JP3653564B2 - 安定な測定試薬及び測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法であり、前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である測定試薬及び測定方法に関し、開封状態においても長期間安定に使用することができる測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
試薬には、不安定なものが多く、保存中に劣化して使用できなくなってしまうことが多々ある。
特に、臨床検査試薬を自動分析装置で使用するといった、試薬を開封状態で使用せざるを得ない場合には、開封状態とすることにより生じる種々の要因により、試薬の劣化は著しい。
【０００３】
例えば、空気中の酸素が試薬に溶け込むことにより、試薬中の成分が酸化され、劣化してしまうことがある。
また、空気中の二酸化炭素が試薬中に溶け込むことにより、試薬のｐＨが低下し、本来の機能が果たせなくなってしまうことがある。
更に、試薬中に二酸化炭素が溶け込むことにより、被検物質（測定しようとする物質）が二酸化炭素により阻害を受けてしまい、正確な測定が出来なくなってしまう場合もある。
【０００４】
最近、近傍の他の試薬中の成分が気化し、その気化した成分が試薬に溶け込むことにより、試薬が劣化してしまうという問題が生じてきた。
【０００５】
例えば、酸化酵素により生じた過酸化水素を４−アミノアンチピリン等の色原体とアニリン誘導体等のカプラーとパーオキシダーゼにより色素に導く検出反応系を使用する試料中の被検物質の測定試薬（いわゆるトリンダー試薬）においては、他の試薬に防腐剤として含有させたアジ化ナトリウムがアジ化水素として気化し、その近傍のトリンダー試薬に溶け込み、被検物質が存在しないにもかかわらず、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）等の電子供与基を有するアニリン誘導体を発色させてしまい、測定に用いることが出来なくなることが知られている。
【０００６】
更に、自動分析装置においては、アジ化物等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物等がその試薬に混入し、上記等の電子供与基を有するアニリン誘導体を発色させてしまい、測定に用いることが出来なくなることが知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように従来の試薬は、アジ化物等の近傍の試薬に含まれる成分が気化し、これが試薬に溶け込み、試薬を劣化させ、機能を低下させるものであった。
【０００８】
更に、従来の試薬は、アジ化物等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物等がその試薬に混入し、試薬を劣化させ、機能を低下させるものであった。
【０００９】
本発明者らは、この従来の酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる被検物質の測定試薬及び測定方法が有する問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、且つ第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満になるように測定試薬を構成することにより、試薬の劣化や機能の低下を防止できることを見出し、開封状態においても長期間安定に使用することができる測定試薬及び測定方法を完成するに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定試薬において、（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、（ロ）もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である、ことを特徴とする、２試薬系の試料中の被検物質の測定試薬である。
【００１１】
そして、本発明の測定試薬においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上であることが好適である。
【００１２】
更に、本発明の測定試薬においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上であることが特に好適である。
【００１３】
なお、本明細書におけるｐＨの値は、特に言及していない限り２０℃における値である。
【００１４】
また、本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定方法において、（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、（ロ）もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ末満である、２試薬系の測定試薬を用いることを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法である。
【００１５】
そして、本発明の測定方法においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上であることが好適である。
【００１６】
更に、本発明の測定方法においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上であることが特に好適である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明による試料中の被検物質の測定方法及び測定試薬は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用い、試料中の被検物質の測定を行うものであり、▲１▼前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、▲２▼もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ末満である、ことを特徴とするものである。
【００１８】
本発明における、電子供与基を有するアニリン誘導体としては、例えば、アニリンのアミノ基の１つ又は２つの水素原子が置換されたアニリン誘導体からなり、前記アニリン誘導体のベンゼン環の３位又は５位の水素原子の一方又は両方が電子供与基で置換されていて、場合により、前記アニリン誘導体のベンゼン環の４位の水素原子がハロゲン原子で置換されている化合物である。
なお、上記の電子供与基を有するアニリン誘導体において、置換している官能基は、アニリン誘導体の４位の炭素原子が活性化される官能基、又はマイナスＩ効果を有する官能基であることが好ましい。
また、本発明の電子供与基を有するアニリン誘導体における電子供与基としては、例えば、メトキシ基［−Ｏ−ＣＨ３］、エトキシ基［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３］、プロポキシ基［−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＣＨ３］、イソプロポキシ基［−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）２］、エチル基［−ＣＨ３−ＣＨ３］、プロピル基［−（ＣＨ２）２−ＣＨ３］、イソプロピル基［−ＣＨ（ＣＨ３）２］等が挙げられる。
また、本発明の電子供与基を有するアニリン誘導体のアミノ基の水素原子を置換する官能基としては、炭素数が１〜５のアルキル基又は炭素数が１〜５のアミノアルキル基等を挙げることができ、このアルキル基又はアミノアルキル基の水素原子は１つ又は２つ以上の水酸基、カルボキシル基、スルホン基、アシル基、サクシニル基、又はこれらの塩等で置換されていてもよい。
そして、本発明の電子供与基を有するアニリン誘導体のベンゼン環の４位の水素原子を置換するハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等を挙げることができる。
【００１９】
本発明における、電子供与基を有するアニリン誘導体である色原体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）等を挙げることができる。
【００２０】
また、本発明において、測定を行う試料としては、被検物質が存在する可能性があり、且つその被検物質の存在の有無の確認又は定量を行おうとするものをいう。
例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト若しくは動物の肝臓、胃、脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽出液等が挙げられる。
【００２１】
本発明において、測定を行う被検物質としては、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系により測定が行えるものであればいずれのものでもよい。
例えば、総コレステロール、遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、レムナント様リポタンパク−コレステロール、β−リポタンパク質、トリグリセライド（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡＮＦＦＡ）、グルコース、乳酸、ピルビン酸、ガラクトース、２・３−ＤＰＧ、シアル酸、クエン酸、フルクトサミン、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、グリコーゲン、フコース、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビン、クレアチニン、クレアチン、尿酸（ＵＡ）、ナトリウム、クロール、カリウム、カルシウム、無機リン、マグネシウム、胆汁酸、リパーゼ、リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）、コリンエステラーゼ（Ｃｈ−Ｅ）等が挙げられる。
【００２２】
本発明における第１の試薬は、前記の電子供与基を有するアニリン誘導体である色原体を含有するものであり、且つｐＨが７．５以上であるものである。
なお、後に実施例に示すように、本発明における測定試薬及び測定方法の開封状態における安定性は、ｐＨに依存している。即ち、この第１の試薬のｐＨが、７．５を過ぎてアルカリ側に傾くにつれて、開封状態における安定性が向上していくので、安定性の面から言うと、第１の試薬のｐＨは、７．５以上であって、より高い方が望ましい。この第１の試薬のｐＨは、７．８以上であることが好ましく、特に８．０以上であることが好ましい。
但し、ｐＨがあまり高すぎると、後記のようなこの第１の試薬に含まれている、色原体、酵素の基質、共役酵素、補酵素、又はタンパク質等が、変性、劣化、分解する恐れがあり好ましくない。
よって、第１の試薬のｐＨは、１２以下とするのが好ましく、特にｐＨ１１以下とすることが好ましい。
【００２３】
本発明におけるもう一方の試薬である第２の試薬は、ｐＨが第１の試薬のｐＨ未満であるものである。
そして、第２の試薬のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることにより、試料、第１の試薬及び第２の試薬を混合した最終反応液のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることができるので、第１の試薬のｐＨが測定反応の至適ｐＨ域より高かったとしても、最終反応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定することができる。
例えば、尿酸、総コレステロール等の測定試薬においては、測定反応の至適ｐＨが６．５〜７．２であるので、第１の試薬のｐＨが７．５以上であっても、第１の試薬のｐＨ未満である第２の試薬を混合することにより、最終反応液のｐＨを至適ｐＨ、即ち６．５〜７．２に設定することができるので、本発明の測定試薬及び測定方法は尿酸、総コレステロール等の測定試薬においては特に有用である。
但し、この第２の試薬において、ｐＨがあまり低すぎると、後記のようなこの第２の試薬に含まれている、酵素の基質、共役酵素、補酵素、又はタンパク質等が、変性、劣化、分解する恐れがあり好ましくない。
よって、第２の試薬は、ｐＨ２以上とするのが好ましく、特にｐＨ３以上とすることが好ましい。
【００２４】
また、電子供与基を有するアニリン誘導体を色原体として用いることで、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系におけるビリルビンによる負誤差の影響を回避することができる。しかし、前記色原体を含有する試薬は、アジ化物等により、試薬が劣化、又は機能が低下してしまうものであった。
本発明による測定試薬及び測定方法によれば、前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨを７．５以上に設定することで、アジ化物等による影響を回避することができるので、前記色原体を使用してビリルビンによる影響をも回避することができる。
なお、このビリルビンの影響を回避する場合には、最終反応液のｐＨを７．５以下、好ましくは７．０以下にすることが望ましい。
そこで、第２の試薬のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることにより、試料、第１の試薬及び第２の試薬を混合した最終反応液のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることができるので、第１の試薬のｐＨが７．５より高かったとしても、最終反応液のｐＨを７．５以下に設定することができる。
【００２５】
なお、本発明の測定試薬及び測定方法において、最終反応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定するには、例えば、以下のように行えばよい。
まず、第１の試薬において、色原体の発色の抑制に効果のあるｐＨ７．５以上のｐＨと緩衝剤濃度を選択する。
次に、第１の試薬のｐＨ未満の数種類のｐＨを有し、適当な緩衝剤濃度の数種類の第２の試薬を、第１の試薬及び試料と所定の量比で混合し、最終反応液のｐＨを確認し、測定反応の至適ｐＨ域に入った第２の試薬のｐＨと緩衝剤濃度を選択する。
【００２６】
ここで、ｐＨ７．５以上に緩衝能を持つ緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸緩衝液、イミダゾール、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等を挙げることができる。また、ｐＨ７．５未満に緩衝能を持つ緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸緩衝液、イミダゾール、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ等を挙げることができる。
更に、本発明における第１の試薬には、ＤＩＰＳＯ又はＴＥＳを含有させることが好ましい。
【００２７】
なお、試料はその量比が小さく、最終反応液のｐＨにほとんど寄与しないので、第１の試薬と第２の試薬の混合液のｐＨをもって、ｐＨの確認を行ってもよい。
【００２８】
また、本発明における第１の試薬及び第２の試薬には、酵素の基質、共役酵素、補酵素、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐剤、試料中に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤、界面活性剤、賦形剤又は活性化剤等を適宜必要に応じて含有させることができる。
【００２９】
本発明における、測定値に誤差を生じさせるアジ化物を含む試薬としては、例えば、防腐剤等の用途のためアジ化ナトリウムなどのアジ化物が処方されている各種の測定試薬等を挙げることができる。
【００３０】
そして、このアジ化物が溶け込むことにより劣化し、機能が低下する試薬としては、前記の電子供与基を有するアニリン誘導体を色原体として用いる試薬を挙げることができる。
【００３１】
この測定試薬及び測定方法により測定を行う場合、測定は反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイント法）のいずれによるものでも良く、測定ステップは第１の試薬及び第２の試薬を用いて２ステップ法により行えばよく、測定波長は紫外部、可視部、又は赤外部の適当な波長を使用することができ、測定反応の温度は３０℃又は３７℃等測定反応が進行し且つ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、又は変質しない範囲内の温度を設定すれば良く、測定反応の開始方法は基質を加えることにより行う方法又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でも良く、そして測定の手法は用手法又は自動分析装置などの装置による方法のいずれをも用いることができる。
【００３２】
本発明における測定においては、試料、第１の試薬及び第２の試薬を混合する順序は、特に制限はなく、用いる測定試薬、測定装置に応じて適宜定めればよい。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
（気体の溶け込みによる試薬の劣化防止効果の実証）
アジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬、及び気化したアジ化物の溶け込みにより発色してしまうＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）含有試薬の組み合わせにおける、ＨＤＡＯＳ含有試薬の気化したアジ化物の溶け込みによる発色、劣化の度合いを確かめた。
【００３４】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウム含有試薬
下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。
【００３５】
次に、試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に、このアジ化ナトリウム含有試薬の３ｍＬを注入し、これを「アジ化ナトリウム含有試薬」とした。
【００３６】
▲２▼ＨＤＡＯＳ含有試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５（２０℃）のものをそれぞれ調製した。
【００３７】
５種類のｐＨに調整した前記の試薬を各々試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に３ｍＬずつ注入し、これをｐＨの異なる５種類の「ＨＤＡＯＳ含有試薬」とした。
【００３８】
（２）試薬の保存
上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、及びＨＤＡＯＳ含有試薬を下記の５種類の組み合わせでビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、５℃の冷蔵庫にて１７日間保存した。なお、各試験管の口に栓はしなかった。
ａ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ６．５）
ｂ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．０）
ｃ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．５）
ｄ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．０）
ｅ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．５）
【００３９】
（３）保存した試薬の発色の判定
保存開始時及び保存１日後、４日後、７日後、１１日後、並びに１７日後に、上記（２）で５℃の冷蔵庫にて保存した、ｐＨの異なる５種類のＨＤＡＯＳ含有試薬が、発色しているか否かを目視で判定した。
【００４０】
（４）判定結果
試薬の発色の判定結果を表１に示した。
【００４１】
【表１】
【００４２】
この表より、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ６．５）」の組み合わせの場合は、保存１日後にして、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．０）」の組み合わせの場合は、保存４日後で既に発色してしまっていることが分かる。
これに対して、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．５）」の組み合わせの場合は、保存４日後でも発色しておらず、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．０）」の組み合わせの場合は、保存７日後でも発色していないことが分かる。
更に、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．５）」の組み合わせの場合は、保存１７日後でさえも発色していないことが分かる。
【００４３】
このことにより、ＨＤＡＯＳ含有試薬（第１の試薬）のｐＨを７．５以上に設定すれば、アジ化ナトリウム含有試薬から気化したアジ化物がＨＤＡＯＳ含有試薬に溶け込んでもＨＤＡＯＳ含有試薬の発色を抑え、試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００４４】
［実施例２］
（アジ化物の混入による試薬の劣化防止効果の実証）
アジ化ナトリウムの混入により発色してしまうＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）含有試薬にアジ化ナトリウムを添加して、試薬プローブ等よりアジ化ナトリウムが混入した場合の試薬を作り出し、ＨＤＡＯＳ含有試薬のｐＨを変更したことによる発色、劣化の度合いを確かめた。
【００４５】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５（２０℃）のものをそれぞれ調整した。
【００４６】
５種類のｐＨに調整した試薬を各々試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に、３ｍＬずつ注入し、これを「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」とした。
【００４７】
（２）試薬の保存
上記（１）で調製した５種類の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」を密栓して、５℃の冷蔵庫にて１７日間保存した。
ａ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ６．５）
ｂ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．０）
ｃ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．５）
ｄ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．０）
ｅ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．５）
【００４８】
（３）試薬の発色の判定
保存開始時及び保存１日後、４日後、７日後、１１日後、並びに１７日後に、ｐＨの異なる５種類の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」が、発色しているか否かを目視で判定した。
【００４９】
（４）測定結果
試薬の発色の判定結果を表２に示した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
この表より、ｐＨ６．５の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存１日後にして、ｐＨ７．０の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存４日後で既に発色していることが分かる。
これに対して、ｐＨ７．５の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ８．０の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存７日後でも発色していないことがわかる。更に、ｐＨ８．５の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存１７日後でさえも発色していないことが分かる。
【００５２】
このことにより、ＨＤＡＯＳ含有試薬のｐＨを７．５以上に設定すれば、アジ化物が混入してもＨＤＡＯＳ含有試薬の発色を抑え、試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００５３】
［実施例３］
（尿酸測定試薬への応用例）
ＨＤＡＯＳを含有する尿酸測定用の第１試薬（第１の試薬）、及び４−アミノアンチピリンを含有する尿酸測定用の第２試薬（第２の試薬）より構成される尿酸測定用試薬を調製し、アジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬を近傍に置いた場合の安定性を検討した。
【００５４】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウム含有試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。
【００５５】
▲２▼本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ８．５（２０℃）に調整したものを調製した。
【００５６】
▲３▼対照・尿酸測定用第１試薬の調製
ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・尿酸測定用第１試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００５７】
▲４▼尿酸測定用第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整したものを調製した。
【００５８】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、対照及び本発明尿酸測定用第１試薬、並びに第２試薬を、図１のようにそれぞれ試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に充填し、下記の組み合わせでビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、５℃の冷蔵庫にて１０日間保存した。なお、各試験管の口に栓はしなかった。
ａ）本発明・尿酸測定用第１試薬（ｐＨ８．５）、第２試薬及びアジ化ナトリウム含有試薬
ｂ）対 照・尿酸測定用第１試薬（ｐＨ７．０）、第２試薬及びアジ化ナトリウム含有試薬
【００５９】
（３）保存した試薬の安定性の判定
保存開始時及び、保存１日後、５日後、並びに１０日後に、本発明及び対照の尿酸測定用第１試薬が発色しているか否かを目視で判定した。
【００６０】
（４）安定性の判定結果
試薬の安定性について、発色の判定結果を表３に示した。
【００６１】
【表３】
【００６２】
この表より、対照・尿酸測定用第１試薬は、保存１日後にして既に発色してしまっているのに対して、本発明・尿酸測定用第１試薬は、保存１０日後でさえも発色していないことが分かる。
【００６３】
このことにより、本発明・尿酸測定用第１試薬では、アジ化ナトリウム含有試薬から気化したアジ化物が尿酸測定試薬に溶け込んでも試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００６４】
（５）相関の測定
本発明・尿酸測定用第１試薬及び対照・尿酸測定用第１試薬並びに尿酸測定用第２試薬にて、５０検体のヒト血清試料の尿酸値を測定して、本発明試薬及び対照試薬の相関を確認した。
【００６５】
ヒト血清試料中の尿酸の測定は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料５μＬに第１試薬として尿酸測定用第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として尿酸測定用第２試薬を８０μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この時の最終反応液のｐＨは、本発明及び対照・尿酸測定用試薬ともに７．０であった。３７℃で反応を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知濃度の尿酸標準液を測定した時の吸光度との比例計算によって尿酸値を求めた。
なお、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度を尿酸値の算出に用いた。
【００６６】
（６）測定結果
本発明・尿酸測定用第１試薬及び対照・尿酸測定用第１試薬並びに尿酸測定用第２試薬を用いてヒト血清試料中の尿酸を測定した時の測定結果を図２に示した。この図において、横軸は対照試薬による測定値を表し、縦軸は本発明試薬による測定値を表す。
【００６７】
【図２】
【００６８】
この図より本発明試薬（ｙ）と対照試薬（ｘ）との回帰式がｙ＝１．００４ｘ−０．０７４であり、相関係数がｒ＝０．９９９であって、良好な相関を示していることがわかる。
【００６９】
このことにより、本発明・尿酸測定用第１試薬及び尿酸測定用第２試薬による尿酸の測定は、アジ化物の溶け込み、混入を受けておらず誤差を生じていない対照・尿酸測定用第１試薬及び尿酸測定用第２試薬と測定値が同一であり、正確な尿酸値を得られることが確かめられた。
【００７０】
［実施例４］
（総コレステロール測定試薬への応用例）
４−アミノアンチピリンを含有する総コレステロール測定用の第１試薬（第２の試薬）、及びＨＤＡＯＳを含有する総コレステロール測定用の第２試薬（第１の試薬）より構成される総コレステロール測定用試薬を調製し、第２試薬にアジ化ナトリウムを添加した場合の安定性を検討した。
【００７１】
（１）試薬の調製
▲１▼総コレステロール測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．９（２０℃）に調整した。
【００７２】
▲２▼アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロール測定用第２試薬の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ８．０、９．０（２０℃）のものをそれぞれ調整した。
【００７３】
▲３▼アジ化ナトリウムを添加した対照・総コレステロール測定用第２試薬の調製
ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・総コレステロール測定用第２試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００７４】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した「第１試薬及びアジ化ナトリウムを添加した本発明及び対照の総コレステロール測定用第２試薬」を密栓して、室温（２５℃）にて１１日間保存した。
ａ）アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロール測定用第２試薬
（ｐＨ８．０）
ｂ）アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロール測定用第２試薬
（ｐＨ９．０）
ｃ）アジ化ナトリウムを添加した対照・総コレステロール測定用第２試薬
（ｐＨ７．０）
ｄ）総コレステロール測定用第１試薬
【００７５】
（３）保存した試薬の安定性の判定
保存開始時及び、保存２日後、４日後、７日後、９日後、並びに１１日後に、本発明及び対照の総コレステロール測定用第２試薬が発色しているか否かを目視で判定した。
【００７６】
（４）安定性の判定結果
試薬の安定性について、発色の判定結果を表４に示した。
【００７７】
【表４】
【００７８】
この表より、対照・総コレステロール測定用第２試薬（ｐＨ７．０）は、２５℃保存２日後にして、既に発色してしまっているのに対して、本発明・総コレステロール測定用第２試薬（ｐＨ８．０及びｐＨ９．０）は、保存１１日後でさえも発色していないことが分かる。
【００７９】
このことにより、本発明の第２試薬では、試薬プローブ等よりアジ化ナトリウムが総コレステロール測定用試薬に溶け込んでも試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００８０】
（５）相関の測定
総コレステロール測定用第１試薬並びに本発明（ｐＨ８．０）及び対照の総コレステロール測定用第２試薬にて、６０検体のヒト血清試料の総コレステロール値を測定して、本発明試薬及び対照試薬の相関を確認した。
【００８１】
ヒト血清試料中の総コレステロールの測定は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料４μＬに第１試薬として総コレステロール測定用第１試薬を３００μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として総コレステロール測定用第２試薬を１００μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この時の最終反応液のｐＨは、本発明及び対象・総コレステロール測定用試薬ともに７．０であった。３７℃で反応を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知濃度の総コレステロール標準液を測定した時の吸光度との比例計算によって総コレステロール値を求めた。
なお、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度を総コレステロール値の算出に用いた。
【００８２】
（６）測定結果
本発明・総コレステロール測定用第２試薬及び対照・総コレステロール測定用第２試薬並びに総コレステロール測定用第１試薬を用いてヒト血清試料中の総コレステロールを測定した時の測定結果を図３に示した。この図において、横軸は対照試薬による測定値を表し、縦軸は本発明試薬による測定値を表す。
【００８３】
【図３】
【００８４】
この図より本発明試薬（ｙ）と対照試薬（ｘ）との回帰式がｙ＝０．９９７ｘ−０．７０２であり、相関係数がｒ＝０．９９７であって、良好な相関を示していることがわかる。
【００８５】
このことにより、総コレステロール測定用第１試薬及び本発明・総コレステロール測定用第２試薬による総コレステロールの測定は、アジ化物の溶け込み、混入を受けておらず誤差を生じていない総コレステロール測定用第１試薬及び対照・総コレステロール測定用第２試薬と測定値が同一であり、正確な総コレステロール値を得られることが確かめられた。
【００８６】
［実施例５］
（尿酸測定試薬におけるビリルビンの影響回避効果の実証）
ＨＤＡＯＳ含有第１試薬（第１の試薬）、及びｐＨ７．０の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第２の試薬）より構成される本発明・尿酸測定用試薬、ＴＯＯＳ含有第１試薬、及びｐＨ７．５の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第２の試薬）より構成される対照１・尿酸測定用試薬、並びにＴＯＯＳ含有第１試薬、及びｐＨ７．０の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第２の試薬）より構成される対照２・尿酸測定用試薬を調製し、ビリルビンによる負誤差の影響を検討した。
【００８７】
（１）試薬の調製
▲１▼本発明・ＨＤＡＯＳ含有第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【００８８】
▲２▼対照・ＴＯＯＳ含有第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
【００８９】
▲３▼第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。
【００９０】
▲４▼第２試薬の調製
ｐＨを７．５（２０℃）に調整すること以外は、上記▲３▼の第２試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００９１】
（２）ビリルビンの影響の測定
ヒト血清試料に干渉チェック・ビリルビン−Ｃ（国際試薬社製）を加えビリルビン濃度２０及び５０ｍｇ／ｄｌの血清試料を作製した。
また、希釈血清試料を、ビリルビン濃度２０及び５０ｍｇ／ｄｌの血清試料の調製と同様に、ヒト血清試料と生理食塩水を９：１の割合で混合し調製した。
この３種類の血清試料の尿酸値を、ＨＤＡＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（本発明）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．５の第２試薬（対照１）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（対照２）の各々の試薬にて５回ずつ測定し、本発明試薬、対照１試薬及び対照２試薬のビリルビンの影響を確認した。
【００９２】
上記（２）の血清試料中の尿酸の測定は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、血清試料５μＬに第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として尿酸測定用第２試薬を８０μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この時の最終反応液のｐＨは、本発明試薬及び対照１試薬では７．０であり、対照２試薬では７．５であった。３７℃で反応を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知濃度の尿酸標準液を測定した時の吸光度との比例計算によって尿酸値を求めた。
なお、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度を尿酸値の算出に用いた。
【００９３】
（３）測定結果
ＨＤＡＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（本発明）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．５の第２試薬（対照１）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（対照２）の各々の試薬にて尿酸を測定した時の測定結果を表５に示した。
【００９４】
【表５】
【００９５】
この表より対照１試薬では、ビリルビン濃度２０ｍｇ／ｄｌで１０．１０％、ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌで２８．８７％の負誤差を示し、対照２試薬では、ビリルビン濃度２０ｍｇ／ｄｌで７．２０％、ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌで２１．１９％の負誤差を示しているのに対し、本発明試薬では、ビリルビン濃度２０ｍｇ／ｄｌで１．７０％、ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌでも４．４７％の負誤差にとどまっていることが分かる。
【００９６】
このことにより、本発明・尿酸測定用第１試薬及び尿酸測定用第２試薬による尿酸の測定は、ビリルビンによる影響を受けておらず、正確な尿酸値が得られることが確かめられた。また、本結果より最終反応液のｐＨが低いほど、ビリルビンの影響を受けないことも分かる。
【００９７】
［実施例６］
（トリグリセライド測定試薬におけるアジ化物の混入による劣化防止効果の実証）
ＨＤＡＯＳを含有するトリグリセライド測定用の第１試薬（第１の試薬）において、緩衝剤としてＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ又はＢｉｃｉｎｅを使用したもの、及び４−アミノアンチピリンを含有するトリグリセライド測定用の第２試薬（第２の試薬）より構成されるトリグリセライド測定用試薬を調製し、アジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬を近傍に置いて、１０℃及び２５℃で保存した場合の安定性を検討した。
【００９８】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウム含有試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。
【００９９】
▲２▼本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５、８．０（２０℃）のものをそれぞれ調製した。
【０１００】
▲３▼本発明・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
緩衝液をＤＩＰＳＯからＭＯＰＳに変えること、及びｐＨを７．５（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０１】
▲４▼本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
緩衝液をＤＩＰＳＯからＢｉｃｉｎｅに変えること、及びｐＨを８．０、８．５及び９．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０２】
▲５▼対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
緩衝液をＤＩＰＳＯからＭＯＰＳに変えること、及びｐＨを６．５（２０℃）及び７．０に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０３】
▲６▼対照・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０４】
▲７▼トリグリセライド測定用第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ
（２０℃）に調製した。
【０１０５】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、対照及び本発明トリグリセライド測定用第１試薬、並びにトリグリセライド測定用第２試薬を、図１のようにそれぞれ試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に充填し、下記の組み合わせでビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、１０℃及び２５℃にて１１日間保存した。
ａ）本発明・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｂ）本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｃ）本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ８．０）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｄ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬
（ｐＨ８．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｅ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬
（ｐＨ８．５）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｆ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬
（ｐＨ９．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｇ）対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ６．５）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｈ）対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｉ）対照・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
【０１０６】
（３）保存した試薬の安定性の判定
保存開始時及び、保存１日後、２日後、４日後、６日後、７日後、８日後、並びに１１日後に、各々のトリグリセライド測定用第１試薬が発色しているか否かを目視で判定した。
【０１０７】
（４）安定性の判定結果
試薬の安定性について、１０℃における発色の判定結果を表６に示した。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
この表６より、対照試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ６．５及びｐＨ７．０）」では、いずれも２日後にして、既に発色してしまっている。「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）」でも、保存６日後で、既に発色してしまっているのが分かる。
これに対して、本発明試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）」では、保存４日後でも発色していないことが分かる。更に、「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ７．５の場合には、保存７日後でも発色しておらず、ｐＨ８．０の場合には、保存１１日後でも発色していないことが分かる。また、「緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ８．０の場合には、保存８日後でも発色しておらず、ｐＨ８．５及びｐＨ９．０の場合には、保存１１日後でも発色していないことが分かる。
【０１１０】
次に、２５℃における発色の判定結果を表７に示した。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】
この表７より、対照試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ６．５及びｐＨ７．０）」では、いずれも２日後にして、既に発色してしまっている。「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）」でも、保存４日後で、既に発色してしまっているのが分かる。
これに対して、本発明試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）」では、保存２日後でも発色していないことが分かる。更に、「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ７．５の場合には、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ８．０の場合には、保存６日後でも発色していないことが分かる。また、「緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ８．０の場合には、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ８．５の場合には、保存８日後でも発色していないことが分かる。更にｐＨ９．０の場合には、保存１１日後でも発色していないことが分かる。
【０１１３】
これらのことにより、本発明・トリグリセライド測定用第１試薬及びトリグリセライド測定用第２試薬では、近傍の試薬に含まれるアジ化ナトリウムが気化し、これがトリグリセライド測定用試薬に溶け込むことにより起こる発色を抑制し、試薬の劣化や、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。また、本結果より第１試薬のｐＨが高いほど、アジ化ナトリウムによる試薬の劣化、機能の低下を防ぐことができることも分かる。同一のｐＨにおいても、緩衝剤がＤＩＰＳＯの場合には、アジ化ナトリウムの影響を更に抑制することができることが明らかとなった。
【発明の効果】
本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法は、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、且つ第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満になるように測定試薬を構成することにより、アジ化物等の近傍の試薬に含まれる成分が気化し、これが試薬に溶け込むことにより起こる発色を抑制し、試薬の劣化や、機能の低下を防止することができる。即ち、測定試薬を開封状態においても長期間安定に使用することができるものである。
また、本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法によれば、アジ化物等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物等がその試薬に混入することにより起こる発色を抑制し、試薬の劣化や、機能の低下を防止することができる。即ち、プローブ方式の自動分析装置においても長期間安定に使用することができるものである。
更に、本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法によれば、ビリルビンによる負誤差の影響を回避できるので、正確な測定値が得られるものである。そして、本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法は、上記の測定試薬の劣化や機能低下を防止することと、最終反応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定することの両立が可能なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】安定性検討のための試薬の保存方法を示した図面。
【図２】本発明及び対照尿酸測定用試薬の相関を示す図面。
【図３】本発明及び対照総コレステロール測定用試薬の相関を示す図面。
本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法であり、前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である測定試薬及び測定方法に関し、開封状態においても長期間安定に使用することができる測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
試薬には、不安定なものが多く、保存中に劣化して使用できなくなってしまうことが多々ある。
特に、臨床検査試薬を自動分析装置で使用するといった、試薬を開封状態で使用せざるを得ない場合には、開封状態とすることにより生じる種々の要因により、試薬の劣化は著しい。
【０００３】
例えば、空気中の酸素が試薬に溶け込むことにより、試薬中の成分が酸化され、劣化してしまうことがある。
また、空気中の二酸化炭素が試薬中に溶け込むことにより、試薬のｐＨが低下し、本来の機能が果たせなくなってしまうことがある。
更に、試薬中に二酸化炭素が溶け込むことにより、被検物質（測定しようとする物質）が二酸化炭素により阻害を受けてしまい、正確な測定が出来なくなってしまう場合もある。
【０００４】
最近、近傍の他の試薬中の成分が気化し、その気化した成分が試薬に溶け込むことにより、試薬が劣化してしまうという問題が生じてきた。
【０００５】
例えば、酸化酵素により生じた過酸化水素を４−アミノアンチピリン等の色原体とアニリン誘導体等のカプラーとパーオキシダーゼにより色素に導く検出反応系を使用する試料中の被検物質の測定試薬（いわゆるトリンダー試薬）においては、他の試薬に防腐剤として含有させたアジ化ナトリウムがアジ化水素として気化し、その近傍のトリンダー試薬に溶け込み、被検物質が存在しないにもかかわらず、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）等の電子供与基を有するアニリン誘導体を発色させてしまい、測定に用いることが出来なくなることが知られている。
【０００６】
更に、自動分析装置においては、アジ化物等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物等がその試薬に混入し、上記等の電子供与基を有するアニリン誘導体を発色させてしまい、測定に用いることが出来なくなることが知られている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように従来の試薬は、アジ化物等の近傍の試薬に含まれる成分が気化し、これが試薬に溶け込み、試薬を劣化させ、機能を低下させるものであった。
【０００８】
更に、従来の試薬は、アジ化物等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物等がその試薬に混入し、試薬を劣化させ、機能を低下させるものであった。
【０００９】
本発明者らは、この従来の酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる被検物質の測定試薬及び測定方法が有する問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、且つ第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満になるように測定試薬を構成することにより、試薬の劣化や機能の低下を防止できることを見出し、開封状態においても長期間安定に使用することができる測定試薬及び測定方法を完成するに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定試薬において、（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、（ロ）もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である、ことを特徴とする、２試薬系の試料中の被検物質の測定試薬である。
【００１１】
そして、本発明の測定試薬においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上であることが好適である。
【００１２】
更に、本発明の測定試薬においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上であることが特に好適である。
【００１３】
なお、本明細書におけるｐＨの値は、特に言及していない限り２０℃における値である。
【００１４】
また、本発明は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定方法において、（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、（ロ）もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ末満である、２試薬系の測定試薬を用いることを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法である。
【００１５】
そして、本発明の測定方法においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上であることが好適である。
【００１６】
更に、本発明の測定方法においては、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上であることが特に好適である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明による試料中の被検物質の測定方法及び測定試薬は、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用い、試料中の被検物質の測定を行うものであり、▲１▼前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、▲２▼もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ末満である、ことを特徴とするものである。
【００１８】
本発明における、電子供与基を有するアニリン誘導体としては、例えば、アニリンのアミノ基の１つ又は２つの水素原子が置換されたアニリン誘導体からなり、前記アニリン誘導体のベンゼン環の３位又は５位の水素原子の一方又は両方が電子供与基で置換されていて、場合により、前記アニリン誘導体のベンゼン環の４位の水素原子がハロゲン原子で置換されている化合物である。
なお、上記の電子供与基を有するアニリン誘導体において、置換している官能基は、アニリン誘導体の４位の炭素原子が活性化される官能基、又はマイナスＩ効果を有する官能基であることが好ましい。
また、本発明の電子供与基を有するアニリン誘導体における電子供与基としては、例えば、メトキシ基［−Ｏ−ＣＨ３］、エトキシ基［−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３］、プロポキシ基［−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＣＨ３］、イソプロポキシ基［−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）２］、エチル基［−ＣＨ３−ＣＨ３］、プロピル基［−（ＣＨ２）２−ＣＨ３］、イソプロピル基［−ＣＨ（ＣＨ３）２］等が挙げられる。
また、本発明の電子供与基を有するアニリン誘導体のアミノ基の水素原子を置換する官能基としては、炭素数が１〜５のアルキル基又は炭素数が１〜５のアミノアルキル基等を挙げることができ、このアルキル基又はアミノアルキル基の水素原子は１つ又は２つ以上の水酸基、カルボキシル基、スルホン基、アシル基、サクシニル基、又はこれらの塩等で置換されていてもよい。
そして、本発明の電子供与基を有するアニリン誘導体のベンゼン環の４位の水素原子を置換するハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子等を挙げることができる。
【００１９】
本発明における、電子供与基を有するアニリン誘導体である色原体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）等を挙げることができる。
【００２０】
また、本発明において、測定を行う試料としては、被検物質が存在する可能性があり、且つその被検物質の存在の有無の確認又は定量を行おうとするものをいう。
例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト若しくは動物の肝臓、胃、脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽出液等が挙げられる。
【００２１】
本発明において、測定を行う被検物質としては、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系により測定が行えるものであればいずれのものでもよい。
例えば、総コレステロール、遊離型コレステロール、エステル型コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、レムナント様リポタンパク−コレステロール、β−リポタンパク質、トリグリセライド（ＴＧ）、リン脂質（ＰＬ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡＮＦＦＡ）、グルコース、乳酸、ピルビン酸、ガラクトース、２・３−ＤＰＧ、シアル酸、クエン酸、フルクトサミン、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、グリコーゲン、フコース、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビン、クレアチニン、クレアチン、尿酸（ＵＡ）、ナトリウム、クロール、カリウム、カルシウム、無機リン、マグネシウム、胆汁酸、リパーゼ、リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）、コリンエステラーゼ（Ｃｈ−Ｅ）等が挙げられる。
【００２２】
本発明における第１の試薬は、前記の電子供与基を有するアニリン誘導体である色原体を含有するものであり、且つｐＨが７．５以上であるものである。
なお、後に実施例に示すように、本発明における測定試薬及び測定方法の開封状態における安定性は、ｐＨに依存している。即ち、この第１の試薬のｐＨが、７．５を過ぎてアルカリ側に傾くにつれて、開封状態における安定性が向上していくので、安定性の面から言うと、第１の試薬のｐＨは、７．５以上であって、より高い方が望ましい。この第１の試薬のｐＨは、７．８以上であることが好ましく、特に８．０以上であることが好ましい。
但し、ｐＨがあまり高すぎると、後記のようなこの第１の試薬に含まれている、色原体、酵素の基質、共役酵素、補酵素、又はタンパク質等が、変性、劣化、分解する恐れがあり好ましくない。
よって、第１の試薬のｐＨは、１２以下とするのが好ましく、特にｐＨ１１以下とすることが好ましい。
【００２３】
本発明におけるもう一方の試薬である第２の試薬は、ｐＨが第１の試薬のｐＨ未満であるものである。
そして、第２の試薬のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることにより、試料、第１の試薬及び第２の試薬を混合した最終反応液のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることができるので、第１の試薬のｐＨが測定反応の至適ｐＨ域より高かったとしても、最終反応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定することができる。
例えば、尿酸、総コレステロール等の測定試薬においては、測定反応の至適ｐＨが６．５〜７．２であるので、第１の試薬のｐＨが７．５以上であっても、第１の試薬のｐＨ未満である第２の試薬を混合することにより、最終反応液のｐＨを至適ｐＨ、即ち６．５〜７．２に設定することができるので、本発明の測定試薬及び測定方法は尿酸、総コレステロール等の測定試薬においては特に有用である。
但し、この第２の試薬において、ｐＨがあまり低すぎると、後記のようなこの第２の試薬に含まれている、酵素の基質、共役酵素、補酵素、又はタンパク質等が、変性、劣化、分解する恐れがあり好ましくない。
よって、第２の試薬は、ｐＨ２以上とするのが好ましく、特にｐＨ３以上とすることが好ましい。
【００２４】
また、電子供与基を有するアニリン誘導体を色原体として用いることで、酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系におけるビリルビンによる負誤差の影響を回避することができる。しかし、前記色原体を含有する試薬は、アジ化物等により、試薬が劣化、又は機能が低下してしまうものであった。
本発明による測定試薬及び測定方法によれば、前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨを７．５以上に設定することで、アジ化物等による影響を回避することができるので、前記色原体を使用してビリルビンによる影響をも回避することができる。
なお、このビリルビンの影響を回避する場合には、最終反応液のｐＨを７．５以下、好ましくは７．０以下にすることが望ましい。
そこで、第２の試薬のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることにより、試料、第１の試薬及び第２の試薬を混合した最終反応液のｐＨを第１の試薬のｐＨ未満とすることができるので、第１の試薬のｐＨが７．５より高かったとしても、最終反応液のｐＨを７．５以下に設定することができる。
【００２５】
なお、本発明の測定試薬及び測定方法において、最終反応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定するには、例えば、以下のように行えばよい。
まず、第１の試薬において、色原体の発色の抑制に効果のあるｐＨ７．５以上のｐＨと緩衝剤濃度を選択する。
次に、第１の試薬のｐＨ未満の数種類のｐＨを有し、適当な緩衝剤濃度の数種類の第２の試薬を、第１の試薬及び試料と所定の量比で混合し、最終反応液のｐＨを確認し、測定反応の至適ｐＨ域に入った第２の試薬のｐＨと緩衝剤濃度を選択する。
【００２６】
ここで、ｐＨ７．５以上に緩衝能を持つ緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸緩衝液、イミダゾール、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ等を挙げることができる。また、ｐＨ７．５未満に緩衝能を持つ緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸緩衝液、イミダゾール、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ等を挙げることができる。
更に、本発明における第１の試薬には、ＤＩＰＳＯ又はＴＥＳを含有させることが好ましい。
【００２７】
なお、試料はその量比が小さく、最終反応液のｐＨにほとんど寄与しないので、第１の試薬と第２の試薬の混合液のｐＨをもって、ｐＨの確認を行ってもよい。
【００２８】
また、本発明における第１の試薬及び第２の試薬には、酵素の基質、共役酵素、補酵素、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの防腐剤、試料中に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤、界面活性剤、賦形剤又は活性化剤等を適宜必要に応じて含有させることができる。
【００２９】
本発明における、測定値に誤差を生じさせるアジ化物を含む試薬としては、例えば、防腐剤等の用途のためアジ化ナトリウムなどのアジ化物が処方されている各種の測定試薬等を挙げることができる。
【００３０】
そして、このアジ化物が溶け込むことにより劣化し、機能が低下する試薬としては、前記の電子供与基を有するアニリン誘導体を色原体として用いる試薬を挙げることができる。
【００３１】
この測定試薬及び測定方法により測定を行う場合、測定は反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイント法）のいずれによるものでも良く、測定ステップは第１の試薬及び第２の試薬を用いて２ステップ法により行えばよく、測定波長は紫外部、可視部、又は赤外部の適当な波長を使用することができ、測定反応の温度は３０℃又は３７℃等測定反応が進行し且つ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、又は変質しない範囲内の温度を設定すれば良く、測定反応の開始方法は基質を加えることにより行う方法又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でも良く、そして測定の手法は用手法又は自動分析装置などの装置による方法のいずれをも用いることができる。
【００３２】
本発明における測定においては、試料、第１の試薬及び第２の試薬を混合する順序は、特に制限はなく、用いる測定試薬、測定装置に応じて適宜定めればよい。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
（気体の溶け込みによる試薬の劣化防止効果の実証）
アジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬、及び気化したアジ化物の溶け込みにより発色してしまうＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）含有試薬の組み合わせにおける、ＨＤＡＯＳ含有試薬の気化したアジ化物の溶け込みによる発色、劣化の度合いを確かめた。
【００３４】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウム含有試薬
下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。
次に、試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に、このアジ化ナトリウム含有試薬の３ｍＬを注入し、これを「アジ化ナトリウム含有試薬」とした。
【００３６】
▲２▼ＨＤＡＯＳ含有試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５（２０℃）のものをそれぞれ調製した。
５種類のｐＨに調整した前記の試薬を各々試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に３ｍＬずつ注入し、これをｐＨの異なる５種類の「ＨＤＡＯＳ含有試薬」とした。
【００３８】
（２）試薬の保存
上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、及びＨＤＡＯＳ含有試薬を下記の５種類の組み合わせでビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、５℃の冷蔵庫にて１７日間保存した。なお、各試験管の口に栓はしなかった。
ａ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ６．５）
ｂ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．０）
ｃ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．５）
ｄ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．０）
ｅ）アジ化ナトリウム含有試薬 及び ＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．５）
【００３９】
（３）保存した試薬の発色の判定
保存開始時及び保存１日後、４日後、７日後、１１日後、並びに１７日後に、上記（２）で５℃の冷蔵庫にて保存した、ｐＨの異なる５種類のＨＤＡＯＳ含有試薬が、発色しているか否かを目視で判定した。
【００４０】
（４）判定結果
試薬の発色の判定結果を表１に示した。
【００４１】
【表１】
この表より、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ６．５）」の組み合わせの場合は、保存１日後にして、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．０）」の組み合わせの場合は、保存４日後で既に発色してしまっていることが分かる。
これに対して、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．５）」の組み合わせの場合は、保存４日後でも発色しておらず、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．０）」の組み合わせの場合は、保存７日後でも発色していないことが分かる。
更に、「アジ化ナトリウム含有試薬及びＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．５）」の組み合わせの場合は、保存１７日後でさえも発色していないことが分かる。
【００４３】
このことにより、ＨＤＡＯＳ含有試薬（第１の試薬）のｐＨを７．５以上に設定すれば、アジ化ナトリウム含有試薬から気化したアジ化物がＨＤＡＯＳ含有試薬に溶け込んでもＨＤＡＯＳ含有試薬の発色を抑え、試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００４４】
［実施例２］
（アジ化物の混入による試薬の劣化防止効果の実証）
アジ化ナトリウムの混入により発色してしまうＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム（ＨＤＡＯＳ）含有試薬にアジ化ナトリウムを添加して、試薬プローブ等よりアジ化ナトリウムが混入した場合の試薬を作り出し、ＨＤＡＯＳ含有試薬のｐＨを変更したことによる発色、劣化の度合いを確かめた。
【００４５】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５（２０℃）のものをそれぞれ調整した。
５種類のｐＨに調整した試薬を各々試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に、３ｍＬずつ注入し、これを「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」とした。
【００４７】
（２）試薬の保存
上記（１）で調製した５種類の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」を密栓して、５℃の冷蔵庫にて１７日間保存した。
ａ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ６．５）
ｂ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．０）
ｃ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ７．５）
ｄ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．０）
ｅ）アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬（ｐＨ８．５）
【００４８】
（３）試薬の発色の判定
保存開始時及び保存１日後、４日後、７日後、１１日後、並びに１７日後に、ｐＨの異なる５種類の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」が、発色しているか否かを目視で判定した。
【００４９】
（４）測定結果
試薬の発色の判定結果を表２に示した。
【００５０】
【表２】
この表より、ｐＨ６．５の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存１日後にして、ｐＨ７．０の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存４日後で既に発色していることが分かる。
これに対して、ｐＨ７．５の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ８．０の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存７日後でも発色していないことがわかる。更に、ｐＨ８．５の「アジ化ナトリウムを添加したＨＤＡＯＳ含有試薬」は、保存１７日後でさえも発色していないことが分かる。
【００５２】
このことにより、ＨＤＡＯＳ含有試薬のｐＨを７．５以上に設定すれば、アジ化物が混入してもＨＤＡＯＳ含有試薬の発色を抑え、試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００５３】
［実施例３］
（尿酸測定試薬への応用例）
ＨＤＡＯＳを含有する尿酸測定用の第１試薬（第１の試薬）、及び４−アミノアンチピリンを含有する尿酸測定用の第２試薬（第２の試薬）より構成される尿酸測定用試薬を調製し、アジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬を近傍に置いた場合の安定性を検討した。
【００５４】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウム含有試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。
▲２▼本発明・尿酸測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ８．５（２０℃）に調整したものを調製した。
▲３▼対照・尿酸測定用第１試薬の調製
ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・尿酸測定用第１試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００５７】
▲４▼尿酸測定用第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整したものを調製した。
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、対照及び本発明尿酸測定用第１試薬、並びに第２試薬を、図１のようにそれぞれ試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に充填し、下記の組み合わせでビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、５℃の冷蔵庫にて１０日間保存した。なお、各試験管の口に栓はしなかった。
ａ）本発明・尿酸測定用第１試薬（ｐＨ８．５）、第２試薬及びアジ化ナトリウム含有試薬
ｂ）対 照・尿酸測定用第１試薬（ｐＨ７．０）、第２試薬及びアジ化ナトリウム含有試薬
【００５９】
（３）保存した試薬の安定性の判定
保存開始時及び、保存１日後、５日後、並びに１０日後に、本発明及び対照の尿酸測定用第１試薬が発色しているか否かを目視で判定した。
【００６０】
（４）安定性の判定結果
試薬の安定性について、発色の判定結果を表３に示した。
【００６１】
【表３】
この表より、対照・尿酸測定用第１試薬は、保存１日後にして既に発色してしまっているのに対して、本発明・尿酸測定用第１試薬は、保存１０日後でさえも発色していないことが分かる。
【００６３】
このことにより、本発明・尿酸測定用第１試薬では、アジ化ナトリウム含有試薬から気化したアジ化物が尿酸測定試薬に溶け込んでも試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００６４】
（５）相関の測定
本発明・尿酸測定用第１試薬及び対照・尿酸測定用第１試薬並びに尿酸測定用第２試薬にて、５０検体のヒト血清試料の尿酸値を測定して、本発明試薬及び対照試薬の相関を確認した。
【００６５】
ヒト血清試料中の尿酸の測定は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料５μＬに第１試薬として尿酸測定用第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として尿酸測定用第２試薬を８０μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この時の最終反応液のｐＨは、本発明及び対照・尿酸測定用試薬ともに７．０であった。３７℃で反応を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知濃度の尿酸標準液を測定した時の吸光度との比例計算によって尿酸値を求めた。
なお、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度を尿酸値の算出に用いた。
【００６６】
（６）測定結果
本発明・尿酸測定用第１試薬及び対照・尿酸測定用第１試薬並びに尿酸測定用第２試薬を用いてヒト血清試料中の尿酸を測定した時の測定結果を図２に示した。この図において、横軸は対照試薬による測定値を表し、縦軸は本発明試薬による測定値を表す。
【００６７】
【図２】
【００６８】
この図より本発明試薬（ｙ）と対照試薬（ｘ）との回帰式がｙ＝１．００４ｘ−０．０７４であり、相関係数がｒ＝０．９９９であって、良好な相関を示していることがわかる。
【００６９】
このことにより、本発明・尿酸測定用第１試薬及び尿酸測定用第２試薬による尿酸の測定は、アジ化物の溶け込み、混入を受けておらず誤差を生じていない対照・尿酸測定用第１試薬及び尿酸測定用第２試薬と測定値が同一であり、正確な尿酸値を得られることが確かめられた。
【００７０】
［実施例４］
（総コレステロール測定試薬への応用例）
４−アミノアンチピリンを含有する総コレステロール測定用の第１試薬（第２の試薬）、及びＨＤＡＯＳを含有する総コレステロール測定用の第２試薬（第１の試薬）より構成される総コレステロール測定用試薬を調製し、第２試薬にアジ化ナトリウムを添加した場合の安定性を検討した。
【００７１】
（１）試薬の調製
▲１▼総コレステロール測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ６．９（２０℃）に調整した。
▲２▼アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロール測定用第２試薬の調製下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ８．０、９．０（２０℃）のものをそれぞれ調整した。
▲３▼アジ化ナトリウムを添加した対照・総コレステロール測定用第２試薬の調製
ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・総コレステロール測定用第２試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００７４】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した「第１試薬及びアジ化ナトリウムを添加した本発明及び対照の総コレステロール測定用第２試薬」を密栓して、室温（２５℃）にて１１日間保存した。
ａ）アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロール測定用第２試薬
（ｐＨ８．０）
ｂ）アジ化ナトリウムを添加した本発明・総コレステロール測定用第２試薬
（ｐＨ９．０）
ｃ）アジ化ナトリウムを添加した対照・総コレステロール測定用第２試薬
（ｐＨ７．０）
ｄ）総コレステロール測定用第１試薬
【００７５】
（３）保存した試薬の安定性の判定
保存開始時及び、保存２日後、４日後、７日後、９日後、並びに１１日後に、本発明及び対照の総コレステロール測定用第２試薬が発色しているか否かを目視で判定した。
【００７６】
（４）安定性の判定結果
試薬の安定性について、発色の判定結果を表４に示した。
【００７７】
【表４】
この表より、対照・総コレステロール測定用第２試薬（ｐＨ７．０）は、２５℃保存２日後にして、既に発色してしまっているのに対して、本発明・総コレステロール測定用第２試薬（ｐＨ８．０及びｐＨ９．０）は、保存１１日後でさえも発色していないことが分かる。
【００７９】
このことにより、本発明の第２試薬では、試薬プローブ等よりアジ化ナトリウムが総コレステロール測定用試薬に溶け込んでも試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。
【００８０】
（５）相関の測定
総コレステロール測定用第１試薬並びに本発明（ｐＨ８．０）及び対照の総コレステロール測定用第２試薬にて、６０検体のヒト血清試料の総コレステロール値を測定して、本発明試薬及び対照試薬の相関を確認した。
【００８１】
ヒト血清試料中の総コレステロールの測定は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料４μＬに第１試薬として総コレステロール測定用第１試薬を３００μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として総コレステロール測定用第２試薬を１００μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この時の最終反応液のｐＨは、本発明及び対象・総コレステロール測定用試薬ともに７．０であった。３７℃で反応を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知濃度の総コレステロール標準液を測定した時の吸光度との比例計算によって総コレステロール値を求めた。
なお、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度を総コレステロール値の算出に用いた。
【００８２】
（６）測定結果
本発明・総コレステロール測定用第２試薬及び対照・総コレステロール測定用第２試薬並びに総コレステロール測定用第１試薬を用いてヒト血清試料中の総コレステロールを測定した時の測定結果を図３に示した。この図において、横軸は対照試薬による測定値を表し、縦軸は本発明試薬による測定値を表す。
【００８３】
【図３】
【００８４】
この図より本発明試薬（ｙ）と対照試薬（ｘ）との回帰式がｙ＝０．９９７ｘ−０．７０２であり、相関係数がｒ＝０．９９７であって、良好な相関を示していることがわかる。
【００８５】
このことにより、総コレステロール測定用第１試薬及び本発明・総コレステロール測定用第２試薬による総コレステロールの測定は、アジ化物の溶け込み、混入を受けておらず誤差を生じていない総コレステロール測定用第１試薬及び対照・総コレステロール測定用第２試薬と測定値が同一であり、正確な総コレステロール値を得られることが確かめられた。
【００８６】
［実施例５］
（尿酸測定試薬におけるビリルビンの影響回避効果の実証）
ＨＤＡＯＳ含有第１試薬（第１の試薬）、及びｐＨ７．０の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第２の試薬）より構成される本発明・尿酸測定用試薬、ＴＯＯＳ含有第１試薬、及びｐＨ７．５の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第２の試薬）より構成される対照１・尿酸測定用試薬、並びにＴＯＯＳ含有第１試薬、及びｐＨ７．０の４−アミノアンチピリン含有第２試薬（第２の試薬）より構成される対照２・尿酸測定用試薬を調製し、ビリルビンによる負誤差の影響を検討した。
【００８７】
（１）試薬の調製
▲１▼本発明・ＨＤＡＯＳ含有第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
▲２▼対照・ＴＯＯＳ含有第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５（２０℃）に調整した。
▲３▼第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。
▲４▼第２試薬の調製
ｐＨを７．５（２０℃）に調整すること以外は、上記▲３▼の第２試薬と同じ試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００９１】
（２）ビリルビンの影響の測定
ヒト血清試料に干渉チェック・ビリルビン−Ｃ（国際試薬社製）を加えビリルビン濃度２０及び５０ｍｇ／ｄｌの血清試料を作製した。
また、希釈血清試料を、ビリルビン濃度２０及び５０ｍｇ／ｄｌの血清試料の調製と同様に、ヒト血清試料と生理食塩水を９：１の割合で混合し調製した。
この３種類の血清試料の尿酸値を、ＨＤＡＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（本発明）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．５の第２試薬（対照１）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（対照２）の各々の試薬にて５回ずつ測定し、本発明試薬、対照１試薬及び対照２試薬のビリルビンの影響を確認した。
【００９２】
上記（２）の血清試料中の尿酸の測定は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、血清試料５μＬに第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として尿酸測定用第２試薬を８０μＬ添加し混合液（最終反応液）とした。この時の最終反応液のｐＨは、本発明試薬及び対照１試薬では７．０であり、対照２試薬では７．５であった。３７℃で反応を行わせ、主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイント）と、第２試薬添加５分目（５０ポイント）の吸光度の増加分より、既知濃度の尿酸標準液を測定した時の吸光度との比例計算によって尿酸値を求めた。
なお、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、各ポイントにおいて測定した吸光度より各ポイントの試薬盲検値を差し引いた吸光度を尿酸値の算出に用いた。
【００９３】
（３）測定結果
ＨＤＡＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（本発明）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．５の第２試薬（対照１）、ＴＯＯＳ含有第１試薬及びｐＨ７．０の第２試薬（対照２）の各々の試薬にて尿酸を測定した時の測定結果を表５に示した。
【００９４】
【表５】
この表より対照１試薬では、ビリルビン濃度２０ｍｇ／ｄｌで１０．１０％、ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌで２８．８７％の負誤差を示し、対照２試薬では、ビリルビン濃度２０ｍｇ／ｄｌで７．２０％、ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌで２１．１９％の負誤差を示しているのに対し、本発明試薬では、ビリルビン濃度２０ｍｇ／ｄｌで１．７０％、ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌでも４．４７％の負誤差にとどまっていることが分かる。
【００９６】
このことにより、本発明・尿酸測定用第１試薬及び尿酸測定用第２試薬による尿酸の測定は、ビリルビンによる影響を受けておらず、正確な尿酸値が得られることが確かめられた。また、本結果より最終反応液のｐＨが低いほど、ビリルビンの影響を受けないことも分かる。
【００９７】
［実施例６］
（トリグリセライド測定試薬におけるアジ化物の混入による劣化防止効果の実証）
ＨＤＡＯＳを含有するトリグリセライド測定用の第１試薬（第１の試薬）において、緩衝剤としてＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ又はＢｉｃｉｎｅを使用したもの、及び４−アミノアンチピリンを含有するトリグリセライド測定用の第２試薬（第２の試薬）より構成されるトリグリセライド測定用試薬を調製し、アジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬を近傍に置いて、１０℃及び２５℃で保存した場合の安定性を検討した。
【００９８】
（１）試薬の調製
▲１▼アジ化ナトリウム含有試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．２（２０℃）に調整した。
▲２▼本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ７．５、８．０（２０℃）のものをそれぞれ調製した。
▲３▼本発明・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
緩衝液をＤＩＰＳＯからＭＯＰＳに変えること、及びｐＨを７．５（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０１】
▲４▼本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
緩衝液をＤＩＰＳＯからＢｉｃｉｎｅに変えること、及びｐＨを８．０、８．５及び９．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０２】
▲５▼対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
緩衝液をＤＩＰＳＯからＭＯＰＳに変えること、及びｐＨを６．５（２０℃）及び７．０に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０３】
▲６▼対照・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬の調製
ｐＨを７．０（２０℃）に調整すること以外は、上記▲２▼の本発明・トリグリセライド測定用第１試薬と同じ測定試薬成分、及び濃度で調製を行った。
【０１０４】
▲７▼トリグリセライド測定用第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ
（２０℃）に調製した。
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、対照及び本発明トリグリセライド測定用第１試薬、並びにトリグリセライド測定用第２試薬を、図１のようにそれぞれ試験管（容量１０ｍＬ、長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に充填し、下記の組み合わせでビニール袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付き）に入れ、チャックを閉めて密封し、１０℃及び２５℃にて１１日間保存した。
ａ）本発明・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｂ）本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｃ）本発明・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ８．０）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｄ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬
（ｐＨ８．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｅ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬
（ｐＨ８．５）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｆ）本発明・Ｂｉｃｉｎｅ含有トリグリセライド測定用第１試薬
（ｐＨ９．０）、第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｇ）対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ６．５）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｈ）対照・ＭＯＰＳ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
ｉ）対照・ＤＩＰＳＯ含有トリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）、
第２試薬並びにアジ化ナトリウム含有試薬
【０１０６】
（３）保存した試薬の安定性の判定
保存開始時及び、保存１日後、２日後、４日後、６日後、７日後、８日後、並びに１１日後に、各々のトリグリセライド測定用第１試薬が発色しているか否かを目視で判定した。
【０１０７】
（４）安定性の判定結果
試薬の安定性について、１０℃における発色の判定結果を表６に示した。
【０１０８】
【表６】
この表６より、対照試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ６．５及びｐＨ７．０）」では、いずれも２日後にして、既に発色してしまっている。「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）」でも、保存６日後で、既に発色してしまっているのが分かる。
これに対して、本発明試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）」では、保存４日後でも発色していないことが分かる。更に、「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ７．５の場合には、保存７日後でも発色しておらず、ｐＨ８．０の場合には、保存１１日後でも発色していないことが分かる。また、「緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ８．０の場合には、保存８日後でも発色しておらず、ｐＨ８．５及びｐＨ９．０の場合には、保存１１日後でも発色していないことが分かる。
【０１１０】
次に、２５℃における発色の判定結果を表７に示した。
【０１１１】
【表７】
この表７より、対照試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ６．５及びｐＨ７．０）」では、いずれも２日後にして、既に発色してしまっている。「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．０）」でも、保存４日後で、既に発色してしまっているのが分かる。
これに対して、本発明試薬の「緩衝剤としてＭＯＰＳを用いたトリグリセライド測定用第１試薬（ｐＨ７．５）」では、保存２日後でも発色していないことが分かる。更に、「緩衝剤としてＤＩＰＳＯを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ７．５の場合には、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ８．０の場合には、保存６日後でも発色していないことが分かる。また、「緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅを用いたトリグリセライド測定用第１試薬」では、ｐＨ８．０の場合には、保存４日後でも発色しておらず、ｐＨ８．５の場合には、保存８日後でも発色していないことが分かる。更にｐＨ９．０の場合には、保存１１日後でも発色していないことが分かる。
【０１１３】
これらのことにより、本発明・トリグリセライド測定用第１試薬及びトリグリセライド測定用第２試薬では、近傍の試薬に含まれるアジ化ナトリウムが気化し、これがトリグリセライド測定用試薬に溶け込むことにより起こる発色を抑制し、試薬の劣化や、機能の低下を防ぐことが出来ることが確かめられた。また、本結果より第１試薬のｐＨが高いほど、アジ化ナトリウムによる試薬の劣化、機能の低下を防ぐことができることも分かる。同一のｐＨにおいても、緩衝剤がＤＩＰＳＯの場合には、アジ化ナトリウムの影響を更に抑制することができることが明らかとなった。
【発明の効果】
本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法は、色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、且つ第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満になるように測定試薬を構成することにより、アジ化物等の近傍の試薬に含まれる成分が気化し、これが試薬に溶け込むことにより起こる発色を抑制し、試薬の劣化や、機能の低下を防止することができる。即ち、測定試薬を開封状態においても長期間安定に使用することができるものである。
また、本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法によれば、アジ化物等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プローブ（試薬採取口）に付着することにより、この試薬プローブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付着したアジ化物等がその試薬に混入することにより起こる発色を抑制し、試薬の劣化や、機能の低下を防止することができる。即ち、プローブ方式の自動分析装置においても長期間安定に使用することができるものである。
更に、本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法によれば、ビリルビンによる負誤差の影響を回避できるので、正確な測定値が得られるものである。そして、本発明の試料中の被検物質の測定試薬及び測定方法は、上記の測定試薬の劣化や機能低下を防止することと、最終反応液のｐＨを測定反応の至適ｐＨ域に設定することの両立が可能なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】安定性検討のための試薬の保存方法を示した図面。
【図２】本発明及び対照尿酸測定用試薬の相関を示す図面。
【図３】本発明及び対照総コレステロール測定用試薬の相関を示す図面。
Claims (6)
- 酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定試薬において、
（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、
（ロ）もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である、ことを特徴とする、２試薬系の試料中の被検物質の測定試薬。 - 色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上である、請求項１に記載の測定試薬。
- 色原体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上である、請求項１に記載の測定試薬。
- 酸化酵素により生じた過酸化水素の検出反応系を使用し、色原体として電子供与基を有するアニリン誘導体を用いる、試料中の被検物質の測定方法において、
（イ）前記色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．５以上であり、
（ロ）もう一方の試薬である第２の試薬のｐＨが第１の試薬のｐＨ未満である、２試薬系の測定試薬を用いることを特徴とする、試料中の被検物質の測定方法。 - 色原体を含有する第１の試薬のｐＨが７．８以上である、請求項４に記載の測定方法。
- 色原体を含有する第１の試薬のｐＨが８．０以上である、請求項４に記載の測定方法。
【０００１】
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