CN1250476A - 制备L－甲硫氨酸γ－裂合酶晶体的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用聚乙二醇制备L－甲硫氨酸γ－裂合酶晶体的方法,特征在于包括向其中加入聚乙二醇之前或之后加热含有L－甲硫氨酸γ－裂合酶溶液的第一步和加入无机盐的第二步。

Description

制备L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体的方法
技术领域
本发明涉及制备用作抗肿瘤剂的L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体的制备方法，包含以上制备方法在内的纯化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法，以及通过以上制备方法可得到的重组L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体。
背景技术
L-甲硫氨酸γ-裂合酶(EC4.4.1.11)为这样的一种酶，其需要磷酸吡哆醛作为辅酶，并且催化L-甲硫氨酸或其衍生物的α，γ-脱离(elimination)和γ-置换，并且也催化S-置换的L-半胱氨酸或其衍生物的α，β-脱离和β-置换。已报导该酶从恶臭假单胞菌(Psendomonas putida)中得到分离和纯化(Nakayama，T.等.，生化年鉴138，421-424(1984))。最近，已发现L-甲硫氨酸γ-裂合酶具有抗肿瘤活性(WO94/11535)。并且，随着近年DNA重组技术的迅速发展，过去仅能从恶臭假单胞菌中获得极微数量的L-甲硫氨酸γ-裂合酶已有可能大量生产。(Inoue，H.等.，生物化学杂志117，1120-1125(1995))。
勿庸置疑，用作药物制品的药物应该是纯品，在过去，L-甲硫氨酸γ-裂合酶从恶臭假单胞菌细胞中提取并结合离子交换柱层析加以纯化(Nakayama，T等.，生物年鉴(Anal.Biochem)138，421-424(1984)，Lishko，VK等.，蛋白表达与纯化4，529-533(1993))。然而用上述方法制备的酶存在作为药品纯度低，难以大量提纯的问题。
作为制备蛋白晶体的方法，使用聚乙二醇的方法是众所周知的。有关L-甲硫氨酸γ-裂合酶，其结晶的方法已有报导(Esaki，N等.，酶学方法143，459-465(1987))结晶通过将L-甲硫氨酸γ-裂合酶与含有聚乙二醇的磷酸钾缓冲液混合并将混合物置于室温而进行(所谓的蒸气扩散法)。然而在该文中，将已预先通过柱层析纯化的高纯度L-甲硫氨酸γ-裂合酶用于结晶。而且，获得的晶体量很小(1.6mg)。
发明内容
从未经提纯、含有杂质的蛋白中制备大量晶体是困难的。即使这种结晶成功，多数因为晶体中仍然含有杂质，不能做为有效的提纯方法。目前，几乎还没有尝试过在该步骤的大规模工业化生产结晶。本发明旨在提供从未纯化的L-甲硫氨酸γ-裂合酶制备大量纯L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体的方法，以及包括该制备方法在内的纯化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法。
基于对上述目的进行深入研究的结果，本项发明者们发现了用聚乙二醇制备L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体的方法。即是说，第一步为在向其中加入聚乙二醇之前或之后加热含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液且第二步为加入无机盐，可在短时间里制备高度纯化的L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体。这样，本发明才得以完成。
在本发明中，L-甲硫氨酸γ-裂合酶意为由微生物如恶臭假单胞菌产生的天然L-甲硫氨酸γ-裂合酶和由重组DNA技术制备的重组L-甲硫氨酸γ-裂合酶中的任意一种或其二者。从工业批量制备的角度来看，重组L-甲硫氨酸γ-裂合酶是优选的。因此，虽然重组L-甲硫氨酸γ-裂合酶(之后也简略称为“rMETase”)用于本发明实施方案中的解释说明，但是天然L-甲硫氨酸γ-裂合酶也同样适用。
用于制备本发明晶体方法中的含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液意为含有未纯化或纯化L-甲硫氨酸γ-裂合酶溶液中的任意一种。此溶液的实例包括在下面步骤1中制备的粗酶溶液、含有未纯化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液以及通过用聚乙二醇去除杂质后而获得的溶液。然而，本发明并不局限于以上这些例子。
此外，阳离子性高分子促凝剂通过结合阳离子基团至核酸或内毒素的阴离子基团上，使核酸或内毒素形成不溶性凝集物而被除去。促凝剂的实例包括聚乙烯亚胺或主要由脱乙酰壳多糖(优选为KurimoverI(栗田工业生产))所组成的阳离子性高分子促凝剂。然而，本发明中所说的阳离子性高分子促凝剂并不局限于这些实例。
附图简述
图1为显示rMETase棱晶的照片。
图2为显示rMETase八面体晶体的照片。
图3描述制备新的rMETase表达质粒pMGLTrc03的策略。
实行本发明的最佳方式1.含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶(rMETase)溶液的制备
(1)rMETase表达菌株的培养
根据Inoue，H.等在生物化学杂志117，1120-1125(1995)中所述的方法制备其中插入有L-甲硫氨酸γ-裂合酶结构基因的表达质粒。更为具体地，通过以下方法制备表达质粒，包括将含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶基因的DNA片段插入pKK223-3、pPL-λ或其它载体中，这些载体具有用于rMETase基因在大肠杆菌中有效表达的合适启动子如lac、tac、trp、trc或λPL及Shine-Dalgarno(SD)序列，或将其插入具有翻译起始密码子ATG的pKK233-2、pTrc99A或其它ATG载体中。将表达质粒导入适当的宿主细胞如大肠杆菌菌株HB101、JM103、JM105、JM109、C600、MV1184、DH1、DH5、DH5α、BL21等中。因此，得到并培养rMETase表达菌株。
(2)细胞残渣的排除
培养后，将湿菌体在20到55℃，优选约42℃下用高压匀浆器(APV-Gaulin)破碎细胞，向其中加入阳离子高分子促凝剂。这一步骤的阳离子高分子促凝剂，最好用聚乙烯亚胺或Kurimover I等。将阳离子高分子促凝剂调节至0.05-0.5％(w/v)，优选0.1-0.2％(w/v)的终浓度后，用阳离子高分子促凝剂于5到25℃、1到20分钟去除细胞残渣从而获得rMETase的粗酶液。除了用阳离子高分子促凝剂去除(残渣)外，也可用高压匀浆器打碎细胞，离心并将上清液在55到65℃下加热处理1到10分钟而去除细胞残渣。将获得的粗酶液通过硫酸铵盐析并离心。将获得的沉淀溶解于缓冲液，优选为磷酸缓冲液中，既获得含有未纯化L-甲硫氨酸γ-裂合酶(rMETase)的溶液。
(3)杂质的去除
随后，将终浓度从5到25％(w/v)，优选从约8到12％(w/v)的聚乙二醇加入含有未纯化rMETase的溶液中。将混合物于大约2℃到15℃，优选4℃搅拌约10分钟至120分钟，优选约60分钟并离心，以去除杂质。所使用的聚乙二醇，优选其平均分子量不低于7,200(如，PEG 6000等)。在此步骤，预先加入硫酸铵使其终浓度为8到10％，优选为10％的饱和浓度，可使rMETase的溶解性变得更高，从而最大限度减少rMETase的丢失。2. rMETase晶体的制备
(1)加热含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液，优选为按上述步骤1去除了其中杂质的溶液，并加入聚乙二醇。加热可在添加聚乙二醇之前或之后进行。而且，聚乙二醇也可在加热之前和之后分开加入。在加热前后分开加入聚乙二醇的情况下，加温前的聚乙二醇添加可与为了上述去除杂质的目的而进行的聚乙二醇添加合并进行。
加热后的温度约为25℃到40℃，优选约30℃到32℃。一般地，通过降温促进结晶。在本发明，出人意料地通过在此阶段加热来促进L-甲硫氨酸γ-裂合酶的结晶。这是本发明最重要的要点之一。
可根据蛋白结晶的常规方法进行聚乙二醇的加入。在优选的实施方案中，加入具有不少于约7,200分子量的聚乙二醇，使其终浓度达到约5到25％(w/v)，然后搅拌，溶解。在加热前后分别加入聚乙二醇时，聚乙二醇的总浓度应调至上述的终浓度。而且，在使用步骤1中制备的含有rMETase溶液的情况下，因为溶液中尚含有为去除杂质而添加的聚乙二醇，应算上这部分聚乙二醇的浓度，使添加入聚乙二醇后的浓度达到上述终浓度。
(2)然后，加入无机盐以得到rMETase的棱晶。所用无机盐，适宜的有碱性金属盐如氯化钠和氯化钾等，其中氯化钠是尤其优选的。无机盐优选以约20mM至500mM，更为优选约100mM至200mM的终浓度使用。无机盐在10分钟至2小时，优选在20分钟加入。
尽管不搅拌也能形成晶体，但最好在操作上述的步骤(1)和(2)时，一边搅拌一边进行。用于结晶的溶液，pH可维持在7到8，最好保持在7.2到7.5。
通过上述步骤析出的rMETase晶体，可通过离心分离出来。
获得的rMETase晶体具有高纯度，并且热源物质被减少。该晶体可在低温下长期保存。
而且，通过重复步骤(1)和(2)，可获得含有极少量污染蛋白的高度纯化的rMETase。通过此结晶而获得的rMETase与通过联合数种柱层析而没有经过结晶获得的rMETase具有相同或更高的纯度。此外，通过包括本发明结晶制备法在内的提纯法(例如，本发明结晶化后再实行离子交换柱层析、分子筛柱层析等柱层析提纯法)，不仅可得到高度纯化，杂质蛋白极少的rMETase晶体，还可使其中含有的热源物质，达到做为医药品许可的极低浓度。
在工业上，很显然此结晶方法较层析方法具有经济优势。因此，包括本发明的晶体制备方法在内的提纯L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法在工业上是非常有用的提纯法。
通过本发明制备方法而可制备的重组型L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体为新型的。本发明也提供这些新型的晶体。根据本发明制备的rMETase晶体，再溶解后，与天然蛋白晶体具有相同的酶促活性，并且相互间氨基末端氨基酸序列也是一致的。
通过列出下面的实施例和参考例，本发明得到更为详细的解释，这些实施例并不限制本发明的范围。参考例1：rMETase表达菌株的培养
将L-甲硫氨酸γ-裂合酶结构基因插入市售的表达载体(Amersham Pharmacia Biotech)，构建出rMETase表达质粒pYH301(Inoue，H等，生物化学杂志117，1120-1125(1995))。将此质粒导入大肠杆菌JM109，以用作rMETase表达菌株。将本菌接种于LB培养基进行种子培养后，将细胞于市售的Terrific培养基(Funakoshi，东京，日本)中，在37℃下培养24小时。参考例2：粗酶溶液的制备
离心300ml参考例1中获得的重组体培养液，收集约20g湿细胞，并悬浮于140ml的细胞破碎用缓冲液(1.3mM磷酸吡哆醛(以下简略为PLP)、0.01％二硫苏糖醇(以下简略为DTT)、100mM磷酸钠缓冲液(以下简略为Na-PB)，pH7.2)，然后破碎细胞。离心破碎细胞后的悬液，获得146ml的上清液(rMETase比活性：20U/mg)。将上清液于60℃下加热5分钟，冷却后，再次离心，得到136ml上清液，作为粗酶溶液(rMETase比活性：30U/mg)。或者，用聚乙烯亚胺于10℃下处理破碎细胞后的155ml悬液5分钟后离心，得到136ml上清液，作为粗酶溶液(rMETase比活性：20U/mg)。参考例3：rMETase酶活性测定法
按如下测定rMETase的酶活性。用稀释缓冲液(10μM PLP，1mM EDTA·2Na·2H2O，0.1g/l(±)-二硫苏糖醇，0.5g/l吐温80，100mM磷酸钾缓冲液(以下简称K-PB，pH8.0))稀释在上面参考例中获得的rMETase溶液，以制备稀释酶溶液。将作为底物的L-甲硫氨酸溶液预先于37℃下保温5分钟(25mM L-甲硫氨酸，10μM PLP，100mM K-PB(pH 8.0))，向其中加入50μl稀释酶溶液，并将混合物于37℃下反应10分钟。加入100μl三氯乙酸(500g/L)溶液(以下称为TCA液)以终止酶的反应。将获得的0.8ml酶反应液、1.6ml乙酸缓冲液(1M乙酸钠/乙酸，pH5.0)和0.6mlMBTH液(1g/L的3-甲基-2-苯并噻唑腙(benzothiazolinonehydrazone)HCl·H2O)的混合物于50℃下反应30分钟，然后冷却至室温。通过测定320nm处的吸光度(E320样品)测定产生的α丁酮酸盐的量。另外，将上述加入稀释酶液和TCA溶液的顺序颠倒过来，进行类似地测定，作为空白(E320空白)。1个酶单位(U)定义为1分钟产生1μmol α丁酮酸盐的酶量。用下式计算：
酶活性(U/ml)＝(1.15·3.00/15.74/0.05/0.80/10)·(ΔE+2(ΔE)2)
            ＝0.5480·(ΔE+2(ΔE)2)(其中，ΔE：E320样品-E320空白，1.15：酶反应液的量(ml)，3.00：MBTH反应液的量(ml)，15.74：吖嗪(azine)衍生物的分子消光系数(mM)，0.05：酶反应样品液的量(ml)，0.80：MBTH反应样品液的量(ml)，10：反应时间(分钟))。参考例4：通过柱层析提纯rMETase
根据参考例2的方法，破碎细胞并加热处理，获取粗酶液。将270ml含有10μM PLP和0.01％2-巯基乙醇(2-ME)的去离子水加入136ml粗酶溶液中，将该液调至pH7.2，然后应用至已用10mMNa-PB(pH7.2)平衡的100ml DEAE-TOYOPEARL 650C柱上(Tosoh公司，东京，日本)。用含有50mM NaCl，10μM PLP及0.01％2-ME的10mM Na-PB(pH7.2)洗柱。然后用含有10mMNaCl，10μM PLP和0.01％2-ME的10mM Na-PB(pH7.2)洗脱酶。rMETase的比活性大约为46U/mg，将100ml含有10μM PLP和0.01％2-ME的10mM Na-PB(pH8.0)加入到约100ml获得的活性级份中，并将混合物调至pH8.0，然后应用至50ml用50mMNa-PB(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(AmershamPharmacia Biotech)上。用含有80mM NaCl，10μM PLP及0.01％2-ME的50mM Na-PB(pH8.0)洗柱。然后用含有120mMNaCl，10μM PLP及0.01％2-ME的50mM Na-PB(pH8.0)洗脱酶。rMETase的比活性约50U/mg。用具有100kDa分子量截断大小(cutting size)的滤膜(Millipore)将得到的活性馏份浓缩到10ml。将10ml浓缩液应用至400ml以10mM Na-PB(pH7.2)(含10μMPLP)平衡的Sephacryl S-200HR柱(Pharmacia Biotech)上。得到的rMETase有效活性级份的比活性为52U/mg。在每个纯化步骤后得到的rMETase比活性和产率列于表1中。表1
    纯化步骤   比活性(U/mg)   产率(％)
破碎细胞后上清液     20     100
粗酶液     30     85
DEAE-TOYOPEARL     46     65
DEAE-Sepharose FF     50     50
浓缩液     50     48
Sephacryl S-200 HR     52     40
实施例1：rMETase晶体的制备-(1)
将58g固体硫酸铵(65％饱和度)逐渐加入136ml根据参考例2制备的粗酶溶液中。在加入硫酸铵的过程中用氨水将溶液调至pH7.2，使其溶解后，从该溶液中将酶盐析出。离心收集沉淀并贮存于冰箱中。将此沉淀溶解于40ml溶解缓冲液(500μM PLP，0.05％2-ME和100mM Na-PB pH7.2)中，并逐渐加入4g PEG 6,000(10％(w/v))，然后将此混合物于4℃搅拌60分钟。离心去除不溶性物质后，将溶液于4℃下再搅拌16小时。将得到的溶液加热至30℃并向其中加入0.8g PEG 6,000(2％(w/v))同时搅拌以溶解PEG 6,000。将2ml 4M的NaCl溶液加入该溶液中并搅拌。将此混合物进一步于30℃下搅拌60分钟以制备棱晶。进一步于4℃下搅拌20小时后，离心得到rMETase的棱晶(图1)。实施例2：rMETase晶体的制备-(2)
将上面实施例1中得到的棱晶溶解于40ml溶解缓冲液中。将该溶液于30℃下加热并逐渐向此溶液中加入4g的PEG 6,000(10％(w/v))，同时搅拌以溶解。将2ml 4M的NaCl溶液加入该溶液中，并将混合物于4℃搅拌20小时。离心收集出现的八面体晶体。将这些晶体再次溶解于35ml溶解缓冲液中。将该溶液加热至30℃后，向其中加入3.5g的PEG 6,000(10％(w/v))，同时搅拌以溶解。然后，边搅拌边加入1.75ml 4M NaCl溶液，并于4℃下进一步搅拌该混合物20小时。离心收集析出的八面体晶体(图2)。
在上面实施例1和2中得到的这些rMETase晶体，被高度纯化，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时表现为单一条带。这证明了本发明的结晶方法具有很高的提纯效果。此外，这样获得的rMETase的比活性、纯度和产率与通过联合上述参考例4中提及的离子-交换柱层析的纯化方法而获得rMETase的比活性、纯度和产率相同或比其更高。实施例3：rMETase晶体的柱层析
将实施例2中得到的晶体溶解于60ml溶解缓冲液中。将此溶液应用至50ml用20mM Na-PB(pH7.2)平衡的DEAE-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech)柱层析中。用含有50mM NaCl，10μM PLP和0.01％ 2-ME的20mM Na-PB(pH7.2)洗柱。然后用含有100mM NaCl，10μM PLP及0.01％ 2-ME的20mMNa-PB(pH7.2)洗脱酶。rMETase的比活性为约52U/mg。用具有10kDa截断大小的滤膜(Millipore)将此得到的活性馏份浓缩为10ml。将10ml此浓缩液应用至400ml的用10mM含有10μM PLP的Na-PB(pH7.2)平衡的Sephacryl S-200HR(Pharmacia Biotech)柱层析中。得到rMETase有效活性级份的比活性为52U/mg。
在实施例1到3中每次操作后得到的rMETase比活性与产率列于表2中。
                                          表2
    纯  化步  骤 加热处理 聚乙烯亚胺处理
  Sp.act.(U/mg)   产量(％)   Sp.act.(U/mg)   产率(％)
实施例1 细胞破碎后的上清液     20     100     20     100
粗酶液     30     85     20     92
未纯化的rMETase液     34     78     28     85
RMETase棱晶     52     70     52     77
实施例2 RMETase八面体晶体     52     65     52     72
实施例3 DEAE-Sepharose FF     52     55     52     61
浓缩液     52     53     52     59
Sephacryl S-200 HR     52     48     52     53
Sp.act.：比活性实施例4：新表达质粒的制备
用含有rMETase基因的pYH301作为模板，通过PCR方法克隆去除起始密码子的rMETase基因(rMETase(-ATG))。将1μl 10pmol的有义引物(序列号1：5′-CCCGGTACCA CGGCTCCAACAAGCTCCCAG-3′)，1μl 10pmol的反义引物(序列号2：5′-CTCGAGACGG GTTCAGGCAC TCGCCTT-3′)和8μl的dNTP混合溶液(每种2.5mM)及一片Ampli WaxTM(Perkin-Elmer公司制，CT，美国)混合并将此得到的混合物于77℃加热7分钟，然后于20℃冷却3分钟。然后，加入0.5μl 5U/μl Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo公司制，Kyoto，日本)及大约1μl 1μg/μl的pYH301，且用蒸馏水将此溶液的量补充至90μl，然后加入10μl由聚合酶试剂盒附带的PCR扩增缓冲液。
其后，用DNA热循环仪(PJ2000型：Perkin-Elmer公司制)进行PCR扩增。反应设定为每个循环94℃下1分钟，55℃下1.5分钟及72℃下2分钟，进行20轮循环。将得到的混合物于72℃下加热7分钟，然后置于室温中。将凝固石蜡层下面的全部水相于琼脂糖凝胶上电泳。用DNA回收系统SpinBindTM(Takara Shuzo公司制)回收扩增的DNA片段。
将2μl收集到的DNA片段，1μl pMOSBlue T-载体(Amersham Pharmacia Biotech)及17μl蒸馏水加入到Ready-To-GoTM T4 DNA连接试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)，并将混合物于16℃下孵育45分钟，然后连结转化大肠杆菌DH5菌株，将转化子孵育于含有氨苄青霉素的琼脂培养基中。从转化子中筛选含有以相反方向插入rMETase基因和氨苄青霉素抗性基因的质粒并命名为LMGL/T-载体。
下面，将LMGL/T-载体的rMETase(-ATG)插入质粒pATG3131起始密码子的下游，该质粒含有trc启动子、SD序列、起始密码子(ATG)、5SrrnBT1T2终止子及四环素抗性基因。首先，用限制酶EcoRI消化5μg的pATG3131，用绿豆核酸酶平滑化并用限制酶XbaI消化，然后于琼脂糖凝胶上电泳，从而用SpinBind回收3.3kbp的片段。另一方面，用限制酶KpnI消化10μg LMGL/T-载体，用DNA补平试剂盒(Takara Shuzo公司制)平滑化并用限制酶XbaI消化，然后于琼脂糖凝胶上电泳以回收1.2kbp的片段。将这两种片段加入Ready-To-GoTM T4 DNA连接试剂盒并于16℃下孵育45分钟，且连结然后转化大肠杆菌JM109。将此转化子孵育于含有四环素的琼脂培养基上，从中筛选含有目的基因的质粒并命名为pMGLTrc03(图3)。实施例5：rMETase晶体的制备-(3)
将rMETase表达质粒pMGLTrc03导入大肠杆菌JM109中，制备了rMETase表达菌株。将得到的菌株培养于作为前种子培养基(preseedmedium)的LB培养基中，并进一步培养于作为种子培养基的含有5％葡萄糖的LB培养基中，然后通过三个30-l的发酵罐于28℃下，将这些细胞培养于含有4％甘油的Terrific培养基(Funakoshi)中24小时。离心(Alfa Laval公司制)得到的重组体培养液57kg，收集到19kg浓缩的菌体细胞，向其中加入17.4kg含有24.57g EDTA、10.34gPLP和3.3g DTT的100mM Na-PB液(pH7.5)。将得到的细胞悬液于28℃下加热，然后用高压匀浆器(APV-Gaulin公司制)进行破碎。破碎后的温度为42℃。在大约5分钟内将2.18L 5％的Kurimover I溶液加入36.6kg得到的破碎后溶液中，搅拌混合物20分钟。离心38.8kg得到的Kurimover I处理溶液，得到37.4kg粗酶溶液。这种粗酶液含有160g rMETase，其比活性为30U/mg。
将8.86kg的硫酸铵逐渐加入粗酶溶液(40％饱和度)，用氨水将溶液调至pH7.2，用于溶解硫酸铵。通过盐析沉淀酶并保存于冰箱中。通过离心分离器(Sharples公司制)收集沉淀，将沉淀物溶解于3.6L溶解缓冲液(0.5mM PLP，0.05％2-ME，20mM Na-PB，pH7.2)中，向其中加入0.2L的溶解了150g硫酸铵的溶解缓冲液。用氨水将此溶液调至pH7.2，并冷却至4℃，向其中逐渐加入1.6L含有540g PEG6,000的溶解缓冲液，并于4℃下搅拌该混合液60分钟。离心去除不溶性物质后，搅拌并逐渐加入5.4L含有650g PEG 6,000的溶解缓冲液。然后将得到的混合物加热至32℃，接着用20分钟时间边搅拌边加入540ml 4M的NaCl溶液。进一步于32℃搅拌60分钟产生rMETase的棱晶。进一步于4℃下搅拌20小时以充分产生晶体，最后离心收集得到rMETase的棱晶。实施例6：rMETase晶体的制备-(4)
将上面获得的棱晶溶解于6L溶解缓冲液中，离心去除其中的不溶性物质，然后逐渐向其中加入2.4L含有760g PEG 6,000的溶解缓冲液，并将得到的混合物加热至32℃。然后，用20分钟时间边搅拌边加入420ml 4M的NaCl溶液，接着将此混合物于32℃下搅拌60分钟。进一步于4℃搅拌20小时产生rMETase的八面体晶体。离心将晶体收集并溶解于6L溶解缓冲液中。6.3L的晶体再溶解液中含有125g的rMETase，比活性为50U/mg。实施例7：结晶后用柱层析对rMETase的纯化-(2)
将实施例6中得到的晶体再溶解液用于以20mM Na-PB(pH7.2)平衡的DEAE-Sepharose FF(Amersham Pharmacia Biotech)柱层析中。用含有0.1mM PLP和0.01％2-ME的20mM Na-PB(pH7.2)洗柱。用含有120mM NaCl，0.1mM PLP和0.01％2-ME的20mM Na-PB(pH7.2)洗脱酶。其比活性为52U/mg。用具有10kDa分子量截断大小的滤膜(Millipore)将得到的15L活性级份浓缩至2.7L。浓缩液含有101g rMETase。将900ml的浓缩液用于18L以含有0.01mM PLP的10mM Na-PB(pH7.2)平衡的Sephacryl S-200 HR(Amersham Pharmacia Biotech)柱层析。此操作进行三次。获得的有效活性级份含有80g rMETase其比活性为52U/mg。
实施例5到7中每次操作后rMETase的比活性及产率列于表3中。表3
    纯  化步  骤     Kurimover I处理
  Sp.act.(U/mg)   产率(％)
实施例5 细胞裂解后的上清液     24     100
粗酶液     25     99
未纯化的rMETase液     40     89
rMETase棱晶     52     80
实施例6 RMETase八面体晶体     52     77
实施例7 DEAE-Sepharose FF     52     64
浓缩液     52     62
Sephacryl S-200 HR     52     50
Sp.act.：比活性序列表序列号：1长度：30个核苷酸类型：核酸链型：单链拓扑学：线性种类：DNA(有义引物)序列：CCCGGTACCA CGGCTCCAAC AAGCTCCCAG序列号：2长度：27个核苷酸类型：核酸链型：单链拓扑学：线性种类：DNA(反义引物)序列：CTCGAGACGG GTTCAGGCAC TCGCCTT
工业应用性：
本发明的用于制备L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体的方法，可纯化L-甲硫氨酸γ-裂合酶至由柱层析得到该产品相同水平或比其更高的水平。与层析相比，用结晶的纯化方法可经济而大规模地提纯目的化合物。因此，本发明的制备晶体的方法作为L-甲硫氨酸γ-裂合酶的工业提纯法是有用的。

Claims (25)

1.利用聚乙二醇制备L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体的方法，其特征在于包括在向其中加入聚乙二醇之前或之后加热含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶溶液的第一步和加入无机盐的第二步。
2.权利要求1的方法，其中加热前的温度约2℃到15℃，加热后的温度约25℃到40℃。
3.权利要求1的方法，其中所述的无机盐为氯化钠或氯化钾。
4.权利要求1的方法，其中无机盐的终浓度约20mM到500mM。
5.权利要求1的方法，其中所述的聚乙二醇具有不少于约7,200的平均分子量。
6.权利要求1的方法，其中的聚乙二醇终浓度约5％(w/v)到25％(w/v)。
7.权利要求1的方法，其中所述的加热在所述加入聚乙二醇之前进行。
8.权利要求1的方法，其中的加热在所述加入聚乙二醇之后进行。
9.权利要求1的方法，其中所述的加入聚乙二醇在所述的加热之前和之后进行。
10.权利要求1、8或9的方法，其进一步包括在所述的加入聚乙二醇之后且其所述的加热之前去除杂质的步骤。
11.权利要求10的方法，其中所述的去除杂质通过在硫酸铵存在下加入聚乙二醇进行。
12.权利要求1的方法，其中的含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液中L-甲硫氨酸γ-裂合酶的浓度约4g/l到30g/l。
13.权利要求1的方法，其中所述的含有L-甲硫氨酸γ-裂合酶的溶液用阳离子高分子促凝剂处理。
14.权利要求13的方法，其中所述的阳离子高分子促凝剂为聚乙烯亚胺。
15.权利要求13的方法，其中的阳离子高分子促凝剂的主要成分为脱乙酰壳多糖。
16.权利要求13的方法，其中所述的阳离子高分子促凝剂为KurimoverI。
17.权利要求1的方法，其中重复一次或更多次一系列以下步骤，包括重新溶解L-甲硫氨酸γ-裂合酶，在加入聚乙二醇之前或之后加热溶液及加入无机盐。
18.包括权利要求1到17中任一项的方法的纯化L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法。
19.权利要求18的纯化方法，其中的柱层析在权利要求1到17中任一项的方法之后进行。
20.包括权利要求18或19纯化方法的制备L-甲硫氨酸γ-裂合酶的方法。
21.通过权利要求1到17中任一项的方法而制备的重组L-甲硫氨酸γ-裂合酶晶体。
22.示于图3中的L-甲硫氨酸γ-裂合酶表达质粒pMGLTrc03。
23.权利要求22的质粒，其宿主为大肠杆菌。
24.含有重组L-甲硫氨酸γ-裂合酶溶液的制备方法，包括以下步骤：
将所述的权利要求22的L-甲硫氨酸γ-裂合酶表达质粒导入宿主中；培养该宿主；以及破碎该宿主。
25.权利要求24的方法，其中细胞破碎的温度约20℃到55℃。
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