JP3811863B2 - Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、抗癌剤として有用なＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法、該製造方法を含むＬ−メチオニン γ−リアーゼの精製方法、および該製造方法により製造され得る組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ結晶に関する。
背景技術
Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ（EC 4.4.1.11）は、Ｌ−メチオニンまたはその誘導体のα，γ−脱離およびγ−置換を触媒し、さらにはＳ−置換Ｌ−システインまたはその誘導体のα，β−脱離およびβ−置換を触媒するピリドキサルリン酸を補酵素とする酵素であり、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のものが報告されている（Nakayama, T. ら、Anal. Biochem. 138, 421-424(1984)）。最近になって、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼが抗癌活性を有していることが明らかになった（WO94/11535）。そして、近年の組換えDNA技術の急速な進歩により、従来シュードモナス・プチダより極く微量にしか得られなかったＬ−メチオニン γ−リアーゼの大量供給が可能となった（Inoue, H. ら、J. Biochem. 117, 1120-1125(1995)）。
医薬品として利用される薬物が純品でなければならないことは当然である。従来、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼは、シュードモナス・プチダの培養物から抽出したのちイオン交換カラムクロマトグラフィーを組み合わせて精製されてきたが（Nakayama, Tら、Anal. Biochem. 138, 421-424(1984)、Lishko VKら、Protein expression and purification 4, 529-533(1993)）、医薬品としては純度が低く、かつ大量精製が困難であるという問題があった。
蛋白質の結晶を製造する方法として、ポリエチレングリコールを使用する方法が一般に良く知られている。Ｌ−メチオニン γ−リアーゼに関しても、ポリエチレングリコールを含むりん酸カリウム緩衝液と混合し、室温で放置する方法（いわゆる蒸気拡散法）で、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼを結晶化する例が報告されている（Esaki Nら、Methods in Enzymol. 143, 459-465(1987)）。しかし、この報告では、クロマトグラフィーにより既に精製された高密度のＬ−メチオニン γ−リアーゼを結晶化しており、しかも極めて微少量(1.6mg)しか結晶化させていない。
発明の開示
未精製で不純物質を含む段階での大量の蛋白質の結晶化は困難なばかりか、仮に成功しても不純物を巻き込み有力な精製法とならないことが多く、工業的に試みられたことはこれまで殆どない。本発明は、大量でしかも未精製のＬ−メチオニン γ−リアーゼを結晶化させることのできる、工業的に有用なＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法、および該製造方法を含むＬ−メチオニン γ−リアーゼの精製方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、ポリエチレングリコールを用いるＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法において、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液にポリエチレングリコールを添加する前または添加した後に加温する第一工程、および無機塩を添加する第二工程を含ませることにより、短時間で、高純度のＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶を製造し得ることを見出し、本発明を完成した。
本発明においてＬ−メチオニン γ−リアーゼとは、シュードモナス・プチダなどの微生物により産生された天然型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼまたは組換えDNA技術により作製された組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの何れか一方かあるいは両方を意味するが、工業的には大量供給の点から組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼが好ましい。従って、以下に組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ（以下、「rMETase」と略称することもある）を用いた本発明の実施の形態を説明するが、天然型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼを用いる場合も同様に行うことができる。
また、本発明の結晶の製造方法で用いるＬ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液とは、未精製のもの、精製済のものを含め、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼを含んでいる溶液の全てを意味する。例えば、下記工程１において調製される粗酵素液、未精製のＬ−メチオニン γ−リアーゼ溶液、ポリエチレングリコールを用いて夾雑物質を除去した後の溶液などが挙げられるが、本発明ではこれらに限定されるものではない。
さらに、本発明で用いる陽イオン性高分子凝集剤は、陽イオン性高分子凝集剤が有するカチオン基と、核酸やエンドトキシンが有するアニオン基との静電気的な結合により、核酸やエンドトキシンを不溶性の凝集物として除去するためのものであり、具体的にはポリエチレンイミンや主成分がキトサン（好ましくはクリムーバーＩ（栗田工業製））である陽イオン性高分子凝集剤が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、rMETaseの柱状結晶の図面に代わる写真である。
図２は、rMETaseの八面体結晶の図面に代わる写真である。
図３は、新規なrMETase発現プラスミドpMGLTrc03の作製を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
１．Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液（rMETase含有溶液）の調製
(1)rMETase発現用菌株の培養
Inoue, H. ら、J. Biochem. 117, 1120-1125(1995)に記載の方法に従ってＬ−メチオニン γ−リアーゼの構造遺伝子部分を組込んだ発現プラスミド、具体的には、rMETase遺伝子を大腸菌内で効率よく発現させるために宿主内で機能する適切なプロモーターlac,tac,trp,trc, λPL等とShine-Dalgarno(SD)配列を有するpKK223-3,pPL-Lambdaやさらに翻訳開始コドンATGを備えたpKK233-2,pTrc99A等にrMETase遺伝子を含むDNA断片を挿入することにより作製された発現プラスミドを、適切な宿主、例えば大腸菌HB101株、JM103株、JM105株、JM109株、C600株、MV1184株、DH1株、DH5株、DH5 α株、BL21株などに導入してrMETase発現用菌株を作製し、該菌株を培養する。
(2)細胞残査の除去
培養後、湿菌体を２０〜５５℃好ましくは約４２℃で高圧ホモジナイザー（APVゴーリン社製）を用いて細胞破砕し、陽イオン性高分子凝集剤を添加する。この際の陽イオン性高分子凝集剤としては、好ましくはポリエチレンイミン又はクリムーバーＩなどが挙げられる。陽イオン性高分子凝集剤の終濃度が0.05〜0.5%(w/v)、好ましくは0.1〜0.2%(w/v)になるよう調製した後、5〜25℃で1〜20分陽イオン性高分子凝集剤により細胞残査を除去し、rMETaseの粗酵素液を得る。陽イオン性高分子凝集剤による処理の代わりに、湿菌体を高圧ホモジナイザーにより細胞破砕した後、遠心分離して得られた上澄液を加熱処理（55〜65℃で1〜10分）して細胞残査を除去してもよい。ついで、得られた粗酵素液を硫酸アンモニウムで塩析後、遠心分離し、得られた沈殿を緩衝液、好ましくはりん酸緩衝液に溶解して未精製のＬ−メチオニン γ−リアーゼ（rMETase）溶液を得る。
(3)夾雑物質の除去
ついで未精製のrMETase溶液に、終濃度5〜25%(W/V)、好ましくは約8〜約12%(W/V)のポリエチレングリコールを添加し、約2℃〜約15℃、好ましくは4℃で、約10分〜約120分、好ましくは約60分攪拌して遠心分離により夾雑物質を除去する。使用するポリエチレングリコールとしては平均分子量約7200以上のもの（例、PEG6000など）が好ましい。この時、予め硫酸アンモニウムの終濃度が飽和濃度として8〜10％、好ましくは10％になるように添加しておくと、rMETaseの溶解度が増し、rMETaseの損失を最少化することが出来る。
２．rMETase結晶の製造
(1) Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液、好ましくは上記工程１．で夾雑物質を除去した後の溶液の加温およびポリエチレングリコールの添加を行う。加温はポリエチレングリコールを添加する前または添加した後の何れでもよい。また、加温の前後に分けてポリエチレングリコールを添加しても良く、この場合、加温前のポリエチレングリコールの添加が上記の夾雑物質を除去するためのポリエチレングリコールの添加と兼ねていても良い。
加温後の温度は約25℃〜約40℃、好ましくは約30〜32℃である。通常の結晶化では、冷却することにより結晶化が促進されるが、本発明の場合は予想外に、この段階で昇温することにより結晶化が促進された。この事が本発明の最も重要な点の一つである。
ポリエチレングリコールの添加は通常行われる蛋白質の結晶化の方法に基づいて行えばよいが、好ましくは、平均分子量が約7200以上のポリエチレングリコールを使用し、終濃度が約5〜約25%(W/V)になるように添加し、攪拌、溶解する。ポリエチレングリコールの添加を加温の前後に分けて行う場合は、その合計が上記の終濃度になるように、また、上記１．で調製したrMETase含有溶液を用いる場合は、夾雑物質を除去するためにすでに添加済のポリエチレングリコールが溶液中に残っているので、それと併せて上記の終濃度になるようにすればよい。
(2) ついで無機塩を添加することにより、rMETaseの柱状結晶が得られる。無機塩としては、好ましくはアルカリ金属塩、例えば塩化ナトリウムや塩化カリウムなどが挙げられるが、塩化ナトリウムが特に好ましい。無機塩は、終濃度約20〜約500mMで用いるのが好ましい。より好ましくは約100〜約200mMである。無機塩は、10分〜2時間程度で添加する。好ましくは20分で添加する。
結晶は攪拌せずとも生成するが、好ましくは上記(1)および(2)の操作の間、攪拌しながら行う。また結晶を製造する際の溶液は、pHを7〜8に保つのが良い。さらに好ましくは、pHを7.2から7.5に保つのが良い。
このようにして析出したrMETase結晶は、例えば遠心分離機を用いて採取することができる。
得られたrMETase結晶は、高純度に精製されており、発熱物質の減少も認められた。さらに、結晶状態では冷所において長期間の保存が可能であった。
また、得られたrMETase結晶を再溶解後、上記(1)および(2)の工程を繰り返し行うことにより、結晶化を行わず複数のクロマトグラフィーを組み合わせて行った方法と同等か、あるいはそれ以上に高純度で、夾雑蛋白質の極めて少ないrMETaseの精製品を得ることができる。さらには当該結晶の製造方法を含む精製方法（例えば本発明の結晶化を行った後にイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを行う精製方法）を行えば、高純度で夾雑蛋白質が極めて少ないことのみならず、医薬品として承認を得ることができるのに十分な程、発熱物質を極低濃度にまで下げることができる。
工業的にも、クロマトグラフィーより結晶化方法の方が経済的に有利であることは自明であり、従って本発明の結晶の製造方法を組み込んだＬ−メチオニン γ−リアーゼ精製方法は工業的に非常に有用な精製方法である。
本発明の結晶の製造方法によって製造され得る組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ結晶は新規の結晶であり、本発明は当該結晶をも提供するものである。本発明により製造されるrMETase結晶は、再溶解後、天然の対応する蛋白質と同様の酵素活性を有し、アミノ末端アミノ酸配列も一致していた。
以下に実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１：rMETase発現用菌株の培養
Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ構造遺伝子部分を市販の発現ベクターpKK223-3（ファルマシアバイオテク）に挿入し、rMETase発現プラスミドpYH301（Inoue, H. ら、J. Biochem. 117, 1120-1125(1995)）を構築した。本プラスミドを大腸菌JM109株に導入し、rMETase発現用菌株とした。本菌をLB培地で種培養した後、市販のTerrific培地（フナコシ）にて、37℃、24時間培養した。
参考例２：粗酵素液の調製
参考例１で得られた組換え体培養液300mlを遠心分離し、約20gの湿菌体を集め、細胞破砕用緩衝液（1.3mMピリドキサールりん酸(以下PLPと略す)、0.01%ジチオスライトール(以下DTTと略す)、100mMりん酸ナトリウム緩衝液(以下Na-PBと略す)、pH7.2）140mlに懸濁した後、細胞破砕した。破砕終了液を遠心分離し、上澄液146mlを得（rMETase比活性：20U/mg）、ついでこの上澄液を加熱処理（60℃、５分）し、冷却後、再度遠心分離し、136mlの上澄液を得、粗酵素液とした（rMETase比活性：30U/mg）。あるいは、細胞破砕終了液155mlをポリエチレンイミン処理（10℃、5分）後、遠心分離し、136mlの上澄液を得、粗酵素液とした（rMETase比活性：20U/mg）。
参考例３：rMETase酵素活性の測定法
rMETase酵素活性は次のようにして測定した。上記実施例で得られたrMETaseを希釈用緩衝液（10μM PLP、1mM EDTA・2Na・2H2O、0.1g/l（±）-ジチオスレイトール、0.5g/l Tween80、100mMりん酸カリウム緩衝液(以下、K-PBと略す、pH8.0)）で希釈し、希釈酵素溶液を調製した。基質として、予め37℃で5分間プレインキュベートしたL-メチオニン溶液（25mM L-メチオニン、10μM PLP、100mM K-PB(pH8.0)）に希釈酵素溶液50μlを添加混合し、37℃で10分間反応させた後、500g/lトリクロロ酢酸溶液（以下、TCA溶液と略す）を100μl添加して酵素反応を停止させた。得られた酵素反応液0.8mlと、酢酸緩衝液（1M酢酸ナトリウム／酢酸、pH5.0）1.6ml、およびMBTH溶液（1g/l 3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン ヒドラゾンHCl・H2O）0.60mlを混合し、50℃で30分間反応させた後、室温まで冷却し、320nmにおける吸光度（E320sample）を測定することにより生成されたαケト酪酸を定量した。また、上記希釈酵素溶液とTCA溶液の添加順序を逆にして同様に操作を行ったものをブランクとした（E320blank）。酵素1ユニット(U)は、1分間に1μmolのαケト酪酸を生成する酵素量と定義し、以下の式に従って計算した。
酵素活性(U/ml)=（1.15・3.00/15.74/0.05/0.80/10）・（ΔE+2(ΔE)2)
=0.5480・（ΔE+2(ΔE)2）
（ただし、ΔE：E320sample−E320blank、1.15：酵素反応液量(ml)、3.00：MBTH反応液量(ml)、15.74：アジン誘導体の分子吸光係数(mMあたり）、0.05：酵素反応試料液量(ml)、0.80：MBTH反応試料液量(ml)、10：反応時間(分)）
参考例４：rMETaseのカラムクロマトグラフィー
参考例２の方法により、細胞粉砕および加熱処理を実施し、粗酵素液を得た。136mlの粗酵素液に10μM PLP、0.01% ２−メルカプトエタノール（以下2-MEと略す）を含むイオン交換水270mlを添加し、pH7.2に調整した後、予め10mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した100mlのDEAE-TOYOPEARL 650C（東ソー）カラムに供した。50mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む10mM Na-PB（pH7.2）で洗浄した後、100mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む10mM Na-PB（pH7.2）にて溶出させた。rMETaseの比活性は約46U/mgであった。得られた活性画分約100mlに10μM PLP、0.01% 2-MEを含む10mM Ma-PB（pH8.0）100mlを添加し、pH8.0に調整した後、予め50mM Na-PB（pH8.0）で平衡化した50mlのDEAE-Sepahrose FF（ファルマシアバイオテク）カラムに供した。80mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む50mM Na-PB（pH8.0）で洗浄した後、120mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む50mM Na-PB（pH8.0）で溶出させた。rMETaseの比活性は約50U/mgであった。得られた活性画分を分画分子量10kDa（ミリポア）の膜を用いて10mlまで濃縮した。濃縮液10mlを予め10μM PLPを含む10mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した400mlのSephacryl S-200 HR（ファルマシアバイオテク）カラムに供した。得られた有効活性画分のrMETaseの比活性は52U/mgであった。表１に本精製の各操作後のrMETaseの比活性および回収率を示した。
実施例１：rMETase結晶の製造−(1)
参考例２の方法により調製した粗酵素液136mlに硫酸アンモニウム58g（65%飽和）を徐々に添加し、アンモニア水でpH7.2に調整しながら溶解させた後、塩析した。遠心分離によって沈殿物を集め冷蔵庫内で保存した。沈殿物を40mlの溶解用緩衝液（500μM PLP、0.05% 2-ME、100mM Na-PB、pH7.2）に溶解後、4g（10%(W/V)）のPEG6000を徐々に添加し、4℃下60分間攪拌した。遠心分離により不溶物を除去した後、さらに4℃下16時間攪拌した。次に30℃まで加温した後、0.8g（2%(w/v)）のPEG6000を添加し、攪拌しながら溶解させた。その後、攪拌しながら、4M NaCl溶液2mlを添加した。さらに60分間、30℃で攪拌することにより溶液中にrMETaseの柱状結晶が確認された。さらに、4℃下20時間攪拌し、析出した結晶を遠心分離によって集めrMETaseの柱状結晶（図１）を得た。
実施例２：rMETase結晶の製造−(2)
上記実施例１で得られた柱状結晶を40mlの溶解用緩衝液に溶解した。この溶液を30℃に加温後、攪拌しながら4g（10%(W/V)）のPEG6000を徐々に添加し、溶解した。その後、攪拌しながら、4M NaCl溶液2mlを添加し、４℃下20時間攪拌した。析出した八面体結晶を遠心分離によって集めた。結晶を再び35mlの溶解用緩衝液に溶解した。この溶液を30℃に加温後、攪拌しながら3.5g（10%(W/V)）のPEG6000を添加し、溶解した。その後、攪拌しながら、4M NaCl溶液1.75mlを添加し、4℃下20時間攪拌した。析出した八面体結晶（図２）を遠心分離によって集めた。
上記実施例1および2によって得られたrMETaseの結晶は、両者ともSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドにまで精製されており、結晶化による精製効果が高いことが確認された。また、後の参考例4に示したイオン交換カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製方法により得られたrMETaseと比活性および純度・回収率の点で同等あるいはそれ以上であった。
実施例３：rMETase結晶のカラムクロマトグラフィー
実施例２によって得られた結晶を60mlの溶解用緩衝液に溶解した。その後、予め20mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した50mlのDEAE-Sepahrose FF（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーに供した。50mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB（pH7.2）で洗浄した後、100mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB（pH7.2）で溶出させた。rMETaseの比活性は約52U/mgであった。得られた活性画分を分画分子量10kDa（ミリポア）の膜を用いて10mLまで濃縮した。濃縮液10mlを予め10μM PLPを含む10mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した400mlのSephacryl S-200 HR（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーに供した。得られた有効活性画分のrMETaseの比活性は52U/mgであった。
表２に実施例１〜３の各操作後のrMETaseの比活性および回収率を示した。
実施例４：新規発現プラスミドの製造方法
rMETase遺伝子を含むpYH301を鋳型としPCRによりrMETase遺伝子の開始コドンを除く遺伝子：rMETase (-ATG)をクローニングした。10pmolのセンスプライマー（配列番号１：5'-CCCGGTACCA CGGCTCCAAC AAGCTCCCAG-3'）1μl、10pmolアンチセンスプライマー（配列番号２：5'-CTCGAGACGG GTTCAGGCAC TCGCCTT-3')1μl、8μlのdNTP混合溶液(各2.5mM)、および1粒のAmpli WaxTM(パーキン・エルマー社製)を加え、77℃、7分加熱し、20℃、3分冷却した。その後、5U/μlのTaq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）0.5μlと約1μg/μlのpYH301 1μlを加え、蒸留水で90μlにメスアップした後、PCR増幅用緩衝溶液（ポリメラーゼキットに添付）10μlを添加した。
その後、DNAサーマルサイクラー(モデルPJ2000:パーキン・エルマー社製)にセットし、PCR増幅を行った。1サイクルの反応は94℃で1分、55℃で1.5分、72℃で2分と設定し、これを20回繰り返した後、72℃7分加熱後、室温に置き、固形化したワックス層の下にある水槽の全量をアガロースゲル電気泳動に供した。増幅された断片をDNA回収システムSpinBindTM(宝酒造社製)により回収した。
回収したDNA断片2μlとpMOSBlue T-vector(Amersham社製)1μlおよび蒸留水17μlをReady-To-GoTM T4 DNA ligation kit(Pharmacia社製)に添加し、16℃、45分インキュベートし連結後、大腸菌DH5株を形質転換した。この形質転換体をアンピシリンを含有する寒天培地にてインキュベートし、このうち目的の形質転換体つまりrMETase遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子の方向が逆向きに挿入されたプラスミドを選択し、LMGL/T-vectorと命名した。
次に、trcプロモーター、SD配列、翻訳開始コドン(ATG)、5SrrnBT1T2ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドpATG3131の翻訳開始コドンの下流にLMGL/T-vectorのrMETase(-ATG)を挿入した。まず、5μgのpATG3131を制限酵素EcoRIで切断、Mung Bean Nucleaseで平滑化、制限酵素XbaIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動に供し、3.3kbpの断片をSpinBindにより回収した。一方、10μgのLMGL/T-vectorを制限酵素KpnIで切断、DNA Blunting kit(宝酒造社製)で平滑化、制限酵素XbaIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動に供し、1.2kbpの断片を回収した。これら2つの断片をReady-To-GoTM T4 DNA ligation kitに添加し、16℃、45分インキュベートし連結後、大腸菌JM109株を形質転換した。この形質転換体をテトラサイクリンを含有する寒天培地にてインキュベートし、このうち目的の遺伝子が導入された形質転換体から得られたプラスミドをpMGLTrc03（図３）と命名した。
実施例５：rMETase結晶の製造−(3)
rMETase発現プラスミドpMGLTrc03を大腸菌JM109株に導入し、rMETase発現用菌株とした。本菌をLB培地で前々培養、0.5%グルコースを含むLB培地で前培養した後、30-lジャーファーメンター3台を用いて、4%グルコースを含むTerrific培地（フナコシ）にて、28℃、24時間培養した。得られた組換え体培養液57kgを遠心分離（アルファラバル社製）し、19kgの濃縮菌体を集め、予めEDTA 24.57g、PLP 10.34g、DTT 3.3gを溶解した17.4kgの100mM Na-PB(pH7.5)を添加した。この菌体懸濁液を28℃に加温した後、高圧ホモジナイザー（APVゴーリン社製）にて破砕した。破砕後の温度は42℃であった。36.6kgの破砕終了液に、2.18lの5%クリムーバーＩ溶液を約5分で添加し、その後20分撹拌した。38.8kgのクリムーバーＩ処理液を遠心分離し、37.4kgの粗酵素液を得た。この粗酵素液には、160gのrMETaseが存在し、比活性は30U/mgであった。
この粗酵素液は硫酸アンモニウム8.86kg(40%飽和)を徐々に添加し、アンモニア水でpH7.2に調整しながら溶解させた後、塩析し冷蔵庫内で保存した。遠心分離（シャープレス製）によって沈殿物を集め、3.6lの溶解用緩衝液(0.5mM PLP、0.05% 2-ME、20mM Na-PB、pH7.2)に溶解後、150gの硫酸アンモニウムを溶解した0.2lの溶解用緩衝液を添加した。この溶液をアンモニウム水でpH7.2に調整し、4℃まで冷却後、予め540gのPEG6000を溶解した1.6lの溶解用緩衝液を徐々に添加し、4℃下60分間攪拌した。遠心分離により不溶物を除去した後、予め650gのPEG6000を溶解した5.4lの溶解用緩衝液を撹拌下、徐々に添加した。次に32℃に加温した後、撹拌しながら540mlの4M NaCl溶液を20分間かけて添加した。更に60分間、32℃で撹拌することにより溶液中にrMETaseの柱状結晶が確認された。更に、４℃下20時間撹拌し、熟成させた後、結晶を遠心分離によって集めrMETaseの柱状結晶を得た。
実施例６：rMETase結晶の製造−(4)
次に、6lの溶解用緩衝液に溶解し、不溶物を遠心分離により除去した後、予め760gのPEG6000を溶解した2.4lの溶解用緩衝液を徐々に添加し、32℃に加温した。その後、攪拌しながら420mlの4M NaCl溶液を20分間かけて添加し、60分間、32℃で攪拌した。更に、4℃下20時間撹拌することでrMETaseの八面体結晶が析出した。遠心分離によってrMETaseの八面体結晶を集め、6lの溶解用緩衝液に溶解した。6.3lの結晶再溶解液には、125gのrMETaseが含まれ、比活性は50U/mgであった。
実施例７：rMETase結晶のカラムクロマトグラフィー−(2)
実施例６で得られた結晶再溶解液を、予め20mM Na-PB(pH7.2)で平衡化した5lのDEAE-Sepharose FF(ファルマシアバイオテク)カラムクロマトグラフィーに供した。0.1mM MPLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB(pH7.2)で洗浄した後、120mM NaCl、0.1mM PLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB(pH7.2)で溶出させた。rMETaseの比活性は52U/mgであった。得られた活性画分15lを分画分子量10kDa(ミリポア)の膜を用いて2.7lまで濃縮した。濃縮液には101gのrMETaseが含まれていた。この濃縮液2.7lのうち、900mlを予め0.01mM PLPを含む10mM Na-PB(pH7.2)で平衡化した18lのSephacryl S200 HR(ファルマシアバイオテク)カラムクロマトグラフィーに供した。この操作を3回実施した。得られた有効活性画分のrMETaseの比活性は52U/mgであり、80gのrMETaseが含まれていた。
表３に実施例５〜７の各操作後のrMETaseの比活性および回収率を示した。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：DNA（センスプライマー）
配列：
配列番号：２
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：DNA（アンチセンスプライマー）
配列：
産業上の利用可能性
本発明のＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法は、カラムクロマトグラフィーによる精製法と同等以上のレベルでＬ−メチオニン γ−リアーゼを精製することができる。結晶化による精製は、カラムクロマトグラフィーによる精製に比べて大量かつ経済的に目的物を精製できるので、本発明の結晶の製造方法は、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの工業的精製方法として有用である。
本発明は、抗癌剤として有用なＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法、該製造方法を含むＬ−メチオニン γ−リアーゼの精製方法、および該製造方法により製造され得る組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ結晶に関する。
背景技術
Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ（EC 4.4.1.11）は、Ｌ−メチオニンまたはその誘導体のα，γ−脱離およびγ−置換を触媒し、さらにはＳ−置換Ｌ−システインまたはその誘導体のα，β−脱離およびβ−置換を触媒するピリドキサルリン酸を補酵素とする酵素であり、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のものが報告されている（Nakayama, T. ら、Anal. Biochem. 138, 421-424(1984)）。最近になって、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼが抗癌活性を有していることが明らかになった（WO94/11535）。そして、近年の組換えDNA技術の急速な進歩により、従来シュードモナス・プチダより極く微量にしか得られなかったＬ−メチオニン γ−リアーゼの大量供給が可能となった（Inoue, H. ら、J. Biochem. 117, 1120-1125(1995)）。
医薬品として利用される薬物が純品でなければならないことは当然である。従来、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼは、シュードモナス・プチダの培養物から抽出したのちイオン交換カラムクロマトグラフィーを組み合わせて精製されてきたが（Nakayama, Tら、Anal. Biochem. 138, 421-424(1984)、Lishko VKら、Protein expression and purification 4, 529-533(1993)）、医薬品としては純度が低く、かつ大量精製が困難であるという問題があった。
蛋白質の結晶を製造する方法として、ポリエチレングリコールを使用する方法が一般に良く知られている。Ｌ−メチオニン γ−リアーゼに関しても、ポリエチレングリコールを含むりん酸カリウム緩衝液と混合し、室温で放置する方法（いわゆる蒸気拡散法）で、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼを結晶化する例が報告されている（Esaki Nら、Methods in Enzymol. 143, 459-465(1987)）。しかし、この報告では、クロマトグラフィーにより既に精製された高密度のＬ−メチオニン γ−リアーゼを結晶化しており、しかも極めて微少量(1.6mg)しか結晶化させていない。
発明の開示
未精製で不純物質を含む段階での大量の蛋白質の結晶化は困難なばかりか、仮に成功しても不純物を巻き込み有力な精製法とならないことが多く、工業的に試みられたことはこれまで殆どない。本発明は、大量でしかも未精製のＬ−メチオニン γ−リアーゼを結晶化させることのできる、工業的に有用なＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法、および該製造方法を含むＬ−メチオニン γ−リアーゼの精製方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、ポリエチレングリコールを用いるＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法において、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液にポリエチレングリコールを添加する前または添加した後に加温する第一工程、および無機塩を添加する第二工程を含ませることにより、短時間で、高純度のＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶を製造し得ることを見出し、本発明を完成した。
本発明においてＬ−メチオニン γ−リアーゼとは、シュードモナス・プチダなどの微生物により産生された天然型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼまたは組換えDNA技術により作製された組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの何れか一方かあるいは両方を意味するが、工業的には大量供給の点から組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼが好ましい。従って、以下に組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ（以下、「rMETase」と略称することもある）を用いた本発明の実施の形態を説明するが、天然型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼを用いる場合も同様に行うことができる。
また、本発明の結晶の製造方法で用いるＬ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液とは、未精製のもの、精製済のものを含め、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼを含んでいる溶液の全てを意味する。例えば、下記工程１において調製される粗酵素液、未精製のＬ−メチオニン γ−リアーゼ溶液、ポリエチレングリコールを用いて夾雑物質を除去した後の溶液などが挙げられるが、本発明ではこれらに限定されるものではない。
さらに、本発明で用いる陽イオン性高分子凝集剤は、陽イオン性高分子凝集剤が有するカチオン基と、核酸やエンドトキシンが有するアニオン基との静電気的な結合により、核酸やエンドトキシンを不溶性の凝集物として除去するためのものであり、具体的にはポリエチレンイミンや主成分がキトサン（好ましくはクリムーバーＩ（栗田工業製））である陽イオン性高分子凝集剤が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、rMETaseの柱状結晶の図面に代わる写真である。
図２は、rMETaseの八面体結晶の図面に代わる写真である。
図３は、新規なrMETase発現プラスミドpMGLTrc03の作製を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
１．Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液（rMETase含有溶液）の調製
(1)rMETase発現用菌株の培養
Inoue, H. ら、J. Biochem. 117, 1120-1125(1995)に記載の方法に従ってＬ−メチオニン γ−リアーゼの構造遺伝子部分を組込んだ発現プラスミド、具体的には、rMETase遺伝子を大腸菌内で効率よく発現させるために宿主内で機能する適切なプロモーターlac,tac,trp,trc, λPL等とShine-Dalgarno(SD)配列を有するpKK223-3,pPL-Lambdaやさらに翻訳開始コドンATGを備えたpKK233-2,pTrc99A等にrMETase遺伝子を含むDNA断片を挿入することにより作製された発現プラスミドを、適切な宿主、例えば大腸菌HB101株、JM103株、JM105株、JM109株、C600株、MV1184株、DH1株、DH5株、DH5 α株、BL21株などに導入してrMETase発現用菌株を作製し、該菌株を培養する。
(2)細胞残査の除去
培養後、湿菌体を２０〜５５℃好ましくは約４２℃で高圧ホモジナイザー（APVゴーリン社製）を用いて細胞破砕し、陽イオン性高分子凝集剤を添加する。この際の陽イオン性高分子凝集剤としては、好ましくはポリエチレンイミン又はクリムーバーＩなどが挙げられる。陽イオン性高分子凝集剤の終濃度が0.05〜0.5%(w/v)、好ましくは0.1〜0.2%(w/v)になるよう調製した後、5〜25℃で1〜20分陽イオン性高分子凝集剤により細胞残査を除去し、rMETaseの粗酵素液を得る。陽イオン性高分子凝集剤による処理の代わりに、湿菌体を高圧ホモジナイザーにより細胞破砕した後、遠心分離して得られた上澄液を加熱処理（55〜65℃で1〜10分）して細胞残査を除去してもよい。ついで、得られた粗酵素液を硫酸アンモニウムで塩析後、遠心分離し、得られた沈殿を緩衝液、好ましくはりん酸緩衝液に溶解して未精製のＬ−メチオニン γ−リアーゼ（rMETase）溶液を得る。
(3)夾雑物質の除去
ついで未精製のrMETase溶液に、終濃度5〜25%(W/V)、好ましくは約8〜約12%(W/V)のポリエチレングリコールを添加し、約2℃〜約15℃、好ましくは4℃で、約10分〜約120分、好ましくは約60分攪拌して遠心分離により夾雑物質を除去する。使用するポリエチレングリコールとしては平均分子量約7200以上のもの（例、PEG6000など）が好ましい。この時、予め硫酸アンモニウムの終濃度が飽和濃度として8〜10％、好ましくは10％になるように添加しておくと、rMETaseの溶解度が増し、rMETaseの損失を最少化することが出来る。
２．rMETase結晶の製造
(1) Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液、好ましくは上記工程１．で夾雑物質を除去した後の溶液の加温およびポリエチレングリコールの添加を行う。加温はポリエチレングリコールを添加する前または添加した後の何れでもよい。また、加温の前後に分けてポリエチレングリコールを添加しても良く、この場合、加温前のポリエチレングリコールの添加が上記の夾雑物質を除去するためのポリエチレングリコールの添加と兼ねていても良い。
加温後の温度は約25℃〜約40℃、好ましくは約30〜32℃である。通常の結晶化では、冷却することにより結晶化が促進されるが、本発明の場合は予想外に、この段階で昇温することにより結晶化が促進された。この事が本発明の最も重要な点の一つである。
ポリエチレングリコールの添加は通常行われる蛋白質の結晶化の方法に基づいて行えばよいが、好ましくは、平均分子量が約7200以上のポリエチレングリコールを使用し、終濃度が約5〜約25%(W/V)になるように添加し、攪拌、溶解する。ポリエチレングリコールの添加を加温の前後に分けて行う場合は、その合計が上記の終濃度になるように、また、上記１．で調製したrMETase含有溶液を用いる場合は、夾雑物質を除去するためにすでに添加済のポリエチレングリコールが溶液中に残っているので、それと併せて上記の終濃度になるようにすればよい。
(2) ついで無機塩を添加することにより、rMETaseの柱状結晶が得られる。無機塩としては、好ましくはアルカリ金属塩、例えば塩化ナトリウムや塩化カリウムなどが挙げられるが、塩化ナトリウムが特に好ましい。無機塩は、終濃度約20〜約500mMで用いるのが好ましい。より好ましくは約100〜約200mMである。無機塩は、10分〜2時間程度で添加する。好ましくは20分で添加する。
結晶は攪拌せずとも生成するが、好ましくは上記(1)および(2)の操作の間、攪拌しながら行う。また結晶を製造する際の溶液は、pHを7〜8に保つのが良い。さらに好ましくは、pHを7.2から7.5に保つのが良い。
このようにして析出したrMETase結晶は、例えば遠心分離機を用いて採取することができる。
得られたrMETase結晶は、高純度に精製されており、発熱物質の減少も認められた。さらに、結晶状態では冷所において長期間の保存が可能であった。
また、得られたrMETase結晶を再溶解後、上記(1)および(2)の工程を繰り返し行うことにより、結晶化を行わず複数のクロマトグラフィーを組み合わせて行った方法と同等か、あるいはそれ以上に高純度で、夾雑蛋白質の極めて少ないrMETaseの精製品を得ることができる。さらには当該結晶の製造方法を含む精製方法（例えば本発明の結晶化を行った後にイオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを行う精製方法）を行えば、高純度で夾雑蛋白質が極めて少ないことのみならず、医薬品として承認を得ることができるのに十分な程、発熱物質を極低濃度にまで下げることができる。
工業的にも、クロマトグラフィーより結晶化方法の方が経済的に有利であることは自明であり、従って本発明の結晶の製造方法を組み込んだＬ−メチオニン γ−リアーゼ精製方法は工業的に非常に有用な精製方法である。
本発明の結晶の製造方法によって製造され得る組換え型Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ結晶は新規の結晶であり、本発明は当該結晶をも提供するものである。本発明により製造されるrMETase結晶は、再溶解後、天然の対応する蛋白質と同様の酵素活性を有し、アミノ末端アミノ酸配列も一致していた。
以下に実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらが本発明の範囲を限定するものではない。
参考例１：rMETase発現用菌株の培養
Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ構造遺伝子部分を市販の発現ベクターpKK223-3（ファルマシアバイオテク）に挿入し、rMETase発現プラスミドpYH301（Inoue, H. ら、J. Biochem. 117, 1120-1125(1995)）を構築した。本プラスミドを大腸菌JM109株に導入し、rMETase発現用菌株とした。本菌をLB培地で種培養した後、市販のTerrific培地（フナコシ）にて、37℃、24時間培養した。
参考例２：粗酵素液の調製
参考例１で得られた組換え体培養液300mlを遠心分離し、約20gの湿菌体を集め、細胞破砕用緩衝液（1.3mMピリドキサールりん酸(以下PLPと略す)、0.01%ジチオスライトール(以下DTTと略す)、100mMりん酸ナトリウム緩衝液(以下Na-PBと略す)、pH7.2）140mlに懸濁した後、細胞破砕した。破砕終了液を遠心分離し、上澄液146mlを得（rMETase比活性：20U/mg）、ついでこの上澄液を加熱処理（60℃、５分）し、冷却後、再度遠心分離し、136mlの上澄液を得、粗酵素液とした（rMETase比活性：30U/mg）。あるいは、細胞破砕終了液155mlをポリエチレンイミン処理（10℃、5分）後、遠心分離し、136mlの上澄液を得、粗酵素液とした（rMETase比活性：20U/mg）。
参考例３：rMETase酵素活性の測定法
rMETase酵素活性は次のようにして測定した。上記実施例で得られたrMETaseを希釈用緩衝液（10μM PLP、1mM EDTA・2Na・2H2O、0.1g/l（±）-ジチオスレイトール、0.5g/l Tween80、100mMりん酸カリウム緩衝液(以下、K-PBと略す、pH8.0)）で希釈し、希釈酵素溶液を調製した。基質として、予め37℃で5分間プレインキュベートしたL-メチオニン溶液（25mM L-メチオニン、10μM PLP、100mM K-PB(pH8.0)）に希釈酵素溶液50μlを添加混合し、37℃で10分間反応させた後、500g/lトリクロロ酢酸溶液（以下、TCA溶液と略す）を100μl添加して酵素反応を停止させた。得られた酵素反応液0.8mlと、酢酸緩衝液（1M酢酸ナトリウム／酢酸、pH5.0）1.6ml、およびMBTH溶液（1g/l 3-メチル-2-ベンゾチアゾリノン ヒドラゾンHCl・H2O）0.60mlを混合し、50℃で30分間反応させた後、室温まで冷却し、320nmにおける吸光度（E320sample）を測定することにより生成されたαケト酪酸を定量した。また、上記希釈酵素溶液とTCA溶液の添加順序を逆にして同様に操作を行ったものをブランクとした（E320blank）。酵素1ユニット(U)は、1分間に1μmolのαケト酪酸を生成する酵素量と定義し、以下の式に従って計算した。
酵素活性(U/ml)=（1.15・3.00/15.74/0.05/0.80/10）・（ΔE+2(ΔE)2)
=0.5480・（ΔE+2(ΔE)2）
（ただし、ΔE：E320sample−E320blank、1.15：酵素反応液量(ml)、3.00：MBTH反応液量(ml)、15.74：アジン誘導体の分子吸光係数(mMあたり）、0.05：酵素反応試料液量(ml)、0.80：MBTH反応試料液量(ml)、10：反応時間(分)）
参考例４：rMETaseのカラムクロマトグラフィー
参考例２の方法により、細胞粉砕および加熱処理を実施し、粗酵素液を得た。136mlの粗酵素液に10μM PLP、0.01% ２−メルカプトエタノール（以下2-MEと略す）を含むイオン交換水270mlを添加し、pH7.2に調整した後、予め10mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した100mlのDEAE-TOYOPEARL 650C（東ソー）カラムに供した。50mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む10mM Na-PB（pH7.2）で洗浄した後、100mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む10mM Na-PB（pH7.2）にて溶出させた。rMETaseの比活性は約46U/mgであった。得られた活性画分約100mlに10μM PLP、0.01% 2-MEを含む10mM Ma-PB（pH8.0）100mlを添加し、pH8.0に調整した後、予め50mM Na-PB（pH8.0）で平衡化した50mlのDEAE-Sepahrose FF（ファルマシアバイオテク）カラムに供した。80mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む50mM Na-PB（pH8.0）で洗浄した後、120mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む50mM Na-PB（pH8.0）で溶出させた。rMETaseの比活性は約50U/mgであった。得られた活性画分を分画分子量10kDa（ミリポア）の膜を用いて10mlまで濃縮した。濃縮液10mlを予め10μM PLPを含む10mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した400mlのSephacryl S-200 HR（ファルマシアバイオテク）カラムに供した。得られた有効活性画分のrMETaseの比活性は52U/mgであった。表１に本精製の各操作後のrMETaseの比活性および回収率を示した。
参考例２の方法により調製した粗酵素液136mlに硫酸アンモニウム58g（65%飽和）を徐々に添加し、アンモニア水でpH7.2に調整しながら溶解させた後、塩析した。遠心分離によって沈殿物を集め冷蔵庫内で保存した。沈殿物を40mlの溶解用緩衝液（500μM PLP、0.05% 2-ME、100mM Na-PB、pH7.2）に溶解後、4g（10%(W/V)）のPEG6000を徐々に添加し、4℃下60分間攪拌した。遠心分離により不溶物を除去した後、さらに4℃下16時間攪拌した。次に30℃まで加温した後、0.8g（2%(w/v)）のPEG6000を添加し、攪拌しながら溶解させた。その後、攪拌しながら、4M NaCl溶液2mlを添加した。さらに60分間、30℃で攪拌することにより溶液中にrMETaseの柱状結晶が確認された。さらに、4℃下20時間攪拌し、析出した結晶を遠心分離によって集めrMETaseの柱状結晶（図１）を得た。
実施例２：rMETase結晶の製造−(2)
上記実施例１で得られた柱状結晶を40mlの溶解用緩衝液に溶解した。この溶液を30℃に加温後、攪拌しながら4g（10%(W/V)）のPEG6000を徐々に添加し、溶解した。その後、攪拌しながら、4M NaCl溶液2mlを添加し、４℃下20時間攪拌した。析出した八面体結晶を遠心分離によって集めた。結晶を再び35mlの溶解用緩衝液に溶解した。この溶液を30℃に加温後、攪拌しながら3.5g（10%(W/V)）のPEG6000を添加し、溶解した。その後、攪拌しながら、4M NaCl溶液1.75mlを添加し、4℃下20時間攪拌した。析出した八面体結晶（図２）を遠心分離によって集めた。
上記実施例1および2によって得られたrMETaseの結晶は、両者ともSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドにまで精製されており、結晶化による精製効果が高いことが確認された。また、後の参考例4に示したイオン交換カラムクロマトグラフィーを組み合わせた精製方法により得られたrMETaseと比活性および純度・回収率の点で同等あるいはそれ以上であった。
実施例３：rMETase結晶のカラムクロマトグラフィー
実施例２によって得られた結晶を60mlの溶解用緩衝液に溶解した。その後、予め20mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した50mlのDEAE-Sepahrose FF（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーに供した。50mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB（pH7.2）で洗浄した後、100mM NaCl、10μM PLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB（pH7.2）で溶出させた。rMETaseの比活性は約52U/mgであった。得られた活性画分を分画分子量10kDa（ミリポア）の膜を用いて10mLまで濃縮した。濃縮液10mlを予め10μM PLPを含む10mM Na-PB（pH7.2）で平衡化した400mlのSephacryl S-200 HR（ファルマシアバイオテク）カラムクロマトグラフィーに供した。得られた有効活性画分のrMETaseの比活性は52U/mgであった。
表２に実施例１〜３の各操作後のrMETaseの比活性および回収率を示した。
rMETase遺伝子を含むpYH301を鋳型としPCRによりrMETase遺伝子の開始コドンを除く遺伝子：rMETase (-ATG)をクローニングした。10pmolのセンスプライマー（配列番号１：5'-CCCGGTACCA CGGCTCCAAC AAGCTCCCAG-3'）1μl、10pmolアンチセンスプライマー（配列番号２：5'-CTCGAGACGG GTTCAGGCAC TCGCCTT-3')1μl、8μlのdNTP混合溶液(各2.5mM)、および1粒のAmpli WaxTM(パーキン・エルマー社製)を加え、77℃、7分加熱し、20℃、3分冷却した。その後、5U/μlのTaq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）0.5μlと約1μg/μlのpYH301 1μlを加え、蒸留水で90μlにメスアップした後、PCR増幅用緩衝溶液（ポリメラーゼキットに添付）10μlを添加した。
その後、DNAサーマルサイクラー(モデルPJ2000:パーキン・エルマー社製)にセットし、PCR増幅を行った。1サイクルの反応は94℃で1分、55℃で1.5分、72℃で2分と設定し、これを20回繰り返した後、72℃7分加熱後、室温に置き、固形化したワックス層の下にある水槽の全量をアガロースゲル電気泳動に供した。増幅された断片をDNA回収システムSpinBindTM(宝酒造社製)により回収した。
回収したDNA断片2μlとpMOSBlue T-vector(Amersham社製)1μlおよび蒸留水17μlをReady-To-GoTM T4 DNA ligation kit(Pharmacia社製)に添加し、16℃、45分インキュベートし連結後、大腸菌DH5株を形質転換した。この形質転換体をアンピシリンを含有する寒天培地にてインキュベートし、このうち目的の形質転換体つまりrMETase遺伝子とアンピシリン耐性遺伝子の方向が逆向きに挿入されたプラスミドを選択し、LMGL/T-vectorと命名した。
次に、trcプロモーター、SD配列、翻訳開始コドン(ATG)、5SrrnBT1T2ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドpATG3131の翻訳開始コドンの下流にLMGL/T-vectorのrMETase(-ATG)を挿入した。まず、5μgのpATG3131を制限酵素EcoRIで切断、Mung Bean Nucleaseで平滑化、制限酵素XbaIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動に供し、3.3kbpの断片をSpinBindにより回収した。一方、10μgのLMGL/T-vectorを制限酵素KpnIで切断、DNA Blunting kit(宝酒造社製)で平滑化、制限酵素XbaIにて切断した後、アガロースゲル電気泳動に供し、1.2kbpの断片を回収した。これら2つの断片をReady-To-GoTM T4 DNA ligation kitに添加し、16℃、45分インキュベートし連結後、大腸菌JM109株を形質転換した。この形質転換体をテトラサイクリンを含有する寒天培地にてインキュベートし、このうち目的の遺伝子が導入された形質転換体から得られたプラスミドをpMGLTrc03（図３）と命名した。
実施例５：rMETase結晶の製造−(3)
rMETase発現プラスミドpMGLTrc03を大腸菌JM109株に導入し、rMETase発現用菌株とした。本菌をLB培地で前々培養、0.5%グルコースを含むLB培地で前培養した後、30-lジャーファーメンター3台を用いて、4%グルコースを含むTerrific培地（フナコシ）にて、28℃、24時間培養した。得られた組換え体培養液57kgを遠心分離（アルファラバル社製）し、19kgの濃縮菌体を集め、予めEDTA 24.57g、PLP 10.34g、DTT 3.3gを溶解した17.4kgの100mM Na-PB(pH7.5)を添加した。この菌体懸濁液を28℃に加温した後、高圧ホモジナイザー（APVゴーリン社製）にて破砕した。破砕後の温度は42℃であった。36.6kgの破砕終了液に、2.18lの5%クリムーバーＩ溶液を約5分で添加し、その後20分撹拌した。38.8kgのクリムーバーＩ処理液を遠心分離し、37.4kgの粗酵素液を得た。この粗酵素液には、160gのrMETaseが存在し、比活性は30U/mgであった。
この粗酵素液は硫酸アンモニウム8.86kg(40%飽和)を徐々に添加し、アンモニア水でpH7.2に調整しながら溶解させた後、塩析し冷蔵庫内で保存した。遠心分離（シャープレス製）によって沈殿物を集め、3.6lの溶解用緩衝液(0.5mM PLP、0.05% 2-ME、20mM Na-PB、pH7.2)に溶解後、150gの硫酸アンモニウムを溶解した0.2lの溶解用緩衝液を添加した。この溶液をアンモニウム水でpH7.2に調整し、4℃まで冷却後、予め540gのPEG6000を溶解した1.6lの溶解用緩衝液を徐々に添加し、4℃下60分間攪拌した。遠心分離により不溶物を除去した後、予め650gのPEG6000を溶解した5.4lの溶解用緩衝液を撹拌下、徐々に添加した。次に32℃に加温した後、撹拌しながら540mlの4M NaCl溶液を20分間かけて添加した。更に60分間、32℃で撹拌することにより溶液中にrMETaseの柱状結晶が確認された。更に、４℃下20時間撹拌し、熟成させた後、結晶を遠心分離によって集めrMETaseの柱状結晶を得た。
実施例６：rMETase結晶の製造−(4)
次に、6lの溶解用緩衝液に溶解し、不溶物を遠心分離により除去した後、予め760gのPEG6000を溶解した2.4lの溶解用緩衝液を徐々に添加し、32℃に加温した。その後、攪拌しながら420mlの4M NaCl溶液を20分間かけて添加し、60分間、32℃で攪拌した。更に、4℃下20時間撹拌することでrMETaseの八面体結晶が析出した。遠心分離によってrMETaseの八面体結晶を集め、6lの溶解用緩衝液に溶解した。6.3lの結晶再溶解液には、125gのrMETaseが含まれ、比活性は50U/mgであった。
実施例７：rMETase結晶のカラムクロマトグラフィー−(2)
実施例６で得られた結晶再溶解液を、予め20mM Na-PB(pH7.2)で平衡化した5lのDEAE-Sepharose FF(ファルマシアバイオテク)カラムクロマトグラフィーに供した。0.1mM MPLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB(pH7.2)で洗浄した後、120mM NaCl、0.1mM PLP、0.01% 2-MEを含む20mM Na-PB(pH7.2)で溶出させた。rMETaseの比活性は52U/mgであった。得られた活性画分15lを分画分子量10kDa(ミリポア)の膜を用いて2.7lまで濃縮した。濃縮液には101gのrMETaseが含まれていた。この濃縮液2.7lのうち、900mlを予め0.01mM PLPを含む10mM Na-PB(pH7.2)で平衡化した18lのSephacryl S200 HR(ファルマシアバイオテク)カラムクロマトグラフィーに供した。この操作を3回実施した。得られた有効活性画分のrMETaseの比活性は52U/mgであり、80gのrMETaseが含まれていた。
表３に実施例５〜７の各操作後のrMETaseの比活性および回収率を示した。
配列番号：１
配列の長さ：３０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：DNA（センスプライマー）
配列：
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直線状
配列の種類：DNA（アンチセンスプライマー）
配列：
本発明のＬ−メチオニン γ−リアーゼ結晶の製造方法は、カラムクロマトグラフィーによる精製法と同等以上のレベルでＬ−メチオニン γ−リアーゼを精製することができる。結晶化による精製は、カラムクロマトグラフィーによる精製に比べて大量かつ経済的に目的物を精製できるので、本発明の結晶の製造方法は、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの工業的精製方法として有用である。
Claims (20)
- ポリエチレングリコールを用いるＬ−メチオニン γ−リアーゼ柱状結晶の製造方法において、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液にポリエチレングリコールを添加する前または添加した後に加温する第一工程、ただし加温前の温度が2℃〜15℃であり、加温後の温度が25℃〜40℃である、および無機塩を添加する第二工程を含むことを特徴とする方法。
- 無機塩が塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである請求項１記載の製造方法。
- 無機塩の終濃度が20mM〜500mMである請求項１記載の製造方法。
- ポリエチレングリコールが平均分子量7200以上のものである請求項１記載の製造方法。
- ポリエチレングリコールの終濃度が5%(W/V)〜25%(W/V)である請求項１記載の製造方法。
- ポリエチレングリコールの添加前に加温する請求項１記載の製造方法。
- ポリエチレングリコールの添加後に加温する請求項１記載の製造方法。
- ポリエチレングリコールの添加を加温の前および後に行う請求項１記載の製造方法。
- ポリエチレングリコールの添加後、加温前に夾雑物質を除去する工程をさらに含む請求項１、７または８記載の製造方法。
- 夾雑物質を除去する工程が硫酸アンモニウム存在下でポリエチレングリコールを添加することにより行われる請求項９記載の製造方法。
- Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液のＬ−メチオニン γ−リアーゼ濃度が４ｇ／ｌ〜３０ｇ／ｌである請求項１記載の製造方法。
- Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ含有溶液が陽イオン性高分子凝集剤により処理したものである請求項１記載の製造方法。
- 陽イオン性高分子凝集剤がポリエチレンイミンである請求項１２記載の製造方法。
- 陽イオン性高分子凝集剤の主成分がキトサンである請求項１２記載の製造方法。
- 陽イオン性高分子凝集剤がクリムーバーＩである請求項１２記載の製造方法。
- 請求項１記載の方法で得られたＬ−メチオニン γ−リアーゼ柱状結晶の再溶解、ポリエチレングリコール添加前または添加後の加温、および無機塩の添加の工程を１またはそれ以上繰り返し行うＬ−メチオニン γ−リアーゼ柱状結晶の製造方法。
- 請求項１記載の方法で得られたＬ−メチオニン γ−リアーゼ柱状結晶の再溶解、ポリエチレングリコール添加前または添加後の加温、および無機塩の添加の工程を１またはそれ以上繰り返し行うＬ−メチオニン γ−リアーゼ八面体結晶の製造方法。
- 請求項１〜１７のいずれかに記載の製造方法を含むＬ−メチオニン γ−リアーゼの精製方法。
- 請求項１〜１７のいずれかに記載の製造方法を実施した後にカラムクロマトグラフィーを行う請求項１８記載の精製方法。
- 請求項１８または１９のいずれかに記載の精製方法を含むＬ−メチオニン γ−リアーゼ製造方法。
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