JP3883202B2 - 弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン組成物 - Google Patents
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Description
ヒトの呼吸器合胞体(RS)ウイルス感染は、無症侯性から重篤な気道疾患まで様々である。乳児や児童では、RSウイルス(RSV)は、世界中のすべての地理的領域における下気道疾患の最も重要な原因の一つであると見なされている。RSウイルスは、1歳未満の乳児における肺炎や細気管支炎の原因として、他のすべての微生物病原体の上位にあり、これらの乳児における致命的な気道疾患の主要な原因である。事実上すべての児童は、2歳までに感染する。高学年の児童や若年成人では、かなりの頻度で再感染が起こる。(チャノック(Chanock)ら、ヴァイラル・インフェクションズ・オブ・ヒューマンズ(Viral Infections of Humans)中、第3版、エイ・エス・エバンス(A.S.Evans)編集、プレナム・プレス(Plenum Press)、N.Y.(1989年))。たいていの健康な成人はRSウイルス感染による重篤な疾患を有しないが、老人の患者や免疫無防備状態の個体は、重篤で生命に危険を及ぼし得る感染を起こしやすい。
RSV感染の治療には問題がある。幼い乳児では、RSV抗原に対する血清抗体および分泌抗体の応答が減少し、それゆえ、より重篤な感染に罹患するのに対し、高学年の児童や成人では、蓄積免疫がより重篤な感染から防御すると思われる。抗ウイルス化合物であるリバビリンは、それが入院期間を短縮したり、支持的治療に対する乳児の必要性を減少させたりするという徴候は存在しないが、重篤な感染を起こした乳児の治療に有望であることを示している。
RSV感染における免疫の機構が、最近、注目されている。分泌抗体が上気道を防御するのに最も重要であると思われるのに対し、高レベルの血清抗体は下気道のRSV感染に対する抵抗性に主要な役割を果たしていると考えられる。RSVに対する高力価の中和抗体を含有する精製ヒト免疫グロブリンは、乳児や低学年の児童における重篤な下気道疾患に対する免疫治療的なアプローチに有用であることがわかる。しかしながら、免疫グロブリン製剤は、血液由来のウイルスを媒介する可能性があったり、調製や貯蔵が困難であり費用が掛かるなどのいくつかの欠点を有する。
RSウイルスに対する、特に乳児や低学年の児童用の効果的なワクチンが、すぐにでも必要とされているにもかかわらず、安全で効果的なワクチンを開発しようとする過去の試みは、失敗に終わっている。1960年代の中頃に試験されたホルマリン不活化ウイルスワクチンは、RSウイルス感染や疾患から防御しなかった。それどころか、RSウイルスによる次の感染の間に、疾患は悪化した。キム(Kim)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・エピデミオロジー(Am.J.Epidemiol.)89巻:422-434頁、チン(Chin)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・エピデミオロジー(Am.J.Epidemiol.)89巻:449-463頁(1969年);カピキアン(Kapikian)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・エピデミオロジー(Am.J.Epidemiol.)89巻:405-421頁(1969年)。
不活化ワクチンに伴う問題点や中和エピトープの可能な交代を解決するために、弱毒化RS変異株を開発することに努力がなされた。フリーデバルト(Friedewald)ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(J.Amer.Med.Assoc.)204巻:690-694頁(1968年)は、充分に弱毒化されてワクチン候補になり得ると思われるRSウイルスの低温継代変異株の製造について報告した。この変異株は、その野生型の親株ウイルスと比べて、26℃でわずかに増大した増殖効率を示したが、その複製は、温度感受性でもなければ、低温に対して有意に適応するものでもなかった。しかしながら、低温継代変異株は、成人に対して弱毒化された。充分に弱毒化されており、以前、RSVに感染した乳児や児童(すなわち、血清反応陽性の個体)には、免疫原性であるが、この変異株は、血清反応陰性の乳児には、上気道に対する低レベルの毒性を保持していた。このRSV変異株は、低温(26℃)におけるウシ腎細胞培養で継代されており、その結果、宿主範囲が減少する変異を獲得した。これら変異の獲得は、変異株がウシ組織中で効率的に複製することを可能にしたのに対し、これらの同じ変異株は、そのRSV株A2親株と比べて、変異株の増殖をヒトの気道に制限した。
同様に、ガルピュア(Gharpure)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J.Virol.)3巻:414-421頁(1969年)は、やはり有望なワクチン候補である温度感受性(ts)変異株の単離を報告した。ある変異株ts-1は、実験室およびボランティアにおいて広く評価された。この変異株は成人のボランティアに無症候性感染をもたらし、免疫化の45日後に野生型ウイルスの攻撃に対する抵抗性を与えた。また、血清反応陽性の乳児や児童や無症候性感染を受けるが、血清反応陰性の乳児は鼻炎の徴候および他の穏やかな症状を示した。さらに、ワクチン被接種者から回収可能なウイルスのうち、温度感受性の部分的または完全な欠失を示すウイルスはわずかな割合であり、穏やかな鼻炎以外の疾患徴候とは関連性がなかったが、ts表現型の不安定性が検出された。
かくして、これらの研究は、低温継代および温度感受性株のうち、弱毒化が不充分で、いく人かのワクチン被接種者、特に血清反応陰性の乳児において穏やかな疾患症状を引き起こすものもあれば、弱毒化が過度であり、防御免疫応答を誘発するために充分に複製できないものもある。(ライト(Wright)ら、インフェクション・アンド・イムニティ(Infect.Immun.)37巻:397-400頁(1982年))。ワクチン候補の変異株からそれらの温度感受性表現型を失わせる遺伝的不安定性は、不安な発見でもあった。一般的には、ホーデスら(Hodes)、プロシーディングズ・オブ・ソサイエティ・フォア・イクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディスン(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)145:1158-1164頁(1974年)、マッキントッシュ(McIntosh)ら、ペディアトリック・リサーチ(Pediatr.Res.)8巻:689-696頁(1974年)、およびベルシェ(Belshe)ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ヴァイロロジー(J.Med.Virol.)3巻:101-110頁(1978年)を参照。
弱毒化RSウイルスワクチンによるアプローチを放棄して、研究者らは、感染細胞の溶解物からの精製RSウイルス外被糖タンパクを用いた、可能性のあるサブユニットワクチン候補を試験した。この糖タンパクは、コットンラットの肺へのRSウイルス感染に対する抵抗性を誘発した(ウォルシュ(Walsh)ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ(J.Infect.Dis.)155巻:1198-1204頁(1987年))が、誘発された抗体は非常に弱い中和活性を有し、精製サブユニットワクチンによる齧歯類の免疫化は疾患促進作用をもたらした(マーフィー(Murphy)ら、ワクチン(Vaccine)8巻:497-502頁(1990年))。
FまたはG外被糖タンパクを発現するワクシニアウイルス組換え体に基づくワクチンについても調べられた。これら組換え体は標準的なウイルス対照物と区別できないRSV糖タンパクを発現し、小さい齧歯類は、ウイルス感染性を中和する高レベルの特異抗体を生じさせるワクシニア-RSV FおよびG組換えウイルスに皮内感染した。実際、ワクシニア-F組換え体によるコットンラットの感染は、下気道でのRSVの複製に対するほとんど完全な抵抗性および上気道での有意な抵抗性を刺激した。オルムステッド(Olmsted)ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83巻:7462-7466頁(1986年)。しかしながら、ワクシニアFおよびワクシニアG組換え体によるチンパンジの免疫化は、RSVの攻撃に対してほとんど防御を与えなかった(コリンズ(Collins)ら、ワクチン(Vaccine)8巻:164-168頁(1990年))。このことは、このアプローチが成功したワクチンを与えそうにないという結論をもたらした。
研究者らは、効果的で安全なRSワクチンを製造するいくつかの異なったアプローチを長年にわたって調べたが、RSウイルスは相変わらず乳児や児童における重篤なウイルス下気道疾患の最も一般的な原因である。その結果、この集団において、入院を必要とすることが多い重篤な病気を予防し、他の個体において疾患を予防することができる安全なワクチンが、依然として、すぐにでも必要とされている。全く驚くべきことに、本発明は、これらおよび他の関連する必要性を満足する。
発明の概要
本発明は、弱毒化された呼吸器合胞体ウイルスのワクチン組成物を提供する。弱毒化ウイルスは、生理学的に許容される担体と共に、ヒト宿主において免疫応答を誘発するのに充分な量で提供され、所望により、宿主の免疫応答を増強するアジュバントを含有していてもよい。本発明は、不完全に弱毒化されたRSウイルスから誘導され、以前に文献に報告された弱毒化RSウイルスによってこれまで示されていない性質を有する弱毒化RSウイルスのいくつかの異なる抗原サブグループを企図する。ある態様では、本発明の弱毒化ウイルスは、低温継代によって不完全に弱毒化され、宿主範囲を制限されたRSウイルス(cpRSV)からなり、これに少なくとも1つまたはそれ以上の付加的な変異を導入して温度感受性(ts)表現型を有するウイルスまたはその子孫(以下、cptsRSVと呼ぶ)を製造する。別の態様では、低温継代によって不完全に弱毒化され、宿主範囲が制限されたRSウイルス(cpRSV)は、次第に低下する温度の下で継代し、付加的な増殖制限変異を導入することによって、低温適応(ca)とされる。さらに別の態様では、不完全に弱毒化されたRSVts変異株、例えば、RSVts-4およびts-1、NG1などは、付加的な変異の導入によって、さらに弱毒化される。tsまたはcp株の弱毒化誘導体は、いくつかの方法で、好ましくは、化学的変異誘発処理で付加的な温度感受性変異の導入によって、20〜24℃の弱毒化温度における培養のさらなる継代によって、あるいは、小プラーク(sp)変異の導入と、不完全に弱毒化された親変異株より複製がより制限されている誘発体の選択とによって、製造される。本発明の弱毒化ウイルスは、抗原サブグループAまたはBのいずれかに属し、両サブグループのウイルスを都合よく組み合わせて、流行中のRSV感染に対してより広い範囲で適用するためのワクチン組成物としてもよい。ワクチンは、典型的には、約103〜106プラーク形成単位(PFU)またはそれ以上という最大効力の用量で処方される。
他の態様では、本発明は、個体の免疫系を刺激し、呼吸器合胞体ウイルスに対する防御を誘発する方法を提供する。これらの方法は、ts変異によって、あるいは、低温(例えば、26℃)における継代によって、元々不完全に弱毒化されたRSVに、ts、caおよび/またはsp変異を導入することによって弱毒化されている免疫学的に充分な量のRSVを、個体に投与することからなる。新生児、血清反応陰性および血清反応陽性の乳児、低学年の児童、ならびに老人におけるRSV感染が場合によっては重篤な結果を与えることを考慮すると、これらの個体は、典型的には、本発明の方法による免疫化から最大の恩恵を被るであろう。たいていの場合、弱毒化されたRSウイルスは、エアロゾルまたは小滴の適用方法によって、個体の気道に、好ましくは鼻腔内に投与される。
さらに他の態様では、本発明は、弱毒化RSウイルスの純粋培養を提供する。ここで、このウイルスは、先に同定されたtsまたはcp変異株のさらなる誘導体化によって、より不完全に弱毒化されている。弱毒化ウイルスは、感染したヒト宿主において、防御免疫応答を誘発することができるが、免疫された宿主において重篤な呼吸器疾患の許容できない症状を起こさないように、充分に弱毒化されている。弱毒化ウイルスは、細胞培養の上清中に存在しており、培養から単離したり、部分的または完全に精製してもよい。このウイルスは、凍結乾燥してもよく、所望により、貯蔵用または宿主への送達用の様々な他の成分と組み合わせることができる。
特定の態様の説明
本発明は、ヒトのワクチン用途に適するRSウイルスを提供する。ここで説明するRSウイルスは、tsまたはcpRSウイルスの不完全弱毒化株に付加的な変異株を導入することによって製造される。これらの変異は、化学的変異誘発物質を添加した細胞培養中でのウイルス増殖の間に、増殖制限変異を導入するために最適以下の温度での継代に供したウイルスの選択によって、あるいは、細胞培養中に小プラークを生産する変異誘発ウイルスの選択によって、上記の株に導入される。
かくして、本発明のワクチンは、弱毒化RVウイルスおよび生理学的に許容される担体を含有する。このワクチンは、免疫学的に充分な量で、RSウイルスに対する免疫学的防御を必要とする個体(例えば、乳児、児童、老人、または免疫抑制療法の成人志願者)に投与される。このワクチンは、個体が引き続いて野生型RSウイルスに感染した場合に、重篤な下気道疾患(例えば、肺炎および細気管支炎)に対して防御的な免疫応答の発生を誘発する。天然を循環するウイルスは、依然として、特に上気道における感染を起こすことができるが、ワクチン接種と、次の野生型ウイルスの感染によって起こり得る抵抗性の増大との結果、鼻炎の可能性を非常に大きく減少させる。ワクチン接種の後、インビトロおよびインビボにおいて同種の(同じサブグループの)野生型ウイルスを中和することができる血清抗体および分泌抗体が、検出可能なレベルで宿主から生じる。多くの場合、宿主抗体は、異なる非ワクチンサブグループの野生型ウイルスをも中和する。より高レベルの交差防御を(すなわち、別のサブグループの異種株に対して)達成するためには、両サブグループAおよびBのうち少なくとも一方の優勢株からの弱毒化RSウイルスを用いて、個体にワクチン接種することが好ましい。
ワクチンの一成分である弱毒化ウイルスは、単離され、典型的には精製された形態にある。「単離された」とは、野生型ウイルスの本来の環境以外(例えば、感染した個体の上咽頭)に存在する弱毒化された修飾RSウイルスに言及することを意味する。より一般的には、「単離された」とは、細胞培養または他の系の異種成分として弱毒化ウイルスを含むことを意味する。例えば、本発明の弱毒化RSウイルスは、感染細胞培養によって生産させ、細胞培養から分離し、天然には存在しない他のRSウイルス(例えば、同時に出願した米国特許出願(代理人の整理番号15280-11-2;その開示内容は、出典を示すことによって、特に明細書の一部とする)に記載されているように、F-タンパクに対する中和モノクローナル抗体に対する抵抗性によって弱毒化されていると選択されるもの)を含む安定剤に添加すればよい。
本発明の弱毒化RSウイルスは、ヒトにおいて自然に循環する野生型のウイルスと比べて、毒性が実質的に非常に減少している。弱毒化ウイルスは、たいていの免疫化個体において感染の徴候が生じないほど充分に弱毒化されている。場合によっては、弱毒化ウイルスは、ワクチン接種を受けていない個体に伝播し得る。しかしながら、その毒性は、ワクチン接種を受けた宿主や偶発的な宿主において、重篤な下気道感染が起こらないほど充分に廃棄されている。
弱毒化のレベルは、例えば、免疫された宿主の気道に存在するウイルスの量を定量し、野生型RSウイルスや、ワクチン候補の株として評価されている他の弱毒化RSウイルスによって生じる量と比較することによって決定すればよい。例えば、本発明の弱毒化ウイルスは、野生型ウイルスの複製レベル(例えば、10〜1000倍低い)と比べて、非常に感受性の高い宿主(例えば、チンパンジー)の上気道における複製制限の度合いが高い。また、チンパンジーの上気道における弱毒化RSVウイルス株の複製レベルは、不完全な弱毒化RSV A2ts-1変異株のものより低いべきである。上気道におけるウイルスの複製に関連する鼻漏の進行をさらに低減するためには、理想的なワクチン候補ウイルスは、上気道および下気道の両方において、制限された複製レベルを示すべきである。しかしながら、本発明の弱毒化ウイルスは、ワクチン接種された個体に防御を付与するのに充分なほどヒトにおいて充分に感染性および免疫原性である。感染した宿主の鼻咽頭におけるRSウイルスのレベルを測定する方法は、文献に公知である。試料は、鼻咽頭の分泌物を吸引または洗浄することによって得られ、ウイルスは組織培養で定量し、その他は実験室での方法による。例えば、ベルシェ(Belshe)ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ヴァイロロジー(J.Med.Virology)1巻:157-162頁(1977年)、フリーデバルト(Friedewald)ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(J.Amer.Med.Assoc.)204巻:690-694頁(1968年);ガルピュア(Gharpure)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J.Virol)3巻:414-421頁(1969年);ライト(Wright)ら、アーク・ゲス・ヴィルスフォルシュ(Arch.Ges.Virusforsch)41巻;238-247頁(1973年)を参照。ウイルスは、宿主動物(例えば、チンパンジー)の鼻咽頭中で都合よく測定することができる。
本発明の充分に弱毒化された誘導体ウイルスを製造するためには、不完全または部分的に弱毒化されている親ウイルス株(例えば、ts-1またはts-4変異株、あるいはcpRSV)に、変異株を導入する。サブグループAのウイルスについては、不完全に弱毒化された親株ウイルスは、好ましくは、サブグループAのA2株の変異株、あるいはその誘導体またはサブクローンであるts-1またはts-1 NG-1、あるいはcpRSVである。
サブクローンBウイルスの部分的に弱毒化された変異株は、野生型サブグループBウイルスを許容可能な細胞基質中で生物学的にクローニングし、その低温継代変異株を発育させ、このウイルスを化学的変異誘発処理に対してts変異株を製造し、あるいはその少量のプラーク変異株を選択することによって製造することができる。様々な選択技術を組み合わせて、ここで説明するさらなる誘導体化に有用なサブグループAまたはBの部分的に弱毒化された変異株を製造してもよい。
いったん所望の部分的に弱毒化された親株を選択すれば、本発明によりヒトでの使用が許容されるワクチンを製造するのに充分なさらなる弱毒化は、ここで説明するいくつかの方法で達成すればよい。
本発明によれば、cp変異株は、いくつかの方法でさらに変異を誘発することができる。ある態様では、この方法は、部分的に弱毒化されたウイルスを、次第に低くした弱毒化温度における細胞培養の継代に供することを伴う。例えば、野生型ウイルスは、典型的には、約34〜35℃で培養されるのに対し、部分的に弱毒化された変異株は、至適以下の温度(例えば、26℃)における細胞培養(例えば、初代ウシ腎細胞)の継代によって製造される。これらの変異株は、わずかではあるが、明らかな低温適応(ca)の証拠を有し、すなわち、その野生型親株ウイルスと比べて、26℃における増殖効率が増大しているが、典型的には、tsではない。かくして、本発明のある方法では、cp変異株または他の部分的に弱毒化された株(例えば、ts-1またはsp)は、約20〜24℃、好ましくは20〜22℃の温度までのMRC-5またはVero細胞の継代によって、低温における効率的な増殖に適応する。低温継代の間における変異株RSウイルスのこのような選択は、部分的に弱毒化された親株と比べて、誘導体株に残存する毒性を実質的に除去する。
本発明の別の態様では、不完全に弱毒化された株を化学的変異誘発処理に供して、ts変異を導入するか、あるいは、すでにtsであるウイルスの場合には、弱毒化された誘導体にts表現型の増大した安定性を付与するのに充分な付加的なts変異を導入する。RSウイルスにts変異を導入する手段には、例えば、ガルピュア(Gharpure)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J.Virol.)3巻:414-421頁(1969年)およびリチャードソン(Richardson)ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ヴァイロロジー(J.Med.Virol.)3巻:91-100頁(1978年)に記載の一般的な方法に従った、濃度が約10-3〜10-5M、好ましくは10-4Mの5-フルオロウリジンまたは5-フルオロウラシルなどの変異誘発物質の存在下におけるウイルスの複製、あるいは、濃度が約100μg/mlのニトロシルグアニジンへのウイルスの曝露が含まれる。他の化学的変異誘発処理を用いることもできる。弱毒化は、ほとんどのRSウイルス遺伝子におけるts変異から生じ得る。本発明の弱毒化RSウイルスの複製の温度感受性のレベルは、許容温度におけるその複製を、いくつかの制限的な温度におけるものと比較することによって測定される。ウイルスの複製が許容温度におけるその複製と比べて100倍またはそれ以上減少する最低の温度は、遮断温度(shutoff temperature)と呼ばれる。実験動物およびヒトにおいては、RSウイルスの複製および毒性は、両方とも、変異株の遮断温度と相関がある。遮断温度が39℃の変異株の複製は、ほどよく制限されるのに対し、遮断温度が38℃の変異株は、充分には複製を行わず、病気の症状は、主として上気道に制限される。遮断温度が35〜37℃のウイルスは、ヒトにおいては、充分に弱毒化されているはずである。かくして、温度感受性である本発明の弱毒化RSウイルスは、約35〜39℃、好ましくは35〜38℃の範囲内の遮断温度を有する。温度感受性の性質を部分的に弱毒化された株に付加すると、本発明のワクチン組成物に有用な完全に弱毒化されたウイルスが生成する。
生存度、弱毒化および免疫原性の基準に加えて、選択される誘導体の性質はまた、所望の属性が維持されるように、できる限り安定でなければならない。インビボにおける複製後のts表現型の遺伝的不安定性は、tsウイルスについては一般的である(マーフィー(Murphy)ら、インフェクション・アンド・イムニティ(Infect. and Immun.)37巻:235-242頁(1982年))。理想的には、本発明のワクチンに有用なウイルスは、その生存度、その弱毒化の性質、免疫された宿主において複製する(たとえ、低レベルであっても)その能力、および、野生型ウイルスによる次の感染によって引き起こされる重篤な疾患に対して防御を付与するのに充分な免疫応答の発生をワクチン被接種者において効率的に誘発するその能力を維持しなければならない。明らかに、従来公知の報告されたRSウイルス変異株は、これらの基準をすべては満足しない。実際、公知の弱毒化RSウイルスについて報告されている結果に基づいた予想に反して、最低2〜3つの異なる変異を有する本発明のウイルスのいくつかは、生育可能であり、従来の変異株より弱毒化されているだけでなく、防御免疫応答を刺激し、場合によっては、多重修飾によって与えられる防御を拡張する(例えば、様々なウイルス株またはサブグループに対する防御、または、異なる免疫学的基礎(例えば、分泌対血清免疫グロブリン、細胞免疫など)による防御を誘発する)能力を保持しながら、従来研究された変異株より一般的にインビボで安定である。
本発明の弱毒化ウイルスの増殖は、RSウイルスの増殖が可能な多数の細胞系において行いうる。RSウイルスは、様々なヒトおよび動物細胞において増殖する。ワクチン用の弱毒化RSウイルスの増殖に好ましい細胞系には、DBS-FRhL-2、MRC-5、およびVero細胞が含まれる。最高のウイルス収率は、通常、Vero細胞などの異数体細胞系によって達成される。細胞は、典型的には、約0.001〜1.0またはそれ以上の感染多重度でもって、ウイルスを接種し、ウイルスの複製が許容される条件下(例えば、約30〜37℃で約3〜5日間)、あるいは、ウイルスが適当な力価に到達するのに必要な長さの期間にわたって、培養する。ウイルスは、細胞培養から取り出し、典型的には、公知の清澄化法(例えば、遠心分離)によって細胞成分から分離し、所望により、当業者に公知の方法を用いて、さらに精製してもよい。
ここで説明したように弱毒化したRSウイルスは、インビボおよびインビトロのモデルにおいて試験し、ワクチン用としての適切な弱毒化、遺伝的安定性、および免疫原性を確認することができる。インビトロ分析では、修飾ウイルスは、小プラーク表現型について試験される。修飾ウイルスは、RS感染の動物モデルにおいて、さらに試験される。メイグニール(Meignier)ら編、アニマル・モデルズ・オブ・レスピラトリー・シンキシアル・ヴァイラス・インフェクション(Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection)、メリュウエクス・ファウンデーション・パブリケーション(Meriuex Foundation Publication)、(1991年)(これは出典を示すことによって明細書の一部とする)には、様々な動物モデルが記載され要約されている。RS感染のコットンラットモデルは、米国特許第4,800,078号およびプリンス(Prince)ら、ヴァイラス・リサーチ(Virus Res.)3巻:193-206頁(1985年)(これらは出典を示すことによって明細書の一部とする)に記載されており、ヒトにおける弱毒化および効力を予想しうるものであると考えられる。チンパンジーを用いたRS感染の霊長類モデルは、ヒトにおける弱毒化および効力を予想しうるものであり、リチャードソン(Richardson)ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ヴァイロロジー(J.Med.Virol.)3巻:91-100頁(1978年);ライト(Wright)ら、インフェクション・アンド・イムニティ(Infect.Immum.)37巻:397-400頁(1982年);クロー(Crowe)ら、ワクチン(Vaccine)(1993年)(印刷中)(これらは出典を示すことによって明細書の一部とする)に詳細に記載されている。
例えば、感染したコットンラットにおけるRSV中和抗体の治療効果は、RSVに感染したサルおよびヒトの免疫治療によるその後の経験と非常に関連性が高いことが示されている。実際、コットンラットは、RSV中和抗体を用いた免疫治療に対する感染したサルおよびヒトの応答に対する信頼できる実験的な代用物であると思われる。例えば、コットンラットにおける治療効果と関連性のあるRSV中和抗体の量は、治療した動物の血清中におけるかかる抗体のレベルによって測定したところ(すなわち、1:302〜1:518の血清RSV中和力価)、サル(すなわち、1:539の力価)またはヒト乳児または低学年の児童(すなわち、1:877)について示されたものと同じ範囲内である。コットンラットにおける治療効果は、肺のウイルス力価における100倍またはそれ以上の減少によって現れた(プリンス(Prince)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J.Virol.)61巻:1851-1854頁)が、サルでは、治療効果は肺のウイルス力価における50倍の減少であることが観察された。(ヘミング(Hemming)ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ(J.Infect.Dis.)152巻:1083-1087頁(1985年))。最後に、重篤なRSV細気管支炎または肺炎のために入院している乳児や低学年の児童における治療効果は、治療グループの酸素投与量の有意な増加および治療患者らの上気道から回収可能なRSV量の有意な減少によって現れた。(ヘミング(Hemming)ら、アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモテラピー(Antimicrob.Agents Chemother.)31巻:1882-1886頁(1987年))。それゆえ、これらの研究に基づけば、コットンラットは、乳児や低学年の児童におけるRSVワクチンの成功を予想するのに適切なモデルを構成すると思われる。ハムスターおよびマウスを含む他の齧歯類は、これらの動物がRSV複製に関して許容的であり、その核心温度がヒトのものに近いので、同様に有用なはずである(ライト(Wright)ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ(J.Infect.Dis.)122巻:501-512頁(1970年)およびアンダーソン(Anderson)ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ヴァイロロジー(J.Gen.Virol.)71巻:(1990年))。
ワクチン用として、本発明の弱毒化ウイルスは、ワクチン組成物に直接用いたり、所望により、当業者に公知の凍結乾燥法によって凍結乾燥することができる。凍結乾燥したウイルスは、典型的には、約4℃で保持される。使用の準備をする場合、凍結乾燥したウイルスは、以下でさらに説明するように、必要に応じてアジュバントと共に、安定化溶液(例えば、食塩水またはSPG、Mg++およびHEPESを含む)中に再構成する。
かくして、本発明のRSウイルスワクチンは、有効成分として、ここで説明する免疫遺伝学的に有効な量の弱毒化RSウイルスを含有する。弱毒化ウイルスは、生理学的に許容される担体および/またはアジュバントと共に、宿主(特に、ヒト)に導入すればよい。有用な担体は、当該分野で公知であり、例えば、水、緩衝水、0.4%食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸などが含まれる。得られた水溶液は、そのまま用いるために包装するか、あるいは凍結乾燥すればよく、凍結乾燥した製剤は、上述のように、投与前に滅菌溶液と混合する。これら組成物は、生理学的な状態に近づけるために必要な医薬上許容される補助物質(例えば、pH調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなど)を含有していてもよい。
エアロゾル、小滴、粗粒スプレー、経口、局所的または他の経路で、最も好ましくは鼻腔内への送達によって、ここで説明する弱毒化RSウイルス組成物を接種すると、宿主の免疫系は、RSウイルスタンパクに特異的な分泌抗体および血清抗体の両方を生じることによって、ワクチンに応答する。ワクチン接種の結果、宿主は、RSウイルス感染に対して少なくとも部分的または完全に免疫性、あるいは、特に下気道における中程度または重篤なRSウイルス感染の進行に対して抵抗性となる。
本発明の弱毒化RSウイルスを含有するワクチン組成物は、RSウイルス感染に対して感受性を有するか、さもなければRSウイルス感染の危険性のあるヒトに投与され、個体自身の免疫応答能力を増強する。このような量は、「免疫遺伝学的に効果的な用量」であると定義される。この使用の際、正確な量は、やはり患者の健康状態や体重、投与の様式、製剤の性質などに依存するが、一般的には患者一人あたり約103〜約106プラーク形成単位(PFU)またはそれ以上のウイルス、より一般的には患者一人あたり約104〜105PFUウイルスの範囲内である。いずれにしても、ワクチン製剤は、重篤または生命に危険を及ぼすRSウイルス感染に対して患者を効果的に防御するのに充分な量の弱毒化RSウイルスを提供すべきである。
ある特定のRSサブグループまたは株に属する本発明の弱毒化RSウイルスは、他のサブグループまたは株に属する弱毒化ウイルスと組み合わせ、複数のRSウイルスに対する防御を達成することができる。典型的には、様々な修飾ウイルスを組み合わせて同時に投与するが、別々に投与してもよい。いくつかの株のRSウイルス間には、交差防御の現象が見られるので、ある株による免疫化は、同一または異なるサブグループに属する数種の異なる株に対して防御しうる。
場合によっては、本発明の弱毒化RSウイルスワクチンを、他の因子(特に、他の幼児期ウイルス)に対する防御応答を誘発するワクチンと組み合わせるのが望ましいかもしれない。たとえば、本発明の弱毒化ウイルスワクチンは、クレメンツ(Clements)ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー(J.Clin.Microbiol.)29巻:1175-1182頁(1991年)(これは出典を示すことによって明細書の一部とする)に記載されているように、パラインフルエンザウイルスワクチンと同時に(典型的には、別々に)または連続的に投与することができる。本発明のワクチン組成物の単一または多重投与を実施することができる。新生児や乳児においては、充分なレベルの免疫を誘発するには、多重投与が必要かもしれない。投与は、生まれて最初の1カ月以内に始めて、幼時期を通じて、天然(野生型)ウイルス感染に対する充分な防御を維持するのに必要な一定間隔(例えば、2カ月、6カ月、1年および2年)で継続すべきである。同様に、重篤なRSウイルス感染に対して特に感受性を有する成人(例えば、健康管理従事者、昼間保育従事者、低学年児童の家族構成員、心肺機能が悪い老人など)は、防御免疫応答を確立および/または維持する多重免疫化を必要とするかもしれない。誘発される免疫のレベルは、中和分泌抗体および中和血清抗体の量と、所望レベルの防御を維持するように調整した投与量またはそれに必要とされる反復ワクチン接種とを測定することによって、モニターすることができる。
以下の実施例は、例示のために与えられるのであって、限定のためではない。
実施例I
低温継代RSVの変異誘発した誘導体の単離および特性付け
本実施例では、より高度に弱毒化され、それゆえRSVワクチン製剤に用いるのが好ましい誘導体tsおよびsp株を製造する、不完全に弱毒化され宿主範囲が制限されたcpRSVの化学的変異誘発処理について説明する。
低温継代RSV(cpRSV)の親株を調製した。フロー・ラボラトリー(Flow Laboratories)ロット3131ウイルス、すなわちヒトにおいて不完全に弱毒化されたcpRSV親株ウイルスは、MRC-5細胞中、25℃で2回継代し、毎回、25℃でMRC-5細胞中に2回希釈し、MRC-5中で3回継代して、変異誘発処理用のcpRSV懸濁液を得た。
cpRSVは、親株を、培地中に濃度4×10-4Mの5-フルオロウラシルの存在下、MRC-5細胞中にて、32℃で増殖させることによって、変異誘発処理した。この濃度は、予備的な研究において、細胞培養中における増殖5日目のウイルス力価が、5-フルオロウラシルを含まない培地と比べて、100倍減少することから明らかなように、至適であることが示された。変異誘発した株は、次いで、寒天重層で維持したVero細胞上でのプラークアッセイによって分析し、インキュベーションを適当な時間行った後、プラークをニュートラルレッド色素で染色した。854個のプラークを選び、新鮮なVero細胞の単層上で増殖させることによって、各プラークの後代を別々に増幅した。Vero細胞に対する細胞変性効果が最大であると思われる時点で、cpRSVに変異誘発処理を施したウイルスの単一プラークの後代を接種した組織培養の各々の内容物を別々に採取した。温度感受性(ts)または小プラーク(sp)表現型を示す後代ウイルスは、HEp-2細胞上のこれらプラークプールの32℃および38℃での力価を測定することによって求めた。sp表現型(32℃で、親株ウイルスと比べて、50%またはそれ以上減少したプラークサイズ)またはts表現型(32℃と比べて、各温度[37°〜40℃]の力価が100倍減少)を示すウイルスについては、さらに評価した。これらの株は、Vero細胞上における連続プラーク精製を3回行うことによって生物学的にクローン化し、次いで、Vero細胞上で増幅した。クローン化した株は、(プラーク形成の効率(EOP)アッセイにおいて)32°、37°、38°、39°および40℃での力価を測定し、それらのspおよびts表現型を確認した。いくつかのクローン化した株の力価は、許容温度(32°)でも比較的低いので、これらウイルスはHEp-2細胞中で1回継代し、インビトロ分析用のウイルス懸濁液を調製した。変異誘発したcpRSVの後代の表現型を表1に示す。
変異株後代の1つは小プラーク表現型を有しており、すなわち、RSVcpsp-143(spは小プラーク(sp)表現型を意味する)であり、残りの変異株後代はts表現型を有していた。RSVcpts変異型は、37℃〜40℃の温度範囲にわたるインビトロでの単層培養におけるプラーク生産能の変化を示す(cpts368は40℃でプラーク生産能を保持している)のに対し、最も温度感受性(ts)であるウイルスcpts248は、38℃でプラークを生産しなかった。かくして、変異誘発したcpRSV後代のいくつかは、プラーク形成の温度感受性に関して、それらのcpRSV親株ウイルスとは顕著な差異を示す。
マウスにおける複製および遺伝的安定性に関する研究
次に、BALB/cマウスの上気道および下気道におけるcpRSV後代の複製レベルを調べた(表2)。2つの最大tsウイルス、すなわちcpts530およびcpts248は、マウスの鼻甲介における複製が約7〜12倍制限されることがわかった(表2)。しかしながら、これらウイルスのいずれも、cpRSV親株ウイルスと比べて、肺における複製は制限されなかった。このように肺より鼻甲介における複製の方が制限されることは、ts変異株に特徴的ではなく、一般的には、より温かい下気道における複製の方が制限される(リッチマン(Richman)およびマーフィー(Murphy)、レビューズ・オブ・インフェクシャス・ディジージズ(Rev.Infect.Dis.)1巻:413-433頁(1979年))。肺および鼻甲介において生産されるウイルスは、入力ウイルスのts性を保持していた(データは示さず)。本発明での発見は、cp親株ウイルスの変異を背景とするts変異の組み合わせが、従来から研究されているts変異株と比べて、インビボでの複製後におけるts表現型の安定性が高レベルであるcpRSVts後代を生じることを示唆した。
cpRSV後代ウイルスのts表現型の遺伝的安定性のレベルをさらに調べるために、ヌードマウスの肺および鼻甲介に存在するウイルスのプラーク形成の効率を、2つの変異誘発したcpRSV後代、特に最もtsな、すなわちts248およびts530について調べた。ヌードマウスは、機能的なT細胞を先天的に有しないので免疫無防備状態にあり、ウイルスがこれら宿主中で非常に長期間にわたって複製することができることから、選択した。このように複製の期間が長いことは、変化した表現型を有するウイルス変異株の出現にとっては好ましい。第12日(注:正常なマウスにおいては、この時点でウイルスはもはや検出できない)に存在するウイルスが特性付けられ、無変化のts表現型を保持していることがわかった(表3)。予想されたように、この試験に正の対照として用いられたts-1変異株は、インビボで不安定なts表現型を示した。かくして、齧歯類におけるts変異株ウイルスの従来の評価とは異なって、これらの結果は、齧歯類中での持続複製後における高レベルのts表現型の安定性が達成されたことを示しており、これは、本発明のウイルスが有意で従来は達成されなかった非常に望ましい性質を有することを表す。
チンパンジーの場合
次に、cpRSVts後代の弱毒化のレベルを、ヒトに最も近い関係の宿主である血清反応陰性のチンパンジーにおいて調べた。チンパンジーまたはフクロウザルにおける試験は、リチャードソン(Richardson)ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ヴァイロロジー(J.Med.Virol.)3巻:91-100頁(1979年);クロー(Crowe)ら、ワクチン(Vaccine)(1993年)(印刷中)(これらは出典を示すことによって明細書の一部とする)の一般的なプロトコルに従って行う。約104プラーク形成単位(PFU)の変異誘発した弱毒化ウイルスを含む懸濁液1mlを各動物に鼻腔内投与する。別の方法は、各部位に104PFUが送達される用量で上気道および下気道の両方にRSVを接種することである。チンパンジーは、10日間にわたって毎日、その後は第20日まで3〜4日毎に試料採取した。チンパンジーの下気道は、スナイダー(Snyder)ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ(J.Infec.Dis.)154巻:370-371頁(1986年)およびクロー(Crowe)ら、ワクチン(Vaccine)(1993年)(印刷中)のプロトコルに従った気管洗浄によって試料採取することができる。数匹の動物は、野生型ウイルスを用いて4〜6週間後に攻撃誘発(challenge)する。動物は、鼻咽頭試料を採取した日毎に、呼吸器疾患の徴候について調べる。鼻漏には0〜4+のスコアを付け、2+またはそれ以上は有意な上気道疾患の証拠であるとみなす。
ウイルスは、上で説明したように、RSV感受性HEp-2細胞への接種によって、鼻や咽喉のスワブ試料および気管洗浄液から単離する。ウイルスの量は、シュニッチャー(Schnitzer)ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー(J.Virol.)17巻:431-438頁(1976年)(これは出典を示すことによって明細書の一部とする)に説明されているように、HEp-2細胞を用いたプラーク法によって、直接的に測定することもできる。ミルズ(Mills)ら、ジャーナル・オビ・イムノロジー(J.Immunol.)107巻:123-130頁(1979年)(これは出典を示すことによって明細書の一部とする)RSV中和抗体を測定するために、ウイルス投与の前で、感染の3〜4週間後に血液の試料を採取する。
cpRSV後代のうち最もtsで弱毒化されているもの(cpts248)を調べて、野生型RSVおよびcpRSV親株ウイルスと比較した(表4)。cpRSV親株ウイルスの複製は、野生型と比べると、鼻咽頭において、わずかに減少し;野生型ウイルスと比べて、鼻漏の量が減少し;そして、野生型と比べて、下気道におけるウイルス複製が約600倍減少した。明らかに、cpウイルスは、チンパンジーの下気道における複製が有意に制限されていたが、これは動物やヒトでのcpRSVに関する以前の評価からは確認されなかった最も望ましい性質である。より有意には、cpts248ウイルスは、野生型と比べて、鼻咽頭における複製がが10倍制限されており、この制限は鼻漏の顕著な減少と関係していた。これらの発見は、cpRSV誘導体ウイルスが生RSVワクチンにとって非常に望ましい2つの性質、すなわち非常に感受性の高い血清反応陰性のチンパンジーの上気道および下気道における弱毒化の証拠を有することを示した。次に、チンパンジーの気道に存在するウイルスの遺伝的安定性のレベルを評価した(表5)。気道分泌物中に存在するウイルスは、ts表現型を保持していたが、これは第8日における3番のチンパンジーからのウイルスについても見られた。このウイルスは、40℃における力価が100倍減少しており、40℃において小プラーク表現型を示したが、このことは、その複製が依然として温度感受性であることを示している。これは、今日まで確認されたうちで最も遺伝的に安定なts変異株を表す。cpts248およびcpts530ウイルスのts表現型の増大した安定性は、インビボでts表現型に寄与する変異の遺伝的安定性に対するcp変異の効果を反映している。かくして、cp3131親株ウイルス中に存在する変異のうちのts変異は、それらが存在しない場合に予想されるよりも安定であると思われる。この重要な性質は、これまで観察されておらず、報告もされていない。cpts248によるチンパンジーの感染は、FおよびG糖タンパクに対する抗体だけでなく、高力価の中和抗体を誘発した(表6)。有意には、cpts248による免疫化は、RSV攻撃から動物を防御したが(表7)、このことは、この変異株がヒトと近い関係にある宿主において効果的なワクチンとして機能することを示している。
これらの上記発見は、cpts248ウイルスが生RSVワクチンにとって望ましい多くの性質、例えば:1)上気道および下気道に対する弱毒化;2)インビボでの複製後の(免疫抑制された動物中における持続複製の後でも)増大した遺伝的安定性;3)満足な免疫原性;および4)野生型RSVの攻撃に対する有意な防御効力を有することを示している。cpts530ウイルスは、cpts248と、類似したプラーク形成の温度感受性、類似したマウスの鼻甲介における複製の制限度、および、免疫不全のヌードマウスにおける高レベルの遺伝的安定性を有しており、それゆえ、これもまたRSウイルスワクチン株である。
さらなる弱毒化
RSウイルスは、チンパンジーよりもヒトにおける方が下気道疾患の症状を多く生じるので、また、チンパンジーに対して充分に弱毒化された変異体が血清反応陰性の乳児や児童に対してはそうでないかもしれないということを認識して、上気道における複製および弱毒化が制限され、遺伝的安定性が高レベルであるという非常に特徴的でないts変異株の性質を有するcpts248および530誘導体を、さらに変異誘発処理した。
cpts248より高度のインビボでの温度感受性を示し、小プラーク表現型を有する後代ウイルスを、さらなる研究用に選択した。1つまたはそれ以上の付加的なts変異を有していたcpts248の変異株誘導体は、5-フルオロウラシルを用いた変異誘発処理によって製造した(表8)。cpts248より温度感受性(ts)であるts変異体を同定したところ、これらのうちのいくつかは、小プラーク(sp)表現型を有していた。これらのcpts248誘導体をマウスに投与した。cpts248/804、248/955、248/404、248/26、248/18、および248/240変異株は、それらのcpts248親株ウイルスより、マウスの上気道および下気道における複製が制限されていた(表9)。かくして、cpts248より弱毒化されているcpts248の生育可能な変異株を同定したところ、cpts248のこれら誘導体は、マウスにおいて広範囲にわたる複製効率を示したが、ts248/26が最も制限されていた。マウスの鼻甲介および肺に存在するウイルスのts表現型は、入力ウイルスとほとんど同一であったが、このことは遺伝的安定性を示している。
cpts248の非常に弱毒化された誘導体であるcpts248/404ウイルスは、野生型と比べて、鼻咽頭における複製が1000倍制限されていた。少なくとも3つの弱毒化変異を有するcpts248/404変異株もまた、2匹の血清反応陰性のチンパンジーの上気道および下気道における複製が非常に制限されており、感染は鼻漏を誘発しなかった(表10)。また、このウイルスは、野生型と比べて、複製の高度な減少を示した(鼻咽頭では、60,000倍減少し、肺では、100,000倍減少した)。それにもかかわらず、これら2匹のチンパンジーは、RSV野生型ウイルスによる次の攻撃に対して非常に抵抗性であった(表11)。さらに、cpts530ウイルスのさらなるts誘導体も生成した(表12)。これらの結果は、本発明のRSウイルスの性質におけるなお一層の向上を表しており、また、RSウイルスワクチン株の開発における非常に重要で有意な進歩を表している。
これらの結果は、以前の研究の間に得られた経験に基づいても、完全には予想できなかった。例えば、初期の研究の結果は、5-フルオロウラシルを用いた1サイクルの変異誘発処理から誘導されたRSVts変異株のインビボでの性質は、先験的には予想できなかったことを示した。さらに、このようにして生成した最初の4つのts変異体のうちの1つは、プラーク形成に対して、他の変異株と同じ遮断温度を示したが、感受性を有するチンパンジーおよび感受性を有する乳児や低学年児童において試験したところ、過剰に弱毒化されていた[ライト(Wright)ら、インフェクション・アンド・イムニティ(Infec.Immum.)37巻(1):397-400頁(1982年)]。これは、プラーク形成に対する37°〜38℃の遮断温度をもたらすts表現型の獲得が、感受性を有するチンパンジー、乳児および児童に対して所望のレベルに弱毒化された変異株を信頼性よく与えなかったことを示していた。実際、従来公知のts変異株を用いた研究の結果は、低温継代した後、連続した2サイクルの化学的変異誘発処理によって、RSVに3つの独立した変異(または変異の組)を導入することが、チンパンジー(外挿によって、幼い乳児に)対する感染性を保持すると共に、RSV疾患の予防に用いるべき生ウイルスワクチンに必要とされる所望レベルの弱毒化、免疫原性および防御効力を示す可能な変異株を与えることができたと結論付ける何らかの根拠を完全には提供しなかった。
上に与えた結果は、明らかに、本発明のcpRSVのいくつかのts誘導体が感染性であり、マウスおよびチンパンジーに対して有意の弱毒化度を示すことを証明している。これらのts変異株誘導体は、弱毒化されており、インビボでの複製後でも、非常に遺伝的に安定であると思われる。これら変異株はまた、チンパンジーのRSV感染に対して有意の抵抗性を誘発する。かくして、これらcpRSV誘導体は、重篤なヒトRSV疾患を予防するように設計された生RSVワクチンへの使用に適するウイルス株である。
実施例II
cpRSV変異株を弱毒化する低温適応化の使用
本実施例では、温度を次第に低下させ、不完全に弱毒化された宿主制限cpRSV株をさらに継代することによって、これらの株へ増殖制限変異を導入し、ヒトのワクチン用として、さらに充分に弱毒化された誘導体株を製造することについて説明する。
このような低温適応化(cp)アプローチを用いて、cpRSV3131ウイルスへさらに弱毒化を導入したが、このウイルスは血清反応陰性の児童では不完全に弱毒化される。
最初の手順では、フロー・ラボラトリーズ(Flow Laboratories)から入手した低温継代RSV(cpRSV3131)の親株を、実施例Iで説明したように、MRC-5細胞中、25℃で継代することによって調製した。簡単には、低温継代ウイルスは、0.01以下の感染多重度で、MRC-5またはVero細胞単層培養中に導入し、感染した細胞を、次の継代前に3〜14日間、インキュベートした。ウイルスは、20〜22℃で20回継代し、さらに弱毒化されたウイルスを誘導した。急速継代の手法は、ウイルス複製の最初の証拠が明らかである限り(すなわち、3〜5日間)、低温で効率的に複製することが可能な変異株の選択にとって好ましかった。さらに、RSVサブグループB株であるセントルイス/14617/85クローン1A1を、初代アフリカングリーンモンキーの腎細胞中に単離し、MRC細胞(1A1-MRC14)中で継代し、クローン化し、これらの細胞中、32〜22℃で51回低温継代した。
第2の手順では、クローン化していない親株cpRSV3131ウイルスの生物学的にクローン化した誘導体を用いた。このウイルスは、ウシ胎児腎(BEK)細胞(cpRSV3131ウイルスを最初に誘導するのに用いた組織--フリードバルデら、ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(J.Amer.Med.Assoc.)204巻:690-694頁(1968年)を参照)中で生物学的にクローン化した。このクローン化したウイルスは、次いで、Vero細胞中、低温で10日間毎に継代した。あるいは、最終希釈(TD2P4)によって、MRC-5細胞中でcpRSV3131ウイルスをクローン化し、Vero細胞中で10日間毎に継代した。
第3の手順は、低温で大きいプラークを生産する変異株の選択を伴う。25℃で大きいプラークを生産するプラークD1と名付けたRSVcp3131誘導体ウイルスを同定した。このウイルスは、第3継代(P3)レベルのcp3131-1(BEK)系列cp3131-17(BEK)系列から誘導した。P3ウイルスによって生産された最大のプラークを32℃で増幅し、次いで、25℃で再びプラーク形成させた。もう1度、最大のプラークを選択し、増幅し、再びプラーク形成させた。このようなサイクルを5回繰り返した後、大プラーク変異株ウイルスD1を得た。D1は、25℃におけるプラーク・トゥー・プラーク精製(plaque-to-plaque purification)のサイクルをさらに2回繰り返すことによって、生物学的にクローン化した。
生物学的にクローン化したウイルスD1は、25℃でcp3131や野生型ウイルスA2より明瞭かつ均一で大きいプラークを生産する。かくして、D1は、25℃における大きいプラークサイズの生成によって、低温に適応している。予備的な研究によると、D1は温度感受性ではないと示唆された。37℃では、D1プラークは、野生型RSVやcp3131のものとは区別できないが、このことは、D1はこの温度で増殖が制限されていないことを示唆している。このことと一致して、D1は、37℃および40℃(すなわち、試験した最高温度)で、Vero細胞単層において広範囲の細胞変性効果を生じる。
実施例III
ts-RSVへのさらなる弱毒化変異の導入
本実施例では、ts変異株を親株ウイルスとして使用し、より完全に弱毒化した株を製造することについて説明する。この方法で、2つのRSV A2ts変異株、すなわちts-4およびts-1NG1を選択した。2つの異なる方法を選択して、RSVts変異株に付加的な変異を導入した。第1に、不完全に弱毒化したRSVts変異株を、化学的変異誘発処理に供し、プラーク形成に関して温度感受性がより高い変異を誘発した後代を選択し、さらに分析した。第2に、RSVts変異株を低温で継代し、ca表現型(すなわち、野生型親株ウイルスと比べて、至適温度以下での複製能力が増大している)を用いて、RSVts変異株を選択した。
ts-1NG1ウイルスの親株は、生きている呼吸器合胞体ウイルス(A-2)ts-1NG-1変異株、MRC-5増殖ウイルスのフロー・ラボラトリーズ(Flow Laboratories)ロットM2から調製した。この変異株は、5-フルオロウラシルを用いた2回の変異誘発処理によって、ts-1変異株から誘導されたものであり、2つまたはそれ以上の独立したts変異を有するが、依然として、感受性を有するチンパンジーにおいて実質的な鼻漏を誘発する。このウイルスを、Vero細胞中、32℃で2回継代し、変異誘発処理用のts-1NG-1懸濁液を調製した。このウイルスを、次いで、4×10-4Mの5-フルオロウラシルの存在下で増殖させて複製の間に変異を誘発するか、あるいは、5-フルオロウラシルで処理した後、36℃で5-アザシチジンに曝露した。変異誘発した株は、次いで、寒天重層で維持したVero細胞上でのプラークアッセイによって分析し、適当なインキュベート期間の後、プラークを顕微鏡で同定した。586個のプラークを選び、新鮮なVero細胞の単層上で増殖させることによって、各プラークの後代を別々に増幅した。Vero細胞に対する細胞変性効果が最大であると思われる時点で、変異誘発したts-1NG-1ウイルスの単一プラークの後代を接種した組織培養の各々の内容物を別々に採取した。ts-1NG-1より温度感受性である後代ウイルスは、HEp-2細胞上のこれらプラークプールの32℃および36℃での力価を測定することによって求めた。ts-1NG-1より高い温度感受性(すなわち、32℃と比べて、制限温度[36℃]の力価が100倍減少)を示すウイルスについては、さらに評価した。RSVts-1NG-1親株ウイルスよりtsである6つのプラーク後代を同定し、これらの株を、Vero細胞上における連続プラーク精製を3回行うことによって生物学的にクローン化した。クローン化した株は、32℃、35℃、36℃、37℃、および38℃での力価を測定し(プラーク形成の効率に関するアッセイ)、それらのts表現型を確認した。HEp-2細胞上でのアッセイによって得られたプラーク形成の効率に関するデータは、さらに6つの変異株の表現型を確認した(表13)。
2つの最もtsなウイルスであるA-20-4およびA-37-8は、それらのts-1NG-1親株ウイルスと比べて、マウスでは非常に弱毒化されていたが、このことは、増大したレベルの温度感受性の獲得が、増強した弱毒化によって達成されたことを示す(表14)。これらのウイルスは、それらが抗体応答を誘発したことから、マウスに対して感染性であった。ts-1NG1/A-20-4ウイルスは、チンパンジーに対して弱毒化され(表15)、ts-1NG1/A-20-4によるチンパンジーの感染は野生型ウイルスの攻撃に対する抵抗性を増大させた(表16)。有意に、鼻漏は生じない。
ts-1NG1ウイルスの変異誘発処理と同じ方法を用いて、ts-4ウイルスの変異誘発処理をも実施した。RSVts-4親株ウイルスよりtsである5つのプラーク後代を同定した(表17)。
また、低温継代によって、ts-1NG-1ウイルスおよびts-4ウイルスに変異を導入した。ts-4ウイルスは、38回の低温継代後、22℃にて、高力価で複製する。
ヒトにおける研究
本発明の弱毒化ウイルスは、例えば、ライト(Wright)ら、インフェクション・アンド・イムニティ(Infect.Immun.)37巻;397-400頁(1982年)、キム(Kim)ら、ペディアトリックス(Pediatrics)52巻:56-63頁(1973年)、およびライト(Wright)ら、ジャーナル・オブ・ペディアトリックス(J.Pediatr.)88巻:931-936頁(1976年)(これらは出典を示すことによって明細書の一部とする)に記載されている充分に確立されたヒトRSワクチンプロトコルに従って、ヒト被験者に投与される。簡単には、成人または児童には、容量が0.5mlで、1mlあたり103〜105PFUの弱毒化ウイルスを含む小滴によって、鼻腔内に接種される。補体結合、プラーク中和、および/または酵素結合免疫吸着検定法によって、抗体応答を評価する。上気道疾患の徴候および症状について、個体をモニターする。チンパンジーに投与すると、ワクチンの弱毒化ウイルスは、ワクチン被接種者の鼻咽頭内にて、野生型ウイルスより約10倍以上またはそれより一層低いレベルで、また、cpRSVまたは他の不完全弱毒化親株のレベルと比べた場合には、約10倍またはそれ以下のレベルで増殖する。充分なレベルの防御免疫を維持するために、これら個体には、必要に応じて、次の免疫化が周期的に施される。
上記のことから、ここでは、説明および理解を目的として、本発明の特定の態様について説明してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変更を行いうることは認められるであろう。したがって、本発明は、添付の請求の範囲によって限定されることはない。
Claims (3)
- 生理学的に許容される担体中に、宿主範囲を制限された低温継代呼吸器合胞体ウイルスの温度感受性変異株、宿主範囲を制限された低温継代呼吸器合胞体ウイルスの低温適応変異体、または、さらに温度感受性変異を有する温度感受性呼吸器合胞体ウイルス変異株から選択される、少なくとも2つの弱毒化変異を有する少なくとも1種の弱毒化呼吸器合胞体ウイルスを含有するワクチン組成物であって、該弱毒化呼吸器合胞体ウイルスがRSV A2 cpts−248(ATCC VR 2450)、RSV A2 cpts−248/404(ATCC VR 2454)、RSV A2 cpts−248/955(ATCC VR 2453)、RSV A2 cpts−530(ATCC VR 2452)、RSV A2 cpts−530/1009(ATCC VR 2451)、およびRSV A2 cpts−530/1030(ATCC VR−2455)からなる群から選択される、ワクチン組成物。
- さらに、免疫応答を増強するアジュバントを含有する請求項1記載のワクチン組成物。
- 弱毒化ウイルスが10 3 〜10 6 PFUの用量で処方された請求項1記載のワクチン組成物。
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US20050287540A1 (en) * | 1995-09-27 | 2005-12-29 | Murphy Brian R | Production of attenuated negative stranded RNA virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
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DE69720024D1 (de) * | 1996-07-12 | 2003-04-24 | Aventis Pasteur | Immunisierungsverfahren in zwei schritten gegen pyramyxoviridae-viren unter verwendung abgeschwächter viraler stämme und preparation von proteinuntereinheiten |
US6699476B1 (en) | 1996-07-15 | 2004-03-02 | Peter L. Collins | Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules |
CA2257823A1 (en) * | 1996-07-15 | 1998-01-22 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secreta Ry Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of | Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
BR9712138A (pt) * | 1996-09-27 | 2000-01-18 | American Cyanamid Co | Vìrus de rna isolado, vacina, processo para imunizr um indivìduo para induzir proteção contra um vìrus de rna não segmentado, sentido negativo, de filamento único, da ordem mononegavirales e para produzir vìrus de rna, molécula de ácido nucleico isolada e composição. |
US20030082209A1 (en) | 2000-07-05 | 2003-05-01 | Skiadopoulos Mario H. | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
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FR2764903A1 (fr) * | 1997-06-23 | 1998-12-24 | Pasteur Institut | Detection des infections par des paramyxovirus (virus respiratoire syncitial et virus parainfluenza) utilisant des polynucleotides codant de la proteine l |
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EP1690940A1 (en) | 1999-04-13 | 2006-08-16 | The Government of the United States of America as Represented by The Department of Health and Human Services | Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
ATE419369T1 (de) | 1999-07-09 | 2009-01-15 | Us Gov Health & Human Serv | Chimäre mensch-rinder respiratory syncytial virus vakzinen |
US7820182B2 (en) * | 1999-07-09 | 2010-10-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of attenuated, human-bovine chimeric respiratory syncytial viruses for use in immunogenic compositions |
ATE350056T1 (de) | 2000-04-03 | 2007-01-15 | Univ Pittsburgh | Zusammensetzungen, die kälteangepasste pferdeinfluenzaviren enthaltende, für die behandlung von bestehende virusinfektionen des atmungssystems |
CN100333792C (zh) * | 2001-09-28 | 2007-08-29 | 南佛罗里达大学 | Rsv基因表达疫苗 |
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US7465456B2 (en) * | 2002-04-26 | 2008-12-16 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
CA2499042A1 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Medimmune Vaccines, Inc. | Functional mutations in respiratory syncytial virus |
US7687240B2 (en) * | 2003-03-18 | 2010-03-30 | Wyeth Holdings Corporation | Process for increasing RSV surface glycoprotein yields using a mutant strain of RSV |
DE602004027362D1 (de) * | 2003-03-28 | 2010-07-08 | Medimmune Llc | Zusammensetzungen und verfahren mit dem respiratory syncytial virus untergruppe b stamm 9320 |
US7566458B2 (en) | 2003-06-16 | 2009-07-28 | Medimmune, Llc | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
BRPI0417672A (pt) * | 2003-12-17 | 2007-03-20 | Wyeth Corp | processos para produzir composições de vìrus estáveis em armazenamento, composições de vìrus e imunogênicas |
AU2004308328B2 (en) * | 2003-12-23 | 2009-06-04 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
US7527800B2 (en) | 2004-05-25 | 2009-05-05 | Medimmune, Llc | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
WO2006098901A2 (en) * | 2005-03-08 | 2006-09-21 | Medimmune Vaccines, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
WO2008133701A1 (en) * | 2006-07-21 | 2008-11-06 | Medimmune, Llc. | Methods and compositions for increasing replication capacity of an influenza virus |
EP2056872A4 (en) * | 2006-08-09 | 2016-12-21 | Medimmune Llc | HEMAGGLUTININ AND NEURAMINIDASE VARIANTS OF FLU |
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US20090017517A1 (en) * | 2007-07-13 | 2009-01-15 | Medimmune, Llc | Preparation of Negative-Stranded RNA Viruses by Electroporation |
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SG173642A1 (en) * | 2009-02-12 | 2011-09-29 | Medimmune Llc | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
GB201003630D0 (en) | 2010-03-04 | 2010-04-21 | Novartis Ag | Avian rotavirus |
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Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US4866034A (en) * | 1982-05-26 | 1989-09-12 | Ribi Immunochem Research Inc. | Refined detoxified endotoxin |
US4800078A (en) * | 1987-05-28 | 1989-01-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Immunotherapeutic method of treating respiratory disease by intranasal administration of Igb |
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