JP3504524B2 - 検査方法及び診断キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、涙腺、唾液腺等の
アクアポリン５（以下「ＡＱＰ５」）が存在する器官の
外分泌物中においてＡＱＰ５又はＡＱＰ５由来のペプチ
ドを検知することにより該器官を検査する方法、及び、
これを適用し、該器官の病態を診断するための診断方法
に使用する診断キットに関する。ＡＱＰ５は、水チャン
ネルタンパク質の１種として、既に公知の膜タンパク質
である。

【０００２】

【従来の技術】ある種の細胞において、近年、細胞膜を
通した早い水の移動が行われることがわかり、更に、こ
の現象には水を通過させる膜タンパク質が関与している
ことが確認され、各種のこのような膜タンパク質が水チ
ャンネルタンパク質として単離されるに至った。

【０００３】このような水チャンネルタンパク質として
は、アクアポリンとして知られているいくつかのタンパ
ク質が単離されている。現在までのところ、哺乳類では
５種類のアクアポリンが知られており、それぞれ、特異
的な器官局在性を示している。

【０００４】ＡＱＰ５は、このような水チャンネルタン
パク質の一つとして、哺乳類の眼（涙腺、角膜上皮組
織）、唾液腺、気管支等に存在していることが知られて
いる（「医学のあゆみ」、１７３巻、９号、７４５−７
４８頁（１９９５年）；Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，
２７０，Ｃ１２−Ｃ３０（１９９６））。

【０００５】ＡＱＰ５は、リーらによって、ヒト及びラ
ットについて、その遺伝子配列及びアミノ酸配列が報告
されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１巻，８
５９９−８６０４頁（１９９６年））。ＡＱＰ５は、細
胞膜を貫通する６つのドメインを有し、これらのドメイ
ンを結ぶループ、Ｎ末端及びＣ末端が細胞内に露出して
いると考えられており、そのアミノ酸配列上に、Ａ−キ
ナーゼ、Ｃ−キナーゼによるリン酸化部位が存在してお
り、交感神経系−ｃＡＭＰによる調節を受けている可能
性のあることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２７０巻，１９０８−１９１２頁（１９９５
年））。

【０００６】ＡＱＰ５は、眼の涙腺組織においては、涙
腺腺房細胞及び管腔上皮細胞の頂端細胞膜（ａｐｉｃａ
ｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に特異的に局在することが知ら
れており、涙液の分泌に関与していると考えられている
（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，２２４巻，１−４頁
（１９９６年））。

【０００７】涙液は、涙腺から分泌され、角結膜上皮を
覆ってこれを湿潤化するとともに涙液中の成分が作用
し、角結膜の機能を維持し障害を防止する役割を果たし
ている。また、唾液は、唾液腺から分泌され、口腔内粘
膜を湿潤化するとともに、含有する消化酵素を食物中に
混合せしめて食物を消化する機能を果たしている。

【０００８】このような涙腺や唾液腺は、細菌感染やウ
イルス感染により、感染性の炎症を起こす。また、他の
原因から、腫瘍が生じたり何らかの機能障害が発生す
る。

【０００９】例えば、シェーグレン症候群として知られ
ている自己免疫型病態やその他の自己免疫疾患症等によ
り、涙腺組織に障害が発生し、機能障害が起こる。この
ような障害が生じると、多くの場合、リンパ球の浸潤等
の組織異常が発生し、正常な機能を果たすことができな
い状態となる。パソロジー インターナショナル（Ｐａ
ｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４４
巻，５５９−５６８頁（１９９４年））には、シェーグ
レン症候群を呈する病態マウスの唾液腺組織中における
インターロイキンやＴＮＦ等のサイトカインの発現昂進
が報告されている。サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７
６巻，６０４−６０７頁（１９９７年））には、シェー
グレン症候群を呈する病態マウスの唾液腺組織中にα−
ホドリンが特異的に発現することが報告されている。プ
ロシーディングス オブ ナショナルアカデミー オブ
サイエンス ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４巻，５７６７−５７７１頁
（１９９７年））には、シェーグレン症候群を呈する病
態マウスの唾液腺組織中においてシステインプロテアー
ゼ活性が上昇することが報告されている。

【００１０】しかしながら、涙腺や唾液腺の障害の有無
及びその障害の程度については、これまで検査する適切
な方法がなく、涙液や唾液の分泌に異常を感じた患者が
来診した場合においても、その異常の事実は診断可能で
あるものの、当該事実と涙腺や唾液腺の障害とを直接関
連づける有効な手段は限られており、例えば、生検（ｂ
ｉｏｐｓｙ）によって組織の一部を採取して検査する方
法が用いられている。しかし、生検は組織の一部を傷つ
けるため、障害をかえって増悪させる危険を伴い、必ず
しも汎用しうる検査方法ではなかった。

【００１１】更に、このような唾液腺や涙腺の障害の存
在が判明した後、例えば、抗炎症剤の投与等の治療措置
を講じる上で、当該障害が昂進しているのか治癒に向か
っているのかを知ることは極めて重要であるが、その知
見を得る必要が生じるたびごとに上述のような生検を行
うことは、患者の負担が大きすぎて現実的ではない。し
かしながら、これに代わる有効な検査手段が事実上無
く、従って、当該障害の進行程度を簡便かつ的確に検査
するための手段がなかった。

【００１２】上述の報告においても、シェーグレン症候
群を呈する病態に特徴的な代謝上の知見を明らかにする
ものではあるが、唾液腺や涙腺の障害を直接に組織の検
査をすることなく検知する方法を示唆するところは全く
ない。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述の現状
に鑑みて、涙腺や唾液腺等の障害を的確かつ簡易に検査
し、しかも、被験者に肉体的負担をかけることなく繰り
返し行うことができる検査方法、及び、これを利用した
涙腺や唾液腺等の病態の診断を行うための診断キットを
提供することを目的とするものである。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＡＱＰ５が存
在する器官の検査方法であって、上記器官から分泌され
る外分泌物を採取する工程、及び、上記外分泌物中から
ＡＱＰ５又はＡＱＰ５由来のペプチドを検知する工程か
らなる検査方法である。本発明はまた、上記検査方法に
必要な試薬及び器具からなる検査キットでもある。本発
明は更に、涙腺又は唾液腺の病態を診断するための診断
キットであって、涙腺又は唾液腺から分泌された検体を
採取するための器具と、アクアポリン５又はアクアポリ
ン５由来のペプチドを検出するための検出試薬及びその
格納容器と、上記検体と上記検出試薬とを接触させて反
応させるための容器とからなる診断キットでもある。以
下に本発明を詳述する。

【００１５】

【発明の実施の形態】検査方法 本発明の検査方法の対象となる器官は、ＡＱＰ５が存在
する器官である。上記器官の典型的なものとしては、涙
腺及び唾液腺を挙げることができる。上記器官以外であ
っても、外分泌物を採取可能であるかぎり本発明の方法
の対象とすることを妨げるものではない。

【００１６】本明細書中、上記「外分泌物」は、対象と
なる器官から体の内外表面に分泌される物質をいうもの
とする。従って、所謂外分泌腺から分泌される物質のみ
ならず、例えば、気管等の粘膜を構成する細胞が排出す
る粘液状物質をも含むものとする。換言すれば、本明細
書中、外分泌物とは、対象となる器官に由来する物質で
あって、外科的手段によることなしに採取することがで
きる物質をいうものである。例えば、対象となる器官が
涙腺である場合は、涙液であり、唾液腺である場合は、
唾液である。また、例えば、気管支等であっても、その
分泌物を非外科的手段で採取可能であれば本発明の方法
を適用することができる。

【００１７】上記第一の工程においては、検査対象器官
からの外分泌物を採取する。この採取方法としては特に
限定されず、検査対象器官に応じて適宜の方法を採用す
ることができ、例えば、涙液は、濾紙、脱脂綿、綿糸等
の吸収材に吸収させる方法、涙液を細管に吸引する方法
等を採用することができる。唾液は、例えば、口腔中に
脱脂綿等の吸収材を含ませて吸収する方法等により採取
することができる。

【００１８】上記第二の工程においては、採取した上記
外分泌物中からＡＱＰ５又はＡＱＰ５由来のペプチドを
検知する。本明細書中、「ＡＱＰ５由来のペプチド」と
は、涙腺、唾液腺等のＡＱＰ５が存在する器官や組織の
細胞膜に存在するＡＱＰ５から切断されて生じるペプチ
ドであって、抗体と結合して抗原抗体反応を生じること
ができるものをいう。ＡＱＰ５由来のペプチドとして
は、例えば、細胞膜に埋め込まれていないＡＱＰ５の構
造、例えば、ループや末端部分等が切断されて生じるペ
プチド等であって、抗体と結合して抗原抗体反応を生じ
ることができるもの等であってよい。本明細書中、ＡＱ
Ｐ５及びＡＱＰ５由来のペプチドを纏めて「ＡＱＰ５タ
ンパク質」と称する。上記ＡＱＰ５は、膜タンパク質で
あって本来は細胞膜に固定されており、細胞外に出現す
ることはない。しかしながら、ＡＱＰ５が存在する器官
において、ＡＱＰ５タンパク質が、上記器官の組織に障
害が発生した場合に、後に詳述するように、外分泌物中
に出現するに到る。上記器官の組織の障害によってＡＱ
Ｐ５タンパク質が漏出する機作は必ずしも明らかではな
いが、単核球の浸潤にともなって、細胞膜の正常な構造
に変化が生じ、膜に固定されていたＡＱＰ５が脱離した
り、また、ＡＱＰ５が切断されたりして出現するものと
考えられる。アクアポリンについては、アクアポリン２
の尿中排泄と腎臓障害との関連が報告されている（Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｅｅｔａｂ（ＵＮＩ
ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ），Ｊｕｎ １９９７年，８２
（６）巻，１８２３−７頁）。しかしながら、器官局在
性が異なるＡＱＰ５については、本発明者らによって始
めて上述の事実が確認された。本発明は、この新規発見
を一つの端緒として完成されたものである。

【００１９】ＡＱＰ５タンパク質の検知方法としては特
に限定されず、微量のタンパク質を検出する周知の方法
に適宜に公知の変形を加えて応用することができる。例
えば、検体をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけ、含有するタンパク質やペプチドを展開、分離し
た後、抗原抗体反応を利用するならば、特定のタンパク
質やペプチドの存在を検知することができる。この場
合、電気泳動されたタンパク質やペプチドをニトロセル
ロース膜上に転写し、転写されたタンパク質やペプチド
に、抗ＡＱＰ５抗体を作用させ、標識したプロテインＡ
や抗ＩｇＧ抗体等を用いて検出するウェスタンブロット
法を好適に使用することができる。

【００２０】上記標識としては、例えば、放射性同位
体、蛍光物質、紫外線又は可視光線吸収物質、フェリチ
ン、酵素、これらの組み合わせ等であってよい。これら
のうち、蛍光物質、酵素又はこれらの組み合わせが好ま
しい。上記蛍光物質としては特に限定されず、例えば、
フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テキ
サスレッド、ルシファーイエロー、カスケードブルー、
フィコエリスリン、エオシン、ビオチン等を挙げること
ができる。

【００２１】上記酵素としては特に限定されないが、容
易に検出可能な信号を発する反応系を構築することがで
きるペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロ
シナーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファタ
ーゼ等を挙げることができる。上記信号は、反応系に応
じて、又は、蛍光物質との組み合わせに応じて、電気
的、光学的、化学的形態を取りうる。

【００２２】上記酵素がペルオキシダーゼである場合
は、 Ｈ₂ Ｏ₂ ＋ＡＨ₂ →２Ｈ₂ Ｏ＋Ａ の反応を触媒する。但し、ＡＨ₂ は、還元型の化合物を
表し、Ａは酸化型の化合物を表す。この化合物として、
例えば、酸化により化学発光する、ルミノール等の物質
を使用するならば、上記反応による発光を検出する適当
な手段、例えば、感光性フィルム等により検知すること
ができる。このような化学発光を利用する方法によれ
ば、１ｐｇ程度の抗ＡＱＰ５抗体検出感度を達成するこ
とができる。

【００２３】また、テトラメチルベンチジン等の、酸化
により発色若しくは変色する物質を使用するか、又は、
オルトフェニレンジアミンジイドクロリド等を使用して
上記反応と発色若しくは変色反応とを組み合わせたなら
ば、発色又は変色を観察することにより、目的物質を検
出することができる。

【００２４】上記抗ＡＱＰ５抗体は、ＡＱＰ５タンパク
質を抗原として得られるものである。上記ＡＱＰ５タン
パク質としては、ＡＱＰ５自体であってもよく、その一
部であるペプチドであってもよい。この場合、タンパク
質の疎水性領域は、一般的にはタンパク質の三次元構造
の内部に位置するので、抗体が認識する部位としては好
ましくないと考えられる。従って、疎水性領域を含まな
いアミノ酸配列部分を使用することが好ましい。このよ
うな疎水性領域を含まないアミノ酸配列部分は、既知の
ＡＱＰ５のアミノ酸配列から、タンパク質化学の知見に
基づいて容易に知ることができる。上記ＡＱＰ５タンパ
ク質としてＡＱＰ５の一部であるペプチドを使用して得
られた抗ＡＱＰ５抗体は、ＡＱＰ５と特異的に結合する
のみならず、抗原として使用したペプチドとも特異的に
結合することができる。ＡＱＰ５由来のペプチドの検出
を目的とする場合には、目的とするペプチドを抗原とし
て得られた抗ＡＱＰ５抗体を使用することが好ましい。

【００２５】上記ペプチドの調製方法としては特に限定
されず、例えば、ペプチド合成装置等により固相上でペ
プチドを合成する方法、担体を用いない液相法によって
合成する方法等の従来公知のペプチド合成方法等を使用
することができる。また、このペプチドをコードするｃ
ＤＮＡをベクターに組み込み、その形質転換体を発現さ
せてペプチドを得る方法等の遺伝子工学的手法を利用し
たり、ＡＱＰ５タンパク質を適当なプロテアーゼによっ
て加水分解して得ることも可能である。

【００２６】上記方法によって調製したペプチドは、逆
相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等の公知
の精製方法によって精製することができ、更に、エドマ
ン法を利用したアミノ酸配列分析装置等によってそのア
ミノ酸配列を確認することができる。

【００２７】このようなＡＱＰ５タンパク質を、適当な
哺乳動物、例えば、ウサギ等に接種して免疫した後、抗
血清を採取し、ＩｇＧ分画を取得することにより、目的
の抗ＡＱＰ５抗体を得ることができる。この場合、ヒト
由来ＡＱＰ５タンパク質を免疫源として使用すれば、抗
ヒトＡＱＰ５抗体が生成される。ヒトの器官の検査用に
は、抗ヒトＡＱＰ５抗体を使用することが好ましいが、
他の動物のＡＱＰ５であっても、アミノ酸配列が同一又
は近似である部位のペプチドを免疫源として使用するな
らば、ヒトの器官からの検体の検査に使用可能である場
合があり、ヒトの器官の検査用であっても、このような
免疫源の使用を排除するものではない。

【００２８】本検査方法は、上記各工程の実行を妨げ
ず、かつ、本発明の目的を阻害しないかぎり他の工程を
含んでいてもよい。上記検査方法に必要な上述の試薬及
び器具を組み合わせることにより、ＡＱＰ５を有する器
官の検査キットとすることができる。

【００２９】診断キット 本発明の検査方法を利用して、ＡＱＰ５をその組織細胞
膜中に有する涙腺や唾液腺等の器官や組織の病状を診断
するための診断方法に使用することができる診断キット
を作製することができる。上記診断キットは、上述の本
発明の検査方法を実行するために必要な試薬を、好まし
くは予め所要量だけ分包しておき、不溶性支持体や専用
容器等に検体とともに添加することにより、容易かつ簡
便に特別に習熟を要することなく正確な結果を得ること
ができるように、複数の要素を組み合わせてなるもので
ある。

【００３０】上記要素としては、検体中のＡＱＰ５タン
パク質を検出する方法によって異なるが、一般には、試
薬及び検体を採取するための器具、上記試薬を格納する
ための容器、上記試薬を反応させるための容器を含む。
上記試薬は、ＡＱＰ５タンパク質の存在を検出し、か
つ、ＡＱＰ５タンパク質が存在しないときにはＡＱＰ５
タンパク質が存在するときの指標を発しない反応系を構
築することができるものである。換言すれば、ＡＱＰ５
タンパク質の存在又は非存在に対応して区別可能な信号
を検出することができる試薬である。好ましくはＡＱＰ
５タンパク質を特異的に認識するための一つ又は複数の
物質を含む試薬である。このような試薬としては、例え
ば、抗ＡＱＰ５抗体と、上記抗ＡＱＰ５抗体とＡＱＰ５
タンパク質との結合体を検出することができる標識とか
らなる試薬であってよい。上記標識は、目的物を検知す
るために、物理的又は化学的手段で検出可能な信号を発
することができるような適当な標識手段であってよい
が、検出が簡便に行えるので、蛍光物質、酵素が好まし
い。上記蛍光物質、酵素としては特に限定されず、いず
れも上述のものを好適に使用することができる。

【００３１】上記酵素がペルオキシダーゼである場合
は、酸化により発色若しくは変色する物質を使用する
か、又は、上記反応と発色若しくは変色反応とを組み合
わせて、発色又は変色を観察することにより、目的物質
を検出することができる。

【００３２】上記ＡＱＰ５タンパク質と抗ＡＱＰ５抗体
との結合体を検出するにあたっては、検体中に極微量存
在するＡＱＰ５タンパク質の検出を的確かつ効率よく行
う必要があることに留意すべきであって、そのために
は、ＡＱＰ５タンパク質と抗ＡＱＰ５抗体との結合体を
局在化させて検出することが好ましい。この局在化のた
めには、（１）抗ＡＱＰ５抗体との反応に先立って予め
検体中のＡＱＰ５タンパク質を適当な不溶性支持体上に
非拡散的に吸着させること、（２）抗ＡＱＰ５抗体との
反応に先立って予め検体中のＡＱＰ５タンパク質を適当
な方法で不溶性支持体上に分離濃縮すること、が好まし
い。

【００３３】上記（１）の方法としては、例えば、涙液
や唾液等をろ紙、綿糸、セルロース膜等の不溶性支持体
上に直接採取する方法であってよい。その際、支持体上
で毛管現象により分離濃縮される効果を期待することも
可能である。上記（２）の方法としては、涙液等を採取
した後、ＳＤＳ−ゲル電気泳動法等の適当な手段によっ
てゲル上に検体を展開し、ゲルの特定部分にＡＱＰ５タ
ンパク質を局在化させてもよい。上記（１）の方法は、
装置及び操作の簡便性に優れるので、簡易な方法を提供
することができる利点がある。

【００３４】上記（１）の方法を採用した場合、不溶性
支持体上のＡＱＰ５タンパク質を検出するには、多糖類
ゲル等の適当な不溶性支持担体上に固定した抗ＡＱＰ５
抗体を、ＡＱＰ５タンパク質を吸着した上記支持体と密
着させてＡＱＰ５タンパク質と結合させ、上記支持担体
上にＡＱＰ５タンパク質を移行させ、その後、上記支持
担体上のＡＱＰ５タンパク質を、標識を持つ第二の抗Ａ
ＱＰ５抗体によって検出することができる。

【００３５】例えば、先ず、上記標識を持つ第二の抗Ａ
ＱＰ５抗体を予め、例えば、セルロース膜等の適当な不
溶性担体上に均一に塗布しておき、これをＡＱＰ５タン
パク質を結合した上記支持担体と密着させることによ
り、局在するＡＱＰ５タンパク質と上記標識を持つ第二
の抗ＡＱＰ５抗体とをその局在部位において結合させ
る。この方法の有利な点は、ＡＱＰ５タンパク質に結合
した第二の抗ＡＱＰ５抗体と、ＡＱＰ５タンパク質に結
合していない第二の抗ＡＱＰ５抗体とを、密着させた両
方の担体を離すことにより、容易に分離することができ
る点にある。また、検出対象であるＡＱＰ５タンパク質
が、予めある程度局在化され、濃縮されている効果を利
用できることにもある。従って、標識の検出において
も、実質的に溶媒を使用しないことが、この効果を有利
に利用する点で好ましい。例えば、呈色反応系を構成す
る化合物であって、標識酵素の基質となるものを少量の
緩衝液とともに吸収性の不溶性支持体に含ませたもの
と、上記標識酵素を持つ第二の抗ＡＱＰ５抗体を担持す
る支持担体とを密着させ、ＡＱＰ５タンパク質の局在部
位において呈色させる方法を採用することができる。

【００３６】上記第二の抗ＡＱＰ５抗体は、上記第一の
抗体と同一の抗体を酵素標識したものであってもよく、
上記第一の抗体と異なる抗体であってもよい。一般的に
は、ＡＱＰ５の異なる部位のペプチドを認識する抗体で
あることが好ましい。

【００３７】なお、上述の標識を持つ第二の抗ＡＱＰ５
抗体を利用する検出方法は、検体を固相上に固定する上
記（１）の方法との組み合わせのみならず、涙液や唾液
等をろ紙、綿糸、脱脂綿、セルロース膜等に採取した
後、適当な緩衝液にＡＱＰ５タンパク質を溶出した検体
に適用することができることは言うまでもない。この場
合は、上記ＡＱＰ５タンパク質を溶解した緩衝液を、抗
ＡＱＰ５抗体を固定したマイクロプレート等に注入し、
ＡＱＰ５タンパク質をいったん抗ＡＱＰ５抗体上に結合
させ、その後、上記標識を持つ第二の抗ＡＱＰ５抗体を
注入してＡＱＰ５タンパク質に結合させ、標識を検知す
ればよい。

【００３８】上述の方法は、検知対象であるＡＱＰ５タ
ンパク質に対して第二の抗ＡＱＰ５抗体を使用するもの
である。一方、抗ＡＱＰ５抗体に対する抗体を第二の抗
体として使用することもできる。この場合は、検知対象
であるＡＱＰ５タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル
やセルロース膜等の適当な不溶性支持体上に、好ましく
は局在的に、担持させ、第一の抗体として抗ＡＱＰ５抗
体を結合させ、この抗ＡＱＰ５抗体を上記抗ＡＱＰ５抗
体に対する第二の抗体によって検出する。上記第二の抗
体は、上記第一の抗体がＩｇＧサブクラスであるから、
ＩｇＧに対する抗体であってよい。この方法は、抗ＡＱ
Ｐ５抗体の使用量を少なくすることができる利点を持
つ。

【００３９】検知対象であるＡＱＰ５タンパク質を支持
体上に担持させるには、上述したろ紙、綿糸、脱脂綿、
セルロース膜等の吸着性支持体上に直接採取する方法で
あってよいが、上記（２）の方法を好適に適用すること
ができる。この場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法等の適当な手段によってゲル上に検体を展開
した後、ＡＱＰ５タンパク質が局在する部分をニトロセ
ルロース膜等に転写させたものが好ましい。上記転写膜
に抗ＡＱＰ５抗体を反応させて膜上に存在するＡＱＰ５
タンパク質と結合させ、次に、好ましくは標識された、
上記抗ＡＱＰ５抗体に対する抗体を第二の抗体として結
合させる。この手法は、ウェスタンブロティング法とし
て周知である。

【００４０】上記診断キットは、上記試薬に加えて、上
述の検体採取器具、上述の支持体、担体等、及び、上記
試薬の格納や、反応操作を行うための専用容器等を含
む。

【００４１】

【実施例】以下に実験例、実施例等を掲げて本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれらのみに限定される
ものではない。

【００４２】実験例１ 抗ラットＡＱＰ５ウサギ抗体
（ＩｇＧ分画）の調製 ＡＱＰ５タンパクＣ末端を認識する抗体を以下の方法で
調製した。 （１）抗ＡＱＰ５ペプチド抗血清の調製 ラットＡＱＰ５タンパク質アミノ酸配列のＣ末端領域の
うち、アミノ酸配列番号２４１〜２５６番目に相当する
アミノ酸配列を有するペプチドをペプチド合成装置によ
り固相法で合成した。このペプチドのアミノ酸配列を配
列表のアミノ酸配列番号１に示した。このアミノ酸配列
番号１のうち、１〜１５番目は、ラットＡＱＰ５タンパ
ク質アミノ酸配列番号２４１〜２５６番目に相当する。

【００４３】得られたペプチドは、ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ；Ｋｅｙｈｏｌｅ ＬｉｍｐｅｔＨｅｍｏｃｙａｎｉ
ｎ）とコンジュゲートさせた。アミノ酸分析の結果か
ら、コンジュゲート１．０ｍｇあたり１７３〜１８６ｎ
ｍｏｌのペプチドが含まれていることが判明した。ウサ
ギには、このコンジュゲートをアジュバントと混合後に
接種し、免疫した。抗体価の上昇をＥＬＩＳＡ法で確認
した後、全採血し抗血清を分離した。

【００４４】（２）ＩｇＧ分画の調製 ＩｇＧ分画の精製は、ＭＡｂＴｒａｐＧＩＩキット（商
品名）（ファルマシア社製）を使用した。上述により得
られたウサギ抗血清をポアサイズ０．４５μｍのメンブ
ランフィルターで濾過後、ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｇ ｃｏｌｕｍｎ（商品名）（ファルマシア社製）
で処理しＩｇＧ分画を得た。得られたＩｇＧはりん酸緩
衝液で中和後、−２０℃で保存した。なお、分離したＩ
ｇＧの一部は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、以下のとお
り、精製の成否の確認に用いた。

【００４５】（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの実行 電気泳動は、カセット電気泳動槽（Ｍｏｄｅｌ ＤＰＥ
−２２０１、第一化学薬品社製）を使用した。ゲルプレ
ートは、マルチゲル１０／２０（商品名）（１０−２０
％ポリアクリルアミドグラジエントゲル、第一化学薬品
社製）を使用した。通電は、電気泳動用電源装置（フナ
コシ社製）を用い、定電流（ｍａｘ．４０ｍＡ／プレー
ト）条件下で行った。試料は全てサンプルバッファー
（０．０６２５Ｍトリス塩酸、２％ＳＤＳ、１０％グリ
セロール、５％２−メルカプトエタノール及び０．０１
％ＢＰＢ混合溶液）に溶解し、５分間煮沸後、ゲルに１
０μｌ注入した。泳動用緩衝液は、０．０２５Ｍトリス
塩酸、０．１９２Ｍグリシン及び０．１％ＳＤＳの混合
溶液を使用した。なお、泳動に際して分子量マーカー
（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓｔａｎ
ｄａｒｄ Ｌｏｗ ｒａｎｇｅ（商品名）、ＢｉｏＲａ
ｄ社製）も同時に泳動させた。泳動終了後、ゲルをクマ
シーブルー染色してタンパク質を検出した。その結果、
５２ｋＤａ付近に単一バンドを認めるのみであり、Ｉｇ
Ｇ分画は充分に精製されていることが確認された。

【００４６】実施例１ マウス涙液中のＡＱＰ５タンパ
ク質の検出 涙腺組織の障害に伴ってＡＱＰ５タンパク質が涙液中に
漏出するか否かを、シェーグレン症候群様の自己免疫性
涙腺組織障害を惹起する病態マウスを用いて以下のとお
り検証した。 （１）刺激分泌涙液の採取 病態マウスとしては、シェーグレン症候群様の自己免疫
性涙腺組織障害を惹起することが知られているＭＲＬ／
ｌｐｒマウス（２４週齢雌性）、ＮＦＳ／Ｓ−ＴＸマウ
ス（生後３日目に胸腺を摘出し涙腺障害を惹起している
マウス；１０週齢雌性）を使用した。ＴＸ群の対照とし
ては、胸腺を摘出していないＮＦＳ／Ｓ−ｎｏｎＴＸマ
ウス（１０週齢雌性）を使用した。また、正常マウスと
してＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢雌性）を使用した。

【００４７】これらの各マウスから、ネンブタール麻酔
下（ペントバルビタール６５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）
に、以下の方法で涙液を採取した。すなわち、正向反射
消失確認後、０．００５％ピロカルピン−ｓａｌｉｎｅ
溶液を体重１０ｇあたり０．１ｍｇ皮下投与し、その
後、１０分間隔で３回、両眼下眼瞼にフェノールレッド
綿糸（ゾーンクイック（商品名）、昭和薬品化工社製）
を１分間挿入し、涙液を綿糸に吸着させた。涙液の吸着
により赤色に呈色した綿糸部分を切り取り、その長さを
計測後、各綿糸を各固体別に１．５ｍｌマイクロチュー
ブ内に入れ、−２０℃で保存した。

【００４８】（２）ＡＱＰ５タンパク質の検出 採取した綿糸の入ったマイクロチューブに、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ用サンプルバッファー（０．０６２５Ｍトリス塩
酸、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２−メルカ
プトエタノール及び０．０１％ＢＰＢ混合溶液）を綿糸
１ｍｍあたり１μｌ添加し、９５℃で５分間熱処理する
ことにより、涙液タンパク質を溶出させた。この溶出液
１０μｌをマルチゲル１０／２０（商品名）（１０−２
０％ポリアクリルアミドグラジエントゲル、第一化学薬
品社製）に注入し、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行
した。電気泳動終了後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐ（商品名）、ミリポア社製）に涙液タンパク質を
転写後、実験例１で調製したウサギ抗ラットＡＱＰ５抗
体を一次抗体とし、二次抗体として西洋わさびペルオキ
シダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａ
ｓｅ（ＨＲＰ））標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ファルマシ
ア社製）を使用してウエスタンブロット法にてＡＱＰ５
タンパク質の検出を行った。検出は、ＥＣＬ ｄｅｔｅ
ｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名）（ファルマシア社製）を
使用し、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）法を用いた。結果を図１に示し
た。

【００４９】（３）マウス涙腺病理標本の作製 ＭＲＬ／ｌｐｒマウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスについて
は、涙液採取後、眼窩外涙腺を摘出した。摘出した涙腺
は、常法によりパラフィン包埋後、ミクロトームにて薄
切片を作製し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ．Ｅ．）
染色を施し、組織障害の有無を観察した。

【００５０】（４）結果 図２に示すように、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（２４週齢雌
性）、ＮＦＳ／Ｓ−ＴＸマウス（１０週齢雌性）の涙液
中には、２８ｋＤａ付近にＡＱＰ５タンパク質を検出し
た。一方、ＮＦＳ／Ｓ−ｎｏｎＴＸマウス（１０週齢雌
性）は、胸腺摘出を行っていないマウスであるが、その
涙液中にはＡＱＰ５タンパク質を検出しない。また、正
常マウスであるＢＡＬＢ／ｃマウスの涙液中には、ＡＱ
Ｐ５タンパク質を検出しなかった。

【００５１】図１Ａに示すように、涙腺病理標本から、
ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（２４週齢雌性）涙腺において
は、単核細胞の浸潤部位が広範囲に観察され、涙腺組織
障害を受けていることが明らかであった。一方、ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス涙腺においては、単核細胞の浸潤は見られ
ず、涙腺組織の異常に関する所見は認められなかった
（図１Ｂ）。

【００５２】実施例２ マウス涙液中のＡＱＰ５タンパ
ク質の検出 涙腺組織の障害の発現に伴ってＡＱＰ５タンパク質の涙
液中への漏出が生じるか否かを、加齢によりシェーグレ
ン症候群様の自己免疫性涙腺組織障害を惹起するモデル
マウスを用いて以下のとおり検証した。 （１）刺激分泌涙液の採取 モデルマウスとしては、シェーグレン症候群様の自己免
疫性涙腺組織障害を加齢に伴って発症することが知られ
ている（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９
７，１５，５１５−５２１）雄のＮＯＤ／Ｓｈｉ Ｊｃ
ｌマウスを使用した。

【００５３】雄のＮＯＤ／Ｓｈｉ Ｊｃｌマウスの４週
齢のものを入手して飼育した。ＮＯＤ／Ｓｈｉ Ｊｃｌ
マウスの雄は、５週齢より以前ではシェーグレン症候群
様の自己免疫性涙腺組織障害の発症を組織学的には確認
できず、事実上発症していないが、５週齢を超えると障
害の発現を組織学的に確認できることを、ＮＯＤ／Ｓｈ
ｉ Ｊｃｌマウスの雄の涙腺のリンパ球浸潤の広がりを
Ｈ．Ｅ染色により病理学的検査することによって予め確
認した。また、涙液分泌量は、加齢により有意には低下
しないことも確認した。

【００５４】５週齢、８週齢、１０週齢に達した雄性Ｎ
ＯＤ／Ｓｈｉ Ｊｃｌマウスの個体から、ネンブタール
麻酔下（投与量：体重１０ｇあたり０．２ｍｌ（６０ｍ
ｇ／ｋｇ））に、以下の方法で涙液を採取した。すなわ
ち、正向反射消失確認後、０．００１％塩酸ピロカルピ
ンを体重１０ｇあたり０．１ｍｇ皮下投与し、その後、
１０分間隔で２回、両眼下眼瞼にフェノールレッド綿糸
（ゾーンクイック（商品名）、昭和薬品化工社製）を１
分間挿入し、涙液を綿糸に吸着させた。涙液の吸着によ
り赤色に呈色した綿糸部分を切り取り、その長さを計測
後、各綿糸を各固体別に１．５ｍｌマイクロチューブ内
に入れ、−８０℃で保存した。

【００５５】（２）ＡＱＰ５タンパク質の検出 採取した綿糸の入ったマイクロチューブに、ＳＤＳサン
プルバッファー（ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーに
０．５％の２−メルカプトエタノールを加えたもの）を
綿糸１０ｍｍあたり４０μｌ添加し、１０分間攪拌し、
サンプルを調製した。このサンプルを９５℃にて５分間
熱処理を施した後、サンプル液１０μｌをマルチゲル１
０／２０（商品名）（１０−２０％ポリアクリルアミド
グラジエントゲル、第一化学薬品社製）に注入し、常法
によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行した。電気泳動終了後、
６０分間ブロッティングを行い涙液タンパク質を転写
後、実験例１で調製したウサギ抗ＡＱＰ５抗体を一次抗
体とし、これにＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体とＨＲＰ
標識ストレプトアビジン−ビオチンの混合液を使用して
ウエスタンブロット法にてＡＱＰ５タンパク質の検出を
行った。検出は、ＥＣＬ検出試薬（アマシャム社製）を
使用し、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）法を用いた。２８ｋＤａ付近にバ
ンドがあられることをもってＡＱＰ５タンパク質を検出
した。

【００５６】（３）涙腺病理標本の作製 各マウスから涙液採取後、直ちに眼窩外涙腺を摘出し
た。摘出した涙腺は、常法によりパラフィン包埋後、ミ
クロトームにて薄切片を作製し、同一箇所の２枚の薄片
につき、一つはＨ．Ｅ．染色を施し、他は、抗ＡＱＰ５
抗体を使用した免疫染色（ＩＨＣ）を施して、組織障害
の有無を観察した。結果を図３に示した。また、涙腺障
害部位面積を測定した。

【００５７】（４）結果 図３ａＨ．Ｅ．に示すように、涙腺病理標本から、雄の
ＮＯＤ／Ｓｈｉ Ｊｃｌマウス（５週齢）涙腺において
は、単核細胞の浸潤は見られず、涙腺組織の異常に関す
る所見は認められなかった。しかし、８週齢（図３ｂ
Ｈ．Ｅ．）、１０週齢（図３ｃＨ．Ｅ．）と加齢するに
つれて単核細胞の浸潤部位が広範囲に観察され、涙腺組
織障害を受けていることが明らかであった。また、免疫
染色の結果から、５週齢、８週齢及び１０週齢のサンプ
ルはいずれもＡＱＰ５を発現していることを示してい
る。

【００５８】表１に示すように、雄のＮＯＤ／Ｓｈｉ
Ｊｃｌマウス（５週齢）サンプルは、涙液中にＡＱＰ５
タンパク質を検出しなかった。涙腺病理標本の観察から
このサンプルには涙腺組織の異常に関する所見は認めら
れず、また、ＡＱＰ５を発現していることも確認された
ことから、正常涙腺組織では涙液中にＡＱＰ５タンパク
質を出現させないことが確かめられた。一方、８週齢、
１０週齢サンプルは、涙液中にＡＱＰ５タンパク質を検
出した。涙腺病理標本の観察からこれらのサンプルには
涙腺組織の異常所見が認められた。従って、涙腺組織の
障害の発現に伴ってＡＱＰ５タンパク質の涙液中への漏
出が生じることが確かめられた。なお、表１中、＋は陽
性を、−は陰性を表す。

【００５９】

【表１】

【００６０】以上の事実から、涙腺組織障害に伴い、涙
腺腺房細胞又は管腔細胞のアピカル側膜タンパク質の一
つであるＡＱＰ５タンパク質が、涙液中に漏出すること
が明らかに示された。また、正常組織ではこのような漏
出が生じないことも明らかに示された。

【００６１】上記知見に従えば、第一に、涙液中のＡＱ
Ｐ５タンパク質を検知することにより、涙腺組織のバイ
オプシーを実施することなく、簡便かつ被験者に負担を
かけることなく、涙腺組織障害を検知することが可能で
ある。また、第二に、涙液中のＡＱＰ５タンパク質を、
イムノアッセイ法等により定量することにより、涙液中
へのＡＱＰ５タンパク質の漏出量又はその経時変化を知
ることが可能である。病理組織学的知見の蓄積による涙
腺障害の程度又は進行の度合いとＡＱＰ５タンパク質の
漏出量との関係等を利用することにより、本発明の方法
を用いて涙腺障害の程度又は進行の度合いに関する知見
を得ることが可能となる。

【００６２】実施例３ 診断キット 以下の抗体及び試薬を使用し、ＡＱＰ５タンパク質の検
出に利用する診断キットを作製した。 一次抗体：抗ＡＱＰ５抗体Ａ（ＩｇＧ分画） 二次抗体：抗ＡＱＰ５抗体Ｂ（ＩｇＧ分画） 検出試薬：オルトフェニレンジアミンジイドクロリド過
酸化水素水溶液 検体採取器具：綿糸又はガラス製毛細管 不溶性担体：９６穴プレート タンパク質検出器具：プラスチック製 標準液：精製ＡＱＰ５タンパク質水溶液

【００６３】

【発明の効果】本発明の検査方法は、上述の構成よりな
るので、涙腺や唾液腺等の障害を的確かつ簡易に検査
し、しかも、被験者に肉体的負担をかけることなく繰り
返し行うことができる。また、これを利用した本発明の
診断キットは、外科的手段によることなく、簡便かつ正
確に、涙腺や唾液腺等の病状の診断を行うことができ
る。

【００６４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 参天製薬株式会社 (SANTEN PHARMACEUTICAL CO., LTD.) <120> 検査方法及び診断キット <130> 99J05Z <150> JP HEI 10-206989 <151> 1998-07-22 <160> 1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> ラットＡＱＰ５タンパク質アミノ酸配列のＣ末端領域のうち、アミノ酸配 列番号２４１〜２５６番目に相当するアミノ酸配列 <400> 1 Gly Thr Tyr Glu Pro Glu Glu Asp Trp Glu Asp His Arg Glu Glu Arg 1 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】涙腺病理標本の写真。Ａは、ＭＲＬ／ｌｐｒ
（２４週齢）マウスである。Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃ（７週
齢雌性）マウスである。

【図２】実施例１で行ったＡＱＰ５の検出結果を表す
図。レーン１は、ＭＲＬ／ｌｐｒ（２４週齢雌性）マウ
スである。レーン２は、ＮＳＦ／Ｓ−ＴＸ（１０週齢雌
性）マウスである。レーン３は、ＮＳＦ／ｎｏｎ−ＴＸ
（１０週齢）マウスである。レーン４は、ＢＡＬＢ／ｃ
（７週齢雌性）マウスである。

【図３】雄のＮＯＤ／Ｓｈｉ Ｊｃｌマウス（５週齢、
８週齢、１０週齢）の涙腺病理標本の写真。ＩＨＣは、
免疫染色のものを表す。Ｈ．Ｅ．は、ヘマトキシリン−
エオシン染色のものを表す。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平10−271996（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−160735（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−130063（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−41997（ＪＰ，Ａ) 特表2000−501931（ＪＰ，Ａ) Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，1998年, ｖｏｌ．275， ｎｏ．４，ｐ．Ｃ1151 −Ｃ1157 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/50 G01N 33/543 575

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクアポリン５が存在する器官の検査方
   法であって、前記器官から分泌される外分泌物を採取す
   る工程、及び、前記外分泌物中からアクアポリン５又は
   アクアポリン５由来のペプチドを検知する工程からなる
   ことを特徴とする検査方法。
2. 【請求項２】 アクアポリン５が存在する器官は、涙腺
   又は唾液腺であり、外分泌物は、涙液又は唾液である請
   求項１記載の検査方法。
3. 【請求項３】 アクアポリン５又はアクアポリン５由来
   のペプチドを検知する方法は、免疫測定法である請求項
   １又は２記載の検査方法。
4. 【請求項４】 免疫測定法は、標識酵素及び／又は標識
   蛍光物質を使用するものである請求項３記載の検査方
   法。
5. 【請求項５】 涙腺又は唾液腺の病態を診断するための
   診断キットであって、涙腺又は唾液腺から外分泌された
   検体を採取するための器具と、アクアポリン５又はアク
   アポリン５由来のペプチドを検出するための検出試薬及
   びその格納容器と、前記検体と前記検出試薬とを接触さ
   せて反応させるための容器とからなることを特徴とする
   診断キット。
6. 【請求項６】 検出試薬は、不溶性担体に担持された抗
   アクアポリン５抗体及び前記抗アクアポリン５抗体に結
   合したアクアポリン５又はアクアポリン５由来のペプチ
   ドに結合することができる標識された第二の抗アクアポ
   リン５抗体を含むものである請求項５記載の診断キッ
   ト。
7. 【請求項７】 検出試薬は、抗アクアポリン５抗体及び
   前記抗アクアポリン５抗体に特異的に結合することがで
   きる標識された第二の抗体を含むものである請求項５記
   載の診断キット。
8. 【請求項８】 標識は、酵素標識及び／又は標識蛍光物
   質である請求項６又は７記載の診断キット。
9. 【請求項９】 標識酵素は、ペルオキシダーゼ、グルコ
   ースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ
   及びアルカリ性ホスファターゼからなる群から選択され
   た酵素である請求項８記載の診断キット。
10. 【請求項１０】 標識蛍光物質は、フルオレセインイソ
    チオシアネート、ローダミン、テキサスレッド、ルシフ
    ァーイエロー、カスケードブルー、フィコエリスリン、
    エオシン及びビオチンからなる群から選択された物質で
    ある請求項８記載の診断キット。