PL172087B1

PL172087B1 - Szczepionka zawierajaca atenuowany wirus oddechowy (RS) PL PL PL

Info

Publication number: PL172087B1
Application number: PL93305807A
Authority: PL
Inventors: Brian R Murphy; Robert M Chanock; James E Crowe Jr; Mark Connors; Kuo-Hom L Hsu; Alan R Davis; Michael D Lubeck; Bernard H Selling
Original assignee: American Home Prod; Health
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1993-04-20
Publication date: 1997-07-31

Abstract

1. Szczepionka zawierajaca atenuowany wirus oddechowy RS, znamienna tym, ze zawiera fizjologicznie dopuszczalny nosnik, przynajmniej jeden atenuowany wirus odde- chowy posiadajacy przynajmniej dwie mutacje atenuujace, wybrany z wrazliwych na temperature mutantów wirusa oddechowego ograniczonego przez warunki gospodarza, pasazowanego w niskiej temperaturze albo zaadaptowanych do niskiej temperatury mutantów wirusa oddechowego ograniczonego przez warunki gospodarza, pasazowane- go w niskiej temperaturze, który to wirus ma fenotyp wrazliwosci na temperature albo fenotyp adaptacji do niskiej temperatury' nie zmieniony przez replikacje in vivo, wykazuje co najmniej 10-krotne zmniejszenie replikacji w górnych drogach oddechowych w po- równaniu z dzikim wirusem oddechowym oraz wywoluje odpowiedz przeciwcial neutrali- zujacych w surowicy in vivo w stopniu porównywalnym z wywolana przez dziki wirus oddechowy. PL PL PL

Description

Podstawa wynalazku. Zakażenia wirusem RS u ludzi mogą przebiegać od bezobjawowych do bardzo ciężkich chorób układu oddechowego. U niemowląt i dzieci wirus RS (RSV) uznawany jest za najważniejszą przyczynę chorób dolnego odcinka dróg oddechowych, we wszystkich regionach świata. Wirus RS wyprzedza wszystkie inne drobnoustroje patogenne jako przyczyna zapalenia płuc i zapalenia oskrzelików u dzieci poniżej jednego roku życia, i jest główną przyczyną chorób dróg oddechowych o ciężkim przebiegu tychże dzieci. W rzeczywistości wszystkie dzieci do drugiego roku życia ulegają zakażeniu. Ponowne infekcje występują ze znaczną częstością u dzieci starszych i u młodych dorosłych. (Chancock i in., Viral Infection of Humans, wyd. 3, wyd. Evans AS, Plenum Press, N.Y. (1989)). Jakkolwiek większość zdrowych dorosłych nie choruje ciężko z powodu zakażeń wirusem RS, pacjenci w podeszłym wieku i osoby poddawane immunosupresji są bardziej narażeni na ciężkie i zagrażające życiu zakażenia.

Leczenie zakażeń RSV jest trudne. Małe dzieci mają zmniejszoną odpowiedź przeciwciał wydzielniczych i surowiczych na antygeny RSV i z tego powodu cierpią na poważne infekcje, podczas gdy odporność nabyta wydaje się chronić starsze dzieci i dorosłych przed poważnymi postaciami zakażeń. Jeden lek przeciwwirusowy, ribavirin, stwarza pewne nadzieje na leczenie poważnych zakażeń u dzieci, jednakże nie ma dowodów by skracał on czas hospitalizacji czy zmniejszał konieczność terapii wspomagającej.

Ostatnio przedmiotem zainteresowania stał się mechanizm odporności w zakażeniach RSV. Przeciwciała wydzielnicze wydają się być głównym czynnikiem zabezpieczającym górne drogi oddechowe, podczas gdy wysoki poziom przeciwciał surowiczych uważany jest za podstawowy czynnik odporności w dolnych drogach oddechowych. Oczyszczone ludzkie immunoglobuliny zawierające wysokie miana przeciwciał neutralizujących RSV mogą być użyteczne w próbach immunoterapii w poważnych zakażeniach dolnych dróg oddechowych u niemowląt i małych dzieci. Preparaty globulin odpornościowych jednakże, posiadają szereg wad, jak np. możliwość przeniesienia wirusów krwiopochodnych oraz trudności i koszty przygotowywania i przechowywania.

Mimo pilnej potrzeby wydajnej szczepionki przeciw RSV, szczególnie u niemowląt i małych dzieci, pierwsze próby wytworzenia bezpiecznej i efektywnej szczepionki spotkały

172 087 się z niepowodzeniem. Szczepionka wirusa inaktywowanego formaliną badana w połowie lat sześćdziesiątych, nie chroniła przed zakażeniem i chorobą wywianą przez wirusa RS. Przeciwnie, pogarszała ona przebieg choroby po następnej infekcji wywołanej przez wirusa RS. (Kim i in.. Am.J. Epidemiol. 89:422-434; Chin i in.. Am. J.Epidemiol., 89:449-463; (1969); Kapikian i in., Am. J.Epidemiol., 89:405-421 (1969).

Aby obejść problemy związane z inaktywowaną szczepionką i prawdopodobne zmiany w epitopach neutralizujących, wysiłki skierowano na uzyskanie atenuowanego mutanta RS. Friedewald i in., J.Amer. Med. Assoc., 204:690-694 (1968) donosi o wytworzeniu pasażowanego w niskiej temperaturze mutanta wirusa RS, który wydawał się posiadać wystarczający stopień atenuowania by być potencjalną szczepionką. Mutant ten przejawiał nieco zwiększoną zdolność wzrostu w temp. 26°C w porównaniu z wirusem rodzicielskim dzikiego szczepu (wild-type), ale jego replikacja ani nie była wrażliwa na temperaturę, ani nie była w istotny sposób zaadaptowana do zimna. Mutant pasażowany w niskiej temperaturze, był jednakże atenuowany dla dorosłych. Jakkolwiek, zadowalająco atenuowany i immunogenny dla niemowląt i małych dzieci, które uprzednio były już zarażone winiseni RS )np. oiobuiki seropo^ńSyne), mutant zachował slabą zjadliwość w stosunku do górnych dróg oddechowych niemowląt seronegatywnych. Opisywanego mutanta RSV pasażowano na hodowli komórek nerki wołu w niskiej temperaturze (26°C) przez co nabył on mutacji umożliwiających mu przeżycie w warunkach gospodarza. Nabycie tych mutacji pozwoliło mutantowi wydajnie replikować w tkance wołowej, podczas gdy te same mutacje ograniczały wzrost wirusa w ludzkich drogach oddechowych, w porównaniu z rodzicielskim szczepem RSV A2.

Podobnie, Gharpure i in., J.Yirol. 3:414-412 (1969) donosi o izolacji mutanta wrażliwego na temperaturę (te), który także był obiecującymi kandydatem na szczepionkę . Jeden ze szczepów, ts-1 szeroko badano w laboratorium i na ochotnikach. Mutant wywoływał bszobjawżwe zakażenie u dorosłych ochotników i dawał odporność na wirusa rodzicielskiego po ekspozycji 45 dni po immunizacji. I ponownie, podczas gdy seropozytywne niemowlęta i dzieci ulegały bezobjawowej infekcji, seronegatywne niemowlęta rozwijały objawy nieżytu górnych dróg oddechowych i inne łagodne objawy. Dodatkowo, stwierdzono' niestabilność fenotypu te, jednakże wirus przejawiający częściową lub całkowitą utratę wrażliwości na temperaturę stanowił tylko małą część uzyskaną ze szczepionki i nie wiązał się z poważniejszymi objawami, jak tylko lekki katar.

Wspomniane badania wykazały, że pasażowane w niskiej temperaturze oraz wrażliwe na temperaturę szczepy są ' czasami niedoatenuowane i wywołują lekkie objawy chorobowe po szczepieniu, szczególnie u niemowląt seronegatywnych, podczas gdy zbyt atenuowane nie replikują w sposób wystarczający do uzyskania odporności zabezpieczającej. (Wright i in., Infect. Immun. 37:397-400 (1982)). Niestabilność genetyczna umożliwiająca mutantom utratę ich fenotypu wrażliwości na temperaturę była również kłopotliwym odkryciem. Patrz, Hodes i in., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 145:1158-1164 (1974); McIntosh i in., Pediatr. Res., 8:689-696 (1974); Belshe i in., J. Med. Virol., 3:101-110 (1978).

Odstępując od podejścia używającego atenuowanego wirusa RS, badawcze testowali podjednostki wirusa jako potencjalnych kandydatów na szczepionki, używając oczyszczonych glikoprotein otoczkowych wirusa RS uzyskanych z lizatów zakażonych komórek. Glikoproteiny wyw(ż^ywajy odporność na zakażenie wirusem RS w płucach szynszyli, Walsh i in., J. Infect. Dis., 155:1198-1204 (1987), ale przeciwciała miały bardzo słabą aktywność neutralizującą, a immunizacja gryzoni oczyszczoną podjednostką prowadziła do wzmożenia choroby (Murphy i in., Vaccine, 8:497-502 (1990)).

Badano również szczepionki w oparciu o rekombinowany wirus krowianki, eksp^sjonujący glikozΓżteiny otoczkowe F i G. Rekombinanty te ekspresjc-mują glikoproteiny RSV nieodróżnialne od naturalnych składników wirusa, zaś gryzonie zakażane podskórnie rekombinowanymi F i G wirusami krowianki-RSV wytwarzały wysokie poziomy specyficznych przeciwciał neutralizujących zakażalność. W rzeczywistości

172 087 zakażenie szynszyli rekombinantami F wirusa krowianki wywoływało niemal całkowitą odporność na replikację wirusa RS w dolnych drogach oddechowych i znaczny wzrost odporności w górnych. Olmsted i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7462-7466 (1986). Jednakże, immunizacja szympansów rekombinantami F i G praktycznie nie dawała odporności przed zakażeniem RSV. (Collins i in., Vaccine, 8:164-168 (1990)). Prowadzi to do wniosku, że to podejście nie zapewni odpowiedniej szczepionki.

Podczas gdy badacze przez lata próbowali różnych podejść do wytworzenia wydajnej i bezpiecznej szczepionki przeciwko wirusowi RS, wirus ten pozostaje najczęstszą przyczyną poważnych chorób dolnych dróg oddechowych u niemowląt i dzieci. Stąd pozostaje pilna potrzeba bezpiecznej szczepionki zdolnej do zapobieżenia poważnym chorobom w tej grupie, wymagającym często hospitalizacji, oraz zabezpieczającej innych osobników. Niniejszy wynalazek w pełni zaspokaja te oraz pokrewne potrzeby.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza szczepionki atenuowanego wirusa oddechowego. Atpniinwanv winie Hnętarpwnoiz ippf w ldneri ?Ήη1 npi iwwntar ojrenwipHw nHnnronśrcnwii x xv~x*~~..xxx_V ’ ~~X,»XXX~X-~XXJ J XX-----------J ..J--------₁-------- _r ^xxxxz«wx~ ..

u ludzkiego gospodarza, w połączeniu z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem i może, dowolnie, zawierać adjuwant w celu wzmożenia odpowiedzi odpornościowej. W wynalazku badanych jest kilka różnych podgrup antygenowych atenuowanego wirusa RS, które uzyskano z niecałkowicie atenuowanego wirusa, i które posiadają kilka cech nie spotykanych w opisanych dotąd atenuowanych wirusach RS. W wykonaniu opisanym tu, atenuowany wirus, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, obejmuje wirusa RS kontrolowanego przez warunki życia gospodarza niecałkowicie atenuowanego przez pasażowanie w niskiej temperaturze (cpRSv). do którego wprowadzono jedną lub więcej mutacji dodatkowych, w celu wytworzenia wirusa i wirusów potomnych posiadających fenotyp wrażliwości na temperaturę (ts), dalej oznaczanego cptsRSV. W innym wykonaniu wirus RS kontrolowany przez warunki życia gospodarza, niecałkowicie atenuowany przez pasożowanie w niskiej temperaturze (cpRSV). adaptowany był do niskiej temperatury (ca) przez kolejne pasaże w coraz niższej temperaturze, w celu wprowadzenia dodatkowej mutacji kontroli wzrostu. W jeszcze innym wykonaniu, niekompletnie atenuowane mutanty tsRSV, jak np RSV ts-4-czy ts-1, NG1 były dalej atenuowane przez wprowadzenie kolejnych mutacji. Atenuowane pochodne szczepów ts i cp wytworzono na kilka sposobów, najkorzystniej przez wprowadzenie dodatkowych mutacji wrażliwych na temperaturę chemiczną mutagenezą, a następnie przez hodowanie w temperaturze 20-24°C, lub przez wprowadzenie mutacji małych łysinek (spi) i selekcję pochodnych, których replikacja jest bardziej kontrolowalna niż niecałkowicie atenuowanego szczepu mutantów rodzicielskich. Atenuowany wirus stanowiący podstawowy składnik będący przedmiotem niniejszego wynalazku szczepionki należy do antygenowej podgrupy A lub B, jak również obie podgrupy mogą być wygodnie łączone w kompozycję szczepionki w celu lepszego zabezpieczenia przed powszechnymi zakażeniami RSV. Szczepionka zwykle tworzona byłaby w dawce od 10³ do 10⁶ jednostek tworzenia łysinek (PFU) lub więcej w celu zapewnienia najwyższej wydajności.

W innych wykonaniach dostarcza sposobów na pobudzenie układu odpornościowego do wywołania odporności przeciw wirusowi oddechowemu. Sposoby te obejmują podawanie osobnikowi odpowiednich dawek RSV, który został atenuowany przez wprowadzenie mutacji, które uzupełniają fenotyp niekompletnie atenuowanego mutanta ts czy pasażowanego w niskich (np. 26°C) temperaturach RSV mutacjami ts, ca i/lub sp. W świetle potencjalnie poważnych następstw zakażeń RSV noworodków, seronegatywnych i seropozytynnych niemowląt i małych dzieci, oraz osób w wieku podeszłym, osobnicy ci winni odnieść korzyści z immunizacji według opisanej metody. W większości przypadków atenuowany wirus podawany jest do dróg oddechowych osobnika, najkorzystniej donosowo w postaci aerozolu lub w postaci kropli.

172 087

W jeszcze innych wykonaniach, wynalazek dostarcza czystych kultur atenuowanego wirusa RS, charakteryzującego się tym, że jest bardziej atenuowany przez kolejne izolowanie pierwotnych mutantów ts i cp. Atenuowany wirus jest zdolny do wzbudzenia chroniącej odpowiedzi odpornościowej, u zakażonego człowieka, będąc wystarczająco atenuowanym by nie .wywołać objawów ciężkiej choroby dróg oddechowych u immunizowanego gospodarza. Atenuowany wirus może być obecny w nadsączu z hodowli komórkowej, częściowo lub całkowicie oczyszczony. Wirus może być · liofilizowany oraz łączony z wieloma różnymi składowymi w celu przechowywania czy dostarczenia osobnikowi, który ma być zaszczepiony.

Opis najkorzystniejszych wykonań

Niniejszy wynalazek dostarcza wirusa RS odpowiedniego do użycia go jako szczepionka u ludzi. Opisany tu wirus RS wytworzono przez wprowadzenie dodatkowych mutacji do kompletnie atenuowanego szczepu ts i cp wirusa RS. Mutacje wprowadzono do szczepu podczas wzrostu wirusa w hodowli •komórkowej, do której dodano chemialz-/»n

Srrz*nro-rt τλ/λ/ΊγΙομ/λ ralalznn r\r7arr tAnnnaruiu-ima ττκ |7VUUUliU »VUlilV *Y ll/AJAp/Kyp^nartiy mutn nami ŁUUVUC,VilUj τι o ctarnm o ΛΑΙΛΟ raturach suboptymalnych w celu wprowadzenia mutacji •ograniczających wzrost, lub przez selekcjonowanie zmutowanego wirusa tworzącego małe łysinki w hodowli komórkowej.

Tak więc, szczepionka, będąca przedmiotem'niniejszego wynalazku, obejmuje atenuowany wirus RS i dopuszczalny fizjologicznie nośnik. Szczepionka podawana jest w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi odpornościowej, osobnikowi, który wymaga ochrony odpornościowej przed wirusem RS, jak np. niemowlę, dziecko, starzec, lub dorosły kandydat do immunosupresji terapeutycznej. Szczepionka wzbudza odpowiedź odpornościową zabezpieczającą przed poważną chorobą dolnych dróg oddechowych, jak np. zapalenie płuc czy zapalenie oskrzelików, gdy osobnik zaszczepiony ulegnie zakażeniu dzikim szczepem wirusa. O ile krążący wirus jest wciąż zdolny do wywołania zakażenia, szczególnie w górnych drogach oddechowych, możliwość wywołania kataru jako powikłania szczepienia jest znacznie zmniejszona oraz zwiększona jest możliwość spotęgowania odporności po zakażeniu przez dziki szczep wirusa. W następstwie szczepienia, pojawiają się możliwe do wykrycia poziomy przeciwciał surowiczych i wydzielniczych gospodarza, zdolnych do neutralizacji homologicznego (tej samej podgrupy) dzikiego szczepu wirusa in vitro i in vivo. W wielu przypadkach przeciwciała zdolne są do neutralizacji dzikich szczepów wirusów innych podgrup. W celu uzyskania wysokiego poziomu odporności krzyżowej np. przeciwko heterologicznym szczepom wirusów innych podgrup, wskazane jest szczepienie osobników atenuowanym wirusem RS z przynajmniej jednego głównego szczepu obu podgrup A i B.

Atenuowany wirus będący składnikiem szczepionki jest wyizolowany i oczyszczony. Przez określenie wyizolowany rozumie się zmodyfikowany atenuowany wirus RS znajdujący się w warunkach innych niż otoczenie wirusa dzikiego szczepu, jak np. nosogardziel osoby zakażonej. W szerszym rozumieniu izolowanie odnosi się do wprowadzenia wirusa jako heterologicznego składnika do hodowli komórkowej czy innego systemu. Przykładowo, atenuowany wirus RS, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, może być produkowany przez zakażoną hodowlę komórkową, wyizolowany z hodowli i połączony ze stabilizatorem, zawierającym inne nie występujące naturalnie wirusy, jak np. wyselekcjonowane, do atenuowania, metodą odporności na przeciwciała neutralizujące białko F.

Atenuowany wirus RS, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, przejawia bardzo silnie zmniejszoną zjadliwość w porównaniu z wirusem dzikiego szczepu, który krąży wśród ludzi naturalnie. Wirus jest na tyle atenuowany, że objawy zakażenia nie występują u większości immunizowanych ludzi. W pewnych warunkach atenuowany wirus jest w stanie rozprzestrzeniać się wśród nie szczepionych osobników. Jednakże, jego zjadliwość jest wystarczająco zmniejszona, tak że nie wystąpią poważne zakażenia dolnych dróg oddechowych u szczepionych lub przypadkowych gospodarzy.

172 087

Poziom atenuacji może być stwierdzony, przykładowo, przez mierzenie ilości wirusa obecnego w drogach oddechowych nie szczepionego gospodarza w porównaniu z ilością wytworzoną przez wirusa RS dzikiego typu czy innych atenuowanych wirusów RS poddawanych badaniu jako potencjalna szczepionka. Przykładowo, atenuowany wirus stosowany w szczepionce będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, winien mieć znaczny stopień ograniczenia replikacji w górnych drogach oddechowych wysoce podatnych gospodarzy, np. szympansów, w porównaniu z replikacją wirusa dzikiego szczepu, np. 10- do 1000 razy. Tak więc poziom replikacji atenuowanego szczepu szczepionki RSV w górnych drogach oddechowych szympansów powinien być niższy niż niekompletnie atenuowanego mutanta A2 ts-1 RSV. W celu dalszego zmniejszenia rozwoju wycieku surowiczego z nosa, co wiąże się z replikacją wirusa w górnych drogach oddechowych, kandydat na idealną szczepionkę wirusową winien mieć ograniczony poziom replikacji zarówno w górnych jak i w dolnych drogach oddechowych. Jednakże, atenuowany wirus, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, musi być wystarczająco zaraźliwy i immunogenny by zapewnić ochronę szczepionym osobnikom. Sposoby na określenie ilości wirusa RS w nosogardzieli zakażonego gospodarza znane sa dobrze z literattuy.. Próbki uzyskiwane są przez aspirację lub wymywanie wydzielmy nosogardzieli, a ilość wirusa oznaczana w hodowli tkankowej lub metodami laboratotyjnymi. Patrz: Belshe i in., J. Med. Virology, 1:157-162 (1977); Friedewald i in., J. Amer. Med Assoc., 204:690-694 (1968); Ghapure i in., J. Virol., 3:414-421 (1969); Wright i in., Arch. Ges. Virusforsch., 41:238-247 (1973). Wirus może być wygodnie mierzony w nosogardzieli zwierząt, jak np. szympansy.

W celu wytworzenia zadowalająco atenuowanej pochodnej wirusa, będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, wprowadza się mutacje do rodzicielskiego szczepu wirusa, całkowicie lub częściowo atenuowanego, np. mutantów ts-1 czy ts-4 lub cpRSV. Dla wirusów podgrupy A, najkorzystniejszym niekompletnie atenuowanym wirusem rodzicielskim jest ts-1 lub ts-1 NG-1 czy cpRSV. które są mutantami szczepu A2 podgrupy A lub pochodnych czy subklonów powyższych.

Częściowo atenuowane mutanty wirusów podgrupy B mogą być wyprodukowane przez klonowanie biologiczne wirusów szczepu dzikiego podgrupy B na odpowiednim substracie komórkowym i wytworzenie mutantów powstałych przez pasażowanie w niskich temperaturach, poddawanie wirusa chemicznej mutagenezie w celu wytworzenia mutantów ts lub selekcję mutantów tworzących małe łysinki. Różne techniki selekcji mogą być łączone w celu wytworzenia częściowo atenuowanego mutanta podgrupy A lub B, który byłby użyteczny dla dalszego pozyskiwania, jak to opisano poniżej.

Gdy potrzebny atenuowany szczep (lub szczepy) rodzicielski jest wyselekcjonowany, może być wdrożona dalsza atenuacja, wystarczająca do wytworzenia szczepionki dopuszczalnej do stosowania u ludzi, kilkoma drogami, jak to opisano poniżej.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem mutant cp może być dalej mutowany kilkoma sposobami. W jednym najkorzystniejszym wykonaniu częściowo atenuowany wirus poddawany jest pasażowaniu w hodowli komórkowej w stopniowo zmniejszających się, atenuujących temperaturach. Przykładowo, podczas gdy wirus szczepu dzikiego typowo hodowany jest w temperaturze 34-35°C częściowo atenuowany mutant wywarzany jest przez pasażowanie w hodowli komórkowej (np. pierwotnej hodowli komórek nerki wołu) w temperaturach suboptymalnych np. 26°C. Takie mutanty posiadają nieznaczną lecz określoną cechę adaptacji do niskiej temperatury (ca), np. zwiększoną wydajność wzrostu w temp. 26°C w porównaniu z wirusem rodzicielskim szczepu dzikiego, ale zwykle nie są ts. Tak więc, w jednej z metod mniejszego wynalazku mutant cp lub inny częściowo atenuowany szczep np. ts-1 czy sp, zaadaptowany jest do wydajnego wzrostu w niskich temperaturach przez pasażowanie w komórkach MRC-5 lub Vero, w temperaturze ok. 20-24°C a najlepiej 20-22°C. Taka selekcja mutantów wirusa RS przez pasażowanie w niskich temperaturach, gruntowanie eliminuje wszelką zjadliwość w szczepie pochodnym w porównaniu z częściowo atenuowanym szczepem rodzicielskim.

172 087

W innym najkorzystniejszym wykonaniu wynalazku niekompletnie atenuowany szczep poddawano chemicznej mutagenezie w celu wprowadzenia mutacji ts lub, w przypadku wirusów już będących ts, dodatkowej mutacji ts wystarczającej do nadania większej stabilności fenotypowi ts w atenuowanej pochodnej. Środki na wprowadzenie mutacji ts do wirusa RS obejmują 'replikację wirusa w obecności mutagenu jak np. 5-fluorourydyna czy 5-fluorouracyl w stężeniu ok. 10’³ do 10'⁵ M, najlepiej ok. 10^-4, lub eksponowanie wirusa na nitrozoguanidynę w stężeniu ok. 100 μ g/ml, zgodnie z ogólnymi metodami opisanymi przez np. Ghapure i in., J. Virol. 3:414-421 (1969) i Richardson i in., J. Med. Virol. 3:91-100 (1978). Inne chemiczne mutageny mogą być również użyte. Atenuacja może być skutkiem mutacji & w niemal każdym genie wirusa RS. Poziom wrażliwości replikacji na temperaturę atenuowanego wirusa RS, będącego przedmiotem niniejszego wynalazku, może być określony przez porównanie jego replikacji w dopuszczalnej temperaturze z replikacją w kilku temperaturach ograniczających. Najniższa temperatura, przy której replikacja wirusa jest zmniejszona 100 krotnie lub więcej w porównaniu z temperaturą dopuszczającą określana jest jako temperatura wyłączająca (shutoff). U zwierząt doświadczalnych i u ludzi, zarówno replikacja iak i

J V v \ z ». z · x j α zjadliwość wirusa RS korelują z temperatrurą zamykającą mutantów. Replikacja mutantów z temperaturą zamykającą równą 39°C jest umiarkowanie ograniczona, podczas gdy mutanty o temperaturze zamykającej równej 38°C replikują gorzej, a objawy choroby są ograniczone do górnych dróg oddechowych. Wirus o temperaturze zamykającej równej 35 do 37°C powinien być całkowicie nie zjadliwy dla ludzi. Stąd, atenuowany wirus RS, wrażliwy na temperaturę, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, winien mieć temperaturę zamykającą w zakresie od 35 do 39°C, najlepiej zaś od 35 do 38°C. Dodanie własności wrażliwości na temperaturę do częściowo atenuowanego szczepu powoduje powstanie całkowicie atenuowanego wirusa użytecznego do wytworzenia kompozycji szczepionki, będącej przedmiotem niniejszego wynalazku.

W dodatku do kryteriów żywotności, atenuacji i immunogenności, wybrane własności pochodnej muszą być stabilne jak tylko to jest możliwe, tak by utrzymać pożądane właściwości. Niestabilność genetyczna fenotypu ts, w następstwie replikacji in vivo, jest regułą u wirusów ts (Murphy i in., Infect, and Immun. 37:235-242 (1982)). Tak więc, idealny wirus użyteczny do wykonania szczepionki, będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, musi utrzymać swą żywotność, własność atenuacji, własność replikacji w immunizowanym gospodarzu (w małym stopniu) oraz zdolność do wydajnego wywołania odpowiedzi odpornościowej przez szczepionkę; zdolną do wytworzenia odporności przeciw poważnym chorobom wywołanym przez zakażenie wirusem dzikiego szczepu. Oczywiste jest, że znane i opisane do tej pory, mutanty wirusa RS nie spełniają wszystkich z wymienionych kryteriów. W przeciwieństwie do oczekiwań opartych na opisanych wynikach dla znanych atenuowanych wirusów RS, niektóre z wirusów, będących przedmiotem niniejszego wynalazku, są nie tylko żywotne i bardziej atenuowane niż poprzednie mutanty, ale są bardziej stabilne genetycznie in vivo niż badane uprzednio mutanty, zachowując zdolność do wywiania ochronnej odpowiedzi odpornościowej, a w pewnych warunkach rozszerzenie odporności nabytej przez liczne modyfikacje, np. wywołanie odporności przeciwko różnym szczepom wirusa i podgrupom, lub odporność spowodowaną różnymi mechanizmami odpornościowymi jak np. przeciwciała wydzielnicze zamiast surowicze, odporność komórkowa itp.

Do hodowli atenuowanego wirusa, będącego przedmiotem niniejszego wynalazku, można używać licznych linii komórkowych umożliwiających jego replikację. Wirus RS rośnie w wielu ludzkich i zwierzęcych komórkach. Najlepszymi do tego ielu są linie komórek DBS-FRhL-2, MRC-5 i Vero. Najwięcej wirusa uzyskać można z hodowli linii heteroploidalnych jak np. komórki Vero. Komórki zakażane są zwykle wielokrotnością dawki zakażającej wahającej się od 0,001 do 1,0 lub więcej, i hodowane w warunkach umożliwiających replikację wirusa np. w ok. 30-37°C przez ok. 3-5 dni lub wystarczająco długo by wirus osiągnął odpowiednie miano. Wirusa pozyskiwano z ho172 087 dowli i oddzielano od składników komórkowych zwykle przez znane powszechnie metody oczyszczania jak np. odwirowanie, i może być dalej oczyszczany przy użyciu metod dobrze znanych osobom kompetentnym.

Wirus RS, który został atenuowany w sposób tu opisany, może być badany w modelach in vitro i in vivo, w celu potwierdzenia odpowiedniej dla szczepionki atenuacji, stabilności genetycznej i immunogenności. W testach in vitro zmodyfikowany wirus badany jest na obecność fenotypu małych łysinek. Zmodyfikowany wirus badany jest następnie na modelu zwierzęcym zakażenia RS. Różne modele zwierzęce opisano i zebrano w Meignier i in., wyd., Animal models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991), załączone tu jako referencja. Model zakażenia szynszyli wirusem RS opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 800 078 oraz Prince i in., Virus Res. 3:193-206 (1985), załączone tu jako referencje, i jest on uznawany za dający się odnieść do ludzi. Model zakażenia naczelnych wirusem RS przy użyciu szympansów odpowiada atenuacji i efektywności u ludzi, i opisano go szczegółowo w Richardson i in., J. Med. Virol. 3:91-100 (1978); Wright i in., Infect. Immun., 37:397-400 (1982): Crowel in.. Vaccine (1993) (w druku), załączone tu jako referencie.

\ Z ‘ ' \ j> \ s ’ ν V w

Przykładowo, wykazano, że efekt leczniczy przeciwciał neutralizujących wirusa RS u zakażonych szynszyli jest wysoce zgodny z późniejszymi doświadczeniami z użyciem immunoterapii u małp i ludzi zakażonych RSV. W rzeczywistości szynszyle wydają się być wiarygodnym eksperymentalnym zamiennikiem dla rozwoju odpowiedzi zakażonych małp i ludzi na immunoterapię przy użyciu przeciwciał neutralizujących RSV. Przykładowo, ilość przeciwciał neutralizujących RSV związanych z efektem terapeutycznym u szynszyli mierzony poziomem tych przeciwciał w surowicach leczonych zwierząt (np. miano neutralizujące RSV surowicy od 1:302 do 1:518) jest tego samego rzędu jakie wykazano dla małp (np. 1:539) czy u niemowląt lub małych dzieci (np. 1:877). Efekt terapeutyczny u szynszyli wyrażał się tysiąckrotnym lub wyższym zmniejszeniem miana wirusa w płucach (Prince i in., J. Virol. 61:1851-1854) podczas gdy u małp efekt terapeutyczny obserwowano jako 50 krotne zmniejszenie miana wirusa. (Hemming i in., J. Infect. Dis. 152:1083-1087 (1985)). Na koniec, efekt terapeutyczny u niemowląt i małych dzieci hospitalizowanych z powodu poważnego zapalenia oskrzelików i płuc wywołanego RSV manifestujący się poprawą parametrów gazometrycznych krwi w grupie leczonej oraz znaczące zmniejszenie ilości wirusa RS uzyskiwanego z górnych dróg oddechowych leczonych pacjentów. (Hemming i in., Animicrob. Agents Chemother. 31:1882-1886 (1987)). Stąd, w oparciu o powyższe badania, staje się jasne, że szynszyle stanowią odpowiedni model dla przewidywania powodzenia szczepionki RSV u niemowląt i małych dzieci. Inne gryzonie, włączywszy chomiki i myszy, powinny również być równie użyteczne ponieważ umożliwiają one replikację wirusa i posiadają temperaturę ciała podobną do ludzi (Wright i in., J. Infect. Dis. 122:501-512 (1970) i Anderson i in., J. Gen. Virol. 71:(1990)).

Do stosowania jako szczepionka atenuowany wirus, opisany w niniejszym opisie może być użyty bezpośrednio w formie szczepionki lub liofilizowany, przy użyciu metod liofilizacji znanych osobom kompetentnym. Liofilizowany wirus utrzymywany jest zwykle w temp. 4°C. W celu użycia liofilizowany wirus odtwarzany jest przez dodatek roztworów stabilizujących np. roztworu soli fizjologicznej lub zawierającego SPG, Mg⁺⁺ i HEPES, z dodatkiem lub bez adjuwantów, tak jak to opisano poniżej.

Tak więc, szczepionki przeciwko wirusowi RS, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, zawierają, jako aktywny składnik, immunogennie efektywne ilości atenuownego wirusa RS, jak to opisano poniżej. Atenuowany wirus może być wprowadzony do gospodarza, zwłaszcza człowieka, wraz z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem i/lub adjuwantem. Użyteczne nośniki są znane powszechnie i obejmują: wodę, buforowaną wodę, 0,4% NaCl, 0,3% glicynę, kwas hialuronowy itp. Powstałe roztwory wodne mogą być pakowane w formie do użycia, lub liofilizowane, z przeznaczeniem do odtworzenia przy użyciu sterylnych roztworów przed użyciem, jak to opisano powyżej.

172 087

Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje dodatkowe niezbędne by wytworzyć warunki fizjologiczne, jak np. czynniki buforujące i regulujące pH, czynniki regulujące osmolarność, zwilżające itp., jak np. octan sodu, mleczan sodu, chlorek sodu, chlorek potasu mhnolaursaian sorbitanu, oleinian trietanoihomiey itp.

Pod wpływem szczepienia kompozycją ateeuowanego wirusa RS jak to opisano, w formie aerozolu, kropli, doustnie, miejscowo lub inną drogą, najkorzystniej w formie umożliwiającej podanie dheosowo, układ odpornościowy gospodarza odpowiada na szczepionkę produkcją przeciwciał, zarówno wydzielniczych jak i surowiczych, specyficznych w stosunku do białek wirusa RS. Jako wynik szczepienia gospodarz staje się częściowo lub całkowicie odporny na zakażenie wirusem RS, lub oporny na rozwój umiarkowanego lub ciężkiego zakażenia wirusowego wywołanego przez RSV, zwłaszcza w dolnych drogach oddechowych.

Kompozycje szczepionki zawierające atenuowany wirus RS, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, podawane są osobie podatnej lub narażonej na ryzyko zakażenia wirusem RS w celu zwiększenia zdolności układu odpornościowego tejże osoby. Taka ilość definiowana jest jako dawka immunoreaeie efektywna. W powyższym znaczeniu, dokładna ilość zależy od stanu ogólnego pacjenta, wagi, sposobu podania, formy recepturowej, itp., ale ogólnie zawiera się pomiędzy 10³ a 10⁶ jednostek tworzących łysinki (PFU) lub więcej wirusa na pacjenta, zaś bardziej powszechnie od 10⁴ do 10⁵ PFU wirusa na pacjenta. W każdym przypadku kompozycja szczepionki winna dostarczać ilości atenuowanego wirusa RS, będącego przedmiotem niniejszego wynalazku, wystarczającą do efektywnego uodpornienia pacjenta przed poważnym lub zagrażającym życiu zakażeniem wirusem RS.

Atenuowany wirus RS stosowany w szczepionce będącej przedmiotem niniejszego wynalazku, pewnej podgrupy RS czy szczepu może być połączony z atenuowanym wirusem innej podgrupy czy szczepu w celu osiągnięcia odporności przeciw wielu wirusom RS. Zwykle różne zmodyfikowane wirusy mogą być mieszane i podawane równocześnie, ale mogą być również podawane osobno. W związku ze zjawiskiem odporności krzyżowej występującym pomiędzy poszczególnymi szczepami wirusa RS, immunizacja jednym ze szczepów może zabezpieczyć przed kilkoma innymi szczepami tej samej łub innych podgrup.

W pewnych przypadkach może być pożądane połączenie szczepionki atenuowanego wirusa RS, będącej przedmiotem niniejszego wynalazku ze szczepionkami wywołującymi odporność na inne drobnoustroje, zwłaszcza na wirusy chorób dziecięcych. Przykładowo, szczepionka oteauhwanero wirusa, będąca przedmiotem niaiejszegh wynalazku, może być podana równocześnie (zwykle osobno) lub po szczepionce wirusa paragrypy, jak to opisano w Clementis i in., J. Clin. Microbiol. 29:1175-1182 (1991), tu zamieszczone jako referencja.

Można stosować pojedyncze lub wielokrotne podawanie kompozycji szczepionki, będącej przedmiotem niniejszego wynalazku. U noworodków i niemowląt konieczne być może, w celu uzyskania odpowiedniego poziomu odporności, wielokrotne podawanie. Podawanie winno zacząć się z pierwszym miesiącem życia, i być kontynuowane okresowo w trakcie dzieciństwa, np. w wieku dwóch miesięcy, sześciu miesięcy, jednego roku i dwóch lat, tak by utrzymać poziom odporności w stosunku do wirusa RS szczepu dzikiego. Podobnie, dorośli szczególnie podatni na powtarzające się i poważne zakażenia wirusem RS, jak np. pracownicy służy zdrowia, członkowie rodziny małych dzieci, osoby starsze, osoby z upośledzoną funkcją układu sercowo-płucnego, itp. mogą wymagać wielokrotnej immunizacji w celu uzyskania i/lub utrzymania odpowiedzi odpornościowej. Poziom wywołanej odporności może być monitorowany pomiarem ilości wydzielniczych i surowiczych przeciwciał neutralizujących, a dawkowanie może być regulowane czy szczepienie powtórzone w celu utrzymania pożądanego poziomu ochrony.

Poniższe przykłady dostarczono w celu zilustrowania, a nie ograniczenia zakresu wynalazku.

172 087

Przykład I Izolowanie i charakterystyka mutowanej pochodnej R S V pasażowanego w niskiej temperaturze.

Niniejszy przykład opisuje chemiczną mutagenezę niekompletnie atenuowansgż cpRSV ograniczanego zakresem gospodarza, w celu wytworzenia pochodnych szczepów ts i sp, które są bardziej atenużwans i stąd bardziej nadają się do użycia w szczepionce.

Przygotowano wyjściowy roztwór rżdzicielskisgż wirusa RS pasażowango w niskich temperaturach (cpRSV). Pochodzący z Flow Laboratories, Seria 3131, niekompletnie atenuowany cpRSV pasażowano dwukrotnie na komórkach MRC-5 w temp. 25'C, następnie rozcieńczono dwukrotnie w zawiesinie komórek MRC-5 w temp. 25 °C, a potem zasażowanż trzy razy w komórkach MRC-5 w celu uzyskania zawiesiny cpRSV do chemicznej mutagsnszy.

cpRSV był poddawany mutagenezie przez hodowanie go w zawiesinie komórek MRC-5 w temp. 32°C w obecności 5-flużrżuracylu w pożywce w stężeniu 4x10⁴M. Wykazano w doświadczeniach wstępnych, że stężenie to jest optymalne przez zmniejszenie stokrotne miana wirusa w pięciodniowej hodowli komórkowej, w porównaniu z pożywka nie zawierającą 5-fiuιżrΩrraev1r. Wirusy podane muta»snszis analizowano

X J tr UŁŁ J ' - J X * o testem tworzenia łysinek z użyciem komórek yerż rosnących na podłożu agarowym, a po odpowiednim czasie inkubacji, łysinki barwione były czerwienią obojętną. Pobrano 854 łysinki i hodowano osobno na świeżych komórkach Vsro. Zawartość każdej z hodowli zakażonej wirusem potomnym z pojedynczych łysinek zmutowanego cpRSV zbierano gdy efekt cytopatyczny był wyrażony najsilniej. Wirusy potomne, które wykazywały poszukiwany fenotyp wrażliwości na temperaturę (ts) i tworzyły małe łysinki (sp) poszukiwane były przez mianowanie łysinek w komórkach HEp-2 w temperaturze 32°C i 38°C. Każdy z wirusów wykazujących fenotyp sp (wielkość łysinki zmniejszona o 50% lub więcej w porównaniu z wirusem rodzicielskim w temp. 32°C) czy fenotyp ts (100 razy zmniejszone miano w temperaturze ograniczającej [37°C do 40°C] w porównaniu z temp. 32°C, był dalej badany. Szczepy te klonowano dalej przez kolejne, trzykrotne oczyszczenie łysinek w komórkach Vsrż, a następnie namnażano również na komórkach ysrż. Klonowane szczepy były mianowane w temp. 32°C, 37°C, 38°C, 39°C i 40°C (w teście efektywności tworzenia łysinek (EOP)) w celu potwierdzenia ich fenotypu sp i ts. Z powodu, że miana niektórych klonów były niskie nawet w temperaturze dopuszczającej (32°C), wirusy te pasażowano raz na linii HEp-2 w celu uzyskania zawiesiny wirusa do badań in vitro. Fenotypy wirusów potomnych imitowanego cpRSV przedstawiono w tabeli 1.

172 087 Tabela 1

Wydajność tworzenia łysinek dziewięciu pochodnych pasażowanych w niskich temperaturach RSV (mutantów cpts i cpsp) na komórkach HEp-2 w temperaturach dopuszczających i ograniczających

Wirus 32°C	Miano wirusa (log₁₀pfu/ml) w temperaturze (°C)	Temp. wyłącz. (°CP	Małe łysinki przy
32	37	38	39	40
szczep dziki A2	4.5	4.4	4.5	3.8	3.8	>40	nie
CfiRSV	6.0	5.8	5.8	6.2	5.4	>40	nie
ts-1	5.7	4.5	2.7	2.4	1.7'	38	nie -
cpsp-143	4.2'	4.5	3.8'	n.g·	3.8'	>40	tak
cpts-368	6.7	6.3	6.1'	5.8”	2.0	40	nie
cpts-274	7.3	7.1	6.6	5.8'	1.0	40	nie
cpts-347	6.2	6.1	5.7'	5.5	<0.7	40	nie
cpts-142	5.7	5.1	4.5'	3.7	<0.7	39	nie
CPts-299	6.2	5.5	5.1'	2.0''	<0.7	39	nie
cots-475	5.4	4.8	4.2	<0.7	<0.7	39	nie
cpts-530	5.5	4.8'	4.5'	<0.7	<0.7	39	nie
cpts-248	6.3	5.3	0.7	<0.7	<0.7	38	nie

i

Mianem temperatury wyłączającej określa się najnizszą temperaturę, przy której obserwuje się 100-krotne bądź większe zmniejszenie miana łysinek (dane wytłuszczonym drukiem).

*

Fenotyp małych łysinek (< 50% wielkości łysinki szczepu dzikiego).

»» ,

Fenotyp baidzo małej łysinki (pinpoint)(<10% wielkości łysinki szczepu dzikiego).

Jeden z wirusów potomnych mutanta posiadał fenotyp małych łysinek, RSV cpsp143 (sp odnosi się do fenotypu małych łysmek(small plaque)), pozostałe wirusy potomne posiadały fenotyp ls. Mutanty RSV cpts wykazywały różną zdolność tworzenia łysinek w jednowarstwowej hodowli komórek in vitro w zakresie temperatur od 37°C do 40°C, z mutantem cpts-368. który zachował zdolność tworzenia łysinek w temp. 40°C, podczas gdy najbardziej wrażliwy na temperaturę (ts) wirus, cpts-248 nie wytwarzał ich już przy 38°C. Stąd, kilka ze zmutowanych wirusów potomnych cpRSV wykazywało znaczną różnicę ze szczepem wyjściowym epRSV w zakresie wrażliwości na temperaturę tworzenia łysinek.

Badania replikacji i stabilności genetycznej na myszach

Badano poziom replikacji wirusów potomnych cpRSV w górnych i dolnych drogach oddechowych myszy BALB/c (Tabela 2). Odkryto, że cpts-530 i cpts-248. dwa z wirusów najbardziej ts (patrz Tabela 1), były 7- do 12-krotnie bardziej ograniczane pod wpływem replikacji w małżowinach nosowych myszy (Tabela 2). Jednakże, replikacja żadnego z wirusów nie była ograniczona w płucach w porównaniu z rodzicielskim wirusem cpRSV. Takie większe ograniczenie replikacji w małżowinach nosowych niż w płucach nie jest charakterystyczne dla mutantów ts, które są generalnie bardziej ograniczane co do replikacji w cieplejszych dolnych drogach oddechowych (Richman and Murphy, Rev, Infect. Dis. 1:413-433 (1979)). Wirus wytworzony w płucach i małżowinach nosowych zachował swój charakter ls wirusa wyjściowego (wyniki nie przedstawione). Powyższe

172 087 odkrycie wskazuje, że kombinacja mutacji & na podłożu mutacji wirusa rodzicielskiego cpRSY dało w wyniku· wirusy potomne ts cpRSV o wyższym stopniu stabilności fenotypu ts po replikacji in vivo niż poprzednio badane mutanty ts.

W celu dalszego badania stabilności genetycznej fenotypu ts wirusów potomnych cpRSY, badana była efektywność tworzenia łysinek wirusów obecnych w płucach i małżowinach nosowych myszy nagich, dla dwóch zmutowanych wirusów potomnych cpRSV. które były najbardziej ts, tzn ts248 i ts530. Myszy nagie wybrane zostały z powodu ich wrodzonego braku limfocytów T, przez co mają one niedobór odporności, i wirus może w nich replikować przez znacznie dłuższy czas. Ten dłuższy czas replikacji może faworyzować pojawiające się mutanty o zmniejszonym fenotypie. Wirus obecny dnia 12 (u myszy normalnych po tym czasie nie można stwierdzić wirusa) badano i stwierdzono, że zachował niezmieniony fenotyp ts (Tabela 3). Tak jak tego oczekiwano, mutant ts włączony do badania jako pozytywna kontrola wykazywał niestabilność fenotypu t§. in vivo. Tak więc, przeciwnie do poprzednich badań mutantów wirusów ts u gryzoni, wyniki wskazują na uzyskanie wysokiego poziomu stabilności fenotypu ts w następstwie przedłużonej replikacji na gryzoniach, co przedstawia znaczącą i do tei pory nie uzyskaną, bardzo pożądaną własność wirusa, będącego przedmiotem niniejszego wynalazku.

Tabela 2

Replikaq'a mutantów cpts - RS V na myszach BALB/c¹Miana wirusa w temperaturze 32°C (średnia logiopfu/g tkanki z tkanek ośmiu zwierząt i odchylenie standartowe)

Zwierzęta zakażone przez	Tęoipeiatura wyłączająca (°C'	Dzień 4	Dzień 5
Małżowina nosowa	Ptuca	Małżowina nosowa	Płuca
Liziki szczep AZ	5TR3	b.UKJ.16	5.81072	r b.OHJ.n	b.810.19 '
cpRSV	>40	4.710.07	5.310.18	4.810.16	5.310.21
rs-1	38	4.010.19	4.710.27	3.810.33	4.910.13
CPSP-143	5^50	“Τ. bit). 14	r~4.11ir.37^-	'4.410.39	-znsKrau^-
cpts-368	40	4.810.15	5.110.35	4.710.08	5.410.23
cpts-274	40	4.210.19	5.010.15	4.210.11	5.110.55
cpts-347	40	4.410.32	4.910.4	4.510.33	5.210.35
cpts-142	39	4.110.32	5.010.19	4.310.24	5.810.4
CPts-299	39	3.910.11	5.210.15	3.910.32	5.010.29
cpts-475	39	4.010.18	5.310.25	4.110.23	4.910.42
cpts-530	39	3.910.18	5.310.15	3.910.14	5.310.19
CPts-248	38	3.910.33	5.110.29	4.210.13	5.510.35

6 3

Myszom podawano 10 ’ pfu donosowo w 0,1 ml dnia 0, a następnie zabijano je dnia 4 lub 5.

172 087

Tabela 3

Stabilność genetyczna RSV cpts-248 i cpts-530 w następstwie przedłużonej replikacji na myszach nagich

	Wydajność tworzenia łysinek przy podanej temperaturze,	akażetuu 1
przez wirusa obecnego w małżowinach nosowych (m n) i płucach (pł) myszy nagich zabitych	12 dnia po z
			32°C			37°C			38°C			40°C
Zwierzęta	Tkanka do		% zwierząt	Śr. miano	% zwierząt	% zwierząt	Śr. miano	% zwierząt	% zwierząt	Śr. miano	% zwierząt	% zwierząt	Śr. miano
zakażone	badań lub	Liczba	u których	(logiopfu	u których	ze	(logiopfu	u których	ze	(logiopfu	u których	ze	(logiopfu
przez:	wirus:	zwierząt	stw. wirusa	na g tkanki lub ml szczepionki)	stwierdź. wirusa	zmienionym fenotypem ts	na g tkanki lub ml szzepionki)	stwierdź. wirusa	zmienionym fenotypem ts	na g tkanki lub ml szczepionki)	stwierdź. wirusa	zmienionym fenotypem ts	nag tkanki lub ml szzzzpionki)
cpis-248	mn	19	100	3.18+034	0	0	<2.0	0	0	<2.0	0	0	<2.0
	pl		90	2.0*0.29	0	0	<1.7	0	0	<1.7	0	0	<1.7
cpts-530	mn	20	100	3.0*0.26	0	0	<2.0	0	0	<2.0	0	0	<2.0
	pł		100	2.4*029	0	0	<1.7	0	0	<1.7	0	0	<1.7
ts-1	mn	19	100	3.7*0.23	74	74	27±0.57	63	63	2.4*036	10	10	2.0*0.13
	P»		100	2.5+0.3	74	74	1 8*0.21	35	32	1 8*015	0	0	<1.7
	CpK-248	-	-	£5	-	-	<7.f	-	-	<07	-	-	<1./
	cpts-530	-	-	5.5	-	-	3.7*	-	-	<0.7	-	-	<0.7
	ts-1	-	-	6.1	-	-	33	-	-	2.7	-	-	<0.7

Miano łysinek pokazano jako średnią log10pfu/gram tkanki 19 lub 20 próbek ± odchylenie standartowe.

Każde ze zwierząt otrzymało 106’^pfu donosowo w 0.1 szczepionki danego wirusa dnia 0.

* Wyłącznie fenotyp małych łysinek.

Badania na szympansach

Poziom atenuacji wirusa potomnego ts cpRSV badano następnie z użyciem seronegatywnych szympansów, gospodarza najbardziej zbliżonego do człowieka. Badania na szympansach i małpach sowich, wykonywano zgodnie z procedurą opisaną przez Richardson i in., J. Med. Virol. 3:91-100 (1979): Crowe i in., Vaccine, (1993)(w druku), umieszczone tu jako referencja. Jeden ml zawiesiny zawierającej ok. 104 jednostek tworzących łysinki (PFU) poddanego mutacji, atenuowanego wirusa podawano donosowo każdemu ze zwierząt. Inną metodą jest podawanie RSV zarówno do górnych jak i dolnych dróg oddechowych w dawce po 104 pfu. Próbki od szympansów pobierano codziennie przez 10 dni, a następnie co 3-4 dni do dnia 20. Próbki z dolnych dróg oddechowych szympansów można pobierać przez płukanki tchawicze zgodnie z metodą opisaną przez Snyder i in., J. Infect. Dis. 154-370-371 (1986) i Crowe i in., Vaccine (1993)(w druku). Niektóre ze zwierząt zakażano w 4 do 6 tygodni później wirusem dzikiego szczepu. Zwierzęta badano pod kątem objawów ze strony chorób układu oddechowego każdego dnia gdy pobierano próbki z nosogardzieli. Wyciek z nosa oceniamy, był w skali od 0 do 4+, przy czym 2+ i więcej uznawano za oznakę znaczącej choroby górnych dróg oddechowych.

Wirusa izolowano z wacików z próbkami z nosa i gardła oraz płukanek tchawiczych przez posianie na wrażliwą na RSV linię komórek HEp-2, jak to opisano powyżej. Ilość wirusa może być również określona bezpośrednio testem łysinkowym z użyciem komórek HEp-2, jak to opisano w Schnitzer i in., J. Virol. 17:431-438 (1976), umieszczone tu specjalnie jako referencja. Próbki krwi zbierane były przed podaniem wirusa i 3 do 4 tygodni po zakażeniu w celu stwierdzenia przeciwciał neutralizujących RSV, jak to opisano w Mills i in., J. Immunol. 107:123-130 (1970), umieszczone tu specjalnie jako referencja.

Badano najbardziej ts i atenuowany wirus potomny cpRSV (cpts248) i porównywano z wirusem szczepu dzikiego RS i rodzicielskim cpRSV (Tabela 4). Replikacja

172 087 wirusa rodzicielskiego cpRSV była nieznacznie zmniejszona w nosogardzieli w porównaniu z wirusem szczepu dzikiego, zmniejszona była ilość wydzieliny w porównaniu z wirusem szczepu dzikiego, oraz zmniejszona ok. 600 krotnie replikacja w dolnych drogach oddechowych. Widać z tego jasno, że replikacja wirusa cp była znacznie ograniczona w dolnych drogach oddechowych szympansów, cecha bardzo pożądana nie stwierdzona w poprzednich badaniach nad cpRSV u ludzi i zwierząt. Wynikiem bardziej znaczącym było 10 krotne ograniczenie replikacji wirusa cpts248 w nosogardzieli w porównaniu z wirusem szczepu dzikiego, ograniczenie to wiązało się ze znacznym zmniejszeniem wycieku z nosa. Odkrycie to wskazuje, że pochodna cpESV posiada dwie cechy pożądane dla żywej szczepionki RSV, mianowicie, wykazuje atenuację zarówno w górnych jak i w dolnych drogach oddechowych bardzo podatnych seronegatywnych szympansów. Następnie zbadano poziom stabilności genetycznej wirusa obecnego w drogach oddechowych szympansów (Tabela 5). Wirus obecny w wydzielinie dróg oddechowych zachował fenotyp ts, co widać u wirusa od szympansa nr. 3 dnia 8, którego miano zmniejszone było 100 krotnie przy 40°C i wykazywał fenotyp małych łysinek przy 40°C, co wskazuje, że ieieg replikacja bvła wciąż wrażliwa na temperature. Oznacza to najbardziej stabilnego genetycznie mutanta ts poznanego do tej pory. Zwiększona stabilność fenotypu ts wirusów cpts248 i cpts530. wskazuje na wpływ mutacji cp na stabilność genetyczną mutacji zapewniającej fenotyp ts in vivo. Stąd, mutacje ts w kontekście istniejących mutacji w wirusie rodzicielskim cp3131 wydają się być bardziej stabilne niż oczekuje się pod ich nieobecność. Ta ważna właściwość nie była do tej pory obserwowana czy opisana. Zakażenie szympansów przez cpts248 wzbudza wysokie miana przeciwciał neutralizujących, jak również przeciwciał w stosunku do glikoprotein F i G (Tabela 6). Immunizacja przy użyciu cpts248 chroni zwierzęta przed zakażeniem RSV (Tabela 7), co wskazuje, że mutant ten działa jako efektywna szczepionka w organizmie gospodarza najbardziej zbliżonego do człowieka.

Powyższe dane wskazują, że wirus cpts248 posiada wiele własności pożądanych dla żywej szczepionki RSV, obejmujących: 1) atenucję w górnych i dolnych drogach oddechowych; 2) zwiększoną stabilność genetyczną po replikacji in vivo, nawet po przedłużonej replikacji u zwierząt poddanych immunosupresji; 3) zadowalającą immunogenność; 4) znaczącą efektywność ochronną przeciwko zakażeniu RSV dzikiego szczepu. Wirus cpts530 posiada podobną do cpts248 wrażliwość na temperaturę tworzenia łysinek, podobny poziom ograniczenia replikacji w małżowinach nosowych myszy i wysoki poziom stabilności genetycznej u obarczonych niedoborem odporności myszy nagich, co również wskazuje na jego przydatność jako szczepionka RSV.

172 087

Tabela 4

Replikacja cpis-RSV 248, cp-RSV i RSV szczepu dzikiego A2 w górnych i dolnych drogach oddechowych seronegatywnych szympansów

1 Zwierzęta zakażone przez:	Droga podania*	Szympans Nr	7dra««»*aaia -z zakażenia «wiruse^a .l-mi miiymo «- t-an-gt-omg hiimooih	i Ocena wycieku z nosa
Nosogardziel	Tchawica
Czas trwania (dniP	Szczytowe miano (log,„ofu/ml	Czas trwania (dni)^b	Szczytowe miano (log,_npfu/m	średnia* )	Szczyt
cpts- 248	IN + IT	1	10	4.6	8^d	5.4	0.2	1
	IN + IT	2	10	4.5	6	2.2	0.1	1
	IN + IT	3	9	4.7	10	2.1	0.1	1
	IN + IT	4	9 śr.9.5	4.2 śr.4.5	8^d śr. 8	2.2 śr, 3	0.1 śr. 0.1	1
cp-RSV	IN	5	20	5.3	8^d	2.9	1.0	3
	IN	6	16	5.8	6“	3.0	1.8	3
	IN + IT	7	13	4.3	6“	3.0	0.6	1
	IN + IT	8	16 śr. 16	5.0 śr. 5.1	10 śr. 7.5	2.8 śr. 1.0	0.5	1
A2 dziki
szczep	IN	9	9	5.1	13	5.4	1.0	1
	IN	10	9	6.0	8	6.0	1.7	4
	IN+IT	11	13	5.3	8	5.9	2.1	3
	IN + IT	12	9 śr. 10	5.4 śr. 5.5	8 śr. 9.3	5.6 śr. 5.7	1.0 śr. 1.4	3

a 4

IN ozn donosowo w dawce 10 pfu w 1 ml szczepionki; IN + IT ozn. zarówno donosowo jak i dotchawiczo po 104 pfu _w 1 ml szczepionki w każde z miejsc bOznacza ostatni dzień po zakażeniu.w którym uzyskano wirusa.

cŚredni wynik oceny wycieku z nosa oznacza sumę dziennych ocen przez okres ośmiu dni w kolo dnia szczytowego nasilenia uzyskiwania wirusa podzieloną przez osiem Cztery oznaczało najwyższą ocenę; zero - najnizszą. dwirusa izolowano tylko wskazanego dnia

Tabela 5

Stabilność genetyczna wirusa obecnego w wymazach z nosogardzieli (NG) lub płukankach oskrzelowych (PO) uzyskanych od zwierząt eksperymentalnie zakażonych cpta-RSV 248

Szympans Nr	Materiał badany	Wirus uzyskany po zakaz, dnia	Miano RSV w danej temperaturze (log10pfu/ml) Miano Miano Miano przy 32°C przy 39°C przy 40°C
1	2	3	4
1-	NG	3	3.2	<0.7	nb
	n	4	2.7	<0.7	nb
		5	4 2	<0.7	nb
		6	3.8	<0.7	nb
		7	4.6	<0.7	nb
	-	8	4.5	<0.7	nb
	u	9	2.6	<0.7	nb
		10	2.0	<0.7	nb
	PO	6	5.4	<0.7	nb
		8	2.7	<0-7	nb
2	NG	3	3.2	<0.7	nb
		4	3.7	<0.7	nb
		5	4.5	<0.7	nb
	n	6	4.1	<0.7	nb
	n	7	3.3	<0.7	nb
		8	4.2	<0.7	nb
		9	2.8	<0.7	nb
		10	1.6	<0.7	nb
	PO	6	2.2	<0.7	nb

ciąg dalszy tabeli

Ϊ 1	2	3		4
3	NG	3	2.7	<0.7	<0.7
		4	3.4	<0.7	<0.7
		5	2.9	<0.7	<0.7
		6	3.3	<0.7	<0.7
	n	7	3.4	0.7^b	<0.7
		8	4.7	3.5^b	2.0°
		9	1.9	<0.7	<0.7
	PO	6	1.8	<0.7	<0.7
		8	1.9	1.2^b	<0.7
		10	2.1	1.3b	<0.7
4	NG	3	3.2	<0.7	nb
	w	4	2.7	<0.7	nb
	_	5	3.4	<0.7	nb
		6	3.3	<0.7	nb
		7	4.2	<0.7	nb
		8	3.5	<0.7	nb
		9	2.1	<0.7	nb
	PO	_	2.2	<0.7	nb

nb ozn. nie badano aizolaty (jednokrotnie pasażowane zawiesiny wirusa o średnim mianie log10pfu/ml równym 4,0) wytworzono z próbek od szympansów, od których pochodziły próbki wacików zawierających wirusa lub płukanki oskrzelowe i badano na wydajność tworzenia łysinek przy 32°C, 39°C i 40°C, ^Procent miana przy 39°C do miana przy 32°C; wacik NG dnia 7=0,2%; NG dnia 8=6%;

PO dnia 8=20%; PO dnia 10=16%. Wszystkie łysinki miały fenotyp małych łysinek; nie obserwowano łysinek wielkości szczepu dzikiego.

^cProcent miana przy 40°C do miana przy 32°C wynosił 0,2%. Wszystkie łysinki były bardzo małej wielkości (pinpoint); nie obserwowano łysinek wielkości szczepu dzikiego.

Tabela 6

Odpowiedź przeciwciał surowiczych szympansów zakażonych RSV cpts-248, cp-RSv lub RSV A2.

Zwierzę zakażone przez	Szympans Nr.	Neutralizulace	ELISA - F	ELISA - G
Dzień 0	Dzień 28	Dzień 0	Dzień 28	Dzień 0	Dzień 28
cpfs-248	4	<3.3	10.7	7.3	15.3	6.3	9.8
cp-RSV	4	<3.3	11.2	11.3	15.3	9.3	12.3
RSV A2	4	<3.3	11,2	8.3	15.3	7.3	10.3

Tabela 7

Immunizacja szympansów przy użyciu cpts-248 wywołuje odporność na RSV A2 szczepu dzikiego podanego 28 dni po immunizacji.

	• Od powiedź na zakażenie Przy użyciu 10* PFU wirusa szczepu dzikiego dnia 28 oo immunizacli
			Zdrowienie z zakażenia wirusem
		N	osogardziel	Tch	awica	Ocena wyc	eku z nosa	Miano
								przeciwciał
Zwierzęta	Szympans	Czas	Szczytowe	Czas	Szczytowe	Średnia	Szczyt	neutralizu-
immuniz.	Nr.	trwania	miano	trwania	miano			jących
przez:		(dni)	(log,₀pfu/ml	(dni)	(log,_opfu/ml;			(log,)	dnia
								28	42 lub 56
opts-248	1	5	2.7	0	<0.7	0	0	10.1	11.0
	2	9	1.8	0	<0.7	0	0	10.3	14.5
cp-RSV	5	5	1.0	0	<0.7	0	0	11.1	13.3
	6	8	0.7	0	<0.7	0	0	11.4	12.9
żaden	9	9	5.1	13	5.4	1.0	1	<3.3	12.4
	10	9	6.0	8	6.0	1.7	4	<3.3	13.2
	11	13	5.3	8	5.9	2.1	3	<3.3	11.6
	12	2	5.4	8	5.6	.10	3	-<·3„3	11.,9-

aśredni wynik oceny wycieku z nosa oznacza sumę wyników podczas ośmiu dni najwyższego miana wirusa podzieloną przez osiem Cztery oznacza ocenę najwyższą; zero - najniższą co oznacza brak wycieku podczas dziesięciodniowej obserwacji.

172 087

Dalsza atenuacja

W związku z tym, że wirus RS powoduje więcej objawów chorobowych w dolnych γ»Ιλ n łii/W»y» -rutU π pt, rry»r\r^-nf'lwi i -irin A/-» »>λτι + «-5·λ+-»>

vxi V/£U.VA1 kJVlWV/V-llV/Vr J VA1 U 1UUL1 AI1ZL. Lł OiLjfinpCiIlOKJ W, 1 U£aiajQV, ZjV illULdUiy wydldi u^dlduu atsnużwans dla szympansów mogą być niewystarczająco atenuowane dla seronegatywnych niemowląt i dzieci, pochodne cpts248 i 530 posiadające bardzo niecharakterystyczne własności mutanta ts ograniczonej replikacji i atenuacji w górnych drogach oddechowych oraz wysoki poziom stabilności genetycznej, były dalej poddawane mutagenezie.

Wirusy potomne wy^k^ri^LujlcOi wyższy stopień wrażliwości na tempesaturę in vkto niż €[1^248 lub posiadające fenotyp małych łysinek wybrano do badań. Mutanty pochodne cpts248 posiadające jedną lub więcej dodatkowych mutacji ts wytworzono mutagenezą z użyciem 5-flużrżuracylu (Tabela 8). Mutanty ts, które były bardziej wrażliwe na temperaturę (ts) niż cpts248 zidentyfikowano; część z nich posiadała fenotyp małych łysinek (sp)- Pochodne cpts248 podano myszom. Pochodne cpts 248/804, 248/955, 248/404, 248/26, 248/18 i 248/240 były bardziej ograniczane co do replikacji w górnych i dolnych drogach oddechowych myszy niż wirus rodzicielski cpts248 (Tabela 9). Tak więc, zidentyfikowano żywotne mutanty cpts248, które były bardziej atenuowane niż cpts248. pochodne te wykazywały szeroki zakres efektywności replikacyjnej u myszy, z czego ts248/26 był najbardziej ograniczony. Fenotyp ts wirusa obecnego w małżowinach nosowych i płucach myszy był prawie identyczny z fenotypem wirusa wyjściowego, co wskazuje na stabilność genetyczną. Wysoce atenuowana pochodna wirusa cpts248. wirus cpts248/404, była 1000 krotnie bardziej ograniczona co do replikacji w nżsogardzisli w porównaniu z wirusem szczepu dzikiego. Mutant cpts248/404. posiadający co najmniej trzy mutacje atenuujące, był również bardzo ograniczony co do replikacji w górnych i dolnych drogach oddechowych dwóch seronegatywnych szympansów, a zakażenie nie wywoływało wycieku z nosa (Tabela 10). Ponownie, wirus wykazywał wysoki stopień ograniczenia replikacji w porównaniu z dzikim szczepem wirusa, rzędu 60000 razy w notżgardzieli i 100000 razy w płucach. Owe dwa szympansy były również bardzo odporne na zakażenie wirusem szczepu dzikiego RS (Tabela 11). Dodatkowo, wytworzono dalsze pochodne wirusa cpts530 (Tabela 12). Powyższe wyniki przedstawiają dalsze ulepszenie we własnościach opisywanego wirusa RS, i stanowią bardzo istotny i znaczący postęp w rozwoju szczepu wirusa szczepionki RS.

Powyższe wyniki były całkowicie nieoczekiwane, opierając się na doświadczeniu płynącym z poprzednich badań. Przykładowo, wyniki wcześniejszych badań wskazywały, że własności in vivo mutantów ts RSV uzyskanych z pojedynczego cyklu mutagenezy wywołanej 5-flużrouracylsm, nie mogą być przewidziane a priori. Ponadto, jakkolwiek jeden z pierwszych czterech mutantów ts wytworzonych w ten sposób wykazywał tą samą temperaturę zamykającą dla tworzenia łysinek co inne mutanty, był zbyt atenuowany w badaniach na podatnych szympansach i podatnych niemowlętach i małych dzieciach (Wright i in., Infect. Immun. 37 (l):397-400 (1982). Wskazywało to, że nabycie fenotypu ts, dającego w wyniku temperaturę zamykającą dla tworzenia łysinek rzędu 37-38°C, nie dawało mutanta o pożądanym poziomie atenuacji dla podatnych szympansów, niemowląt i małych dzieci. W rzeczywistości, wyniki badań z użyciem znanych do tej pory mutantów ts nie dostarczały żadnej podstawy do wnioskowania, że wprowadzenie trzech niezależnych mutacji (lub zestawu mutacji) do RSV poprzez pasażżwanie w niskich temperaturach, a następnie dwóch następujących po sobie cykli chemicznej mutagenezy, może dać żywotne mutanty, które zachowują zakażalność w stosunku do szympansów (i przez ekstrapolację, dla małych dzieci) i wykazują pożądany poziom atenuacji, immunogenności i efektywności zabezpieczenia wymaganej od żywej szczepionki wirusa, by ją użyć w zapobieganiu chorób wywołanych przez RSV.

Zaprezentowane powyżej wyniki jasno wskazują, że poszczególne pochodne ts wirusa cpRS. stosowanego w szczepionce według wynalazku, są zaraźliwe i wykazują znaczny stopień atenuacji dla myszy i szympansów. Powyższe pochodne mutantów ts są atenuowane i wydają się być wysoce stabilne genetycznie po replikacji in νινί).

Mutanty te również powodują znaczną odporność szympansów na zakażenia RSV. Stąd, pochodne coRSV reprezentują szczep wirusa odpowiedni do użycia jako żywa szczepionka RSV wybrana by zapobiec poważnym chorobom ludzi, wywołanym przez RSV.

Tabela 8

Efektywność tworzenia łysinek dziesięciu mutantów uzyskanych z RSV cp£y-248 przez dodatkową mutagenezę 5-FU.

Wirus	Miano wirusa (log_5Opfu/ml) w temperaturze (°C)	temp. wyłącz. (“CP	małe łysinki przy 32°C
32	35	36	37	38	39	40
szczep αζικι A 2	4.5	4.6	4.4	4.5	4.5	3.8	3.8	>40	nie
cp-RSV	4.7	4.4	4.3	4.3	4.2	3.7	3.5	>40	nie
fs-1	5.6	5.4	4.9	4.4	3.7		<IQ.7	38	nie
cpts-248	3.4	3.0	2.6*	1.7”	<0.7	<0.7	<0.7	38	nie
248/1228	5.5*	5.3*	5.3”	<0,7	<0.7	<0,7	<0 7	37	tak
248/1075	5.3	5.3	S.l' ⁼	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	37	tak
248/965	4.5	4.2	4.2*	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	37	nie
248/967	4.4	3.7	3.6*	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	37	nie
248/804	4.9	4.5	4.0*	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	37	nie
248/955	4.8	3.7	2.8*	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	36	nie
248404	3.6	2.9*	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	36	nie
248/26	3.1	2.9'	<0.7	<0.7	<0J7	<0.7	<0.7	36	nie
248/18	4.0*	4.0**	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	<0.7	36	tak
248/240	5.8*	ŁZ2	..<9,?	<;Q.7	<Q,7		<0,7	_	tak

^Mianem temperatury wyłączającej określa się najniższą temperaturą, przy której obserwuje się 100-krotne bądź większe zmniejszenie miana łysinek (dane wytłuszczonym drukiem).

* Fenotyp małych łysinek (<50% wielkości łysinki szczepu dzikiego).

**Fenotyp bardzo małej łysinki (pinpoint)(<10% wielkości łysinki szczepu dzikiego).

Tabela 9

Replikacja i stabilność genetyczna dziesięciu mutantów uzyskanych z RSV cptt-248 na myszach BALB/c.

Wirus użyty do zakażenia	Temperatura wyłączająca !°Ct	Małżowiny nosowe	Płuca
32°C	36°C	37°C	38’C	32°C	36°C	37°C	38°C
szczep dziki A 2	>40	5.110.15	5.210.23	5.210.14	5.210.27	6.110.14	5.810.23	6.010.12	5.910.17
cp-RSV	>40	4.910.2	5.110.16	4.910.24	4.910.22	6.010.16	5.910.23	5.610.15	5.610.16
rs-1	38	3.910.25	2.710.27	2.410.42	2.510.29	4.110.21	3.510.23	2.610.18	2.010.23
cofs-248	38	4.010.16	2.510.34	<2.0	<2.0	4:410.37	1.810.15	<1.7	<1.7
243/1228	37	4. tiO.lo	2.410.48	<2.0	<2.0	2.010.37	<1.7	<i.7	<1.7
248/1075	37	4.210.18	2.410.4	<2.0	<2.0	5.510.16	3.510.18	<1.7	<1.7
248/965	37	3.810.23	<2.0	<2.0	<2.0	4.510.21	3.410.16	<1.7	<1.7
248/967	37	4.410.2	<2.0	<2.0	<2.0	5.410.2	3.610.19	<1.7	<1.7
248/804	37	2.910.13	<2.0	<2.0	<2.0	3.UUW.13	<1.7	<1.7	<1.7
248/955	36	3.210.1	<2 0	<2.0	<2.0	3.2122	<1.7	<1.7	<1.7
248404	36	2.110.31	<2.0	<2.0	<2 0	4.4+0.12	1.810.2	<1.7	<1.7
248/26	36	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0	2.310.2	<1.7	<1.7	<1.7
248/18	36	2.910.99	<2.0	<2.0	<2.0	4.310.23	1.810.15	<1.7	<1.7
248/2-40	2S	2.910.82	<2.0	£ifl	<2.0	3.310.12,	<U	£t,7	£12

ń ¹ Myszom podano 10 ’ pfu donosowo w lekkim znieczuleniu dnia 0, a następnie zabito je przez uduszenie w CO2 dnia 4.

172 087 Tabela 10

Replikacja cpts-RSV 248/404, cpts 248/18, cpts-RSV 248, cp-RSV i RSV dzikiego szczepu A2 w górnych i dolnych drogach oddechowych seronegatywnych szympansów.

Zwierzę zakażone prez:	Droga Szympans	Nosogardziel	Tchawica	Ocena wycieku z nosa
Czas trwania (dni?	Szczytowe m>ano tloo.APfu/ml)	Czas trwania (dnl)b	Szczytowe miano lioa,„pfu/ml)	Średnia	Szczyt
zakażenia	Nr.
cpts-248/404	IN + IT	13	0	<0.7	0	<0.7	0	0
	IN + IT	14	0	<0.7	0.	<0.7	0	0
cpts-248#	IN + IT	1	10	4.6	8	5.4	0.2	1
	IN + IT	2	10	4.5	6	2.2	0.1	1
	IN + IT	3	9	4.7	10	2.1	0.1	1
	IN + IT	4	9	4.2	8	2 2	0.1	1
			śr,9,5	śr,4,5	śr 8	śr.3	śr.0 1	śr 1
cp-RSV#	IN	5	20	5.3	8	2.9	1.0	3
	IN	6	16	5 8	6	3 0	1.8	3
	IN+IT	7	13	4.3	6	3.0	0.6	1
	IN + IT	8	16	5.0	10	2.8	0.5	1
			śr, 16	śr.5.1	śr.7.5	śr.2,9	śr.1	śr.2
A2 eziki
	IM	o	o	5 1	13	5 4	1 o	1

	IN	10	9	6.0	8	6.0	1.7	4
	in + σ	11	13	5.3	8	59	2.1	3
	IN + IT	12	9	5.4	8	5.6	1.0	3
			śr.10	śr 5.5	śr 9.3	śr.5 7	śr 1 4	śr.2 8

# zwierzęta opisane w Tabeli 4 i 7.

n 4

IN ozn. donosowo w dawce 104 pf_u w 1 szczepionki; IN + IT ozn zarówno donosowo jak i dotchawiczo po 104 pfu _w j m szczepionki w każde z miejsc ^Oznacza ostatni dzień po zakażeniu w którym uzyskano wirusa cśredni wynik oceny wycieku z nosa oznacza sumę dziennych ocen przez okres ośmiu dni w koło dnia szczytowego nasilenia uzyskiwania wirusa podzieloną przez osiem.

Cztery oznaczało najwyższą ocenę; zero - najnizszą.

^wirusa izolowano tylko danego dnia

Tabela 11

Immunizacja szympansów przy użyciu cpts-248/404 wywołuje odporność na zakażenie RSV A2 dzikiego typu po 28 dniach

Wirus użyty do immuni- zacii	Szympans Nr,	Zdrowienie z zakażenia wirusem	Ocena wvc eku z nosa	Miano przeciwciał surowiczych neutr.
Nosoaardziel	Tchawica
Czas trwania (dni)	Szczytowe miano (loa,₀pfu/ml)	Czas trwanie (dni)	Szczytowe miano (loa,₀pfu/ml\|	Średnia	Szczyt
Dzień 28	Dzień 42 lub 56
cpts-248/404	13	0	<0.7	0	<0.7	0	0	nb	nb
	14	8 śr.4	3.4 śr.2	0 śr.0	<0.7 śr 0 7	0 śr.0	0 śr.0	nb	nb
cpts-248#	1	5	2.7	0	<07	0	0	10.1	11
	2	9 śr 7	1.8 śr 2 3	0 śr.0	<0.7 śr.0 7	0 śr.0	0 śr 0	10.3 śr 10.2	14.5 śr.12.8
cp-RSV#	5	5	1.0	0	<0.7	0	0	11.1	13.3
	6	8 śr.6.5	0.7 śr0.9	0 śr 0	<0.7 śr 0 7	0 śr.0	0 śr.0	11.4 śr.11.2j	12.9 śr.13.1
żaden#	9	9	5.1	13	5.4	1 0	1	<3.3	12.4
	10	9	6.0	8	6.0	1.7	4	<3.3	13.2
	11	13	5.3	8	5.9	2.1	3	<3.3	11.6
	12	9	5.4 śr.5.5	8 -śr,9,3	5.6 śr.5.7	1.0 _	3 śr.2 8	<3.3 śr.3.3	11.2 śr.12.1

nb ozn. nie badano # zwierzęta opismie w Tabeit 4,7 110

172 087

Tabela 12

Efektywność tworzenia łysinek 14 mutantów uzyskanych z RSV cpts-530 badanych na komórkach HEp_-2 w temperaturach /τ,ΙίπΜηίηΓητζ,Ιι t,Tori-»nt i <Τ··*5orwrr»lł nnrAnmnnin »» o

LŁiinr/.itw»Q.|Qe,jvil YTZUUOl i t/giaxiJ.vzxŁjc^vjvix yt |zviunuułuu łi nvutivn|i

Wirus	Miano wirusa (loe,<>pfu/ml) przy podanej temperaturze	Temperatura wyłączająca (°C)	Małe łysinki przy 32 °C
32	35	36	37
cp-RSV	6.3	6.3	6.0	6.3	>40	nie
cofs-530	2.7	25	2.4’	2 2	39	me
530/9	4.4	3.5’	3.0·’	<1.0	37	nie
530/346	3.1	3.0’	2.3’’	<1.0	37	nie
530/653	2.0	2.5’	<1.0	<1.0	36	nie
530/667	4.8	4.2’	<1.0	<1.0	36	nie
530/403	2.6’	<1.0	<1.0	<1.0	35	nie
530/188	3.2*	<1.0	<1.0	<1.0	35	tak
530/464	3.6*	<1.0	<1.0	<1.0	35	tak
530/1009	4.4	4.4	3.0’’	<0.7	37	nie
530/1178	4.1*	3.8’	2.5’’	<0.7	37	tak
530/1074	4.1	4.1’	2.4	<0.7	37	nie
530/963	4.5	4.3’	2.3’	<0.7	36	nie
530/977	4.6	4.2’	0.7’	<0.7	36	nie
530/1030	3.2’	1.3’’	<0.7	<0.7	36	tak
530/1003	-3-6	3.0’-	<0.7	<0 7	3fi	nie

Fenotyp małych łysinek (<50% wielkości łysinki szczepu dzikiego).

**

Fenotyp bardzo małej łysinki (pinpoint)(<10% wielkości łysinki szczepu dzikiego).

Przykład II. Adaptowanie do niskiej temperatury w celu atenuowania mutantów cpRSV

Niniejszy przykład opisuje wprowadzenie mutacji ograniczenia wzrostu do niecałkowicie atenuowanego ograniczonego warunkami gospodarza szczepu cpRSY przez dalsze pasażowanie szczepu w malejących temperaturach w celu wytworzenia szczepu pochodnego, który byłby zadowalająco atenuowany do zastosowania go jako szczepionka u ludzi.

Próby z adaptacją do niskiej temperatury (ca) użyte były w celu wprowadzenia dalszej atenuacji do wirusa cpRSV3131. który jest niekompletnie atenuowany dla seronegatywnych dzieci.

Zgodnie z pierwszą strategią, roztwór wyjściowy pasażowanego w niskiej temperaturze RSV (cpRSV3131) uzyskanego z Flow Laboratories, przygotowano przez pasażowanie na komórkach MRC-5, jak to opisano w przykładzie I. Pokrótce wirusem pasażowanym w niskiej temperaturze zakażono jednowarstwowe hodowle komórek MRC-5 i Vero w wielokrotności dawki zakażającej rzędu <0,01, a następnie zakażone komórki .-inkubowano 3 do 14 dni do następnego pasażu . Wirusa pasażowano ponad i 20i razy w temperaturze 20-22°C w celu uzyskania bardziej atenuowanego wirusa. Technika szybkiego pasażu, jak tylko pojawiają się pierwsze oznaki replikacji wirusa (tzn. 3 do 5 dni) jest najkorzystniejsza do selekcji mutantów zdolnych do efektywnego replikowania w niskich temperaturach. Dodatkowo, szczep podgrupy B RSV, St. Louis/14617/85 klon 1A1, wyizolowano z hodowli pierwotnej komórek nerki afrykańskiej małpy zielonej, pasażowano i klonowano w komórkach MRC-5 (1A1-MRC-14), a następnie pasażowano 51 razy na tych komórkach przy 32 do 22°C.

Druga strategia używała klonowanej biologicznie pochodnej nieklonowanego wirusa rodzicielskiego cpRSV. Wirus ten klonowano biologicznie na komórkach nerki płodowej wołu . (BEK) (tkanki użytej do pierwszego uzyskania wirusa cpRSV3131: patrz Friedewald i in., J.Amer.Med.Assoc., 204:690-694 (1968)). Ów klonowany wirus był następnie pasażowany w odstępach 10 dniowych · na komórkach VERO w niskiej temperaturze. Równocześnie, wirus cpRSV klonowano w rozcieńczeniach końcowych (TD2P4) na komórkach MRC-5 i pasażowano w odstępach 10 dniowych na komórkach Vero.

172 087

Trzecia strategia wykorzystywała selekcję mutantów produkujących duże łysinki w niskiej temperaturze. Wyizolowano pochodną wirusa cp3131 RSV, oznaczoną Dl, wytwarzającą duże łysinki przy 25°. Wirus otrzymano z trzeciego poziomu (P3) pasażu odgałęzienia cp3131-1(BEK linii cp3131-17(BEK). Największa łysrnka wytworzona przez wirusa P3 namnożona została przy 32°C, a następnie ponownie posiana w temp. 25°C, i ponownie wyizolowano największą łysinkę, namnożono i posiano. Po pięciu takich cyklach, uzyskano mutanta Dl tworzącego duże łysinki. D1 klonowano biologicznie przez dwa dodatkowe cykle oczyszczania w temp, 25°C.

Klonowany biologicznie wirus Dl wytwarzał oddzielne, jednakowo większe łysinki przy 25°C, niż wirus cp3131 czy wirus dzikiego szczepu A2. Tak więc, Dl jest zaadaptowany do zimna pod względem tworzenia dużych łysinek przy 25°C. Wstępne doświadczenia wskazywały, że Dl nie jest wrażliwy na temperaturę. W temperaturze 37°C łysinki nie różniły się od wytworzonych przez wirusa dzikiego szczepu RS czy cp3131. co sugerowało, że Dl nie jest ograniczany co do wzrostu w tej temperaturze. Zgodnie z tym, Dl powodował rozsiany efekt zytopatyczny w hodowli komórek Vero w temperaturze od 37°C do 40°C (tzn. najwyższych badanych temperaturach).

\ ' U J J J X z

Przykład III. Wprowadzanie dalszych mutacji atenuujących do tsRSV

Niniejszy przykład obrazowuje użycie mutantów ts jako wirusów rodzicielskich w celu uzyskania całkowicie atenuowanych szczepów. Dwa mutanty ts RSV A2 wybrano do tego procesu, konkretnie były to ts-4 i ts-1 NG1. Dwa różne sposoby wybrano w celu wprowadzenia dodatkowych mutacji do mutantów ts RSV. Pierwszy polegał na poddaniu niekompletnie atenuowanego mutanta ts RSV chemicznej mutagenezie, zaś zmutowane wirusy potomne bardziej wrażliwe na temperaturę, co określano na podstawie tworzenia łysinek, wybrano do dalszych badań. Drugi polegał na pasażowaniu mutantów ts RSV w niskiej temperaturze, w celu uzyskania wirusów o fenotypie ca, tzn., o zwiększonej zdolności replikacji w temperaturze suboptymalnej w porównaniu z wirusem rodzicielskim dzikiego szczepu.

Roztwór wyjściowy wirusa ts-1 NG1 przygotowano z żywego mutanta wirusa oddechowego (A2) ts-1 NG1 z Flow Laboratories, Nr. serii M2, rosnącego na linii komórkowej MRC-5. Mutant ten, uzyskany przez drugi cykl mutagenezy z użyciem 5-fluorouracylu, posiadał dwie lub więcej niezależnych mutacji ts, ale wciąż wywoływał znaczny wyciek z nosa u podatnych na zakażenie szympansów. Wirusa dwukrotnie pasażowano na komórkach Vero przy 32°C w celu uzyskania zawiesiny ts-1 NG-1 do mutagenezy. Wirusa hodowano w obecności 4x10'⁴ M 5-fluorouracylu w celu wywołania mutacji podczas replikacji, lub eksponowano na działanie 5-azacytydyny w temperaturze 36°C po traktowaniu go 5-fluorouracylem. Roztwór poddawany mutagenezie był następnie badany na tworzenie łysinek w hodowli komórek Vero, hodowanych na podłożu agarowym, w którym to badaniu, po odpowiednim okresie inkubacji łysinki identyfikowano mikroskopowo. Zebrano 586 łysinek, a wirusy pochodzące z każdej z łysinek namnażano osobno przez wzrost na świeżej hodowli komórek Vero. Zawartość każdej z hodowli tkankowej z wirusem pochodzącym z pojedynczej łysinki poddanego mutagenezie wirusa ts-1 NG1 zbierano oddzielnie gdy efekt cytopatyczny na komórkach Vero osiągnął maksimum. Wirusów potomnych będących bardziej wrażliwych na temperaturę niż ts-1 NG1 poszukiwano przez mianowanie pul łysinek na komórkach HEp-2 przy 32°C i 36°C. Każdy z wirusów wykazujących większą wrażliwość na temperaturę niż ts-1 NG1 (tzn. 100 krotne zmniejszenie miana w temperaturze ograniczającej [36°C] w porównaniu z 32°C) był dalej badany. Wirusy, pochodzące z sześciu łysinek, będące bardziej ts niż wirus wyjściowy ts-1 NG1 RSV, wyizolowano i dalej klonowano biologicznie przez kolejne trzykrotne oczyszczanie łysinek na komórkach Vero, a następnie namnażano na tychże komórkach. Klonowane szczepy mianowano przy 32°C, 35°C, 36°C, 37°C i 38°C (test wydajności tworzenia łysinek) w celu potwierdzenia ich fenotypu ts. Dane z testu wydajności tworzenia łysinek potwierdziły fenotypy sześciu mutantów (Tabela 13).

Dwa wirusy najbardziej ts, A-20-4 i A-37-8, były bardziej atenuowane w teście na myszach niż ich wirus rodzicielski ts-1 NG1, co wskazuje na nabycie zwiększonego poziomu wrażliwości na temperaturę co związane było z tym, że sprzyjało atenuacji (Tabela 14). Wirusy te były zaraźliwe dla myszy ponieważ indukowały odpowiedź przeciwciał. Wirus ts-1 NG1/A-20-4 był atenuowany dla szympansów (Tabela 15), a zakażenie nim powodowało odporność na zakażenie wirusem szczepu dzikiego (Tabela 16). Istotnie, nie występował wyciek z nosa.

Mutagenezę wirusa ts-4 wykonywano przy użyciu tych samych metod co w przypadku wirusa ts-1 NG1. Zidentyfikowano pięć potomnych łysinek, które były bardziej ts niż rodzicielski RSV ts-4 (Tabela 17).

Tak więc, do wirusów ts-1 NG1 i ts-4 wprowadzone zostały mutacje przez pasażowanie w niskiej temperaturze. Wirus ts-4 replikował do wysokich mian przy 22°C po 38 pasażach w niskiej temperaturze.

Tabela 13

Wydajność tworzenia łysinek przez pochodne ts-1 NG1

Wirus	Miano (loomiptj/ml) w	podanej temperaturze
32°C	35°C	36°C	37°C	38°C
A-20-4(4-1)‘	5.9*	<1	<1	<1	<1
A-37-8(1-2)	8.3	6.3	<1	<1	<1
A-15-7	3.5	nb	2.1	1.5	<1
A-25-8	5.3	nb	5.0*	4.8*	<1
A-21	5.1	nb	4.8**	4.5**	<1
ts-1 NG1	6.6	6.6	6,5	6.6	<1

atysinki oczyszczone 3x *

fenotyp małych łysinek (<50% wielkości łysinek wirusa dzikiego typu) fenotyp bardzo małych łysinek (<10% wielkości łysinek wirusa dzikiego typu)

Tabela 14

Rephkaqa wirusa rodzicielskiego ts-7 NG1 i potomnych wirusów w myszach BALB/c.

Wirus	Dawka	Dzień do	Miana w płucach	Miana w nosie
loan	zakaż.	32°C	38°C	32°C	38°C
A 2 dzik' szczep	6.1	4	4.6610.32’	4.810.16	3.1810.4	3.2940.33
		5	5.1840.33	5.2540.23	3.440.2	3.4710.14
ts-1 NG1	5.8	4	4.3110.17	<2.0	2.8240.25	<2.0
		5	3.9810.12	<2.0	2.7410.31	<2.0
A-20-4	6.1	4	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0
		5	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0
A-37-8	6.3	4	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0
		5	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0

^aŚr. log10±odchylenie standartowe. 6 zwierząt na grupę

172087 Tabela 15

Replikacja ts-1 NG1/A-20-4, ts-1 NG1, ts-1 lub wirusa RSV dzikiego szczepu A2 w górnych i dolnych drogach oddechowych seronegatywnych szympansów.

Zwierzęta zakażone orzez;	Droga podania*	Szympans Nr	7/^ΓΠOιenii . 7ll·s1βeia otIllQem
Nosogardziel	Tchawica	Ocena wycieku z nosa
Czas trwania (dni)	Szczytowe miano (log,„pfu/ml)	Czas trwania (dni)	Szczytowe miano (logwpfu/ml)	Średnia	Szczyt
ts-1 NG1/A-20-4 IN + IT	15	0	<0.7	0	<0.7	0	0
	IN + IT	16	0	<0.7	0	<0 7	0	0
	IN + IT	17	0	<0.7	0	<0 7	0	0
	IN + IT	18	16a śr.4	2.7 Sr. 1 2	0 śr.0	<0.7 śr.0.7	0 śr.0	0 śr.0
ts-1 NG1	IN	19*	8	4.2	0	< 1.1	0.6	1
	IN	20*	7	3.9	0	< 1.1	0.7	1
	IN	2V	13	5.4	0	<1 1	0.4	1
	IN	22-	10 śr.9.5	5.2 śr 4 7	10¹ śr.0.25	3 70 śr.1.8	0.6 śr.0.6	2 Sr. 1.3
ts-1	IN	23·	16	3 4	n	<1 1	0 4	1
	IN	24·	13	4.4	0	< 1.1	1.0	3
	IN	25·	13	5.0	130	2.2	2.0	4
	IN	26·	10 śr.13	3 4 śr.4,1	0 śr.0.25	<1 1 śr. 1.4	1 0 śr. 1.1	2 .........śr.2.5 .
A 2 dziki
szczep	IN	9'	9	5.1	13	5.4	1.0	1
	IN	10'	9	6.0	8	60	1.7	4
	IN + IT	11’	13	5 3	8	5.9	2.1	3
	IN + IT	12·	9 i..-śr.ia	5.4 śr.5.5	8 śr.9.3	5.6 śr 5.7	1.0 śr. 1.4	3 Sr.2.8

aiN ozn. donosowo; IN + IT ozn zarówno donosowo jak i dotchawiczo. bozn ostatni dzień po zakażeniu, w którym uzyskiwano wirusa ^cśrednia oceny wycieku z nosa; ozn. sumę dziennych ocen przez okres ośmiu dni w pobliżu dnia szczytowego nasilenia uzyskiwania wirusa podzieloną przez osiem. Cztery oznacza ocenę najwyzszą, zero - najnizszą.

wirusa izolowano tylko wskazanego Onia zwierzęta uzyte w doświadczeniu opisanym przez Crowe i in., Vnccine (w druku) (1993) ^zwierzęta użyte w doświadczeniu opisanym przez Collins i in , Vaccine 8:164-168 (1990)

Tabela 16

Immunizacja szympansów przy użyciu 104 pf_u rsv tj-1 NG1/A-20-4, tt-1 Ng1 i ts-1 wywołuje odporność na zakażenie przy użyciu 10e pfu RSV dzikiego szczepu A2 po 28 dniach

Wirus użyty do immun.izacii	Szympans Nr.	Czas trwania (dni)	Zdrowienie z za każenia wirusem	Ocena wycieku z	tosa Miano przeciw-
Nosogardziel	Czas trwania (dni)	Tchawica
Szczytowe miano (loBnpfu/ml)	Szczytowe miano (log_wpfu/ml)	Średniaa	Szczyt	c Dzień 28	iał surowiczych Dzień 42 luh 56
15-1 NG1 /A-20-4	15	0	<0.7	0	<0.7	0	0	<3.3	niejasny
	16	n	<0.7	0	<0.7	0	0	<3.3	r-tiojoorty
	17	0	<0.7	0	<0.7	0	0	6.8	niejasny
	18	3	2.0	0	<0.7	0	0	9.7	niejasny
		śr.0.8	śr. 1.0	śr.0	śr. <0.7	śr.0	śr 0	śr.5.8	śr.
Js-1 NG1	19·	0	<0.7	0	<11	0	0	11.4	10.4
20·	0	<0 7	0	<11	0	0	14 4	12.4
	21·	0	<0.7	0	<11	0	0	11.8	8 9
	22·	0	<0.7	0	<11	0	0	10.2	10.6
		_	śr<0.7	śrd3	śr <1.1	śr.0	śr.0	śr. 12.0	śr10 6

172 087 ciąg dalszy tabeli

1	2	3	4	5	6	7	8	9	1 10

ia-i		V	<0.7	0	<1.1	U	0	• 0.9	9.8
	nnb			A
								12.2	i 5.8
	25^b	5	0.7	0	<1.1	0	0	7.7	9 9
	26^k	5	07	0	<1.1	0	0	17.7	14.5
		śr.2.5	fcOJ	Jr.O-	śr. <1.1	śr 0	śr.0	śr.12.1	śr.12.5
żaden	9'	9	5.1	13	5.4	1.0	1	<3.3	12.4
	10'	9	6.0	8	6.0	1.7	4	<3.3	13.2
	11^b	13	5.3	8	5.9	2.1	3	<3.3	11.6
	12b	9	5.4	8	5.6	1.0	3	<3.3	11.2
		śr.10	SłŁS	śr.9.3	SŁZ	śr,1.5	_	śr.<3.3	—Sr. 12.1

a^rednia oceny wycieku z nosa, ozn sumę dziennych ocen przez okres ośmiu dni w pobliżu dnia szczytowego nasilenia uzyskiwania wirusa podzieloną przez osiem. Cztery oznacza ocenę najwyższą; zero - najnizszą.

bzwierzęta użyte w doświadczeniu opisanym przez Crowe i in., Vaccine (w druku) (1993) ^czwierzęta użyte w doświadczeniu opisanym przez Collins i in., Vaccine 8-164-168 (1990) iawia i /

Wydajność tworzenia łysinek pochodnych tt-4

Szczep	Miano wirusa (loa^pfu/ml)
32°C	35°C	36°C	37°C	38°C
ts-4/F-15-8	6.0	5.9*	6.0*	<2.0*	<2.0
JS-4/F-19-1	5.5	5.3*	5.4*	<2.0	<2.0
ts-4/F-20-7	6.1	6.1*	6.1*	<2.0*	<2.0
ts-4/F-29-7	5.8	<2.0	<2.0	<2.0	<2.0
ts-4/F-31-2	5,6	<2.0*	<2.0*	<2.0	<2.0
ts-4 (wirus rodzicielski)	6.1	6.3	6.3	6.1	<2.0

^aszczep niejasny * ...

fenotyp malej łysinki (<50% wielkości łysinki dzikiego szczepu)

Badania na ludziach.

Atenuowany wirus, będący przedmiotem niniejszego wynalazku, podawany jest ludziom zgodnie z dobrze ustalonym protokołem szczepionki przeciw RS, jak to opisano np. Wright i in., Infect. Immun., 37:397-400 (1982); Kim i in., Pediatrics 52:56-63 (1973); oraz Wright i in., J. Pediatr., 88:931-936 (1976), załączone tu jako referencja. Pokrótce, dorosłych i dzieci szczepiono donorowo przy pomocy kropli zawierających od 10³ do 10⁵ PFU atenuowanego wirusa na ml w objętości 0,5 ml. Odpowiedź przeciwciał badana była wiązaniem dopełniacza, neutralizacji łysinek, i/lub enzymatycznego testu immunosorpcyjnegż. Osobnicy badani byli pod kątem objawów chorobowych ze strony górnych dróg oddechowych. Podobnie jak w przypadku podawanego szympansom, atenuowany wirus, wchodzący w skład niniejszej szczepionki rósł w nżtżgardzieli szczepionych osiągając poziomy więcej niż dziesięciokrotnie niższe w porównaniu z wirusem szczepu dzikiego, i około 10 krotnie niższe w porównaniu z wirusem cpRSY lub innym niekompletnie atenuowanym szczepem rodzicielskim. Osobnikom, u których wymagane jest utrzymanie wysokich poziomów odporności okresowo podawane są kolejno szczepienia.

Claims

Zastrzelenia patentowe

1. Szczepionka zawierająca atenuowany wirus oddechowy RS, znamienna tym, że zawiera fizjologicznie dopuszczalny nośnik, przynajmniej jeden atenuowany wirus oddechowy posiadający przynajmniej dwie mutacje atenuujące, wybrany z wrażliwych na temperaturę mutantów wirusa oddechowego ograniczonego przez warunki gospodarza, pasażowanego w niskiej temperaturze albo zaadaptowanych do niskiej temperatury mutantów wirusa oddechowego ograniczonego przez warunki gospodarza, pasażowanego w niskiej temperaturze, który to wirus ma fenotyp wrażliwości na temperaturę albo fenotyp adaptacji do niskiej temperatury nie zmieniony przez replikację in vivo, wykazuje co najmniej 10-łcrotne zmniejszenie replikacji w górnych drogach oddechowych w porównaniu z dzikim wirusem oddechowym oraz wywołuje odpowiedź przeciwciał neutralizujących w surowicy in vivo w stopniu porównywalnym z wywołaną przez dziki wirus oddechowy.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo zawiera adiuwant w celu zwiększenia odpowiedzi odpornościowej.
3. Szczepionka według zastrz.1, znamienna tym, że wirus jest wirusem oddechowym pasażowanym w niskiej temperaturze, ograniczonym przez warunki gospodarza, który jest dalej atenuowany przez wprowadzenie jednej lub więcej dodatkowych mutacji, które czynią go wrażliwym na temperaturę lub niezdolnym do wytwarzania łysinek o normalnej wielkości w hodowli tkankowej.
4. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że wirus jest wirusem oddechowym pasażowanym w niskiej temperaturze, ograniczonym przez warunki gospodarza, który¹ jest pasażowany w temperaturach od ok. 20°C do 25°C, w celu dalszej atenuacji i uczynienia go zaadaptowanym do zimna.
5. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że atenuowany wirus należy do podgrupy A lub B.
6. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że atenuowany wirus należy do szczepu A2 podgrupy A.

Ί. Szczepionka wekług eastrz. 1, znamiennatym, że atenuowany wirns oddechody wybrany został z grupy:

(i) cptsRSY 248,248/404, 248/804, 248/955, cpts spRSV 248/1228;

(ii) cptsRSY 475;

(iii) cptsRSY 530, 530/9, 530/346, 530/653, 530/667, 530/403, 530/188, 530/464, 530/1009, 530/1178, 530/1074, 530/963, 530/977, 530/1030, 530/1003;

(iv) cpRSV 3131D1;

(v) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8, A-15-7, A-25-8, A-21; i (vi) RSV ts-4/F-i5-8, F-19-1, F-20-7, F-29-7 i F-31-2.
8. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że atenuowony wirus oddechowy wybrany został z grupy:

(i) cpsRSY 248, 248/404, 248/804, 248/955, cpts spRSY 248/1228;

(ii) cptsRSY 530;

(iii) cpRSV 3131D1;

(iv) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8 i (v) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7.
9. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że atenuowany wirus oddechowy wybrany został z grupy:

(i) cptsRSY 248, 248/404;

(ii) cptsRSY 530;

172 087 (iii) RSV ts-1 NG 1/A-20-4, A-37-8 i (iv) RSV ts-4/F-19-1, F-29-7.
10. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że atenuowany wirus oddechowy wybrany został z grupy:

' (i) cptsRSY 248/404;

(ii) cptsRSY 530; i (iii) RSV ts-1 NG-1/A-20-4.
11. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że została wytworzona w dawce od 10³ do 10^ć PFU atenuowanego wirusa.
12. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera atenuowany szczep RSV, wytworzony przez wprowadzenie mutacji wrażliwości na temperaturę do pasażowanego w niskiej temperaturze szczepu RSV, tak że temperatura wyłączająca dla tworzenia łysinek jest w zakresie 35-39°C.
13. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że temperatura wyłączająca jest w zakresie 35-38°C.
14. Szczepionka według zastrz. 12. znamienna tvm. że atenuowany szczeń RSV

X - —j -----r należy do antygenowej podgrupy A.
15. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że atenuowany szczep RSV należy do antygenowej podgrupy B.