水酸基を選択的に酸化する工程で使用する炭酸銀が高価であること、低温下でのオゾン酸化工程を経由するので特殊な反応設備が必要なこと、などの問題点が存在しており、この方法も必ずしも工業的に有利な方法とはいえない。
【０００９】
本発明の目的は、スクアラミンなどの医薬の合成中間体として有用な化合物を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記の化合物を、入手容易な原料より、高純度で効率よく製造し得る方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を原料として選び、該３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を微生物を用いた変換反応に付すことにより、新規な化合物である７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドが高純度で効率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドである。また、本発明は、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を基質として７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である細菌を、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を含む培地で培養することを特徴とする７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの製造方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌は、シュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５）に変異処理を施して得られたシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である。
【００１３】
シュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＤ４０１４）菌株およびシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株の菌学的性質を以下の表１および表２に示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】
【表２】
【００１６】
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株の親株であるシュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４）株は、シュードモナス属プチダ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に属する細菌であり［特公平３−６９９１８号参照］、一般に突然変異株はその親株と同じ種に属するものと考えられていること、および上記の表１に示した菌学的性質より、シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株はシュードモナス属プチダ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に属する細菌であると判定した。
【００１７】
本菌株は、シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株と命名され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０として独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、保管されている。
【００１８】
本発明による７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの生産は、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を基質として、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である細菌を、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を含む培地で培養することにより行う。
【００１９】
３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸の塩としては、例えば、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸のナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩またはカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。培地中の３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩の濃度は、１〜３０ｇ／Ｌの範囲であるのが好ましく、単離効率、細菌に対する阻害性などの観点からは５〜２０ｇ／Ｌの範囲であるのがより好ましい。
【００２０】
培地は、上記のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である細菌が資化利用できる栄養源を含有するものであればよい。炭素源としては、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を単一炭素源としてもよく、または３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩にグルコース、グリセリン、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどを併用してもよい。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源；ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの有機窒素源などが用いられる。また、この他にリン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩類が添加される。
【００２１】
培養条件に特に制限はないが、培養温度は２８〜３２℃の範囲であるのが好ましく、２９〜３１℃の範囲であるのがより好ましい。また、培地のｐＨは、７〜９の範囲であるのが好ましく、７．７〜８．６の範囲であるのがより好ましい。培養時間は、１２時間〜３日間の範囲であるのが好ましい。培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気条件下に行う。
【００２２】
このようにして細菌の培養を行うことにより、原料である３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩が細菌により変換され、培養液中に７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドが蓄積する。この際、蓄積された７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは、基質の３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩に比して、水に対する溶解度が著しく小さいため、培養液中に析出沈澱する。該７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの分離採取は、例えば、沈澱している７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを含む培養液を静置し、浮遊している菌体を含む培養液からデカンテーションにより分離することにより行うか、遠心分離または濾過助剤を用いる操作により得られる、菌体と７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを含む混合物にメタノールを加えて、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを溶解させた後、菌体およびその他の不溶物を除去して得られるメタノール溶液からメタノールを減圧下に留去させることにより行う。この際、水を加えてメタノールを留去させると、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは針状結晶として析出するため、分離回収が容易となる。
【００２３】
７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド、例えば（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは、その２０位ホルミル基を還元することにより（２０Ｓ）−７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オン（後述の参考例２参照）に誘導される。この化合物は、さらに、オルガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２巻、２９２１頁（２０００年）に記載された方法によりスクアラミンに変換される。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００２５】
参考例１
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａの取得方法
培地１（普通寒天培地）の斜面培地に一晩生育させたシュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４、ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５）菌株の１白金耳を、予め試験管に準備した培地２（ブイヨン液体培地）の１０ｍｌに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。得られた培養液の１ｍｌを予め試験管に準備した培地２（前記のとおり）の１０ｍｌに植菌し、６時間振盪培養した。得られた培養液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで無菌的に濾過集菌し、０．１Ｍリン酸緩衝液２０ｍｌで洗浄した後、同緩衝液２５ｍｌに該フィルターに付着した菌を懸濁させた。得られた菌液のうち４ｍｌに終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、３０℃で１０分間振盪することにより、突然変異処理を行った。突然変異処理を施した菌液は、直ちに上記のリン酸緩衝液で１０倍に希釈し、これを培地１の平板培地に５００〜１０００個のコロニーを出現させるように希釈して塗布した後、３０℃で一晩静置培養を行った。出現したコロニーをランダムに培地１の平板培地に釣菌（５０個／プレート）し、翌日それぞれを培地１（前記のとおり）の斜面培地に植菌した。こうして得られた生育菌株を、予め滅菌した培地３（組成：３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸１０ｇ、水酸化ナトリウム１．１ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸二水素一カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム６ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、ペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．５ｇ、グルコース０．５ｇ、水道水１Ｌ、ｐＨ７．８）の１０ｍｌを含む試験管に２白金耳植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間、振盪培養した。得られたそれぞれの培養液中の生産物を薄層クロマトグラフィーにより検定し、目的とする（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを選択的に蓄積している一菌株を見出し、これをシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）と命名した。
【００２６】
実施例１
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）を培地１（前記のとおり）の斜面培地に植菌し、３０℃で１日間培養した。次に、生育した菌体の２白金耳を３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸を含む培地３（前記のとおり）の液体培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で一晩振盪培養した後、得られた培養液を同組成の培地３（前記のとおり）の１００ｍｌが入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間培養した。なお、培養に供した３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸の総量は１．１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）である。得られた培養液を５０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、得られた菌体と生成物の混合物に水１００ｍｌを入れて懸濁させた後、再度、遠心分離処理を行うことにより該混合物を洗浄した。該混合物にメタノール２００ｍｌを添加して生成物を溶解した後、濾過して清澄なメタノール溶液を得た。該メタノール溶液に水３０ｍｌを加えた後、ロータリーエバポレーターによりメタノールを一部留去し、次いで、得られた濃縮液を冷却し、晶析した固形物を濾取し、乾燥することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド３１０ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ、収率３２％）を得た。
【００２７】
得られた（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの一部を取り、これにメタノールを加えて１％溶液とし、この溶液をＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名、東ソー株式会社製、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）カラム（カラム温度４０℃、カラムオーブン；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＴＯ−６Ａ 株式会社島津製作所製）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ポンプ部；モデル５１０ ウォーターズ社製）に注入した。移動相として水／メタノールの容量比２７／７３の混合液（リン酸５０μｌ／Ｌ添加）を１ｍｌ／分で流し、検出を屈折率方式（検出器；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１ 昭和電工株式会社製）で行った。得られたクロマトグラムにおける各ピークの面積比（データ処理；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ 株式会社島津製作所製）から上記（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの純度を求めたところ、９６％であった。
【００２８】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３ ，ＴＭＳ基準，ｐｐｍ）δ：
９．５６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９５Ｈｚ），５．４２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９８Ｈｚ），３．９７−３．９８（１Ｈ，ｂｓ），２．６３５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．９６，２．９６，１４．８４Ｈｚ），２．３０−２．５５（４Ｈ，ｍ），１．１０−２．１０（１４Ｈ，ｍ），１．２０５（３Ｈ，ｓ），１．１３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９４Ｈｚ），０．７６９（３Ｈ，ｓ）
【００２９】
参考例２
（２０Ｓ）−７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンの合成
実施例１と同様にして得られた（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド２．００ｇ（５．８１ｍｍｏｌ）にエタノール２０ｍｌを加え、攪拌しながら氷冷した。得られた溶液に、水素化ホウ素ナトリウム０．１１ｇ（２．９１ｍｍｏｌ）を加えた後、氷冷下で１時間撹拌した。得られた反応液に３％塩酸を加えて中和し、エタノールを減圧下で留去した。残留物に酢酸エチル１００ｍｌおよび水２０ｍｌを加え洗浄し、次いで、水層を分離し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過し、減圧下で濃縮することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ）−７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オン１．７７ｇ（収率８８％）を得た。
【００３０】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３ ，ＴＭＳ基準，ｐｐｍ）δ：
５．７９６（１Ｈ，ｓ），３．９６５（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１．９８Ｈｚ），３．６３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９６，１０．８８Ｈｚ），３．３７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９２，１０．８８Ｈｚ），２．６１２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．９７，２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．４１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．３−２．５（ｍ，２Ｈ），１．０−２．１（ｍ，１５Ｈ），１．１９４（３Ｈ，ｓ），１．０５２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９２Ｈｚ），０．７４０（３Ｈ，ｓ）．
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、スクアラミンなどの医薬の合成中間体として有用な７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを高純度で効率よく製造することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、式（Ｉ）
【０００２】
【化１】
で示される７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドおよびその製造方法に関する。本発明により提供される７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは、例えば、下式で示されるスクアラミン（ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ）などの医薬の合成中間体として有用である。
【０００４】
【化２】
スクアラミンは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌などに対する強力な抗菌活性を有するとともに、抗ガン活性を有することが報告され、新たな抗生物質として注目されている化合物である［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、３７８６頁（１９９８年）；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、８５９９頁（１９９８年）；ＷＯ ９８／２４８００など参照］。
【０００６】
【従来の技術】
従来、スクアラミンはサメの肝臓から抽出されていたが、その抽出効率が０．００１〜０．００２重量％と極めて低いため、化学的合成方法の検討が行われてきた。スクアラミンの化学的合成方法としては、１）３β−アセトキシ−５−コラン酸を出発原料とする方法［テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、３５巻、８１０３頁（１９９４年）参照］、２）３β−ヒドロキシ−５−コラン酸を出発原料とする方法［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６０巻、５１２１頁（１９９５年）；ＷＯ ９４／１９３６６参照］、３）２１−ヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンを出発原料とする方法［ＷＯ ９８／２４８００；オルガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２巻、２９２１頁（２０００年）参照］、４）スティグマステロールを出発原料とする方法［ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、３７８６頁（１９９８年）；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、８５９９頁（１９９８年）；ＷＯ ９８／２４８００参照］が知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記１）、２）および３）の方法でそれぞれ出発原料として用いる３β−アセトキシ−５−コラン酸、３β−ヒドロキシ−５−コラン酸、２１−ヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンはいずれも高価である。また、上記１）の方法ではスクアラミンを得るまでに１７工程を要し、２）の方法では１９工程を要するなど反応操作が煩雑である。したがって、これらの方法はスクアラミンの工業的に有利な製造方法とは言い難い。
【０００８】
一方、上記４）の方法では、出発原料として用いるスティグマステロールは安価に入手可能であるが、スクアラミンの合成までには２０工程を要する。また、４）の方法では、３位水酸基を選択的に酸化する工程で使用する炭酸銀が高価であること、低温下でのオゾン酸化工程を経由するので特殊な反応設備が必要なこと、などの問題点が存在しており、この方法も必ずしも工業的に有利な方法とはいえない。
【０００９】
本発明の目的は、スクアラミンなどの医薬の合成中間体として有用な化合物を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記の化合物を、入手容易な原料より、高純度で効率よく製造し得る方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を原料として選び、該３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を微生物を用いた変換反応に付すことにより、新規な化合物である７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドが高純度で効率よく得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドである。また、本発明は、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を基質として７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である細菌を、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を含む培地で培養することを特徴とする７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの製造方法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する細菌は、シュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５）に変異処理を施して得られたシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である。
【００１３】
シュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＤ４０１４）菌株およびシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株の菌学的性質を以下の表１および表２に示す。
【００１４】
【表１】
【表２】
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株の親株であるシュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４）株は、シュードモナス属プチダ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に属する細菌であり［特公平３−６９９１８号参照］、一般に突然変異株はその親株と同じ種に属するものと考えられていること、および上記の表１に示した菌学的性質より、シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株はシュードモナス属プチダ種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）に属する細菌であると判定した。
【００１７】
本菌株は、シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株と命名され、ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０として独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託、保管されている。
【００１８】
本発明による７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの生産は、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を基質として、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である細菌を、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を含む培地で培養することにより行う。
【００１９】
３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸の塩としては、例えば、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸のナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩またはカルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。培地中の３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩の濃度は、１〜３０ｇ／Ｌの範囲であるのが好ましく、単離効率、細菌に対する阻害性などの観点からは５〜２０ｇ／Ｌの範囲であるのがより好ましい。
【００２０】
培地は、上記のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である細菌が資化利用できる栄養源を含有するものであればよい。炭素源としては、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を単一炭素源としてもよく、または３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩にグルコース、グリセリン、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどを併用してもよい。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源；ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの有機窒素源などが用いられる。また、この他にリン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩類が添加される。
【００２１】
培養条件に特に制限はないが、培養温度は２８〜３２℃の範囲であるのが好ましく、２９〜３１℃の範囲であるのがより好ましい。また、培地のｐＨは、７〜９の範囲であるのが好ましく、７．７〜８．６の範囲であるのがより好ましい。培養時間は、１２時間〜３日間の範囲であるのが好ましい。培養は、振盪培養または通気攪拌培養などの好気条件下に行う。
【００２２】
このようにして細菌の培養を行うことにより、原料である３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩が細菌により変換され、培養液中に７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドが蓄積する。この際、蓄積された７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは、基質の３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩に比して、水に対する溶解度が著しく小さいため、培養液中に析出沈澱する。該７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの分離採取は、例えば、沈澱している７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを含む培養液を静置し、浮遊している菌体を含む培養液からデカンテーションにより分離することにより行うか、遠心分離または濾過助剤を用いる操作により得られる、菌体と７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを含む混合物にメタノールを加えて、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを溶解させた後、菌体およびその他の不溶物を除去して得られるメタノール溶液からメタノールを減圧下に留去させることにより行う。この際、水を加えてメタノールを留去させると、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは針状結晶として析出するため、分離回収が容易となる。
【００２３】
７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド、例えば（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドは、その２０位ホルミル基を還元することにより（２０Ｓ）−７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オン（後述の参考例２参照）に誘導される。この化合物は、さらに、オルガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２巻、２９２１頁（２０００年）に記載された方法によりスクアラミンに変換される。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【００２５】
参考例１
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａの取得方法
培地１（普通寒天培地）の斜面培地に一晩生育させたシュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４、ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５）菌株の１白金耳を、予め試験管に準備した培地２（ブイヨン液体培地）の１０ｍｌに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。得られた培養液の１ｍｌを予め試験管に準備した培地２（前記のとおり）の１０ｍｌに植菌し、６時間振盪培養した。得られた培養液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで無菌的に濾過集菌し、０．１Ｍリン酸緩衝液２０ｍｌで洗浄した後、同緩衝液２５ｍｌに該フィルターに付着した菌を懸濁させた。得られた菌液のうち４ｍｌに終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、３０℃で１０分間振盪することにより、突然変異処理を行った。突然変異処理を施した菌液は、直ちに上記のリン酸緩衝液で１０倍に希釈し、これを培地１の平板培地に５００〜１０００個のコロニーを出現させるように希釈して塗布した後、３０℃で一晩静置培養を行った。出現したコロニーをランダムに培地１の平板培地に釣菌（５０個／プレート）し、翌日それぞれを培地１（前記のとおり）の斜面培地に植菌した。こうして得られた生育菌株を、予め滅菌した培地３（組成：３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸１０ｇ、水酸化ナトリウム１．１ｇ、硝酸アンモニウム２ｇ、リン酸二水素一カリウム１ｇ、リン酸水素二カリウム６ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、ペプトン０．５ｇ、酵母エキス０．５ｇ、グルコース０．５ｇ、水道水１Ｌ、ｐＨ７．８）の１０ｍｌを含む試験管に２白金耳植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間、振盪培養した。得られたそれぞれの培養液中の生産物を薄層クロマトグラフィーにより検定し、目的とする（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを選択的に蓄積している一菌株を見出し、これをシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）と命名した。
【００２６】
実施例１
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）を培地１（前記のとおり）の斜面培地に植菌し、３０℃で１日間培養した。次に、生育した菌体の２白金耳を３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸を含む培地３（前記のとおり）の液体培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で一晩振盪培養した後、得られた培養液を同組成の培地３（前記のとおり）の１００ｍｌが入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで４８時間培養した。なお、培養に供した３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸の総量は１．１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）である。得られた培養液を５０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、得られた菌体と生成物の混合物に水１００ｍｌを入れて懸濁させた後、再度、遠心分離処理を行うことにより該混合物を洗浄した。該混合物にメタノール２００ｍｌを添加して生成物を溶解した後、濾過して清澄なメタノール溶液を得た。該メタノール溶液に水３０ｍｌを加えた後、ロータリーエバポレーターによりメタノールを一部留去し、次いで、得られた濃縮液を冷却し、晶析した固形物を濾取し、乾燥することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド３１０ｍｇ（０．９０ｍｍｏｌ、収率３２％）を得た。
【００２７】
得られた（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの一部を取り、これにメタノールを加えて１％溶液とし、この溶液をＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名、東ソー株式会社製、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）カラム（カラム温度４０℃、カラムオーブン；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＴＯ−６Ａ 株式会社島津製作所製）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ポンプ部；モデル５１０ ウォーターズ社製）に注入した。移動相として水／メタノールの容量比２７／７３の混合液（リン酸５０μｌ／Ｌ添加）を１ｍｌ／分で流し、検出を屈折率方式（検出器；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１ 昭和電工株式会社製）で行った。得られたクロマトグラムにおける各ピークの面積比（データ処理；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ 株式会社島津製作所製）から上記（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの純度を求めたところ、９６％であった。
【００２８】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３ ，ＴＭＳ基準，ｐｐｍ）δ：
９．５６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９５Ｈｚ），５．４２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９８Ｈｚ），３．９７−３．９８（１Ｈ，ｂｓ），２．６３５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．９６，２．９６，１４．８４Ｈｚ），２．３０−２．５５（４Ｈ，ｍ），１．１０−２．１０（１４Ｈ，ｍ），１．２０５（３Ｈ，ｓ），１．１３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９４Ｈｚ），０．７６９（３Ｈ，ｓ）
【００２９】
参考例２
（２０Ｓ）−７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンの合成
実施例１と同様にして得られた（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド２．００ｇ（５．８１ｍｍｏｌ）にエタノール２０ｍｌを加え、攪拌しながら氷冷した。得られた溶液に、水素化ホウ素ナトリウム０．１１ｇ（２．９１ｍｍｏｌ）を加えた後、氷冷下で１時間撹拌した。得られた反応液に３％塩酸を加えて中和し、エタノールを減圧下で留去した。残留物に酢酸エチル１００ｍｌおよび水２０ｍｌを加え洗浄し、次いで、水層を分離し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過し、減圧下で濃縮することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ）−７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オン１．７７ｇ（収率８８％）を得た。
【００３０】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３ ，ＴＭＳ基準，ｐｐｍ）δ：
５．７９６（１Ｈ，ｓ），３．９６５（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１．９８Ｈｚ），３．６３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９６，１０．８８Ｈｚ），３．３７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９２，１０．８８Ｈｚ），２．６１２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．９７，２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．４１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．３−２．５（ｍ，２Ｈ），１．０−２．１（ｍ，１５Ｈ），１．１９４（３Ｈ，ｓ），１．０５２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９２Ｈｚ），０．７４０（３Ｈ，ｓ）．
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、スクアラミンなどの医薬の合成中間体として有用な７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを高純度で効率よく製造することができる。
Claims (2)
- ７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド。
- ３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を基質として７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ）菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０７０）である細菌を、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸および／またはその塩を含む培地で培養することを特徴とする７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの製造方法。
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