JP3731614B2 - イミダゾピロロキノリン類の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イミダゾピロロキノリン類の製造方法に関し、さらに詳細には、細菌を使用して得られたピロロキノリンキノンからイミダゾピロロキノリン類を製造する方法に係わる。本発明のイミダゾピロロキノリン類は、 7,10 −ジヒドロ−7 −オキソ−イミダゾ［4,5,1-ij］ピロロ［2,3-f ］キノリン−1,3,9 −トリカルボン酸（以下総称してＩＰＱ類と記す）であり、化学構造式は化１のごとくである。
【０００２】
【化１】
［Ｒは水素原子、メチル基、イソプロピル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、カルバモイル基または水酸基、カルボキシル基、カルバモイル基、メチルメルカプト基、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、メルカプト基、イミダゾリル基、アミノ基、グアニジノ基、メトキシ基もしくはリン酸基で置換された炭素数１乃至４のアルキル基を示す〕
ＩＰＱ類は、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱと記す）の誘導体であり、今後、医薬品として開発しうる重要な物質である。なお、ＰＱＱは、1979年にメタノ−ル資化性細菌のメタノール脱水素酵素の補酵素として見い出された。
【０００３】
【従来の技術】
ＰＱＱは、細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母、さらには、哺乳動物にも存在し、補酵素として重要な働きを担っている。また、さらに、近年までに細胞の増殖促進作用（特開昭６１−５８５８４号公報、同６３−２３３７８３号公報）、抗白内障作用（特開昭６３−４１４２１号公報、同６３−４８２１５号公報、同６４−２９３１３号公報）、肝臓疾患予防治療作用（特開昭６３−１９２７１７号公報）、創傷治癒作用（特開昭６３−１５２３０９号公報）、抗アレルギ−作用（特開昭６３−１７４９３号公報）、逆転写酵素阻害作用（特開昭６３−１５６７２４号公報、特開平１−２９３１３号公報）およびグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用（特開昭６３−２１５６２８号公報、特開平１−２９３１３号公報）など多くの生理活性が明らかにされている。しかしながら、ＰＱＱは、腎毒性を有することが近年明らかにされ（渡辺ら、Hiroshima J.Med.Sci.，第３８巻，１号，第４９〜５１頁 (１９８９年) ）、毒性および腎毒性が低く安全なＰＱＱ誘導体の開発が望まれている。
【０００４】
本発明者らは、種々のＰＱＱ誘導体について、腎毒性および急性毒性試験を行なったところ、イミダゾピロロキノリン類（ＩＰＱ類）がこれらの毒性を大幅に軽減していることを見い出した。しかして、ＩＰＱ（前記の化１においてR ＝H の場合に相当）は、ＰＱＱとグリシンを反応させて得られることが知られている。しかしながら、この方法においては、不純物を含まない高純度のＰＱＱが使用されている。ＰＱＱは、通常細菌を使用して生産されるが、このときに得られる培養液にはＰＱＱの他に細菌菌体、蛋白質および糖類などの細菌内物質、培地成分ならびに副生成物などの夾雑物が多種多量に含まれており、これらの夾雑物が反応に悪影響を及ぼすことが危惧され、かつ、ＰＱＱの醗酵生産が終了した後には、ＰＱＱは蛋白質などと急速に反応して、損耗されるので、このＰＱＱの損耗を防ぐために、この培養液から速やかにＰＱＱを分離・回収し、さらに必要に応じて精製されたＰＱＱがＩＰＱの生産に使用されていた。しかしながら、培養液からのＰＱＱの分離・回収および精製には煩雑な工程が必要であり、また、培養液中のＰＱＱの蓄積量が極めて低いことから、これを効率よく分離・精製するには、さらに複雑な工程が必要である。このように、手数をかけて得られる高純度のＰＱＱを使用することは、ＩＰＱの工業的生産に際して、重大な隘路となっていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、細菌を用いるＩＰＱ類の培養生産方法を種々検討した結果、ＰＱＱを生産する能力を有する細菌を、メタノ−ルを炭素源とする培地中に培養し、培養液中にＰＱＱを蓄積させ、引き続いてこの培養液に、各種アミノ酸およびモノメチルアミンのうち少なくとも一種を添加し、酸素の存在下でＰＱＱとこれらの化合物とを反応させることにより、培養液中に蓄積されたＰＱＱが効率よくＩＰＱ類に転換されることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、メタノ−ルを炭素源とする培地中でピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を培養してピロロキノリンキノンを含有する培養液を得、該培養液に各種アミノ酸およびモノメチルアミンから選ばれた少なくとも一種を添加し、ピロロキノリンキノンと各種アミノ酸およびモノメチルアミンから選ばれた少なくとも１種とを酸素の存在下で反応させイミダゾピロロキノリン類を生成させることを特徴とするイミダゾピロロキノリン類の製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において使用される細菌としては、メタノ−ルの資化性を有し、かつ、ＰＱＱを菌体外に生産する能力を有する細菌であれば、いずれでもよいが、これらの菌の代表的な菌株としては、
１．メチロバチルス属に属する
メチロバチルス グリコゲネス ATCC 29475(=JCM 2850 =NCIB 11375) 、同 ATCC 21275 (=JCM 2841) 、同 ATCC 21452(=JCM 2842)、同 ATCC 21961(=JCM 2843)、同 ATCC 21852 (=JCM 2840 =NCIB 11376) 、同 ATCC 21369(=JCM 2844)、同 ATCC 21958(=JCM 2847)、同 ATCC 21963(=JCM 2848)、同 ATCC 21370(=JCM 2849)、同 ATCC 21372(=JCM 2852)、同 ATCC 21959 、同 ATCC 21371(=JCM 2853)、同 ATCC 21957 、同 ATCC 21276(=JCM 2854)、同 ATCC 21453(=JCM 2855)、同 ATCC 21962 (=JCM 2856) 、同ATCC 21704(=JCM 2857) 、同 ATCC 21960(=JCM 2858)、同 ATCC 21439 、同 NCIB 10508(=JCM 2859)、同 NCIB 10509 、同 NCIB 10510(=JCM 2860)、同 NCIB 10511 、同 NCIB 10512 (=JCM 2861) 、同 NCIB 10513 、同 NCIB 10514 、同 NCIB 10592(=JCM 2862)、同 NCIB 10593 、同 NCIB 10594(=JCM 2863)、同 NCIB 10595 、同 NCIB 10596(=JCM 2864)、同 JCM 2851(=NRRL B-5458) 、同 JCM 2866 、同 FERM P-1692、同 FERM P-1693、同 FERM P-1694、同 FERM P-2182、同 FERM P-2184、同 FERM P-2247、同 FERM P-2661、同 FERM P-2662、同 FERM P-2663、同 FERM P-4036、同 FERM P-4037、同 FERM P-4038、同 FERM P-4039、同 FERM P-4040、同 FERM P-4041、同 FERM P-4042および同 FERM P-4043
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３６巻，第５０２−５１１頁（１９８６）に準拠した）；
【０００７】
２．メチロフィルス属に属する
メチロフィルス メチロトロファス NCIB 10515 および 同 ATCC 31226 (=NCIB 11809)
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３７巻，第４４６−４４８頁（１９８７）に準拠した）；
【０００８】
３．メチロバクテリウム属に属する
メチロバクテリウム エクストロクェンス DSM 1337(=JCM 2802=NCIB 9399) 、同 JCM 2803(=NCIB 10409)、同 ATCC 8457(=DSM 1340=IAM 1081=JCM 2804=NCIB 2879) 、同 ATCC 14718(=DSM 1338=JCM 2805=NCIB 9133) および同 DSM 1339(=JCM 2806=NCIB 9686)、
メチロバクテリウム ロディナム ATCC 14821(=JCM 2811=NCIB 9421) および同 NCIB 9145、
メチロバクテリウム ロデシアナム NCIB 12249 、同 ATCC 21611(=JCM 2807)、同 ATCC 21612(=JCM 2808)、同 ATCC 21613(=JCM 2809)、同 ATCC 21614(=JCM 2810)、同 NCIB 10597 、同 NCIB 10598(=JCM 2812)、同 NCIB 10599(=JCM 2813)、同 NCIB 10600(=JCM 2814)、同 NCIB 10601(=JCM 2817)、同 NCIB 10602(=JCM 2815)、同 NCIB 10611(=JCM 2816)、同 ATCC 21438(=JCM 2821)および同 NCIB 9141、
メチロバクテリウム ザットマニ− NCIB 12243、同 NCIB 10603(=JCM 2818)、同 NCIB 10604(=JCM 2825)、同 NCIB 10606(=JCM 2819)、同 NCIB 10607(=JCM 2820)、同 NCIB 10608(=JCM 2821)、同 NCIB 10609(=JCM 2822)、同 NCIB 10610(=JCM 2823)および同 NCIB 10612(=JCM 2824)、
メチロバクテリウム オルガノフィラム ATCC 27886(=JCM 2833) およびNRRL B-3449(=JCM 2834)
メチロバクテリウム メソフィリカス ATCC 29983(=JCM 2829=NCIB 11561) 、メチロバクテリウム フジサワエンシス NCIB 12417および同 NCIB 11272 、
メチロバクテリウム ラジオトレランス IAM 12099(=ATCC 27329=JCM 2830=NCIB 10815) 、同 IAM 12098(=JCM 2831) 、同 NCIB 9142および同 NCIB 9143、
メチロバクテリウム アミノボランス JCM 8240 ならびに
メチロバクテリウム エスピ− ATCC 35064 、同 FERM P-4893、同 FERM P-4894、同 FERM P- 4895 、同 FERM P-4896、同 FERM P-4897および同 FERM P-9466
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３３巻，第８７５−８７７頁（１９８３），第３８巻，第１２４−１２７頁（１９８８）および第４３巻，第５０４−５１３頁（１９９３）に準拠した）；
【０００９】
４．アンシロバクタ−属に属する
アンシロバクタ− アキュアティクス ATCC 25396(=CCM 1786=DSM 101=NCIB 9271) 、同 ATCC 27068(=DSM 334) 、同 ATCC 27069 、同 ATCC 21373 (=DSM 1106) 、同 NCIB 10516(=DSM 2457)、同 DSM 2666(=FERM P-4416) 、同 DSM 2667(=FERM P-4417) 、同 DSM 2668(=FERM P-4418) および同 DSM 2669(=FERM P-4419) ならびに
アンシロバクタ− エスピ− DSM 1107、同 DSM 1108、同 DSM 1277 、同 DSM 2455 および同 DSM 2456
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３６巻，第４１５−４２１頁（１９８６）に準拠した）；
【００１０】
５．ハイホミクロビウム属に属する
ハイホミクロビウム ブルガレ ATCC 27500、
ハイホミクロビウム アエステュアリー NCIB 11052(=ATCC 27483) 、同 NCIB 9698(=JCM 6889) および同 DSM 1564(=ATCC 27488)
ハイホミクロビウム ホーランディカム ATCC 27498および同 ATCC 27497 、
ハイホミクロビウム ファシリス NCIB 10342(=ATCC 27485=DSM 1565)、同 NCIB 9699、同 NCIB 11053 、同 ATCC 27484 、同 NCIB 9697(=ATCC 27491) および同 ATCC 27492 、
ハイホミクロビウム ザバルジニィー DSM 1566および同 NCIB 9696、
ハイホミクロビウム メチロボラム IFO 14180(=JCM 6890)および同 NCIB 10517 ならびに
ハイホミクロビウム デニトロフィカンス DSM 1869(=NCIB 11706)
〔菌種名は、Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 3, p1895-1904, (1989)(The William & Wilkins Co., Baltimore)およびInternational Journal of Systematic Bacteriology，第４５巻，第５２８−５３２頁（１９９５）に準拠した〕；
【００１１】
６．キサントバクタ−属に属する
キサントバクタ− オ−トトロフィカス DSM 432、同 DSM 431、同 DSM 685、同 DSM 1393 、同 DSM 1618 、同 DSM 2009 および同 DSM 2267 ならびに
キサントバクタ− フラバス DSM 338(=NCIB 10071)
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第２８巻，第５７３−５８１頁（１９７８）および同，第２９巻，第２８３−２８７頁（１９７９）に準拠した）；
【００１２】
７．アシドモナス属に属する
アシドモナス メタノリカ JCM 6891(=IMET 10945)および同 JCM 3712(=FERM P-2664)
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３９巻，第５０−５５頁（１９８９）に準拠した）；
【００１３】
８．パラコッカス属に属する
パラコッカス デニトリフィカンス ATCC 17441(=DSM 65=IAM 12479=NCIB 11627) 、同 ATCC 13543(=CCM 982=NRRL B-3784) 、同 ATCC 19367 (=DSM 413=IFO 13301=NCIB 8944=NRRL B-3785)、同 CCM 1396(=DSM 415=NCIB 9722) および同 IFO 12442、ならびに
パラコッカス アルカリフィルス JCM 7364(=FERM P-9282)、同 FERM P-9280および同 FERM P-9281
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３９巻，第１１６−１２１頁（１９８９）に準拠した）；
【００１４】
９．チオバチルス属に属する
チオバチルス ノベルス ATCC 8093(=CCM 1077 =DSM 506=IFO 12443=NCIB 9113) および同 NCIB10456
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３０巻，第２２５−４２０頁（１９８０）に準拠した）；
【００１５】
１０．メチロファ−ガ属に属する
メチロファ−ガ マリ−ナ ATCC 35842(=NCMB 2244)、
メチロファ−ガ サラシカ ATCC 33146(=IAM 12458=NCMB 2163)、同 NCMB 2162(=FERM P-3622)および同 ATCC 33145 ならびに
メチロファ−ガ エスピ− FERM P-3619 、同 FERM P-3620、同 FERM P-3623および同 FERM P-3624
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３７巻，第４０２−４０６頁（１９８２）に準拠した）；
【００１６】
１１．ミコバクテリウム属に属する
ミコバクテリウム メタノリカ FERM P-8823、同 FERM P-8824、同 FERM P-8825、同 FERM P-8826、同 FERM P-8827、同 FERM P-9464、同 FERM P-9465および同 FERM P-9497
（ミコバクテリウム属に属するこれらの菌株の菌学的性質は、特開昭６３−２８３８５号公報、同６４−５１０７７号公報および同６４−６０３７１号公報に記載されている）などがある。
【００１７】
なお、前記のこれらの菌株はすべて公知である。また、これらの菌株より得られた変異株も使用することが出来る。これらのＰＱＱ生産菌を培養するにあたって用いられる栄養培地は、主炭素源として、メタノ−ルを含有することが必要である。さらに培地成分として、通常の窒素源、無機物の適量が使用される。窒素源としては、通常は、たとえば、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が用いられ、無機塩類としては、通常は、たとえばリン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が用いられる。また、使用菌株が栄養要求性を示す場合には、その要求性物質を培地に添加する必要がある。また、メチロファ−ガ属細菌は、生育にＮａＣｌが必要なので、培地中に、ＮａＣｌを２〜４重量％となるように添加するか、あるいは、培地作成に用いる水として海水を使用する必要がある。培養温度は、通常２５〜４５℃の範囲で各菌株にとって生育、増殖に適した温度を選択すればよい。培養ｐＨは、通常６〜８の範囲で各菌株にとって生育、増殖に適したｐＨを選択する。しかし、アシドモナス属細菌の生育ｐＨは、２．０〜５．５であり、パラコッカス アルカリフィルスの菌株の生育ｐＨは、７．０〜１０．０であるので、これらの菌株を用いる場合は、これらの範囲内のｐＨを選択する必要がある。窒素源として、アンモニウム塩を使用した場合は、菌体が増殖するに伴って培養液中のｐＨが低下するので、培養期間中の培溶液のｐＨを所定のｐＨを保つために、アンモニア、苛性カリもしくは苛性ソ−ダ等を添加して、培養液のｐＨを調節する必要がある。これらの中でアンモニアが特に好ましい。このような条件下で通気攪拌などの方法で好気培養を行うことにより、培養液中にＰＱＱが生成される。
【００１８】
次に、この培養液にα−アミノ酸およびモノメチルアミンの少なくとも一種を添加してこれらと培養液中に含有されているＰＱＱとを酸素の存在下で反応させて、使用されたα−アミノ酸またはモノメチルアミンに対応するＩＰＱ類を得る。ここで用いられるα−アミノ酸の代表例としてはグリシン、スレオニン、プロリン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、セリン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、システインなどがある。これらの化合物のうち、光学活性体のあるものは、Ｄ体、Ｌ体、あるいはラセミ体のいずれでもよい。また、モノメチルアミンとしては、塩酸塩などのモノメチルアミン塩類を用いることも可能である。
【００１９】
これらの化合物の添加時期は通常培養液中のＰＱＱ濃度が１０μg 〜１０g ／l 、好ましくは１００μg 〜１０g ／l となった時である。添加量は、培養液中のＰＱＱに対して１モル倍以上、好ましくは５モル倍以上、更に好ましくは大過剰とすることがよく、実際には０．１g ／l 以上となるよう添加する事が好ましい。本発明では通常はこのような培養液をそのまま使用するが、必要に応じて濃縮により培養液の水分の一部を除去してから使用することも妨げない。添加の方法としては一度に全量を添加する方法、逐次添加する方法どちらでも可能であるが、上記濃度とすることが必要である。反応液のｐＨは、通常は、一般に２〜10の範囲が好ましく、その最適ｐＨはＩＰＱ類の種類により異なるが、更に詳しくは後で述べる。
【００２０】
反応温度は、実用上、２０〜１００℃程度が好ましく、特に２５〜８０℃が好ましい。反応時間は４８時間以内、好ましくは１〜３０時間である。また、反応液中の溶存酸素濃度には特に制限はないが、反応を短時間で終了させるためには、０．５〜１ppm 以上が好ましい。そのために空気あるいは酸素またはその混合ガスなどを通気し、撹拌したり、さらに、反応槽の圧力を高めるなどの手段が使用される。
【００２１】
このような条件で反応させることによりＰＱＱ等を原料としてＩＰＱ類が得られる。ＰＱＱの醗酵生産が終了した後、培養液に各種アミノ酸あるいはモノメチルアミンを添加するまでの時間は、短いほど好ましく、通常は、10時間以内、好ましくは、２時間以内とされる。
【００２２】
ＩＰＱ（R=H ）はグリシン、トリプトファン、プロリン、スレオニン、チロシン、セリンおよびモノメチルアミンのうち少なくとも一種を培養液に添加することにより得られ、反応ｐＨとしてはｐＨ６〜９が特に好ましい。また、１−メチルエチルＩＰＱ（R=CH(CH3)2）はバリンを、１−メチルプロピルＩＰＱ（R=CH(CH3)CH2CH3 ）はイソロイシンを、２−メチルプロピルＩＰＱ（R=CH2CH(CH3)2 ）はロイシンを、メチルＩＰＱ（R=CH3 ）はアラニンを、２−カルボキシエチルＩＰＱ（R=CH2CH2CO2H）はグルタミン酸を、２−カルボモイルエチルＩＰＱ（R=CH2CH2CONH2 ）はグルタミンを、２−メチルチオエチルＩＰＱ（R=CH2CH2SCH3）はメチオニンを、ベンジルＩＰＱ（R=CH2-C6H5）はフェニルアラニンを、カルボキシメチルＩＰＱ（R=CH2CO2H ）はアスパラギン酸を、カルバモイルメチルＩＰＱ（R=CH2CONH2）はアスパラギンを、４−アミノブチルＩＰＱ（R=(CH2)4NH2 ）はリジンを、３−グアニジノプロピルＩＰＱ（R=(CH2)3NHCNH2）はアルギニンを、メルカプトメチルＩＰＱ（R=CH2SH ）はシステインを、メトキシメチルＩＰＱ（R=CH2OCH3 ）はＤＬ−O −メチルセリンを、ホスホリロキシメチルＩＰＱ（R=CH2OPO3H2）はＤＬ−O −ホスホリルセリンを、カルバモイルＩＰＱ（R=CO2NH2）はＤＬ−セリンアミドを、R が化２
【００２３】
【化２】
で表させる４−イミダゾリルメチルＩＰＱはヒスチジンを、それぞれ培養液に添加することにより得られ、反応ｐＨとしてはｐＨ６〜９が特に好ましい。
【００２４】
一方、ヒドロキシメチルＩＰＱ（R=CH2OH ）は、培養液にセリンを添加し、反応ｐＨを２〜６とすることにより得られ、最適なｐＨは４〜６である。反応ｐＨが６を越えることにより、ＩＰＱ（R=H ）が得られる。４−ヒドロキシフェニルメチルＩＰＱ（R=CH2-C6H4OH）は、培養液にチロシンを添加し、反応ｐＨを４〜８とすることにより得られ、最適なｐＨは６〜８である。反応ｐＨが８を越えることによりＩＰＱ（R=H ）が得られる。
【００２５】
このようにして得られた反応生成液から、たとえば、濾過もしくは遠心分離などの通常の固液分離手段によって、菌体などの固形分を除去し、上澄液を得る。ｐＨ２〜５などの低ｐＨでＩＰＱ類を生成させた場合、生成されたＩＰＱ類が反応生成液中で沈澱物として存在している場合もあるので、反応液および反応生成液のそれぞれのｐＨを中性乃至アルカリ性以上にし、生成されたＩＰＱ類を一旦溶解させた後、上澄液を得る必要がある。得られた上澄液からＩＰＱ類が分離・回収される。上澄液からのＩＰＱ類の分離、精製には種々の方法が用いられる。例えば沈澱法、洗浄法、限外濾過法、抽出法およびＩＰＱ類を吸着する樹脂担体を用いる方法等が挙げられる。これらの方法を単独あるいは組み合わせてＩＰＱ類を分離、精製することができる。
【００２６】
ＩＰＱ類を分離精製する方法についてさらに具体的に説明する。沈澱法としては、たとえば、塩酸、硫酸および硝酸などの無機酸ならびにトリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロメタンスルホン酸などの有機酸などにより反応生成液を酸性として、ＩＰＱ類を沈澱させる酸性沈澱法、反応生成液に、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどのアルカリ金属塩、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩を添加してＩＰＱ類を沈澱させる塩析法または反応生成液と、たとえばアセトンなどのＩＰＱ類の溶解度の低い溶媒とを混合し沈澱させる溶媒沈澱法などがある。これらの沈澱法においては、液温を低くする程、ＩＰＱ類の回収率は向上する。前記の沈澱法によって得られたＩＰＱ類の粉体、または、ＩＰＱ類を含む沈澱物を、たとえば、アセトン、ジエチルエーテルおよび酸性の水のようなＩＰＱ類を溶かしにくい溶剤で洗浄する洗浄法を適用することにより、ＩＰＱ類の純度をさらに向上させることができる。発酵法によるＩＰＱ類の生産において培養液中の高分子の夾雑物を除く必要がある場合には、限外濾過法を利用することができる。
【００２７】
限外濾過法として、セファデックスＧ−１０（商品名、ファルマシア株式会社製）およびトヨパールＨＷシリーズ（商品名、東ソー株式会社製）などのゲル濾過用樹脂担体を用いる方法あるいは各種限外濾過膜や限外濾過中空糸を用いる方法などを適用することができる。抽出法に用いる抽出剤として、水および有機溶媒等が使用される。有機溶剤としては、水との相溶性が小さい有機溶剤が好ましく、たとえば、ｎ−ブタノールのような炭素数４個以上の脂肪族アルコールが好適に使用される。ＩＰＱ類を吸着する樹脂担体を用いた方法では、ＩＰＱ類を吸着・脱離することのできる樹脂担体であれば特に制限なく利用できる。この樹脂担体の代表例として、陰イオン交換樹脂担体では、多糖系担体のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（商品名、ファルマシア株式会社製）、親水性ポリマー系樹脂のＤＥＡＥ−トヨパール６５０（商品名、東ソー株式会社製）およびアンバーリストＡ−２１（商品名、ローム・アンド・ハース株式会社製）などがある。また、吸着・分離型樹脂担体では、疎水性ポリマー系樹脂のダイヤイオンＨＰシリーズ（商品名、三菱化成株式会社製）およびアンバーライトＸＡＤシリーズ（商品名、ローム・アンド・ハース株式会社製）などの他にシリカ、オクタデシルシリカおよびアルミナなどがある。疎水性クロマトグラフィ用樹脂担体では、ブチル−トヨパール６５０およびフェニル−トヨパール６５０（東ソー株式会社製）などがある。ＩＰＱ類の同定には、元素分析、核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトルおよび質量分析などの手段が用いられる。また、ＩＰＱ類の定量には、高速液体クロマトグラフィーにより行うことが出来る。
【００２８】
［ＰＱＱおよびＩＰＱ類の急性毒性および腎毒性試験］
（１）マウスに対する急性毒性試験
１）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類をマウス１kg当り２０、４０、８０、１６０および２００mgのそれぞれを腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。ＩＰＱ類としては、ＩＰＱ、１−メチルプロピルＩＰＱ、２−メチルチオエチルＩＰＱおよびベンジルＩＰＱを用いた。なお、一群は８匹とした。その結果、ＰＱＱ・Ｎａ2 ２０mg/kg 投与および４０mg/kg 投与ではマウスは死亡しなかったが、８０mg投与で５匹、１６０mg投与および２００mg投与で８匹全部死亡した。ＰＱＱ・Ｎａ2 のＬＤ50は約７０mg/kg マウスであった。一方、ＩＰＱ類では全てのマウスが死亡しなかった。
【００２９】
２）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＩＰＱをマウス１kg当り０．１g 、０．２g 、０．４g 、０．８g あるいは１．２g のそれぞれを腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。なお、一群は８匹とした。ＩＰＱ０．１〜０．４g 投与ではすべてのマウスが死亡せず、０．８g では２匹、１．２g では６匹が死亡した。ＬＤ50は約１．０g/kgマウスであった。３）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＩＰＱをマウス１kg当り１．０g 、１．５g あるいは２．０g をそれぞれ経口投与し、１４日間、２５℃で飼育した。一群は８匹とした。その結果、すべてのマウスは死亡しなかった。
１）〜３）の結果より、ＩＰＱ類はＰＱＱに比べて毒性が著しく低下していたことがわかる。
【００３０】
（２）マウスに対する腎毒性
１）尿検査による腎毒性
急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類を腹腔投与し、マウスを飼育した。毎日、マウスの尿を採取し、臨床検査試薬（商品名：ウリステックスＩＩ、マイルス・三共株式会社製）を用いてグルコ−ス濃度を調べた。第１表に示すように、ＰＱＱ・Ｎａ2 を投与したマウスの尿からは糖が検出されたが、ＩＰＱ類を投与したマウスの尿からは糖が検出されなかった。すなわち、ＰＱＱは腎毒性が認められたが、ＩＰＱ類では腎毒性が認められなかった。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
２）血液検査による腎毒性
（イ）急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類を腹腔投与し、マウスを飼育した。投与１日後に絶食（水は与える）し、さらに18時間後に採血して血清を得た。血清中のグルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニン（Creatinine）を臨床検査試薬（商品名：富士ドライケムスライド、富士写真フィルム株式会社製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均値で示した。結果を第２表に示す。
【００３３】
ＰＱＱ・Ｎａ2 投与では、グルコ−スの大幅な減少、尿素態窒素およびクレアチニンの大幅な増加がみられ、腎毒性が認められた。これに対してＩＰＱ類の投与では、グルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニンのそれぞれの含有量は「無投与」の場合と大差なかった。
【００３４】
【表２】
【００３５】
（ロ）急性毒性試験と同様にして、ＩＰＱを１５０mg、３００mg、４００mgあるいは６００mg/kg 腹腔投与し、マウスを１日飼育した。その後、絶食（水は与える）し、さらに18時間後に採血して血清を得た。血清中のグルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニン（Creatinine）を臨床検査試薬（商品名：富士ドライケムスライド、富士写真フィルム株式会社製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均値で示した。結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
ＩＰＱのいずれの投与量でも、グルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニンのそれぞれの蓄積量は「無投与」の場合と大差はなかった。１）および２）の結果より、ＰＱＱは腎毒性が認められたが、ＩＰＱ類は腎毒性が認められなかった。
【００３７】
（３）ラットに対する腎毒性
Wistarラット 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類をラット１kg当り４０mgそれぞれ腹腔投与し、７日間、２５℃で飼育した。なお、一群は５匹とした。その結果ＰＱＱ・Ｎａ2 では３日目に１匹、５日目に２匹死亡したが、ＩＰＱ投与では死亡ラットはみられなかった。ＰＱＱ・Ｎａ2 のラットに対する急性毒性は約４０mg/kg ラットであった。
投与前（０日目）、投与後１日目、３日目、５日目および７日目に血液（血清）および尿を採取した。血清中の尿素対窒素、クレアチニン、グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピリビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を、富士ドライケムスライトを用いて測定した。また、尿中のグルコース濃度をエームス尿検査試験紙−ウリステックスＩＩ（マイルス・三共株式会社製）を用いて測定した。結果を第４に示す。
【００３８】
ＰＱＱ投与により、血清中の尿素態窒素、クレアチニン、およびＧＯＴまた尿中のグルコース濃度が増加した。その量は、特に投与１〜３日目が高く、その後低下する傾向が見られた。一方、ＩＰＱ投与では全期間を通じて、何ら変化はみられなかった。つまり、ラットに対して、ＰＱＱは腎毒性を示したがＩＰＱは毒性を示さなかった。
【００３９】
【表４】
【００４０】
【実施例】
以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、チアミン塩酸塩 ４mg、パントテン酸カルシウム ４mg、ビオチン ２０μｇおよびメタノ−ル １２mlを溶解し、ｐＨが ７．１に調整された液２００mlを１ｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間滅菌し、これを培地とした。これに前記と同様な培地を用いて３０℃で２日間前培養された各種菌株（表５に示す）の培養液をそれぞれ１容量％接種し、３０℃で回転振盪培養を行なって、培養開始３日後に培養液を得た。
【００４１】
これらの培養液をそれぞれ２等分し、一方にはグリシンを０．３g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、２４時間、３０℃で回転振盪してＩＰＱ生成液を得た。残り一方には、Ｌ−セリンを０．４g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間、回転振盪して反応を行い、ヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中に含まれているＩＰＱ類量を測定した。結果を表５に示す。
【００４２】
なお、ＩＰＱ類量は、次に示す高速液体クロマトグラフで求めた（以下の実施例でも同様）。
機器：島津製作所製高速液体クロマトグラフ
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ Ａ−３０２
（４．６mmφ×１５０mm）
展開液：0.1M KH2PO4 、0.1M HClO4/CH3CN：H2O
＝ １：９ ( ｐＨ ２．５)
流速：１．５ ／min
検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ
ＵＶ−ＶＩＳ検出器（２５９nmおよび４２０nm）
【００４３】
【表５】
【００４４】
実施例２
純水１ｌあたり、(NH4)2SO4 ３g 、KH2PO4 ４g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・ XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、パントテン酸カルシウム ４mg、およびメタノ−ル１２mlを溶解し、ｐＨが４．５に調整された培地を使用した以外は実施例１と同様にして、アシドモナス メタノリカ JCM 6891を３日間培養し、培養液を得た。この培養液を二等分し、一方には、モノメチルアミン塩酸塩を０．３g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、２４時間３０℃で撹拌してＩＰＱ反応生成液を得た。残り一方には、Ｌ−セリンを０．４g/ となるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間、回転振盪して反応を行い、ヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中に含まれるＩＰＱ類量を測定した。結果を表６に示す。
【００４５】
実施例３
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３ｇ、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、ビオチン２０μg およびメタノ−ル１２mlを溶解し、１２０℃で２０分間殺菌し、その後に、Na2CO3 １０重量％水溶液を無菌的に加え、ｐＨが９．０に調整された培地を使用した以外は、実施例１と同様にしてパラコッカス アルカリフィルス ＪＣＭ 7364 を３日間培養し、培養液を得た。この培養液を二等分し、一方には、Ｌ−セリンを０．４g/ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、３０℃で２４時間撹拌して、ＩＰＱ反応生成液を得た。残り一方には、Ｌ−セリンを０．４g/ｌとなるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間撹拌してヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中に含まれるＩＰＱ類を測定した。結果を表６に示す。
【００４６】
実施例４
海水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３．０g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・ XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O 5mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、メタノ−ル１２mlを溶解し、ｐＨが７．１に調整された培地を使用した以外は、実施例１と同様にして、メチロファ−ガ属細菌を３日間培養し、培養液を得た。この培養液を二等分し、一方には、Ｌ−スレオニンを ０．５g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、３０℃で２４時間撹拌してＩＰＱ反応生成液を得た。残り一方には、Ｄ−セリンを０．４g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間撹拌してヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して、上澄液を得、その中に含まれるＩＰＱ類を測定した。結果を表６に示す。
【００４７】
【表６】
【００４８】
実施例５
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３．０g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mgおよびメタノ−ル８mlを溶解し、ｐＨが７．１に調整された液２００mlを１ｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間滅菌し、これを培地とした。これにハイホミクロビウム ブルガレ NCIB 9775 を接種し、３０℃でロ−タリ−シェ−カ−で回転数２２０回／分の回転振盪培養して得られた。この培養液を種母液とした。
【００４９】
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 １．０g 、MgSO4 ・7H2O １．０g 、KH2PO4１．４g を溶解した培地１５ｌを３０ｌ容培養槽に入れ、滅菌した。純水１０mlあたりに、FeSO4 ・7H2O ７５mg、ZnSO4 ・7H2O １５０mg、CaCl2 ・2H2O １５０mg、NaCl １５０mg、MnSO4 ・4 〜5H2O ４５mg、H3BO3 ３mg、CuSO4 ・5H2O １．５ mg 、CoCl2 ・2H2O 1.5mg、KI １．５mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O １．５mgを溶解したミネラル溶液を殺菌した。３０ｌ容培養槽の温度が３０℃に低下した後、槽内の培地に、このミネラル溶液１０mlを無菌的に加え、さらにアンモニア水を無菌的に添加して培養液のｐＨを６．８に調整した。この培養槽内に、メタノ−ルを１５０mlおよび前記の種母液２００mlを無菌的に加え、通気量１０ｌ／min 、回転数３００回／分で撹拌しつつ温度３０℃、培養液 ｐＨを６．８になるようにアンモニア水を添加しながら培養した。細菌が増殖するに従って、培養液中のメタノ−ル濃度が低下したが、排気ガス中のメタノ−ルをガスクロマトグラフィ−で分析することにより検出し、培養液中のメタノ−ル濃度が０．１〜０．５重量％になるようにメタノ−ルを補充した。
【００５０】
このような方法により、７基の３０ｌ容培養槽で１０日間培養し、各々の培養槽内の培養液に（１）グリシン ９０g 、（２）Ｌ−セリン １２０g 、（３）Ｄ−セリン １２０g 、（４）Ｌ−スレオニン １５０g、（５）Ｄ−スレオニン １５０g 、（６）Ｌ−プロリン １５０g 、（７）Ｄ−プロリン １５０g、（８）Ｌ−チロシン ２１０g 、（９）Ｄ−チロシン ２１０g 、（１０）Ｌ−トリプトファン ２４０g 、（１１）Ｄ−トリプトファン ２４０g および（１２）モノメチルアミン塩酸塩７５g をそれぞれ添加し、反応液のｐＨを８．５になるように調節しながらさらに２４時間反応を行って反応生成液を得た。反応生成液中のＩＰＱの蓄積量を表７に示す。
【００５１】
【表７】
【００５２】
実施例６
菌株として、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ 1869 を使用した以外は、実施例５と同様にして、７基の３０ｌ容培養槽で１０日間培養した培養液に、グリシンを（１）４．５g 、（２）９．０g 、（３）１５．０g 、（４）４５g 、（５）７５g 、（６）１５０g および（７）２２５g をそれぞれ添加し、反応液のｐＨを８．０になるように調節しながらさらに５時間培養を行って反応生成液を得た。反応生成液中ＩＰＱ蓄積量を表８に示す。
【００５３】
【表８】
【００５４】
実施例７
実施例６と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ
1869の培養を８基の３０ｌ容培養槽で１０日間行なった。その後、各々の培養槽の培養液のｐＨを（１）ｐＨ ３．０、（２）ｐＨ４．０、（３）ｐＨ５．０、（４）ｐＨ６．０、（５）ｐＨ７．０、（６）ｐＨ ８．０、（７）ｐＨ９．０および（８）ｐＨ１０．０とし、グリシン３０g を各々の培養槽中の培養液に添加し、さらに３時間反応を行って反応生成液を得た。各培養槽の反応生成液をそのまま遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ量および前記（１）〜（５）について、反応生成液のｐＨを８．５に調整した後に遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ量をそれぞれ表９に示す。
【００５５】
【表９】
【００５６】
実施例８
実施例６と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ
1869の培養を８基の３０ｌ容培養槽で１０日間行なった。その後、各々の培養槽の反応液のｐＨを（１）ｐＨ２．０、（２）ｐＨ３．０、（３）ｐＨ４．０、（４）ｐＨ５．０、（５）ｐＨ ６．０、（６）ｐＨ７．０、（７）ｐＨ８．０、（８）ｐＨ９．０、（９）ｐＨ１０．０ とし、Ｌ−セリン ４２g を各々の培養槽中の培養液に添加し、5時間反応を行って反応生成液を得た。各培養槽の反応生成液をそのまま遠心分離して得られた分離液中のＩＰＱおよびヒドロキシメチルＩＰＱ量ならびに反応生成液のｐＨを8.5 に調整した後、遠心分離した場合の分離液中のＩＰＱおよびヒドロキシメチルＩＰＱ量を表１０および表１１に示す。
【００５７】
【表１０】
【００５８】
【表１１】
【００５９】
実施例９
実施例６と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ1869の培養を４基の３０ｌ容培養槽で１０日間行なった。その後、各々の培養槽内の培養液の温度を（１）２０℃、（２）３０℃、（３）４０℃、（４）５０℃、（５）７０℃とし、Ｌ−スレオニン ４８g を各々の培養槽内の培養液に添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながら５時間反応を行って反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱ蓄積量を表１２に示す。
【００６０】
【表１２】
【００６１】
実施例１０
実施例６と同様にして、メチロバチルス グリコゲネス FERM P-2247 を培養した。培養開始４日目の培養液に、モノメチルアミン塩酸塩 ２７g を添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながらさらに６時間培養を続けて反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱの蓄積量は、220mg ／ｌであった。
【００６２】
実施例１１
実施例６と同様にして、パラコッカス デニトリフィカンス ATCC 19367を培養した。培養開始１０日目の培養液に、Ｄ−セリン４２g を添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながら反応を６時間行って反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱの蓄積量は、１４０mg／ｌであった。
【００６３】
実施例１２
培地に使用する水として、海水を用いた他は、実施例６と同様にして、メチロファ−ガ サラシカ ATCC 33146を培養した。培養開始１０日目の培養液に、Ｄ−スレオニン４８g を添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながら反応を6時間行って反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱの蓄積量は１６３mg／ｌであった。
【００６４】
実施例１３
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mgおよびメタノ−ル１２mlを溶解し、ｐＨが７．１に調整された液２００mlを１ｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌し、これを培地とした。これにハイホミクロビウム ブルガレ NCIB 9775を接種し、３０℃でロ−タリ−シェ−カ−で回転数２２０回／分の回転振盪培養によって得られた培養液を種母液とした。
【００６５】
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 １g 、MgSO4 ・7H2O １g 、KH2PO4 １．４g を添加した培地１５ｌを３０ｌ容培養槽に入れ、滅菌した。純水１０mlあたりに、FeSO4 ・7H2O ７５mg、ZnSO4 ・7H2O １５０mg、CaCl2 ・2H2O １５０mg、NaCl １５０mg、MnSO4 ・4 〜5H2O ４５mg、H3BO3 ３mg、CuSO4 ・5H2O １．５mg、CoCl2 ・2H2O １．５mg、KI １．５mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O １．５mgを溶解したミネラル溶液を滅菌した。３０ｌ容培養槽の温度が30℃に低下した後、前記の槽内の培地にこのミネラル溶液１０mlを無菌的に加え、さらにアンモニア水を無菌的に添加して、培養液のｐＨを６．８に調整した。
この培養槽内に、メタノ−ルを１５０mlおよび前記の種母液２００mlを無菌的に加え、通気量１０ｌ／分、回転数３００回／分で撹拌しつつ、温度３０℃、アンモニア水を添加しながら培養液のｐＨを６．８に維持しながら培養した。細菌が増殖するに従って、培養液中のメタノ−ル濃度が低下したが、それを排気ガス中のメタノ−ルをガスクロマトグラフィ−で分析することにより検出し、この低下分に相当する量のメタノ−ルを補充して培養液中のメタノ−ル濃度を０．１〜０．５重量％に維持した。
【００６６】
このような方法により、２台の３０ｌ 容培養槽で１０日間培養し、各々の培養槽内の培養液のｐＨを塩酸で４．０に調整したのち、（１）Ｌ−セリン １２０g ／１５ｌおよび（２）Ｄ−セリン１２０g ／１５ｌとなるよう、それぞれ添加し、空気で通気撹拌しつつ、培養液のｐＨを４．０になるように調節しながら、３０℃で２４時間反応を行なって反応生成液を得た。反応生成液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離し、上澄液を得た。上澄液中に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量を表１３に示す。
【００６７】
【表１３】
【００６８】
実施例１４
菌株として、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス DSM 1869を使用した以外は、実施例１３と同様にして、３０ｌ容培養槽で１０日間培養し、その後、培養液のｐＨを４．０に調整し、Ｌ−セリンを４２g 添加し、反応を行なった。Ｌ−セリンを添加した後、各時間毎に反応生成液を採取し、ｐＨ７に調整した後遠心分離し、その反応生成液に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱ量を測定した。その結果を表１４に示す。
【００６９】
【表１４】
【００７０】
実施例１５
菌株を変更した以外は、実施例１３と同様にして、メチロバチルス グリコゲネス FERM P-2247 の培養を３０ｌ容培養槽で４日間行なった。その後、培養槽中の培養液のｐＨを４．５に調整し、Ｌ−セリン４２gを添加し、６時間反応を行ない、反応生成液を得た。反応生成液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離し、上澄液を得た。上澄液中に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量は、１ｌあたり２００mgであった。
【００７１】
実施例１６
菌株を変更した以外は実施例１３と同様にして、パラコッカス デニトリフィカンス ATCC 19367の培養を３０ｌ容培養槽で１０日間培養した。その後、培養槽中の培養液のｐＨを６．０に調整し、Ｄ−セリン４２g を添加し、６時間反応を行ない、反応生成液を得た。ヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量は、反応生成液１ｌあたり１１０mgであった。
【００７２】
実施例１７
菌株を変更し、培地に使用する水として海水を用いた他は、実施例１３と同様にして、メチロファ−ガ サラシカ ATCC 33146を３０ｌ容培養槽で１０日間培養した。その後、培養槽中の反応液のｐＨを４．０に調整し、ＤＬ−セリン４２g を添加して、空気で通気撹拌しながら３０℃で６時間反応を行なって、反応生成液を得た。反応生成液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離し、上澄液を得た。その上澄液中に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量は１ｌ当たり１４２mgであった。
【００７３】
実施例１８
実施例１４と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス DSM 1869の培養を３０ｌ容培養槽を用いて行い、培養液１５ｌを得た。この培養液を各々２００mlづつを１ｌ容三角フラスコに入れ、各種アミノ酸を０．６g づつ添加し、ＮａＯＨあるいはＨＣｌを用いてｐＨ４、７あるいは９とし、３０℃で振盪させながら２４時間反応を行って反応生成液を得た。各フラスコの反応生成液のｐＨを７．０に調整した後に遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ類蓄積量をそれぞれ表１５に示す。
【００７４】
【表１５】
X-IPQ：それぞれの添加アミノ酸に対応するIPQ 類
を示し、具体的な対応は次の表１６の通りである。
【００７５】
【表１６】
【００７６】
実施例１９
実施例１８で用いたＰＱＱ含有培養液と同じ培養液を各々２００mlづつ１２個の１ｌ容三角フラスコに入れた。各々のフラスコに、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−セリンあるいはL-システインを各々０．６gづつ添加し、ＮａＯＨあるいはＨＣｌを用いてｐＨを４、７あるいは９とし、３０℃で振盪させながら２４時間反応を行って反応生成液を得た。各フラスコの反応生成液のｐＨを７．０に調整した後に、遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ類蓄積量をそれぞれ表１７に示す。各々の反応液中には、各々のアミノ酸に対応するＩＰＱ類の他に、ＩＰＱも存在した。
【００７７】
【表１７】
【００７８】
【表１８】
【００７９】
実施例２０
実施例９のうち培養槽内の培養液の温度を３０℃として得たＩＰＱ含有反応液を１２，０００×g で２０分間遠心分離した上澄液を用いてＩＰＱの回収実験を行った。各々５０mlづつをＨＣｌを用いて、ｐＨ７．２、６．５、５．７、５．０、４．７、４．２、３．７、３．１、２．６、２．１、１．５および１．０に調整し、室温で４時間放置後、１２，０００×g で２０分間遠心分離し、ＩＰＱを沈澱として回収した。上澄液中に残存するＩＰＱを高速液体クロマトで分析した結果を第１９表に示す。ＩＰＱはｐＨ４以下で沈澱として回収できることがわかる。
【００８０】
【表１９】
【００８１】
【発明の効果】
本発明により、細菌を使用して得られたＰＱＱを含有する培養液からＰＱＱを分離・回収・精製することなくイミダゾピロロキノリン類を容易にかつ安定的に得ることが可能である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、イミダゾピロロキノリン類の製造方法に関し、さらに詳細には、細菌を使用して得られたピロロキノリンキノンからイミダゾピロロキノリン類を製造する方法に係わる。本発明のイミダゾピロロキノリン類は、 7,10 −ジヒドロ−7 −オキソ−イミダゾ［4,5,1-ij］ピロロ［2,3-f ］キノリン−1,3,9 −トリカルボン酸（以下総称してＩＰＱ類と記す）であり、化学構造式は化１のごとくである。
【０００２】
【化１】
ＩＰＱ類は、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱと記す）の誘導体であり、今後、医薬品として開発しうる重要な物質である。なお、ＰＱＱは、1979年にメタノ−ル資化性細菌のメタノール脱水素酵素の補酵素として見い出された。
【０００３】
【従来の技術】
ＰＱＱは、細菌に限らず、真核生物のカビ、酵母、さらには、哺乳動物にも存在し、補酵素として重要な働きを担っている。また、さらに、近年までに細胞の増殖促進作用（特開昭６１−５８５８４号公報、同６３−２３３７８３号公報）、抗白内障作用（特開昭６３−４１４２１号公報、同６３−４８２１５号公報、同６４−２９３１３号公報）、肝臓疾患予防治療作用（特開昭６３−１９２７１７号公報）、創傷治癒作用（特開昭６３−１５２３０９号公報）、抗アレルギ−作用（特開昭６３−１７４９３号公報）、逆転写酵素阻害作用（特開昭６３−１５６７２４号公報、特開平１−２９３１３号公報）およびグリオキサラ−ゼＩ阻害作用−制癌作用（特開昭６３−２１５６２８号公報、特開平１−２９３１３号公報）など多くの生理活性が明らかにされている。しかしながら、ＰＱＱは、腎毒性を有することが近年明らかにされ（渡辺ら、Hiroshima J.Med.Sci.，第３８巻，１号，第４９〜５１頁 (１９８９年) ）、毒性および腎毒性が低く安全なＰＱＱ誘導体の開発が望まれている。
【０００４】
本発明者らは、種々のＰＱＱ誘導体について、腎毒性および急性毒性試験を行なったところ、イミダゾピロロキノリン類（ＩＰＱ類）がこれらの毒性を大幅に軽減していることを見い出した。しかして、ＩＰＱ（前記の化１においてR ＝H の場合に相当）は、ＰＱＱとグリシンを反応させて得られることが知られている。しかしながら、この方法においては、不純物を含まない高純度のＰＱＱが使用されている。ＰＱＱは、通常細菌を使用して生産されるが、このときに得られる培養液にはＰＱＱの他に細菌菌体、蛋白質および糖類などの細菌内物質、培地成分ならびに副生成物などの夾雑物が多種多量に含まれており、これらの夾雑物が反応に悪影響を及ぼすことが危惧され、かつ、ＰＱＱの醗酵生産が終了した後には、ＰＱＱは蛋白質などと急速に反応して、損耗されるので、このＰＱＱの損耗を防ぐために、この培養液から速やかにＰＱＱを分離・回収し、さらに必要に応じて精製されたＰＱＱがＩＰＱの生産に使用されていた。しかしながら、培養液からのＰＱＱの分離・回収および精製には煩雑な工程が必要であり、また、培養液中のＰＱＱの蓄積量が極めて低いことから、これを効率よく分離・精製するには、さらに複雑な工程が必要である。このように、手数をかけて得られる高純度のＰＱＱを使用することは、ＩＰＱの工業的生産に際して、重大な隘路となっていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、細菌を用いるＩＰＱ類の培養生産方法を種々検討した結果、ＰＱＱを生産する能力を有する細菌を、メタノ−ルを炭素源とする培地中に培養し、培養液中にＰＱＱを蓄積させ、引き続いてこの培養液に、各種アミノ酸およびモノメチルアミンのうち少なくとも一種を添加し、酸素の存在下でＰＱＱとこれらの化合物とを反応させることにより、培養液中に蓄積されたＰＱＱが効率よくＩＰＱ類に転換されることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、メタノ−ルを炭素源とする培地中でピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を培養してピロロキノリンキノンを含有する培養液を得、該培養液に各種アミノ酸およびモノメチルアミンから選ばれた少なくとも一種を添加し、ピロロキノリンキノンと各種アミノ酸およびモノメチルアミンから選ばれた少なくとも１種とを酸素の存在下で反応させイミダゾピロロキノリン類を生成させることを特徴とするイミダゾピロロキノリン類の製造法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において使用される細菌としては、メタノ−ルの資化性を有し、かつ、ＰＱＱを菌体外に生産する能力を有する細菌であれば、いずれでもよいが、これらの菌の代表的な菌株としては、
１．メチロバチルス属に属する
メチロバチルス グリコゲネス ATCC 29475(=JCM 2850 =NCIB 11375) 、同 ATCC 21275 (=JCM 2841) 、同 ATCC 21452(=JCM 2842)、同 ATCC 21961(=JCM 2843)、同 ATCC 21852 (=JCM 2840 =NCIB 11376) 、同 ATCC 21369(=JCM 2844)、同 ATCC 21958(=JCM 2847)、同 ATCC 21963(=JCM 2848)、同 ATCC 21370(=JCM 2849)、同 ATCC 21372(=JCM 2852)、同 ATCC 21959 、同 ATCC 21371(=JCM 2853)、同 ATCC 21957 、同 ATCC 21276(=JCM 2854)、同 ATCC 21453(=JCM 2855)、同 ATCC 21962 (=JCM 2856) 、同ATCC 21704(=JCM 2857) 、同 ATCC 21960(=JCM 2858)、同 ATCC 21439 、同 NCIB 10508(=JCM 2859)、同 NCIB 10509 、同 NCIB 10510(=JCM 2860)、同 NCIB 10511 、同 NCIB 10512 (=JCM 2861) 、同 NCIB 10513 、同 NCIB 10514 、同 NCIB 10592(=JCM 2862)、同 NCIB 10593 、同 NCIB 10594(=JCM 2863)、同 NCIB 10595 、同 NCIB 10596(=JCM 2864)、同 JCM 2851(=NRRL B-5458) 、同 JCM 2866 、同 FERM P-1692、同 FERM P-1693、同 FERM P-1694、同 FERM P-2182、同 FERM P-2184、同 FERM P-2247、同 FERM P-2661、同 FERM P-2662、同 FERM P-2663、同 FERM P-4036、同 FERM P-4037、同 FERM P-4038、同 FERM P-4039、同 FERM P-4040、同 FERM P-4041、同 FERM P-4042および同 FERM P-4043
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３６巻，第５０２−５１１頁（１９８６）に準拠した）；
【０００７】
２．メチロフィルス属に属する
メチロフィルス メチロトロファス NCIB 10515 および 同 ATCC 31226 (=NCIB 11809)
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３７巻，第４４６−４４８頁（１９８７）に準拠した）；
【０００８】
３．メチロバクテリウム属に属する
メチロバクテリウム エクストロクェンス DSM 1337(=JCM 2802=NCIB 9399) 、同 JCM 2803(=NCIB 10409)、同 ATCC 8457(=DSM 1340=IAM 1081=JCM 2804=NCIB 2879) 、同 ATCC 14718(=DSM 1338=JCM 2805=NCIB 9133) および同 DSM 1339(=JCM 2806=NCIB 9686)、
メチロバクテリウム ロディナム ATCC 14821(=JCM 2811=NCIB 9421) および同 NCIB 9145、
メチロバクテリウム ロデシアナム NCIB 12249 、同 ATCC 21611(=JCM 2807)、同 ATCC 21612(=JCM 2808)、同 ATCC 21613(=JCM 2809)、同 ATCC 21614(=JCM 2810)、同 NCIB 10597 、同 NCIB 10598(=JCM 2812)、同 NCIB 10599(=JCM 2813)、同 NCIB 10600(=JCM 2814)、同 NCIB 10601(=JCM 2817)、同 NCIB 10602(=JCM 2815)、同 NCIB 10611(=JCM 2816)、同 ATCC 21438(=JCM 2821)および同 NCIB 9141、
メチロバクテリウム ザットマニ− NCIB 12243、同 NCIB 10603(=JCM 2818)、同 NCIB 10604(=JCM 2825)、同 NCIB 10606(=JCM 2819)、同 NCIB 10607(=JCM 2820)、同 NCIB 10608(=JCM 2821)、同 NCIB 10609(=JCM 2822)、同 NCIB 10610(=JCM 2823)および同 NCIB 10612(=JCM 2824)、
メチロバクテリウム オルガノフィラム ATCC 27886(=JCM 2833) およびNRRL B-3449(=JCM 2834)
メチロバクテリウム メソフィリカス ATCC 29983(=JCM 2829=NCIB 11561) 、メチロバクテリウム フジサワエンシス NCIB 12417および同 NCIB 11272 、
メチロバクテリウム ラジオトレランス IAM 12099(=ATCC 27329=JCM 2830=NCIB 10815) 、同 IAM 12098(=JCM 2831) 、同 NCIB 9142および同 NCIB 9143、
メチロバクテリウム アミノボランス JCM 8240 ならびに
メチロバクテリウム エスピ− ATCC 35064 、同 FERM P-4893、同 FERM P-4894、同 FERM P- 4895 、同 FERM P-4896、同 FERM P-4897および同 FERM P-9466
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３３巻，第８７５−８７７頁（１９８３），第３８巻，第１２４−１２７頁（１９８８）および第４３巻，第５０４−５１３頁（１９９３）に準拠した）；
【０００９】
４．アンシロバクタ−属に属する
アンシロバクタ− アキュアティクス ATCC 25396(=CCM 1786=DSM 101=NCIB 9271) 、同 ATCC 27068(=DSM 334) 、同 ATCC 27069 、同 ATCC 21373 (=DSM 1106) 、同 NCIB 10516(=DSM 2457)、同 DSM 2666(=FERM P-4416) 、同 DSM 2667(=FERM P-4417) 、同 DSM 2668(=FERM P-4418) および同 DSM 2669(=FERM P-4419) ならびに
アンシロバクタ− エスピ− DSM 1107、同 DSM 1108、同 DSM 1277 、同 DSM 2455 および同 DSM 2456
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３６巻，第４１５−４２１頁（１９８６）に準拠した）；
【００１０】
５．ハイホミクロビウム属に属する
ハイホミクロビウム ブルガレ ATCC 27500、
ハイホミクロビウム アエステュアリー NCIB 11052(=ATCC 27483) 、同 NCIB 9698(=JCM 6889) および同 DSM 1564(=ATCC 27488)
ハイホミクロビウム ホーランディカム ATCC 27498および同 ATCC 27497 、
ハイホミクロビウム ファシリス NCIB 10342(=ATCC 27485=DSM 1565)、同 NCIB 9699、同 NCIB 11053 、同 ATCC 27484 、同 NCIB 9697(=ATCC 27491) および同 ATCC 27492 、
ハイホミクロビウム ザバルジニィー DSM 1566および同 NCIB 9696、
ハイホミクロビウム メチロボラム IFO 14180(=JCM 6890)および同 NCIB 10517 ならびに
ハイホミクロビウム デニトロフィカンス DSM 1869(=NCIB 11706)
〔菌種名は、Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 3, p1895-1904, (1989)(The William & Wilkins Co., Baltimore)およびInternational Journal of Systematic Bacteriology，第４５巻，第５２８−５３２頁（１９９５）に準拠した〕；
【００１１】
６．キサントバクタ−属に属する
キサントバクタ− オ−トトロフィカス DSM 432、同 DSM 431、同 DSM 685、同 DSM 1393 、同 DSM 1618 、同 DSM 2009 および同 DSM 2267 ならびに
キサントバクタ− フラバス DSM 338(=NCIB 10071)
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第２８巻，第５７３−５８１頁（１９７８）および同，第２９巻，第２８３−２８７頁（１９７９）に準拠した）；
【００１２】
７．アシドモナス属に属する
アシドモナス メタノリカ JCM 6891(=IMET 10945)および同 JCM 3712(=FERM P-2664)
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３９巻，第５０−５５頁（１９８９）に準拠した）；
【００１３】
８．パラコッカス属に属する
パラコッカス デニトリフィカンス ATCC 17441(=DSM 65=IAM 12479=NCIB 11627) 、同 ATCC 13543(=CCM 982=NRRL B-3784) 、同 ATCC 19367 (=DSM 413=IFO 13301=NCIB 8944=NRRL B-3785)、同 CCM 1396(=DSM 415=NCIB 9722) および同 IFO 12442、ならびに
パラコッカス アルカリフィルス JCM 7364(=FERM P-9282)、同 FERM P-9280および同 FERM P-9281
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３９巻，第１１６−１２１頁（１９８９）に準拠した）；
【００１４】
９．チオバチルス属に属する
チオバチルス ノベルス ATCC 8093(=CCM 1077 =DSM 506=IFO 12443=NCIB 9113) および同 NCIB10456
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３０巻，第２２５−４２０頁（１９８０）に準拠した）；
【００１５】
１０．メチロファ−ガ属に属する
メチロファ−ガ マリ−ナ ATCC 35842(=NCMB 2244)、
メチロファ−ガ サラシカ ATCC 33146(=IAM 12458=NCMB 2163)、同 NCMB 2162(=FERM P-3622)および同 ATCC 33145 ならびに
メチロファ−ガ エスピ− FERM P-3619 、同 FERM P-3620、同 FERM P-3623および同 FERM P-3624
（菌種名は、International Journal of Systematic Bacteriology，第３７巻，第４０２−４０６頁（１９８２）に準拠した）；
【００１６】
１１．ミコバクテリウム属に属する
ミコバクテリウム メタノリカ FERM P-8823、同 FERM P-8824、同 FERM P-8825、同 FERM P-8826、同 FERM P-8827、同 FERM P-9464、同 FERM P-9465および同 FERM P-9497
（ミコバクテリウム属に属するこれらの菌株の菌学的性質は、特開昭６３−２８３８５号公報、同６４−５１０７７号公報および同６４−６０３７１号公報に記載されている）などがある。
【００１７】
なお、前記のこれらの菌株はすべて公知である。また、これらの菌株より得られた変異株も使用することが出来る。これらのＰＱＱ生産菌を培養するにあたって用いられる栄養培地は、主炭素源として、メタノ−ルを含有することが必要である。さらに培地成分として、通常の窒素源、無機物の適量が使用される。窒素源としては、通常は、たとえば、硫酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が用いられ、無機塩類としては、通常は、たとえばリン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が用いられる。また、使用菌株が栄養要求性を示す場合には、その要求性物質を培地に添加する必要がある。また、メチロファ−ガ属細菌は、生育にＮａＣｌが必要なので、培地中に、ＮａＣｌを２〜４重量％となるように添加するか、あるいは、培地作成に用いる水として海水を使用する必要がある。培養温度は、通常２５〜４５℃の範囲で各菌株にとって生育、増殖に適した温度を選択すればよい。培養ｐＨは、通常６〜８の範囲で各菌株にとって生育、増殖に適したｐＨを選択する。しかし、アシドモナス属細菌の生育ｐＨは、２．０〜５．５であり、パラコッカス アルカリフィルスの菌株の生育ｐＨは、７．０〜１０．０であるので、これらの菌株を用いる場合は、これらの範囲内のｐＨを選択する必要がある。窒素源として、アンモニウム塩を使用した場合は、菌体が増殖するに伴って培養液中のｐＨが低下するので、培養期間中の培溶液のｐＨを所定のｐＨを保つために、アンモニア、苛性カリもしくは苛性ソ−ダ等を添加して、培養液のｐＨを調節する必要がある。これらの中でアンモニアが特に好ましい。このような条件下で通気攪拌などの方法で好気培養を行うことにより、培養液中にＰＱＱが生成される。
【００１８】
次に、この培養液にα−アミノ酸およびモノメチルアミンの少なくとも一種を添加してこれらと培養液中に含有されているＰＱＱとを酸素の存在下で反応させて、使用されたα−アミノ酸またはモノメチルアミンに対応するＩＰＱ類を得る。ここで用いられるα−アミノ酸の代表例としてはグリシン、スレオニン、プロリン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、セリン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、システインなどがある。これらの化合物のうち、光学活性体のあるものは、Ｄ体、Ｌ体、あるいはラセミ体のいずれでもよい。また、モノメチルアミンとしては、塩酸塩などのモノメチルアミン塩類を用いることも可能である。
【００１９】
これらの化合物の添加時期は通常培養液中のＰＱＱ濃度が１０μg 〜１０g ／l 、好ましくは１００μg 〜１０g ／l となった時である。添加量は、培養液中のＰＱＱに対して１モル倍以上、好ましくは５モル倍以上、更に好ましくは大過剰とすることがよく、実際には０．１g ／l 以上となるよう添加する事が好ましい。本発明では通常はこのような培養液をそのまま使用するが、必要に応じて濃縮により培養液の水分の一部を除去してから使用することも妨げない。添加の方法としては一度に全量を添加する方法、逐次添加する方法どちらでも可能であるが、上記濃度とすることが必要である。反応液のｐＨは、通常は、一般に２〜10の範囲が好ましく、その最適ｐＨはＩＰＱ類の種類により異なるが、更に詳しくは後で述べる。
【００２０】
反応温度は、実用上、２０〜１００℃程度が好ましく、特に２５〜８０℃が好ましい。反応時間は４８時間以内、好ましくは１〜３０時間である。また、反応液中の溶存酸素濃度には特に制限はないが、反応を短時間で終了させるためには、０．５〜１ppm 以上が好ましい。そのために空気あるいは酸素またはその混合ガスなどを通気し、撹拌したり、さらに、反応槽の圧力を高めるなどの手段が使用される。
【００２１】
このような条件で反応させることによりＰＱＱ等を原料としてＩＰＱ類が得られる。ＰＱＱの醗酵生産が終了した後、培養液に各種アミノ酸あるいはモノメチルアミンを添加するまでの時間は、短いほど好ましく、通常は、10時間以内、好ましくは、２時間以内とされる。
【００２２】
ＩＰＱ（R=H ）はグリシン、トリプトファン、プロリン、スレオニン、チロシン、セリンおよびモノメチルアミンのうち少なくとも一種を培養液に添加することにより得られ、反応ｐＨとしてはｐＨ６〜９が特に好ましい。また、１−メチルエチルＩＰＱ（R=CH(CH3)2）はバリンを、１−メチルプロピルＩＰＱ（R=CH(CH3)CH2CH3 ）はイソロイシンを、２−メチルプロピルＩＰＱ（R=CH2CH(CH3)2 ）はロイシンを、メチルＩＰＱ（R=CH3 ）はアラニンを、２−カルボキシエチルＩＰＱ（R=CH2CH2CO2H）はグルタミン酸を、２−カルボモイルエチルＩＰＱ（R=CH2CH2CONH2 ）はグルタミンを、２−メチルチオエチルＩＰＱ（R=CH2CH2SCH3）はメチオニンを、ベンジルＩＰＱ（R=CH2-C6H5）はフェニルアラニンを、カルボキシメチルＩＰＱ（R=CH2CO2H ）はアスパラギン酸を、カルバモイルメチルＩＰＱ（R=CH2CONH2）はアスパラギンを、４−アミノブチルＩＰＱ（R=(CH2)4NH2 ）はリジンを、３−グアニジノプロピルＩＰＱ（R=(CH2)3NHCNH2）はアルギニンを、メルカプトメチルＩＰＱ（R=CH2SH ）はシステインを、メトキシメチルＩＰＱ（R=CH2OCH3 ）はＤＬ−O −メチルセリンを、ホスホリロキシメチルＩＰＱ（R=CH2OPO3H2）はＤＬ−O −ホスホリルセリンを、カルバモイルＩＰＱ（R=CO2NH2）はＤＬ−セリンアミドを、R が化２
【００２３】
【化２】
【００２４】
一方、ヒドロキシメチルＩＰＱ（R=CH2OH ）は、培養液にセリンを添加し、反応ｐＨを２〜６とすることにより得られ、最適なｐＨは４〜６である。反応ｐＨが６を越えることにより、ＩＰＱ（R=H ）が得られる。４−ヒドロキシフェニルメチルＩＰＱ（R=CH2-C6H4OH）は、培養液にチロシンを添加し、反応ｐＨを４〜８とすることにより得られ、最適なｐＨは６〜８である。反応ｐＨが８を越えることによりＩＰＱ（R=H ）が得られる。
【００２５】
このようにして得られた反応生成液から、たとえば、濾過もしくは遠心分離などの通常の固液分離手段によって、菌体などの固形分を除去し、上澄液を得る。ｐＨ２〜５などの低ｐＨでＩＰＱ類を生成させた場合、生成されたＩＰＱ類が反応生成液中で沈澱物として存在している場合もあるので、反応液および反応生成液のそれぞれのｐＨを中性乃至アルカリ性以上にし、生成されたＩＰＱ類を一旦溶解させた後、上澄液を得る必要がある。得られた上澄液からＩＰＱ類が分離・回収される。上澄液からのＩＰＱ類の分離、精製には種々の方法が用いられる。例えば沈澱法、洗浄法、限外濾過法、抽出法およびＩＰＱ類を吸着する樹脂担体を用いる方法等が挙げられる。これらの方法を単独あるいは組み合わせてＩＰＱ類を分離、精製することができる。
【００２６】
ＩＰＱ類を分離精製する方法についてさらに具体的に説明する。沈澱法としては、たとえば、塩酸、硫酸および硝酸などの無機酸ならびにトリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸およびトリフルオロメタンスルホン酸などの有機酸などにより反応生成液を酸性として、ＩＰＱ類を沈澱させる酸性沈澱法、反応生成液に、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどのアルカリ金属塩、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩を添加してＩＰＱ類を沈澱させる塩析法または反応生成液と、たとえばアセトンなどのＩＰＱ類の溶解度の低い溶媒とを混合し沈澱させる溶媒沈澱法などがある。これらの沈澱法においては、液温を低くする程、ＩＰＱ類の回収率は向上する。前記の沈澱法によって得られたＩＰＱ類の粉体、または、ＩＰＱ類を含む沈澱物を、たとえば、アセトン、ジエチルエーテルおよび酸性の水のようなＩＰＱ類を溶かしにくい溶剤で洗浄する洗浄法を適用することにより、ＩＰＱ類の純度をさらに向上させることができる。発酵法によるＩＰＱ類の生産において培養液中の高分子の夾雑物を除く必要がある場合には、限外濾過法を利用することができる。
【００２７】
限外濾過法として、セファデックスＧ−１０（商品名、ファルマシア株式会社製）およびトヨパールＨＷシリーズ（商品名、東ソー株式会社製）などのゲル濾過用樹脂担体を用いる方法あるいは各種限外濾過膜や限外濾過中空糸を用いる方法などを適用することができる。抽出法に用いる抽出剤として、水および有機溶媒等が使用される。有機溶剤としては、水との相溶性が小さい有機溶剤が好ましく、たとえば、ｎ−ブタノールのような炭素数４個以上の脂肪族アルコールが好適に使用される。ＩＰＱ類を吸着する樹脂担体を用いた方法では、ＩＰＱ類を吸着・脱離することのできる樹脂担体であれば特に制限なく利用できる。この樹脂担体の代表例として、陰イオン交換樹脂担体では、多糖系担体のＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５（商品名、ファルマシア株式会社製）、親水性ポリマー系樹脂のＤＥＡＥ−トヨパール６５０（商品名、東ソー株式会社製）およびアンバーリストＡ−２１（商品名、ローム・アンド・ハース株式会社製）などがある。また、吸着・分離型樹脂担体では、疎水性ポリマー系樹脂のダイヤイオンＨＰシリーズ（商品名、三菱化成株式会社製）およびアンバーライトＸＡＤシリーズ（商品名、ローム・アンド・ハース株式会社製）などの他にシリカ、オクタデシルシリカおよびアルミナなどがある。疎水性クロマトグラフィ用樹脂担体では、ブチル−トヨパール６５０およびフェニル−トヨパール６５０（東ソー株式会社製）などがある。ＩＰＱ類の同定には、元素分析、核磁気共鳴スペクトル、赤外吸収スペクトルおよび質量分析などの手段が用いられる。また、ＩＰＱ類の定量には、高速液体クロマトグラフィーにより行うことが出来る。
【００２８】
［ＰＱＱおよびＩＰＱ類の急性毒性および腎毒性試験］
（１）マウスに対する急性毒性試験
１）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類をマウス１kg当り２０、４０、８０、１６０および２００mgのそれぞれを腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。ＩＰＱ類としては、ＩＰＱ、１−メチルプロピルＩＰＱ、２−メチルチオエチルＩＰＱおよびベンジルＩＰＱを用いた。なお、一群は８匹とした。その結果、ＰＱＱ・Ｎａ2 ２０mg/kg 投与および４０mg/kg 投与ではマウスは死亡しなかったが、８０mg投与で５匹、１６０mg投与および２００mg投与で８匹全部死亡した。ＰＱＱ・Ｎａ2 のＬＤ50は約７０mg/kg マウスであった。一方、ＩＰＱ類では全てのマウスが死亡しなかった。
【００２９】
２）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＩＰＱをマウス１kg当り０．１g 、０．２g 、０．４g 、０．８g あるいは１．２g のそれぞれを腹腔投与し、１４日間、２５℃で飼育した。なお、一群は８匹とした。ＩＰＱ０．１〜０．４g 投与ではすべてのマウスが死亡せず、０．８g では２匹、１．２g では６匹が死亡した。ＬＤ50は約１．０g/kgマウスであった。３）ＳＰＦ−ＩＣＲマウス 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＩＰＱをマウス１kg当り１．０g 、１．５g あるいは２．０g をそれぞれ経口投与し、１４日間、２５℃で飼育した。一群は８匹とした。その結果、すべてのマウスは死亡しなかった。
１）〜３）の結果より、ＩＰＱ類はＰＱＱに比べて毒性が著しく低下していたことがわかる。
【００３０】
（２）マウスに対する腎毒性
１）尿検査による腎毒性
急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類を腹腔投与し、マウスを飼育した。毎日、マウスの尿を採取し、臨床検査試薬（商品名：ウリステックスＩＩ、マイルス・三共株式会社製）を用いてグルコ−ス濃度を調べた。第１表に示すように、ＰＱＱ・Ｎａ2 を投与したマウスの尿からは糖が検出されたが、ＩＰＱ類を投与したマウスの尿からは糖が検出されなかった。すなわち、ＰＱＱは腎毒性が認められたが、ＩＰＱ類では腎毒性が認められなかった。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
２）血液検査による腎毒性
（イ）急性毒性試験と同様にして、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類を腹腔投与し、マウスを飼育した。投与１日後に絶食（水は与える）し、さらに18時間後に採血して血清を得た。血清中のグルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニン（Creatinine）を臨床検査試薬（商品名：富士ドライケムスライド、富士写真フィルム株式会社製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均値で示した。結果を第２表に示す。
【００３３】
ＰＱＱ・Ｎａ2 投与では、グルコ−スの大幅な減少、尿素態窒素およびクレアチニンの大幅な増加がみられ、腎毒性が認められた。これに対してＩＰＱ類の投与では、グルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニンのそれぞれの含有量は「無投与」の場合と大差なかった。
【００３４】
【表２】
（ロ）急性毒性試験と同様にして、ＩＰＱを１５０mg、３００mg、４００mgあるいは６００mg/kg 腹腔投与し、マウスを１日飼育した。その後、絶食（水は与える）し、さらに18時間後に採血して血清を得た。血清中のグルコ−ス、尿素態窒素およびクレアチニン（Creatinine）を臨床検査試薬（商品名：富士ドライケムスライド、富士写真フィルム株式会社製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均値で示した。結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
（３）ラットに対する腎毒性
Wistarラット 雄、５週齢（チャ−ルズリバ−株式会社製）に、ＰＱＱ・Ｎａ2 およびＩＰＱ類をラット１kg当り４０mgそれぞれ腹腔投与し、７日間、２５℃で飼育した。なお、一群は５匹とした。その結果ＰＱＱ・Ｎａ2 では３日目に１匹、５日目に２匹死亡したが、ＩＰＱ投与では死亡ラットはみられなかった。ＰＱＱ・Ｎａ2 のラットに対する急性毒性は約４０mg/kg ラットであった。
投与前（０日目）、投与後１日目、３日目、５日目および７日目に血液（血清）および尿を採取した。血清中の尿素対窒素、クレアチニン、グルタミン酸オキサル酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）およびグルタミン酸ピリビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）を、富士ドライケムスライトを用いて測定した。また、尿中のグルコース濃度をエームス尿検査試験紙−ウリステックスＩＩ（マイルス・三共株式会社製）を用いて測定した。結果を第４に示す。
【００３８】
ＰＱＱ投与により、血清中の尿素態窒素、クレアチニン、およびＧＯＴまた尿中のグルコース濃度が増加した。その量は、特に投与１〜３日目が高く、その後低下する傾向が見られた。一方、ＩＰＱ投与では全期間を通じて、何ら変化はみられなかった。つまり、ラットに対して、ＰＱＱは腎毒性を示したがＩＰＱは毒性を示さなかった。
【００３９】
【表４】
【実施例】
以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、チアミン塩酸塩 ４mg、パントテン酸カルシウム ４mg、ビオチン ２０μｇおよびメタノ−ル １２mlを溶解し、ｐＨが ７．１に調整された液２００mlを１ｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間滅菌し、これを培地とした。これに前記と同様な培地を用いて３０℃で２日間前培養された各種菌株（表５に示す）の培養液をそれぞれ１容量％接種し、３０℃で回転振盪培養を行なって、培養開始３日後に培養液を得た。
【００４１】
これらの培養液をそれぞれ２等分し、一方にはグリシンを０．３g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、２４時間、３０℃で回転振盪してＩＰＱ生成液を得た。残り一方には、Ｌ−セリンを０．４g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間、回転振盪して反応を行い、ヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中に含まれているＩＰＱ類量を測定した。結果を表５に示す。
【００４２】
なお、ＩＰＱ類量は、次に示す高速液体クロマトグラフで求めた（以下の実施例でも同様）。
機器：島津製作所製高速液体クロマトグラフ
カラム：ＹＭＣ ＯＤＳ Ａ−３０２
（４．６mmφ×１５０mm）
展開液：0.1M KH2PO4 、0.1M HClO4/CH3CN：H2O
＝ １：９ ( ｐＨ ２．５)
流速：１．５ ／min
検出器：島津ＳＰＤ−６ＡＶ
ＵＶ−ＶＩＳ検出器（２５９nmおよび４２０nm）
【００４３】
【表５】
実施例２
純水１ｌあたり、(NH4)2SO4 ３g 、KH2PO4 ４g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・ XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、パントテン酸カルシウム ４mg、およびメタノ−ル１２mlを溶解し、ｐＨが４．５に調整された培地を使用した以外は実施例１と同様にして、アシドモナス メタノリカ JCM 6891を３日間培養し、培養液を得た。この培養液を二等分し、一方には、モノメチルアミン塩酸塩を０．３g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、２４時間３０℃で撹拌してＩＰＱ反応生成液を得た。残り一方には、Ｌ−セリンを０．４g/ となるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間、回転振盪して反応を行い、ヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中に含まれるＩＰＱ類量を測定した。結果を表６に示す。
【００４５】
実施例３
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３ｇ、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、ビオチン２０μg およびメタノ−ル１２mlを溶解し、１２０℃で２０分間殺菌し、その後に、Na2CO3 １０重量％水溶液を無菌的に加え、ｐＨが９．０に調整された培地を使用した以外は、実施例１と同様にしてパラコッカス アルカリフィルス ＪＣＭ 7364 を３日間培養し、培養液を得た。この培養液を二等分し、一方には、Ｌ−セリンを０．４g/ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、３０℃で２４時間撹拌して、ＩＰＱ反応生成液を得た。残り一方には、Ｌ−セリンを０．４g/ｌとなるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間撹拌してヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して上澄液を得、その中に含まれるＩＰＱ類を測定した。結果を表６に示す。
【００４６】
実施例４
海水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３．０g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・ XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O 5mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mg、メタノ−ル１２mlを溶解し、ｐＨが７．１に調整された培地を使用した以外は、実施例１と同様にして、メチロファ−ガ属細菌を３日間培養し、培養液を得た。この培養液を二等分し、一方には、Ｌ−スレオニンを ０．５g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ８．５に調整し、３０℃で２４時間撹拌してＩＰＱ反応生成液を得た。残り一方には、Ｄ−セリンを０．４g ／ｌとなるよう添加し、ｐＨ４．０に調整し、３０℃で２４時間撹拌してヒドロキシメチルＩＰＱ生成液を得た。これらの反応生成液を遠心分離して、上澄液を得、その中に含まれるＩＰＱ類を測定した。結果を表６に示す。
【００４７】
【表６】
実施例５
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３．０g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O ３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mgおよびメタノ−ル８mlを溶解し、ｐＨが７．１に調整された液２００mlを１ｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間滅菌し、これを培地とした。これにハイホミクロビウム ブルガレ NCIB 9775 を接種し、３０℃でロ−タリ−シェ−カ−で回転数２２０回／分の回転振盪培養して得られた。この培養液を種母液とした。
【００４９】
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 １．０g 、MgSO4 ・7H2O １．０g 、KH2PO4１．４g を溶解した培地１５ｌを３０ｌ容培養槽に入れ、滅菌した。純水１０mlあたりに、FeSO4 ・7H2O ７５mg、ZnSO4 ・7H2O １５０mg、CaCl2 ・2H2O １５０mg、NaCl １５０mg、MnSO4 ・4 〜5H2O ４５mg、H3BO3 ３mg、CuSO4 ・5H2O １．５ mg 、CoCl2 ・2H2O 1.5mg、KI １．５mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O １．５mgを溶解したミネラル溶液を殺菌した。３０ｌ容培養槽の温度が３０℃に低下した後、槽内の培地に、このミネラル溶液１０mlを無菌的に加え、さらにアンモニア水を無菌的に添加して培養液のｐＨを６．８に調整した。この培養槽内に、メタノ−ルを１５０mlおよび前記の種母液２００mlを無菌的に加え、通気量１０ｌ／min 、回転数３００回／分で撹拌しつつ温度３０℃、培養液 ｐＨを６．８になるようにアンモニア水を添加しながら培養した。細菌が増殖するに従って、培養液中のメタノ−ル濃度が低下したが、排気ガス中のメタノ−ルをガスクロマトグラフィ−で分析することにより検出し、培養液中のメタノ−ル濃度が０．１〜０．５重量％になるようにメタノ−ルを補充した。
【００５０】
このような方法により、７基の３０ｌ容培養槽で１０日間培養し、各々の培養槽内の培養液に（１）グリシン ９０g 、（２）Ｌ−セリン １２０g 、（３）Ｄ−セリン １２０g 、（４）Ｌ−スレオニン １５０g、（５）Ｄ−スレオニン １５０g 、（６）Ｌ−プロリン １５０g 、（７）Ｄ−プロリン １５０g、（８）Ｌ−チロシン ２１０g 、（９）Ｄ−チロシン ２１０g 、（１０）Ｌ−トリプトファン ２４０g 、（１１）Ｄ−トリプトファン ２４０g および（１２）モノメチルアミン塩酸塩７５g をそれぞれ添加し、反応液のｐＨを８．５になるように調節しながらさらに２４時間反応を行って反応生成液を得た。反応生成液中のＩＰＱの蓄積量を表７に示す。
【００５１】
【表７】
実施例６
菌株として、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ 1869 を使用した以外は、実施例５と同様にして、７基の３０ｌ容培養槽で１０日間培養した培養液に、グリシンを（１）４．５g 、（２）９．０g 、（３）１５．０g 、（４）４５g 、（５）７５g 、（６）１５０g および（７）２２５g をそれぞれ添加し、反応液のｐＨを８．０になるように調節しながらさらに５時間培養を行って反応生成液を得た。反応生成液中ＩＰＱ蓄積量を表８に示す。
【００５３】
【表８】
実施例７
実施例６と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ
1869の培養を８基の３０ｌ容培養槽で１０日間行なった。その後、各々の培養槽の培養液のｐＨを（１）ｐＨ ３．０、（２）ｐＨ４．０、（３）ｐＨ５．０、（４）ｐＨ６．０、（５）ｐＨ７．０、（６）ｐＨ ８．０、（７）ｐＨ９．０および（８）ｐＨ１０．０とし、グリシン３０g を各々の培養槽中の培養液に添加し、さらに３時間反応を行って反応生成液を得た。各培養槽の反応生成液をそのまま遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ量および前記（１）〜（５）について、反応生成液のｐＨを８．５に調整した後に遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ量をそれぞれ表９に示す。
【００５５】
【表９】
実施例８
実施例６と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ
1869の培養を８基の３０ｌ容培養槽で１０日間行なった。その後、各々の培養槽の反応液のｐＨを（１）ｐＨ２．０、（２）ｐＨ３．０、（３）ｐＨ４．０、（４）ｐＨ５．０、（５）ｐＨ ６．０、（６）ｐＨ７．０、（７）ｐＨ８．０、（８）ｐＨ９．０、（９）ｐＨ１０．０ とし、Ｌ−セリン ４２g を各々の培養槽中の培養液に添加し、5時間反応を行って反応生成液を得た。各培養槽の反応生成液をそのまま遠心分離して得られた分離液中のＩＰＱおよびヒドロキシメチルＩＰＱ量ならびに反応生成液のｐＨを8.5 に調整した後、遠心分離した場合の分離液中のＩＰＱおよびヒドロキシメチルＩＰＱ量を表１０および表１１に示す。
【００５７】
【表１０】
【表１１】
実施例９
実施例６と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス ＤＳＭ1869の培養を４基の３０ｌ容培養槽で１０日間行なった。その後、各々の培養槽内の培養液の温度を（１）２０℃、（２）３０℃、（３）４０℃、（４）５０℃、（５）７０℃とし、Ｌ−スレオニン ４８g を各々の培養槽内の培養液に添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながら５時間反応を行って反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱ蓄積量を表１２に示す。
【００６０】
【表１２】
実施例１０
実施例６と同様にして、メチロバチルス グリコゲネス FERM P-2247 を培養した。培養開始４日目の培養液に、モノメチルアミン塩酸塩 ２７g を添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながらさらに６時間培養を続けて反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱの蓄積量は、220mg ／ｌであった。
【００６２】
実施例１１
実施例６と同様にして、パラコッカス デニトリフィカンス ATCC 19367を培養した。培養開始１０日目の培養液に、Ｄ−セリン４２g を添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながら反応を６時間行って反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱの蓄積量は、１４０mg／ｌであった。
【００６３】
実施例１２
培地に使用する水として、海水を用いた他は、実施例６と同様にして、メチロファ−ガ サラシカ ATCC 33146を培養した。培養開始１０日目の培養液に、Ｄ−スレオニン４８g を添加し、培養液のｐＨを８．０に調整しながら反応を6時間行って反応生成液を得た。反応生成液のＩＰＱの蓄積量は１６３mg／ｌであった。
【００６４】
実施例１３
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 ３g 、KH2PO4 １．４g 、Na2HPO4 ２．１g 、MgSO4 ・7H2O ０．２g 、CaCl2 ・2H2O ３０mg、FeC6H5O7・XH2O３０mg、MnCl2 ・4H2O ５mg、ZnSO4 ・7H2O ５mg、CuSO4 ・5H2O ０．５mgおよびメタノ−ル１２mlを溶解し、ｐＨが７．１に調整された液２００mlを１ｌ容三角フラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌し、これを培地とした。これにハイホミクロビウム ブルガレ NCIB 9775を接種し、３０℃でロ−タリ−シェ−カ−で回転数２２０回／分の回転振盪培養によって得られた培養液を種母液とした。
【００６５】
純水１ｌあたりに、(NH4)2SO4 １g 、MgSO4 ・7H2O １g 、KH2PO4 １．４g を添加した培地１５ｌを３０ｌ容培養槽に入れ、滅菌した。純水１０mlあたりに、FeSO4 ・7H2O ７５mg、ZnSO4 ・7H2O １５０mg、CaCl2 ・2H2O １５０mg、NaCl １５０mg、MnSO4 ・4 〜5H2O ４５mg、H3BO3 ３mg、CuSO4 ・5H2O １．５mg、CoCl2 ・2H2O １．５mg、KI １．５mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O １．５mgを溶解したミネラル溶液を滅菌した。３０ｌ容培養槽の温度が30℃に低下した後、前記の槽内の培地にこのミネラル溶液１０mlを無菌的に加え、さらにアンモニア水を無菌的に添加して、培養液のｐＨを６．８に調整した。
この培養槽内に、メタノ−ルを１５０mlおよび前記の種母液２００mlを無菌的に加え、通気量１０ｌ／分、回転数３００回／分で撹拌しつつ、温度３０℃、アンモニア水を添加しながら培養液のｐＨを６．８に維持しながら培養した。細菌が増殖するに従って、培養液中のメタノ−ル濃度が低下したが、それを排気ガス中のメタノ−ルをガスクロマトグラフィ−で分析することにより検出し、この低下分に相当する量のメタノ−ルを補充して培養液中のメタノ−ル濃度を０．１〜０．５重量％に維持した。
【００６６】
このような方法により、２台の３０ｌ 容培養槽で１０日間培養し、各々の培養槽内の培養液のｐＨを塩酸で４．０に調整したのち、（１）Ｌ−セリン １２０g ／１５ｌおよび（２）Ｄ−セリン１２０g ／１５ｌとなるよう、それぞれ添加し、空気で通気撹拌しつつ、培養液のｐＨを４．０になるように調節しながら、３０℃で２４時間反応を行なって反応生成液を得た。反応生成液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離し、上澄液を得た。上澄液中に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量を表１３に示す。
【００６７】
【表１３】
実施例１４
菌株として、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス DSM 1869を使用した以外は、実施例１３と同様にして、３０ｌ容培養槽で１０日間培養し、その後、培養液のｐＨを４．０に調整し、Ｌ−セリンを４２g 添加し、反応を行なった。Ｌ−セリンを添加した後、各時間毎に反応生成液を採取し、ｐＨ７に調整した後遠心分離し、その反応生成液に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱ量を測定した。その結果を表１４に示す。
【００６９】
【表１４】
実施例１５
菌株を変更した以外は、実施例１３と同様にして、メチロバチルス グリコゲネス FERM P-2247 の培養を３０ｌ容培養槽で４日間行なった。その後、培養槽中の培養液のｐＨを４．５に調整し、Ｌ−セリン４２gを添加し、６時間反応を行ない、反応生成液を得た。反応生成液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離し、上澄液を得た。上澄液中に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量は、１ｌあたり２００mgであった。
【００７１】
実施例１６
菌株を変更した以外は実施例１３と同様にして、パラコッカス デニトリフィカンス ATCC 19367の培養を３０ｌ容培養槽で１０日間培養した。その後、培養槽中の培養液のｐＨを６．０に調整し、Ｄ−セリン４２g を添加し、６時間反応を行ない、反応生成液を得た。ヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量は、反応生成液１ｌあたり１１０mgであった。
【００７２】
実施例１７
菌株を変更し、培地に使用する水として海水を用いた他は、実施例１３と同様にして、メチロファ−ガ サラシカ ATCC 33146を３０ｌ容培養槽で１０日間培養した。その後、培養槽中の反応液のｐＨを４．０に調整し、ＤＬ−セリン４２g を添加して、空気で通気撹拌しながら３０℃で６時間反応を行なって、反応生成液を得た。反応生成液のｐＨを７．０に調整した後、遠心分離し、上澄液を得た。その上澄液中に含まれるヒドロキシメチルＩＰＱの蓄積量は１ｌ当たり１４２mgであった。
【００７３】
実施例１８
実施例１４と同様にして、ハイホミクロビウム デニトロフィカンス DSM 1869の培養を３０ｌ容培養槽を用いて行い、培養液１５ｌを得た。この培養液を各々２００mlづつを１ｌ容三角フラスコに入れ、各種アミノ酸を０．６g づつ添加し、ＮａＯＨあるいはＨＣｌを用いてｐＨ４、７あるいは９とし、３０℃で振盪させながら２４時間反応を行って反応生成液を得た。各フラスコの反応生成液のｐＨを７．０に調整した後に遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ類蓄積量をそれぞれ表１５に示す。
【００７４】
【表１５】
を示し、具体的な対応は次の表１６の通りである。
【００７５】
【表１６】
実施例１９
実施例１８で用いたＰＱＱ含有培養液と同じ培養液を各々２００mlづつ１２個の１ｌ容三角フラスコに入れた。各々のフラスコに、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−セリンあるいはL-システインを各々０．６gづつ添加し、ＮａＯＨあるいはＨＣｌを用いてｐＨを４、７あるいは９とし、３０℃で振盪させながら２４時間反応を行って反応生成液を得た。各フラスコの反応生成液のｐＨを７．０に調整した後に、遠心分離して得られた上澄液中のＩＰＱ類蓄積量をそれぞれ表１７に示す。各々の反応液中には、各々のアミノ酸に対応するＩＰＱ類の他に、ＩＰＱも存在した。
【００７７】
【表１７】
【表１８】
実施例２０
実施例９のうち培養槽内の培養液の温度を３０℃として得たＩＰＱ含有反応液を１２，０００×g で２０分間遠心分離した上澄液を用いてＩＰＱの回収実験を行った。各々５０mlづつをＨＣｌを用いて、ｐＨ７．２、６．５、５．７、５．０、４．７、４．２、３．７、３．１、２．６、２．１、１．５および１．０に調整し、室温で４時間放置後、１２，０００×g で２０分間遠心分離し、ＩＰＱを沈澱として回収した。上澄液中に残存するＩＰＱを高速液体クロマトで分析した結果を第１９表に示す。ＩＰＱはｐＨ４以下で沈澱として回収できることがわかる。
【００８０】
【表１９】
【発明の効果】
本発明により、細菌を使用して得られたＰＱＱを含有する培養液からＰＱＱを分離・回収・精製することなくイミダゾピロロキノリン類を容易にかつ安定的に得ることが可能である。
Claims (1)
- メタノ−ルを炭素源とする培地中でピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を培養してピロロキノリンキノンを含有する培養液を得、該培養液に各種アミノ酸およびモノメチルアミンから選ばれた少なくとも１種を添加し、ピロロキノリンキノンと各種アミノ酸およびモノメチルアミンから選ばれた少なくとも１種とを酸素の存在下で反応させイミダゾピロロキノリン類を生成させることを特徴とするイミダゾピロロキノリン類の製造法。
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