JP3882220B2 - キャピラリー電気泳動チップ - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、極微量のタンパクや核酸などを、高速かつ高分解能に分析する場合に利用される電気泳動チップに関し、さらに詳しくは、基板に形成した溝をキャピラリーとして用いるキャピラリー電気泳動チップに関する。
【0002】
【従来の技術】
従来より極微量のタンパクや核酸などを分析する場合には、電気泳動装置が用いられており、その代表的な装置としてキャピラリ−電気泳動装置がある。この泳動装置は、内径50μm程度もしくはそれ以下のガラスキャピラリー内に泳動バッファを充填し、一方の端に試料を導入した後、キャピラリー両端に高電圧を印加して、分析対象物をキャピラリー内で展開させるもので、ガラスキャピラリー内が容積に対して表面積が大きい、すなわち冷却効率が高いことより、高電圧の印加が可能となり、DNAなどの極微量試料を高速かつ高分解能にて分析することができる。
【0003】
また、前記したガラスキャピラリーを用いたものは、試料導入量の再現性が低い、高速とはいえ一分析に数分から数十分の時間を要する、使用するキャピラリー外径が100〜数100μm程度と細く破損し易いため、ユーザが行うべきキャピラリー交換時の取扱いが容易でない等の課題を有する。
【0004】
そのため、D.J. Harrison et al. / Anal. Chim. Acta 283 (1993) 361-366に記されているように、2枚の基板を接合して形成された、キャピラリ電気泳動チップが提案されている。この電気泳動チップ11の例を図4に示す。これは一対の透明基板(ガラス板)51、52からなり、一方の透明基板52の表面にエッチングにより泳動用のキャピラリ溝54、55を形成し、他方の透明基板51にその溝54、55の端に対応する位置にリザーバ53を設けたものである。
【0005】
この装置の使用は、両透明基板51、52を図4(c)に示すように重ね、いずれかのリザーバ53から泳動液を溝54、55の中に注入する。そして短い方の溝54の両端のリザーバ53に電極を差し込んで所定時間だけ高電圧を印加する。これにより、試料は溝54の中に分散される。次に長い方の溝55の両端のリザーバに電極を差し込み、泳動電圧を印加する。これにより、両溝54、55の交差部分56に存在する試料が溝55内を電気泳動する。従って、溝55の適当な位置に紫外可視分光光度計、蛍光光度計、電気化学検出器等の検出器を配置しておき、分離成分の検出を行う。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来チップでは、検出手段として紫外可視分光光度計を用いる場合には泳動溝の内径が数十μmであるため、十分な光路長を得ることができなかった。この課題を解決するため、溝の内面に反射面を設け、多数回反射させることにより光路長を長くすることも考えられるが、反射による光の減衰が高く、高い感度が得にくい。
【0007】
そこで、本発明は、感度を落とさず、大きなS/N比を得ることができる新規なキャピラリ電気泳動チップを提供することを目的とする。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、一対の板状部材を備え、少なくとも一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成され、他方の板状部材には該溝に略対応する位置に貫通孔が設けられ、これら板状部材が溝を内側にして張り合わされて成るキャピラリー電気泳動チップにおいて、前記溝終端近傍の内径を終端近傍以外の溝内径より大きくするとともに、拡大溝の両端に、平面若しくは放物面の反射面を有する光入出射溝を設けたことを特徴とする。
【0009】
板状部材とは例えば各種ガラス、石英もしくはSi基板が用いられ、それらの厚みは例えば0.2〜1mm程度が好ましい。この板状部材に、例えばフォトファブリケーション技術により溝が形成される。フォトファブリケーション技術とは、フォトマスクのパターンを転写して複製を作製する技術をいい、一般にはフォトレジストまたはレジストと呼ばれる感光性材料をメタルマスクを介し基板表面に塗布し、光でパターンを転写する。そして、転写した平面的なパターンからエッチングなどによりある程度の立体的な形に加工するものである。
【0010】
使用するフォトレジスト(またはレジスト)は、例えば東京応化社製OFPR5000、シプレイ・ファーイースト社製マイクロポジットS1400、OMR83−100cpを用いることができるが、これらに限定されず、後のエッチング工程に耐え得るものであれば特に限定されない。また、その厚さは後のエッチング工程に耐える厚みが必要であり、1〜2μmの厚みが一般的である。
【0011】
マスクパターンの転写は、一般の集積回路の場合のようにレジストを塗布した基板にフォトマスクを密着する密着露光やステッパ(縮小投影露光装置)などを用いる投影露光が行われる。また、ホログラフィック露光であっても良い。なお、露光の際に使用する光源としては、例えば、超高圧水銀ランプのg線(436nm)を用いることができ、露光条件はレジスト材とレジストの厚みに依存する。マスクパターンが転写されてメタルが露出すると、メタルマスクのパターニングを行い、基板表面を出す。メタルマスクのパターニングは、例えばメタルとして金を用いた場合は、王水により行う。
【0012】
エッチングの方法は、各種ガラスや石英をエッチングする場合は、ウエットエッチングが挙げられる。そのエッチャントは、各種ガラスや石英がエッチングされる溶液であれば特に限定されるものではないが、例えば、弗酸系の溶液が使用されるのが一般的である。また、Si基板にエッチングする方法としては、ウエットエッチング(異方性エッチング)が挙げられる。異方性エッチングに用いるエッチャントは、KOH水溶液、TMAH(テトラメチルアンモニウムハイドライド)、ヒドラジンなどこの分野で使用されているエッチャントであれば、特に限定されるものではない。
【0013】
溝(泳動用溝)の内径は、10〜75μmで、好ましくは30μmである。拡大部の溝内径は、これより大きく50〜500μmで、好ましくは300μmである。拡大溝の両端には、泳動方向に平行な方向に光入出射溝が設けられる。光入出反射溝は前記の溝形成法と同様の溝形成法により形成される。光入反射溝の内径は、10〜75μmで、好ましくは30μmである。光入出射溝の内面には、スパッタリングによりアルミニウムなどが蒸着されて、光が反射されるようになっている。光入射溝に光源からの光を入射させ、光は泳動用溝を通過後、光出射溝により反射して検出器に至る。光源としては、紫外・可視域の光源、例えばHe−Cd半導体レーザー、重水素ランプ、タングステンランプを用い、検出器としては、例えば光電子増倍管、シリコンホトダイオードを用いるが、これらに限定されない。
【0014】
一方の板状部材には、例えば、テーパ状の貫通孔を形成する。ここで、ガラスや石英基板に貫通孔を形成する方法は、特に限定されるものではないが、超音波加工を用いるのが一般的である。貫通孔の大きさは、特に限定されるものでないが、例えば開口直径は0. 1〜数mm程度が望ましい。
【0015】
板状部材の張り合わせは、溝を内側にして重ね合わせて行う。2枚の板状部材の張り合わせ(接合)手段は特に限定されるものではないが、本発明の場合は微量分析装置ゆえ、接着剤は使用せず板状部材同士を直接接合するのが望ましい。ガラス同士の接合には、真空中もしくは窒素置換雰囲気中で600〜900℃程度に加熱することで、2枚のガラスを融着する手段が望ましい。また石英の接合には、例えば、少なくとも一方の基板接合面にガラスをスパッタ成膜した後に、上記と同様に加熱する手段が望ましい。さらにガラスとシリコンを接合する場合は、例えば、400℃程度に加熱してガラス側に−1kV程度の負電圧を印加して接合する陽極接合法を用いても良い。
【0016】
【発明の実施の形態】
本発明のキャピラリー電気泳動チップの概略を図面に基づいて説明する。
図1はキャピラリー電気泳動チップの溝を形成した方の板状部材を示しており、図1中1は例えばガラス基板からなる板状部材で、縦10mm、横20mm、厚さ0.5mmのものを用いることができる。板状部材1にはフォトファブリケーション技術により溝が形成される。溝はサンプル用溝2、泳動用溝3からなり、サンプル用溝2と泳動用溝3は一部で交差している。これら溝は、例えば深さ10μm、幅30μmである。
【0017】
また、泳動用溝3の終端近くは溝内径が拡大され、拡大溝が形成される。この拡大溝は最大幅が100μm、深さが10μmの台形溝である。また、この拡大溝の両端には光入出射溝5,5´が形成される。光入出射溝5,5´は、例えば深さ10μm、幅30μmである。これら拡大溝4、光入出射溝5,5´の概略図を図2に示してある。図2(a)は図1のa−a´の断面図で、(b)は上面図である。なお、光入出射溝5,5´の内壁にはスパッタリングによりアルミニウム膜を蒸着し、反射膜6、6´を形成している。光源及び検出器(図示せず)は、板状部材の外部に設置しており、光源からの光は光入射溝5の反射膜6方向に入射される。入射光は、反射膜6で反射して拡大溝4に入り、通過した光は光出射溝5´の反射膜6で反射して検出器に入るようになっている。
【0018】
更にサンプル用溝2、泳動用溝3の終端には液溜7、8、9、10が設けてあり、液溜7〜10は直径1mm、深さ10μmである。
【0019】
なお、図示されていないが、板状部材1には他の板状部材が接合される。他の板状部材は板状部材1と同様の材質、縦横幅を有しており、液溜7〜10に対応する位置に超音波加工により貫通孔が形成されており、貫通孔の径は液溜の径に合致している。接合後、貫通孔に針状電極を挿入し、リード線で高圧電源、パワーコントローラと接続する。
【0020】
以上の構成で試料の分析は次の様に行う。
先ず、電解質溶液を溜7〜10に満たした後、板状部材の貫通孔からマイクロシリンジにより試料を液溜8に注入する。液溜8、9の針状電極間に電位差(約100V/cm)を与えて、泳動用溝3に試料を導入する。次に液溜7,10の針状電極間に電位差(約250V/cm)を与え、拡大溝4内に試料を泳動させる。拡大溝4には、図3に示す如く、光源12より発せられた光が板状部材11、光入射溝5の反射膜6を介して入射してくる。このとき、板状部材1の屈折率1をnとすると、スネルの法則より図3中sin(2θ1 −θ3 )=nsin(90−θ1 )となり、エッチングにより作られた台形の角度θ1 により、入射角θ3 は決まる。
【0021】
拡大溝4内の試料が紫外・可視吸収のある場合には、試料濃度に比例して光は減衰し、光出射溝5´に入る。光出射溝5´に入った光は反射膜6´で反射して図示しない検出器に入る。
【0022】
なお、以上の説明では光入出射溝の反射面は平面であったが、反射面を放物面とすることにより、光の入射角を不問にすることができる。
【0023】
【発明の効果】
本発明によれば、検出が拡大溝で行われるので、光路長を長くとることができ、検出感度が上がる。また、泳動用溝の一部が拡大しているので、試料のバンド幅が拡大溝に出た途端狭くなり、ピークの幅も狭くなる。したがって、高感度だけでなく、高分離能を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の電気泳動チップの板状部材概略図
【図2】本発明の電気泳動チップの拡大溝4、光入出射溝5,5´の概略図
【図3】本発明の電気泳動チップに光が入射するときの説明図
【図4】従来のキャピラリ電気泳動チップの構成図。
【符号の説明】
1:板状部材 2:サンプル用溝2
3:泳動用溝 4:拡大溝
5、5´:光入出射溝 6、6´:反射膜
7、8、9、10:液溜
Claims (1)
- 一対の板状部材を備え、少なくとも一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成され、他方の板状部材には該溝に略対応する位置に貫通孔が設けられ、これら板状部材が溝を内側にして張り合わされて成るキャピラリー電気泳動チップにおいて、前記溝終端近傍の内径を終端近傍以外の溝内径より大きくするとともに、拡大溝の両端に、平面若しくは放物面の反射面を有する光入出射溝を設けたことを特徴とするキャピラリー電気泳動チップ。
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