JP3861949B2 - クロマノール配糖体およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマノール配糖体およびその製造方法に関するものである。詳しくは、本発明は、抗酸化活性及び放射線防護作用に優れたクロマノール配糖体および糖転移作用を触媒する酵素の存在下で２−置換アルコールに糖を結合させることによる上記クロマノール配糖体の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
下記一般式で表わされるクロマノール配糖体は、特開平０７−１１８，２８７号において、優れた抗酸化活性、熱やｐＨ安定性及び水溶性を有する下記一般式で表わされるクロマン環から誘導される化合物であることが報告されている。
【０００３】
【化４】
【０００４】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）
しかしながら、上記公報では、上記一般式で表わされるクロマノール配糖体は確かに抗酸化活性、熱やｐＨ安定性及び水溶性を有することが記載されているものの、実際には、一部のクロマノール配糖体［２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール、２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール、２−（α−Ｄ−マルトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール及び２−（α−Ｄ−マルトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール］、すなわち、クロマン環にメチルあるいはエチル基を介して糖残基としてα−グルコース残基が結合した物質（以下、「α−グルコピラノシル型クロマノール配糖体」と称する）についてのみ上記したような特性が報告されているのみである。
【０００５】
したがって、クロマン環に糖残基としてα−グルコース以外の糖残基が結合した物質については特開平０７−１１８，２８７号において十分開示されているとはいえない。
【０００６】
また、特開平０７−１１８，２８７号においては、リノール酸メチル、リポソームといったモデル系におけるα−グルコピラノシル型クロマノール配糖体の抗酸化活性が記載されているのみである。
【０００７】
クロマノール配糖体の生体への応用を考えた場合、クロマノール配糖体の糖の種類が変わることにより、例えば、その吸収、分布及び代謝などの、いわゆる薬物動態が大きく変わる可能性は非常に高い。したがって、細胞若しくは動物を用いた系により抗酸化活性を評価する場合には、特開平０７−１１８，２８７号にに記載されたモデル系では明らかにできないような活性の違いが現れる可能性が高く、その違いは非常に重要な意味を持つものであるといえる。
【０００８】
一方、原子力発電における作業者、Ｘ線によるレントゲン検査技師または放射線を用いた癌などの診断若しくは治療に携わる技術者や医学者は、作業時には放射線の被爆をある程度防止している。しかしながら、この方法による放射線防護は完全とはいえず、上記したような作業に長期間従事していると全体としてはかなりの量の放射線を被爆する場合もある。また、原子力発電所の事故などの最悪の場合では、放射線を全身に一度に被爆してしまうため、被爆した人が死亡したりあるいは死亡しないまでも一定の潜伏期間後に生殖機能、骨髄機能障害や皮膚障害等の臓器・組織レベル及び細胞レベルでの放射線障害が発現する。
【０００９】
このような諸問題を考慮して、現在、放射線管理（防護）を実施するにあたっては、法令や放射線の事業所内における障害予防規定などによって個人の被爆を規制している。しかしながら、このような放射線防護基準をもってしても放射線被爆による障害を完全に防止できるわけではない。また、放射線を被爆しても人体は痛みなどを知覚せず、また上記したような症状が現れるまでには一定の潜伏期間があるため、症状が現れて初めて被爆したことを知るが、現在の医療ではこのような症状を根治することはかなり困難である。
【００１０】
また、放射線治療を受ける癌患者に関しても、一度にかなりの量の放射線が治療すべき悪性腫瘍部分に照射されるが、悪性腫瘍部周辺の正常な組織にも放射線が照射される。被爆した正常組織は、放射線によって生体内に発生したフリーラジカルにより細胞膜や染色体などの細胞内分子の酸化的な化学反応が起こって、細胞増殖の停止（細胞死）や突然変異の誘発等の重大な障害が引き起こされる。
【００１１】
このような化学反応の発生を防止する薬剤として、従来、水素ラジカル供与性を有するβ−メルカプトエチルアミンなどの数多くの各種アミノチオール類が知られている（菅原努ほか、「放射線と医学」、共立出版社、１９８６年）が、その強い副作用のため、有効な防護効果が発現するために必要とされる量を投与できず、いまだ実用化には至っていない。
【００１２】
また、代表的なビタミンＥとして知られているα−トコフェロールは、クロマン環の６位の水酸基から水素原子を供与してフリーラジカルを消去する機能を有する化合物であるが、ビタミンＥは、その分子内に長鎖の炭化水素基（フィチル基）を有するために、水に溶けない粘稠性の油状物である。このため、生体のフリーラジカルによる損傷を防ぐ目的でビタミンＥを投与する場合には、内服液や注射剤などの溶液の形態での使用はできないという致命的な欠点がある。このような欠点を克服するために、２位のフィチル基をカルボキシル基で置換することにより水溶性が付与された６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸が開発され、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）という名称で水溶性の抗酸化剤として市販されているが、その水溶性は極めて低く（１６ｍｇ／１００ｍｌ）、いまだ満足できるものではない。また、同様にして、２位のフィチル基をアルコールで置換した６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メタノール（以下、「メタノール型２−置換アルコール」と称する）も開発された。このメタノール型２−置換アルコールは、１０１ｍｇ／１００ｍｌの水溶性を有し、トロロックスの約６．３倍の水溶性を示すが、このような比較的高い水溶性をもってしても、例えば、患者に１ｇを投与するためには、１リットルという多量の水に溶解して用いなければならず、水溶性がなお不十分であるという問題があった。
【００１３】
したがって、現代および将来を通じて人類は様々な分野で放射線を被爆する可能性が大きく、このため放射線被爆から人類を守る機能を有しかつ水溶性である放射線防護剤の開発が切望されているが、いまだ満足できる放射線防護剤が開発されていないのが現状である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、優れた抗酸化活性及び放射線防護作用を有するクロマノール配糖体およびその製造方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記諸事情を鑑みて、様々な糖残基がクロマン環に結合した各種クロマノール配糖体について抗酸化活性及び放射線防護作用等の特性を検討した結果、β−グルコース、フルクトース、及びマンノースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基がクロマン環に結合したクロマノール配糖体はα−グルコース残基またはそのオリゴ糖残基がクロマン環に結合したクロマノール配糖体に比べて上記特性に優れていることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、上記目的は、下記一般式（１）：
【００１７】
【化５】
【００１８】
（ただし、式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ５は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、及びマンノースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）で表わされるクロマノール配糖体により達成される。
【００１９】
上記目的は、一般式（２）：
【００２０】
【化６】
【００２１】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、およびｎは０〜４の整数である）で表わされる２−置換アルコールと、セロビオース、カードラン、ラミナラン、メリビオース、ラフィノース、ラクトース、アラビノガラクタン、ショ糖、イヌリン及びメチルマンノピラノシドからなる群より選ばれた糖とを、相当する糖転移作用を触媒する酵素の存在下に反応させることを特徴とする一般式（１）：
【００２２】
【化７】
【００２３】
（但し、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びｎは前記定義のとおりであり、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、及びマンノースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、およびｍは１〜６の整数である）で表わされるクロマノール配糖体の製造方法によっても達成される。
【００２４】
本発明はまた、該糖がセロビオース、ラクトース、ショ糖またはメチルマンノピラノシドである、前記クロマノール配糖体の製造方法である。
【００２５】
本発明はまた、該酵素がβ−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼまたはβ−フルクトフラノシダーゼである、前記クロマノール配糖体の製造方法である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明のクロマノール配糖体は下記一般式（１）で表わされる化合物である。
【００２８】
【化８】
【００２９】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、マンノース及びガラクトースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）
上記一般式（１）において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は、同一または異なる水素原子または低級アルキル基であるが、低級アルキル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の低級アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、及びオクチル基等が挙げられ、これらのうち、メチル基及びエチル基が好ましい。また、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、マンノース及びガラクトースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わすが、この際、糖残基中の水酸基の水素原子は低級アルキル基、好ましくは炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または低級アシル基、好ましくは炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されていてもよい。さらに、ｎは、０〜６、好ましくは１〜４の整数であり、ｍは、１〜６、好ましくは１〜３の整数である。
【００３０】
本発明のクロマノール配糖体は、上記一般式（１）で表わされる化合物であれば特に制限されないが、具体的には、下記のクロマノール配糖体が挙げられる：２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；および
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール。
【００３１】
本発明のクロマノール配糖体は、下記一般式（２）：
【００３２】
【化９】
【００３３】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 ，Ｒ5 及びｎは式（１）と同様である）で表わされる２−置換アルコール及びセロビオース、カードラン、ラミナラン、メリビオース、ラフィノース、ラクトース、アラビノガラクタン、ショ糖、イヌリン及びメチルマンノピラノシドからなる群より選ばれた糖を相当する糖転移作用を触媒する酵素の存在下に反応させ、２−置換アルコールの２位の水酸基に特異的に糖の特定の水酸基を結合させることからなる酵素反応によって製造される（特開平７−１１８，２８７号公報参照）。
【００３４】
上記反応において原料として用いられる一般式（２）で表わされる２−置換アルコール（以下、単に「２−置換アルコール」と称する）は公知の物質であり、例えば、特公平１−４３７５５号公報や特公平１−４９１３５号公報等に開示された方法により得ることができる。また、例えば、一般式（２）中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、ｎが１である２−置換アルコールはトロロックスを水素化リチウムアルミニウムの存在下においてジエチルエーテル中で加熱還流処理することなどにより容易に得ることができる。
【００３５】
本発明において使用される糖は、当然、目的とするクロマノール配糖体の種類によって決まり、セロビオース、カードラン、ラミナラン、メリビオース、ラフィノース、ラクトース、アラビノガラクタン、ショ糖、イヌリン及びメチルマンノピラノシドからなる群より選ばれるが、好ましくは、セロビオース、ラクトース、ショ糖及びメチルマンノピラノシドが挙げられる。
【００３６】
本発明において、２−置換アルコールの濃度は、反応液中において飽和濃度若しくはそれに近い濃度にすることが望ましい。また、糖の濃度は、全原料に対して、５〜７５（ｗ／ｖ）％、好ましくは１０〜６５（ｗ／ｖ）％である。
【００３７】
本発明において使用される糖転移作用を触媒する酵素（以下、単に「酵素」とも称する）は、反応に用いる糖の種類によって使い分けることが好ましく、その代表例を以下に挙げる。
【００３８】
（１）２−置換アルコールにβ結合でグルコース残基を結合させる場合
（ａ）セロビオース、カードラン、ラミナランなどのβ結合よりなるオリゴ糖に対してはβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２１）、例えば、オリエンタル酵母工業株式会社製のアーモンド由来のβ−グルコシダーゼを作用させることが望ましい。
【００３９】
（ｂ）リン酸存在下のセロビオースに対してはセロビオース ホスホリラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．２０）を作用させることが望ましい。
【００４０】
（２）２−置換アルコールにα結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）メリビオース、ラフィノースなどに対してはα−ガラクトシダーゼ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２２）を作用させることが望ましい。
【００４１】
（３）２−置換アルコールにβ結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）ラクトースなどに対してはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２３）、例えば、東洋紡績株式会社製のエシェリキア コリ(Escherichia coli)由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させることが望ましい。
【００４２】
（ｂ）アラビノガラクタンなどに対してはエンド−１，４−β−ガラクタナーゼ（Ｅｎｄｏ−１，４−β−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．８９）を作用させることが望ましい。
【００４３】
（４）２−置換アルコールにβ結合でフルクトース残基を結合させる場合
（ａ）ショ糖、ラフィノース、メリビオースなどに対してはレバンシュークラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．１０）を作用させることが望ましい。
【００４４】
（ｂ）ショ糖に対してはβ−フルクトフラノシダーゼ（β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２６）、例えば、和光純薬工業株式会社製のベーカーズ イースト由来のインベルターゼを作用させることが望ましい。
【００４５】
（ｃ）イヌリンなどに対してはイヌリンフルクトトランスフェラーゼ（ｉｎｕｌｉｎ ｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．９３）を作用させることが望ましい。
【００４６】
（５）２−置換アルコールにα結合でマンノース残基を結合させる場合
（ａ）メチルマンノピラノシドなどに対してはα−マンノシダーゼ（α−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２４）、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製のジャック ビーンズ（Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）由来のα−マンノシダーゼを作用させることが望ましい。
【００４７】
上記酵素のうち、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ及びβ−フルクトフラノシダーゼが本発明において好ましく使用される。
【００４８】
本発明において、糖転移作用を触媒する酵素の添加量は、使用する酵素、糖及び有機溶媒の種類および反応液の量によって異なる。
【００４９】
本発明によるクロマノール配糖体の製造において、２−置換アルコールを糖溶液に溶解させることが望ましいが、その際、有機溶媒を添加することが好ましい。本発明において使用できる有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、及びアセトニトリルなどが挙げられ、酵素の糖転移活性を高める点を考慮すると、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドやエタノールが好ましく使用される。有機溶媒の添加濃度は、１〜５０（ｖ／ｖ）％であり、反応効率を考えると５〜４０（ｖ／ｖ）％であることが好ましい。
【００５０】
本発明のクロマノール配糖体の製造における反応条件に関しては、ｐＨが５．０〜７．５、好ましくは５．５〜７．０であり、反応温度が２０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃であり、および反応時間が２〜４０時間、好ましくは１０〜３０時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量等により影響をうけることはいうまでもない。反応終了後、反応液をＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィーで処理することにより、目的とするクロマノール配糖体が高純度で得られる。また、一般式（１）におけるｍが３以上であるクロマノール配糖体が製造される場合には、製造されたｍが１から８位の混合物の形態を有するクロマノール配糖体を、ＨＰＬＣを用いた分取クロマトグラフィーなどで処理することにより、高純度のクロマノール配糖体が各ｍ毎に得ることができる。
【００５１】
このようにして得られたクロマノール配糖体は、一般的に、高い水溶性を有しかつ油溶性にも富むので、細胞膜近傍に局在化したり、また、細胞膜を透過し、さらに細胞内にも入ることができ、放射線照射によって細胞膜内や細胞内に生じたフリーラジカルを捕捉して、細胞膜の損傷及びＤＮＡの突然変異等を防ぐことができる。
【００５２】
【実施例】
次に実施例により本発明を説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことは言うまでもない。
【００５３】
参考例１：β−グルコシダーゼの活性測定
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌに２０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド水溶液０．５ｍｌを加え３７℃で５分間予備加温した後、酵素溶液０．５ｍｌを加え、同温度条件下において１５分間反応させた後、０．２Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 溶液２．０ｍｌを加え反応を停止させ、４００ｎｍの吸光度を測定した。なお、１Ｕは、上記条件において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量とした。
【００５４】
参考例２：β−ガラクトシダーゼの活性測定
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）２．５ｍｌ、３．３６Ｍメルカプトエタノール溶液０．１ｍｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液（ｐＨ７．３）０．１ｍｌ、３４ｍＭ ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液０．２ｍｌをキュベット（ｄ＝１．０ｃｍ）に入れ、３７℃に制御された分光光度計にセットした。５分間インキュベートした後、酵素溶液０．５ｍｌを加え、４１０ｎｍの吸光度変化を求めた。なお，１Ｕは、上記条件において１分間に１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノールを生成する酵素量とした。
【００５５】
参考例３：β−フルクトフラノシダーゼの活性測定
８０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で調製した５．０％ショ糖溶液１．０ｍｌを２０℃で５分間予備加温した後、酵素溶液１．０ｍｌを加え、同温度条件下において３分間反応させた後、生成した還元糖量をＦｅｈｌｉｎｇ−Ｌｅｈｒｍａｎ−Ｓｃｈｏｏｒｌ変法で測定した。なお、１Ｕは、上記条件において３分間に１．０ｍｇのグルコース相当還元糖を生成する酵素量とした。
【００５６】
参考例４：α−マンノシダーゼの活性測定
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに２０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド水溶液０．５ｍｌを加え２５℃で５分間予備加温した後、酵素溶液０．５ｍｌを加え、同温度条件下において１５分間反応させた後、０．２Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 溶液２．０ｍｌを加え反応を停止させ、４００ｎｍの吸光度を測定した。なお、１Ｕは、上記条件において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量とした。
【００５７】
参考例５：α−グルコシダーゼ（α-glucosidase, EC 3.2.1.20)の活性測定
４（ｗ／ｖ）％マルトース水溶液１００μｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液４０μｌを加え、同温度条件下において２０分間反応させた後５分間の煮沸処理により反応を停止させた。次に、上記反応によるグルコースの生成量をグルコース測定キット（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１μｍｏｌのマルトースの加水分解を触媒する酵素量とした。
【００５８】
実施例１
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で調製した３０（ｗ／ｖ）％セロビオース１１００ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した５％（ｗ／ｖ）の下記一般式（３）で示される２−置換アルコール（メタノール型：上記一般式（２）においてＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、Ｒ5 がＨであり、ｎが１である）（以下、単に「メタノール型２−置換アルコール」と称する）溶液２２０ｍｌおよび５５００Ｕのオリエンタル酵母株式会社製のアーモンド由来のβ−グルコシダーゼを加え、５０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約５％であった。なお、この際、転移率は、２−置換アルコールの減少の割合として記載した（以下の実施例においても同様とする）。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））処理することで高純度のクロマノール配糖体である式（４）で示される２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(β-D-glucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)]を約５００ｍｇ得た。
【００５９】
【化１０】
【００６０】
【化１１】
【００６１】
このようにして得られた２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
【００６２】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００６３】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２０および１．２３（ｓ，３Ｈ）
１．６３から１．７５（ｍ，１Ｈ）
１．８６から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
２．９７から４．３９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．８
１１．９
１２．７
１９．７および１９．９
２２．１および２２．４
２８．０および２８．１
６１．０
７０．０
７３．３
７３．４
７３．９および７４．１
７６．７
７６．８
１０３．５および１０３．６
１１６．８
１２０．３
１２０．８
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００６４】
【外１】
【００６５】
実施例２
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した４０（ｗ／ｖ）％ラクトース８００ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した２．７５％（ｗ／ｖ）の上記一般式（２）においてＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、Ｒ5 がＨであり、ｎが２である２−置換アルコール（エタノール型）溶液１６０ｍｌおよび４０００Ｕの東洋紡績株式会社製のエシェリキア コリ由来のβ−ガラクトシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約３０％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））で処理後、メタノール及び酢酸エチルを用い結晶化することで高純度のクロマノール配糖体である式（５）で示される２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(β-D-galactopyranosyl)ethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)] を約１７００ｍｇ得た。
【００６６】
【化１２】
【００６７】
このようにして得られた２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
【００６８】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００６９】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２０（ｓ，３Ｈ）
１．７０から１．８６（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．２４から４．７３（ｍ，１３Ｈ）
７．３７（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．７
２０．１
２４．０および２４．１
３１．６
３８．０および３８．２
６０．３および６０．４
６４．４
６８．１
７０．５
７３．０
７３．４
７５．０
１０３．４および１０３．５
１１６．６
１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ４１２ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００７０】
【外２】
【００７１】
実施例３
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で調製した７０（ｗ／ｖ）％ショ糖１６００ｍｌに対し、エタノールで調製した５％（ｗ／ｖ）のメタノール型２−置換アルコール溶液３２０ｍｌおよび１００Ｕの和光純薬工業株式会社製のベーカーズイースト由来のインベルターゼを加え、５０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約４％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））処理することで高純度のクロマノール配糖体である式（６）で示される２−（β−Ｄ−フルクトフラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(β-D-fuructofuranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)]を約３００ｍｇ得た。
【００７２】
【化１３】
【００７３】
このようにして得られた２−（β−Ｄ−フルクトフラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図３に示す。
【００７４】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００７５】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．１７（ｓ，３Ｈ）
１．６４から１．７０（ｍ，１Ｈ）
１．８５から１．９０（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．００（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１５から５．１３（ｍ，１３Ｈ）
７．３６（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．８
１１．８
１２．７
１９．８
２２．４および２２．５
２８．２
６０．９
６２．７および６２．９
６５．８および６５．９
７４．０
７５．０および７５．２
７６．４および７６．５
８１．９および８２．１
１０３．７
１１７．０
１２０．３
１２０．７
１２２．５
１４４．４
１４５．１
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００７６】
【外３】
【００７７】
実施例４
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で調製した３０（ｗ／ｖ）％メチルマンノピラノシド４００ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した５％（ｗ／ｖ）のメタノール型２−置換アルコール溶液８０ｍｌおよび４００Ｕのシグマ社製のＪａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来のα−マンノシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約１２％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））処理することで高純度のクロマノール配糖体である式（７）で示される２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(α-D-mannopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)]を約５００ｍｇ得た。
【００７８】
【化１４】
【００７９】
このようにして得られた２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図４に示す。
【００８０】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００８１】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．１７および１．２１（ｓ，３Ｈ）
１．６５から１．７４（ｍ，１Ｈ）
１．７７から１．９１（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１６から４．６９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．８
１２．７
１９．７および１９．８
２１．９および２２．１
２８．２および２８．５
６１．０および６１．２
６６．７および６６．９
７０．２および７０．３
７１．０
７３．８
７３．９
７４．１
１００．１および１００．２
１１６．７
１２０．２および１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．１および１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００８２】
【外４】
【００８３】
比較例１
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％のメタノール型２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび４００Ｕの東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.)由来のα−グルコシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約４５％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノール溶液で溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，５：１，ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：式（８）で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(α-D-glucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol] を約３００ｍｇ得た。
【００８４】
【化１５】
【００８５】
このようにして得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図５に示す。
【００８６】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ，13Ｃ−ＮＭＲ，質量分析及び比旋光度の結果を示す。
【００８７】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比旋光度：
【００８８】
【外５】
【００８９】
実施例５：細胞膜酸化障害抑止効果の評価
実施例１から４及び比較例１で得られたクロマノール配糖体を０．４％Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ培地（以下、「ＤＭＥＭ培地」と略称する）中に最終濃度が０．５ｍＭになるように溶解し、クロマノール配糖体溶液を調製した。
【００９０】
ヒト肝芽腫細胞（以下、「ＨｅｐＧ２」と略称する）を６ウェルの細胞培養用マルチプレート（住友ベークライト製）で１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で継代培養し、コンフルエント(confluent) な状態になるまで増殖させた。このようにして培養されたＨｅｐＧ２の上清を除去し、１ウェル当たりＣａ及びＭｇを含まないリン酸緩衝塩類溶液（以下、「ＣＭＦ−ＰＢＳ」と略称する）１ｍｌで細胞を２回洗浄した。次に、上記クロマノール配糖体溶液を１ウェル当たり１．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で１８時間インキュベートした。さらに、上清を除去した後、ＣＭＦ−ＰＢＳ １ｍｌで１ウェル当たり細胞を２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地を１．５ｍｌ加えた。さらに、ＣＭＦ−ＰＢＳに溶かした１００ｍＭの２’，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（以下、「ＡＡＰＨ」と略称する）を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で４時間インキュベートした。そして、１ウェル当たりＣＭＦ−ＰＢＳ １ｍｌで細胞を２回洗浄後、８．１％ドデシル硫酸ナトリウム処理により細胞膜を可溶化し、遠心分離処理により、上清を分離した。上清中のタンパク質量はマックウェル法により測定し、脂質過酸化物質量はチオバルビツール酸（以下、「ＴＢＡ」と略称する）反応により求めた。また、タンパク質１ｍｇ当たりのＴＢＡ反応物（以下、「ＴＢＡＲＳ」と略称する）の量（ｎｍｏｌ／ｍｇ・タンパク質）を求めた。この際、上記クロマノール配糖体の濃度を０ｍＭとした以外は上記反応を同様に繰り返して得られた比較対照のＴＢＡＲＳの量（ｎｍｏｌ／ｍｇ・タンパク質）を基準として下記式より細胞膜酸化障害抑制率を計算した。結果を表１に示す。本実施例において、上記細胞は１群４〜５連で実験を行い、結果はこれらの平均値として表わした。
【００９１】
【数１】
【００９２】
【表１】
【００９３】
表１から、実施例１から４で得られた式（４）から（７）で示されるクロマノール配糖体、特に、実施例３及び４で得られた式（６）及び（７）で示されるクロマノール配糖体は、比較例１で得られた式（８）で示されるクロマノール配糖体に比べて、同等またはそれ以下の細胞膜酸化障害抑制率を示すことが分かる。これより、本発明によるクロマノール配糖体は、式（８）で示されるクロマノール配糖体に比べて、有意に優れた抗酸化活性を有することが示される。
【００９４】
実施例６：放射線防護作用の評価
実施例１から４及び比較例１で得られたクロマノール配糖体をＲＰＭＩ−１６４０＋１０％牛胎仔血清＋ＨＥＤＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）系培養液（以下、「完全培養液」と略称する）中に最終濃度が１ｍＭになるように溶解し、クロマノール配糖体溶液を予め調製した。
【００９５】
次に、マウスのＴリンパ腫株ＥＬ−４細胞を完全培養液中で３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で継代培養し、細胞密度が２×１０5 個／ｍｌになるように調整した。このようにして培養されたＥＬ−４細胞培養液の上清を除去し、上記クロマノール配糖体溶液をそれぞれ等量加え、Ｘ線を照射するまでの３０分間、上記と同様の条件下で細胞培養を行った。クロマノール配糖体を含む培養液中で所定時間培養した後、３Ｇｙの放射線を０．９２Ｇｙ／分の線量率で照射した。放射線照射終了直後、細胞を遠心沈降（４００ｇ×５分）させ、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、完全培養液で再浮遊させて培養した。これに、サイトカラシンＢのＤＭＳＯ溶液（２ｍｇ／ｍｌ濃度）を最終濃度が３μｇ／ｍｌになるように添加し、２０時間培養後に２核細胞中の小核保有細胞の頻度（小核誘発頻度）を測定し、細胞の放射線損傷の頻度を表わす尺度とした。また、各放射線照射細胞について、上記クロマノール配糖体溶液の濃度を０ｍＭとした以外は上記操作を同様に繰り返して得られた比較対照の小核誘発頻度を基準として下記式より小核誘発抑制率を計算した。この際、上記細胞は１群４〜５連で放射線照射実験を行い、結果はこれらの平均値として表わした。結果を表２に示す。
【００９６】
【数２】
【００９７】
【表２】
【００９８】
表２より、小核誘発頻度は、実施例１から４で得られた本発明によるクロマノール配糖体は、比較例１で得られた値に比べて有意に小さく、これより、本発明によるクロマノール配糖体は放射線被爆による細胞の損傷を有効に抑制することが示された。
【００９９】
【発明の効果】
上述したように、本発明の一般式（１）で表わされるクロマノール配糖体は、抗酸化活性及び放射線防護作用等の様々な特性に優れている。
【０１００】
したがって、本発明のクロマノール配糖体は、抗酸化剤として有用であり、化粧品、衣料品、食品及び化成品など様々な分野における原料として有効に利用できる。
【０１０１】
また、上記利点に加えて、本発明のクロマノール配糖体は、その高い放射線防護効果により、放射線被爆による障害を有効に防止する放射線防護剤において使用でき、さらにこのような用途に使用する際には、その高い水溶性により、錠剤や散剤等の固形製剤の形態のみならず、注射用等の液状の製剤の形態でも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例１における赤外線吸収スペクトルである。
【図２】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例２における赤外線吸収スペクトルである。
【図３】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例３における赤外線吸収スペクトルである。
【図４】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例４における赤外線吸収スペクトルである。
【図５】は、本発明によるクロマノール配糖体の比較例１における赤外線吸収スペクトルである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、クロマノール配糖体およびその製造方法に関するものである。詳しくは、本発明は、抗酸化活性及び放射線防護作用に優れたクロマノール配糖体および糖転移作用を触媒する酵素の存在下で２−置換アルコールに糖を結合させることによる上記クロマノール配糖体の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
下記一般式で表わされるクロマノール配糖体は、特開平０７−１１８，２８７号において、優れた抗酸化活性、熱やｐＨ安定性及び水溶性を有する下記一般式で表わされるクロマン環から誘導される化合物であることが報告されている。
【０００３】
【化４】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）
しかしながら、上記公報では、上記一般式で表わされるクロマノール配糖体は確かに抗酸化活性、熱やｐＨ安定性及び水溶性を有することが記載されているものの、実際には、一部のクロマノール配糖体［２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール、２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール、２−（α−Ｄ−マルトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール及び２−（α−Ｄ−マルトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール］、すなわち、クロマン環にメチルあるいはエチル基を介して糖残基としてα−グルコース残基が結合した物質（以下、「α−グルコピラノシル型クロマノール配糖体」と称する）についてのみ上記したような特性が報告されているのみである。
【０００５】
したがって、クロマン環に糖残基としてα−グルコース以外の糖残基が結合した物質については特開平０７−１１８，２８７号において十分開示されているとはいえない。
【０００６】
また、特開平０７−１１８，２８７号においては、リノール酸メチル、リポソームといったモデル系におけるα−グルコピラノシル型クロマノール配糖体の抗酸化活性が記載されているのみである。
【０００７】
クロマノール配糖体の生体への応用を考えた場合、クロマノール配糖体の糖の種類が変わることにより、例えば、その吸収、分布及び代謝などの、いわゆる薬物動態が大きく変わる可能性は非常に高い。したがって、細胞若しくは動物を用いた系により抗酸化活性を評価する場合には、特開平０７−１１８，２８７号にに記載されたモデル系では明らかにできないような活性の違いが現れる可能性が高く、その違いは非常に重要な意味を持つものであるといえる。
【０００８】
一方、原子力発電における作業者、Ｘ線によるレントゲン検査技師または放射線を用いた癌などの診断若しくは治療に携わる技術者や医学者は、作業時には放射線の被爆をある程度防止している。しかしながら、この方法による放射線防護は完全とはいえず、上記したような作業に長期間従事していると全体としてはかなりの量の放射線を被爆する場合もある。また、原子力発電所の事故などの最悪の場合では、放射線を全身に一度に被爆してしまうため、被爆した人が死亡したりあるいは死亡しないまでも一定の潜伏期間後に生殖機能、骨髄機能障害や皮膚障害等の臓器・組織レベル及び細胞レベルでの放射線障害が発現する。
【０００９】
このような諸問題を考慮して、現在、放射線管理（防護）を実施するにあたっては、法令や放射線の事業所内における障害予防規定などによって個人の被爆を規制している。しかしながら、このような放射線防護基準をもってしても放射線被爆による障害を完全に防止できるわけではない。また、放射線を被爆しても人体は痛みなどを知覚せず、また上記したような症状が現れるまでには一定の潜伏期間があるため、症状が現れて初めて被爆したことを知るが、現在の医療ではこのような症状を根治することはかなり困難である。
【００１０】
また、放射線治療を受ける癌患者に関しても、一度にかなりの量の放射線が治療すべき悪性腫瘍部分に照射されるが、悪性腫瘍部周辺の正常な組織にも放射線が照射される。被爆した正常組織は、放射線によって生体内に発生したフリーラジカルにより細胞膜や染色体などの細胞内分子の酸化的な化学反応が起こって、細胞増殖の停止（細胞死）や突然変異の誘発等の重大な障害が引き起こされる。
【００１１】
このような化学反応の発生を防止する薬剤として、従来、水素ラジカル供与性を有するβ−メルカプトエチルアミンなどの数多くの各種アミノチオール類が知られている（菅原努ほか、「放射線と医学」、共立出版社、１９８６年）が、その強い副作用のため、有効な防護効果が発現するために必要とされる量を投与できず、いまだ実用化には至っていない。
【００１２】
また、代表的なビタミンＥとして知られているα−トコフェロールは、クロマン環の６位の水酸基から水素原子を供与してフリーラジカルを消去する機能を有する化合物であるが、ビタミンＥは、その分子内に長鎖の炭化水素基（フィチル基）を有するために、水に溶けない粘稠性の油状物である。このため、生体のフリーラジカルによる損傷を防ぐ目的でビタミンＥを投与する場合には、内服液や注射剤などの溶液の形態での使用はできないという致命的な欠点がある。このような欠点を克服するために、２位のフィチル基をカルボキシル基で置換することにより水溶性が付与された６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸が開発され、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）という名称で水溶性の抗酸化剤として市販されているが、その水溶性は極めて低く（１６ｍｇ／１００ｍｌ）、いまだ満足できるものではない。また、同様にして、２位のフィチル基をアルコールで置換した６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−メタノール（以下、「メタノール型２−置換アルコール」と称する）も開発された。このメタノール型２−置換アルコールは、１０１ｍｇ／１００ｍｌの水溶性を有し、トロロックスの約６．３倍の水溶性を示すが、このような比較的高い水溶性をもってしても、例えば、患者に１ｇを投与するためには、１リットルという多量の水に溶解して用いなければならず、水溶性がなお不十分であるという問題があった。
【００１３】
したがって、現代および将来を通じて人類は様々な分野で放射線を被爆する可能性が大きく、このため放射線被爆から人類を守る機能を有しかつ水溶性である放射線防護剤の開発が切望されているが、いまだ満足できる放射線防護剤が開発されていないのが現状である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、優れた抗酸化活性及び放射線防護作用を有するクロマノール配糖体およびその製造方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記諸事情を鑑みて、様々な糖残基がクロマン環に結合した各種クロマノール配糖体について抗酸化活性及び放射線防護作用等の特性を検討した結果、β−グルコース、フルクトース、及びマンノースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基がクロマン環に結合したクロマノール配糖体はα−グルコース残基またはそのオリゴ糖残基がクロマン環に結合したクロマノール配糖体に比べて上記特性に優れていることを発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、上記目的は、下記一般式（１）：
【００１７】
【化５】
（ただし、式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ５は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、及びマンノースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）で表わされるクロマノール配糖体により達成される。
【００１９】
上記目的は、一般式（２）：
【００２０】
【化６】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、およびｎは０〜４の整数である）で表わされる２−置換アルコールと、セロビオース、カードラン、ラミナラン、メリビオース、ラフィノース、ラクトース、アラビノガラクタン、ショ糖、イヌリン及びメチルマンノピラノシドからなる群より選ばれた糖とを、相当する糖転移作用を触媒する酵素の存在下に反応させることを特徴とする一般式（１）：
【００２２】
【化７】
（但し、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びｎは前記定義のとおりであり、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、及びマンノースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、およびｍは１〜６の整数である）で表わされるクロマノール配糖体の製造方法によっても達成される。
【００２４】
本発明はまた、該糖がセロビオース、ラクトース、ショ糖またはメチルマンノピラノシドである、前記クロマノール配糖体の製造方法である。
【００２５】
本発明はまた、該酵素がβ−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼまたはβ−フルクトフラノシダーゼである、前記クロマノール配糖体の製造方法である。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明のクロマノール配糖体は下記一般式（１）で表わされる化合物である。
【００２８】
【化８】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、マンノース及びガラクトースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）
上記一般式（１）において、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 は、同一または異なる水素原子または低級アルキル基であるが、低級アルキル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の低級アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、及びオクチル基等が挙げられ、これらのうち、メチル基及びエチル基が好ましい。また、Ｘはβ−グルコース、フルクトース、マンノース及びガラクトースからなる群より選ばれた単糖残基またはオリゴ糖残基を表わすが、この際、糖残基中の水酸基の水素原子は低級アルキル基、好ましくは炭素原子数が１〜８の低級アルキル基または低級アシル基、好ましくは炭素原子数が１〜１０の低級アシル基で置換されていてもよい。さらに、ｎは、０〜６、好ましくは１〜４の整数であり、ｍは、１〜６、好ましくは１〜３の整数である。
【００３０】
本発明のクロマノール配糖体は、上記一般式（１）で表わされる化合物であれば特に制限されないが、具体的には、下記のクロマノール配糖体が挙げられる：２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−ガラクトピラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−マンノピラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）プロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）イソプロピル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）イソブチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）イソペンチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ヘキシル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）ヘプチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール；および
２−（（αまたはβ）−Ｄ−フルクトフラノシル）オクチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール。
【００３１】
本発明のクロマノール配糖体は、下記一般式（２）：
【００３２】
【化９】
（ただし、式中、Ｒ1 ，Ｒ2 ，Ｒ3 ，Ｒ4 ，Ｒ5 及びｎは式（１）と同様である）で表わされる２−置換アルコール及びセロビオース、カードラン、ラミナラン、メリビオース、ラフィノース、ラクトース、アラビノガラクタン、ショ糖、イヌリン及びメチルマンノピラノシドからなる群より選ばれた糖を相当する糖転移作用を触媒する酵素の存在下に反応させ、２−置換アルコールの２位の水酸基に特異的に糖の特定の水酸基を結合させることからなる酵素反応によって製造される（特開平７−１１８，２８７号公報参照）。
【００３４】
上記反応において原料として用いられる一般式（２）で表わされる２−置換アルコール（以下、単に「２−置換アルコール」と称する）は公知の物質であり、例えば、特公平１−４３７５５号公報や特公平１−４９１３５号公報等に開示された方法により得ることができる。また、例えば、一般式（２）中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、ｎが１である２−置換アルコールはトロロックスを水素化リチウムアルミニウムの存在下においてジエチルエーテル中で加熱還流処理することなどにより容易に得ることができる。
【００３５】
本発明において使用される糖は、当然、目的とするクロマノール配糖体の種類によって決まり、セロビオース、カードラン、ラミナラン、メリビオース、ラフィノース、ラクトース、アラビノガラクタン、ショ糖、イヌリン及びメチルマンノピラノシドからなる群より選ばれるが、好ましくは、セロビオース、ラクトース、ショ糖及びメチルマンノピラノシドが挙げられる。
【００３６】
本発明において、２−置換アルコールの濃度は、反応液中において飽和濃度若しくはそれに近い濃度にすることが望ましい。また、糖の濃度は、全原料に対して、５〜７５（ｗ／ｖ）％、好ましくは１０〜６５（ｗ／ｖ）％である。
【００３７】
本発明において使用される糖転移作用を触媒する酵素（以下、単に「酵素」とも称する）は、反応に用いる糖の種類によって使い分けることが好ましく、その代表例を以下に挙げる。
【００３８】
（１）２−置換アルコールにβ結合でグルコース残基を結合させる場合
（ａ）セロビオース、カードラン、ラミナランなどのβ結合よりなるオリゴ糖に対してはβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２１）、例えば、オリエンタル酵母工業株式会社製のアーモンド由来のβ−グルコシダーゼを作用させることが望ましい。
【００３９】
（ｂ）リン酸存在下のセロビオースに対してはセロビオース ホスホリラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．２０）を作用させることが望ましい。
【００４０】
（２）２−置換アルコールにα結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）メリビオース、ラフィノースなどに対してはα−ガラクトシダーゼ（α−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２２）を作用させることが望ましい。
【００４１】
（３）２−置換アルコールにβ結合でガラクトース残基を結合させる場合
（ａ）ラクトースなどに対してはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２３）、例えば、東洋紡績株式会社製のエシェリキア コリ(Escherichia coli)由来のβ−ガラクトシダーゼを作用させることが望ましい。
【００４２】
（ｂ）アラビノガラクタンなどに対してはエンド−１，４−β−ガラクタナーゼ（Ｅｎｄｏ−１，４−β−ｇａｌａｃｔａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．８９）を作用させることが望ましい。
【００４３】
（４）２−置換アルコールにβ結合でフルクトース残基を結合させる場合
（ａ）ショ糖、ラフィノース、メリビオースなどに対してはレバンシュークラーゼ（ｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．１０）を作用させることが望ましい。
【００４４】
（ｂ）ショ糖に対してはβ−フルクトフラノシダーゼ（β−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２６）、例えば、和光純薬工業株式会社製のベーカーズ イースト由来のインベルターゼを作用させることが望ましい。
【００４５】
（ｃ）イヌリンなどに対してはイヌリンフルクトトランスフェラーゼ（ｉｎｕｌｉｎ ｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＥＣ ２．４．１．９３）を作用させることが望ましい。
【００４６】
（５）２−置換アルコールにα結合でマンノース残基を結合させる場合
（ａ）メチルマンノピラノシドなどに対してはα−マンノシダーゼ（α−ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２４）、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製のジャック ビーンズ（Ｊａｃｋ Ｂｅａｎｓ）由来のα−マンノシダーゼを作用させることが望ましい。
【００４７】
上記酵素のうち、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ及びβ−フルクトフラノシダーゼが本発明において好ましく使用される。
【００４８】
本発明において、糖転移作用を触媒する酵素の添加量は、使用する酵素、糖及び有機溶媒の種類および反応液の量によって異なる。
【００４９】
本発明によるクロマノール配糖体の製造において、２−置換アルコールを糖溶液に溶解させることが望ましいが、その際、有機溶媒を添加することが好ましい。本発明において使用できる有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、アセトン、及びアセトニトリルなどが挙げられ、酵素の糖転移活性を高める点を考慮すると、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドやエタノールが好ましく使用される。有機溶媒の添加濃度は、１〜５０（ｖ／ｖ）％であり、反応効率を考えると５〜４０（ｖ／ｖ）％であることが好ましい。
【００５０】
本発明のクロマノール配糖体の製造における反応条件に関しては、ｐＨが５．０〜７．５、好ましくは５．５〜７．０であり、反応温度が２０〜６０℃、好ましくは３０〜５０℃であり、および反応時間が２〜４０時間、好ましくは１０〜３０時間である。但し、これらの条件は使用する酵素量等により影響をうけることはいうまでもない。反応終了後、反応液をＸＡＤ（オルガノ株式会社）を担体として用いたカラムクロマトグラフィーで処理することにより、目的とするクロマノール配糖体が高純度で得られる。また、一般式（１）におけるｍが３以上であるクロマノール配糖体が製造される場合には、製造されたｍが１から８位の混合物の形態を有するクロマノール配糖体を、ＨＰＬＣを用いた分取クロマトグラフィーなどで処理することにより、高純度のクロマノール配糖体が各ｍ毎に得ることができる。
【００５１】
このようにして得られたクロマノール配糖体は、一般的に、高い水溶性を有しかつ油溶性にも富むので、細胞膜近傍に局在化したり、また、細胞膜を透過し、さらに細胞内にも入ることができ、放射線照射によって細胞膜内や細胞内に生じたフリーラジカルを捕捉して、細胞膜の損傷及びＤＮＡの突然変異等を防ぐことができる。
【００５２】
【実施例】
次に実施例により本発明を説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことは言うまでもない。
【００５３】
参考例１：β−グルコシダーゼの活性測定
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍｌに２０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド水溶液０．５ｍｌを加え３７℃で５分間予備加温した後、酵素溶液０．５ｍｌを加え、同温度条件下において１５分間反応させた後、０．２Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 溶液２．０ｍｌを加え反応を停止させ、４００ｎｍの吸光度を測定した。なお、１Ｕは、上記条件において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量とした。
【００５４】
参考例２：β−ガラクトシダーゼの活性測定
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）２．５ｍｌ、３．３６Ｍメルカプトエタノール溶液０．１ｍｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液（ｐＨ７．３）０．１ｍｌ、３４ｍＭ ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド溶液０．２ｍｌをキュベット（ｄ＝１．０ｃｍ）に入れ、３７℃に制御された分光光度計にセットした。５分間インキュベートした後、酵素溶液０．５ｍｌを加え、４１０ｎｍの吸光度変化を求めた。なお，１Ｕは、上記条件において１分間に１μｍｏｌのｏ−ニトロフェノールを生成する酵素量とした。
【００５５】
参考例３：β−フルクトフラノシダーゼの活性測定
８０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で調製した５．０％ショ糖溶液１．０ｍｌを２０℃で５分間予備加温した後、酵素溶液１．０ｍｌを加え、同温度条件下において３分間反応させた後、生成した還元糖量をＦｅｈｌｉｎｇ−Ｌｅｈｒｍａｎ−Ｓｃｈｏｏｒｌ変法で測定した。なお、１Ｕは、上記条件において３分間に１．０ｍｇのグルコース相当還元糖を生成する酵素量とした。
【００５６】
参考例４：α−マンノシダーゼの活性測定
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに２０ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド水溶液０．５ｍｌを加え２５℃で５分間予備加温した後、酵素溶液０．５ｍｌを加え、同温度条件下において１５分間反応させた後、０．２Ｍ Ｎａ2 ＣＯ3 溶液２．０ｍｌを加え反応を停止させ、４００ｎｍの吸光度を測定した。なお、１Ｕは、上記条件において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量とした。
【００５７】
参考例５：α−グルコシダーゼ（α-glucosidase, EC 3.2.1.20)の活性測定
４（ｗ／ｖ）％マルトース水溶液１００μｌに１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）３００μｌを加え、３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液４０μｌを加え、同温度条件下において２０分間反応させた後５分間の煮沸処理により反応を停止させた。次に、上記反応によるグルコースの生成量をグルコース測定キット（和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。なお、１Ｕは上記条件において１分間に１μｍｏｌのマルトースの加水分解を触媒する酵素量とした。
【００５８】
実施例１
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で調製した３０（ｗ／ｖ）％セロビオース１１００ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した５％（ｗ／ｖ）の下記一般式（３）で示される２−置換アルコール（メタノール型：上記一般式（２）においてＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、Ｒ5 がＨであり、ｎが１である）（以下、単に「メタノール型２−置換アルコール」と称する）溶液２２０ｍｌおよび５５００Ｕのオリエンタル酵母株式会社製のアーモンド由来のβ−グルコシダーゼを加え、５０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約５％であった。なお、この際、転移率は、２−置換アルコールの減少の割合として記載した（以下の実施例においても同様とする）。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））処理することで高純度のクロマノール配糖体である式（４）で示される２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(β-D-glucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)]を約５００ｍｇ得た。
【００５９】
【化１０】
【化１１】
このようにして得られた２−（β−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
【００６２】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００６３】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２０および１．２３（ｓ，３Ｈ）
１．６３から１．７５（ｍ，１Ｈ）
１．８６から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
２．９７から４．３９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．８
１１．９
１２．７
１９．７および１９．９
２２．１および２２．４
２８．０および２８．１
６１．０
７０．０
７３．３
７３．４
７３．９および７４．１
７６．７
７６．８
１０３．５および１０３．６
１１６．８
１２０．３
１２０．８
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００６４】
【外１】
実施例２
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で調製した４０（ｗ／ｖ）％ラクトース８００ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した２．７５％（ｗ／ｖ）の上記一般式（２）においてＲ1 、Ｒ2 、Ｒ3 及びＲ4 がＣＨ3 であり、Ｒ5 がＨであり、ｎが２である２−置換アルコール（エタノール型）溶液１６０ｍｌおよび４０００Ｕの東洋紡績株式会社製のエシェリキア コリ由来のβ−ガラクトシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約３０％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））で処理後、メタノール及び酢酸エチルを用い結晶化することで高純度のクロマノール配糖体である式（５）で示される２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(β-D-galactopyranosyl)ethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)] を約１７００ｍｇ得た。
【００６６】
【化１２】
このようにして得られた２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）エチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
【００６８】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００６９】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２０（ｓ，３Ｈ）
１．７０から１．８６（ｍ，４Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．２４から４．７３（ｍ，１３Ｈ）
７．３７（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．７
２０．１
２４．０および２４．１
３１．６
３８．０および３８．２
６０．３および６０．４
６４．４
６８．１
７０．５
７３．０
７３．４
７５．０
１０３．４および１０３．５
１１６．６
１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ４１２ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００７０】
【外２】
実施例３
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で調製した７０（ｗ／ｖ）％ショ糖１６００ｍｌに対し、エタノールで調製した５％（ｗ／ｖ）のメタノール型２−置換アルコール溶液３２０ｍｌおよび１００Ｕの和光純薬工業株式会社製のベーカーズイースト由来のインベルターゼを加え、５０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約４％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））処理することで高純度のクロマノール配糖体である式（６）で示される２−（β−Ｄ−フルクトフラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(β-D-fuructofuranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)]を約３００ｍｇ得た。
【００７２】
【化１３】
このようにして得られた２−（β−Ｄ−フルクトフラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図３に示す。
【００７４】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００７５】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．１７（ｓ，３Ｈ）
１．６４から１．７０（ｍ，１Ｈ）
１．８５から１．９０（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．００（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１５から５．１３（ｍ，１３Ｈ）
７．３６（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．８
１１．８
１２．７
１９．８
２２．４および２２．５
２８．２
６０．９
６２．７および６２．９
６５．８および６５．９
７４．０
７５．０および７５．２
７６．４および７６．５
８１．９および８２．１
１０３．７
１１７．０
１２０．３
１２０．７
１２２．５
１４４．４
１４５．１
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００７６】
【外３】
実施例４
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で調製した３０（ｗ／ｖ）％メチルマンノピラノシド４００ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した５％（ｗ／ｖ）のメタノール型２−置換アルコール溶液８０ｍｌおよび４００Ｕのシグマ社製のＪａｃｋ Ｂｅａｎｓ由来のα−マンノシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約１２％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノールで溶出後、８０％メタノールでクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリガゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，６：１（ｖ／ｖ））処理することで高純度のクロマノール配糖体である式（７）で示される２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(α-D-mannopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)]を約５００ｍｇ得た。
【００７８】
【化１４】
このようにして得られた２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図４に示す。
【００８０】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００８１】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．１７および１．２１（ｓ，３Ｈ）
１．６５から１．７４（ｍ，１Ｈ）
１．７７から１．９１（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１６から４．６９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．８
１２．７
１９．７および１９．８
２１．９および２２．１
２８．２および２８．５
６１．０および６１．２
６６．７および６６．９
７０．２および７０．３
７１．０
７３．８
７３．９
７４．１
１００．１および１００．２
１１６．７
１２０．２および１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．１および１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【００８２】
【外４】
比較例１
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で調製した６０（ｗ／ｖ）％マルトース溶液８０ｍｌに対し、ジメチルスルホキシドで調製した５（ｗ／ｖ）％のメタノール型２−置換アルコール溶液１６ｍｌおよび４００Ｕの東洋紡株式会社製のサッカロマイセス属(Saccharomyces sp.)由来のα−グルコシダーゼを加え、４０℃において２０時間反応させた。このときの２−置換アルコールのクロマノール配糖体への転移率は約４５％であった。この反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したＸＡＤ−４（オルガノ株式会社製）カラムにアプライし、非吸着物を３０％メタノール溶液で溶出後、８０％メタノール溶液でクロマノール配糖体を溶出させた。次に得られたクロマノール配糖体画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール，５：１，ｖ／ｖ）処理することで高純度のクロマノール配糖体：式（８）で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール[2-(α-D-glucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol] を約３００ｍｇ得た。
【００８４】
【化１５】
このようにして得られた２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルを図５に示す。
【００８６】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ，13Ｃ−ＮＭＲ，質量分析及び比旋光度の結果を示す。
【００８７】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２３および１．２５（ｓ，３Ｈ）
１．６９から１．７６（ｍ，１Ｈ）
１．８７から１．９２（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５１（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．０５から４．８８（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．７
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．４
２８．２
６０．６および６０．８
７０．０および７０．１
７１．２および７１．５
７１．９
７２．６および７２．９
７３．１
７３．８および７３．９
９８．７および９８．８
１１６．６および１１６．７
１２０．１および１２０．２
１２０．７および１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．１
質量スペクトル（ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比旋光度：
【００８８】
【外５】
実施例５：細胞膜酸化障害抑止効果の評価
実施例１から４及び比較例１で得られたクロマノール配糖体を０．４％Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ培地（以下、「ＤＭＥＭ培地」と略称する）中に最終濃度が０．５ｍＭになるように溶解し、クロマノール配糖体溶液を調製した。
【００９０】
ヒト肝芽腫細胞（以下、「ＨｅｐＧ２」と略称する）を６ウェルの細胞培養用マルチプレート（住友ベークライト製）で１０％ウシ胎児血清を含んだＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で継代培養し、コンフルエント(confluent) な状態になるまで増殖させた。このようにして培養されたＨｅｐＧ２の上清を除去し、１ウェル当たりＣａ及びＭｇを含まないリン酸緩衝塩類溶液（以下、「ＣＭＦ−ＰＢＳ」と略称する）１ｍｌで細胞を２回洗浄した。次に、上記クロマノール配糖体溶液を１ウェル当たり１．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で１８時間インキュベートした。さらに、上清を除去した後、ＣＭＦ−ＰＢＳ １ｍｌで１ウェル当たり細胞を２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地を１．５ｍｌ加えた。さらに、ＣＭＦ−ＰＢＳに溶かした１００ｍＭの２’，２−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（以下、「ＡＡＰＨ」と略称する）を０．５ｍｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で４時間インキュベートした。そして、１ウェル当たりＣＭＦ−ＰＢＳ １ｍｌで細胞を２回洗浄後、８．１％ドデシル硫酸ナトリウム処理により細胞膜を可溶化し、遠心分離処理により、上清を分離した。上清中のタンパク質量はマックウェル法により測定し、脂質過酸化物質量はチオバルビツール酸（以下、「ＴＢＡ」と略称する）反応により求めた。また、タンパク質１ｍｇ当たりのＴＢＡ反応物（以下、「ＴＢＡＲＳ」と略称する）の量（ｎｍｏｌ／ｍｇ・タンパク質）を求めた。この際、上記クロマノール配糖体の濃度を０ｍＭとした以外は上記反応を同様に繰り返して得られた比較対照のＴＢＡＲＳの量（ｎｍｏｌ／ｍｇ・タンパク質）を基準として下記式より細胞膜酸化障害抑制率を計算した。結果を表１に示す。本実施例において、上記細胞は１群４〜５連で実験を行い、結果はこれらの平均値として表わした。
【００９１】
【数１】
【表１】
表１から、実施例１から４で得られた式（４）から（７）で示されるクロマノール配糖体、特に、実施例３及び４で得られた式（６）及び（７）で示されるクロマノール配糖体は、比較例１で得られた式（８）で示されるクロマノール配糖体に比べて、同等またはそれ以下の細胞膜酸化障害抑制率を示すことが分かる。これより、本発明によるクロマノール配糖体は、式（８）で示されるクロマノール配糖体に比べて、有意に優れた抗酸化活性を有することが示される。
【００９４】
実施例６：放射線防護作用の評価
実施例１から４及び比較例１で得られたクロマノール配糖体をＲＰＭＩ−１６４０＋１０％牛胎仔血清＋ＨＥＤＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）系培養液（以下、「完全培養液」と略称する）中に最終濃度が１ｍＭになるように溶解し、クロマノール配糖体溶液を予め調製した。
【００９５】
次に、マウスのＴリンパ腫株ＥＬ−４細胞を完全培養液中で３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で継代培養し、細胞密度が２×１０5 個／ｍｌになるように調整した。このようにして培養されたＥＬ−４細胞培養液の上清を除去し、上記クロマノール配糖体溶液をそれぞれ等量加え、Ｘ線を照射するまでの３０分間、上記と同様の条件下で細胞培養を行った。クロマノール配糖体を含む培養液中で所定時間培養した後、３Ｇｙの放射線を０．９２Ｇｙ／分の線量率で照射した。放射線照射終了直後、細胞を遠心沈降（４００ｇ×５分）させ、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、完全培養液で再浮遊させて培養した。これに、サイトカラシンＢのＤＭＳＯ溶液（２ｍｇ／ｍｌ濃度）を最終濃度が３μｇ／ｍｌになるように添加し、２０時間培養後に２核細胞中の小核保有細胞の頻度（小核誘発頻度）を測定し、細胞の放射線損傷の頻度を表わす尺度とした。また、各放射線照射細胞について、上記クロマノール配糖体溶液の濃度を０ｍＭとした以外は上記操作を同様に繰り返して得られた比較対照の小核誘発頻度を基準として下記式より小核誘発抑制率を計算した。この際、上記細胞は１群４〜５連で放射線照射実験を行い、結果はこれらの平均値として表わした。結果を表２に示す。
【００９６】
【数２】
【表２】
表２より、小核誘発頻度は、実施例１から４で得られた本発明によるクロマノール配糖体は、比較例１で得られた値に比べて有意に小さく、これより、本発明によるクロマノール配糖体は放射線被爆による細胞の損傷を有効に抑制することが示された。
【００９９】
【発明の効果】
上述したように、本発明の一般式（１）で表わされるクロマノール配糖体は、抗酸化活性及び放射線防護作用等の様々な特性に優れている。
【０１００】
したがって、本発明のクロマノール配糖体は、抗酸化剤として有用であり、化粧品、衣料品、食品及び化成品など様々な分野における原料として有効に利用できる。
【０１０１】
また、上記利点に加えて、本発明のクロマノール配糖体は、その高い放射線防護効果により、放射線被爆による障害を有効に防止する放射線防護剤において使用でき、さらにこのような用途に使用する際には、その高い水溶性により、錠剤や散剤等の固形製剤の形態のみならず、注射用等の液状の製剤の形態でも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例１における赤外線吸収スペクトルである。
【図２】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例２における赤外線吸収スペクトルである。
【図３】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例３における赤外線吸収スペクトルである。
【図４】は、本発明によるクロマノール配糖体の実施例４における赤外線吸収スペクトルである。
【図５】は、本発明によるクロマノール配糖体の比較例１における赤外線吸収スペクトルである。
Claims (2)
- 一般式（１）：
- 一般式（２）：
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