JP3593482B2

JP3593482B2 - ＷＷドメインを有するヒト核蛋白質とそれをコ−ドするｃＤＮＡ

Info

Publication number: JP3593482B2
Application number: JP33257299A
Authority: JP
Inventors: 誠志加藤; 晃彦小室; 豊広瀬
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 1999-11-24
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: AU1549401A; CA2360530C; EP1148125B1; JP2001149075A; DE60039029D1; EP1148125A1; US7067642B1; EP1148125A4; CA2360530A1; WO2001038531A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ヒト細胞の核に存在し、ＷＷドメインを有する新規蛋白質と、この蛋白質をコードしているｃＤＮＡおよびこの蛋白質に対する抗体に関するものである。この発明の蛋白質および抗体は、各種疾患の診断および治療に有用であり、この発明のヒトｃＤＮＡは、遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として有用である。また、ｃＤＮＡはこの発明の蛋白質を大量生産するための遺伝子源として用いることが出来る。
【０００２】
【従来技術】
核蛋白質とは、細胞核の中で機能している蛋白質の総称である。核内には生物の設計図であるゲノムＤＮＡが存在しており、核蛋白質はこれらのゲノムＤＮＡの複製、転写調節などに関与している。核蛋白質の中で機能が明らかになっている代表的なものは、転写因子、スプライシング因子、核内レセプター、細胞周期調節因子、癌抑制因子などがある。これらの因子は、発生・分化などの生命現象のみならず、癌等の疾患とも密接に関係している（村松正寛編、ＮＥＷメディカルサイエンス、「転写のしくみと疾患」）。したがって、これらの核蛋白質は、特定遺伝子の転写・翻訳を調節する低分子医薬品を開発するためのタ−ゲット蛋白質としての可能性を秘めており、できるだけ多くの核蛋白質を得ることが望まれている。
【０００３】
ＷＷドメインとはＳＨ２、ＳＨ３、ＰＨ、ＰＴＢドメインと類似した蛋白質−蛋白質相互作用モチーフの新しいファミリーである。このドメインは、２個の保存されたトリプトファンを持つ約４０アミノ酸残基からなり、ＳＨ３ドメインと同様にプロリンリッチなアミノ酸配列に結合することが知られている（Ｈ．Ｉ．ＣｈｅｎａｎｄＭ．Ｓｕｄｏｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．９２，７８１９−７８２３）。ＷＷドメインとそのリガンドが結合したもののＸ線結晶解析の結果、立体構造はＳＨ３と異なることが判明している（Ｍ．Ｊ．Ｍａｃｉａｓｅｔａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ，３８２，６４６−６４９）。他のプロテインモチーフと同様に細胞骨格系（Ｐ．ＢｏｒｋａｎｄＭ．Ｓｕｄｏｌ（１９９４）ＴＩＢＳ，１９，５３１−５３３）、情報伝達系に関与する蛋白質（Ｈ．Ｉ．ＣｈｅｎａｎｄＭ．Ｓｕｄｏｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．９２，７８１９−７８２３）、蛋白分解系のユビキチン−プロテインリガーゼ（Ｏ．Ｓｔａｕｂｅｔａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯＪ．１５，２３７１−２３８０）、転写活性化因子（Ｐ．ＢｏｒｋａｎｄＭ．Ｓｕｄｏｌ（１９９４）ＴＩＢＳ，１９，５３１−５３３）などに含まれており、細胞内情報伝達系において重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この出願は、ヒト細胞の核に存在する新規蛋白質、この蛋白質をコードするｃＤＮＡおよびこのヒト核蛋白質に対する抗体を提供することを課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下（１）〜（７）の発明を提供する。
（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むヒト核蛋白質。
（２）発明（１）の蛋白質をコードするＤＮＡ断片。
（３）発明（１）の蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ断片。
（４）配列番号２の塩基配列からなる、発明（３）のＤＮＡ断片。
（５）発明（２）から（４）のいずれかのＤＮＡ断片をインビトロ翻訳あるいは宿主細胞内で発現しうる発現ベクター。
（６）発明（５）の発現ベクターによる形質転換体であって、発明（１）のヒト核蛋白質を生産しうる形質転換細胞。
（７）発明（１）のヒト核蛋白質に対する抗体。
【０００６】
【発明の実施の形態】
この出願の前記発明（１）の蛋白質は、ヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、配列番号１のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは配列番号１のアミノ酸配列ををコードするＤＮＡを用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができるが、組換えＤＮＡ技術で取得する方法が好ましく用いられる。例えば、発明（３）または（４）のｃＤＮＡを有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで蛋白質を発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ｃＤＮＡがコードしている蛋白質を大量に発現させることができる。
【０００７】
発明（１）の蛋白質をインビトロ翻訳でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域を、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換え（発明（５））、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含む、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、発明（１）の蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
【０００８】
発明（１）の蛋白質を、大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、発明（３）のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えた発現ベクター（発明（５））を作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体（発明（６））を培養すれば、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってこのｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【０００９】
発明（１）の蛋白質を、真核細胞でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、発明（３）のｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え（発明（５））、真核細胞内に導入すれば（発明（６））、発明（１）の蛋白質を真核細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクタ−として用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質として発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、発明（１）の蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１０】
発明（１）の蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１１】
発明（１）の蛋白質には、配列番号１で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。また、発明（１）の蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、実施例に挙げたグルタチン−Ｓ−トランスフェラ−ゼ（ＧＳＴ）や緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）との融合蛋白質などが例示できる。
【００１２】
発明（２）のＤＮＡ断片には、上記蛋白質をコードするすべてのＤＮＡが含まれる。このＤＮＡは、化学合成による方法、ｃＤＮＡクローニングによる方法などを用いて取得することができる。
【００１３】
発明（３）および（４）のＤＮＡ断片（ｃＤＮＡ）は、例えばヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、岡山−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄＢｅｒｇ，Ｐ．，（１９８２）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．２，１６１−１７０）、Ｇｕｂｌｅｒ−Ｈｏｆｆｍａｎ法（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．ａｎｄＨｏｆｆｍａｎ，（１９８３）Ｊ．Ｇｅｎｅ２５，２６３−２６９）などいかなる方法を用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得るためには、実施例にあげたようなキャッピング法（Ｋａｔｏ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０）を用いることが望ましい。
【００１４】
発明（３）のｃＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を含むことを特徴とするものであり、例えば、配列番号３で表されるものは、２６６９ｂｐからなる塩基配列を有し、２１１５ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有していた。このＯＲＦは、７０４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。発明（３）または（４）のｃＤＮＡを大腸菌や動物培養細胞内で発現させると、約８０ｋＤａの蛋白質が得られた。この蛋白質はＲＮＡポリメラ−ゼＩＩのＣ末端ドメインと結合することから、転写制御に関与していると考えられる。
【００１５】
発明（１）の蛋白質は、どの組織でも発現しているので、配列番号２あるいは配列番号３に記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、発明（３）または（４）のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマ−として、ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００１６】
一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２あるいは配列番号３において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡも発明（３）および（４）の範疇にはいる。
【００１７】
同様に、これらの変更によって生じる、１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、発明（１）の範疇に入る。
【００１８】
発明（３）または（４）のｃＤＮＡには、配列番号２あるいは３で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範疇にはいる。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
【００１９】
発明（７）の抗体は、発明（１）の蛋白質を抗原として用いて動物を免役した後、血清から得ることが出きる。抗原としては配列番号１のアミノ酸配列に基づき化学合成したペプチドや、真核細胞や原核細胞で発現させた蛋白質を用いることが出きる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる（例えば、特開平７−３１３１８７号公報の発明）。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエロ−マと融合させてハイブリド−マを作製すれば、発明（１）の蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体を産生することができる。
【００２０】
【実施例】
次に実施例を示してこの出願の発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。ｃＤＮＡ合成は文献（Ｋａｔｏ，Ｓ．ｅｔａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｅ，１５０，２４３−２５０）に従った。
（１）ｃＤＮＡクロ−ニング
ヒト完全長ｃＤＮＡライブラリ−（ＷＯ９７／０３１９０記載）から選択したｃＤＮＡクロ−ンの大規模塩基配列決定の結果、クロ−ンＨＰ０３４９４を得た。このクロ−ンは、２９１ｂｐの５’非翻訳領域、２１１５ｂｐのＯＲＦ、２６３ｂｐの３’非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号３）。ＯＲＦは７０４アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。
【００２１】
この蛋白質のアミノ酸配列（配列番号１）を用いてプロテインデータベースを検索したが、類似性を有する既知蛋白質はなかった。また、このｃＤＮＡの塩基配列を用いてＧｅｎＢａｎｋを検索したところ、ＥＳＴの中に９０％以上の相同性を有するもの（例えば、アクセション番号Ａ１７５８３６５）が存在したが、部分配列なのでこの発明の蛋白質と同じ蛋白質をコ−ドしているかどうかは判定できない。
【００２２】
モチ−フ配列検索を行ったところ、表１に示したように、４３番目から７８番目までの領域が、ＷＷドメインと類似性を有していた。４９番目と７２番目のトリプトファン、７５番目のプロリンが、これまで知られている全てのＷＷドメインに保存されているアミノ酸残基である。
【００２３】
【表１】

【００２４】
（２）ノ−ザンブロット
ヒト各組織ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡがブロットしてあるＭｕｌｔｉｔｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をｍＲＮＡソ−スとして用いた。プローブとして、完全長ＨＰ０３４９４ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片を、ランダムプライマーラベリングキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により放射能ラベルして用いた。ノ−ザンブロットハイブリダイゼ−ションの条件はすべて、キットに付属のプロトコールに従った。心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、大腸、末梢血すべてに約３ｋｂのハイブリダイゼ−ションバンドが得られ、この蛋白質はハウスキーピングなものであることが示唆された。
（３）インビトロ翻訳による蛋白質合成
この発明のｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを用いて、Ｔ_ＮＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるインビトロ転写／翻訳を行なった。この際［^３５Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行なった。プラスミド２μｇを、Ｔ_ＮＴウサギ網状赤血球溶解物１２．５μｌ、緩衝液（キットに付属）０．５μｌ、アミノ酸混合液（メチオニンを含まない）２μｌ、［^３５Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）２μｌ（０．３５ＭＢｑ／μｌ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ０．５μｌ、ＲＮａｓｉｎ２０Ｕを含む総量２５μｌの反応液中で３０℃で９０分間反応させた。反応液３μｌにＳＤＳサンプリングバッファー（１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、１２０ｍＭ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、０．０２５％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール）２μｌを加え、９５℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィーを行ない、翻訳産物の分子量を求めた。その結果、このクロ−ンは、ＯＲＦから予想される分子量８０，６１８とほぼ同じ８０ｋＤａの翻訳産物を生成した。
（４）大腸菌によるＧＳＴ融合蛋白質の発現
ＥｃｏＲＩ認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる２６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号４）とＳａｌＩ認識部位を付加した停止コドンまでを含む２６ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号５）を用い、ｐＨＰ０３４９４を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。塩基配列を確認した後、宿主大腸菌ＢＬ２１の形質転換を行った。ＬＢ培地中で３７℃で５時間培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．４ｍＭになるように加え、さらに３７℃で２．５時間培養した。菌体を遠心により分離し、溶解溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭＥＤＴＡ−１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．２％ＳＤＳ，０．２ｍＭＰＭＳＦ）に溶かし、一度−８０℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行った。１０００ｘｇで３０分遠心し、上清にグルタチオンセファロース４Ｂを加え、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを十分洗浄した後、溶出溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−５０ｍＭグルタチオン）で融合蛋白質を溶出した。その結果、分子量約１１０ｋＤａのＧＳＴ−ＨＰ０３４９４融合蛋白質を得た。
（５）抗体作製
上記の融合蛋白質を抗原として家兔に常法により免疫を行い抗血清を得た。抗血清はまず、４０％飽和硫安沈殿画分をＧＳＴアフィニティーカラムによりＧＳＴ抗体を除いた。素通り画分をさらにＧＳＴ−ＨＰ０３４９４の抗原カラムにより精製した。
（６）ウェスタンブロット
ヒトフィブロサルコ−マ細胞株ＨＴ−１０８０の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜ブロットした後、５％スキムミルクを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＴＰＢＳ）で１時間室温でブロッキングし、抗体をＴＰＢＳで１００００倍希釈したものと１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄し、さらにＴＰＢＳで１００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと１時間インキュベートした。ＴＰＢＳで４回洗浄し、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）により発光させて検出したところ、分子量８０ｋＤａのシグナルが得られた。この分子量はウサギ無細胞翻訳系による本蛋白質のインビトロ翻訳産物の分子量と一致していた。
（７）ＧＦＰ融合蛋白質の発現
ＥｃｏＲＩ認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる２６ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号４）とＳａｌＩ認識部位をを付加した停止コドンまでを含む２６ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号５）を用い、ｐＨＰ０３４９４を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで消化し、ＧＦＰ融合蛋白質発現用ベクタ−ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。塩基配列を確認した後、得られたｐＥＧＦＰ−Ｃ２−ＨＰ０３４９４をリポフェクション法によりＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。蛍光顕微鏡により観察したところｐＥＧＦＰ−Ｃ２をトランスフェクトした細胞では、細胞全体に蛍光が見られるのに対し、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２−ＨＰ０３４９４では核のみに蛍光が見られた。この結果からＨＰ０３４９４は核に存在する蛋白質であることが示された。
（８）ＲＮＡポリメラ−ゼＩＩＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）との結合
ＢａｍＨＩ認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる３３ｍｅｒのセンスプライマー（配列番号６）とＥｃｏＲＩ認識部位を付加した停止コドンまでを含む３３ｍｅｒのアンチセンスプライマー（配列番号７）を用い、ｐＨＰ０３４９４を鋳型としてＰＣＲによりＷＷドメインをコ−ドする翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。これを（４）と同様にして大腸菌内で発現させ、ＧＳＴとＨＰ０３４９４のＷＷドメインの融合蛋白質ＧＳＴ−ＨＰ０３４９４ＷＷを得、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、^３２ＰラベルしたＧＳＴ−ＣＴＤまたは、核抽出物によりリン酸化した^３２Ｐ−ＧＳＴ−ｐＣＴＤ（リン酸化体）（Ｈｉｒｏｓｅ，ＹａｎｄＭａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９５，９３−９６）とインキュベートし、ファーウエスタン法（Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．ｅｔａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ，７０，３５１−３６４）により検出した。ＨＰ０３４９４のＷＷドメインはリン酸化されたＣＴＤとより強く結合することが示された。このことから、この発明の蛋白質は転写調節に関与していることが示唆された。
【００２５】
【発明の効果】
この出願は、ヒト細胞の核に存在する新規蛋白質、この蛋白質をコードするＤＮＡ、この蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡ、およびこのヒト核蛋白質に対する抗体を提供する。この発明の蛋白質および抗体は、癌などの病態の診断および治療などに有用である。このＤＮＡを用いることにより、この蛋白質を大量に発現することができる。この蛋白質と結合する低分子化合物をスクリ−ニングすることによる、新しい型の抗腫瘍剤等の医薬を探索することができる。
【００２６】
【配列表】

Claims

ＷＷドメインを有する配列番号１のアミノ酸配列を含み、リン酸化蛋白質と結合するヒト核蛋白質。
請求項１の蛋白質をコードするＤＮＡ断片。
請求項１の蛋白質をコードするヒトｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ断片。
配列番号２の塩基配列からなる、請求項３のＤＮＡ断片。
請求項２から４のいずれかのＤＮＡ断片を保有し、請求項１のヒト核蛋白質をインビトロ翻訳あるいは宿主細胞内で発現しうる発現ベクター。
請求項５の発現ベクターを保有する形質転換体であって、請求項１のヒト核蛋白質を生産しうる形質転換細胞。
請求項１のヒト核蛋白質に対する抗体。