JP3752457B2 - ヒト・dnaミスマッチ修復蛋白 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドならびにポリペプチドの使用、さらにかかるポリヌクレオチドならびにポリペプチドの製造に関する。より詳細には、本発明ポリペプチドは原核細胞のmutL4遺伝子のヒト・相同体であり、以後、hMLH1、hMLH2およびhMLH3という。
【0002】
【従来の技術】
原核生物および真核生物の両方において、DNAミスマッチ修復遺伝子は、DNA複製および遺伝学的組み換えの間に生じるエラーの修正において際立った役割を果たしている。現在までのところ、イー・コリ(E.coli)のメチル特異的DNAミスマッチ修復系は最もよく理解されているDNAミスマッチ修復系である。イー・コリにおいて、この修復経路は、ミューテーター遺伝子mutS、mutL、mutHおよびuvrDの生成を包含している。これらの遺伝子のうちいずれか1つの変異体はミューテーター表現型を示すであろう。MutSは、この修復プロセスを開始するDNAミスマッチ結合蛋白であり、uvrDはDNAヘリカーゼであり、MutHは、半メチル化GATC配列の非メチル化鎖を切開する潜在的なエンドヌクレアーゼである。MutL蛋白はミスマッチDNA−MutS−MutH複合体を認識し、これに結合してMutH蛋白のエンドヌクレアーゼ活性を増大させる。非メチル化DNA鎖がMutHにより切断された後、1本鎖DNA結合蛋白、DNAポリメラーゼIII、エキソヌクレアーゼIおよびDNAリガーゼがこの修復プロセスの完了に必要とされる(モドリッチ,ピー(Modrich P.)、アニュ・レビュ・ジェネティクス(Annu.Rev.Genetics)、第25巻:229〜253頁(1991年))。
【0003】
イー・コリのMutLHS系のエレメントは、原核生物および真核生物の進化の過程で保存されているように思われる。遺伝学的研究分析は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は細菌のMutLHS系と同様のミスマッチ修復系を有することを示唆している。エス・セレビシエ(S.cerevisiae)において、少なくとも2つのMutL相同体であるPMS1およびMLH1が報告されている。それらのうちのいずれかの変異は有糸分裂ミューテーター表現型を導く(プロラ(Prolla)ら、モレ・セル・バイオロ(Mol.Cell.Biol.)第14巻:407〜415頁(1994年))。少なくとも3つのMutS相同体、すなわち、MSH1、MSH2、およびMSH3がエス・セレビシエにおいて見いだされている。MSH2遺伝子の崩壊は核変異率に影響する。エス・セレビシエにおける変異体MSH2、PMS1、およびMLH1は、ジヌクレオチド繰り返し配列の拡張および濃縮速度を増大させることが見いだされている(ストランド(Strand)ら、ネイチャー(Nature)、第365巻:274〜276頁(1993年))。
【0004】
肺癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、結腸癌および胃癌のごとき多くのヒトの腫瘍は繰り返しDNA配列の不安定性を示す(ハン(Han)ら、キャンサー(Cancer)、第53巻:5087〜5089頁(1993年);チボドー(Thibodeau)ら、サイエンス(Science)、第206巻:816〜819頁(1993年);リシンガー(Risinger)ら、キャンサー(Cancer)、第53巻:5100〜5103頁(1993年))。この現象は、おそらくDNAミスマッチ修復の欠乏がこれらの癌の原因であろうということを示唆する。
【0005】
最近まで、ヒトにおけるDNAミスマッチ修復系についてはほとんどわかっていないが、MutS遺伝子のヒト・相同体がクローン化され、遺伝性非ポリポーシス結腸癌(HNPCC)の原因であることがわかった(フィッシェル(Fishel)ら、セル(Cell)第75巻:1027〜1038頁(1993年)およびリーチ(Leach)ら、セル、第75巻:1215〜1225頁(1993年))。当初は、HNPCCは、ジヌクレオチド不安定性を引き起こす染色体2p16における遺伝子座に関連しているとされた。次いで、DNAミスマッチ修復蛋白(MutS)相同体がこの遺伝子座に位置し、いくつかの保存的領域におけるC→T過渡的変異が特異的にHNPCC患者において観察されることが報告された。遺伝性非ポリポーシス結腸癌はヒトの最もありふれた遺伝病の1つであり、西洋世界においては200人に1人が罹患している。
【0006】
遺伝性結腸癌はいくつかの遺伝子座における変異から生じうることが示されている。染色体5上の遺伝子に関連している家族性結腸腺腫症ポリポーシス(APC)は遺伝性結腸癌のごく一部の原因である。遺伝性結腸癌はガードナー症候群(Gardner's syndrome)、ターコット症候群(Turcot's syndrome)、ポイツ−ジェガーズ症候群(Peutz-Jaeghers syndrome)および幼若結腸ポリポーシスにも関連している。さらに、遺伝性非ポリポーシス結腸癌はすべてのヒトの癌の5%を占める。すべての異なるタイプの家族性結腸癌は遺伝の優性常染色体モードによって伝達されることが示されている。
染色体2の短いアームへのHNPCCの局在化以外に、第2の遺伝子座がHNPCC素因に関連していた(リンドホルム(Lindholm)ら、ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)第5巻:279〜282頁(1933年))。染色体3の短いアーム上の多形性マーカーとその疾病遺伝子座との間において強力な関連が示された。
この知見は、おそらく、種々のDNAミスマッチ修復蛋白上の変異がヒトの遺伝性の疾患および癌の発生に重大な役割を果たしていることを示唆する。
【0007】
HNPCCは、結腸、子宮内膜および他の器官の癌の明らかな常染色体優性的に遺伝する素因によって臨床的に特徴づけられる(リンチ,エイチ・ティー(Lynch,H.T.)ら、ガストロエンテロロジー(Gastroenterology)、第104巻:1535〜1549頁(1993年))。特定の家族性HNPCCにおける疾病に関連している2p16および3p21〜22におけるマーカーの同定により、そのメンデル則の性質が明確に確認された(ペルトマキ,ピー(Peltomaki,P.)ら、サイエンス(Science)、第260巻:810〜812頁(1993年))。HNPCC患者由来の腫瘍は、単純な繰り返し配列(マイクロサテライト(microsatellites)の広範な変化により特徴づけられる(アールトネン,エル・エイ(Aaltonen,L.A.)ら、サイエンス第260巻:812〜816頁(1993年))。このタイプの遺伝学的不安定性は、もともと、部分集団中(散在性結腸直腸癌の12ないし18%)において観察された(上記文献)。細菌および酵母における研究により、DNAミスマッチ修復遺伝子の欠陥はマイクロサテライトの同様の不安定性を引き起こす可能性があり(レビンソン,ジー(Levinson,G.)およびグートマン,ジー・エイ(Gutman,G.A.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nuc.Acids Res.)、第15巻:5325〜5338頁(1987年))、ミスマッチ修復の欠損はHNPCCの原因であると仮定された(ストランド,エム(Strand,M.)ら、ネイチャー第365巻:274〜276頁(1993年))。HNPCC腫瘍細胞系からの抽出物の分析により、ミスマッチ修復が実際に欠損しており、この推定を明確に指示するものであることが示された(パーソンズ,アール・ピー(Parsons,R.P.)ら、セル(Cell)、第75巻:1227〜1236頁(1993年))。すべての家族性HNPCCが同一の遺伝子座に関連しているわけではなく、そして酵母において少なくとも3つの遺伝子が同様の表現型を作る可能性があるので、他のミスマッチ修復遺伝子がHNPCCの同じケースにおいて役割を果たしている可能性があると思われる。
【0008】
hMLH1は、酵母・mutL−相同体yMLH1と最も相同性が高いが、hMLH2およびhMLH3は酵母・mutL−相同体yPMS1に対してより高い相同性を有する(hMLH2およびhMLH3は、酵母・PMS1遺伝子に対するそれらの相同性のために、時々、明細書中でhPMS1およびhPMS2という)。hMLH1以外にも、染色体2q32上のhMLH2遺伝子および染色体7p22上のhMLH3遺伝子は、HNPCC患者の生殖系列において変異していることが見いだされた。このことは、HNPCCに関与する遺伝子数を2倍にし、この疾病の比較的高い発生率の説明の一助となる。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑みると、ヒト・DNA修復蛋白およびかかる蛋白をコードするDNA(RNA)、さらに組み換え法によるかかる蛋白の製造方法に対する必要性が生じている。また、ヒト・DNA修復遺伝子における変化を調べる方法も必要となっている。
【0010】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明の1の態様によれば、hMLH1、hMLH2およびhMLH3である新規な推定上の成熟ポリペプチド、ならびに生物学的に活性があり診断上または治療上有用なフラグメント、アナログおよびそれらの誘導体が提供される。本発明ポリペプチドはヒト起源である。
本発明のもう1つの態様によれば、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNAを包含する、かかるペプチド、並びに生物学的に活性があり診断上または治療上有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする単離核酸分子が提供される。
本発明のさらにもう1つの態様によれば、hMLH1、hMLH2およびhMLH3配列に特異的にハイブリダイズするに十分な長さの核酸分子からなる核酸プローブが提供される。
【0011】
本発明のさらにもう1つの態様によれば、hMLH1、hMLH2または
hMLH3核酸配列を含んでいる組み換え原核および/または真核宿主細胞を、該蛋白の発現を促進する条件下で培養し、次いで、該蛋白を回収することからなる、組み換え法によるかかるポリペプチドの製造方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、治療目的、例えば、癌の治療のための、かかるポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用方法が提供される。
【0012】
本発明のもう1つの態様によれば、hMLH1、hMLH2またはhMLH3核酸配列およびかかる核酸配列によりコードされる蛋白における変異に関連した疾病の診断方法および該疾病に対する感受性の診断方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、DNAの科学的研究、合成、およびDNAベクターの製造に関するインビトロ目的の、かかるポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用方法が提供される。
本発明のこれらのおよび他の態様は、本明細書の教示から当業者に明らかである。
【0013】
以下の図面は本発明具体例の説明であり、請求の範囲により包含される本発明の範囲を限定する意味はない。
図1−6は、ヒト・DNA修復蛋白hMLH1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。373自動DNAシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems,Inc.)を用いて配列決定を行った。配列決定の精度は97%より高いと予想される。
図7−14は、hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
図15−21は、hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
図22−24は、MACAW(バージョン1.0)プログラムを用いて、エス・セレビシエ(S.cerevisiae)のPMS1(yPMS1)の推定アミノ酸配列と、hMLH2ならびにhMLH3アミノ酸配列とを並べたものである。保存性のあるブロックのアミノ酸は大文字で示され、それらのペア−ワイズ・スコア(pair-wise scores)の平均上に影をつけた。
図25は、hMLH2の変異分析である。(A)HNPCC患者のCWにおける転写停止変異に関するIVSP分析およびマッピング。コドン1から369までの翻訳(レーン1)、コドン1から290までの翻訳(レーン2)、コドン1から214までの翻訳(レーン3)。CWは患者CWのcDNAから翻訳され、NORは正常個体のcDNAから翻訳される。矢じりは、潜在的な停止変異により切断されたポリペプチドを示す。矢印は分子量マーカーをキロダルトンで示す。(B)CWの配列分析により、コドン233におけるCのTへのトランジション変異が示される(矢印により示す)。レーン1およびレーン3は対照患者由来の配列;レーン2はCWのゲノムDNA由来の配列である。各配列混合物からのddA混合物を隣のレーンに負荷してddC、ddD、およびddT混合物との比較を容易にする。
図26は、hMLH3の変異分析である。(A)患者GCからのhMLH3のIVSP分析。レーンGCは個体GCの線維芽細胞由来;レーンGCxは患者GCの腫瘍由来;レーンNOR1および2は正常対照個体由来である。FLは全長の蛋白を示し、矢じりは生殖系列の切断されたポリペプチドを示す。矢印は分子量マーカーをキロダルトンで示す。(B)患者GCからのDNAについてのPCR分析は、障害が腫瘍細胞中の両方のhMLH3対立遺伝子に存在することを示す。cDNA中の欠損領域の5'側、3'側、またはその中間(MID)を増幅するプライマーを用いて増幅を行った。レーン1,患者GCの線維芽細胞由来のDNA;レーン2,患者GCの腫瘍由来のDNA;レーン3,正常対照患者由来のDNA;レーン4,DNA鋳型なしの反応。矢印は分子量を塩基対で示す。
【0014】
本発明の1の態様によれば、図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)の推定アミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする単離核酸(ポリヌクレオチド)、またはATCC寄託物75649、75651、75650として寄託されたクローン(1994年1月25日寄託)のcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。 ATCC寄託物75649は、本明細書ではhMLH1と呼ばれるヒト・DNA修復蛋白をコードする全長の配列を含むcDNAクローンであり;ATCC寄託物75651は、本明細書ではhMLH2と呼ばれるヒト・DNA修復蛋白をコードする全長の配列を含むcDNAクローンであり;ATCC寄託物75650は、本明細書ではhMLH3と呼ばれるヒト・DNA修復蛋白をコードする全長の配列を含むcDNAクローンである。
【0015】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、心臓、肺、前立腺、脾臓、肝臓、胆嚢、胎児の脳および精巣組織から調製された1種またはそれ以上のライブラリーから得てもよい。hMLH1のポリヌクレオチドはヒト・胆嚢cDNAライブラリーから発見された。さらに、N末端においてhMLH1と同一である6種のcDNAクローンが、ヒト・小脳、8週目の胚、胎児心臓、HSC172細胞およびジャーケット細胞(Jurket cell)cDNAのライブラリーから得られた。hMLH1遺伝子は、細菌および酵母のmutL蛋白に対して相同性を示す85kD蛋白をコードする756アミノ酸の読み取り枠を含んでいる。しかしながら、その5'非翻訳領域は、オリゴヌクレオチドを設計するために非翻訳領域を伸長させる目的で胎児心臓から得たcDNAクローンから得られた。
【0016】
hMLH2遺伝子はヒト・T細胞リンパ種cDNAライブラリー由来であった。hMLH2のcDNAクローンは、イン−フレーム(in-frame)停止コドンが両側に隣接している2796塩基対の読み取り枠を含むことが同定された。それは酵母のPMS1ファミリーに構造的に関連している。それは934アミノ酸残基からなる蛋白をコードする読み取り枠を含んでいる。該蛋白は、蛋白全体に関して、酵母・PMS1と27%の同一性および82%の類似性という最高度の相同性を示す。
3種のPMS関連蛋白の中で有意な相同性のある第2の領域はカルボキシル末端であり、コドン800〜900にある。この領域は、酵母・PMS1蛋白hMLH2ならびにhMLH3蛋白との間において、それぞれ、22%および47%の相同性を有するが、これらの蛋白と他の酵母・mutL相同体であるyMLH1との間においてはごくわずかな相同性しか観察されなかった。
【0017】
hMLH3遺伝子はヒト・子宮内膜腫瘍cDNAライブラリー由来であった。hNLH3クローンは2586塩基対の読み取り枠を有すると同定された。それは酵母のPMS2ファミリーに構造的に関連している。それは862アミノ酸残基からなる蛋白をコードする読み取り枠を含んでいる。該蛋白は、蛋白全体に関して、酵母・PMS2と32%の同一性および66%の類似性という最高度の相同性を示す。
イー・コリ由来のmutL相同体において保存されているGFRGEALドメインが、hMLH1、hMLH2およびhMLH3のアミノ酸配列において保存されていることは、hMLH1、hMLH2およびhMLH3の推定上の同定に関して重要である。
【0018】
本発明ポリヌクレオチドはRNA形態またはDNA形態であってよく、該DNAはcDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを包含する。DNAは2本鎖または1本鎖であってよく、1本鎖がコーディング鎖であっても非コーディング鎖であってもよい。成熟ポリペプチドをコードするコーディング配列は図1−6、7−14および15−21(配列番号:1)に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列と同じであってもよく、あるいは遺伝コードの余剰もしくは縮重の結果として、コーディング配列が、図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)のDNAまたは寄託されたcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードしている別のコーディング配列であってもよい。
図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)の成熟ポリペプチドまたは寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドに関するコーディング配列のみ;成熟ポリペプチドに関するコーディング配列(ならびに所望によりさらなるコーディング配列も)およびイントロンもしくは成熟ポリペプチドに関する配列の5'および/または3'側の非コーディング配列のごとき非コーディング配列を包含する。
よって、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチド、並びにさらなるコーディング配列および/または非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【0019】
さらに本発明は、図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託されたクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は天然に存在するポリヌクレオチド対立遺伝子変異体または天然に存在しないポリヌクレオチドの変異体であってよい。
よって、本発明は、図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)に示すものと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは寄託されたクローンのcDNAによりコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びに図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)に示すものと同じ成熟ポリペプチドまたは寄託されたクローンのcDNAによりコードされるのと同じ成熟ポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードするかかるポリヌクレオチドの変異体を包含する。かかるヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体および付加もしくは挿入変異体を包含する。
上記のごとく、ポリヌクレオチドは、図1−6、7−14および15−21(配列番号:1、3および5)に示すコーディング配列または寄託されたクローンのコーディング配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコーディング配列を有していてもよい。当該分野において知られているように、対立遺伝子変異種は、1個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有していてもよいポリヌクレオチド配列のもう1つの形態であり、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。
【0020】
さらに本発明ポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にイン−フレーム(in-frame)で融合したコーディング配列を有していてもよい。マーカー配列は、例えば、細菌宿主の場合にマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を行うためのpQE−9ベクターにより提供されるヘキサ−ヒスチジンタグ(hexa-histidine tag)であってもよく、あるいは、例えば、哺乳動物宿主、例えばCOS−7細胞を用いる場合には、マーカー配列がヘマグチニン(HA)タグであってもよい。HAタグは、インフルエンザ・ヘマグルチニン蛋白由来のエピトープに対応する(ウィルソン,アイ(Wilson,I.)ら、セル、第37巻:767頁(1984年))。
【0021】
さらに本発明は、少なくとも50%、好ましくは70%の配列間同一性がある場合に、上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。詳細には、本発明は、厳密な条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書の用語「厳密な条件」は、少なくとも95%、好ましくは少なくとも97%の配列間同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい具体例において、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図1−6、7−14および15−21(配列番号:1、3および5)のcDNAまたは寄託されたcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチドをコードする。
【0022】
本明細書にいう寄託物とは、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持されるものを意味する。これらの寄託物は当業者の便宜のためのみに提供され、寄託物が35U.S.C.§112の下で必要とされるという承認ではない。寄託された材料中に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、参照により本明細書に記載されているものと見なされ、本明細書の配列の記載との矛盾のイベントにおいて支配的である。該寄託材料の製造、使用または販売にはライセンスが必要でありうるし、かかるライセンスをここで認める。
【0023】
さらに本発明は、図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、または寄託されたcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにかかるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。
図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)のポリペプチドまたは寄託cDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合、「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、かかるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を有するポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ蛋白部分の開裂により活性化されて活性成熟ポリペプチドを生じうるプロ蛋白を包含する。 本発明ポリペプチドは、組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであってよく、好ましくは組み換えポリペプチドである。
図1−6、7−14および15−21(配列番号:2、4および6)のポリペプチドまたは寄託cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)1個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存的もしくは非保存的アミノ酸残基(好ましくは保存性残基)で置換されているもの(かかる置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされていてもよく、あるいはされていなくてもよい)、あるいは(ii)1個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延ばす化合物のごとき別の化合物(例えば、ポリエチレングリコール)に融合しているもの、であってもよい。かかるフラグメント、誘導体およびアナログは本明細書の教示から、当業者の範囲内にあると思われる。
好ましくは、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離形態であり、好ましくは均一に精製される。
【0024】
用語「単離」は、物質がその元の環境(例えば、天然に存在する場合には天然環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されなが、天然系において同時に存在する物質のいくつかまたはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部でありうるし、さらに/またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部でありうるし、さらにかかるベクターまたは組成物がその天然環境の一部分でないという点で単離されうる。
【0025】
本発明はまた、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺伝学的に操作された宿主細胞、および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に関する。
例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい本発明ベクターで宿主細胞を遺伝学的に操作する。例えば、ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であってもよい。プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、あるいはhMLH1、hMLH2およびhMLH3遺伝子を増幅するのに適するように修飾された慣用的な栄養培地中で操作された宿主細胞を培養する。温度、pH等のごとき培養条件は、発現用に選択された宿主細胞に関して以前用いられたものであり、当業者に明らかであろう。
組み換え法によるポリペプチドの製造のために本発明ポリヌクレオチドを用いてもよい。よって、例えば、ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド発現のための種々の発現ベクターのいずれか1つに含有されていてもよい。かかるベクターは、染色体、非染色体および合成DNA配列、例えば、SV40誘導体;細菌プラスミド;ファージDNA;バキュロウイルス;酵母プラスミド;プラスミドならびにファージのDNAの組み合わせ由来のベクター;ワクチニア、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルスならびに偽狂犬病のごときウイルスDNAを包含する。しかしながら、宿主中で複製可能で製造可能である限り、他のいずれのベクターであっても使用できる。
種々の方法により適当なDNA配列をベクター中に挿入することができる。一般的には、当該分野において知られた方法によりDNA配列を適当な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入する。かかる方法および他の方法は当業者の範囲内であると思われる。
発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令するための適当な発現調節配列(プロモーター)に作動可能に結合している。かかるプロモーターの代表例として、LTRもしくはSV40プロモーター、イー・コリのlacもしくはtrp、ラムダファージPLプロモーター、および原核細胞または真核細胞あるいはそのウイルス中で遺伝子の発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。また、発現ベクターは、翻訳介しのためのリボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含んでいる。また、ベクターが、発現を増幅するための適当な配列を含んでいてもよい。
さらに、好ましくは、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供する1個またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、真核細胞培養についてジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、あるいはイー・コリにおいてはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。
【0026】
上記の適当なDNA配列ならびに適当なプロモーターもしくは調節配列を含有するベクターを用いて適当な宿主を形質転換して、宿主が蛋白を発現しうるようにする。
適当な宿主の代表例としては、イー・コリ(E.coli)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)のごとき細菌細胞;酵母のごとき真菌細胞;ドロソフィラ(Drosophila)S2ならびにスポドプテラ(Spodoptera)Sf9のごとき昆虫細胞;CHO、COSもしくはボウズ・メラノーマ(Bowes melanoma);アデノウイルス;植物細胞等が挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲内であると思われる。
より詳細には、さらに本発明は、上記で広く述べた1またはそれ以上の配列からなる組み換え構築物を包含する。該構築物はプラスミドまたはウイルスベクターのごときベクターからなり、その中へ本発明配列が順方向または逆方向に挿入されている。この具体例の好ましい態様において、さらに構築物は、例えば、該配列に作動可能に結合したプロモーターを包含する調節配列からなる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、市販されている。以下のベクターを、実施例を用いて提供する。細菌のもの:pQE70、pQE60、pQE−9(キアジェン・インコーポレイテッド(Qiagen,Inc.)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(ストラタジーン(Stratagene));ptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(ファルマシア(Pharmacia))。真核細胞のもの:pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(ストラタジーン)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(ファルマシア)。しかしながら、宿主中で複製可能で製造可能である限り、他のいずれのベクターであっても使用できる。
CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択可能マーカーを有する他のベクターを用いて、プロモーター領域をいずれの所望遺伝子からであっても選択することができる。2つの適当なベクターはpKK232−8およびpCM7である。特別に命名された細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびTRPを包含する。真核プロモーターは、CMV即時初期、HSVチミジンキナーゼ、初期ならびに後期SV40、レトロウイルス由来のLTRs、およびマウス・メタロチオネイン−Iを包含する。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者の通常のレベルである。
【0027】
さらなる具体例において、本発明は、上記構築物を含有する宿主細胞に関する。該宿主細胞は、哺乳動物のごとき高等真核細胞であってもよく、あるいは酵母細胞のごとき下等真核細胞でってもよく、また、宿主細胞は細菌細胞のごとき原核細胞であってもよい。宿主細胞中への構築物の導入を、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストランによるトランスフェクション、またはエレクトロポーレーション(デイビス,エル(Davis,L.)、ディブナー,エム(Dibner,M.)、バティー,アイ(Battey,I.)、ベイシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Basic Methods in Molecular Biology)(1986年))により行うことができる。
宿主細胞中の構築物を慣用的方法で使用して組み換え配列によりコードされた遺伝子産物を製造することができる。別法として、慣用的ペプチド合成装置により、本発明ポリペプチドを合成的に製造することもできる。
【0028】
適当なプロモーターの調節下において、成熟蛋白を、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現させることができる。本発明DNA構築物由来のRNAを用い、無細胞翻訳系を用いてかかる蛋白を製造してもよい。原核および真核宿主について用いる適当なクローニングおよび発現ベクターは、サムブルック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング;ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、第2版、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)、N.Y.(1989年)により記載されており、参照により該開示を本明細書に記載されているものと見なす。
本発明ポリペプチドをコードしているDNAの高等真核生物による転写を、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大させる。エンハンサーはDNAのシス作用性エレメントであり、通常は、約10ないし300bpであり、プロモーターに作用してその転写を増大させる。例は、複製開始点の後期側の100ないし270bpのSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。
一般的には、組み換え発現ベクターは、複製開始点および宿主細胞の形質転換を可能にするイー・コリのアンピシリン耐性遺伝子ならびにエス・セレビシエのTRP1遺伝子のごとき選択可能マーカー、および下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含んでいる。かかるプロモーターは、3−ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、α−因子、酸ホスファターゼ、または特に熱ショック蛋白をコードするオペロン由来であってもよい。異種構造配列を、翻訳開始ならびにターミネーション配列とともに適当なフェーズ(phase)中に集める。所望により、異種配列が、例えば、発現組み換え産物の安定化または精製簡単化のごとき所望の特徴を付与するN末端同定ペプチドを含んでいる融合蛋白をコードしていてもよい。
【0029】
所望蛋白をコードする構造DNA配列を適当な翻訳開始ならびにターミネーションシグナルとともに、機能的プロモーターを伴った作動可能なリーディングフェーズ(reading phase)中に挿入することにより、細菌での使用に有用な発現ベクターを構築する。ベクターは、1個またはそれ以上の表現型の選択可能マーカーおよびベクターの維持を確実なものにし、所望であれば宿主中での増幅を可能にする複製開始点からなるであろう。形質転換に適する原核宿主は、イー・コリ、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、サルモネラ・ティフィムリウムおよびシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属の種々の種を包含するが、他のものも選択の対象でありうる。
代表的であるが限定的でない例において、細菌での使用に有用なベクターは、選択可能マーカーおよびよく知られたクローニングベクターpBR322(ATCC37017)の遺伝エレメントよりなる市販プラスミド由来の細菌の複製開始点からなる。かかる市販ベクターは、例えば、pKK223−3(スゥエーデン、ウプサラ(Uppsala)のファルマシア・ファイン・ケミカルズ(Pharmacia Fine Chemicals))およびGEM1(アメリカ合衆国、ウィスコンシン州、マジソン(Madison)のプロメガ・バイオテク(Promega Biotech))を包含する。これらのpBR322「骨格」部分を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と結合する。
適当な宿主株の形質転換、次いで、適当な細胞密度に至る宿主株の増殖後、適当な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)により選択プロモーターを誘導し、適当時間細胞を培養する。
典型的には、細胞を遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、次いで、得られた粗抽出物をさらなる精製のために取っておく。
凍結−融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を包含するいずれの慣用的な方法によっても蛋白発現に用いる微生物細胞を破壊することができ、かかる方法は当業者によく知られている。
【0030】
種々の哺乳動物細胞培養系を用いて組み換え蛋白を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例は、グルツマン(Gluzman)、セル、第23巻:175頁(1981年)により記載されたサル・腎臓線維芽細胞のCOS−7細胞系、およびC適合ベクターを発現させる能力のある他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターならびにエンハンサー、および必要とされるいずれかのリボゾーム結合部位、ポリアデニレーション部位、スプライスドナーならびにアクセプター部位、転写ターミネーション配列、および5'フランキング非転写配列からなるであろう。SV40スプライス由来のDNA配列、およびポリアデニレーション部位を用いて必要な非転写遺伝エレメントを提供してもよい。
【0031】
硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する方法により、組み換え細胞培養物からポリペプチドを回収し精製することができる。成熟蛋白の配置の完成において必要に応じて蛋白再生工程を用いることができる。最後に、最終精製工程として高品質液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いることができる。
本発明ポリペプチドは当然に精製された生成物であってもよく、あるいは化学合成法の生成物であってもよく、あるいは原核もしくは真核宿主から組み換え法により製造されてもよい(例えば、培養された細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞)。組み換え製造法に用いる宿主に応じて、本発明ポリペプチドはグリコシレーションされていてもよく、あるいはされていなくてもよい。
【0032】
本発明のさらなる態様において、ガン、詳細には、遺伝性のガンに対する感受性の決定方法が提供される。よって、ヒト・mutLの相同体であるヒト・修復蛋白、さらに詳細には本明細書に記載のヒト・修復蛋白における変異はガンに他する感受性を示すものであり、かかるヒト・相同体をコードする核酸配列をかかる感受性の確認のためのアッセイに用いてもよい。よって、例えば、該アッセイを用いて本明細書記載のヒト・DNA修復蛋白における欠失、切断、挿入、フレームシフト等のごとき変異を決定してもよく、かかる変異はガン素因の指示となるものである。
例えば、DNA配列決定アッセイにより変異を確認してもよい。血液試料(これに限定しない)を包含する組織試料をヒト・患者から得る。試料を当該分野のいて知られた方法により処理してRNAを得る。mRNA上に存在するポリアデノシン伸長部分にハイブリダイズするポリチミジン残基からなるオリゴヌクレオチドプライマーを添加することにより第1鎖cDNAをRNA試料から合成する。逆転写酵素およびデオキシヌクレオチドを添加して第1鎖DNAの合成を行う。本発明DNA修復蛋白のDNA配列に基づいてプライマー配列を合成する。一般的には、プライマー配列は15ないし30個、好ましくは18ないし25個のヒト・DNA修復遺伝子の連続した塩基からなる。表1は、hMLH1に基づくオリゴヌクレオチドプライマー配列の実例を示す。該プライマーをペアー(1の「センス」鎖および1の「アンチセンス鎖」)にして用いてPCR法(サイキ(Saiki)ら、ネイチャー、第324巻:163〜166頁(1986年))により患者からのcDNAを増幅して、かかる蛋白に対する患者のcDNAの3種の重複フラグメントを得る。また表1は好ましいプライマー配列ペアーのリストを示す。次いで、遺伝子全体のうちの約200塩基対の各ポイントにおけるcDNAの塩基対に対応するように合成されたプライマー配列のセットを用いて、重複フラグメントをジデオキシ法に供する。
【0033】
【表1】
*図1−6のヌクレオチド配列に沿った位置に対応する数であり、ATGは1である。
【0034】
好ましいプライマー配列ペアーは:
758、1313
1319、1320
660、1909
725、1995
1680、2536
1727、2610
表1に示すヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号:7から配列番号:19までのものを表す。
【0035】
表2は、使用できるオリゴヌクレオチドプライマー配列の代表例(センスおよびアンチセンス)を掲載するものであり、好ましくは、プライマー配列の全セットを配列決定に用いて、患者のDNA修復蛋白における変異がどの部分に存在するかを決定する。プライマー配列は15ないし30塩基の長さであり、好ましくは18ないし25塩基の間の長さである。次いで、患者から決定された配列の情報を変異していない配列と比較して変異が存在するかどうかを決定する。
【0036】
【表2】
*図1−6のヌクレオチド配列に沿った位置に対応する数であり、ATGは1である。表2に示すヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号:20から配列番号:33までのものを表す。
【0037】
もう1つの具体例において、表2のプライマー配列をPCR法に用いて変異領域を増幅することができた。該領域を配列決定し、かかる変異遺伝子素因を予想するための診断として用いることができた。
別法として、変性剤の存在下または不存在下におけるゲル中のDNAフラグメントの電気泳動度の変化を検出することにより行われるDNA配列の相違に基づく遺伝学的試験により、本発明遺伝子における変異に対するアッセイを行ってもよい。高分解能ゲル電気泳動により、小規模の配列欠失および挿入を可視化することができる。特異的融点または部分的融点によってゲル中の異なる位置で異なるDNAフラグメントの移動が妨害される変性ホルムアミドグラジエントゲルにより、異なる配列のDNAフラグメントを識別してもよい(例えば、メイヤーズ(Meyers)ら、サイエンス、第230巻:1242頁(1985年)参照)。
RNaseおよびS1プロテクションのごときヌクレアーゼプロテクションアッセイまたは化学的開裂法(例えば、コットン(Cotton)ら、PNAS,USA、第85巻:4397〜4401頁(1985年))により、特定の位置における配列の変化を明らかにしてもよい。RNase消化または融点の相違により、完全にマッチした配列をミスマッチの2本鎖から識別することができる。
よって、ハイブリダイゼーション、RNaseプロテクション、化学的開裂、ウェスタンブロット分析、直接的DNA配列決定または制限酵素の使用(例えば、制限フラグメント長多型性(RFLP))およびゲノムDNAのサザンブロッティングのごとき方法によって、特定のDNA配列の検出を行うことができる。
より慣用的なゲル電気泳動および配列決定のほかに、インシトゥ(in situ)分析により変異を検出することもできる。
【0038】
ポリペプチドを用い、かかるポリペプチドのインビボ(in vivo)発現により癌を治療し、あるいは癌を予防してもよく、これを、しばしば、「遺伝子治療」という。
よって、例えば、患者からの細胞をエクスビボ(ex vivo)でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いて操作し、次いで、該ポリペプチドで治療すべき患者に該操作された細胞を提供する。例えば、本発明ポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子を用いることにより、当該分野において知られた方法により細胞を操作してもよい。
同様に、例えば、当該分野において知られた方法により、インビボでのポリペプチド発現よってに細胞をインビボで操作してもよい。当該分野において知られているように、本発明ポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子の生産用プロデューサー細胞を、インビボでの細胞の操作およびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与してもよい。かかる方法による本発明ポリペプチド投与のためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者に明らかであるはずである。例えば、細胞の操作用の発現ビヒクルはレトロウイルス以外のものであってもよく、例えば、適当な送達ビヒクルと組み合わせた後でインビボでの細胞の操作に用いられるアデノウイルスであってもよい。
【0039】
本明細書において同定された各cDNA配列またはその一部分を、ポリヌクレオチド試薬として、多様な方法で使用することができる。該配列を特定の細胞タイプにおける特定のmRNAの存在に関する診断プローブとして該配列を用いることができる。さらに、遺伝学的連関分析(多形性)における使用に適した診断プローブとしてこれらの配列を用いることができる。
また、本発明配列は染色体の同定に価値がある。該配列は特異的に標的化され、個々のヒト・染色体の特定の位置にハイブリダイズしうる。そのうえ、染色体上の特定部位を同定する必要が現在ある。実際の配列データ(繰り返し多型性)に基づくわずかの染色体マーキング試薬が染色体位置のマーキングに用いられている。本発明の染色体に対するDNAのマッピングは、それらの配列を疾病に関連した遺伝子と関連づけることにおける重要な第1工程である。
簡単に説明すると、cDNAからPCRプライマー(好ましくは、15〜25bp)を調製することにより、配列を染色体に対してマッピングすることができる。3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNA中の1個より多いエキソンをまたがないプライマーを迅速に選択し、かくして、増幅プロセスを複雑になる。次いで、これらのプライマーを、個々のヒト・染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに用いる。プライマーに対応するヒト・遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるであろう。
【0040】
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に対して特定のDNAを帰属するための迅速方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマ−について本発明を用いて、特定の染色体または大規模なゲノムクローンのプールからのフラグメントのパネルについて、同様の方法で、下位の位置決めを行うことができる。同様に用いてその染色体に対してマッピングできる他のマッピング法は、インシトゥ・ハイブリダイゼーション、標識フロー−ソーティッド染色体(labeled flow-sorted chromosomes)でのプレスクリーニングおよび染色体特異的cDNAライブラリー構築のためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションを包含する。
中期染色体スプレッド(spread)に対するcDNAクローンの蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)を用いて1工程で正確な染色体上の位置がわかる。この方法は500また600塩基程度の短いcDNAについて用いることができる。しかしながら、それよりも長いクローンは、ユニークな染色体上の位置に結合して簡単な検出のための十分なシグナルを発する可能性がある。FISHは、発現配列tagまたはESTが由来するクローンの使用を必要とし、クローンが長いほどよい。例えば、2000bpがよく、4000bpがよりよいが、4000bpよりも長いものは、合理的なパーセンテージで良好な結果を得るにはおそらく必要ないであろう。この方法のレビューのためには、バーマ(Verma)ら、ヒューマン・クロモゾームズ:ア・マニュアル・オブ・ベイシック・テクニックス(Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques)、パーガモン・プレス(Pergamon Press)、ニューヨーク(1988年)参照。
正確な染色体上の位置に配列をマッピングしたならば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝学的マップのデータを用いて修正することができる。かかるデータは、例えば、ブイ・マクシック(V.McKusick)、メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン(Mendelian Inheritance in Man)(ジョーンズ・ホプキンス(Jones Hopkins)大学のウェルチ・メディカルライブラリー(Welch Medical Library)からオンラインで利用できる)において見いだされる。次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病との間の関係を、連関分析(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により確認する。
次いで、罹患した個体と罹患していない個体との間のcDNAまたはゲノム配列の相違を決定することが必要である。変異が罹患した個体のいくつかまたはすべてにおいて観察され、正常個体には観察されない場合には、該変異は該疾病の原因である可能性がある。
現在の物理的マッピングの分解能および遺伝学的マッピング方法では、疾病に関連した1の染色体領域に正確に位置するcDNAは50ないし500個の原因遺伝子のうちの1個である可能性がある(このことは、1メガベースのマッピング分解能であり、20kbあたり1個の遺伝子であると仮定してのことである)。
【0041】
hMLH2遺伝子の5'領域を含むゲノムP1クローン(1670)を用いてhMLH2の局在化が示された。バンディング(banding)を明らかにするために対比染色されたヒト・中期染色体スプレッドの詳細な分析により、hMLH2遺伝子がバンド2p32中に存在することが示された。同様に、hMLH3遺伝子の3'領域を含むゲノムP1クローン(2053)を用いてhMLH3の存在位置が決定された。バンディング(banding)を明らかにするために対比染色されたヒト・中期染色体スプレッドの詳細な分析により、hMLH3が染色体7上の最も遠方のバンドであるバンド7p22中に位置することが示された。種々のゲノムクローンに関する分析により、hMLH3は、そのすべてが染色体7上にある関連遺伝子のサブファミリーのメンバーであることが示された。
【0042】
ポリペプチド、それらのフラグメントもしくは誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてそれらに対する抗体を得ることができる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。また、本発明は、キメラ、1本鎖、およびヒト化抗体、並びにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの生成物を包含する。当該分野において知られた種々の方法を、かかる抗体およびフラグメントの製造に使用してもよい。
ポリペプチドを動物に直接注射すること、またはポリペプチドを動物に、好ましくはヒトに投与することにより、本発明配列に対応するポリペプチドに対して生成された抗体を得ることができる。次いで、そのようにして得られた抗体はポリペプチド自体に結合するであろう。この方式で、ポリペプチドの一部分のみをコードする配列を用いてネイティブなポリペプチド全体に結合する抗体を得ることができる。次いで、かかる抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の製造に関して、連続細胞系培養により製造される抗体を提供するいかなる方法を用いてもよい。例は、ハイブリドーマ法(コーラー(Kohler)およびミルステイン(Milstein)、1975年、ネイチャー、第256巻:495〜497頁)、トリオーマ法、ヒト・B細胞ハイブリドーマ法(コズボール(Kozbor)ら、1983年、イミュノロジー・トゥデイ(Immunology Today)、第4巻:72頁)、およびヒト・モノクローナル抗体を製造するためのEBV−ハイブリドーマ法(コール(Cole)ら、1985年、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)、アラン・アール・リス・インコーポレイテッド(Alan R.Liss,Inc.)、77〜96頁)を包含する。
1本鎖抗体の製造に関して記載された方法(米国特許第4,946,778号)を適用して本発明免疫原性ポリペプチド生成物に対する1本鎖抗体を製造することができる。さらに、トランスジェニックマウスを用いて本発明免疫原性ポリペプチド生成物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。
【0043】
さらに本発明は、以下の実施例に関して記載されるであろう。しかしながら、本発明はかかる実施例に限定されないことが理解されるべきである。特記しないかぎり、すべての部または量は重量である。
以下の実施例の理解を容易にするために、しばしば出てくる方法および/または用語について説明する。
「プラスミド」は、大文字および/または数字が先行および/または後に続く小文字pで示される。本発明の出発プラスミドは市販の、制限されずに公的に入手可能な、または公表された方法により市販プラスミドから構築可能なものであってもよい。さらに、記載されたプラスミドと等価なプラスミドが当該分野において知られており、当業者に明らかである。
DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列においてのみ作用する制限酵素でのDNAの触媒的開裂をいう。本発明において用いられる種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、コファクターおよび他の必要物質は当業者に知られている。分析目的ならば、典型的には、約20μlの緩衝液中で、1μgのプラスミドまたはDNAフラグメントを約2ユニットの酵素とともに使用する。プラスミド構築用のDNAフラクションの単離を目的とするならば、典型的には、より大きな体積中で、5ないし50μgのDNAを20ないし250ユニットの酵素で消化する。特定の制限酵素に関する適当なバッファーおよび基質量は製造者により特定されている。37℃において約1時間のインキュベーション時間が通常用いられるが、提供者の指示に従って変更してもよい。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望フラグメントを単離する。
ゲデル,ディー(Goeddel,D.)ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第8巻:4057頁(1980年)により記載された8パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて開裂フラグメントのサイズ分離を行う。
【0044】
「オリゴヌクレオチド」は、化学合成されてもよい1本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。かかる合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸を有しておらず、よって、キナーゼ存在下でATP用いてリン酸を付加しなければ別のオリゴヌクレオチドに結合しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、デホスホリレーションされたフラグメントに結合するであろう。
「結合」は、2種の2本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスをいう(ティー・マニアティスら、上記文献、146頁)。特記しない限り、10ユニットのT4DNAリガーゼ(「リガーゼ」)を0.5μgのほぼ等モル量のDNAフラグメントに対して用い、既知バッファーおよび条件下でライゲーションを行ってもよい。
特記しない限り、グラハム,エフ(Graham,F.)およびファン・デル・エブ,エイ(Van der Eb,A.)、ウイロロジー(Virology)、第52巻:456〜457頁(1973年)の方法に記載のごとく形質転換を行う。
【0045】
【実施例】
実施例1
hMLH1の細菌での発現
まず、挿入フラグメントを合成するために、DNAの5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いてヒト・DNAミスマッチ修復蛋白hMLH1をコードする全長のDNA配列ATCC#75649を増幅する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは配列
CGGGATCCAT GTCGTTCGTG GCAGGG (配列番号:34)
を有し、開始コドンに続くhMLH1コーディグ配列の18個のヌクレオチドが続いているBamHI制限酵素部位を含んでいる。3'配列
GCTCTAGATT AACACCTCTC AAAGAC (配列番号:35)は、XbaI部位に対する相補的配列を含み、該遺伝子の末端である。制限酵素部位は細菌発現ベクターpQE−9(キアジェン・インコーポレイテッド(Quiagen,Inc.)、カリフォルニア州チャツワース(Chatsworth))上の制限酵素部位に対応している。該プラスミドベクターは抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IPTG調節可能プロモーター/オペレーター(P/O)、リボゾーム結合部位(RBS)、6−ヒスチジンタグ(6−His)および制限酵素クローニング部位をコードしている。pQE−9ベクターをBamHIおよびXbaIで消化し、次いで、細菌のRBSにおいて開始する読み取り枠を維持しているpQE−9ベクター中に該挿入フラグメントを結合する。次いで、結合混合物を用いて、多コピーのプラスミドpREP4を含んでいるイー・コリM15/rep4株(キアジェン・インコーポレイテッド)を形質転換する。
pREP4はlacIリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性(Kanr)を付与する。LBプレート上での増殖能により形質転換体を確認し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の両方を補足したLB培地中で一晩(O/N)液体培養する。該一晩培養物を用いて1:100ないし1:250の割合の大型培養に接種する。光学密度600(O.D.600)が0.4と0.6の間になるまで細胞を増殖させる。次いで、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を添加して最終濃度1mMとする。
【0046】
LacIリプレッサーを不活性化し、P/Oの読みを解除して遺伝子発現を増大させることによりIPTGは誘導を行う。細胞をさらに3ないし4時間増殖させる。次いで、遠心分離(6000xgで20分)により細胞を収穫する。カオトロピック剤である6Mグアニジン塩酸中で細胞ペレットを溶解させる。清澄化後、6−Hisタグを有する蛋白による固い結合を可能にする条件下(ホリウチ,イー(Horiuchi,E.)ら、ジェネティック・エンジニアリング、プリンシプル・アンド・メソッズ(Genetic Engineering,Principles and Methods)、第12巻:87〜98頁(1990年))でのニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーにより、可溶化したhMLH1をこの溶液から精製する。いくつかのプロトコール(ジェニック,アール(Jaenicke,R.)およびルドルフ,アール(Rudolph,R.)、プロテイン・ストラクチャー−ア・プラクティカル・アプローチ(Protein Structure-A Practical Approach)、IRLプレス(IRL Press)、ニューヨーク(1990年))によりGnHClからの蛋白の再生を行うことができる。まず、段階的透析を用いてGnHClを除去する。別法として、Ni−キレートカラムから単離された精製蛋白を第2のカラムに結合させることができ、直線的にGnHClを減少させるグラジエントを行う。カラムに結合し、次いで、250mMイミダゾール、150mM NaCl、25mM Tris−HCl pH7.5および10%グリセロールを含有するバッファーで溶離する間に蛋白は再生される。最後に、可溶性蛋白を、5mM重炭酸アンモニウムを含有する貯蔵用バッファーに対して透析する。精製蛋白をSDS−PAGEにより分析した。
【0047】
実施例2
hMLH1、hMLH2ならびにhMLH3の発現およびイー・コリmut1に対する相補の検出のための自発的変異アッセイ
pQE9hMLH1、pQE9hMLH2またはpQE9hMLH3/GW3733形質転換体を自発的変異アッセイに供した。さらにプラスミドベクターpQE9をAB1157(k-12,argE3 hisG4,LeuB6proA2 thr-1 ara-1 rpsL31 supE44 tsx-33)およびGW3733に形質転換して、それぞれ陽性および陰性対照として用いた。
約100ないし1000個のイー・コリを接種した15個の2ml培養物を、LBアンピシリン培地中37℃においてmlあたり2x108個まで増殖させた。各培養物10μlを希釈し、アンピシリンプレートに撒いて生細胞数を測定した。次いで、各培養物の残りの細胞をセイライン中に濃縮し、アルギニンを欠いた最少培地のプレートに撒いてArg−の復帰を測定した。表3において、等式(r/m)−In(m)=1.24(リー(Lea)ら、ジャーナル・オブ・ジェネティクス(J.Genetics)、第49巻:264〜285頁(1949年))に従って、分散あたりの変異株のメジアン数(r)から、培養物あたりの平均変異数(m)を計算した。1世代あたりの変異率をm/Nとして記録した。ここに、Nは培養物あたりの細胞の平均数を表す。
【0048】
【0049】
機能相補の結果は、ヒト・mutLは部分的にイー・コリのmutLミューテーター表現型を救済することを示し、ヒト・mutLは細菌発現系においてうまく発現されるのみならず細菌中で機能することが示された。
【0050】
実施例3
hMHL1の染色体マッピング
hMHL1に関するcDNAの5'末端における配列に従ってオリゴヌクレオチドプライマーのセットを設計した。このプライマーのセットは94kbセグメントに及ぶ。下記条件のセットにおいてこのプライマーのセットをポリメラーゼ連鎖反応に使用した:
30秒、95℃
1分、56℃
1分、70℃
このサイクルを32回繰り返し、次いで、70℃で5分のサイクルを1回行った。体細胞ハイブリッドパネル(ビオス・インコーポレイテッド(Bios,Inc.)のほかに、ヒト、マウス、およびハムスターを鋳型として用いた。8%ポリアクリルアミドゲルまたは3.5%アガロースゲルのいずれかにより反応物を分析した。染色体3に対応するヒト・ゲノムDNA試料および体細胞ハイブリッド試料中において94塩基対のバンドが観察された。さらに、種々の他の体細胞ハイブリッドゲノムDNAを用いてhMLH1遺伝子の染色体3pへの局在化が示された。
【0051】
実施例4
HNPCC血族におけるhMLH1遺伝子の変異の決定方法
HNPCC血族である人からの組織試料から得たRNAからcDNAを得て、該cDNAをPCRの鋳型として用いた。PCRはにはプライマー
GCATCTAGAC GTTTCCTTGG C (配列番号:36)
および
CATCCAAGCT TCTGTTCCCG (配列番号:37)
(図1−6のコドン1から394までを増幅);
GGGGTGCAGC AGCACATCG (配列番号:38)
および
GGAGGCAGAA TGTGTGAGCG (配列番号:39)
(図1−6(配列番号:2)のコドン326から729までを増幅);さらに
TCCCAAAGAA GGACTTGCT (配列番号:40)、
および
AGTATAAGTC TTAAGTGCTA CC (配列番号:41)
(図1−6(配列番号:2)のコドン602から756まで、および3’非翻訳配列の128ヌクレオチドを増幅)
を用いた。すべての分析に関して用いたPCR条件は、サン・シドランスキ,ディー(San Sidransky,D.)ら、サイエンス、第252巻:706頁(1991年)に記載の緩衝液中、95℃で30秒、52〜58℃で60〜120秒、次いで、70℃で60〜120秒を35サイクル行うことからなっていた。SequiThermポリメラーゼ(エピセンター・テクノロジーズ(Epicentre Technologies))を用い、5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマーを用いてPCR生成物を配列決定した。選択されたエキソンのイントロン−エキソン境界も決定し、ゲノムPCR生成物を分析して結果を確認した。次いで、変異と思われるものを有するPCR生成物をクローン化し、配列決定して直接配列決定の結果を確認した。ホルトン,ティー・エイ(Holton,T.A.)およびグラハム,エム・ダブリュ(Graham,M.W.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第19巻:1156頁(1991年)に記載のごとくPCR生成物をT−テイルドベクター(T-tailed vector)中にクローン化し、T7ポリメラーゼ(ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル(United States Biochemical))を用いて配列決定した。7つの血族からの罹患した個体はすべて、hMLH1遺伝子のコドン578から632までのヘテロ接合欠失を示した。これらの7つの血族のうちの5人は共通の祖先にたどり着くことができた。製造者により記載されたようにして、プライマーをT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識して、さらにゲノムDNAのPCR生成物を配列決定することにより、SequiThermポリメラーゼを用いてP1クローン(全hMLH1遺伝子を含むヒト・ゲノムP1ライブラリー(ジェノム・システムズ(Genome Systems))をサイクルシークエンシング(cycle-sequencing)することにより、コドン578〜632周辺のゲノム配列を決定した。コドン578〜632を含むエキソンを増幅するのに用いたプライマーは、
TTTATGGTTT CTCACCTGCC (配列番号:42)
および
GTTATCTGCC CACCTCAGC (配列番号:43)であった。PCR生成物は、該エキソンの上流の105bpのイントロンC配列およびエキソンの117bp下流を含んでいた。PCR生成物中の変異は該血族においては観察されず、ゆえにRNAにおける欠失は単なるスプライス部位の変異のせいではなかった。コドン578〜632は、上記血族における遺伝子生成物から欠失されている単一エキソンを構成することがわかった。このエキソンはいくつかの非常に保存的なアミノ酸を含んでいる。
【0052】
第2の家族(L7)において、上記プライマーを用いてPCRを行ったところ、コドン727の最初のヌクレオチド(nt)から始まる4bpの欠失が観察された。この欠失は166ヌクレオチド下流の新たなストップコドンを伴うフレームシフトにより起こり、hMLH1のカルボキシ末端の29個のアミノ酸が53個のアミノ酸(通常は、そのうちのいくつかは3'非翻訳領域のヌクレオチドによりコードされている)により置換された。
上記プライマーを用いるPCRの後、別の血族(L2516)において別の変異が見られ、該変異はコドン755と756との間の4bpの挿入からなっていた。この挿入はフレームシフトおよび正常なターミネーションコドンから102ヌクレオチド(34アミノ酸)下流までを含むORFの拡張を引き起こした。それゆえ、血族L7およびL2516両方における変異はhMLH1のC末端を変化させると予想された。
連関の研究には血族が少なすぎたので、コードされる蛋白のサイズの変化からhMLH1における可能な変異を決定した。hMLH1の組み合わせ転写−翻訳(coupled transcription-translation)に用いたプライマーは、図1−6のコドン1から394までについては
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGCA TCTAGACGTT TCCCTTGGC
(配列番号:44)
および
CATCCAAGCT TCTGTTCCCG (配列番号:45)であり、図1−6(配列番号:2)のコドン326から729までについては
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGGG GTGCAGCAGC ACATCG
(配列番号:46)
および
GGAGGCAGAA TGTGTGAGCG (配列番号:47)であった。得られたPCR生成物は、T7 RNAポリメラーゼによる転写に関するシグナルおよびそれらの5'末端における翻訳開始に関するシグナルを有していた。18の血族からの患者のリンパ芽球細胞由来のRNAを用いて2種の生成物(それぞれ、コドン1からコドン394まで伸長、またはコドン326からコドン729まで伸長)を増幅した。次いで、PCRプライマー中に取り込まれている転写−翻訳シグナルを用いてインビトロでPCR生成物を転写し、翻訳した。パウエル,エス・エム(Powell,S.M.)ら、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン(New England Journal of Medicine)、第329巻、1982頁(1993年)により記載されたようにして、かつ40マイクロCiの35S標識メチオニンを用いて行われた組み合わせ転写−翻訳反応において、PCR生成物を鋳型として用いた。試料を同じバッファーで希釈し、5分間煮沸し、次いで、10%から20%までのアクリルアミドのグラジエントを有するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。ゲルを乾燥し、ラジオグラフィーに供した。すべての試料は予想されたサイズのポリペプチドを示したが、異常に移動するポリペプチドが1つのケースにおいてさらに見いだされた。関連のあるPCR生成物の配列を決定し、コドン347の最初のヌクレオチドから始まる371bpの欠失を有することが見いだされた。この変化はヘテロ接合形態において存在し、コドン346の30ヌクレオチド下流の新たな停止コドンにおけるフレームシフトを生じ、かくして、観察された切断ポリペプチドが説明された。マイクロサテライト不安定性を示す4種の結腸腫瘍細胞系を試験した。4種のうち1種(細胞系H6)はこのアッセイにおいて正常ペプチドを示さず、27kdのところに移動する短い生成物のみを生産した。対応cDNAの配列を決定し、コドン252におけるCのAへのトランスバージョンを有することが見いだされ、セリンに代わってターミネーションコドンが生じていた。翻訳の分析と一致して、正常なCの位置におけるバンドはこの腫瘍由来のcDNAまたはゲノムDNAにおいて同定されず、それが機能的hMLH1遺伝子を欠くことが示された。
表4はこれらの配列決定アッセイの結果を示す。結腸癌の家族歴を有する人において欠失が見いだされた。より詳細には、10家族のうち9家族がhMLH1の変異を示した。
【0053】
【表3】
【0054】
実施例5
hMLH2の細菌での発現および精製
まず、挿入フラグメントを合成するために、DNA配列の5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いてhMLH2をコードするDNA配列ATCC#75651を増幅する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは配列
CGGGATCCAT GAAACAATTG CCTGCGGC (配列番号:48)を有しており、この配列は、開始コドンに続くhMLH2の17個のヌクレオチドが続いているBamHI制限酵素部位を含んでいる。3'配列
GCTCTAGACC AGACTCATGC TGTTTT (配列番号:49)はXbaI部位に対する相補的配列を含み、hMLH2の18個のヌクレオチドが後に続いている。制限酵素部位は細菌発現ベクターpQE−9(キアジェン・インコーポレイテッド(Qiagen,Inc.)、カリフォルニア州チャツワース(Chatworth))の制限酵素部位に対応している。pQE−9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IPTG−調節可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボゾーム結合部位(RBS)、6−Hisタグおよび制限酵素部位をコードしている。次いで、増幅された配列およびpQE−9をBamHIおよびXbaIで消化する。増幅された配列をpQE−9中に結合し、ヒスチジンタグおよびRBSをコードしている配列を伴うフレーム中に挿入する。次いで、結合混合物を用いて、多コピーのプラスミドpREP4を含んでいるイー・コリM15/rep4株(キアジェン・インコーポレイテッド)を形質転換する。pREP4はlacIリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性(Kanr)を付与する。LBプレート上での増殖能により形質転換体を確認し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の両方を補足したLB培地中で一晩(O/N)液体培養する。該一晩培養物を用いて1:100ないし1:250の割合の大型培養に接種する。光学密度600(O.D.600)が0.4と0.6の間になるまで細胞を増殖させる。次いで、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を添加して最終濃度1mMとする。
【0055】
LacIリプレッサーを不活性化し、P/Oの読みを解除して遺伝子発現を増大させることによりIPTGは誘導を行う。細胞をさらに3ないし4時間増殖させる。次いで、遠心分離(6000xgで20分)により細胞を収穫する。カオトロピック剤である6Mグアニジン塩酸中で細胞ペレットを溶解させる。清澄化後、6−Hisタグを有する蛋白による固い結合を可能にする条件下(ホリウチ,イー(Horiuchi,E.)ら、ジェネティック・エンジニアリング、プリンシプル・アンド・メソッズ(Genetic Engineering,Principles and Methods)、第12巻:87〜98頁(1990年))でのニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーにより、可溶化したhMLH1をこの溶液から精製する。いくつかのプロトコール(ジェニック,アール(Jaenicke,R.)およびルドルフ,アール(Rudolph,R.)、プロテイン・ストラクチャー−ア・プラクティカル・アプローチ(Protein Structure-A Practical Approach)、IRLプレス(IRL Press)、ニューヨーク(1990年))によりGnHClからの蛋白の再生を行うことができる。まず、段階的透析を用いてGnHClを除去する。別法として、Ni−キレートカラムから単離された精製蛋白を第2のカラムに結合させることができ、直線的にGnHClを減少させるグラジエントを行う。カラムに結合し、次いで、250mMイミダゾール、150mM NaCl、25mM Tris−HCl pH7.5および10%グリセロールを含有するバッファーで溶離する間に蛋白は再生される。最後に、可溶性蛋白を、5mM重炭酸アンモニウムを含有する貯蔵用バッファーに対して透析する。精製蛋白をSDS−PAGEにより分析した。
【0056】
実施例6
hMLH3の細菌での発現および精製
まず、挿入フラグメントを合成するためにDNA配列の5'および3'末端に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、hMLH3をコードするDNA配列ATCC#75650を増幅する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは配列
CGGGATCCAT GGAGCGAGCT GAGAGC (配列番号:50)を有しており、この配列は、開始コドンに続くhMLH3の18個のヌクレオチドが続いているBamHI制限酵素部位を含んでいる。3'配列
GCTCTAGAGT GAAGACTCTG TCT (配列番号:51)はXbaI部位に対する相補的配列を含み、hMLH3の18個のヌクレオチドが後に続いている。制限酵素部位は細菌発現ベクターpQE−9(キアジェン・インコーポレイテッド(Qiagen,Inc.)、カリフォルニア州チャツワース(Chatworth))の制限酵素部位に対応している。pQE−9は、抗生物質耐性(Ampr)、細菌の複製開始点(ori)、IPTG−調節可能プロモーターオペレーター(P/O)、リボゾーム結合部位(RBS)、6−Hisタグおよび制限酵素部位をコードしている。次いで、増幅された配列およびpQE−9をBamHIおよびXbaIで消化する。増幅された配列をpQE−9中に結合し、ヒスチジンタグおよびRBSをコードしている配列を伴うフレーム中に挿入する。次いで、結合混合物を用いて、多コピーのプラスミドpREP4を含んでいるイー・コリM15/rep4株(キアジェン・インコーポレイテッド)を形質転換する。pREP4はlacIリプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性(Kanr)を付与する。LBプレート上での増殖能により形質転換体を確認し、アンピシリン/カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離し、制限分析により確認する。所望の構築物を含有するクローンを、Amp(100μg/ml)およびKan(25μg/ml)の両方を補足したLB培地中で一晩(O/N)液体培養する。該一晩培養物を用いて1:100ないし1:250の割合の大型培養に接種する。光学密度600(O.D.600)が0.4と0.6の間になるまで細胞を増殖させる。次いで、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を添加して最終濃度1mMとする。
【0057】
LacIリプレッサーを不活性化し、P/Oの読みを解除して遺伝子発現を増大させることによりIPTGは誘導を行う。細胞をさらに3ないし4時間増殖させる。次いで、遠心分離(6000xgで20分)により細胞を収穫する。カオトロピック剤である6Mグアニジン塩酸中で細胞ペレットを溶解させる。清澄化後、6−Hisタグを有する蛋白による固い結合を可能にする条件下(ホリウチ,イー(Horiuchi,E.)ら、ジェネティック・エンジニアリング、プリンシプル・アンド・メソッズ(Genetic Engineering,Principles and Methods)、第12巻:87〜98頁(1990年))でのニッケル−キレートカラムクロマトグラフィーにより、可溶化したhMLH1をこの溶液から精製する。いくつかのプロトコール(ジェニック,アール(Jaenicke,R.)およびルドルフ,アール(Rudolph,R.)、プロテイン・ストラクチャー−ア・プラクティカル・アプローチ(Protein Structure-A Practical Approach)、IRLプレス(IRL Press)、ニューヨーク(1990年))によりGnHClからの蛋白の再生を行うことができる。まず、段階的透析を用いてGnHClを除去する。別法として、Ni−キレートカラムから単離された精製蛋白を第2のカラムに結合させることができ、直線的にGnHClを減少させるグラジエントを行う。カラムに結合し、次いで、250mMイミダゾール、150mM NaCl、25mM Tris−HCl pH7.5および10%グリセロールを含有するバッファーで溶離する間に蛋白は再生される。最後に、可溶性蛋白を、5mM重炭酸アンモニウムを含有する貯蔵用バッファーに対して透析する。精製蛋白をSDS−PAGEにより分析した。
【0058】
実施例7
遺伝性の癌におけるhMLH2およびhMLH3の変異の決定方法
ゲノムクローンの単離
hMLH2およびhMLH3のcDNA配列に関して選択されたプライマーを用いるPCRにより、ヒト・ゲノムP1ライブラリー(ジェノミック・システムズ・インコーポレイテッド(Genomic Systems,Inc.))をスクリーニングした。プライマー
AAGCTGCTCT GTTAAAAGCG (配列番号:52)
および
GCACCAGCAT CCAAGGAG (配列番号:53)
を用いてhMLH2に関して2個のクローンを単離し、133bpの生成物を得た。プライマー
CAACCATGAG ACACATCGC (配列番号:54)
および
AGGTTAGTGA AGACTCTGTC (配列番号:55)
を用いてhMLH3に関して3個のクローンを単離し、121bpの生成物を得た。ジゴキシゲニンデオキシ−ウリジン5'−トリホスフェート(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Manheim))を用いてゲノムクローンをニックトランスレーションし、ジョンソン,シー(Johnson,C.)ら、メソッズ・セル・バイオロ(Methods Cell Biol.)、第35巻:73〜99頁(1991年)に記載のごとくFISHを行った。発現されたhMLH3遺伝子座への特異的ハイブリダイゼーションのために大過剰のヒト・cot−1 DNAを用いてhMLH3プローブとのハイブリダイゼーションを行った。4,6−ジアミノ−2−フェニルインドールおよびヨウ化プロピジウムを用いて染色体を対比染色し、C−およびR−バンドの組み合わせを得た。クールド・チャージ−カップルド・デバイス・カメラ(cooled charge-coupled device camera)(フォトメトリクス(Photometrics)、アリゾナ州タクソン(Tucson))および可変励起波長フィルター(ジョンソン,シー(Johnson,C.)ら、ジェネティ・アナリ・テク・アプリ(Genet.Anal.Tech.Appl.)、第8巻:75頁(1991年)と組み合わせたトリプル−バンド・フィルター・セット(Triple-band filter set)(クロマ・テクノロジー(Chroma Technology)、バーモント州ブラットレボロ(Brattleboro))を用いて、正確なマッピングのために配置されたイメージを得た。イメージの収集、分析および染色体断片長の測定を、ISeeグラフィカル・プログラム・システム(ISee Graphical Program System)(イノビジョン・コーポレイション(Inovision Corporation)、ノースカロライナ州ダラム(Durham))を用いて行った。
【0059】
転写にカップリングした翻訳の変異の分析
IVSP分析の目的で、hMLH2遺伝子を3つの重複セグメントに分けた。第1のセグメントはコドン1から500までを含んでいたが、中間のセグメントはコドン270から755まで、最後のセグメントはコドン485からコドン933における翻訳終結部位までを含んでいた。第1のセグメントに関するプライマーは、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGAA CAATTGCCTG CGG
(配列番号:56)
および
CCTGCTCCAC TCATCTGC (配列番号:57)であり、中間のセグメントに関しては、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGAA GATATCTTAA AGTTAATCCG
(配列番号:58)
および
GGCTTCTTCT ACTCTATATG G (配列番号:59)であり、最後のセグメントに関しては、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGCA GGTCTTGAAA ACTCTTCG
(配列番号:60)
および
AAAACAAGTC AGTGAATCCT C (配列番号:61)であった。患者CWにおける停止変異をマッピングするために用いたプライマーは、すべて第1のセグメントと同じ5'プライマーであった。3'ネスティッドプライマーは:
AAGCACATCT GTTTCTGCTG
(配列番号:62)コドン1から369
ACGAGTAGAT TCCTTTAGGC
(配列番号:63)コドン1から290
CAGAACTGAC ATGAGAGCC
(配列番号:64)コドン1から214
であった。
【0060】
hMLH3の分析のために、hMLH3のcDNAを全長生成物として、あるいは2つの重複セグメントとして増幅した。全長のhMLH3に関するプライマーは、
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGAG CGAGCTGAGA GC
(配列番号:65)
および
AGGTTAGTGA AGACTCTGTC (配列番号:66)(コドン1から863まで)であった。セグメント1に関しては、センスプライマーは上記のものと同じで、アンチセンスプライマーは
CTGAGGTCTC AGCAGGC (配列番号:67)(コドン1から472まで)であった。セグメント2のプライマーは
GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACCATGGTG TCCATTTCCA GACTGCG
(配列番号:68)
および
AGGTTAGTGA AGACTCTGTC (配列番号:69)(コドン415から863まで)であった。増幅を下記のごとく行った。
【0061】
PCR生成物は、T7 RNAポリメラーゼおよび5'末端における翻訳開始の認識シグナルを含んでいた。40μCiの36S−メチオニン(NEN、デュポン(Dupont))を含有するカップリングした転写−翻訳反応においてPCR生成物を鋳型として用いた。試料をSDS試料バッファーで希釈し、10%から20%までのアクリルアミドのグラジエントを含有するSDS−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動により分析した。ゲルを固定し、EnHance(デュポン)で処理し、乾燥し、次いで、オートラジオグラフィーに供した。
【0062】
RT−PCRおよびPCR生成物の直接配列決定
Superscript II(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)を用いてリンパ芽球または腫瘍細胞のRNAからcDNAを得た。次いで、cDNAをPCR用鋳型として用いた。すべての増幅の条件は、バッファー中、95℃で30秒、52℃ないし65℃で60秒ないし120秒、次いで、70℃で60秒ないし120秒で、35サイクルであった。PCR生成物を直接配列決定し、T−テイルドクローニングベクターPCR2000(インビトロジェン(Invitrogen))中にクローン化し、T7ポリメラーゼ(ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル)を用いて配列決定した。PCR生成物の直接配列決定のために、PCR反応物をまずフェノールクロロホルム抽出し、次いで、エタノール沈殿した。製造者により説明されているようにSequithermポリメラーゼ(エピセンター・テクノロジーズ)およびガンマ−32P標識プライマーを用いて鋳型を直接配列決定した。
【0063】
変異のイントロン/エキソン境界およびゲノム分析
製造者により説明されているようにガンマ−32P標識プライマーおよびSequithermポリメラーゼを用いてP1クローンをサイクル配列決定(cycle-sequencing)することによりイントロン/エキソン境界を決定した。コドン195から233までを含むhMLH2エキソンを増幅するために用いたプライマーはTTATTTGGCA GAAAAGCAGA G (配列番号:70)
および
TTAAAAGACT AACCTCTTGC C (配列番号:71)であり、215bpの生成物が得られた。プライマー
CTGCTGTTAT GAACAATATG G (配列番号:72)を用いて生成物をサイクル配列決定した。患者GCにおけるhMLH3のゲノム欠失を分析するために用いたプライマーは:
5'領域増幅用には
CAGAAGCAGT TGCAAAGCC (配列番号:73)と
AAACCGTACT CTTCACACAC (配列番号:74)
(hMLH3のコドン233から257を含む74bpの生成物が得られる)、
GAGGAAAAGC TTTTGTTGGC (配列番号:75)と
CAGTGGCTGC TGACTGAC (配列番号:76)
(hMLH3のコドン347から377を含む93bpの生成物が得られる)、
さらに
TCCAGAACCA AGAAGGAGC (配列番号:77)と
TGAGGTCTCA GCAGGC (配列番号:78)
(hMLH3のコドン439から472を含む99bpの生成物が得られる)であった。
【0064】
【0065】
上記教示を考慮すれば本発明に対する多くの修飾および変更可能が可能であり、それゆえ、添付した請求の範囲に範囲内であり、本発明を特別に説明したのとは別なように実施してもよい。
【0066】
【発明の効果】
本発明によれは、3種のヒト・DNA修復蛋白およびかかる蛋白をコードするDNA(RNA)、さらに組み換え法によるかかる蛋白の製造方法をが提供される。ヒト・DNA修復遺伝子の1つであるhMLH1は染色体3に対してマッピングされ、hMLH2は染色体2に対してマッピングされ、さらにhMLH3は染色体7に対してマッピングされた。本発明は、hMLH1、hMLH2およびhMLH3遺伝子における変化を診断する方法を提供する。
【0067】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】 ヒト・DNA修復蛋白hMLH1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。373自動DNAシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems,Inc.)を用いて 配列決定を行った。配列決定の精度は97%より高いと予想される。
【図2】 ヒト・DNA修復蛋白hMLH1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。373自動DNAシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems,Inc.)を用いて 配列決定を行った。配列決定の精度は97%より高いと予想される。
【図3】 ヒト・DNA修復蛋白hMLH1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。373自動DNAシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems,Inc.)を用いて 配列決定を行った。配列決定の精度は97%より高いと予想される。
【図4】 ヒト・DNA修復蛋白hMLH1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。373自動DNAシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems,Inc.)を用いて 配列決定を行った。配列決定の精度は97%より高いと予想される。
【図5】 ヒト・DNA修復蛋白hMLH1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。373自動DNAシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems,Inc.)を用いて 配列決定を行った。配列決定の精度は97%より高いと予想される。
【図6】 ヒト・DNA修復蛋白hMLH1のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。373自動DNAシークエンサー(アプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッド(Applied Biosystems,Inc.)を用いて 配列決定を行った。配列決定の精度は97%より高いと予想される。
【図7】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図8】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図9】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図10】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図11】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図12】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図13】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図14】 hMLH2のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図15】 hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図16】 hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図17】 hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図18】 hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図19】 hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図20】 hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図21】 hMLH3のcDNA配列および対応する推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸を標準的な1文字略記法により表す。
【図22】 MACAW(バージョン1.0)プログラムを用いて、エス・セレビシエ(S.cerevisiae)のPMS1(yPMS1)の推定アミノ酸配列と、hMLH2ならびにhMLH3アミノ酸配列とを並べたものである。保存性のあるブロックのアミノ酸は大文字で示され、それらのペア−ワイズ・スコア
(pair-wise scores)の平均上に影をつけた。
【図23】 MACAW(バージョン1.0)プログラムを用いて、エス・セレビシエ(S.cerevisiae)のPMS1(yPMS1)の推定アミノ酸配列と、hMLH2ならびにhMLH3アミノ酸配列とを並べたものである。保存性のあるブロックのアミノ酸は大文字で示され、それらのペア−ワイズ・スコア
(pair-wise scores)の平均上に影をつけた。
【図24】 MACAW(バージョン1.0)プログラムを用いて、エス・セレビシエ(S.cerevisiae)のPMS1(yPMS1)の推定アミノ酸配列と、hMLH2ならびにhMLH3アミノ酸配列とを並べたものである。保存性のあるブロックのアミノ酸は大文字で示され、それらのペア−ワイズ・スコア
(pair-wise scores)の平均上に影をつけた。
【図25】 hMLH2の変異分析である。(A)HNPCC患者のCWにおける転写停止変異に関するIVSP分析およびマッピング。コドン1から369までの翻訳(レーン1)、コドン1から290までの翻訳(レーン2)、コドン1から214までの翻訳(レーン3)。CWは患者CWのcDNAから翻訳され、
NORは正常個体のcDNAから翻訳される。矢じりは、潜在的な停止変異により切断されたポリペプチドを示す。矢印は分子量マーカーをキロダルトンで示す。(B)CWの配列分析により、コドン233におけるCのTへのトランジション変異が示される(矢印により示す)。レーン1およびレーン3は対照患者由来の配列;レーン2はCWのゲノムDNA由来の配列である。各配列混合物からのddA混合物を隣のレーンに負荷してddC、ddD、およびddT混合物との比較を容易にする。
【図26】 hMLH3の変異分析である。(A)患者GCからのhMLH3のIVSP分析。レーンGCは個体GCの線維芽細胞由来;レーンGCxは患者
GCの腫瘍由来;レーンNOR1および2は正常対照個体由来である。FLは全長の蛋白を示し、矢じりは生殖系列の切断されたポリペプチドを示す。矢印は分子量マーカーをキロダルトンで示す。(B)患者GCからのDNAについてのPCR分析は、障害が腫瘍細胞中の両方のhMLH3対立遺伝子に存在することを示す。cDNA中の欠損領域の5'側、3'側、またはその中間(MID)を増幅するプライマーを用いて増幅を行った。レーン1,患者GCの線維芽細胞由来のDNA;レーン2,患者GCの腫瘍由来のDNA;レーン3,正常対照患者由来のDNA;レーン4,DNA鋳型なしの反応。矢印は分子量を塩基対で示す。
Claims (14)
- (a)配列番号:4に示すアミノ酸配列またはATCC 75651のcDNAインサートによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;および
(b)配列番号:3のコーティング領域のヌクレオチド配列またはATCC 75651中に含まれるcDNAインサートのコーディング領域のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群より選択されるポリヌクレオチド。 - DNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- cDNAである請求項2のDNA。
- ゲノムDNAである請求項2のDNA。
- RNAである請求項1のポリヌクレオチド。
- 請求項2ないし4のいずれか1項のDNAを含むベクター。
- 該DNAが原核細胞または真核細胞中での発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結されている請求項6のベクター。
- 請求項1ないし5のいずれか1項のポリヌクレオチドまたは請求項6または7のベクターで遺伝学的に操作された宿主細胞。
- ヒト・DNAミスマッチ修復蛋白の成熟形態ポリペプチドを製造する方法であって、
請求項8の宿主細胞を培養し、次いで、培養物からポリペプチドを回収すること
を特徴とする方法。 - 請求項1ないし5のいずれか1項のポリヌクレオチドによりコードされる、あるいは請求項9の方法により得ることのできるポリペプチド。
- 請求項1ないし5のいずれか1項のポリヌクレオチドあるいは請求項6または7のベクターで細胞を遺伝学的に操作することを特徴とする、請求項10のポリペプチドを発現しうる細胞の製造方法。
- 請求項10のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 癌に対する感受性を診断するための、請求項1ないし5のいずれか1項のポリヌクレオチドを含む組成物。
- 下記工程:
(a)対象から得た生物学的試料中のhMLH2遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列を決定し、次いで
(b)該生物学的試料からのhMLH2遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列を、配列番号:3のコーディング領域のヌクレオチド配列と比較する
を特徴とする、癌に対する感受性を調べる方法であって、該生物学的試料中のhMLH2遺伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列と配列番号:3のコーディング領域のヌクレオチド配列との間の相違が癌に対する感受性を示すものである方法。
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