HU220189B - Gyengített légzési syncytialis vírus vakcinakészítmények - Google Patents
Gyengített légzési syncytialis vírus vakcinakészítmények Download PDFInfo
- Publication number
- HU220189B HU220189B HU9403023A HU9403023A HU220189B HU 220189 B HU220189 B HU 220189B HU 9403023 A HU9403023 A HU 9403023A HU 9403023 A HU9403023 A HU 9403023A HU 220189 B HU220189 B HU 220189B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- rsv
- attenuated
- vaccine composition
- cpts
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18561—Methods of inactivation or attenuation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Vertical, Hearth, Or Arc Furnaces (AREA)
Description
Az emberek légzési syncytiális (RS) vírus fertőzése tünetmentestől a súlyos légúti betegségig változhat. Csecsemőkben és gyermekekben az RS vírust (RSV) tekintik az alsó légúti betegségek legfontosabb okozójának a Föld minden geográfiai területén. Az RS vírus túlszárnyalja az összes egyéb mikrobás patogént a pneumonia és a bronchiolitis okozójaként egyévesnél kisebb gyermekekben, és az ilyen gyermekekben ez a fő okozója a halálos végű légúti betegségeknek. Kétéves korára úgy tűnik, hogy minden gyermek fertőződik. Nagyobb gyermekekben és fiatal felnőttekben az újrafertőződés figyelemreméltó gyakorisággal következik be [Chanock és munkatársai, Viral Infections of Humans, 3. kiadás, szerkesztő A. S. Evans, Plenum Press, N. Y. (1989)]. Noha az egészséges felnőttekben az RS vírusfertőzés nem okoz komoly betegséget, idősebb betegekben és gyengült immunrendszerű személyekben sokkal gyakoribb a súlyos, sőt életveszélyes fertőzések felléptének veszélye.
Az RSV-fertőzések kezelése problematikus. A kisgyermekek csökkent szérum- és szekréciós antitestválasszal rendelkeznek RSV antigénekre, és így súlyosabb fertőzéseket szenvednek, míg a kumulatív immunitás úgy tűnik, hogy védi a nagyobb gyermekeket és felnőtteket a fertőzés komolyabb formái ellen. Egyetlen antivirális vegyület, a ribavirin mutatkozott ígéretesnek súlyosan fertőzött gyermekek kezelésében, anélkül, hogy megrövidítette volna a kórházi tartózkodás időtartamát, vagy csökkentené a kiegészítőterápiák szükségességét. Újabban az RSV-fertőzésekben az immunitás mechanizmusa került előtérbe. A szekréciós antitestek tűnnek a legfontosabbnak a felső légutak védelmében, míg az alsó légutak RSV-fertőzésekkel szembeni rezisztenciájában a szérumantitesteket vélik a legfontosabbnak. Az RSV-t semlegesítő antitestek magas titerét tartalmazó, tisztított humán immunglobulin hasznos lehet a súlyos alsó légúti megbetegedések immunterápiás kezelésében csecsemők és kisgyermekek esetén. Az immunglobulin-készítményeknek azonban számos hátránya van, így például a vérben lévő vírusok átvitelének lehetősége és az előállítás és raktározás nehézsége és költségei.
Az RS vírus elleni hatékony vakcina iránti sürgető szükség ellenére - különösen csecsemők és kisgyermekek számára - a hatékony és biztonságos vakcina kifejlesztésére irányuló kísérletek nem jártak sikerrel. Az 1960-as évek közepén tesztelt, formaiinnal inaktivált vírusvakcina nem adott védelmet az RS vírusfertőzés vagy megbetegedés ellen. Ehelyett a betegség még fokozódott is egy RS vírus általi újabb fertőzés során [Kim és munkatársai, Am. J. Epidemiol, 89, 422-434 (1969), Chin és munkatársai, Am. J. Epidemiol, 89, 449-463 (1969); Kapikian és munkatársai, Am. J. Epidemiol, 89, 405-421 (1969)].
Az inaktivált vakcinákkal és a neutralizációs epitópok lehetséges változásával kapcsolatos problémák elkerülése érdekében a kutatások a gyengített RS mutánsokra irányultak. Friedewald és munkatársai [J. Amer. Med. Assoc., 204, 690-694 (1968)] ismertették egy alacsony hőmérsékleten passzált RS vírusmutáns előállítását, amely úgy tűnt, hogy elegendő mértékben gyengített ahhoz, hogy vakcinát lehessen belőle előállítani. Ez a mutáns kissé jobban tudott szaporodni 26 °C-on, mint a vad típusú szülővírus, de replikációja nem volt sem hőmérséklet-érzékeny, sem jelentősen hideget igénylő. A hidegen passzált mutáns azonban felnőttekre nézve gyengített volt. Noha a korábban RSV-vel fertőzött gyermekekben és csecsemőkben (azaz a szeropozitív egyedekben) a mutáns kielégítően gyengített és immunogén volt, a szeronegatív csecsemők felső légútjaiban megtartotta kismértékű virulenciáját. Ezt az RSV-mutánst marhavese-sejttenyészetben passzálták alacsony hőmérsékleten (26 °C-on) és ennek következtében gazdaspecifikus gyengített mutációk alakultak ki. Ezen mutációk kialakulása lehetővé tette, hogy a mutáns megfelelően replikálódjon marhaszövetben, míg ugyanezen mutációk megakadályozták a mutáns szaporodását emberi légutakban, szemben a szülői A2 RSV törzzsel.
Gharpure és munkatársai [J. Virol, 3, 414-421 (1969)] ismertették hőmérséklet-érzékeny (ts) mutánsok izolálását, amelyek szintén ígéretesek voltak vakcinálás szempontjából. Egy mutánst - a ts-l-et laboratóriumban - önkénteseken részletesen kiértékelték. A mutáns felnőtt önkéntesekben tünetmentes fertőzést produkált, és rezisztenciát biztosított az immunizálás után 45 nappal bekövetkező vad típusú vírusfertőzéssel szemben. Azonban, míg a szeropozitív csecsemők és gyermekek aszimptómás fertőzésen mentek át, a szeronegatív csecsemőkben rhinitis és egyéb enyhe tünetek jelei fejlődtek ki. Ezenkívül kimutatták, hogy a ts fenotípus instabil, noha a hőmérséklet-érzékenységüket részlegesen vagy teljesen elvesztő vírusok csak kis hányadát tették ki a vakcinákból visszanyerhető vírusoknak, és nem okoztak enyhe rhinitisen kívül egyéb betegségtüneteket.
A tanulmányokból így kitűnt, hogy a hidegen paszszált vagy hőmérséklet-érzékeny törzsek közül némelyik nem volt eléggé gyengített, és enyhe betegségtüneteket okozott bizonyos vakcinákban, különösen szeronegatív csecsemők esetén, míg mások túlságosan gyengítettek voltak, és nem tudtak megfelelő mértékben replikálódni ahhoz, hogy védő immunválaszt váltsanak ki [Wright és munkatársai, Infect. Immun., 37, 397-400 (1982)]. A genetikus instabilitás - amely lehetővé tette, hogy a vakcinamutánsok elveszítsék hőmérséklet-érzékeny fenotípusukat - szintén kiábrándító felismerés volt [Hodes és munkatársai, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 145, 1158-1164 (1974); Mclntosh és munkatársai, Pediatr. Rés., 8, 689-696 (1974) és Belshe és munkatársai, J. Med. Virol., 3, 101-110 (1978)].
A gyengített RS vírusvakcina-megoldást elvetve a kutatók speciális alegységvakcinákat kezdtek vizsgálni, fertőzött sejtek lizátumából származó, tisztított RS vírusburok-glikoproteinek alkalmazásával. A glikoproteinek RS vírusfertőzéssel szembeni rezisztenciát indukáltak mezei patkányok tüdejében [Walsh és munkatársai, J. Infect. Dis. 155, 1198-1204 (1987)], de az indukált antitestek igen gyenge neutralizálóaktivitást mutattak, és a rágcsálók tisztított alegységvakcinával végzett immunizálása a betegség felerősítéséhez vezetett [Murphy és munkatársai, Vaccine, 8, 497-502 (1990)].
HU 220 189 Β
Alkalmaztak rekombináns vacciniavírus-alapú vakcinákat is, amelyek F vagy G burok-glikoproteint expresszálnak. Ezek a rekombinánsok RSV-glikoproteineket expresszálnak, amelyek az autentikus virális megfelelőtől nem különböztethetők meg, és a vaccinia-RSV F és G rekombináns vírusokkal intradermálisan fertőzött kis rágcsálókban specifikus antitestek magas koncentrációja alakul ki, amely semlegesíti a vírus fertőzőképességét. Valóban, mezei patkányok fertőzése vaccinia-Frekombinánsokkal majdnem teljes rezisztenciát eredményezett RSV-replikációval szemben az alsó légutakban, és jelentős rezisztenciát a felső légutakban [Olmsted és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 7462-7466 (1986)]. Azonban csimpánzok immunizálása vaccinia-F- és vaccinia-G-rekombinánsokkal szinte semmi védelmet nem adott RSV-fertőzéssel szemben [Collins és munkatársai, Vaccine, 8, 164-168 (1990)]. Ebből arra következtettek, hogy ezzel a megoldással valószínűleg nem lehet megfelelő vakcinát kapni.
Az évek során a kutatók számos különféle megközelítést vizsgáltak meg a hatékony és biztonságos RSvakcinák előállítása szempontjából. Az RS vírus csecsemőkben és gyermekekben a súlyos, virális eredetű alsó légúti betegségek leggyakoribb okozója maradt. Ezért nagy szükség van egy olyan biztonságos vakcina előállítására, amely a népesség ezen csoportjában - és egyéb személyekben is - képes e súlyos, gyakran kórházi ápolást igénylő betegség megelőzésére. Meglepő módon a találmány szerinti megoldással ez a szükséglet kielégíthető.
A találmány gyengített légzési syncytiális vírust tartalmazó vakcinakészítményekre vonatkozik. A készítmény humán gazdaszervezetben immunválasz indukálására elegendő mennyiségű gyengített vírust tartalmaz fiziológiásán elfogadható hordozóanyagban, és adott esetben adjuvánst is tartalmazhat a gazdaszervezet immunválaszának fokozására. Ismertetjük a gyengített RS vírus különböző antigén alcsoportjait is, amelyek nem teljesen gyengített RS vírusból származnak, és amelyek a szakirodalomban korábban ismertetett gyengített RS vírusoktól eltérő tulajdonságokkal rendelkeznek. A találmány egyik kiviteli alakjában a találmány szerinti gyengített vírus egy hidegen passzálással nem teljesen gyengített, gazdaspecifikus RS vírus (cpRSV), amelybe legalább egy vagy több további mutációt vezettünk be, amellyel a vírust vagy annak utódját hőmérsékletérzékeny (ts) fenotípusúvá alakítottuk, ezt a továbbiakban cptsRSV-nek nevezzük. Egy másik kiviteli alakban a hidegen passzálással nem teljesen gyengített, gazdaspecifikus RS vírust (cpRSV) hideget igénylővé (ca) tettük egyre alacsonyabb hőmérsékleteken végzett passzálással, és ezzel további szaporodást gátló mutációkat vezettünk be. Egy újabb kiviteli alakban a nem teljesen gyengített RSV ts mutánsokat, például az RSV ts-4-et és a ts—1 NGl-et tovább gyengítettük újabb mutációk bevezetésével. A ts vagy cp törzsek gyengített származékait különféle módokon állítottuk elő, előnyösen újabb hőmérséklet-érzékeny mutációk bevezetésével kémiai mutagenezissel, további passzázsokkal 20-24 °C-os, gyengítő hőmérsékleteken, vagy kis plakk-(sp-) mutációk bevezetésével, és azon származékok szelektálásával, amelyek gyengébben szaporodnak, mint a nem teljesen gyengített szülői mutáns törzs. A találmány szerinti gyengített vírus vagy az A vagy a B antigénalcsoporthoz tartozik, és mindkét alcsoportból származó vírus célszerűen kombinálható a vakcinakészítményekben a legelterjedtebb RSV-fertőzések elleni még hatékonyabb védelem céljából. A vakcina rendszerint mintegy 103-106 plakk-képző egységet (PFU) tartalmaz egy dózisban, de a maximális hatékonyság elérésére ennél többet is tartalmazhat.
A találmány szerinti vakcinakészítmény az egyedek immunrendszerének stimulálására alkalmazható a légzési syncytiális vírus elleni védelem kialakítása céljából. Az eljárás értelmében az egyednek immunológiailag hatásos mennyiségben eredetileg ts mutáció(k)val, vagy alacsony hőmérsékleteken, például 26 °C-on végzett passzálással nem teljesen gyengített, RSV-be ts, ca és/vagy sp fenotípust meghatározó mutációk bevezetésével gyengített RSV-t adunk. Tekintettel az RSV-fertőzések potenciálisan komoly következményeire újszülöttekben, szeronegatív vagy szeropozitív csecsemőkben és kisgyermekekben, valamint idősebbekben, ezen emberek számára a legelőnyösebb a találmány szerinti eljárással történő immunizálás. A legtöbb esetben a gyengített RS vírust a kezelendő személy légútjába adagoljuk, előnyösen intranazálisan aeroszol vagy csepp formájában.
A találmány továbbá gyengített RS vírus tiszta tenyészeteire vonatkozik, amelyekben a vírus a korábban azonosított ts vagy cp mutánsok további derivatizálásával még jobban gyengített. A gyengített vírus képes immunválaszt kiváltani egy fertőzött humán gazdaszervezetben, mégis megfelelő mértékben gyengített ahhoz, hogy az immunizált gazdában ne váltson ki súlyos légzési betegségre utaló megengedhetetlen tüneteket. A gyengített vírus a sejttenyészet felülúszójában lehet jelen, a tenyészetből izolálható, és részben vagy teljesen tisztítható. A vírust liofilizálhatjuk is, és különféle egyéb komponensekkel kombinálhatjuk tárolás céljából, vagy a gazdaszervezetbe történő bevitelhez.
A találmány tárgya egyrészt RS vírus, amely vakcinaként alkalmazható emberben. A találmány szerinti RS vírust a nem teljesen gyengített ts vagy cp RS vírustörzsekbe további mutációk bevezetésével állítjuk elő. A mutációkat a törzsekbe a vírus szaporítása során vezetjük be sejttenyészetben, amelyhez kémiai mutagént adtunk; a szaporodást csökkentő mutációk bevezetésére szuboptimális hőmérsékleten passzáltunk vírus szelektálásával, vagy sejttenyészetben kis telepeket képező mutagenizált vírus szelektálásával.
A találmány szerinti vakcina egy gyengített RS vírust és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmaz. A vakcinát immunogén hatást kiváltó mennyiségben adagoljuk az RS vírus elleni immunológiai védelmet igénylő egyednek, például csecsemőnek, gyermeknek vagy idősebb embernek, vagy immunszuppresszív terápiában részesülő felnőttnek. A vakcina immunválaszt vált ki, amely a súlyos alsó légúti fertőzések, például pneumonia és bronchiolitis elleni védelmet ad, ha az egyén vakcinálást követően vad típusú RS vírussal
HU 220 189 Β fertőződik. Noha a természetben előforduló vírus még képes fertőzést okozni, különösen a felső légutakban, a vakcinálás eredményeképpen a rhinitis lehetősége nagymértékben csökken, és a rezisztencia erősíthető is vad típusú vírussal történő fertőzéssel a vakcinálást követően. A vakcinálást követően a gazdában kimutatható mennyiségben szérum- és szekréciós antitestek termelődnek, amelyek képesek a homológ (ugyanazon alcsoportba tartozó) vad típusú vírus in vitro és in vivő semlegesítésére. Sok esetben a gazdaantitestek a vakcinától eltérő altípusba tartozó vad típusú vírus semlegesítésére is képesek. A nagyobb mértékű keresztvédelem, azaz az egyéb alcsoportba tartozó heterológ törzsek elleni védelem elérésére az egyedeket előnyösen mindkét, A és B alcsoport legalább egy-egy predomináns törzséből származó gyengített vírussal vakcináljuk.
A vakcina komponensét képező gyengített vírus izolált és szokásos módon tisztított formában van. Izolált alatt olyan gyengített, módosított RS vírust értünk, amely a vad típusú vírus natív környezetétől, például a fertőzött egyed garatétól eltérő helyen fordul elő. Még általánosabban izolált alatt olyan gyengített vírust értünk, amely egy sejttenyészet vagy egyéb rendszer heterológ komponensét képezi. így például a találmány szerinti gyengített RS vírust fertőzött sejttenyészetben állíthatjuk elő, a sejttenyészetből elválaszthatjuk, és olyan stabilizátorhoz adhatjuk, amely egyéb, nem természetben előforduló RS vírusokat tartalmaz, például olyan vírusokat, amelyeket az F-protein elleni semlegesítő monoklonális antitestekkel szembeni rezisztencia általi gyengítettség alapján szelektáltunk például a 15280-11-2 aktaszámú US szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, amelynek teljes tartalmára referenciaként leírásunkban utalunk.
A találmány szerinti gyengített RS vírus virulenciája lényegesen kisebb, mint az emberben természetesen keringő vad típusú vírusé. A gyengített vírus oly mértékben gyengített, hogy az immunizált egyedek többségében nem jelentkeznek fertőzési tünetek. Néhány esetben a gyengített vírus mégis képes a nem vakcináit egyedekben szóródni. Azonban virulenciája lényegesen csökkent, úgyhogy súlyos alsó légúti fertőzések a vakcináit vagy a véletlenszerű gazdákban nem fordulnak elő.
A gyengítés mértékét például úgy határozhatjuk meg, hogy meghatározzuk az immunizált gazda légútjában jelen lévő vírus mennyiségét, és ezt összehasonlítjuk a vad típusú RS vírus vagy az egyéb, vakcinatörzsként kiértékelt gyengített RS vírusok által produkált mennyiséggel. így például a találmány szerinti gyengített vírus replikációja jelentős mértékben gátolt egy nagyon érzékeny gazda, például csimpánz felső légútjában a vad típusú vírus replikációjához viszonyítva, például 10-szer-1000-szer kisebb. Hasonlóképpen a találmány szerinti gyengített RSV vakcinavírustörzs replikációjának mértéke a csimpánzok felső légútjában kisebb lesz, mint a nem teljesen gyengített RSV A2 ts-1 mutánsé. A vírus felső légútban való replikációjával kapcsolatos orrfolyás kialakulásának további csökkentése érdekében az ideális vakcinavírus replikációjának mind a felső, mind az alsó légútban csökkent mértékűnek kell lennie. Azonban a találmány szerinti gyengített vírusnak megfelelő mértékben fertőzőnek és immunogénnek kell lennie emberben, hogy a vakcináit egyedben védelmet biztosítson. Szakirodalomból jól ismertek azok a módszerek, amelyek alkalmasak a fertőzött gazda orrgaratában jelen lévő RS vírusok mennyiségének meghatározására. A mintákat az orrgarati szekrétumok kiszívásával vagy kimosásával kapjuk, és a vírus menynyiségét szövettenyészetben vagy egyéb laboratóriumi eljárással határozzuk meg [lásd például Belsche és munkatársai, J. Med., Virology 1, 157-162 (1977), Friedewald és munkatársai, J. Amer. Med. Assoc., 204, 690-694 (1968); Gharpure és munkatársai, J. Virol, 3, 414-421 (1969); és Wright és munkatársai, Arch. Ges. Virusforsch, 41, 238-247 (1973)]. A vírust célszerűen a gazdaállat, például csimpánz orrgaratában méljük.
A találmány szerinti megfelelően gyengített, derivatizált vírusok előállítására a mutációkat egy olyan szülői vírustörzsbe visszük be, amelyet előzetesen nem teljesen, vagy részlegesen gyengítettünk, ilyenek például a ts-1 vagy ts-4 mutánsok, vagy a cpRSV. Az A alcsoportba tartozó vírus esetén a nem teljesen gyengített szülői vírus előnyösen ts-1 vagy ts-1 NG-1 vagy cpRSV, ezek az A alcsoportba tartozó A2 törzs mutánsai, vagy annak származékai vagy szubklónjai.
A B alcsoportba tartozó vírusok részlegesen gyengített mutánsait a vad típusú B alcsoportba tartozó vírusok biológiai klónozásával állíthatjuk elő megfelelő sejtszubsztrátban, és a hidegen passzált mutánsok kialakításával; a vírust kémiai mutagenézisnek alávetve előállítjuk a ts-mutánsokat; vagy kiszelektáljuk azok kis plakkot képező mutánsait. A különböző szelekciós technikákat kombinálhatjuk az A vagy B alcsoportba tartozó részlegesen gyengített mutánsok előállítására, amelyek a találmány szerinti további derivatizálásra alkalmazhatók.
A kívánt, részlegesen gyengített szülői törzs(ek) kiválasztása után a találmány szerinti, emberekben alkalmazható vakcina előállításához szükséges további gyengítést az alábbiakban ismertetett különféle eljárásokkal végezhetjük.
A találmány értelmében a cp-mutánst különféle eljárásokkal tovább mutagenizálhatjuk. Az eljárás egyik kiviteli módja szerint a részlegesen gyengített vírust sejttenyészetben passzáljuk fokozatosan csökkentett, gyengítő hőmérsékleteken. így például míg a vad típusú vírust jellegzetesen körülbelül 34-35 °C-on tenyésztjük, a részlegesen gyengített mutánsokat sejttenyészetekben (például primer marhavesesejtekben) szuboptimális hőmérsékleten, például 26 °C-on történő passzálással állítjuk elő. Ezek a mutánsok kismértékben, de határozottan hideghez való hozzászokást (ca) mutatnak, azaz nagyobb mértékben szaporodnak 26 °C-on, mint a vad típusú szülői vírus, de tipikusan nem hőmérséklet-érzékenyek (ts). így a találmány szerinti egyik eljárás értelmében a cp-mutánst vagy más, részlegesen gyengített törzset, például ts-l-et vagy sp-t alkalmassá tesszük arra, hogy alacsonyabb hőmérsékleten kielégítő mértékben szaporodjon azáltal, hogy MRC-5 vagy Verő sejtekben alacsonyabb hőmérsékleten, körülbelül 20-24 °C4
HU 220 189 Β on, előnyösen 20-22 °C-on passzáljuk ezeket. Az RS mutáns vírus ilyen szelekciója a hidegen passzálás során lényegében eliminálja a derivatizált törzs maradék virulenciáját a részlegesen gyengített szülőhöz viszonyítva.
A találmány szerinti eljárás másik kiviteli módja szerint a nem teljesen gyengített törzseket kémiai mutagenezisnek alávetve vezetjük be a ts-mutációkat, vagy a már ts-mutáns vírusok esetében további ts-mutációkat alakítunk ki, amelyek alkalmasak a ts fenotípus fokozott stabilitását biztosítani a gyengített származékban. A ts-mutációk RS vírusokba való bevezetésére például a vírust egy mutagén, így például 5-fluor-uridin vagy 5-fluor-uracil körülbelül 10~3-10-5 mol/l, előnyösen körülbelül 10~4 mol/l koncentrációjának jelenlétében szaporítjuk, vagy a vírust nitro-guanidin hatásának tesszük ki körülbelül 100 pg/ml koncentrációban (lásd például Gharpure és munkatársai, J. Virol, 3, 414-421 (1969) és Richardson és munkatársai, J. Med. Virol, 3, 91-100 (1978) eljárását]. Egyéb kémiai mutagéneket is alkalmazhatunk. Gyengítés származhat ts-mutációból majdnem minden RS vírusgénben. A találmány szerinti gyengített RS vírus replikációjának hőmérsékletérzékenységét úgy határozhatjuk meg, hogy a replikációt megengedő (permisszív) hőmérsékleten való szaporodást a különféle korlátozó (restriktív) hőmérsékleteken való szaporodással hasonlítjuk össze. Azt a legalacsonyabb hőmérsékletet, amelyen a vírus replikációja századrészére vagy még nagyobb mértékben csökken a megengedő hőmérsékleteken való replikációhoz képest, shut-off hőmérsékletnek nevezzük. Az állatokkal és emberekkel végzett kísérletekben az RS vírusnak mind a replikációja, mind a virulenciája korrelációban van a mutáns shut-off hőmérsékletével. A 39 °C shutoff hőmérsékletű mutánsok replikációja enyhén korlátozott, míg a 38 °C shut-off hőmérsékletű mutánsok kevésbé jól replikálódnak, és a betegség tünetei főleg a felső légútra korlátozódnak. A 35-37 °C shut-off hőmérsékletű vírusnak teljesen gyengítettnek kell lennie emberben. Ennek megfelelően a találmány szerinti hőmérséklet-érzékeny, gyengített RS vírus shut-off hőmérséklete körülbelül 35-39 °C lesz, előnyösen 35-38 °C. Egy részlegesen gyengített vírus tulajdonságainak kiegészítése a hőmérsékletre való érzékenységgel teljesen gyengített vírust eredményez, amely a találmány szerinti vakcinakészítményekben alkalmazható.
Az életképesség, gyengítettség és immunogén jelleg kritériumain kívül a szelektált származékok tulajdonságainak a lehető legstabilabbnak kell lennie ahhoz, hogy a kívánt tulajdonságok fenntarthatok legyenek. Az in vivő replikációt követően a ts fenotípus genetikus instabilitása szabályszerű a ts vírusok esetén [Murphy és munkatársai, Infect and Immun., 37, 235-242 (1982)]. Ideális esetben a találmány szerinti vakcinákban alkalmazható vírusnak meg kell tartania életképességét, gyengített jellegét, az immunizált gazdában való szaporodási képességét (noha kisebb mértékben), és azon képességét, hogy megfelelő mértékű immunválaszt váltson ki a vakcináit egyedben, amely elegendő a vakcinálást követően egy vad típusú vírussal való fertőzés okozta komoly betegség elleni védelem biztosítására. Az ez idáig ismert RS vírusmutánsok nyilvánvalóan nem elégítették ki a fenti összes kritériumot. Az ismert, gyengített RS vírusokkal kapott eredményekre alapozott elvárásokkal szemben a találmány szerinti vírusok némelyike - amelyek minimálisan két vagy három eltérő mutációval rendelkeznek - nemcsak életképesek és jobban gyengítettek, mint az ismert mutánsok, hanem genetikailag stabilabbak in vivő, mint a korábban tanulmányozott mutánsok, megtartják védő immunválaszt stimuláló képességüket, és bizonyos esetekben szélesebb körű védelmet biztosítanak a többszörös módosítások révén, például különféle vírustörzsek vagy-alcsoportok elleni védelmet indukálnak, vagy eltérő immunológiai alapon védenek, például szekréciós immunitással szemben a szérum-immunglobulinokkal, celluláris immunitással és hasonlókkal.
A találmány szerinti gyengített vírusok szaporítását különféle sejtvonalakban végezhetjük, amelyekben az RS vírus szaporodni képes. Az RS vírus különféle humán és állati sejtekben szaporodik. A vakcinakészítésre alkalmas gyengített RS vírus szaporítására előnyös sejtvonalak például a DBS-FRhL-2, az MRC-5 és a Verő sejtek. A legmagasabb hozamokat rendszerint heteroploid sejtvonalakkal, például Verő sejtekkel kapjuk. A sejteket rendszerint körülbelül 0,001 -1,0-szeres vagy többszörös fertőző dózissal inokuláljuk, és a vírus replikációját megengedő körülmények között tenyésztjük, például 30-37 °C-on körülbelül 3-5 napon keresztül, vagy a vírus megfelelő titerének létrejöttéhez szükséges időn át. A vírusokat a sejttenyészetből eltávolítjuk, a celluláris komponensektől ismert tisztítási eljárásokkal, például centrifúgálással elválasztjuk, és kívánt esetben szakemberek számára jól ismert eljárások alkalmazásával tovább tisztítjuk.
A fentiek szerint gyengített RS vírusokat in vitro és in vivő modellekben tesztelhetjük a vakcinakészítéshez szükséges megfelelő gyengítettség, genetikus stabilitás és immunogén jelleg kimutatása céljából. Az in vitro meghatározásokban a módosított vírust kis plakk fenotípusra teszteljük. A módosított vírusok tesztelését RSfertőzés kimutatására alkalmas állatmodellekben végezzük. Különféle állatmodellek ismertek, ezeket összefoglalóan Meignier és munkatársai írták le [Animál Models of Respiratory Syncytial Vírus Infection, Merieux Foundation Publication (1991)]. Az RS-fertőzés mezeipatkány-modelljét az US 4 800 078 számú szabadalmi leírásban és Prince és munkatársai [Vírus Rés., 3, 193-206 (1985)] ismertetik, és feltételezéseink szerint e tesztek eredményeiből következtetni lehet az emberben mutatott hatékonyságra és a gyengítettségre. Az RS-fertőzés főemlősmodellje - amelyben csimpánzt alkalmaznak - alkalmas az emberben való hatékonyság és gyengítettség megítélésére [részletesen ismertetik Richardson és munkatársai, J. Med. Virol, 3, 91-100 (1978); Wright és munkatársai, Infect. Immun., 37, 397-400 (1982); Crowe és munkatársai, Vaccine (1993) (nyomdában)].
így például az RSV-t semlegesítő antitestek terápiás hatása fertőzött mezei patkányokban kimutatottan erősen releváns a későbbiekben RSV-vel fertőzött majmokon és embereken végzett immunterápiával. A patkány5
HU 220 189 Β nyal kapott kísérleti értékekből valóban lehet következtetni a fertőzött majmok és emberek RSV-t semlegesítő antitestekkel végzett immunterápiára adott válaszára. Például az RSV-t semlegesítő antitestek mennyisége - amely a terápiás hatással van összefüggésben, és amelyet ilyen antitestek szérumkoncentrációjával mérünk a kezelt állatokban azonos nagyságrendű mezei patkányban (a szérum RSV-t semlegesítő titere 1:302-1:518), majmokban (a titer 1:539) és emberi csecsemőkben vagy kisgyermekekben (a titer 1:877). A terápiás hatás a tüdőben lévő vírus titerének 100-szoros vagy még nagyobb csökkenésében nyilvánul meg (Prince és munkatársai, J. Virol, 61, 1851-1854), míg a majmokban a terápiás hatás a tüdő vírustiterének 50-szeres csökkenésével mutatható ki [Hemming és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 1083-1087 (1985)]. Végül a terápiás hatás súlyos RSV bronchiolitisszel vagy pneumoniával kórházba került csecsemőkben vagy kisgyermekekben a kezelt csoportban az oxigénellátás lényeges növekedésében és a kezelt betegek felső légútjából visszanyerhető RSV mennyiségének jelentős csökkenésében nyilvánult meg [Hemming és munkatársai, Antimicrob. Agents Chemother., 31, 1882-1886 (1987)]. A fenti tanulmányok alapján úgy tűnik, hogy a mezeipatkány-modellből megbízhatóan lehet következtetni az RSV vakcina alkalmazhatóságára csecsemőkben és kisgyermekekben. Egyéb rágcsálók - például a hörcsög és az egér hasonlóképpen hasznosak lehetnek, mivel ezekben az állatokban az RSV képes szaporodni, és testhőmérsékletük az emberéhez hasonlóbb [Wight és munkatársai, J. Infect. Dis., 122, 501-512 (1970) és Anderson és munkatársai, J. Gén. Virol., 71, (1990)].
Vakcinálás céljára a találmány szerinti gyengített vírust közvetlenül alkalmazhatjuk a vakcinakészítményekben, vagy kívánt esetben, ismert módon liofilizálhatjuk. A liofilizált vírust rendszerint körülbelül 4 °C-on tároljuk. Az alkalmazás előtt a liofilizált vírust stabilizálóoldatban, például sóoldatban vagy SPG-t, Mg2+-ionokat és HEPES-t tartalmazó oldatban rekonstituálhatjuk adjuvánssal vagy adjuváns nélkül, amint azt alább ismertetjük.
A találmány szerinti RS vírusvakcinák hatóanyagként egy fenti gyengített RS vírust tartalmaznak immunogén szempontból hatásos mennyiségben. A gyengített vírust a gazdába, különösen az emberbe fiziológiásban elfogadható hordozóval és/vagy adjuvánssal vihetjük be. A használható hordozók a szakirodalomból jól ismertek, ilyen például a víz, a pufferolt víz, 0,4%-os sóoldat, 0,3%-os glicinoldat, hialuronsav és hasonlók. A kapott vizes oldatokat alkalmazásra kész formában csomagolhatjuk, vagy liofilizálhatjuk, és a liofilizált készítményt az adagolás előtt steril oldattal elegyíthetjük a fent ismertetett módon. A készítmények gyógyászatilag elfogadható segédanyagokat is tartalmazhatnak, amelyek a megfelelő fiziológiai körülmények biztosításához szükségesek, például pH-beállító és pufferolószereket, tonicitást beállító szereket, nedvesítőszereket és hasonlókat, így például nátrium-acetátot, nátrium-laktátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalcium-kloridot, szorbitán-monolaurátot, trietanolamin-oleátot és hasonlókat.
A fent ismertetett, gyengített RS víruskészitménynyel aeroszol, csepp, szemcsés spray útján, orálisan, helyileg vagy egyéb módon, legelőnyösebben intranazális adagolással történő inokulálás után a gazda immunrendszere az RS vírusproteinekre specifikus szekréciós és szérumantitestek termelésével válaszol a vakcinára. A vakcinálás eredményeként a gazda legalább részlegesen vagy teljesen immunis lesz az RS vírusfertőzéssel szemben, vagy rezisztens lesz enyhe vagy súlyos RS virális fertőzések kifejlődésével szemben, különösen az alsó légutakban.
A találmány szerinti gyengített RS vírust tartalmazó vakcinakészítményeket az RS vírusfertőzéssel szemben érzékeny vagy egyébként veszélyeztetett egyénnek adagoljuk az egyén saját immunválaszadó képességének fokozására. Ezt a mennyiséget nevezzük immunogén szempontból hatékony dózisnak. Ilyen alkalmazás esetén a pontos mennyiségek a beteg egészségi állapotától és testtömegétől, az adagolás módjától, a készítmény formájától stb. függnek, de általában betegenként körülbelül 103—106 plakk-képző egység (PFU) vagy ennél több vírust adagolunk, még gyakrabban körülbelül 104—105 PFU vírust adagolunk betegenként. Minden esetben a vakcinakészítményeknek a találmány szerinti gyengített RS vírus olyan mennyiségét kell tartalmazniuk, amely elegendő a beteg hatékony védelmére a súlyos vagy életveszélyes RS vírusfertőzés ellen.
Egy adott RS alcsoportba vagy törzsbe tartozó találmány szerinti gyengített RS vírust eltérő alcsoportba vagy törzsbe tartozó gyengített vírusokkal kombinálhatjuk, így több RS vírus ellen is védelmet biztosítunk. Rendszerint a különböző módosított vírusokat összekeverjük és egyidejűleg adagoljuk, de külön-külön is adagolhatjuk ezeket. Bizonyos RS vírustörzsek közötti keresztvédelem jelensége következtében az egy törzzsel végzett immunizálás védelmet adhat több különböző, azonos vagy eltérő alcsoportba tartozó törzs ellen.
Bizonyos esetekben kívánatos lehet a találmány szerinti gyengített RS vírusvakcinák kombinálása olyan vakcinákkal, amelyek egyéb ágensek, különösen egyéb gyerekkori vírusok elleni védelmi választ indukálnak, így például a találmány szerinti gyengített vírusvakcinát egyidejűleg (rendszerint külön-külön) vagy egymás után adagolhatjuk parainfluenzavírus-vakcinákkal, például a Clements és munkatársai által ismertetett vakcinákkal [J. Clin. Microbiol., 29, 1175-1182 (1991)].
A találmány szerinti vakcinakészítmények adagolása egyszeri vagy többszöri lehet. Újszülöttekben és csecsemőkben szükség lehet többszöri adagolásra az immunitás megfelelő mértékének kiváltására. Az adagolást egy hónapos kor elérése előtt kell elkezdeni, és meghatározott időközökben folytami kell a gyermekkorban, például két hónapos korban, hat hónapos korban, egyéves és kétéves korban, hogy a natív (vad típusú) RS vírusfertőzés elleni védelem megfelelő szintjét fenntartsuk. Hasonlóképpen azoknak a felnőtteknek, akik különösen érzékenyek az ismételt vagy súlyos RS vírusfertőzésekre - például egészségügyi dolgozóknak, ápolóknak, kisgyerekek családtagjainak, idősebbeknek, csökkent kardiopulmonáris funkcióval rendelkező egyedeknek
HU 220 189 Β stb. - szintén szükségük lehet többszöri immunizálásra a védő immunválasz kiváltására és/vagy fenntartására.
Az indukált immunitás szintjét a semlegesítő szekréciós vagy szérumantitestek mennyiségének mérésével lehet nyomon követni, és a dózisokat ehhez kell igazítani, 5 vagy a vakcinálást szükség szerint meg kell ismételni a védelem kívánt mértékének fenntartására.
A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.
1. példa
Hidegen passzált RSV mutagén származékainak izolálása és jellemzése
Ebben a példában a nem teljesen gyengített gazdaspecifikus cpRSV kémiai mutagenezisét ismertetjük, 15 amellyel olyan ts és sp törzseket állítunk elő, amelyek sokkal nagyobb mértékben gyengítettek és így RSV vakcinakészítmények előállítására előnyösebben alkalmazhatók.
Előállítottunk egy hidegen passzált RSV (cpRSV) 20 törzstenyészetet. Emberben nem teljesen gyengített cpRSV szülői vírusként Flow Laboratories Lót 3131 vírust használtuk, ezt kétszer passzáltuk MRC-5 sejtekben 25 °C-on, befejezésül kétszer hígítottuk MRC-5 sejtekkel 25 °C-on, majd háromszor passzáltuk MRC-5 sejtekben, így kaptuk a mutagenezisre használt cpRSVszuszpenziót.
A cpRSV-t úgy mutagenizáltuk, hogy a szülői törzstenyészetet MRC-5 sejtekben 32 °C-on tenyésztettük 5-fluor-uracil jelenlétében, amelynek koncentrációja a 30 tápközegben 4χ IO-4 mol/1 volt. Előkísérletekben kimutattuk, hogy ez a koncentráció optimális, mivel a vírustiter 100-szoros csökkenését eredményezte a sejttenyészetben az 5-fluor-uracil nélküli közeghez viszonyítva. A mutagenizált törzstenyészetet ezután plakkmódszerrel Verő sejteken analizáltuk, amelyeket agar fedőréteg alatt tartottunk fenn, és meghatározott időn keresztüli inkubálás után a plakkokat semleges vörös festékkel festettük. 854 plakkot leszedtünk, és minden egyes plakkból az utódokat elkülönítetten szaporítottuk friss Verő egysejtrétegeken való tenyésztéssel. Amikor a Verő sejtekre kifejtett citopatikus hatások maximálisnak látszot10 tak, a cpRSV mutagenizált vírus egyetlen plakkjából származó utódokkal inokulált szövettenyészetek tartalmát elkülönítetten összegyűjtöttük. A megsokszorozott plakkokat HEp-2 sejteken 32 °C-on és 38 °C-on titrálva kimutattuk azokat az utódvírusokat, amelyek hőmérséklet-érzékeny (ts) vagy kis plakk (sp) fenotípussal rendelkeztek. Azokat a vírusokat, amelyek sp fenotípussal (a plakk mérete a szülővíruséhoz képest 32 °C-on 50%-kal vagy annál nagyobb mértékben csökkent) vagy ts fenotípussal [restriktív hőmérsékleten (37-40 °C-on) a 32 °C-on kapott értékekhez viszonyítva 100-szoros titercsökkenés] rendelkeztek, tovább vizsgáltuk. Ezeket a törzseket biológiailag klónoztuk Verő sejteken háromszor végzett sorozatos plakktisztítással, majd Verő sejtekben felerősítettük. A klónozott törzseket 32 °C-on,
37 °C-on, 38 °C-on, 39 °C-on és 40 °C-on titráltuk [a plakk-képződés hatékonyságának (EOP) meghatározásával] sp és ts fenotípusuk megerősítésére. Mivel néhány klónozott törzs titere viszonylag alacsony volt még a szaporodást megengedő hőmérsékleten (32 °C-on) is, ezeket a vírusokat egyszer passzáltuk HEp-2 sejtekben az in vitro analízisre megfelelő vírusszuszpenziók előállítására. A mutagenizált cpRSV utódjainak fenotípusait az 1. táblázatban foglaltuk össze.
1. táblázat
Hidegen passzált RSV kilenc származékának (cpts- vagy cpsp-mutánsok) plakk-képző hatékonysága HEp-2 sejtekben permisszív és restriktív hőmérsékleteken
| Vírus | Vírus titere (lg pfu/ml) a megadott hőmérsékleten (°C) | Shut-off hőmérséklet (°C)> | Kis plakk 32 °C-on | ||||
| 32 | 37 | 38 | 39 | 40 | |||
| vad típusú A2 | 4,5 | 4,4 | 4,5 | 3,8 | 3,8 | >40 | nincs |
| cp-RSV | 6,0 | 5,8 | 5,8 | 6,2 | 5,4 | >40 | nincs |
| ts— 1 | 5,7 | 4,5 | 2,7 | 2,4 | 1,7* | 38 | nincs |
| cpsp-143 | 4,2* | 4,1* | 3,8* | 3,9* | 3,8* | >40 | van |
| cpts-3 68 | 6,7 | 6,3 | 6,1* | 5,8** | 2,8** | 40 | nincs |
| cpts-274 | 7,3 | 7,1 | 6,6 | 5,8* | 1,0** | 40 | nincs |
| cpts-347 | 6,2 | 6,1 | 5,7* | 5,5** | <0,7 | 40 | nincs |
| cpts-142 | 5,7 | 5,1 | 4,5* | 3,7** | <0,7 | 39 | nincs |
| cpts 299 | 6,2 | 5,5 | 5,1* | 2,0** | <0,7 | 39 | nincs |
| cpts-475 | 5,4 | 4,8* | 4,2** | <0,7 | <0,7 | 39 | nincs |
| cpts-530 | 5,5 | 4^· OO * | 4,5* | <0,7 | <0,7 | 39 | nincs |
| cpts-248 | 6,3 | 5,3** | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 38 | nincs |
1 Shut-off hőmérséklet: az a legalacsonyabb restriktív hőmérséklet, amelyen a plakk titemek 100-szoros vagy még nagyobb csökkenését észleltük (vastagon kiemelt számok a táblázatban).
* Kis plakk fcnotipus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 50%-a).
** Tűhegy plakk fenotípus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 10%-a).
HU 220 189 Β
A mutáns utódok egyike (RSV cpsp-143) kis plakk fenotípussal rendelkezett (sp jelenti a kis plakk fenotípust) és a többi mutáns utód ts fenotípust mutatott. Az RSV cpts mutánsok azzal a megváltozott képességgel rendelkeztek, hogy in vitro egysejtréteg-tenyészetekben 37-40 °C hőmérséklet-tartomány felett képesek plakkot képezni, a cpts-368 megtartotta plakk-képző képességét 40 °C-on, a leginkább hőmérséklet-érzékeny (ts) vírus, a cpts-248 nem képezett plakkot 38 °C-on. így a mutagenizált cpRSV utódok közül néhány jelentős élté- 10 rést mutatott a szülői spRSV vírustól a plakk-képzés hőmérséklet-érzékenységét tekintve.
Replikációs és genetikai stabilitás vizsgálata egérben
A következőkben a cpRSV utódvírus replikációjá- 15 nak szintjét tanulmányoztuk BALB/c egerek felső és alsó légútjában (2. táblázat). Azt tapasztaltuk, hogy a két leginkább ts vírus, a cpts-530 és a cpts-248 (lásd 1. táblázatot) szaporodása körülbelül 7-12-szeresen korlátozott volt az egerek orrkagylójában (2. táblázat). 20 Azonban a vírusok egyikének szaporodása sem volt gátolva tüdőben a szülői spRSV vírushoz viszonyítva.
A replikáció eme nagyobb gátlása az orrkagylóban a tüdőhöz képest nem jellemző a ts-mutánsokra, amelyek szaporodása általában nagyobb mértékben gátolt a mele- 25 gebb alsó légutakban [Richman és Murphy: Rév. Infect. Dis., 1, 413-433 (1979)]. A tüdőben és az orrkagylóban termelődött vírus megtartotta a bevitt vírus ts jellegét (adatokat nem közöltük). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a cp szülői vírusban meglévő mutációk kombinálása a ts-mutációkkal olyan cpRSV ts utódot eredményez, amelyben a ts fenotípus stabilitása nagyobb mértékű in vivő replikáció után, mint a korábban tanulmányozott ts-mutánsokban.
A ts fenotípusú cpRSV utódvírusok genetikus stabilitása mértékének további kiaknázására két mutagenizált cpRSV utódra megvizsgáltuk a csupasz egerek tüdejében és orrkürtjében jelen lévő vírusok plakk-képzésének hatékonyságát, ez a két vírus, a ts-248 és ts-530 a leginkább ts vírusok közé tartozott. A csupasz egereket azért választottuk a vizsgálatokra, mert ezek immunrendszere a funkcionális T-sejtek örökletes hiánya miatt csökkent működésű, és a vírus sokkal hosszabb időn keresztül képes ezekben a gazdákban szaporodni. Ez a hosszabb replikációs periódus kedvez a megváltozott fenotípussal rendelkező vírusmutánsok megjelenésének. A 12. napon jelen lévő vírust (megjegyezzük, hogy normál egerekben a vírus ezen időpontban már nem detektálható) megvizsgáltuk, és azt találtuk, hogy változatlan ts fenotípussal rendelkezik (3. táblázat). Várt módon a fenti tesztben pozitív kontrollként vizsgált ts—1 mutáns in vivő instabil ts fenotípust mutatott, így a ts mutáns vírusok rágcsálókban való előzetes értékelésével szemben az eredmények azt mutatják, hogy rágcsálókban a hosszabb replikációt követően a ts fenotípus stabilitása nagyobb mértékű volt, ami a találmány szerinti vírusok jelentős és ez idáig el nem ért, nagyon kívánatos tulajdonságát jelenti.
2. táblázat cpts-RSV mutánsok replikációjá BALB/c egerekben1
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírusok | Vírusok shut-off hőmérséklete (°C) | Vírustiter 32 °C-on (átlagos lg pfu/g szövet, 8 állat szövetéből ±standard hiba | |||
| 4. nap | 5. nap | ||||
| Orrkürtök | Tüdők | Orrkürtök | Tüdők | ||
| vad típusú A2 cp RSV ts— 1 | >40 >40 38 | 5,0±0,16 4,7 ±0,07 4,0±0,19 | 5,8±0,20 5,3 ±0,18 4,7+0,27 | 5,0±0,ll 4,8±0,16 3,8±0,33 | 5,8±0,19 5,3 ±0,21 4,9±0,13 |
| cpsp-143 | >40 | 4,5±0,14 | 4,1 ±0,37 | 4,4±0,39 | 4,6±0,39 |
| cpts-368 | 40 | 4,8±0,15 | 5,l±0,35 | 4,7±0,08 | 5,4±0,23 |
| cpts-274 | 40 | 4,2±0,19 | 5,0±0,15 | 4,2±0,ll | 5,1 ±0,55 |
| cpts-347 | 40 | 4,4 ±0,32 | 4,9±0,40 | 4,5±0,33 | 5,2±0,35 |
| cpts-142 | 39 | 4,1 ±0,34 | 5,0±0,19 | 4,3 ±0,24 | 5,8±0,40 |
| cpts-299 | 39 | 3,9±0,ll | 5,2±0,15 | 3,9±0,32 | 5,0±0,29 |
| cpts-475 | 39 | 4,0±0,18 | 5,3±0,25 | 4,l±0,23 | 4,9±0,42 |
| cpts-530 | 39 | 3,9±0,18 | 5,3±0,15 | 3,9±0,14 | 5,3 ±0,19 |
| cpts-248 | 38 | 3,9±0,33 | 5,1 ±0,29 | 4,2±0,13 | 5,5±0,35 |
1 Az egereknek 106·3 pfu vírust adagoltunk intranazálisan 0,1 ml inokulumban a 0. napon, majd a 4. vagy 5. napon az állatokat elpusztítottuk,
HU 220 189 Β
3. táblázat cpts-248 és cpts-530 RSV törzs genetikus stabilitása hosszabb replikációt követően, csupasz egérben
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Vizsgált szövetminta vagy bevitt vírus | A vírussal való fertőzést követő 12. napon elpusztított csupasz egerek orrkürtjében (n. t.) vagy tüdejében jelen lévő vírus plakk-képzésének hatékonysága a megadott hőmérsékleten | |||||
| 32 °C | 37 °C | ||||||
| Állatok száma | Kimutathatóan vírusgazda állatok %-a | Átlagos titer (lg pfu/g szövet vagy ml inokulum) | Kimutathatóan vírusgazda állatok %-a | Megváltozott ts fenotípusú vírust tartalmazó állatok %-a | Átlagos titer (lg pfu/g szövet vagy ml inokulum) | ||
| cpts-248 | n. t. | 19 | 100 | 3,8+0,34 | 0 | 0 | <2,0 |
| yy | tüdő | y y | 90 | 2,0+0,29 | 0 | 0 | <1,7 |
| cpts-530 | n. t. | 20 | 100 | 3,0+0,26 | 0 | 0 | <2,0 |
| tüdő | y y | 100 | 2,4+0,29 | 0 | 0 | <1,7 | |
| ts— 1 | Π. t. | 19 | 100 | 3,7+0,23 | 74 | 74 | 2,7+0,57 |
| tüdő | y y | 100 | 2,5+0,30 | 74 | 74 | 1,8+0,21 | |
| cpts-248 | - | 4,9 | - | <0,7 | |||
| cpts-530 | - | - | 5,5 | - | 3,7* | ||
| ts— 1 | - | - | 6,1 | - | 3,3 |
a 3. táblázat folytatása
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Vizsgált szövetminta vagy bevitt vírus | A vírussal való fertőzést követő 12. napon elpusztított csupasz egerek onkürtjében (n. t.) vagy tüdejében jelen lévő vírus plakk-képzésének hatékonysága a megadott hőmérsékleten | ||||||
| 38 °C | 40 °C | |||||||
| Állatok száma | Kimutathatóan vírusgazda állatok %-a | Megváltozott ts fenotípusú vírust tartalmazó állatok %-a | Átlagos titer (lg pfu/g szövet vagy ml inokulum) | Kimutatha- tóan vírusgazda állatok %-a | Megváltozott ts fenotípusú vírust tartalmazó állatok %-a | Átlagos titer (lg pfu/g szövet vagy ml inokulum) | ||
| cpts-248 | n. t. | 19 | 0 | 0 | <2,0 | 0 | 0 | <2,0 |
| y y | tüdő | y y | 0 | 0 | <1,7 | 0 | 0 | <1,7 |
| cpts-530 | n. t. | 20 | 0 | 0 | <2,0 | 0 | 0 | <2,0 |
| y y | tüdő | y y | 0 | 0 | <1,7 | 0 | 0 | <1,7 |
| ts— 1 | n. t. | 19 | 63 | 63 | 2,4+0,36 | 10 | 10 | 2,0+0,13 |
| y y | tüdő | y y | 35 | 32 | 1,8+0,15 | 0 | 0 | <1,7 |
| cpts-248 | - | <0,7 | - | <0,7 | ||||
| cpts-530 | - | <0,7 | - | <0,7 | ||||
| ts— 1 | - | 2,7 | - | <0,7 |
1 A plakktiterek jelentése 19 vagy 20 mintából származó átlagos lg pfu/g sző vctértéki standard hiba.
2 Az egyes állatok 106·3 pfu vírust kaptak intranazálisan 0,1 ml inokulumban a megadott vírusból a 0. napon. * Csak kis plakk fenotípus.
Csimpánzokon végzett vizsgálatok A cpRSV ts utód gyengítettségének mértékét ezután 50 szeronegatív csimpánzokon értékeltük ki, amelyek az emberhez leginkább hasonló gazdák. A csimpánzokon vagy bagolymajmokon a kísérleteket Richardson és munkatársai általános eljárása szerint végeztük [Richardson és munkatársai, J. Med. Virol, 3, 91-100 (1979); Crowe és 55 munkatársai, Vaccine (1993) (nyomdában)]. Minden egyes állatnak intranazálisan 1 ml szuszpenziót adtunk, amely hozzávetőleg 104 plakk-képző egység (PFU) mutagenizált, gyengített vírust tartalmazott. Másik eljárás szerint az RSV-t mind a felső, mind az alsó légútba beoltot- 60 tűk, az egyes helyekre 104 PFU-t adagoltunk. A csimpánzokból ezután 10 napon keresztül naponta, majd 20 napon keresztül minden 3., 4. napon mintát vettünk. A csimpánzok alsó légútjából a mintát tracheális mosással nyertük, Snyder és munkatársai [J. Infec. Dis., 154, 370-371 (1986)] és Crowe és munkatársai [Vaccine (1993) (nyomdában)] módszere szerint. Néhány állatot 4-6 hét elteltével vad típusú vírussal provokáltunk. Az állatok kiértékelését a légúti betegség jelei alapján végeztük mindennap, az oirgarati minták vételével. Az orrfolyást O-tól 4+-ig pontoztuk, a 2+ vagy annál nagyobb értéket vettük a jelentős felső légúti megbetegedés bizonyítékának.
HU 220 189 Β
A vírust az orrból vagy torokból vett kenet tamponokból és a tracheális mosófolyadékokból izoláltuk RSV-szenzitív HEp-2 sejtekbe való leoltással a fentiek szerint. A vírus mennyiségét közvetlenül is meghatározhatjuk plakkmódszerrel HEp-2 sejteket alkalmazva Schnitzer és munkatársai módszere szerint [J. Virol, 17, 431-438 (1976)]. A vérmintákat a vírus beadása előtt, és 3-4 héttel az inokulálás után vettük az RSV-t semlegesítő antitestek meghatározása céljából Mills és munkatársai módszere szerint [J. Immunoi. 107, 123-130 (1970)].
A leginkább ts és gyengített cpRSV utódot (cpts-248-at) tanulmányoztuk, és összehasonlítottuk a vad típusú RSV-vel és a cpRSV szülővírussal (4. táblázat). A cpRSV szülővírus szaporodása kismértékben csökkent az orrgaratban a vad típusúval összehasonlítva, mennyisége az orrváladékban a vad típusú vírushoz viszonyítva kevesebb volt, és körülbelül 600-szoros csökkenést tapasztaltunk a vírusreplikációban az alsó légútban, a vad típusúval összehasonlítva. A cp vírus replikációja jelentősen csökkent a csimpánzok alsó légútjában, és ez egy olyan kívánatos tulajdonság, amelyet ez idáig nem tapasztaltak állatokon vagy emberen korábban vizsgált cpRSV esetén. Még jelentősebb, hogy a cpts-248 vírus replikációja 10-szeresére csökkent a vad típusúhoz viszonyítva az orrgaratban, és ez a csökkenés az orrváladék képződésének jelentős csökkenésével párosult. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a cpRSV-származék-vírus élő RSV vakcina előállításához két nagyon kívánatos tulajdonsággal rendelkezik, mégpedig gyengítettnek bizonyult az igen érzékeny szeronegatív csimpánzok mind alsó, mind felső légútjában. Ezt követően kiértékeltük a csimpánzok légútjában jelen lévő vírus genetikus stabilitásának mértékét (5. táblázat). A légúti szekrétumokban jelen lévő vírus megtartotta a ts fenotípust, és a 3-as számú csimpánzból származó vírusnál még a 8. napon is azt tapasztaltuk, hogy a titer csökkenése 100-szoros volt 40 °C-on, és 40 °C-on kis plakk fenotípust mutatott, jelezvén, hogy replikációja még mindig hőmérséklet-érzékeny. Ez képviseli az ez idáig azonosított mutánsok közül a genetikusán legstabilabb ts-mutánst. A cpts-248 és cpts-530 vírusok ts fenotípusának megnövekedett stabilitása tükrözi a cp-mutációk hatását az in vivő ts fenotípust eredményező mutációk genetikus stabilitására. így a cp 3131 szülővírusban jelen lévő mutációk vonatkozásában a ts-mutációk stabilabbnak tűnnek, mint ami azok távollétében várható volna. Ezt a jelentős tulajdonságot korábban nem ismerték fel, és nem írták le. A csimpánzok cpts-248-cal való fertőzése a semlegesítő antitestek magasabb titerét, valamint az F- és G-glikoproteinekkel szembeni antitestek magasabb titerét eredményezte (6. táblázat). Hasonló módon a cpts-248-cal végzett immunizálás megvédte az állatokat az újabb RSV-fertőzéssel szemben (7. táblázat), jelezvén, hogy ez a mutáns hatékony vakcinavírusként funkcionál emberhez nagyon hasonló gazdában.
A fent ismertetett adatok azt jelzik, hogy a cpts-248 vírus sok olyan tulajdonsággal rendelkezik, amely élő RSV vakcina előállításához kívánatos, beleértve: 1. a felső és alsó légútban egyaránt gyengített voltát; 2. megnövekedett genetikus stabilitást in vivő replikáció után, immunszupresszált állatokban még hosszabb replikációt követően is; 3. kielégítő immunogén jelleget; és 4. jelentős védő hatékonyságot vad típusú RSV-vel való fertőzés ellen. A cpts-530 vírus a cpts-248 vírus közös tulajdonsága a plakk-képződés hasonló hőmérséklet-érzékenysége, egerek orrkürtjében a replikáció hasonló mértékű csökkenése, és az immunhiányos, csupasz egerekben a genetikus stabilitás hasonló magas szintje, tehát a cpts-530 vírus is alkalmazható RS vírusvakcinatörzsként.
4. táblázat cpts-RSV 248, cp-RSV vagy vad típusú RSV A2 szaporodása szeronegatív csimpánzok felső és alsó légútjában
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Inokuláció módja | Csimpánzok száma | Vírusvisszanyerés | |||||
| Orrgarat | Trachea | Orrváladék | ||||||
| Időtartamb (napok) | Csúcstitcr (lg pfu/ml) | Időtartamb (napok) | Csúcstitcr (lg pfú/ml) | Átlag11 | Csúcs | |||
| cpts-248 | IN+IT | 1 | 10 | 4,6 | 8d | 5,4 | 0,2 | 1 |
| IN+IT | 2 | 10 | 4,5 | 6 | 2,2 | 0,1 | 1 | |
| IN+IT | 3 | 9 | 4,7 | 10 | 2,1 | 0,1 | 1 | |
| IN+IT | 4 | 9 átlag 9,5 | 4,2 átlag 4,5 | 8d átlag 8,0 | 2,2 átlag 3,0 | 0,1 átlag 0,1 | 1 | |
| cp-RSV | IN | 5 | 20 | 5,3 | 8d | 2,9 | 1,0 | 3 |
| IN | 6 | 16 | 5,8 | 6d | 3,0 | 1,8 | 3 | |
| IN+IT | 7 | 13 | 4,3 | 6d | 3,0 | 0,6 | 1 | |
| IN+IT | 8 | 16 átlag 16 | 5,0 átlag 5,1 | 10d átlag 7,5 | 2,8 átlag 2,9 | 0,5 átlag 1,0 | 1 |
HU 220 189 Β
4. táblázat (folytatás)
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Inokuláció módja | Csimpánzok száma | Vírusvisszanyerés | |||||
| Orrgarat | Trachea | Orrváladék | ||||||
| Időtartam1’ (napok) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | ldőtartamb (napok) | Csúcstiter (lg pfú/ml) | Átlagc | Csúcs | |||
| Vad típusú A2 | IN | 9 | 9 | 54 | 13 | 5,4 | 1,0 | 1 |
| IN | 10 | 9 | 6,0 | 8 | 6,0 | 1,7 | 4 | |
| IN+IT | 11 | 13 | 5,3 | 8 | 5,9 | 2,1 | 3 | |
| IN+IT | 12 | 9 átlag 10 | 5,4 átlag 5,5 | 8 átlag 9,3 | 5,6 átlag 5,7 | 1,0 átlag 1,4 | 3 |
3 IN=csak intranazális adagolás 104 pfti dózisban 1,0 ml inokulumban;
IN+lT=mind intranazális, mind intratracheális adagolás 104 pfu/1,0 ml inokulum mennyiségben mindkét helyen.
b A fertőzést követő utolsó napot jelenti, amelyen a vírus még visszanyerhető.
c Átlagos orrváladékpontszám, a napi pontok összegét jelenti 8 napon keresztül a maximális vírusszámot képviselő nap körül, nyolccal osztva. A legmagasabb pontszám a 4, a legalacsonyabb pontszám a 0.
d A vírust csak a megadott napon izoláltuk.
5. táblázat
Kísérletileg cpts-RSV 248-cal fertőzött állatokból kapott eredeti orrgarati (NP) kenet tamponokban vagy tracheális öblítőkben (TL) jelen lévő vírus genetikus stabilitása
| RSV titere a megadott hőmérsékleten (lg pfu/ml) | |||||
| Csimpánzok száma | NP kenet tampon vagy TL minta | Vírus izolálása a fertőzés után (nap) | Titer 32 °C-on | Titer 39 °C-on | Titer 40 °C-on |
| 1“ | NP | 3 | 3,2 | <0,7 | NT |
| 4 | 2,7 | <0,7 | NT | ||
| 5 | 4,2 | <0,7 | NT | ||
| 6 | 3,8 | <0,7 | NT | ||
| i * | 7 | 4,6 | <0,7 | NT | |
| 8 | 4,5 | <0,7 | NT | ||
| »» | 9 | 2,6 | <0,7 | NT | |
| 10 | 2,0 | <0,7 | NT | ||
| TL | 6 | 5,4 | <0,7 | NT | |
| 8 | 2,7 | <0,7 | NT | ||
| 2a | NP | 3 | 3,2 | <0,7 | NT |
| 4 | 3,7 | <0,7 | NT | ||
| 5 | 4,5 | <0,7 | NT | ||
| *» | 6 | 4,1 | <0,7 | NT | |
| 7 | 3,3 | <0,7 | NT | ||
| 8 | 4,2 | <0,7 | NT | ||
| 9 | 2,8 | <0,7 | NT | ||
| 10 | 1,6 | <0,7 | NT | ||
| TL | 6 | 2,2 | <0,7 | NT | |
| 3 | NP | 3 | 2,7 | <0,7 | <0,7 |
| 4 | 3,4 | <0,7 | <0,7 | ||
| 5 | 2,9 | <0,7 | <0,7 | ||
| 6 | 3,3 | <0,7 | <0,7 | ||
| »s | 7 | 3,4 | 0,7b | <0,7 | |
| 8 | 4,7 | 3,5b | 2,0” | ||
| 9 | 1,9 | <0,7 | <0,7 | ||
| TL | 6 | 1,8 | <0,7 | <0,7 | |
| 8 | 1,9 | l,2b | <0,7 | ||
| 10 | 2,1 | l,3b | <0,7 |
HU 220 189 Β
5. táblázat (folytatás)
| RSV titere a megadott hőmérsékleten (lg pfu/ml) | |||||
| Csimpánzok száma | NP kenet tampon vagy TL minta | Vírus izolálása a fertőzés után (nap) | Titer 32 °C-on | Titer 39 °C-on | Titer 40 °C-on |
| 4 | NP | 3 | 3,2 | <0,7 | NT |
| 4 | 2,7 | <0,7 | NT | ||
| 5 | 3,4 | <0,7 | NT | ||
| »» | 6 | 3,3 | <0,7 | NT | |
| 7 | 4,2 | <0,7 | NT | ||
| 8 | 3,5 | <0,7 | NT | ||
| »» | 9 | 2,1 | <0,7 | NT | |
| TL | 8 | 2,2 | <0,7 | NT |
NT=nem tesztelt.
a Izolátumokat (egyszer passzált vírusszuszpenziók, átlagos titerük 4,0 lg pfü/ml) készítettünk a mintákhoz ezekből a csimpánzokból, az egyes eredeti vírust tartalmazó orrgaratkenet tamponból vagy tracheális öblítőből, és vizsgáltuk a plakk-kcpződés mértékét 32 °C-on, 39 °C-on és 40 °C-on. Egyetlen izolátum sem volt képes plakkot képezni 39 °C-on vagy 40 °C-on. A 3-as és 4-es számú csimpánzból kapott izolátumokat nem teszteltük ezzel a módszerrel.
b A 39 °C-on kapott titer%-a a 32 °C-on kapott titeréhez képest: NP kenet tampon 7. nap=0,2%, NP kenet tampon 8. nap=6%. TL 8. nap=20%, TL 10. nap= 16%. Az összes plakk csak kis plakk fenotípust mutatott, nem volt látható vad típusú plakkméret.
c %-os titer 40 °C-on a 32 °C-on mérthez képest 0,2%. Az összes plakk tűhegyplakk fenotipusú volt, vad típusú plakkméretet nem detektáltunk.
6. táblázat
RSV cpts-248-cal, cpRSV-vel vagy vad típusú RSV A2-vel fertőzött csimpánzok szérumantitestválaszai
| Állatok immunizálására használt vírus | Csimpánzok száma | Szérumantitesttiterek (reciprok átlag log2) | |||||
| Semlegesítés | ELISA-F | ELISA-G | |||||
| 0. nap | 28. nap | 0. nap | 28. nap | 0. nap | 28. nap | ||
| cpts-248 | 4 | <3,3 | 10,7 | 7,3 | 15,3 | 6,3 | 9,8 |
| cp-RSV | 4 | <3,3 | H,2 | 11,3 | 15,3 | 9,3 | 12,3 |
| vad-típusú RSV A2 | 4 | <3,3 | 11,2 | 8,3 | 15,3 | 7,3 | 10,3 |
7. táblázat
Csimpánzok cpts-248 vírussal való immunizálása által indukált rezisztencia vad típusú RSV A2 vírussal történő fertőzés ellen a 28. napon
| Állat immunizálására alkalmazott vírus | Csimpánz ok száma | 104 pfú vad típusú vírus adagolására adott válasz a 28. napon | |||||||
| Vírusvisszanyerés | Orrfolyás pontszáma | Szérumsemlegesítő antitest titere (reciprok log2) a megadott napon | |||||||
| Orrgarat | Légcső | ||||||||
| Időtartam (nap) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Időtartam (nap) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Átlag3 | Csúcs | 28. nap | 42. vagy 52. nap | ||
| cpts-248 | 1 | 5 | 2,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | 10,1 | 11,0 |
| 2 | 9 | 1,8 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | 10,3 | 14,5 | |
| cp-RSV | 5 | 5 | 1,0 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | 11,1 | 13,3 |
| 6 | 8 | 0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | 11,4 | 12,9 | |
| 9 | 9 | 5,1 | 13 | 5,4 | 1,0 | 1 | <3,3 | 12,4 | |
| nincs | 10 | 9 | 6,0 | 8 | 6,0 | 1,7 | 4 | <3,3 | 13,2 |
| 11 | 13 | 5,3 | 8 | 5,9 | 2,1 | 3 | <3,3 | 11,6 | |
| 12 | 9 | 5,4 | 8 | 5,6 | 1,0 | 3 | <3,3 | 11,2 |
a Az átlagos orrfolyáspontszám a pontok összegét jelenti a maximális vírusürítés 8 napja alatt, nyolccal osztva.
A legmagasabb pontszám 4. A 0 pontszám azt jelenti, hogy nem észlelhető orrfolyás a tíznapos megfigyelési idő egyetlen napján sem.
HU 220 189 Β
További gyengítések
Mivel az RS vírus több alsó légútibetegség-tünetet okoz emberen, mint csimpánzon, és felismerve azt, hogy a mutánsok, amelyek csimpánzok esetén kielégítően gyengítettek, esetleg nem lesznek azok szeronegatív csecsemők és kisgyermekek esetén, a cpts-248- és -530származékokat, amelyekben a korlátozott replikáció hőmérséklet-érzékenysége és a gyengítettség nem volt elég erős a felső légutakban, és genetikai stabilitásuk nagyobb mértékű volt, tovább mutagenizáltuk.
További tanulmányozások céljára azokat az utódvírusokat szelektáltuk, amelyek a cpts-248-nál nagyobb mértékű hőmérséklet-érzékenységet mutattak in vitro, és kis plakk fenotípussal rendelkeztek. A cpts-248 mutáns származékait, amelyek egy vagy több további ts-mutációval rendelkeztek, 5-fluor-uracillal kiváltott mutagenezissel állítottuk elő (8. táblázat). Azonosítottuk azokat a ts-mutánsokat, amelyek a cpts-248-nál hőmérséklet-érzékenyebbek (ts) voltak, és ezek közül néhány kis plakk (sp) fenotípussal rendelkezett. Ezeket a cpts-248-származékokat egereknek adagoltuk. A cpts-248/804, 248/955, 248/404, 248/26, 248/18 és 248/240 mutánsok replikációja egerek alsó és felső légútjában nagyobb mértékben volt korlátozott, mint a cpts-248 szülői vírusé (9. táblázat). így azonosítottuk azokat az életképes cpts-248-mutánsokat, amelyek a cpts-248-nál jobban gyengítettek, és ezek a cpts-248-származékok széles tartományban változó replikatív hatékonyságot mutattak egerekben, a leginkább korlátozott a ts248/26 volt. Az egerek orrkürtjében és tüdejében jelen lévő vírus ts fenotipusa majdnem azonos volt a bevitt víruséval, ami a genetikus stabilitást jelzi. Egy erősen gyengített cpts-248származék, a cpts-248/404 replikációja az orrgaratban 1000-szeresen kisebb mértékű volt, mint a vad típusé. A legalább 3 gyengítőmutációval rendelkező cpts-248/404 mutáns replikációja két szeronegatív csimpánz felső és alsó légútjában is erősen korlátozott volt, és a fertőzés nem indukált orrfolyást (10. táblázat). A vírus replikációja szintén nagymértékben csökkent a vad típushoz viszonyítva, az orrgaratban a csökkenés 60 000-szeres, és a tüdőben 100 000-szeres volt. Ezenkívül ez a két csimpánz erősen rezisztens volt a vad típusú RSV vírussal való utólagos fertőzéssel szemben (11. táblázat). Ezenkívül a cpts-530 vírus további ts-származékait is előállítottuk (12. táblázat). Ezek az eredmények mutatják a további javulást a találmány szerinti RS vírusok tulajdonságaiban, és nagyon fontos és jelentős előrelépést képviselnek az RS vírusvakcinatörzsek kifejlesztésében.
Ezek az eredmények teljesen meglepőek voltak a korábbi tanulmányok során nyert tapasztalatok alapján, így például korábbi tanulmányok eredményei azt mutatták, hogy egyetlen 5-fluor-uracillel végzett mutagenezisciklusból származó RSV ts-mutáns tulajdonságai in vivő nem jósolhatok meg a priori. Ezenkívül annak ellenére, hogy az ily módon előállított első négy ts-mutáns egyike ugyanazt a shut-off hőmérsékletet mutatta plakk-képződésre, mint a többi mutánsok, túlságosan gyengítettnek mutatkozott, amikor érzékeny csimpánzokon és érzékeny csecsemőkön vagy kisgyermekeken tesztelték [Wright és munkatársai, Infect Immun. 37 (1), 397-400 (1982)]. Ez azt jelenti, hogy a plakkképződésre 37-38 °C-os shut-off hőmérsékletet eredményező ts fenotípus nem fog megbízhatóan olyan mutánst eredményezni, amely kívánt mértékben gyengített lenne érzékeny csimpánzok, csecsemők és gyermekek esetén. Valójában az eddig ismert ts-mutánsokkal végzett kísérletek eredményeiből egyáltalán nem lehetett arra következtetni, hogy három független mutáció (vagy mutációsorozat) bevezetése az RSV-be, hidegen passzálással, majd két ezt követő kémiai mutagenezisciklussal olyan életképes mutánsokat fog eredményezni, amelyek megtartják fertőzőképességüket csimpánzokkal (és ebből következtethetően csecsemőkkel) szemben és élő vírusvakcinákhoz szükséges mértékben gyengítettek, immunogének és védőhatásúak, ezáltal RSV-betegségek megelőzésére alkalmazhatók.
A fent közölt kísérleti eredmények világosan bizonyítják, hogy a találmány szerinti meghatározott cpRSV ts-származékok fertőzőképesek, és jelentős mértékben gyengítettek egerek és csimpánzok esetén. Ezek a tsmutáns-származékok gyengítettek, és genetikailag nagyon stabilnak tűnnek in vivő replikáció után. Ezek a mutánsok ezenkívül jelentős rezisztenciát indukálnak csimpánzokon RSV-fertőzés ellen. így ezek a cpRSV-származékok élő RSV-vakcinákban alkalmazható megfelelő vírustörzseket képviselnek, amely vakcinák súlyos humán RSV-betegségek megelőzésére alkalmazhatók.
8. táblázat
RSV cpts-248-ból további 5FU mutagenezissel kapott tíz mutáns plakk-képzésének hatékonysága
| Vírus | Vírus titere (lg pfu/ml) a megadott hőmérsékleten (°C) | Shut-off hőmérséklet (°C)> | Kis plakk 32 °C-on | ||||||
| 32 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | |||
| Vad típusú A2 | 4,5 | 4,6 | 4,4 | 4,5 | 4,5 | 3,8 | 3,8 | >40 | nincs |
| cp RSV | 4,7 | 4,4 | 4,3 | 4,3 | 4,2 | 3,7 | 3,5 | >40 | nincs |
| ts— 1 | 5,6 | 5,4 | 4,9 | 4,4 | 2,7 | 2,0 | <0,7 | 38 | nincs |
| cpts-248 | 3,4 | 3,0 | 2,6* | 1,7** | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 38 | nincs |
| 248/1228 | 5,5* | 5,3* | 5,3** | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 37 | van |
| 248/1075 | 5,3* | 5,3* | 5,1** | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 37 | van |
| 248/965 | 4,5 | 4,2* | 4,2** | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 37 | nincs |
| 248/967 | 4,4 | 3,7 | 3,6* | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 37 | nincs |
HU 220 189 Β
8. táblázat (folytatás)
| Vírus | Vírus titere (lg pfii/ml) a megadott hőmérsékleten (°C) | Shut-off hőmérséklet (°C)' | Kis plakk 32 °C-on | ||||||
| 32 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | |||
| 248/804 | 4,9 | 4,5 | 4,0* | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 37 | nincs |
| 248/955 | 4,8 | 3,7 | 2,8* | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 36 | nincs |
| 248/404 | 3,6 | 2,9* | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 36 | nincs |
| 248/26 | 3,1 | 2,9* | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 36 | nincs |
| 248/18 | 4,0* | 4,0** | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 36 | van |
| 248/240 | 5,8* | 5,7** | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | <0,7 | 36 | van |
1 Shut-off hőmérséklet: az a legalacsonyabb restríktív hőmérséklet, amelyen a plakktitemek 100-szoros vagy még nagyobb csökkenését észleltük (vastagon kiemelt számok a táblázatban).
* Kis plakk fenotípus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 50%-a).
** Tűhegyplakk fenotípus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 10%-a).
9. táblázat
RSV cpts-248-ból származó tíz mutáns replikációja és genetikus stabilitása Balb/c egereken1
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Vírus shut-off hőmérséklete (°C) | Vírustiter (átlag lg pfii/g szövet hat állatból ± standard hiba) | |||||||
| Orrkürtök | Tüdők | ||||||||
| 32 °C | 36 °C | 37 °C | 38 °C | 32 °C | 36 °C | 37 °C | 38 °C | ||
| vad típusú A2 | >40 | 5,1+0,15 | 5,2+0,23 | 5,2+0,14 | 5,2+0,27 | 6,1+0,14 | 5,8+0,23 | 6,0+0,12 | 5,9+0,17 |
| cp-RSV | >40 | 4,9+0,20 | 5,1+0,16 | 4,9+0,24 | 4,9+0,22 | 6,0+0,16 | 5,9+0,23 | 5,6+0,15 | 5,6+0,13 |
| ts-1 | 38 | 3,9+0,25 | 2,7+0,27 | 2,4+0,42 | 2,5+0,29 | 4,1+0,21 | 3,5+0,23 | 2,6+0,18 | 2,0+0,33 |
| cpts-248 | 38 | 4,0+0,16 | 2,5+0,34 | <2,0 | <2,0 | 4,4+0,37 | 1,8+0,15 | <1,7 | <1,7 |
| 248/1228 | 37 | 4,1+0,15 | 2,4+0,48 | <2,0 | <2,0 | 2,0+0,37 | <1,7 | <1,7 | <1,7 |
| 248/1075 | 37 | 4,2+0,18 | 2,4+0,40 | <2,0 | <2,0 | 5,5+0,16 | 3,5+0,18 | <1,7 | <1,7 |
| 248/965 | 37 | 3,8 ±0,23 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 4,5+0,21 | 3,4+0,16 | <1,7 | <1,7 |
| 248/967 | 37 | 4,4+0,20 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 5,4+0,20 | 3,6+0,19 | <1,7 | <1,7 |
| 248/804 | 37 | 2,9+0,19 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 3,6+0,19 | <1,7 | <1,7 | <1,7 |
| 248/955 | 36 | 3,2+0,10 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 3,2+0,22 | <1,7 | <1,7 | <1,7 |
| 248/404 | 36 | 2,1+0,31 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 4,4+0,12 | 1,8+0,20 | <1,7 | <1,7 |
| 248/26 | 36 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 2,3+0,20 | <1,7 | <1,7 | <1,7 |
| 248/18 | 36 | 2,9+0,99 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 4,3+0,23 | 1,8+0,15 | <1,7 | <1,7 |
| 48/240 | 36 | 2,9+0,82 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | 3,9+0,12 | <1,7 | <1,7 | <1,7 |
1 Az egereknek 106·3 píu vírust adagoltunk intranazálisan könnyű altatás alatt a 0. napon, majd szén-dioxid-belélegeztetéssel a 4. napon az állatokat leöltük.
10. táblázat cpts-RSV 248/404, cpts-248/18, cpts-RSV 248, cp-RSV vagy vad típusú RSV A2 replikációja szeronegatív csimpánzok felsői és alsó légútjában
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Fertőzés módja | Csimpánzok száma | V írusvisszanyerés | |||||
| Orrgarat | Légcső | Orrváladék | ||||||
| Időtartam11 (napok) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Időtartam11 (napok) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Átlag0 | Csúcs | |||
| cpts-248/404 | IN+IT | 13 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 |
| IN+IT | 14 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 |
HU 220 189 Β
10. táblázat (folytatás)
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Fertőzés módja | Csimpánzok száma | V írus visszanyerés | |||||
| Orrgarat | Légcső | Orrváladék | ||||||
| Időtartam11 (napok) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Időtartam8 (napok) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Átlag11 | Csúcs | |||
| Cpts-248# | IN+IT | 1 | 10 | 4,6 | 8d | 5,4 | 0,2 | 1 |
| IN+IT | 2 | 10 | 4,5 | 6 | 2,2 | 0,1 | 1 | |
| IN+IT | 3 | 9 | 4,7 | 10 | 2,1 | 0,1 | 1 | |
| IN+IT | 4 | 9 átlag 9,5 | 4,2 átlag 4,5 | 8d átlag 8,0 | 2,2 átlag 3,0 | 0,1 átlag 0,1 | 1 átlag 1,0 | |
| cp-RSV# | IN | 5 | 20 | 5,3 | 8d | 2,9 | 1,0 | 3 |
| IN | 6 | 16 | 5,8 | 6d | 3,0 | 1,8 | 3 | |
| IN+IT | 7 | 13 | 4,3 | 6d | 3,0 | 0,6 | 1 | |
| IN+IT | 8 | 16 átlag 16 | 5,0 átlag 5,1 | ÍO1 átlag 7,5 | 2,8 átlag 2,9 | 0,5 átlag 1,0 | 1 átlag 2,0 | |
| vad típusú A2# | IN | 9 | 9 | 5,1 | 13 | 5,4 | 1,0 | 1 |
| IN | 10 | 9 | 6,0 | 8 | 6,0 | 1,7 | 4 | |
| IN+IT | 11 | 13 | 5,3 | 8 | 5,9 | 2,1 | 3 | |
| IN+IT | 12 | 19 átlag 10 | 5,4 átlag 5,5 | 8 átlag 9,3 | 5,6 átlag 5,7 | 1,0 átlag 1,4 | 3 átlag 2,8 |
a IN=csak intranazális; IN+IT=mind intranazális, mind intratrachcális adagolás.
8 A fertőzés utáni utolsó napot jelenti, amelyen a vírust visszanyertük.
c Átlagos orrváladékpontszám, a napi pontok összegét jelenti 8 napon keresztül a maximális vírusszámot képviselő nap körül, nyolccal osztva. A legmagasabb pontszám a 4, a legalacsonyabb pontszám a 0.
d A vírust csak a megadott napon izoláltuk.
* Nem tesztelt.
# Ezek ugyanazok az állatok, mint amelyeket a 4. és 7. táblázatban feltüntettünk.
11. táblázat
Csimpánzok cpts-248/404 vírussal való immunizálása által indukált rezisztencia RSV A2 vad típusú vírussal történő fertőzés ellen a 28. napon
| Állat immunizálására alkalmazott vírus | Csim- pánzok száma | V írusvisszanyerés | Orrfolyáspontszám | Szérumscmlegesítő antitest litere (reciprok log2) a megadott napon | |||||
| Orrgarat | Légcső | ||||||||
| Időtartam (nap) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Időtartam (nap) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Átlag3 | Csúcs | 28. nap | 42. vagy 52. nap | ||
| cpts-248/404 | 13 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | NYT | NYT |
| 14 | 8 átlag 4,0 | 3,4 átlag 2,0 | 0 átlag 0 | <0,7 átlag <0,7 | 0 átlag 0 | 0 átlag 0 | NYT | NYT | |
| cpts-248# | 1 | 5 | 2,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | 10,1 | 11,0 |
| 2 | 9 átlag 7,0 | 1,8 átlag 2,3 | 0 átlag 0 | <0,7 átlag <0,7 | 0 átlag 0 | 0 átlag 0 | 10,3 átlag 10,2 | 14,5 átlag 12,8 | |
| cp-RSV# | 5 | 5 | 1,0 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | 11,1 | 13,3 |
| 6 | 8 átlag 6,5 | 0,7 átlag 0,9 | 0 átlag 0 | <0,7 átlag <0,7 | 0 átlag 0 | 0 átlag 0 | 11,4 átlag 11,2 | 12,9 átlag 13,1 | |
| nincs# | 9 | 9 | 5,1 | 13 | 5,4 | 1,0 | 1 | <3,3 | 12,4 |
| 10 | 9 | 6,0 | 8 | 6,0 | 1,7 | 4 | <3,3 | 13,2 | |
| 11 | 13 | 5,3 | 8 | 5,9 | 2,1 | 3 | <3,3 | 11,6 | |
| 12 | 9 átlag 10 | 5,4 átlag 5,5 | 8 átlag 9,2 | 5,6 átlag 5,7 | 1,0 átlag 1,4 | 3 átlag 2,8 | <3,3 átlag <3,3 | 11,2 átlag 12,1 |
3 Az átlagos orrfolyáspontszám a pontok összegét jelenti a maximális vírusürítés 8 napja alatt, nyolccal osztva.
A legmagasabb pontszám 4. A 0 pontszám azt jelenti, hogy nem észlelhető orrfolyás a tíznapos megfigyelési idő egyetlen napján sem. NYT=még nem tesztelt.
# Ezek ugyanazok az állatok, mint amelyeket a 4., 7. és 10. táblázatban ismertettünk.
HU 220 189 Β
12. táblázat
RSV cpts-53O-ból származó 14 mutáns plakk-képzésének hatékonysága HEp sejteken tesztelve, permmisszív és restriktív hőmérsékleteken, a kontrollokkal összehasonlítva
| Vírus | Vírus titere (lg pfú/ml) a megadott hőmérsékleten (°C) | Shut-off hőmérséklet (°C)' | Kis plakk 32 °C-on | |||
| 32 | 35 | 36 | 37 | |||
| cp-RSV | 6,3 | 6,3 | 6,0 | 6,3 | >40 | nincs |
| cpts-530 | 2,7 | 2,5 | 2,4* | 2,2** | >39 | nincs |
| 1. kísérlet 530/9 | 4,4 | 3,5* | 3,0** | <1,0 | 37 | nincs |
| 530/346 | 3,1 | 3,0* | 2,3** | <1,0 | 37 | nincs |
| 530/653 | 2,0 | 2,5* | <1,0 | <1,0 | 36 | nincs |
| 530/667 | 4,8 | 4,2* | <1,0 | <1,0 | 36 | nincs |
| 530/403 | 2,6* | <1,0 | <1,0 | <1,0 | 35 | nincs |
| 530/188 | 3,2* | <1,0 | <1,0 | <1,0 | 35 | van |
| 530/464 | 3,6* | <1,0 | <1,0 | <1,0 | 35 | van |
| 2. kísérlet 530/1009 | 4,4 | 4,4 | 3,0** | <0,7 | 37 | nincs |
| 530/1178 | 4,1* | 3,8* | 2,5** | <0,7 | 37 | van |
| 530/1074 | 4,1 | 4,1* | 2,4** | <0,7 | 37 | nincs |
| 530/963 | 4,5 | 4,3* | 23** | <0,7 | 36 | nincs |
| 530/977 | 4,6* | 4,2* | 0,7* | <0,7 | 36 | nincs |
| 530/1030 | 3,2* | 1,3** | <0,7 | <0,7 | 36 | van |
| 530/1003 | 3,6 | 3,0* | <0,7 | <0,7 | 36 | nincs |
* Kis plakk fenotípus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 50%-a).
** Tühegyplakk fenotípus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 10%-a).
1 Shut-off hőmérséklet: az a legalacsonyabb restriktív hőmérséklet, amelyen a plakktitemek 100-szoros vagy még nagyobb csökkenését észleltük (vastagon kiemelt számok a táblázatban). Azokra a vírusokra, amelyeknek titere 32 °C-on <2,9, a shut-offhőmérséklet azt a legalacsonyabb hőmérsékletet jelenti, amelyen a vírus nem képez plakkot.
2. példa
Hideghez szoktatás alkalmazása a cpRSV-mutánsok gyengítésére
Ebben a példában szaporodásgátló mutációk bevezetését ismertetjük nem teljesen gyengített, gazdaspecifikus cpRSV törzsekbe a törzsek egyre csökkenő hő- 40 mérsékleteken végzett további passzálásával olyan származékok előállítására, amelyek megfelelőbben gyengítettek humán vakcinákban való alkalmazásra.
Ezt a hideghez való szoktatást (ca) alkalmaztuk a szeronegatív gyermekekben nem teljesen gyengítettnek mutatkozó cpRSV 3131 vírus további gyengítésére.
Első lépésben a Flow Laboratories-ból származó, hidegen passzált RSV-ből (cpRSV 3131) szülői törzstenyészetet állítottunk elő oly módon, hogy MRC-5 sejtekben 25 °C-on passzáltuk az 1. példában leírtak sze- 50 rint. Röviden, a hidegen passzált vírust egysejtrétegű MRC-5 vagy Verő sejttenyészetre inokuláltuk (a fertőzés multiplicitása <0,01), és a fertőzött sejteket 3 -14 napon keresztül inkubáltuk a soron következő passzálás előtt. A jobban gyengített vírus előállítására a vírust 20 alkalommal passzáltuk 20-22 °C-on. A gyors paszszálás módszere - amint a vírus szaporodásának első jele nyilvánvalóvá válik (azaz 3-5 nap) - előnyös volt azon mutánsok szelektálására, amelyek alacsony hőmérsékleteken megfelelően szaporodnak. Ezenkívül egy
RSV B alcsoportba tartozó törzset, a St. Louis/ /14617/85 1A1 kiónt primer afrikai zöldmajomvesesejteken izoláltuk, MRC sejtekben passzáltuk és klónoztuk (1A1-MRC14), és hidegen 51-szer passzáltuk ezekben a sejtekben 32- 22 °C-on.
Egy másik megközelítés szerint a klónozatlan szülői cpRSV 3131 vírus egy biológiailag klónozott származékát alkalmaztuk. Ezt a vírust biológiailag klónoztuk marhaembrióvese-(BEK-) sejtekben [ezt a szövetet alkalmazták eredetileg a cpRSV 3131 előállítására 45 lásd Friedewald és munkatársai, J. Amer. Med. Assoc., 204, 690-694 (1968)]. Ezt a klónozott vírust ezután 10 napos időközökben Verő sejtekben passzáltuk alacsony hőmérsékleten. Alternatív megoldásként a cpRSV 3131 vírust véghígítással (TD2P4) klónoztuk MRC-5 sejtekben és 10 napos intervallumokban Verő sejtekben passzáltuk.
Egy harmadik megközelítés szerint szelektáltuk azokat a mutánsokat, amelyek alacsony hőmérsékleten nagy plakkokat képeznek. Azonosítottunk egy RSV 55 cp3131 származékvírust, amelyet Dl-plakknak neveztünk el, ez 25 °C-on nagy plakkokat képez. Ez a vírus a cp3131-l (BEK) vonal cp3131-17 (BEK) vonal harmadik passzálásából (P3) származott. A P3 vírus által képezett legnagyobb plakkot 32 °C-on szaporítottuk, 60 majd 25 °C-on újra plakkokat képeztünk. Ismét kiváló
HU 220 189 Β lasztottuk a legnagyobb plakkot, újra szaporítottuk, majd újra plakkot képeztünk. Öt ilyen ciklus után kaptuk a Dl nagy plakk mutáns vírust. A Dl-et biológiailag klónoztuk két további plakkról plakkra tisztítási ciklussal 25 °C-on.
A biológiailag klónozott Dl vírus jelentősen és egységesen nagyobb plakkokat képez 25 DC-on, mint a cp3131 vagy a vad típusú A2 vírus. így a Dl hideghez szokott a nagy plakkméret kritériuma alapján 25 °C-on. Előzetes vizsgálatokból arra következtettünk, hogy a Dl nem hőmérséklet-érzékeny. 37 °C-on a Dl plakkokat nem lehet megkülönböztetni a vad típusú RSV vagy a cp3131 plakkjaitól, ami azt jelenti, hogy a Dl szaporodása nem korlátozott ezen a hőmérsékleten. Ezzel összhangban a Dl erős citopatikus hatást fejt ki egysejtrétegú Verő sejtekre 37 °C-on és 40 °C-on (azaz a tesztelt legmagasabb hőmérsékleteken).
3. példa
További gyengítőmutációk bevezetése ts-RSV-be
Ebben a példában szülői vírusként ts-mutánsok alkalmazását ismertetjük tökéletesebben gyengített törzsek előállítására. A kísérletekhez két RSV A2 ts-mutánst szelektáltunk, mégpedig a ts-4-et és a ts-1 NG1et. Az RSV ts-mutánsokba további mutációk bevezetésére két különböző módszert alkalmaztunk. Az első módszer szerint a nem teljesen gyengített RSV ts-mutánst kémiai mutagenezisnek vetettük alá, és a plakkképzését tekintve inkább hőmérséklet-érzékeny mutagenizált utódot választottuk ki további analízisre. Második módszer szerint az RSV ts-mutánsokat alacsony hőmérsékleten passzálva szelektáltuk a ca fenotípusú RSV ts-mutánsokat, azaz azokat a mutánsokat, amelyek a vad típusú szülővírushoz képest jobban tudtak szaporodni szuboptimális hőmérsékleten.
A ts-1 NGl vírus szülői törzstenyészetet MRC-5ön szaporított élő légzési syncytiális vírus (A2) ts-1 NGl mutáns vírusból (Flow Laboratories Lót M2) állítottuk elő. Ez a mutáns - amely ts-mutánsból származik egy második 5-fluor-uracillal végzett mutagenezissel két vagy több, egymástól független ts-mutációval rendelkezik, de még mindig jelentős orrfolyást idéz elő érzékeny csimpánzokban. Ezt a vírust Verő sejtekben 32 °Con kétszer passzálva állítottuk elő mutagenezishez a ts-1 NGl szuszpenziót. A vírust 4xl0~4 mol/1 5-fluoruracil jelenlétében szaporítva indukáltuk a mutációkat a szaporodás során, vagy 5-aza-citidinnel kezeltük 36 °Con az 5-fluor-uracillal végzett kezelés után. A mutagenizált törzset ezután plakkvizsgálattal analizáltuk Verő sejteken, amelyeket agar fedőréteg alatt tartottunk, és megfelelő időn keresztüli inkubálás után a plakkokat mikroszkóposán azonosítottuk. 586 plakkot szedtünk le, és az egyes plakkokat elkülönítetten szaporítottuk Verő sejtek friss egysejtrétegén. A mutagenizált ts-1 NGl vírus egyetlen plakkjának utódjaival inokulált egyes szövettenyészetek tartalmát külön-külön összegyűjtöttük, amikor a Verő sejtekre kifejtett citopatikus hatás maximálisnak tűnt. Az így összegyűjtött plakkokat HEp-2 sejteken 32 és 36 °C-on titrálva választottuk ki azokat az utódvírusokat, amelyek a ts-1 NGl-nél nagyobb mértékben voltak hőmérséklet-érzékenyek. Minden olyan vírust tovább vizsgáltunk, amely a ts-1 NGl-nél nagyobb hőmérséklet-érzékenységet mutatott [azaz titere 100szorosan csökkent restriktív hőmérsékleten (36 °C-on) a 32 °C-on mért titerhez képest]. Hat olyan plakkutódot azonosítottunk, amely az RSV ts-1 NGl szülővírusnál hőmérséklet-érzékenyebb volt, és ezeket a törzseket biológiailag klónoztuk Verő sejteken háromszori sorozatos plakktisztítással, majd Verő sejtekben szaporítottuk. A klónozott törzseket 32 °C-on, 35 °C-on, 36 °C-on, °C-on és 38 °C-on titráltuk (plakk-képzés hatékonyságának vizsgálata) ts fenotípusuk megerősítésére. A plakk-képződés hatékonyságára vonatkozó adatok, amelyeket HEp-2 sejteken végzett vizsgálattal kaptunk, még inkább megerősítették a hat mutáns fenotípusát (13. táblázat).
A két leginkább hőmérséklet-érzékeny vírus, az A-20-4 és az A-37-8 egereken erősen gyengítettnek mutatkozott a ts-1 NGl szülővírushoz viszonyítva, jelezvén, hogy a hőmérséklet-érzékenység fokozott szintjének megszerzése nagyobb mértékű gyengítettséggel párosult (14. táblázat). Ezek a vírusok egerekre nézve fertőzőképeseket voltak, mert antitestválaszt indukáltak. A ts-1 NG-l/A-20-4 vírus csimpánzokon gyengítettnek mutatkozott (15. táblázat), és a csimpánzok fertőzése ts-1 NG1/A—20-4 vírussal rezisztenciát indukált a vad típusú vírussal való fertőzés ellen (16. táblázat). Nagyon jelentős, hogy orrfolyás nem jelentkezett.
A ts-4 vírus mutagenezisét is elvégeztük a ts-1 NGl vírus mutagenezisére alkalmazott eljárással. Öt olyan plakkutódot azonosítottunk, amely az RSV ts-4 szülővírusnál erősebben hőmérséklet-érzékeny volt (17. táblázat).
A ts-1 NGl vírusba és a ts-4 vírusba hidegen passzálással is bevezettünk mutációkat. A ts-4 vírus 22 °C-on jobban replikálódott (titere nagyobb volt) hidegen passzálás után.
13. táblázat ts-1 NGl származékok plakk-képzésének hatékonysága
| Vírus | Titer (lg pfú/ml) a megadott hőmérsékleten | ||||
| 32 °C | 35 °C | 36 °C | 37 °C | 38 °C | |
| A-20-4 (4-l)a | 5,9* | <1 | <1 | <1 | <1 |
| A-37-8 (1-2)* | 6,3 | 6,3 | <1 | <1 | <1 |
| A-15-7 | 3,5 | ND | 2,1 | 1,5 | <1 |
HU 220 189 Β
13. táblázat (folytatás)
| Vírus | Titer (lg pfu/ml) a megadott hőmérsékleten | ||||
| 32 °C | 35 °C | 36 °C | 37 °C | 38 °C | |
| A-25-8 | 5,3 | ND | 5,0* | 4,8* | <1 |
| A-21 | 5,1** | ND | 4,8** | 4,5** | <1 |
| ts-INGI | 6,6 | 6,6 | 6,5 | 6,6 | <1 |
a Háromszor plakktisztított.
* Kis plakk fenotípus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 50%-a).
** Tűhegyplakk fenotípus (vad típusú plakk méretének legfeljebb 10%-a).
14. táblázat ts-1 NG1 szülő- és utódvírusok replikációja Balb/C egerekben
| Vírus | Dózis (lg 10) | Fertőzés utáni nap | Titer a tüdőben | Titer az orrban | ||
| 32 °C | 38 °C | 32 °C | 38 °C | |||
| A2 wt | 6,1 | 4 | 4,66±0,32a | 4,80+0,16 | 3,18+0,40 | 3,29+0,33 |
| 5 | 5,18+0,33 | 5,25+0,23 | 3,40+0,20 | 3,47+0,14 | ||
| TslNGl | 5,8 | 4 | 4,31+0,17 | <2,0 | 2,82+0,25 | <2,0 |
| 5 | 3,98+0,12 | <2,0 | 2,74+0,31 | <2,0 | ||
| A-20-4 | 6,1 | 4 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | <2,0 |
| 5 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | ||
| A-37-8 | 6,3 | 4 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | <2,0 |
| 5 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | <2,0 |
a Átlag lg 10±standard hiba, hat állat/csoport.
15. táblázat ts-1 NG1/A-20-4, ts-1 NG1, ts-1 vagy vad típusú RSV A2 replikációja szeronegatív csimpánzok felső és alsó légútjában
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Inokuláció módja | Csimpánzok száma | Virusvisszanyerés | |||||
| Orrgarat | Trachea | Orrváladék | ||||||
| Időtartamb (napok) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Időtartamb (napok) | Csúcstiter (lg pfu/ml) | Átlag' | Csúcs | |||
| ts-INGI/ | IN+IT | 15 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 |
| /A-20-4 | IN+IT | 16 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 |
| IN+IT | 17 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | |
| IN+IT | 18 | 16d átlag 4,0 | 2,7 átlag 1,2 | 0 átlag 0 | <0,7 átlag <0,7 | 0 átlag 0 | 0 átlag 0 | |
| ts-INGI | IN | 19' | 8 | 4,2 | 0 | <1,1 | 0,6 | 1 |
| IN | 20' | 7 | 3,9 | 0 | <1,1 | 0,7 | 1 | |
| IN | 21' | 13 | 5,4 | 0 | <1,1 | 0,4 | 1 | |
| IN | 22' | 10 átlag 9,5 | 5,2 átlag 4,7 | 10* átlag 0,25 | 3,7d átlag 1,8 | 0,6 átlag 0,6 | 2 átlag 1,3 | |
| tsl | IN | 23' | 16 | 3,4 | 0 | <1,1 | 0,4 | 1 |
| IN | 24' | 13 | 4,4 | 0 | <1,1 | 1,0 | 3 | |
| IN | 25' | 13 | 5,0 | 13d | 2,2 | 2,0 | 4 | |
| IN | 26' | 10 átlag 13 | 3,4 átlag 4,1 | 0 átlag 0,25 | <1,1 átlag 1,4 | 1,0 átlag 1,1 | 2 átlag 2,5 |
HU 220 189 Β
75. táblázat (folytatás)
| Állatok fertőzésére alkalmazott vírus | Inokuláció módja | Csimpánzok száma | Vírusvisszanyerés | |||||
| Orrgarat | Trachea | Orrváladék | ||||||
| Időtartamb (napok) | Csúcstiter (lg pfú/ml) | Időtartamb (napok) | Csúcstiter (lg píú/ml) | Átlag= | Csúcs | |||
| vad típusú A2 | IN | 9f | 9 | 5,1 | 13 | 5,4 | 1,0 | 1 |
| IN | 10f | 9 | 6,0 | 8 | 6,0 | 1,7 | 4 | |
| IN+IT | 11= | 13 | 5,3 | 8 | 5,9 | 2,1 | 3 | |
| IN+IT | 12= | 9 átlag 10 | 5,4 átlag 5,5 | 8 átlag 9,3 | 5,6 átlag 5,7 | 1,0 átlag 1,4 | 3 átlag 2,8 |
3 IN=csak intranazális; IN+IT=mind intranazális, mind intratracheális adagolás.
b A fertőzés utáni utolsó napot jelenti, amelyen a vírust visszanyertük.
= Átlagos orrváladékpontszám, a napi pontok összegét jelenti 8 napon keresztül a maximális vírusszámot képviselő nap körül, nyolccal osztva. A legmagasabb pontszám a 4, a legalacsonyabb pontszám a 0.
4 A vírust csak a megadott napon izoláltuk.
= Állatok Crowe és munkatársaitól [Vaccine, nyomdában (1993)].
f Állatok Collins és munkatársaitól [Vaccine 8, 164-168 (1990)].
16. táblázat
Csimpánzok immunizálása 104 pfú RSV ts—1 NGl/A-20-4-gyel, ts-1 NGl-gyel vagy ts-l-gyel rezisztenciát indukált 104 pfu vad típusú RSV A2-vel való fertőzés ellen a 28. napon
| Állat immunizálására alkalmazott vírus | Csimpánzok száma | V írusvisszanyerés | Orrfolyás pontszáma | Szérumsemlegesítő antitest titere (reciprok log2) a megadott napon | |||||
| Orrgarat | Légcső | ||||||||
| Időtartam (nap) | Csúcstiter (lg pfú/ml) | Időtartam (nap) | Csúcstiter (lg pfú/ml) | Átlag3 | Csúcs | 28. nap | 42. vagy 52. nap | ||
| ts-INGI/ /A-20-4 | 15 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | <3,3 | folyamat- ban |
| 16 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | <3,3 | folyamat- ban | |
| 17 | 0 | <0,7 | 0 | <0,7 | 0 | 0 | 6,8 | folyamat- ban | |
| 18 | 3 átlag 0,8 | 2,0 átlag 1,0 | 0 átlag 0 | <0,7 átlag <0,7 | 0 átlag 0 | 0 átlag 0 | 9,7 átlag 5,8 | folyamat- ban átlag | |
| ts-INGI | 19b | 0 | <0,7 | 0 | <1,1 | 0 | 0 | 11,4 | 10,4 |
| 20b | 0 | <0,7 | 0 | <1,1 | 0 | 0 | 14,4 | 12,4 | |
| 21b | 0 | <0,7 | 0 | <1,1 | 0 | 0 | 11,8 | 8,9 | |
| 22b | 0 átlag 0 | <0,7 átlag <0,7 | 0 átlag 0 | <1,1 átlag <1,1 | 0 átlag 0 | 0 átlag 0 | 10,2 átlag 12,0 | 10,6 átlag 10,6 | |
| ts— 1 | 23b | 0 | <0,7 | 0 | <1,1 | 0 | 0 | 10,9 | 9,8 |
| 29b | 0 | <0,7 | 0 | <1,1 | 0 | 0 | 12,2 | 15,8 | |
| 25b | 5 | 0,7 | 0 | <1,1 | 0 | 0 | 7,7 | 9,9 | |
| 26b | 5 átlag 2,5 | 0,7 átlag 0,7 | 0 átlag 0 | <1,1 átlag <1,1 | 0 átlag 0 | 0 átlag 0 | 17,7 átlag 12,1 | 14,5 átlag 12,5 |
HU 220 189 Β
16. táblázat (folytatás)
| Állat immunizálására alkalmazott vírus | Csimpánzok száma | V írusvisszanyerés | Orrfolyás pontszáma | Szérumsemlegesítő antitest titere (reciprok log2) a megadott napon | |||||
| Orrgarat | Légcső | ||||||||
| Időtartam (nap) | Csúcstitcr (lg pfú/ml) | Időtartam (nap) | Csúcstiter (lg pfú/ml) | Átlag3 | Csúcs | 28. nap | 42. vagy 52. nap | ||
| nincs | 9C | 9 | 5,1 | 13 | 5,4 | 1,0 | 1 | <3,3 | 12,4 |
| l(k | 9 | 6,0 | 8 | 6,0 | 1,7 | 4 | <3,3 | 13,2 | |
| llb | 13 | 5,3 | 8 | 5,9 | 2,1 | 3 | <3,3 | 11,6 | |
| 12b | 9 átlag 10 | 5,4 átlag 5,5 | 8 átlag 9,3 | 5,6 átlag 5,7 | 1,0 átlag 1,5 | 3 átlag 2,8 | <3,3 átlag <3,8 | 11,2 átlag 12,1 |
“ Az átlagos orrfolyáspontszám a pontok összeget jelenti a maximális vírusürítés 8 napja alatt, nyolccal osztva.
A legmagasabb pontszám 4. A 0 pontszám azt jelenti, hogy nem észlelhető orrfolyás a tíznapos megfigyelési idő egyetlen napján sem; 0 a legalacsonyabb pontszám.
b Állatok Crowe és munkatársaitól [Vaccinc, nyomdában (1993)].
c Állatok Collins és munkatársaitól [Vaccine 8, 164-168 (1990)].
17. táblázat ts-4-származékok plakk-képzésének hatékonysága
| Vírus | Titer (lg pfú/ml) a megadott hőmérsékleten | ||||
| 32 °C | 35 °C | 36 °C | 37 °C | 38 °C | |
| ts-4/F-15-8 | 6,0 | 5,9* | 6,0* | <2,0a | <2,0 |
| ts-4/F-19-l | 5,5 | 5,3* | 5,4* | <2,0 | <2,0 |
| ts-4/F-20-7 | 6,1 | 6,1* | 6,1* | <2,0a | <2,0 |
| ts-4/F-29-7 | 5,8 | <2,0 | <2,0 | <2,0 | <2,0 |
| ts-4/F-31-2 | 5,6 | <2,0a | <2,0a | <2,0 | <2,0 |
| ts-4 (szülő) | 6,1 | 6,3 | 6,3 | 6,1 | <2,0 |
3 Hazy-festés.
* Kis plakk fenotípus (vad típusú plakk méretének < 50%-a).
Embereken végzett vizsgálatok A találmány szerinti gyengített vírust embereknek adagoltuk jól ismert humán RSV vakcinaprotokollok szerint [lásd például Wright és munkatársai, Infect. Immun. 37, 397-400 (1982); Kim és munkatársai, Pediat- 45 rics 52, 56-63 (1973) és Wright és munkatársai, J. Pediatr. 88, 931-936 (1976)]. Röviden, a felnőtteket vagy gyerekeket intranazálisan fertőztük cseppkészítménnyel, amely ml-enként 103—105 pfu gyengített vírust tartalmaz, a dózistérfogat 0,5 ml. Az antitestválaszt 50 komplement fixálással, plakksemlegesítéssel és/vagy enzimkötött immunszorbens-meghatározással értékeltük ki. A kísérleti alanyokon figyelemmel kísértük a felső légúti betegségek tüneteit és jeleit. A csimpánzokon végzett kísérletekhez hasonlóan a vakcina gyengített ví- 55 rusa a vakcináit egyedek orrgaratában legalább tízszer kisebb mértékben szaporodott, mint a vad típusú vírus, és a szaporodás mértéke legalább tízszer kisebb volt a cpRSV vagy az egyéb, nem teljesen gyengített szülőtörzsek szaporodásához viszonyítva. A kísérleti alanyok- 60 nak szükség szerint időközönként további immunizálásokat is adtunk a védőimmunitás megfelelő szintjének fenntartására.
Noha a találmány megértésére és szemléltetésére a fentiekben specifikus kiviteli alakokat közöltünk, a találmány oltalmi körébe tartoznak a szakember számára magától értetődő módosítások is.
Claims (29)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy egy fiziológiásán elfogadható hordozóban legalább egy gyengített légzési syneytiális vírust tartalmaz, amely legalább két gyengítőmutációval rendelkezik, a fenti vírust gazdaspecifikus, hidegen passzált légzési syneytiális vírus hőmérséklet-érzékeny mutánsa, gazdaspecifikus, hidegen passzált légzési syneytiális vírus hideghez szokott mutánsai, vagy további hőmérséklet-érzékeny mutációkkal rendelkező hőmérsék20HU 220 189 Β let-érzékeny légzési syncytiális vírusmutánsok közül választjuk, amely gyengített vírus hőmérséklet-érzékeny vagy hideghez szokott fenotípussal rendelkezik az in vivő replikáció során, replikációja legalább 10-szer kisebb mértékű a felső légutakban, mint a vad típusú légzési syncytiális vírusé, és a szérumban a vad típusú légzési syncytiális víruséval összemérhető mennyiségű semlegesítő antitestválaszt indukál in vivő.
- 2. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy egy immunválaszt fokozó adjuvánst is tartalmaz.
- 3. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus egy vagy több további mutációval tovább gyengített, ezáltal hőmérséklet-érzékennyé tett, vagy szövettenyészetben normál méretű plakkok képzésére képtelen gazdaspecifikus, hidegen passzált légzési syncytiális vírus.
- 4. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus egy körülbelül 20-25 °Con végzett hidegen passzálással tovább gyengített, és ezáltal hideghez szoktatott gazdaspecifikus, hidegen passzált, légzési syncytiális vírus.
- 5. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített vírus egy vagy több mutáció bevezetésével, hidegen passzálással vagy kémiai mutagenezissel tovább gyengített, ezáltal hőmérséklet-érzékenyebbé tett, vagy szövettenyészetben normál méretű plakkok képzésére képtelen ts-ING-l.
- 6. Az 5. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus legalább egy mutáció bevezetésével tovább gyengített ts-1 NG-1 vírus.
- 7. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített vírus egy vagy több mutáció bevezetésével, hidegen passzálással vagy kémiai mutagenezissel tovább gyengített, ezáltal hőmérséklet-érzékenyebbé tett, vagy szövettenyészetben normál méretű plakkok képzésére képtelen ts-4.
- 8. A 7. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus legalább egy mutáció bevezetésével tovább gyengített ts-4 vírus.
- 9. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített vírus A vagy B alcsoportba tartozik.
- 10. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített vírus az A2 törzs A alcsoportjába tartozik.
- 11. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts spRSV 248/1228;ii) cpts RSV 475;iii) cpts RSV 530, 530/9, 530/346, 530/653, 530/667,530/403, 530/188, 530/464, 530/1009, 530/1178,530/1074, 530/963, 530/977, 530/1030, 530/1003;iv) cpRSV 3131 Dl;v) RSV ts-1 NG1/A-20-4, A-37-8, A-15-7,A-25-8, A-21; és vi) RSV ts-4/F-15-8, F-19-1, F-20-7, F-29-7,F-31-2.
- 12. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts spRSV 248/1228;ii) cpts RSV 530;iii) cpts RSV 3131 Dl;iv) RSV ts-1 NG1/A-20-4, A-37-8; ésv) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7.
- 13. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248, 248/404;ii) cpts RSV 530;iii) RSV ts-1 NG1/A-20-4, A-37-8; és iv) RSV ts-4/F-19-l, F-29-7.
- 14. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248/404;ii) cpts RSV 530; és iii) RSV ts-1 NG1/A-20-4.
- 15. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy egy dózisa 103-106 pfú gyengített vírust tartalmaz.
- 16. Vakcinakészítmény légzési syncytiális vírus elleni védelem kiváltására valamely egyed immunrendszerének stimulálásával, azzal jellemezve, hogy fiziológiásán elfogadható hordozóban, immunológiailag hatásos mennyiségben legalább egy gyengített vírust tartalmaz, amelyet legalább két gyengítőmutációt tartalmazó, gazdaspecifikus, hidegen passzált légzési syncytiális vírus hőmérséklet-érzékeny mutánsaiból, gazdaspecifikus, hidegen passzált, légzési syncytiális vírus hideghez szoktatott mutánsaiból és további hőmérsékletérzékenységet fokozó mutációkat tartalmazó, hőmérséklet-érzékeny légzési syncytiális vírusból választunk, amely gyengített vírus hőmérséklet-érzékeny vagy hideghez szokott fenotípussal rendelkezik az in vivő replikáció során, replikációja legalább 10-szer kisebb mértékű a felső légutakban, mint a vad típusú légzési syncytiális vírusé, és a szérumban a vad típusú légzési syncytiális víruséval összemérhető mennyiségű semlegesítő antitestválaszt indukál in vivő.
- 17. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a vírus egy vagy több további mutációval tovább gyengített, ezáltal hőmérsékletérzékennyé tett, vagy szövettenyészetben normál méretű plakkok képzésére képtelen gazdaspecifikus, hidegen passzált légzési syncytiális vírus.
- 18. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített vírus, egy körülbelül 20-25 °C-on végzett hidegen passzálással tovább gyengített, és ezáltal hideghez szoktatott gazdaspecifikus, hidegen passzált, légzési syncytiális vírus.
- 19. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített vírus egy vagy több mutáció bevezetésével, hidegen passzálássalHU 220 189 Β vagy kémiai mutagenezissel tovább gyengített, ezáltal hőmérséklet-érzékenyebbé tett, vagy szövettenyészetben normál méretű plakkok képzésére képtelen ts-1 NG-1.
- 20. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts spRSV 248/1228;ii) cpts RSV 475;iii) cpts RSV 530, 530/9, 530/346, 530/653, 530/667,530/403, 530/188, 530/464, 530/1009, 530/1178,530/1074, 530/963, 530/977, 530/1030, 530/1003;iv) cpRSV 3131 Dl;v) RSV ts-1 NG1/A-20-4, A-37-8, A-15-7,A-25-8, A-21;és vi) RSV ts-4/F-15-8, F-19-1, F-20-7, F-29-7,F-31-2.
- 21. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts spRSV 248/1228;ii) cpts RSV 530;iii) cpts RSV 3131 Dl;iv) RSV ts-1 NG1/A-20-4, A-37-8; ésv) RSV ts-4/F-19-l, F-29-7.
- 22. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248,248/404;ii) cpts RSV 530;iii) RSV ts-1 NG1/A-20-4, A-37-8; és iv) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7.
- 23. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített légzési syncytiális vírust az alábbi csoportból választjuk:i) cpts RSV 248/404;ii) cpts RSV 530; és iii) RSV ts-1 NG1/A-20-4.
- 24. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a gyengített vírust 103—106 pfu mennyiségben tartalmazza.
- 25. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy felsó légúti adagolásra alkalmas formában van.
- 26. A 25. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzaljellemezve, hogy orrgaratba történő adagolásra alkalmas formában van.
- 27. A 25, igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy spray, csepp vagy aeroszol formában van.
- 28. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a légzési syncytiális vírus elleni védelmet a vírussal szembeni antitestekre szeronegatív egyed immunrendszerének stimulálásával váltja ki.
- 29. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzaljellemezve, hogy a légzési syncytiális vírus elleni védelmet a vírusra szeropozitív egyed immunrendszerének stimulálásával váltja ki.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US87274692A | 1992-04-21 | 1992-04-21 | |
| US3994593A | 1993-04-09 | 1993-04-09 | |
| PCT/US1993/003670 WO1993021310A1 (en) | 1992-04-21 | 1993-04-20 | Attenuated respiratory syncytial virus vaccine compositions |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9403023D0 HU9403023D0 (en) | 1994-12-28 |
| HUT69992A HUT69992A (en) | 1995-09-28 |
| HU220189B true HU220189B (hu) | 2001-11-28 |
Family
ID=26716607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9403023A HU220189B (hu) | 1992-04-21 | 1993-04-20 | Gyengített légzési syncytialis vírus vakcinakészítmények |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5922326A (hu) |
| EP (1) | EP0640128B1 (hu) |
| JP (1) | JP3883202B2 (hu) |
| KR (1) | KR100257171B1 (hu) |
| AT (1) | ATE181359T1 (hu) |
| AU (1) | AU683840B2 (hu) |
| CA (1) | CA2118509C (hu) |
| DE (1) | DE69325370T2 (hu) |
| DK (1) | DK0640128T3 (hu) |
| ES (1) | ES2132233T3 (hu) |
| GR (1) | GR3031208T3 (hu) |
| HU (1) | HU220189B (hu) |
| IL (1) | IL105456A (hu) |
| MX (1) | MX9302278A (hu) |
| NZ (1) | NZ252857A (hu) |
| RU (1) | RU2139729C1 (hu) |
| UA (1) | UA41315C2 (hu) |
| WO (1) | WO1993021310A1 (hu) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9200117D0 (en) | 1992-01-06 | 1992-02-26 | Connaught Lab | Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use |
| TW275632B (hu) * | 1992-04-21 | 1996-05-11 | American Cyanamid Co | |
| ATE164313T1 (de) | 1993-08-06 | 1998-04-15 | Connaught Lab | Inaktivierte respiratorische synzytial-virus- impfstoffe |
| US7223410B1 (en) | 1994-08-05 | 2007-05-29 | Sanofi Pasteur Limited | Inactivated respiratory syncytial viral vaccines |
| US5716821A (en) * | 1994-09-30 | 1998-02-10 | Uab Research Foundation | Prevention and treatment of respiratory tract disease |
| US5789229A (en) * | 1994-09-30 | 1998-08-04 | Uab Research Foundation | Stranded RNA virus particles |
| US6019980A (en) * | 1995-06-07 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US6083925A (en) | 1995-06-07 | 2000-07-04 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
| US7846455B2 (en) | 1996-07-15 | 2010-12-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated chimeric respiratory syncytial virus |
| US20050287540A1 (en) * | 1995-09-27 | 2005-12-29 | Murphy Brian R | Production of attenuated negative stranded RNA virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
| WO1997012032A1 (en) * | 1995-09-27 | 1997-04-03 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences |
| US7485440B2 (en) | 1995-09-27 | 2009-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2 |
| US6689367B1 (en) | 1995-09-27 | 2004-02-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
| AU2438597A (en) * | 1996-04-04 | 1997-10-29 | Regents Of The University Of Michigan, The | Attenuated respiratory syncytial virus |
| US6077514A (en) * | 1996-04-04 | 2000-06-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Attenuated respiratory syncytial virus |
| CA2260107A1 (en) * | 1996-07-12 | 1998-01-22 | The Regents Of The University Of Michigan | Two-step immunization procedure against the pyramyxoviridae family of viruses using attenuated viral strains and subunit protein preparation |
| KR100894670B1 (ko) | 1996-07-15 | 2009-04-22 | 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 | 클론닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된 호흡기 세포융합 바이러스 백신의 생산 |
| US6699476B1 (en) | 1996-07-15 | 2004-03-02 | Peter L. Collins | Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules |
| CN1232504A (zh) * | 1996-09-27 | 1999-10-20 | 美国氰胺公司 | 在单链负义病毒目病毒内引起减毒的3'基因组启动子区和聚合酶基因中的突变 |
| US20030082209A1 (en) | 2000-07-05 | 2003-05-01 | Skiadopoulos Mario H. | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| US7201907B1 (en) | 1997-05-23 | 2007-04-10 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines |
| US7951383B2 (en) | 1997-05-23 | 2011-05-31 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| US6410023B1 (en) | 1997-05-23 | 2002-06-25 | United States Of America | Recombinant parainfluenza virus vaccines attenuated by deletion or ablation of a non-essential gene |
| US7632508B2 (en) | 1997-05-23 | 2009-12-15 | The United States Of America | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
| FR2764903A1 (fr) * | 1997-06-23 | 1998-12-24 | Pasteur Institut | Detection des infections par des paramyxovirus (virus respiratoire syncitial et virus parainfluenza) utilisant des polynucleotides codant de la proteine l |
| US7662397B2 (en) | 1997-07-15 | 2010-02-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promoter-proximal genes |
| US20040005542A1 (en) | 2001-06-22 | 2004-01-08 | Krempl Christine D | Respiratory syncytial virus vaccines expressing protective antigens from promotor- proximal genes |
| US6482414B1 (en) | 1998-08-13 | 2002-11-19 | The University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Cold-adapted equine influenza viruses |
| US6579528B1 (en) | 1998-08-13 | 2003-06-17 | The University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Cold-adapted equine influenza viruses |
| US6177082B1 (en) | 1998-08-13 | 2001-01-23 | The University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Cold-adapted equine influenza viruses |
| AU4065500A (en) | 1999-04-13 | 2000-11-14 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
| BR0013195A (pt) * | 1999-07-09 | 2002-07-23 | Government Of The Us Dept Of H | Produção de vacinas de virus sincicial respiratório quimérico humano-bovino, atenuado |
| US7820182B2 (en) * | 1999-07-09 | 2010-10-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of attenuated, human-bovine chimeric respiratory syncytial viruses for use in immunogenic compositions |
| ATE350056T1 (de) | 2000-04-03 | 2007-01-15 | Univ Pittsburgh | Zusammensetzungen, die kälteangepasste pferdeinfluenzaviren enthaltende, für die behandlung von bestehende virusinfektionen des atmungssystems |
| EP1441762A1 (en) * | 2001-09-28 | 2004-08-04 | University Of South Florida | Rsv gene expression vaccine |
| WO2003091401A2 (en) | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Medimmune Vaccines, Inc. | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
| US7465456B2 (en) * | 2002-04-26 | 2008-12-16 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
| AU2003295339B2 (en) * | 2002-09-27 | 2009-03-26 | Medimmune, Llc | Functional mutations in respiratory syncytial virus |
| US7687240B2 (en) * | 2003-03-18 | 2010-03-30 | Wyeth Holdings Corporation | Process for increasing RSV surface glycoprotein yields using a mutant strain of RSV |
| US7572904B2 (en) * | 2003-03-28 | 2009-08-11 | Medimmune, Llc | Nucleic acids encoding respiratory syncytial virus subgroup B strain 9320 |
| WO2005018539A2 (en) * | 2003-06-16 | 2005-03-03 | Medimmune Vaccines, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
| AU2004299057B2 (en) * | 2003-12-17 | 2010-06-24 | Wyeth Llc | Methods for porducing storage stable viruses and immunogenic compositions thereof |
| JP4771959B2 (ja) | 2003-12-23 | 2011-09-14 | メディミューン，エルエルシー | インフルエンザウイルス作製のための多重プラスミド系 |
| EP1771552B1 (en) | 2004-05-25 | 2012-08-01 | MedImmune Vaccines, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
| WO2006098901A2 (en) | 2005-03-08 | 2006-09-21 | Medimmune Vaccines, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
| EP2049662A4 (en) * | 2006-07-21 | 2009-12-30 | Medimmune Llc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING REPLICATION CAPACITY OF A FLU VIRUS |
| KR101586968B1 (ko) * | 2006-08-09 | 2016-01-20 | 메디뮨 엘엘씨 | 인플루엔자 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 변이체 |
| US8673613B2 (en) * | 2007-06-18 | 2014-03-18 | Medimmune, Llc | Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide |
| WO2009012155A2 (en) * | 2007-07-13 | 2009-01-22 | Medimmune, Llc | Preparation of negative-stranded rna viruses by electroporation |
| CN102149405A (zh) | 2008-07-11 | 2011-08-10 | 米迪缪尼股份有限公司 | 流感血凝素和神经氨酸酶变体 |
| MX2011008497A (es) | 2009-02-12 | 2011-12-16 | Us Gov Nat Inst Health | Variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza. |
| GB201003630D0 (en) | 2010-03-04 | 2010-04-21 | Novartis Ag | Avian rotavirus |
| CA2850962A1 (en) | 2011-10-07 | 2013-09-06 | Medimmune, Llc | Influenza hemagglutinin variants |
| DK3511015T3 (da) * | 2012-04-13 | 2021-03-15 | Us Health | Genetisk stabil levende svækket respiratorisk syncytialvirusvaccine og fremstilling deraf |
| EP3766516A1 (en) * | 2013-03-14 | 2021-01-20 | President and Fellows of Harvard College | Nanoparticle-based compositions |
| CN105189756B (zh) | 2013-03-14 | 2021-06-11 | 爱默蕾大学 | 具有沉默突变的重组rsv、其相关疫苗和方法 |
| BR112018008708A2 (pt) | 2015-10-29 | 2018-11-06 | Univ Emory | rsv quimérico, composições imunogênicas e métodos de uso |
| RU2746280C1 (ru) * | 2020-08-03 | 2021-04-12 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины" (ФИЦ ФТМ) | Штамм респираторно-синцитиального вируса RSV/Novosibirsk/66Hl/2018 для использования в диагностике респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4866034A (en) * | 1982-05-26 | 1989-09-12 | Ribi Immunochem Research Inc. | Refined detoxified endotoxin |
| US4800078A (en) * | 1987-05-28 | 1989-01-24 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Immunotherapeutic method of treating respiratory disease by intranasal administration of Igb |
| US5250298A (en) * | 1988-10-07 | 1993-10-05 | University Of Delaware | Live attenuated newcastle disease virus vaccines and preparation thereof |
-
1993
- 1993-04-19 IL IL10545693A patent/IL105456A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-04-20 NZ NZ252857A patent/NZ252857A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-04-20 AU AU42907/93A patent/AU683840B2/en not_active Ceased
- 1993-04-20 DK DK93912315T patent/DK0640128T3/da active
- 1993-04-20 AT AT93912315T patent/ATE181359T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-04-20 KR KR1019940703740A patent/KR100257171B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-04-20 UA UA94105948A patent/UA41315C2/uk unknown
- 1993-04-20 WO PCT/US1993/003670 patent/WO1993021310A1/en active IP Right Grant
- 1993-04-20 EP EP93912315A patent/EP0640128B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-20 HU HU9403023A patent/HU220189B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-04-20 MX MX9302278A patent/MX9302278A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-04-20 ES ES93912315T patent/ES2132233T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-04-20 JP JP51866393A patent/JP3883202B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-04-20 RU RU94045898A patent/RU2139729C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-04-20 DE DE69325370T patent/DE69325370T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-04-20 CA CA002118509A patent/CA2118509C/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-10-21 US US08/327,263 patent/US5922326A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-30 US US08/453,304 patent/US6284254B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-30 US US08/453,294 patent/US5882651A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-15 GR GR990402303T patent/GR3031208T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69325370D1 (de) | 1999-07-22 |
| UA41315C2 (uk) | 2001-09-17 |
| KR950701382A (ko) | 1995-03-23 |
| JP3883202B2 (ja) | 2007-02-21 |
| AU683840B2 (en) | 1997-11-27 |
| RU2139729C1 (ru) | 1999-10-20 |
| GR3031208T3 (en) | 1999-12-31 |
| JPH07505891A (ja) | 1995-06-29 |
| ATE181359T1 (de) | 1999-07-15 |
| CA2118509C (en) | 2009-05-19 |
| NZ252857A (en) | 1997-06-24 |
| US5882651A (en) | 1999-03-16 |
| DK0640128T3 (da) | 1999-11-22 |
| KR100257171B1 (ko) | 2000-05-15 |
| WO1993021310A1 (en) | 1993-10-28 |
| EP0640128B1 (en) | 1999-06-16 |
| ES2132233T3 (es) | 1999-08-16 |
| MX9302278A (es) | 1994-07-29 |
| RU94045898A (ru) | 1996-09-20 |
| US6284254B1 (en) | 2001-09-04 |
| AU4290793A (en) | 1993-11-18 |
| CA2118509A1 (en) | 1993-10-28 |
| DE69325370T2 (de) | 1999-10-14 |
| IL105456A (en) | 1996-12-05 |
| US5922326A (en) | 1999-07-13 |
| EP0640128A1 (en) | 1995-03-01 |
| IL105456A0 (en) | 1993-08-18 |
| HUT69992A (en) | 1995-09-28 |
| HU9403023D0 (en) | 1994-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2139729C1 (ru) | Вакцинная композиция, способ стимулирования иммунной системы | |
| Ruckwardt et al. | Immunological lessons from respiratory syncytial virus vaccine development | |
| Stott et al. | Immune and histopathological responses in animals vaccinated with recombinant vaccinia viruses that express individual genes of human respiratory syncytial virus | |
| Karron et al. | Evaluation of two live, cold-passaged, temperature-sensitive respiratory syncytial virus vaccines in chimpanzees and in human adults, infants, and children | |
| Dudas et al. | Respiratory syncytial virus vaccines | |
| Connors et al. | Cotton rats previously immunized with a chimeric RSV FG glycoprotein develop enhanced pulmonary pathology when infected with RSV, a phenomenon not encountered following immunization with vaccinia—RSV recombinants or RSV | |
| Crowe Jr et al. | A comparison in chimpanzees of the immunogenicity and efficacy of live attenuated respiratory syncytial virus (RSV) temperature-sensitive mutant vaccines and vaccinia virus recombinants that express the surface glycoproteins of RSV | |
| Crowe Jr et al. | A further attenuated derivative of a cold-passaged temperature-sensitive mutant of human respiratory syncytial virus retains immunogenicity and protective efficacy against wild-type challenge in seronegative chimpanzees | |
| Byrd et al. | Animal models of respiratory syncytial virus infection | |
| CN100354425C (zh) | 减毒的人－牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产 | |
| US3992522A (en) | Temperature-sensitive recombinant mutant viruses and a process for producing same | |
| US6077514A (en) | Attenuated respiratory syncytial virus | |
| EP0567100B1 (en) | Respiratory syncytial virus (RSV) mutant and pharmaceutical composition containing such a mutant | |
| Prince et al. | Monophosphoryl lipid A adjuvant reverses a principal histologic parameter of formalin-inactivated respiratory syncytial virus vaccine-induced disease | |
| Prince et al. | Respiratory syncytial virus infection in owl monkeys: viral shedding, immunological response, and associated illness caused by wild-type virus and two temperature-sensitive mutants | |
| Chanock et al. | Live viral vaccines for respiratory and enteric tract diseases | |
| US6946136B2 (en) | Temperature-sensitive and cold-adapted human parainfluenza virus type 2 (HPIV-2) and vaccines based on such virus | |
| Hsu et al. | Isolation and characterization of a highly attenuated respiratory syncytial virus (RSV) vaccine candidate by mutagenesis of the incompletely attenuated RSV A2 ts-1 NG-1 mutant virus | |
| US20060110740A1 (en) | Use of sendai virus as a human parainfluenza vaccine | |
| US20180318411A1 (en) | Method of vaccination with an attenuated rsv vaccine formulation | |
| WO1997038138A1 (en) | Attenuated respiratory syncytial virus | |
| Groothuis et al. | Immunoprophylaxis and immunotherapy: role in the prevention and treatment of repiratory syncytial virus | |
| Faverio et al. | Immunoprophylaxis of group B respiratory syncytial virus infection in cotton rats | |
| PL172087B1 (pl) | Szczepionka zawierajaca atenuowany wirus oddechowy (RS) PL PL PL |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: THE UNITED STATES OF AMERICA AS REPRESENTED BY THE Owner name: WYETH (DELAWARE ALLAMBAN BEJEGYZETT CEG), US |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |