JP3498960B2 - 蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ - Google Patents

蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、試料中の分析物を測定するための方法、組
成物、およびキットに関するものである。特に、本発明
は、一重項酸素と反応して蛍光生成物を生成できる光活
性インジケーター前駆体を利用する特異的結合アッセイ
に関するものである。
臨床診断分野は、容易かつ正確に測定し得る物質（分
析物）の種類、並びに、測定方法の両方に関して、近年
大きな広がりを見せている。液体中に低濃度で存在する
物質を測定するための好便で信頼でき、かつ有害でない
方法が望まれている。臨床化学において、これらの物質
は、体液中に10-12モル以下の濃度で存在することもあ
る。これら低濃度の物質を検出する困難さは、利用し得
る試料サイズが比較的小さい場合に増大する。
アッセイを開発する際には、多くの考慮すべき問題が
存在する。１つの考慮点は、分析物の濃度変化に対する
シグナル応答である。第２の考慮点は、実施に際しての
アッセイプロトコールの容易さである。第３の考慮点
は、試料間の干渉の多様性である。有用なアッセイを開
発する際の更なる考慮点には、試薬類の製造および精製
の容易さ、設備の利用可能性、自動化の容易さ、および
対象物質との相互作用がある。
広い技術範疇の一つが、分析物存在の関数として、標
識化リガンドの特定の空間的および極性の構成に特異的
に結合できる受容体の使用に関する。受容体が結合する
ことにより観察される効果は、標識によって変わるもの
である。ある場合には、受容体が結合することにより、
単に、結合標識化リガンドと非結合標識化リガンドとの
分子量の相異を生ずる。他の場合には、受容体の結合
が、結合標識化リガンドの遊離標識化リガンドからの分
離を容易ならしめるものであったり、または、標識化リ
ガンドに結合する受容体の量に応じてシグナルが変化す
るように標識から得られたシグナルの性質に影響を及ぼ
すこともある。受容体を標識化し、リガンドを標識化し
ないというような更なるバリエーションもある。別法と
して、受容体およびリガンドの双方を標識化するか、ま
たは異なる受容体を２つの異なる標識で標識化するが、
その際、標識は、極めて近接している場合に相互作用
し、かつ存在するリガンドの量は、受容体の標識が相互
作用し得る度合に影響を与えるものである。
依然として、広範囲の様々なリガンド類に適用できる
か、または他の方法が容易に適用可能でない特定の場合
に使用できる、新規かつ正確な技術に対する要望があ
る。
結合標識と非結合標識を分離する必要のない均一系イ
ムノアッセイは、小分子の場合には、既に報告されてい
る。これらのアッセイには、シバのFRAT（登録商標）ア
ッセイ、EMIT（登録商標）アッセイ、酵素チャンネリン
グイムノアッセイ、および、蛍光エネルギー転移イムノ
アッセイ（FETI）；酵素阻害因子イムノアッセイ（ホフ
マン・ラロッシュおよびアボット・ラボラトリーズ）；
蛍光分極化（fluorescence polarization）イムノアッ
セイ（ダンドリッカー）、その他がある。これらの方法
は全て、感度に限界があり、FETIおよび酵素チャンネリ
ングを含む２、３の方法のみが、大分子多エピトープ性
分析物に適している。
分離工程を必要とする不均一系イムノアッセイは、一
般に、小分子および大分子の双方に対して有用である。
酵素類（ELISA）、蛍光標識（FIA）、放射線標識（RI
A）、化学発光標識（CLA）等を含む、様々な標識が使用
されている。
蛍光化合物類および化学発光化合物類などの発光化合
物類は、その光放出能力のため、アッセイ分野において
広く応用されている。この理由から、発光物質は、核酸
アッセイおよびイムノアッセイのようなアッセイにおけ
る標識として利用されてきた。例えば、特異的結合対の
一員を発光物質とコンジュゲートとさせて、様々なプロ
トコールを採用する。発光物質コンジュゲートは、分析
物を含有する疑いのある試料中の分析物の量と相関し
て、固相および液相間に分配され得る。いずれかの相の
発光を測定することにより、観察される発光のレベルを
試料中の分析物の濃度に対して関係づけることができ
る。
ラテックス・ビーズおよびリポソームなどの粒子類
も、各アッセイに利用されている。例えば、均一系アッ
セイにおいて、酵素を、抗体または抗原で標識したリポ
ソームの水性相に封じ込めることができる。試料および
補体の存在下で、リポソームは、酵素を放出することに
なる。抗体または抗原標識化リポソームで、水性相内に
封入された水溶性蛍光または非蛍光染料、または脂質小
胞の脂質二重層に溶解した脂溶性染料を有するものは、
表面結合抗体または抗原との免疫化学反応に参入する能
力のある分析物をアッセイするのにも利用されている。
染料をリポソームの水性相から放出するために合成洗剤
が使用されている。粒子を蛍光染料で染色し、イムノア
ッセイにおける標識として使用する。非染色粒子も用い
られる（例えば、ラテックス凝集）。
関連技術 ヨーロッパ公開特許出願第0 345 776号（マックカプ
ラ）は、標識として感光剤を利用する特異的結合アッセ
イを開示している。感光剤は、１またはそれ以上の波長
の放射による励起、またはその他の化学的または物理的
刺激（例えば、電子転移、電気分解、エレクトロルミネ
センス、またはエネルギー転移）により刺激したとき
に、（ａ）一重項分子酸素を産生する分子酸素との相互
作用の際に、または（ｂ）分子酸素と相互作用して過酸
化水素が生じることによりその元の非励起状態に戻され
得る還元型を呈するロイコ染料との相互作用の際に、励
起状態に達する、あらゆる部位を含む。励起した感光剤
とのいずれかの相互作用は、試薬の添加により、検出可
能なシグナルを産生するものである。
ヨーロッパ公開特許出願第0 476 556号（モッゼンボ
ッカー）は、調整した光による光源物質（lumigenic su
bstance）−光感受性物質溶液の照射を採用して、光感
受性物質の濃度と相関して短波長光を産生する、光感受
性物質の測定法を開示している。
イムノアッセイの発光物質レベルは、マックカプラ
等、ジャーナル・オブ・バイオルミネセンス・アンド・
ケミルミネセンス（1989年）、４巻、51−58頁に記載さ
れている。
ヨーロッパ公開特許出願第0 515 194号（ウルマン
等）は、分析物を含有する疑いのある培地中の分析物を
測定する方法を開示している。かかる開示方法の一つ
は、分析物を含有する疑いのある培地を、分析物が存在
する場合に光増感剤と化学発光化合物を極めて近接せし
めるような条件下で、処理することを含んで成るもので
ある。光増感剤は、一重項酸素を産生し、それが極めて
近接している場合に該化学発光化合物を活性化する。そ
の結果、活性化された化学発光物質は、一重項酸素によ
る活性化の光を生じる。生じた光の量は、培地中の分析
物量と相関する。
この方法では、産生された各一重項酸素は、たった１
つの化学発光化合物としか反応できず、また、たった１
つの光子しか放射できない。従って、該方法の感度は、
化学発光化合物の化学ルミネセンス量子効果によって、
かつ、更に重要には、一重項酸素との反応の際に放出さ
れる限られた数の光子を検出する能力によって、制限さ
れる。
発明の概要 本発明は、分析物の測定法、分析物のアッセイを行う
ためのキット類、および該方法およびアッセイに有用な
化合物類に関する。
本発明の一態様は、特異的結合対（sbp）の一員であ
る分析物を測定する方法である。この態様の一実施態様
では、該方法は、分析物を含有する疑いのある媒体；そ
の励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感
剤、ただし該光増感剤は、sbp構成員に結合（associate
d）しているものである；および一重項酸素と反応する
と光活性インジケーターを形成する能力のある光活性イ
ンジケーター前駆体、ただし該光活性インジケーター前
駆体はsbp構成員に結合しているものである、の組み合
わせを提供する第１段階；次いで、光の照射により光増
感剤を励起させる第２段階；および、光活性インジケー
ターの蛍光を測定する最終段階、を含んで成る。sbp構
成員の少なくとも１つは、分析物または分析物と相補的
なsbp構成員に、直接的または間接的に結合する能力が
ある。測定された蛍光は、媒体中の分析物の量と相関す
る。
別の実施態様では、該方法は、分析物を含有する疑い
のある試料；その励起状態で一重項酸素を産生する能力
のある光増感剤を含む懸濁可能な第１粒子、ただし該粒
子は自身に結合した特異的結合対（sbp）構成員を有す
る；および一重項酸素と反応すると光活性インジケータ
ーを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体を
含む懸濁可能な第２粒子、ただし該粒子は自身に結合し
たsbp構成員を有する、を水性媒体中で組み合わせる第
１段階；媒体を照射して、光増感剤を励起させ、一重項
酸素を産生する第２段階；および光活性インジケーター
の蛍光を測定する最終段階、を含んで成る。各sbp構成
員は、分析物または分析物と相補的なsbp構成員に、直
接的または間接的に結合する能力がある。測定された蛍
光は、媒体中の分析物の量と相関する。
その他の実施態様では、該方法は、分析物を含有する
疑いのある媒体；その励起状態で一重項酸素を産生する
能力のある光増感剤、ただし該光増感剤はsbp構成員に
結合しているものである；および自身に結合したsbp構
成員を有する懸濁可能な粒子、ただし該懸濁可能な粒子
は一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成
する能力のある光活性インジケーター前駆体を含む、の
組み合わせを提供する第１段階；該組み合わせに光を照
射して光増感剤を励起させる第２段階；および、光活性
インジケーターの蛍光を測定する最終段階を含んで成
る。各sbp構成員は、分析物または分析物と相補的なsbp
構成員に、直接的または間接的に結合する能力がある。
測定された蛍光は、媒体中の分析物の量と相関する。
本発明の他の態様は、分析物の測定法である。該方法
は、分析物を含有する疑いのある媒体；その励起状態で
一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし該光
増感剤は第1sbp構成員に結合しているものである；およ
び一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成
する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし該
光活性インジケーター前駆体は第2sbp構成員に結合して
いるものである、の組み合わせを提供する第１段階；該
組み合わせに光を照射して光増感剤を励起させる第２段
階；および、光活性インジケーターの蛍光を測定する最
終段階、を含んで成る。各sbp構成員は、分析物または
分析物と相補的なsbp構成員に、直接的または間接的に
結合する能力がある。測定された蛍光は、媒体中の分析
物の量と相関する。
本発明のその他の態様は、ポリヌクレオチド分析物を
測定する方法である。該方法は、分析物;1またはそれ以
上のポリヌクレオチドプローブ（ただし、各プローブ
は、分析物のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド
配列を含み、かつ少なくとも１つのプローブは、該相補
的ヌクレオチド配列とは異なる特異的結合対（sbp）構
成員に結合していするものである）；その励起状態で一
重項酸素を産生する能力のある光増感剤（ただし、該光
増感剤は、該プローブのヌクレオチド配列に相補的な配
列を有するポリヌクレオチドに結合しているものであ
る）；および一重項酸素と反応すると光活性インジケー
ターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆
体、ただし該光活性インジケーター前駆体は該プローブ
に結合したsbp構成員と相補的なsbp構成員に結合するも
のである、を水性媒体中で組み合わせる第１段階；該媒
体に光を照射して光増感剤を励起させて一重項酸素を産
生させる第２段階；および、光活性インジケーターの蛍
光を測定する第３段階、を含んで成る。蛍光は、媒体中
の分析物の量と相関する。
分析物を測定する方法は、（Ａ）分析物がポリヌクレ
オチドである場合、（ａ）水性媒体中で、（１）該分析
物；（２）１またはそれ以上のポリヌクレオチドプロー
ブ、ただし各プローブは該分析物のヌクレオチド配列と
相補的なヌクレオチド配列を含有し、かつプローブの少
なくとも１つは、特異的結合対（sbp）構成員に結合し
ているか、または、自身に組み込まれているかまたは結
合している該sbp構成員を有する粒子に結合しているか
または組み込まれているものであり、該sbp構成員は、
該相補的ヌクレオチド配列とは異なるものである；
（３）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある
光増感剤、ただし、該光増感剤は、該プローブのヌクレ
オチド配列と相補的なヌクレオチド配列に結合している
か、または、自身に組み込まれているかまたは結合して
いる該該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレ
オチド配列を有する粒子に結合しているか、または組み
込まれているものであり；および（４）一重項酸素と反
応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光
活性インジケーター前駆体、ただし該光活性インジケー
ター前駆体は該プローブと結合している該sbp構成員と
相補的なsbp構成員に結合しているか、または、自身に
組み込まれているかまたは結合している該プローブと結
合している該sbp構成員と相補的なsbp構成員を有する粒
子に結合しているかまたは組み込まれているものであ
る、を組み合わせ、（ｂ）該媒体に光を照射し、該光増
感剤を励起させて一重項酸素を産生し；そして（ｃ）該
光活性インジケーターの蛍光を測定する；ここで該蛍光
は該媒体中の該分析物の量と相関するものである、を含
んで成るか； または（Ｂ）分析物がポリヌクレオチド以外である場
合、（ａ）（１）分析物を含有する疑いのある媒体；
（２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある
光増感剤、ただし該光増感剤は第１特異的結合対（sb
p）構成員に結合しているか、または、自身に組み込ま
れているかまたは結合している第１特異的結合対（sb
p）構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込
まれているものである；および（３）一重項酸素と反応
すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活
性インジケーター前駆体、ただし該光活性インジケータ
ー前駆体は第2sbp構成員に結合しているか、または、自
身に組み込まれているかまたは結合している第2sbp構成
員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれてい
るものである、の組み合わせを用意し、（ｂ）該組み合
わせに光を照射して、該光増感剤を励起させ；そして
（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定すること；
ここで、各sbp構成員は、該分析物または該分析物に相
補的なsbp構成員に、直接的または間接的に結合する能
力があり、かつ該蛍光は該媒体中の該分析物の量と相関
し、該光増感剤は所望により該第1sbp構成員が結合して
いる懸濁可能な粒子の一部であり、該光活性インジケー
ター前駆体は所望により該第2sbp構成員が結合している
懸濁可能な粒子の一部である、を含んで成る。
本発明の別の態様は、光活性インジケーター前駆体が
結合した平均直径20ないし4000ナノメーターの懸濁可能
な粒子を含んで成る組成物であり、該光活性インジケー
ター前駆体は、セレニウムまたはテルリウム原子を含有
するものである。
本発明のまた別の態様は、分析物のアッセイを行うた
めのキットである。該キットは、パッケージした組み合
わせ物中に、該光活性インジケーター前駆体を含む懸濁
可能粒子、ただし該光活性インジケーター前駆体はセレ
ニウムまたはテルリウム原子を含有し、かつ該粒子はそ
れに結合したsbp構成員を有する；およびsbp構成員と結
合している光増感剤、ただしこれはその励起状態におい
て酸素をその一重項状態に活性化する能力があり、sbp
構成員の少なくとも１つは、分析物にまたは分析物と相
補的なsbp構成員に結合する能力があるものである、を
含んで成る。
本態様の別の実施態様では、該キットは、パッケージ
した組み合わせ物中に、セレニウムまたはテルリウム原
子を含有する光活性インジケーター前駆体を含む懸濁可
能な第１粒子、ただしこの第１粒子はそれに結合したsb
p構成員を有する；および光増感剤を含む懸濁可能な第
２粒子、ただしこの第２粒子はそれに結合したsbp構成
員を有する、を含む組成物を含んで成る。このsbp構成
員の少なくとも１つは、分析物に、または分析物と相補
的なsbp構成員に結合する能力がある。
本態様の別の実施態様では、キットは、パッケージし
た組み合わせ物中に、セレニウムまたはテルリウム原子
を含有する光活性インジケーター前駆体、ただしこの光
活性インジケーター前駆体は第1sbp構成員と結合してい
るものである；および、その励起状態において酸素をそ
の一重項状態に活性化する能力があり、第2sbp構成員と
結合しているものである光増感剤を含んで成る。このsb
p構成員は、分析物に、または分析物と結合する能力の
あるsbp構成員に結合する能力がある。
本発明の別の態様は、sbp構成員である分析物の結合
アッセイである。このアッセイは、分析物を含有する疑
いのある媒体を、分析物にまたは分析物と相補的なsbp
構成員に、直接的または間接的に結合する能力のあるsb
p構成員と組み合わせる第１段階；分析物または相補的s
bp構成員に対するsbp構成員の結合を検出する第２段
階、ただしこの検出は媒体中の光活性インジケーター前
駆体を一重項酸素にさらして光活性インジケーターを生
成させることを含む；および光活性インジケーターの蛍
光を測定する最終段階、を含んで成る。
本発明の他の態様は、下記の構造： 式中、Ｈは、XR基に対してシスであり;Xは、セレニウム
またはテルリウムであり;Rは、不飽和炭素原子、シリコ
ン原子、またはスズ原子によりＸに結合している有機ま
たは有機金属基であり；そして、Ａは、炭素−炭素基と
一緒になるとき（所望により、１またはそれ以上の芳香
環と縮合した）脂環式環、または複素環を形成し；一重
項酸素を有する化合物と反応すると、ＨおよびXR基が、
炭素−炭素二重結合に換わって、その最大吸収で少なく
とも10,000M-1cm-1の消光係数、および少なくとも0.1の
蛍光放出量子収率を有する蛍光分子が得られる、を含
む、光活性インジケーター前駆体として有用な化合物類
である。
本発明の他の態様は、光活性インジケーター分子の調
製法である。この方法は、本発明の化合物（上記のとお
り）を一重項酸素と反応させて、その最大吸収で少なく
とも10,000M-1cm-1の消光係数、および少なくとも0.1の
蛍光放出量子収率を有する光活性インジケーターを得る
ことを含んで成る。
本発明の利点の１つは、蛍光光活性インジケーター
（光活性インジケーター前駆体と一重項酸素との反応か
ら生じる）が、ヨーロッパ公開特許出願第0 515 194号
に記載された方法に使用された化学発光化合物の少なく
とも105倍多くの光子を産生できることである。これ
は、たいてい単一蛍光光活性インジケーター分子を、そ
れが崩壊する前に、105倍まで励起させることができる
からである。従って、本発明において形成される蛍光光
活性インジケーター分子は、照射により１万の光子を生
成できる。それ故に、この蛍光の検出によって、より高
感度のアッセイを提供できる。更に、本発明における光
活性インジケーター分子の蛍光の測定では、標準蛍光計
の使用が可能であり、一方、前記したアッセイにおける
化学発光化合物の活性化により生じる化学発光の検出
は、より専門的な分光計を必要とする。
図面の簡単な説明 図１は、DNA検出アッセイ結果のグラフ表示である。
各アッセイの結果は、異なる記号で表している。
発明の詳細な説明 定義 本明細書および添付の請求の範囲に使用する下記用語
は、特記しない限り、指示した意味を有する： “アルキル”とは、脂環式炭化水素から水素原子１つ
を除去することにより生じる一価分枝状、または非分枝
状基を意味し；低級アルキルおよび高級アルキルの両方
を含む。
“低級アルキル”とは、１ないし５の炭素原子を含有
するアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペ
ンチル、および同種物を意味する。
“高級アルキル”とは、６以上の炭素原子、通常、６
ないし20の炭素原子を含有するアルキル基、例えば、ヘ
キシル、ヘプチル、オクチル、および同種物を意味す
る。
“アルキリデン”とは、アルキル基の２つの水素原子
を同一の炭素原子から取ることによって生じる二価有機
基、例えば、エチリデン、および同種物を意味する。
“アルキレン”とは、アルキル基の２つの水素原子を
異なる炭素原子から取ることによって生じる二価有機基
を意味する。
“脂環式環”とは、不飽和であってもよく、部分的に
飽和していてもよい、炭素長５ないし７の環状炭化水素
基を意味する。
“アリール”とは、芳香族炭化水素から１原子を除く
ことにより生じ、１またはそれ以上の芳香環、通常は、
１ないし４の芳香環を含有する有機基、例えば、フェニ
ル（ベンゼン由来）、ナフチル（ナフタレン由来）、お
よび同種物を意味する。
“アラルキル”とは、アリール基が結合したアルキル
基を有する有機基、例えば、ベンジル、フェネチル、３
−フェニルプロピル、１−ナフチルエチル、および同種
物を意味する。
“アルコキシ”とは、式−ORaで、Raがアルキル基で
ある基、例えば、メトキシ、エトキシ、および同種物を
意味する。
“アリールオキシ”とは、式−ORbで、Rbがアリール
基である基、例えば、フェノキシ、ナフトキシ、および
同種物を意味する。
“アラルコキシ”とは、式−ORcで、Rcがアラルキル
基である基、例えば、ベンジルオキシ、１−ナフチルエ
トキシ、および同種物を意味する。
“アルキルチオ”とは、式−SRaで、Raがアルキル基
である基、例えば、メチルチオ、エチルチオ、および同
種物を意味する。
“アリールチオ”とは、式−SRbで、Rbがアリール基
である基、例えば、フェニルチオ、ナフチルチオ、およ
び同種物を意味する。
“複素環”とは、炭素原子、および窒素、酸素、およ
び硫黄から成る群から選択される１から３のヘテロ原子
からなり、飽和か不飽和かのいずれかであり、その中
で、窒素、炭素、または硫黄原子は、所望により酸化さ
れていてもよく、かつ、窒素原子は、所望により４級化
されていてもよい、安定な単環、二環、または三環式環
系を意味し、上記定義の複素環系のどれもがベンゼン環
と縮合しているようなあらゆる環系を含む。複素環系
は、任意のヘテロ原子、または炭素原子で置換されてい
てもよく、その結果、安定な構造を生じる。このような
複素環系の例には、ピペリジン、ピペラジン、２−オキ
ソピペラジン、２−オキソピペリジン、２−オキソピロ
リジン、２−オキソアゼピン、アゼピン、ピロール、４
−ピペリドン、ピロリジン、ピラゾール、ピラゾリジ
ン、イミダゾール、イソダゾリン、イミダゾリジン、ピ
リジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、オキサゾ
ール、オキサゾリジン、インダン、イソキサゾール、イ
ソキサゾリジン、モルホリン、チアゾール、チアゾリジ
ン、イソチアゾール、キヌクリジン、イソチアゾリジ
ン、インドール、イソインゾール、インドリン、イソイ
ンドリン、オクタヒドロインドール、オキタヒドロイソ
インドール、キノリン、イソキノリン、デカヒドロイソ
キノリン、ベンズイミダゾール、チアジアゾール、ジヒ
ドロベンゾフラン、ベンゾフラン、ベンゾピラン、1,4
−ベンゾピロン、1,2−ベンゾピロン、ベンゾチアゾー
ル、ベンゾキサゾール、フラン、テトラヒドロフラン、
ピラン、テトラヒドロピラン、チオフェン、ベンゾチオ
フェン、チアモルホリン、チアモルホリンスルホキシ
ド、チアモルホリンスルホン、およびオキサジアゾール
があるが、これらに限定されるわけではない。本発明の
目的に好ましい複素環は、ベンゾピロン類である。
“置換された”とは、分子の水素原子が、ハロゲン等
のような単一原子であり得る他の原子、または、有機基
などの原子群の一部で置き換わった状況を意味する。
“電子供与基”とは、分子に結合したとき、電子供与
基が電子貧弱になって、分子のその他の部分と比べて正
に荷電するように分子を分極化する能力がある、即ち、
電子密度を低減する置換基を意味する。かかる基は、例
示説明であって限定ではないが、アミン類、エーテル
類、チオエーテル類、ホスフィン類、ヒドロキシ、オキ
シアニオン類、メルカプタン類、およびそれらのアニオ
ン類、スルフィド類等であり得る。
“有機基”とは、基内の原子の原子価を満たすのに必
要な必須数の水素原子以外の１ないし50の原子を有する
置換基を意味する。一般に、かかる基における主要原子
は、炭素（Ｃ）であるが、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫
黄（Ｓ）、リン（Ｐ）であっても良く、存在するなら
ば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＰは、炭素と、またはお互いの
１またはそれ以上と、または水素と、または金属原子と
結合して、様々な官能基、例えば、カルボン酸類、アル
コール類、チオール類、カルボキサミド類、カルバメー
ト類、カルボン酸エステル類、スルホン酸類、スルホン
酸エステル類、リン酸、リン酸エステル類、尿素類、カ
ルバメート類、ホスホルアミド類、スルホンアミド類、
エーテル類、スルファイド類、チオエーテル類、オレフ
ィン類、アセチレン類、アミン類、ケトン類、アルデヒ
ド類、ニトリル類、および同等物を形成することができ
る。このような有機基の例には、アルキル、アルキリジ
ン、アリール、アラルキル、およびヘテロサイクリルが
あり、ここで、アルキル、アルキリジン、アリール、ア
ラルキル、またはヘテロサイクリル基は、上記官能基の
１またはそれ以上で置換されていてもよいが、これらは
例示であって限定ではない。
“有機金属基”とは、金属原子と連結した（上記定義
の）有機基を含有する基を意味する。
“分析物”とは、検出すべき化合物または組成物を意
味する。分析物は、特異的結合対（sbp）の一員を含ん
で成ることができ、リガンドであっても良く、一価（モ
ノエピトープ性）または多価（多エピトープ性）であ
り、普通は、抗原性またはハプテン性であり、共通のエ
ピトープ部位または決定因子部位の少なくとも１つを共
有する単一化合物または複数の化合物である。分析物
は、バクテリアなどの細胞、またはＡ、Ｂ、Ｏ等のよう
な血液型抗原、またはHLA抗原を持つ細胞、または微生
物、例えば、バクテリア類、真菌類、原生動物類、また
はウイルスなどの細胞の一部であることができる。
多価リガンド分析物は、通常、ポリ（アミノ酸）、即
ち、ポリペプチド類およびタンパク質類、ポリサッカラ
イド類、核酸類およびそれらの組み合わせである。この
ような組み合わせは、バクテリアの成分類、ウイルス
類、染色体類、遺伝子類、ミトコンドリア、核、細胞
膜、および同等物を含む。
ほとんどの場合、当該発明を適用できる多エピトープ
性リガンド分析物は、少なくとも約5,000、より普通に
は、少なくとも約10,000の分子量を有する。ポリ（アミ
ノ酸）の範疇では、対象となるポリ（アミノ酸）は、一
般に、分子量約5,000から5,000,000、より普通には、分
子量約20,000から1,000,000である；対象となるホルモ
ン類の間では、分子量は、普通、約5,000から60,000の
範囲である。
類似の構造的特徴を有するタンパク質類、特定の生物
学的機能を有するタンパク質類、特定の微生物、特に疾
病を生ぜしめる微生物に関するタンパク質類、等のファ
ミリーについて、タンパク質の多様さを考慮することが
できる。このようなタンパク質には、例えば、免疫グロ
ブリン類、サイトカイン類、酵素類、ホルモン類、癌抗
原、栄養学的マーカー類（nutritional markers）、組
織特異的抗原等がある。
本発明において対象となる、タンパク質類、血液凝固
因子、タンパク質系ホルモン類、抗原性ポリサッカライ
ド類、微生物類、および他の病原体の種類は、米国特許
第4,650,770号に詳細に開示されており、これらの開示
は、その全体を本明細書に参照して組み込んである。
モノエピトープ性リガンド分析物類は、一般に、分子
量約100から2,000であり、より普通には、分子量125か
ら1,000である。
分析物には、薬剤類、代謝物類、農薬、汚染物質、お
よび同等物がある。対象となる薬剤類の中には、アルカ
ノイド類が含まれる。アルカノイド類の中には、モルヒ
ネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメトルファン、そ
れらの誘導体および代謝物類を含むモルヒネアルカロイ
ド類；コカイン、およびベンジルエクゴニン、それらの
誘導体類および代謝物類を含むコカインアルカロイド
類；リセルグ酸のジエチルアミドを含む麦角アルカロイ
ド類；ステロイドアルカロイド類；イミナゾイルアルカ
ロイド類；キナゾリンアルカロイド類；イソキノリンア
ルカロイド類；キニンおよびキニジン、それらの誘導体
および代謝物を含むキノリンアルカロイド類がある。
薬剤類の次のグループは、エストロゲン類、アンドロ
ゲン類、副腎皮質ステロイド類、胆汁酸類、ジゴキシン
およびジゴキシゲニンを含む強心性グリコシド類および
アグリコン類、サポニン類およびサポゲニン類、それら
の誘導体、および代謝物を含むステロイド類を含む。ま
た、ジエチルスチルベストロールなどのステロイド疑似
物質も含む。
薬剤類の次のグループは、５から６の環員を有するラ
クタム類であり、バルビチュレート類、例えば、フェノ
バルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダ
ントイン、プリミドン、エトスクシイミド、およびそれ
らの代謝物を含む。
薬剤類の次のグループは、炭素原子２から３のアルキ
ルを伴うアミノアルキルベンゼン類であり、アンフェタ
ミン類；エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリンを含
むカテコールアミン類；ナルセイン；パパベリン；およ
びこれらの代謝物を含む。
薬剤類の次のグループは、オキサゼパン、クロルプロ
マジン、テグレトール、それらの誘導体および代謝物を
含むベンズ複素環類であり、該複素環は、アゼピン類、
ジアゼピン類、およびフェノチアジン類である。
薬剤類の次のグループは、プリン類であり、テオフィ
リン、カフェイン、それらの代謝物類および誘導体類を
含む。
薬剤類の次のグループは、マリジュアナから誘導され
るものを含み、カンナビノールおよびテトラヒドロカン
ナビノールを含む。
薬剤類の次のグループは、チロキシン、コルチゾー
ル、トリヨードチロニン、テストステロン、エストラジ
オール、エストロン、プロゲステロンなどのホルモン
類、アンギオテンシン、LHRHなどのポリペプチド類、お
よびシクロスポリン、FK506、ミコフェノール酸、その
他などの免疫抑制物質である。
薬剤類の次のグループは、ビタミン類、例えば、Ａ、
Ｂ（例えば、B12）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＫ、葉酸、チ
アミンを含む。
薬剤類の次のグループは、プロスタグランジン類であ
るが、水酸化および不飽和の程度および部位によって異
なる。
薬剤類の次のグループは、トリ環状抗鬱薬類であり、
イミプラミン、ジスメチルイミプラミン、アミトリプチ
リン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリイミ
プラミン、クロミプラミン、ドキセピン、およびデスメ
チルドキセピンを含む。
薬剤類の次のグループは、抗腫瘍薬であり、メトトレ
キセートを含む。
薬剤類の次のグループは、抗生物質であり、ペニシリ
ン、クロロマイセチン、テトラサイクリン、テトラマイ
シン、代謝物類および誘導体類を含む。
薬剤類の次のグループは、ヌクレオシド類およびヌク
レオチド類であり、適切な糖の付いたATP、NAD、FMN、
アデノシン、グアノシン、チミジン、およびシチジンお
よびそれらのリン酸置換体を含む。
薬剤類の次のグループは、メタドン、メプロバメー
ト、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロン
酸（valproic acid）、ブチロフェノン類、抗ヒスタミ
ン類、クロラムフェニコール、アトロピンなどの抗コリ
ン作用薬、それらの代謝物類および誘導体類を含む多方
面にわたる個々の薬剤類である。
疾患状態に関連した代謝物は、スペルミン、ガラクト
ース、フェニルピルビン酸、および１型ポルフィリンを
含む。
薬剤類の次のグループは、ゲンタマイシン、カナマイ
シン、トブラマイシン、およびアミカシンなどのアミノ
グルコシド類である。
対象となる農薬類の中には、ポリハロゲン化ビフェニ
ル類、リン酸エステル類、チオホスフェート類、カルバ
メート類、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それら
の代謝物類および誘導体類がある。
受容体分析物の場合、分子量は、一般に、10,000から
２×108、より普通には、10,000から106の範囲である。
免疫グロブリン類、IgA、IgG、IgE、およびIgMの場合、
分子量は、一般に、約160,000から約106で変わる。酵素
類は、通常、分子量約10,000から1,000,000の範囲であ
る。天然の受容体は、広範囲に変わるが、一般に、少な
くとも分子量約25,000であり、106、またはそれ以上の
分子量であることもあり、アビジン、ストレプトアビジ
ン、DNA、RNA、チロキシン結合グロブリン、チロキシン
結合プリアルブミン、トランスコルチン、等などの物質
類を含む。
分析物の用語は、更に、下記に定義するポリヌクレオ
チド類のようなポリヌクレオチド分析物を含む。これら
は、ｍ−RNA、ｒ−RNA、ｔ−RNA、DNA、DNA−RNA二本鎖
分子等を含む。また、分析物の用語は、例えば、制限酵
素類、アクチベーター類、レプレッサー類、ヌクレアー
ゼ類、ポリメラーゼ類、ヒストン類、修復酵素類、化学
療法薬、および同種物などのポリヌクレオチド結合成分
類である受容体を含む。
分析物は、宿主由来の体液のような試料中に直接見い
出された分子であり得る。この試料は、直接調べること
ができ、分析物をより容易に検出可能にするために前処
理することもできる。更に、対象となる分析物は、対象
となる分析物に相補的な特異的結合対構成員などの、対
象となる分析物の存在証拠となる成分を検出することに
より、測定でき、これらの存在は、対象となる分析物が
試料中に存在する場合のみ、検出される。従って、分析
物の存在証拠となる成分が、アッセイにおいて検出され
る分析物となるのである。体液は、例えば、尿、血液、
血漿、血清、唾液、精液、糞、たん、脳脊髄液、涙、粘
液、および同等物であることができる。
“特異的結合対（sbp）構成員”とは、他の分子の特
定の空間的および極性の構成と特異的に結合し、それに
よって、他の分子の特定の空間的および極性の構成と相
補的なものとして定義される領域を表面上または腔内に
有する、１または２つの異なる分子を意味する。特異的
結合対の一員は、リガンドおよび受容体（アンチリガン
ド）として表す。これらは、普通、抗原−抗体などの免
疫学的ペアの一員であり、一方、ビオチン−アビジン、
ホルモン類−ホルモン受容体類、核酸二本鎖分子、IgG
−プロテインＡ、DNA−DNA、DNA−RNAなどのポリヌクレ
オチド対、および同等物などの他の特異的結合対は、免
疫学的ペアではないが、本発明、およびsbp構成員の定
義に含まれる。
“ポリヌクレオチド”とは、天然状態で、約６ないし
500,000またはそれ以上のヌクレオチドを有し、かつ単
離状態で、約６ないし50,000またはそれ以上のヌクレオ
チド、普通は、約６ないし20,000ヌクレオチド、より頻
繁には、６ないし10,000ヌクレオチドを有する、ポリマ
ーヌクレオチドである化合物または組成物を意味する。
“ポリヌクレオチド”の用語は、天然に生じる、または
合成的に生成される、任意の供給源由来の、精製または
非精製形態の、DNA（dsDNAおよびssDNA）およびRNA、普
通はDNAを含む、オリゴヌクレオチド類および核酸類も
含み、ｔ−RNA、ｍ−RNA、ｒ−RNA、ミトコンドリアDNA
およびRNA、クロロプラストDNAおよびRNA、DNA−RNAハ
イブリッド類、またはそれらの混合物、遺伝子、染色
体、プラスミド類、微生物類、例えば、バクテリア、酵
母類、ウイルス類、ウイロイド類、糸状菌、真菌、植
物、動物、ヒトなどの生物学的物質のゲノム、それらの
フラグメント類および同等物であり得る。
“ポリヌクレオチドプローブ”とは、標的ポリヌクレ
オチド分析物の塩基配列と相補的な塩基配列を有する一
本鎖核酸分子を意味する。プローブ類は、一般に、化学
的に合成された長さ６から200塩基対のDNAまたはRNAポ
リヌクレオチド類から成り、標的ポリヌクレオチド分析
物と安定なハイブリダイゼーション複合体を形成できな
ければならない。
“リガンド”とは、受容体が天然に存在するか、また
は調製できる、あらゆる有機化合物を意味する。また、
リガンドの用語は、修飾リガンド類であるリガンド類似
体を含み、普通は分子量100以上の、普通は有機基、ま
たは分析物類似体であるリガンド類似体であり、受容体
に対する類似リガンドと拮抗でき、該修飾により、リガ
ンド類似体を他の分子に結合させる手段を提供するもの
である。リガンド類似体は、必要ではないが、より多く
の水素が、リガンド類似体をハブまたは標識に連結させ
る結合で置換されている点で、普通、リガンドとは異な
る。リガンド類似体は、リガンドに対するのと同様の方
法で受容体に結合できる。類似体は、例えば、リガンド
に対する抗体のイディオタイプを指向する抗体であって
もよい。
“受容体”または“アンチリガンド”とは、分子の特
定の空間的および極性の構成、例えば、エピトープ性部
位または決定因子部位を認識する能力のあるあらゆる化
合物または組成物を意味する。例示的な受容体類には、
天然に生じる受容体類、例えば、チロキシン結合グロブ
リン、抗体類、酵素類、Fabフラグメント類、レクチン
類、核酸類、アビジン類、プロテインＡ、バースター
（barstar）、補体成分Clq、および同等物がある。アビ
ジンは、卵白アビジンおよび他の供給源由来のビオチン
結合タンパク質類、例えば、ストレプトアビジンを含む
ことを意図する。
“特異的結合”とは、２つの異なる分子のうちの１つ
が、もう一方の分子に対し、その他の分子類の場合の実
質的に低い認識と比べて、特異的に認識することを意味
する。一般に、この分子は、その表面上、または腔内
に、２つの分子間の特異的認識を生ぜしめる領域を有す
る。特異的結合の例は、抗体−抗原相互作用、酵素−基
質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用、およびその他
である。
“非特異的結合”とは、特異的表面構造から比較的独
立している分子間の非共有結合を意味する。非特異的結
合は、分子間の疎水相互作用を含む幾つかの要因から生
じ得る。
“抗体”とは、もう一方の分子の特定の空間的および
極性の構成に特異的に結合し、それによって、もう一方
の分子の特定の空間的および極性の構成と相補的である
と定義される免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノ
クローナルまたはポリクローナルであることができ、当
業者にはよく知られた技術、例えば、宿主の免疫感作、
および血清（ポリクローナル）の収集により、または連
続的ハイブリッド細胞ラインを調製し、分泌タンパク質
（モノクローナル）を調製することにより、または、ク
ローニングして、天然抗体の特異的結合に必要なアミノ
酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列または
その変異バージョンを発現させることにより、調製でき
る。抗体類は、完全な免疫グロブリンまたはそれらのフ
ラグメントを含み、免疫グロブリン類には、様々な分類
およびアイソタイプがあり、例えば、IgA、IgD、IgE、E
gG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、等である。それらのフ
ラグメント類は、Fab、FvおよびＦ（ab'）２、Fab'、お
よび同等物を含むと考えられる。加えて、免疫グロブリ
ン類またはそれらのフラグメントの凝集体類、ポリマー
類、およびコンジュゲート類は、特定分子の結合親和性
を維持するのに十分適切な場合に、使用することができ
る。
“連結基”とは、分子間の共有結合を意味する。連結
基は、分子、例えば、光増感剤、光活性インジケーター
前駆体、sbp構成員、または連結されている粒子または
粒子の一部と結合した分子、の性質に依存して変わる。
光増感剤または光活性インジケーター前駆体に普通に存
在するか、または導入される官能基類は、これらの分子
をsbp構成員に、またはリポソームまたは油滴の脂肪親
和性成分、ラテックス粒子、シリコン粒子、金属ゾル、
または染料クリスタライトなどの粒子に連結させるため
に採用されるものである。
ほとんどの場合、カルボニル官能性が連結基として有
用であり、例えば、オキソカルボニル基、例えば、アル
ドヒド類、アセチルおよびカルボキシ基、および非オキ
ソカルボニル基（窒素および硫黄類似体を含む）、例え
ば、アミジン、アミデート、チオカルボキシ、およびチ
オノカルボキシである。オキソ以外の別の官能性もま
た、連結基として有用であり、例えば、ハロゲン、ジア
ゾ、メルカプト、オレフィン（特に、活性化オレフィ
ン）、アミノ、ホスホロ、および同種物である。連結基
の詳しい説明は、米国特許第3,817,837号に見ることが
でき、この開示は、本明細書に参照して組み込んであ
る。
連結基は、結合であってもよいし、１から100原子の
鎖、普通は、約１ないし70原子の鎖、好ましくは１ない
し50原子の鎖、より好ましくは１ないし20原子の鎖であ
ってもよく、それぞれ独立して、通常は、炭素、酸素、
硫黄、窒素、およびリンからなる群から選択される。連
結基におけるヘテロ原子の数は、通常、約０から20の範
囲であり、普通は、約１から15、より好ましくは２ない
し６の範囲である。鎖中の原子は、有機基のところで記
載したのと同様の方法により水素以外の原子で置換する
ことができる。一般則として、特定の連結基の長さは任
意に選択することができ、合成の好便さを提供し、結合
sbp構成員の相互干渉を最少化し、蛍光エネルギーアク
セプターなどの所望の基、重金属などの項間交差の触
媒、および同種物の組み込みを可能にすることができ
る。連結基は、脂肪族、または芳香族であり、ジアゾ基
を伴う場合でも、芳香族基は、通常含まれる。
ヘテロ原子が存在するとき、酸素は、通常、炭素、硫
黄、窒素、またはリンと結合したオキソまたはオキシと
して存在し；窒素は、通常、炭素、酸素、硫黄、または
リンと結合したニトロ、ニトロソ、またはアミノとして
存在し；硫黄は、酸素に倣うものであるが；リンは、炭
素、硫黄、酸素、または窒素に結合しており、通常、ホ
スホン酸およびリン酸モノまたはジエステルとして存在
している。
連結基とコンジュゲートされた分子との間の共有結合
形成における共通の官能性は、アルキルアミン、アミジ
ン、チオアミド、エーテル、尿素、チオウレア、グアニ
ジン、アゾ、チオエーテル、およびカルボキシレート、
スルホネート、およびリン酸エステル類、アミド類およ
びチオエステル類である。
たいていは、本発明の光増感剤および光活性インジケ
ーター前駆体が、粒子、表面、sbp構成員と連結してい
る場合、それらは、非オキソカルボニル基（窒素および
硫黄類似体を含む）、ホスフェート基、アミノ基、アル
キル化剤（例えば、ハロまたはトシルアルキルなど）、
エーテル基（ヒドロキシを含む）、チオエーテル基（メ
ルカプトを含む）、オキソカルボニル基（例えば、アル
デヒドまたはケトン）、または活性オレフィン、例え
ば、ビニルスルホン、またはα，β−不飽和エステルま
たはアミドを有する。これらの官能性は、アミン基、カ
ルボキシル基、活性オレフィン、またはアルキル化剤、
例えば、ブロモアセチルなどの官能性を有する粒子、表
面、またはsbp構成員に連結するものである。アミノお
よびカルボン酸、またはその窒素誘導体、またはリン酸
を連結させると、アミド類、アミジン類、およびホスホ
ルアミド類が形成される。メルカプタンおよび活性化オ
レフィンを連結させると、チオエーテル類が形成され
る。メルカプタンとアルキル化剤を連結させると、チオ
エーテル類が形成される。アルデヒドおよびアミンを還
元条件下で連結させると、アルキルアミンが形成され
る。カルボン酸またはリン酸、およびアルコールを連結
させると、エステルが形成される。
“親水性または水溶解度を分与する基または官能性”
とは、親水性官能性を意味し、水による固体の湿潤度、
および結合する化合物の水への溶解度を増大するもので
ある。このような官能基または官能性は、有機基である
ことができ、スルホネート、スルフェート、ホスフェー
ト、アミジン、ホスホネート、カルボキシレート、ヒド
ロキシル、特にポリオール類、アミン、エーテル、アミ
ド、および同等物であり得る。官能基の例は、カルボキ
シアルキル、スルホノキシアルキル、CONHOCH2COOH、CO
−（グリコサミン）、糖類、デキストラン、シクロデキ
ストリン、SO2NHCH2COOH、SO3H、CONHCH2CH2SO3H、PO3H
2、OPO3H2、ヒドロキシル、カルボキシル、ケトン、お
よびそれらの組み合わせである。上記官能性の殆どは、
光増感剤または光活性インジケーター前駆体のsbp構成
員または支持体への付着を可能にする付着基としても利
用できる。
“親油性または脂質溶解度を分与する基または官能
性”とは、親油性官能性を意味し、水による表面の湿潤
度、および結合する化合物の水への溶解度を低減するも
のである。このような官能基または官能性は、１ないし
50またはそれ以上の原子、普通は、水素またはハロゲン
で置換された炭素原子、を含有でき、アルキル、アルキ
リデン、アリール、およびアラルキルであることができ
る。親油性基または官能性は、通常、１ないし６の直鎖
状または分枝状の、少なくとも炭素原子６、さらに普通
には、少なくとも炭素原子10、さらに、好ましくは少な
くとも炭素原子12で、普通は炭素原子30を越えない、脂
肪族基を有するものである。脂肪族基は、脂環式、複素
環式、または芳香環式であり得る５員環ないし６員環に
結合している場合もある。
“光増感剤”とは、本発明の場合、準安定状態、普通
は三重項状態、に励起され得る分子を意味し、分子酸素
が近くにある場合に、直接または間接的にそのエネルギ
ーを、酸素に転移でき、同時に、しばしば一重項酸素ま
たは1O2（１△ｇ）として表される酸素の高反応性励起
状態まで酸素を励起させることができるものである。光
増感剤は、普通、光の吸収により、または適切な励起状
態の供与体からのエネルギー転移により、励起される
が、化学励起、電子化学活性化、または他の手段によっ
ても励起され得る。光増感剤の励起は、普通、外部供給
源からの光の照射によって引き起こされるものである。
本発明の光増感剤は、普通、250ないし1100nm、好まし
くは300ないし1000nm、より好ましくは450ないし950nm
の範囲の波長で吸収極大を有し、その吸収極大で、500M
-1cm-1以上、好ましくは少なくとも5000M-1cm-1、より
好ましくは少なくとも50,000M-1cm-1の消光係数を伴
う。光増感剤による光の吸収の後に生じる励起状態、普
通は三重項状態、の寿命は、普通、酸素不在下で少なく
とも100nsec、好ましくは少なくとも１μsecである。一
般に、寿命は、酸素へエネルギーを転移させるのに十分
に長くなければならず、普通は、10-5ないし10-3M（媒
体によって変わる）の範囲の濃度で存在するものであ
る。光増感剤の励起状態は、普通、その基底状態とは異
なるスピン量子数（Ｓ）を有するものであり、普通は、
通常の場合のように基底状態が一重項（Ｓ＝０）である
とき、三重項（Ｓ＝１）状態である。好ましくは、光増
感剤は、高い項間交差収率を持つ。即ち、光増感剤の励
起は、少なくとも10％、望ましくは少なくとも40％、好
ましくは80％以上の効率で長い生存状態（普通は三重
項）を生じる（量子収率は、普通0.5以下、好ましくは
0.1以下）。
本発明の光増感剤は、比較的光安定性であり、産生さ
れた一重項分子酸素と効率良く反応しない。最も有用な
光増感剤には、幾つかの構造的特徴が存在する。多くの
光増感剤は、堅く固定された、少なくとも１つ、頻繁に
は、３つまたはそれ以上のコンジュゲート化二重結合ま
たは三重結合、多くは芳香性構造、を有する。それら
は、項間交差を加速する少なくとも１つの基、例えば、
カルボニルまたはイミン基、または周期表の３列から６
列から選択される重原子、特に、ヨウ素または臭素、を
含有することが多いか、またはそれらは、多芳香性構造
を有することが多い。典型的な光増感剤には、アセト
ン、ベンゾフェノン、および９−チオキサントンなどの
ケトン類；エオシンおよびローズベンガルなどのキサン
テン類；ブクミンステルフレレンおよび9,10−ジブロモ
アンスラセンなどの多芳香族化合物類；ヘマトポルフィ
リンおよびクロロフィルなどの金属ポリフィリン類を含
むポリフィリン類；オキサジン類；シアニン類；スクア
レート染料類；フタロシアニン類；メロシアニン類；メ
チレンブルー等などのチアジン類、およびこれらの化合
物の項間交差を高め、それらの化合物をより親油性また
はより親水性にさせるために、および／または、例え
ば、sbp構成員に付着させるための付着基として、有機
基により置換された、それらの化合物の誘導体類があ
る。本発明において利用され得るその他の光増感剤の例
は、上記特性を有するもの、およびN.J.ツロ、“モレキ
ュラー・フォトケミストリー”、132頁、W.A.ベンジャ
ミン社、ニューヨーク、1965年に列挙されているもので
ある。
本発明の光増感剤は、光増感剤を、油滴、リポソー
ム、ラテックス粒子、および同等物などの懸濁可能な粒
子に組み込む場合に、親油性成分への溶解を確実にする
ため、好ましくは、相対的に非極性である。
“光活性インジケーター前駆体”とは、一重項酸素と
反応して、光活性インジケーターを形成する、または結
果的に光活性インジケーターに変換される補助化合物と
反応できる化合物を形成するような分子を意味する。光
活性インジケーター化合物を導く化合物類を与え得る一
重項酸素の反応には、数種の型がある。採用する反応の
型、および望まれる光活性インジケーターの選択は、本
発明で採用される光活性インジケーター前駆体および補
助化合物類の構造に対する指針を提供するものである。
光活性インジケーター前駆体は、好ましくは、非常に
迅速、普通は、少なくとも104ないし106sec-1、好まし
くは、少なくとも106ないし108sec-1、より好ましく
は、＞108sec-1である一重項酸素との反応を受けるもの
である。反応の初期生成物は、反応することにより光活
性前駆体を与える中間体であり、この中間体は、好まし
くは、一重項酸素を形成してから、光にさらすことによ
って光活性インジケーターから放出される蛍光を検出す
る間の所望の時間に比べて短い寿命を有するものであ
る。一重項酸素産生と蛍光検出を同時に行うためには、
寿命は、普通、10-3ないし10秒、好ましくは10-3秒であ
る。一重項酸素の産生と蛍光検出が連続している場合、
寿命は、10-3秒から30分またはそれ以上、好ましくは＜
１秒ないし60秒で変わり得る。
一重項酸素の高速度の反応は、一重項酸素反応性基
を、電子豊富な光活性インジケーター前駆体中に提供す
ることにより、達成される。これらの基は、普通、オレ
フィンまたはアセチレン、ヒドラジンおよびヒドロキシ
ルアミン誘導体類、セレナイド類およびテルライド類で
あるが、これらの基に限定されるわけではない。例え
ば、テルライド類は、迅速に一重項酸素と反応して、オ
レフィンを生成することから、特に有用であることが見
い出されている。反応速度は、テルリウムの電子利用可
能性（酸化電位）に依存している。例えば、アリール環
上の電子供与基をテルリウム原子上に置換すると、速度
を増大できる。テルリウムをセレニウム（次により低い
カルコゲニド）に変えると、速度は減少するが、分子の
酸化安定性は増大する。
光活性インジケーター前駆体が、ヒドラジンまたはヒ
ドラジドを含有するとき、一重項酸素との反応により、
二重結合を生成できる。例えば、一重項酸素は、下記反
応に例示するように、ヒドラジド類を直接、蛍光光活性
インジケーター類に変換できる： ヒドラジンの酸化電位は、高速反応を提供するのに重
要な要因である。アシル基（例えば、ヒドラジドにおけ
るように）などの電子求引基類は、反応を遅くするにも
かかわらず、本発明においては、光活性インジケーター
前駆体としてアシルヒドラジド類およびジアシルヒドラ
ジド類を依然使用できる。反応が十分に迅速である場合
は、しばしば、反応を塩基の存在下で加速させることが
できる。例えば、３−アミノフタロイルヒドラジドは、
強塩基の存在下で、電子豊富であり、かつ一重項酸素と
迅速に反応して光活性インジケーターとしての３−アミ
ノフタレートを形成できるアニオンを形成する。しかし
ながら、ヒドロキシルイオンは、懸濁可能な粒子が疎水
性マトリックス内に光活性インジケーター前駆体を含有
する場合、塩基として使用できない。その代わり、アガ
ロースなどの親水性粒子類を使用して、ヒドロキシルイ
オンへのアクセスを可能にすることができる。普通、粒
子が親水性であるとき、光活性インジケーター前駆体
は、懸濁可能な粒子と共有結合するものである。
有用な一重項酸素反応のまた別の例は、ヨーロッパ公
開特許出願第0 515 194号に記載されているような電子
豊富オレフィンとの反応である。２つの基本的な型の反
応が記載されている。これらの１つは、下記トランスホ
ーメーションにより例示される“エン”反応である： この反応は、二重結合の位置をシフトし、ヒドロペルオ
キシドを生成する。シフトした二重結合は、光活性イン
ジケーター前駆体の２つの助色団基のコンジュゲーショ
ンを引き起こすことができ、そうして、蛍光光活性イン
ジケーターを生成できる。
他の光活性インジケーター前駆体は、一重項酸素と反
応することにより、酸化可能基と本質的に反応して蛍光
光活性インジケーターを生じることができるヒドロペル
オキシド類を形成する。かかる前駆体、および、続く反
応および生成物の一例には、下記がある： 別法として、一重項酸素と光活性インジケーター前駆
体との反応により形成されたヒドロペルオキシド、例え
ば、1,3−ジフェニルプロペンは、蛍光光活性インジケ
ーターを形成するための補助化合物として存在するロイ
コ型の染料を酸化するように働くことができる。このヒ
ドロペルオキシドは、補助化合物におけるＶ群元素を酸
素化して、関連する蛍光化合物の電子供与消光剤として
働かせることができる。例えば、補助化合物： は、蛍光性が乏しいが、ヒドロペルオキシドにより酸素
化して、より高度の蛍光化合物： とすることができる。
これとは別に、補助化合物は、ヒドロペルオキシドと
反応することにより、後に除去されて蛍光光活性インジ
ケーターを形成し得る中間体を生成し得る、セレニウム
またはテルリウム原子を有していてもよい。
別法として、光活性インジケーター前駆体は、一重項
酸素とゆっくりと反応するか、または全く反応しない
が、一重項酸素のヒドロペルオキシド反応生成物および
補助分子とは反応する。例えば、下記反応において、補
助化合物を一重項酸素と反応させてヒドロペルオキシド
を形成し、次いで、式（Ik）の光活性インジケーター前
駆体と反応させて、蛍光光活性インジケーターを形成す
る： これらの各例において、補助化合物および光活性イン
ジケーター前駆体を、共有結合的に連結させることがで
きる。このような場合、生じた分子を光活性インジケー
ター前駆体として表す。
オレフィン類と一重項酸素との第２の典型的な反応
は、ジオキセタンを形成する２＋２付加である。この反
応は、結合破壊（bond breaking）を導くことができ、
従って、基本的な蛍光分子から消光基（quenching grou
p）を分離できる。これとは別に、結合破壊工程によ
り、蛍光物質であり得るか、または蛍光分子を導き得る
後の反応を受けることができる、ケトン、アルデヒド、
またはエステルを導くことができる。
上記全てのオレフィン反応において、オレフィンをエ
ーテル類、チオエーテル類、アミン類、および同種物な
どの電子供与基で置換すれば、その速度は速まる。
一重項酸素のまた別の型の反応は、ジエン類を用いる
４＋２付加環化である。かかる反応は、最初、エンドペ
ルオキシド類を導く。ある場合において、エンドペルオ
キシド類は、適切に配置された基と反応して、蛍光物質
であり得るラクトンまたはラクタムを提供できる活性エ
ステル類または無水物類に転位できる。例えば、下記反
応式において形成されたエンドペルオキシドは、転位し
て蛍光ラクトンを形成する： 別法として、エンドペルオキシド類は、上記ヒドロペ
ルオキシド類のところで十分に記載したとおり、光活性
インジケーター前駆体を酸化できる。
蛍光光活性インジケーター分子を生成するための、光
活性インジケーター前駆体と一重項酸素との反応の更な
る例は、以下に例示説明する： 従って、光活性インジケーター前駆体の構造は、採用
する特定の一重項酸素反応に依存するものであり、普通
は、光活性インジケーターを生成するのに必要な一重項
酸素との反応により開始される後の反応が、比較的迅速
に進むことが確実であるように設計されている。加え
て、光活性インジケーター前駆体の構造は、所望の吸収
および放出波長を有し、比較的高い、好ましくは、＞0.
1、より好ましくは0.4以上の蛍光量子収率、および所望
の励起波長で高い、好ましくは＞1000M-1cm-1、より好
ましくは＞10,000M-1cm-1の消光係数を有する、光活性
インジケーターの形状を導くものである。
本発明の好ましい光活性インジケーター前駆体は、下
記構造（Ｉ）： 式中、Ｈは、XR基に対してシスであり;Xは、セレニウム
またはテルリウム原子であり;Rは、不飽和炭素原子、シ
リコン原子、またはスズ原子によりＸに結合する有機ま
たは有機金属基であり；および、Ａは、炭素−炭素基と
一緒になるとき（所望により、１またはそれ以上の芳香
環と縮合した）脂環式環、または複素環を形成し；一重
項酸素を有する化合物と反応すると、ＨおよびXR基が、
炭素−炭素二重結合に換わって、その吸収極大で少なく
とも10,000M-1cm-1の消光係数、および少なくとも10％
の蛍光量子効率を有する蛍光分子を生ずる、を含有する
化合物類を含む。
これらの化合物類の中で特に好ましいのは、Ｘがテル
リウムである化合物類である。最も好ましいのは、下式
の化合物である： 式中、Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはス
ズ原子によりＸに結合する有機または有機金属基であ
り;R1は、水素またはアルキルであり；残りの水素原子
の４つまでが、一緒になって１またはそれ以上の脂環式
環または芳香環式環を形成し得るアルキルまたはアルキ
レン置換基により置換されてもよい。
本明細書に開示した構造（Ｉ）を含有する化合物類
は、その構造の誘導体類、例えば、式（Ia）の化合物、
式（If）の化合物、または式（Ik）の化合物として本明
細書には表している。Ｘがテルリウムであるような化合
物類、およびこの化合物と一重項酸素との反応により形
成される蛍光光活性インジケーター分子の例を下記に与
える： 目下、本発明の好ましい光増感インジケーター前駆体
は、上記式（Ie）および（If）の化合物類である。
これらの化合物類におけるフェニルテルリジルラジカ
ル（−TeC6H5）を、他のテルリウム誘導体類、例えば、
TeSiC（CH3）３、およびTeSn（（CH2）3CH3）３に換え
ることができ、また、フェニル基を、好ましくは−Ｎ
（CH3）２および−OCH3などの電子供与基で置換するこ
とができる。Ｘがセレニウムである場合は、セレニウム
を強電子供与基または原子、例えばスズなどによって置
換するのが好ましい。
他の分類の光活性インジケーター前駆体も本発明に使
用できる。例えば、一重項酸素との反応において化学発
光する化合物類は、本発明の光活性インジケーターとし
て働くことができる蛍光生成物に変換されることが多
い。このような光活性インジケーター前駆体、および一
重項酸素との反応の際に生成される光活性インジケータ
ーの例には、下記がある： “光活性インジケーター”とは、波長250ないし1100n
m、好ましくは300ないし950nmの光を吸収した後、蛍光
または燐光、好ましくは蛍光により光を放出するか、ま
たはその励起エネルギーをアクセプター分子に伝達し、
その際に蛍光または燐光により光を放出する分子を意味
する。好ましくは、放出量子数は、高く、普通は少なく
とも0.1、好ましくは少なくとも0.4、より好ましくは0.
7以上であり、吸収極大の消光係数は、普通、5000m-1cm
-1である。
本発明の光活性インジケーターは、代表的なものとし
て、蛍光化合物、例えば、典型的には、300および400ナ
ノメーターの間の光を吸収し、400および500ナノメータ
ーを放出する蛍光増白剤などの蛍光化合物類；ロダミン
およびフルオレセインなどのキサンテン類；ビマン類；
ウンベリフェロンなどのクマリン類；ダンシルなどの芳
香族アミン類；スクアレート染料類；ベンゾフラン類；
シアニン類、メロシアニン類、希土キレート類、および
同等物などである。燐光物質である光活性インジケータ
ー類は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、ピレン、
アンスラセン、およびアセナフテンなどの多芳香族化合
物類を含む。光活性インジケーターは、クロメン類を含
む。アクセプター分子にエネルギーを伝達できる光活性
インジケーターは、普通、250ないし550nmで吸収するも
のである。かかるアクセプター分子は、発光物質であ
り、上記発光物質および燐光光活性インジケーター類の
いずれもを含むことができる。
“蛍光を測定する”とは、光の照射による励起の際に
本発明の光活性インジケーターから放出された光の量の
検出および算出を意味する。光活性インジケーターの蛍
光は、普通、光の照射により光活性インジケーターを励
起させ、同時に、そこから放出される光（即ち、蛍光）
を検出することにより、測定されるものであるが、その
他の蛍光検出方法も本発明により実施される。蛍光の測
定は、光が直接的に吸収されるのか、または間接的に吸
収されるのかどうか、または放出が励起一重項状態から
起こるのか、またはより高い多重項の状態から起こるの
かどうかにかかわらず、光の照射と同時に、または照射
後直ちに光活性インジケーターにより放出される光の検
出を含むことを意図されている。蛍光の測定は、光増感
剤による光の吸収により開始される化学励起以外の化学
励起により励起された供与体からのエネルギーの伝達後
に光活性インジケーターから放出される光の測定もまた
含むことを意図されている。例えば、光活性インジケー
ターの蛍光の測定は、例えば、過酸化水素とペルオキシ
ダーゼをルミノールに添加することによる化学発光分子
の活性化、およびルミノール反応生成物から光活性イン
ジケーターへのエネルギー伝達の結果として光活性イン
ジケーターから放出される光の測定を含む。
“支持体”または“表面”とは、多孔性または非多孔
性水不溶性物質を含んでなる表面を意味する。この表面
は、多くの形、例えば、ストリップ、ロッド、ビーズを
含む粒子、および同等物のいずれか１つを持つことがで
きる。この表面は、親水性か、または親水性にさせる能
力があるものであり、シリカ、硫酸マグネシウム、およ
びアルミナなどの無機粉末；天然ポリマー物質、特にセ
ルロース物質およびセルロースから誘導される物質、例
えば、紙、例えば、濾紙、クロマトグラフ用ペーパー等
を含む繊維；合成または修飾化天然由来ポリマー類、例
えば、ニトムセルロース、セルロース、アセテート、ポ
リ（ビニルクロリド）、ポリアクリルアミド、架橋デキ
ストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリ
スチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフ
タレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、
等；これらは、単独で、または他の物質と併せてのいず
れかで使用される；バイオガラスとして利用できるガラ
ス、セラミック類、金属類、および同等物を含む。リポ
ソーム、脂質小胞、および細胞などの天然または合成ア
センブリーも採用できる。
支持体または表面へのsbp構成員の結合は、一般に文
献から入手できるよく知られた技術により達成され得
る。例えば、“インモビライズド・エンザイムス”、千
畑一郎、ハルステッド・プレス、ニューヨーク（1978
年）、およびクアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、24巻、3059頁（1970年）参
照。
表面は、普通、多官能性であるか、または、多官能性
化される能力があるか、または、特異的または非特異的
結合または非共有相互作用により、ポリヌクレオチド、
sbp構成員、光増感剤、および／または光活化学発光化
合物を結合する能力がある。広範囲の官能基が利用で
き、また組み込むことができる。官能基には、カルボン
酸類、アルデヒド類、アミノ基類、シアノ基類、エチレ
ン基類、ヒドロキシル基類、メルカプト基類、および同
等物がある。広範囲の化合物類を表面に連結させる方法
は、よく知られており、文献に詳細に例示説明されてい
る。例えば、クアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、24巻、3059頁（1970年）参
照。オリゴヌクレオチドまたはsbp構成員に対する連結
基の長さは、連結される化合物の性質、連結される化合
物と特異的結合特性に関する表面との距離の影響、その
他に依存して、広範囲に変わる。
“懸濁可能な粒子”とは、少なくとも20nmで直径約20
ミクロン以下であり、普通は、少なくとも約40nmで約10
ミクロン未満、好ましくは、約0.10から2.0ミクロンで
あり、かつ普通は、約４ピコリットル未満の容量を有す
る、水に懸濁させることができる粒子を意味する。懸濁
可能な粒子は、有機物または無機物、膨張性または非膨
張性、多孔性または非多孔性であることができ、好まし
くは、密度近似水（一般に約0.7から1.5g/ml）のもので
あり、透明、部分的に透明、または不透明であり得る物
質から成る。懸濁可能な粒子は、普通、荷電しており、
好ましくは負に荷電している。この懸濁可能な粒子は、
固体（例えば、ポリマー、金属、ガラス、有機物および
鉱物、塩類、およびケイソウなどの無機物）、油滴（例
えば、炭化水素、フルオロカーボン、シリコン液）、ま
たは小胞（例えば、合成物、例えばリン脂質、または他
の脂質、例えば、リン酸ジアルキル類、または天然物、
例えば、細胞およびオルガネラ）であることができる。
懸濁可能な粒子は、ラテックス粒子または有機または無
機ポリマーから成る他の粒子；脂質小胞、例えば、リポ
ソーム；リン脂質小胞；油滴；シリコン粒子；金属ゾ
ル；細胞；および染料クリスタライトであっても良い。
有機物の場合は、懸濁可能な粒子は、ポリマー類、付
加または縮合ポリマーのいずれかであることができ、ア
ッセイ媒体に容易に懸濁可能である。有機懸濁可能粒子
は、また、その表面でsbp構成員と（直接的、または間
接的のいずれかで）結合し、かつ光増感剤または光活性
インジケーター前駆体と、その表面で結合するか、その
容量内で組み込むために、吸着性であるか、または官能
性を与えることができるものである。
この懸濁可能な粒子は、天然由来物質、合成的に修飾
される天然由来物質、および合成物質から誘導できる。
脂質二重層のような天然または合成アセンブリー、例え
ば、リポソーム類、および非リン脂質小胞が好ましい。
対象となる粒子の有機ポリマーの中には、ポリサッカラ
イド類、特に、架橋ポリサッカライド類、例えば、セフ
ァロースとして入手できるアガロース、セファデックス
およびセファクリルとして入手できるデキストラン、セ
ルロース、スターチ、および同等物；付加ポリマー類、
例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリレー
トおよびメタクリレートの誘導体類のホモポリマー類お
よびコポリマー類、特にエステル類、およびハイドロゲ
ルを含む遊離のヒドロキシル官能性を有するアミド類、
および同等物がある。無機ポリマーには、バイオガラス
として入手できるガラス類および同等物がある。ゾル
は、金、セレニウム、および他の金属類を含む。懸濁可
能な粒子は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、等の
ような分散させた水不溶性染料であっても良く、光増感
剤として働くこともできる。懸濁可能な粒子は、ケイソ
ウ、細胞、ウイルス粒子、油滴、アルキルトリグリセラ
イドなどの脂肪粒子、マグネトソーム、細胞核、および
同等物を含む場合もある。
非ポリマー性粒子を使用する場合、この粒子サイズ
は、粉砕、超音波処理、振動などの機械的手段により大
きい粒子を小さい粒子に砕くことによって変わり得る。
上記定義の表面または支持体同様、懸濁可能な粒子
は、普通、多官能性であるか、または多官能性にさせる
ことができるか、または、特異的、非特異的共有または
非共有相互作用により、sbp構成員、光増感剤、または
光活性インジケーター前駆体に結合させることができ
る。広範囲の官能基が利用でき、また組み込むことが出
来る。官能基の例には、カルボン酸類、アルデヒド類、
アミノ基類、シアノ基類、エチレン基類、ヒドロキシル
基類、メルカプト基類、および同等物がある。この粒子
とsbp構成員、化学発光化合物、または光増感剤との共
有結合を採用する場合、連結法は、よく知られており、
文献に十分に例示説明されいる。例えば、クアトレカサ
ス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、24巻、3059頁（1970年）参照。連結基の長さは、連
結される化合物の性質、連結される化合物と特異的結合
特性に関する表面との距離の影響、分析物、その他に依
存して、広範囲に変わる。
光増感剤および／または光活性インジケーター前駆体
は、懸濁可能な粒子に溶解するか、または共有結合する
ものを選択できるが、ただし、光増感剤および光活性イ
ンジケーター前駆体は、同一の粒子に結合しない。非共
有結合のとき、この化合物と粒子は、普通、全て疎水性
であり、化合物が粒子から分離する能力および同一粒子
に結合する能力を低減する。光増感剤と光活性インジケ
ーターの両方が同一粒子に結合するという問題は、化合
物の１つまたは両方のいずれかを粒子に共有結合させ、
それによって、各化合物を親水性か、または疎水性にさ
せることにより最小限度に押さえることができる。
各粒子に結合した光増感剤または光活性インジケータ
ー前駆体分子の数は、少なくとも１つであって良く、粒
子が光増感剤または光活性インジケーター前駆体分子全
体からなるために十分に高い数であり得る。分子の好ま
しい数は、アッセイにおけるバックグラウンドに対して
最も高いシグナルを提供するように経験的に選択される
（シグナルは、粒子がお互いに結合するような条件で決
められ、バックグラウンドは、粒子が結合しない場合の
ものである）。通常、光増感剤および光活性インジケー
ター前駆体の粒子中の濃度は、10-8から5M、普通は、10
-5から10-1M、好ましくは、10-3から10-1Mの範囲であ
る。
“油滴”とは、例えば、リン脂質、スフィンゴミエリ
ン、アルブミン、その他などの両親媒性分子である乳化
剤でコートされ、安定化された親油性化合物を含んで成
る液体またはワックス状粒子を意味する。
リン脂質は、脂肪族ポリオールの脂肪族カルボン酸エ
ステルを基礎とするものであり、少なくとも１つのヒド
ロキシル基が、約８から36、より普通には、約10から20
の炭素原子のカルボン酸エステルで置換されており、０
から３のエチレン不飽和部位、より普通には、０から１
のエチレン不飽和部位、および、ホスフェートで置換さ
れリン酸エステルを形成する少なくとも１つの、普通は
１つのみのヒドロキシル基を持つ。ホスフェート基を、
さらに、ジまたはより多い官能性であり、一般にヒドロ
キシルまたはアミノ基を有する小さい脂肪族化合物で置
換する場合もある。
油滴は、適切なリン脂質化合物を界面活性剤、アニオ
ン、カチオン、または非イオンと合わせ、ただし、界面
活性剤は、混合物の約0.1から0.4重量パーセント、より
普通には、約0.1から20重量パーセントである、さら
に、水性媒質中の混合物を超音波処理またはボルテキシ
ングなどの振動処理にかけることにより、常法に従い作
成できる。例示的なリン親油性化合物には、炭化水素油
類、フルオロカーボンを含むハロカーボン類、アルキル
フタレート類、トリアルキルホスフェート類、トリグリ
セライド類、等がある。
sbp構成員は、普通、油滴の表面に吸着するか、また
は油滴の表面成分に直接的、または間接的に結合するも
のである。sbp構成員を液体粒子調製中または調製後に
液体粒子に組み込むことができる。sbp構成員は、普
通、粒子表面に存在する分子の約0.5から100モルパーセ
ント、より普通には、１ないし90モルパーセント、頻繁
には、約５から80モルパーセント、および好ましくは、
約50から100モルパーセントで存在するものである。
以下に、油滴を安定化させるために利用できる両親媒
性化合物を列挙するが、例示であって、限定ではない：
ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリ
ン、ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチ
ジルコリン、卵ホスファチジルコリン、ジアパルミトイ
ルホスファチジルコリン、ホスファチド酸、カルジオリ
ピン、レシチン、ガラクトセレブロシド、スフィンゴミ
エリン、ジセチルホスフェート、ホスファチジルイノシ
トール、２−トリヘキサデシルアンモニウムエチルアミ
ン、1,3−ビス（オクタデシルホスフェート）−プロパ
ノール、ステアロイルオキシエチレンホスフェート、リ
ン脂質類、ジアルキルホスフェート類、ドデシル硫酸ナ
トリウム、カチオン性洗浄剤類、アニオン性洗浄剤類、
アルブミンなどのタンパク質類、非イオン性洗浄剤、
等。
油滴の安定化は、ポリシアノアクリレート類などのポ
リマー、デキストラン、アルブミンなどのポリマー化タ
ンパク質類、ヒドロキシブチルメタクリレート、ポリア
クリルアミド、および同等物でコーティングすることに
よっても達成できる。
親油性基を有する、既に記載した他の化合物類を使用
してもよい。ほとんどの場合、これらの化合物類は、直
鎖または分枝状であり得る、炭素原子６ないし20のアル
キル基、普通はアルキル基類の混合物、を有するアルキ
ルベンゼン類であり、カルボキシル基、ヒドロキシル
基、ポリオキシアルキレン基（炭素原子２から３のアル
キレン）、カルボキシル基、スルホン酸基、またはアミ
ノ基を有する。
脂肪族脂肪酸は、通常、炭素原子約10から36、より普
通には、約12から20であるものを使用できる。また、脂
肪酸に対して指示される炭素制限を有する脂肪アルコー
ル、同様の炭素制限の脂肪アミン、および様々なステロ
イドもまたその用途を見い出すことができる。
油滴は、フルオロカーボン油またはシリコン油（シリ
コン粒子）を含むことができる。このような小滴は、ギ
アエバーによって、米国特許第4,634,681号および4,61
9,904号（これらの開示は、本明細書全体に組み込んで
ある）に記載されている。これらの小滴は、フルオロカ
ーボン油またはシリコン油を水性相中に分散させること
により生成する。小滴は、選択した油（一般に、商業的
に入手可能な油など）の少量を、より多い量の水性相を
含む容器に入れることにより調製される。液体系を振動
処理にかけ、乳化を起こさせ、次いで遠心分離する。均
一相を除去し、残った小滴を水性緩衝液媒質に再度懸濁
する。上記遠心分離およびデカンテーション工程を１回
以上繰り返すことができ、その後小滴を利用する。
多くの方法でsbp構成員を小滴に結合させることがで
きる。ギウエバーにより記載されているとおり、特定の
sbp構成員、特に、タンパク質性sbp構成員を、乳化工程
の前後に過剰のsbp構成員を水性媒質中に導入すること
により、小滴上に被覆することができる。洗浄工程は、
過剰のsbp構成員を除去するために望ましい。油の官能
性化により、上記sbp構成員に連結するための官能性が
導入される。かかる官能性は、光増感剤または光活性イ
ンジケーター前駆体に小滴を連結するために採用するこ
ともできる。一方、光増感剤または光活性インジケータ
ー前駆体は、油滴の油相に可溶性であるように選択され
ることが多く、共有結合されない。油がフルオロカーボ
ンであるとき、フッ素化光増感剤または光活性インジケ
ーター前駆体は、対応する非フッ素化派生体よりも可溶
性であることが多い。
“リポソーム”とは、ほぼ球状形の微小胞を意味し、
本発明において用いるのに好ましい物質の１つである。
リポソームは、少なくとも約20nmであって約20ミクロン
を越えない、普通は、少なくとも約40nmであって約10ミ
クロン以下の直径を有する。好ましくは、リポソームの
直径は、沈澱または浮遊を制限するために約２ミクロン
以下である。
リポソームの外部殻は、多量の水または水性溶液を封
入する両親媒性二重層からなる。二重層を１つ以上有す
るリポソームは、多重ラメラ小胞と呼ばれる。二重層を
１つだけ有するリポソームは、単ラメラ小胞と呼ばれ
る。親油性光増感剤または光活性インジケーター前駆体
を使用する場合、多重ラメラ小胞が本発明において好ま
しく、なぜなら、多重ラメラ小胞は、これらの物質を単
ラメラ小胞よりも多量に組み込む能力を持つからであ
る。両親媒性二重層は、リン脂質から成ることが多い。
本発明において有用な粒子の調製に使用されるリン脂質
は、レクチンを含む天然膜中に見い出されたリン脂質ま
たはリン脂質混合物、または飽和または不飽和12−炭素
または24−炭素直鎖脂肪酸の合成グリセリルホスフェー
トジエステルであることができ、そのホスフェートは、
モノエステルとして、または極性アルコール、例えば、
エタノールアミン、コリン、イノシトール、セリン、グ
リセロール、および同等物のエステルとして存在し得
る。特定の好ましいリン脂質は、Ｌ−α−パルミトイル
オレオイル−ホスファチジルコリン（POPC）、パルミト
イルオレオイルホスファチジル−グリセロール（POP
G）、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルグリセロー
ル、Ｌ−α−（ジオレオイル）−ホスファチジルエタノ
ールアミン（DOPE）、およびＬ−α−（ジオレオイル）
−ホスファチジルβ−（４−（Ｎ−マレイミドメチル）
−シクロヘキサン−１−カルボキシアミド）エタノール
（DOPE−MCC）である。
二重層におけるリン脂質に、コレステロールを追加し
てもよく、また、普通は荷電している極性ヘッド基、お
よび普通は２つの直鎖状炭化水素鎖からなる疎水性部を
有する他の両親媒性化合物で置換してもよい。このよう
な置換物の例には、ジアルキルホスフェート、アルキル
基が直鎖状の12ないし20の炭素原子鎖を有するジアルコ
キシプロピルホスフェート類、Ｎ−（2,3−ジ−（９−
（Ｚ）−オクタ−デセニルオキシ））−プロプ−１−イ
ル−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド（DOTM
A）、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、および同
等物がある。
本発明に使用するリポソーム類は、好ましくは、懸濁
液を安定化し、自然凝集を防ぐために高い負電荷密度を
有する。
リポソームは、水和、および乾燥させたリン脂質また
はリン脂質置換物の水性溶液中への機械分散を含む様々
な方法によって製造できる。こうして調製したリポソー
ムは、様々な寸法、組成、および性質を有する。機械的
に分散させたリポソームの性質の不均一性および不調和
性を低減する一つの方法は、超音波処理である。かかる
方法は、平均リポソームサイズを小さくする。別法とし
て、押出成型は、リポソーム製造中の最終段階として利
用可能である。米国特許第4,529,561号は、サイズの単
一性を改善するためにリポソームを単一な孔サイズ膜を
通して加圧下で押出成型する方法を開示している。
本発明において使用する場合、リポソームは、sbp構
成員に結合する能力を持ち、かつ水性または非水性層に
結合させた光増感剤または光活性インジケーター前駆体
を有する能力を持つべきである。本発明において使用さ
れるリポソームは、普通、脂質の外部表面に結合するsb
p構成員を有するものである。
脂質二重層に溶解させた疎水性または両親媒性光増感
剤または光活性インジケーター前駆体を含有するリポソ
ームの調製は、オルセン等、バイオケミカ・エ・バイオ
フィジカ・アクタ、557（９）、1979年に記載されてい
る方法を含む、様々な方法で実施できる。概略を述べる
と、クロロホルムなどの有機溶媒中適切な化合物を含有
する脂質の混合物を、ガラス容器壁上で薄フィルム状に
乾燥させる。脂質フィルムを、振盪またはボルテキシン
グすることにより適切な緩衝液で水和する。その後、脂
質懸濁液を順番に小さくなる孔サイズ、例えば、2.0、
1.0、0.8、0.6、0.4、および0.2ミクロン、を有する一
連のポリカーボネートフィルター膜を通して押出成型す
る。どの篩過も、特に最も小さいフィルターを通す篩過
を繰り返すことが望ましい。リポソームを、例えば、セ
ファクリルＳ−1000のカラムを通すようなゲル濾過によ
り精製できる。カラムを緩衝液で溶出し、リポソームを
集めることができる。冷所に貯蔵すると、この方法で製
造したリポソームの貯蔵寿命は、伸びる。これとは別
に、光増感剤または光活性インジケーター前駆体をリポ
ソーム調製後に液体懸濁液に加えることができる。
小滴およびリポソームの標識化は、例えば、脂質二重
層を構成する分子にチオールまたはマレイミドまたはビ
オチン基を加入させることを、しばしば含む。次いで、
その表面に、光増感剤、光活性インジケーター前駆体分
子、またはsbp構成員を、粒子と、スルフヒドリル反応
試薬、スルフヒドリル基、またはアビジンにそれぞれ結
合しているこれらの物質の１つとの反応により結合させ
る。スルフヒドリル反応基は、ブロモアセトアミドおよ
びマレイミドなどのアルキル化試薬を含む。
sbp構成員は、弱い疎水性相互作用により、リポソー
ム粒子の表面に引き寄せることができるが、このような
相互作用は、一般に、インキュベーションおよび洗浄中
に遭遇する剪断力に抵抗するのに十分なものではない。
sbp構成員を、例えば、上記に示したDOPE−MCCの使用に
より、該リポソームをメルカプタン基で官能化したsbp
構成員から選択したものと結合させることにより、官能
化したリポソーム粒子に共有結合させるのが好ましい。
例えば、sbp構成員が抗体であるならば、Ｓ−アセチル
−メルカプト無水コハク酸（SAMASA）と反応させ、加水
分解して、スルフヒドリル修飾化抗体を提供することが
できる。
“ラテックス粒子”とは、普通、直径20nmないし20m
m、より好ましくは100ないし1000nmの粒子寸法を有する
特定の水懸濁可能水不溶性ポリマー物質を意味する。ラ
テックスは、以下のような置換ポリエチレンであること
が多い；ポリスチレン−ブタジエン、ポリアクリルアミ
ドポリスチレン、アミノ基を有するポリスチレン、ポリ
アクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリルブタ
ジエン、スチレンコポリマー、ポリビニルアセテート−
アクリレート、ポリビニルピリジン、ビニル−クロリド
アクリレートコポリマー類、および同等物。スチレンお
よびカルボキシル化スチレン、または他の活性基、例え
ば、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン、および同等物で
官能化したスチレンの非架橋化ポリマー類が好ましい。
ブタジエンなどのジエンで置換されたスチレン類のコポ
リマーを使用することも多い。
本発明において使用される光増感剤または光活性イン
ジケーター前駆体とラテックス粒子との結合は、重合に
より粒子を形成する間に組み込むことができ、普通は、
予め形成した粒子中へ、普通は、粒子内への非共有溶解
（noncovalent dissolution）により組み込まれるもの
である。普通は、光活性インジケーター前駆体または光
増感剤の溶液を採用する。使用し得る溶媒には、アルコ
ール類（エタノールを含む）、エチレングリコール、お
よびベンジルアルコール；ジメチルホルムアミド、ホル
ムアミド、アセトアミド、およびテトラメチル尿素、お
よび同種物などのアミド類；ジメチルスルホキシドおよ
びスルホランなどのスルホキシド類；およびカルビトー
ル、エチルカルビトール、ジメトキシエタン、および同
種物などのエーテル類、および水が含まれる。粒子が不
溶性である高沸点溶媒を用いることは、粒子中への化合
物類の溶解を容易にさせる高めの温度の使用を可能と
し、特に適している。溶媒類は、単独で、または組み合
わせて使用することができる。光増感剤を組み込むため
に特に好ましい溶媒類は、光増感剤の三重項励起状態を
失活しないようなものであり、なぜならば、それらの溶
媒の内在特性のため、または、それらの溶媒が、粒子中
に不溶性である水などの溶媒に自身が溶解されるという
能力によって実質的に粒子から除去できるためである。
芳香族溶媒類、一般に、粒子に可溶性である溶媒類が好
ましい。粒子内の光活性インジケーター前駆体を組み込
むためには、溶媒は、それらの内在特性または粒子から
除去される能力のため、生じた光活性インジケーターの
蛍光と干渉しないようなものを選択するべきである。芳
香族溶媒類は、また頻繁に好まれるものである。代表的
な芳香族溶媒類には、ジブチルフタレート、ベンゾニト
リル、ナフトニトリル、ジオクチルテレフタレート、ジ
クロロベンゼン、ジフェニルエーテル、ジメトキシベン
ゼン、等がある。
光増感剤または光活性インジケーター前駆体が粒子に
共有結合している場合以外は、普通は、電子的に中性な
光増感剤または光活性インジケーター前駆体を使用する
ことが好ましい。液体媒体は、ポリマービーズを粘着性
がなくなるまで軟化しないものを選択するのが好まし
い。好ましい技術は、選択したラテックス粒子を、光増
感剤または光活性インジケーター前駆体が少なくとも限
られた溶解性を有するような液体媒体中に懸濁すること
を含んで成る。好ましくは、液体媒体中の光増感剤また
は光活性インジケーター前駆体の濃度は、一重項酸素の
最高形成効率、および媒体中に生じた光活性インジケー
ターからの放出される最高量子収率を有する粒子を提供
するように選択する。溶媒中の粒子の歪みまたは溶解
は、粒子が不溶性である混和性共溶媒を加えることによ
り、防ぐことができる。
一般に、この操作中に採用する温度は、光増感剤標識
化粒子の一重項酸素形成および光活性インジケーター前
駆体標識化粒子から生じる光活性インジケーターの量子
収率を最大にするように、選択されるが、ただし、粒子
は、選択した温度で凝集してはならない。通常は、昇温
温度を採用する。この操作のための温度は、一般に、20
℃から200℃、より普通には、50℃から170℃の範囲であ
る。室温で水にほぼ不溶性であるある化合物類が、昇温
温度で、例えば、エタノール、およびエチレングリコー
ル、および同等物などの低分子量アルコールに可溶性で
あることが観察されている。カルボキシル化修飾ラテッ
クス粒子は、かかる温度で低分子量アルコールを許容す
ることが示されている。
sbp構成員は、ラテックス粒子の表面に物理的に吸着
することができ、また、粒子に共有結合することもでき
る。sbp構成員がラテックス粒子の表面に弱く結合して
いるだけの場合、その結合は、ある場合には、インキュ
ベーションおよび洗浄中に遭遇する粒子対粒子剪断力に
耐えることができないこともある。従って、普通は、sb
p構成員をラテックス粒子に、吸着を最小限にするよう
な条件下で共有結合させるのが好ましい。これは、ラテ
ックスの表面を化学的に活性化することにより達成でき
る。例えば、表面カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステルを形成することができ、次いで、エ
ステル基と反応するアミノ基を有するリンカーと、また
はアミノ基を有するsbp構成員と直接的に、接触させ
る。リンカーは、普通、アッセイ成分の粒子表面に対す
る非特異的結合を低減するようなものを選択し、好まし
くは、ラテックス粒子への結合とsbp構成員への結合の
両方に対して適切な官能性を与えるものである。適切な
物質には、マレイミド化アミノデキストラン（MAD）、
ポリスチレン、アミノサッカライド、および同等物があ
る。MADは、フバート等、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ、75
（７）、3143頁、1978年に記載のようにして調製でき
る。
ある方法では、MADを、水溶性カルボジイミド、例え
ば、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル
カルボジイミドを用いて、まずカルボキシル含有ラテッ
クス粒子に結合させる。次いで、被覆粒子を試薬類中で
平衡化して、非特異的結合を保護する。このような試薬
類には、ウシ血清γグロブリン（BGG）などのタンパク
質、トゥイーン20、トリトンＸ−100、および同等物な
どの洗浄剤がある。その後、スルフヒドリル基を有す
る、またはスルフヒドリル基を誘導するように適切に修
飾したsbp構成員を粒子の懸濁液に加え、その際、sbp構
成員とMADの間の共有結合が、粒子上で形成される。次
いで、過剰の未反応sbp構成員を洗浄により除去でき
る。
“金属ゾル”とは、重金属、即ち、IB金属群などの原
子数20以上の金属、例えば、金または銀を含む懸濁可能
な粒子を意味する。
金属ゾル粒子は、例えば、リューベリングにより、米
国特許第4,313,734号に記載されており、その開示は、
本明細書全体に参照して組み込んである。このようなゾ
ルは、金属、金属化合物、または金属または金属化合物
で被覆されたポリマー核のコロイド状水性分散物を含
む。
金属ゾルは、金属類または金属化合物類、例えば、酸
化金属類、水酸化金属類、および金属または金属化合物
で被覆されたポリマー核の金属塩類であり得る。このよ
うな金属の例には、白金、金、銀、水銀、鉛、パラジウ
ム、および銅があり、金属化合物類の例には、ヨウ化
銀、臭化銀、水和酸化銅、酸化鉄、水酸化鉄または水和
酸化鉄、水酸化アルミニウムまたは水和酸化アルミニウ
ム、水酸化クロムまたは水和酸化クロム、酸化バナジウ
ム、硫化ヒ素、水酸化マンガン、硫化鉛、硫化水銀、硫
化バリウム、および二酸化チタンがある。一般に、これ
らの有用な金属類または金属化合物類は、知られている
技術手段により容易に入手できることを実証できる。
上記金属類または金属化合物類で被覆されたポリマー
核からなる分散粒子を含んで成るゾル類を使用するのが
有利なこともある。これらの粒子は、純粋な金属、また
は金属化合物の分散相と同様の特性を有するが、サイ
ズ、密度、および金属接点は、所望により組み合わすこ
とができる。
金属ゾル粒子は、それ自身知られている多くの方法に
より調製できる。例えば、金ゾルの調製の場合、リュー
ベリングは、文献、G.フレンのネイチャー・フィジカル
・サイエンス、241、20頁（1973年）を引用している。
金属ゾル粒子は、上記sbp構成員または光増感剤また
は光活性インジケーター前駆体との連結の際に記載した
ような様々な官能基を含有するように修飾することがで
きる。例えば、ポリマー結合剤を用いて、多くの重金属
と強力に結合するチオール基、または、例えば、磁気粒
子を被覆するためのアドバンスド・マグネティックスに
より、ヨーロッパ公開特許出願84400952.2に記載されて
いるように金属粒子とトリアルコキシアミノアルキルシ
ランとの反応により結合してポリマーコーティングを形
成できるシリル化剤を含有するポリマーなどの粒子を、
被覆できる。
“染料クリスタライト”とは、純粋または混合固体水
不溶性染料の微結晶であり、好ましくは、上記光増感剤
として働くことができる染料である。本発明に有用な染
料クリスタライトは、20nmないし20μｍのサイズ範囲を
持つ。
染料クリスタライトを調製する１つの方法は、米国特
許第4,373,932号（グリブノー等）に記載されており、
その開示は、本明細書全体に組み込んである。グリブノ
ーは、コロイド状染料粒子および疎水性染料または顔料
の水性分散物を記載しており、直接的、または間接的に
結合した免疫化学的に反応性の成分を有することができ
る。染料粒子は、一般に、染料を水に分散させ、次い
で、遠心分離することにより、調製する。染料ペレット
を得、水に再懸濁させて、これにガラスビーズを加え
る。この懸濁液を数日間室温でころがした。液体をデカ
ントし、遠心分離して、液体を吸引後、染料粒子を得
る。
染料クリスタライトを調製するその他の方法は、水混
和性溶媒中の染料の溶液を水にゆっくりと添加するもの
である。他の方法は、水中の固体染料懸濁液を超音波処
理するものである。
sbp構成員の染料粒子への結合は、直接または間接吸
着または化学共有結合により達成できる。後者は、コー
ティング物質中、および染料中の適切な官能基の存在に
左右される。例えば、ジアゾ化芳香族アミノ基を含有す
る化合物および所望の官能基を、染料のフェノール基、
またはアニリン基にカップリングすることにより、官能
基を染料クリスタライトの表面上に導入できる。
染料がカルボキシル基を有する場合、染料クリスタラ
イトをカルボジイミドにより活性化し、第１級アミノ成
分に結合させることができる。例えば、臭化シアンまた
はハロゲン置換ジまたはトリアジン類により、脂肪族第
１級アミノ基およびヒドロキシル基を活性化することが
でき、その後、第１級アミノ成分との、または、例え
ば、−SHまたは−OH基との結合を起こすことができる。
二官能性反応性化合物を使用することもできる。例え
ば、グルタルアルデヒドを、染料およびsbp構成員の第
１級アミノ成分の相互カップリングのために使用でき、
また、例えば、ヘテロ−二官能性試薬、例えば、Ｎ−ス
クシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ートを、第１級アミノ成分をチオール基を含有する生物
にカップリングさせるために採用できる。
“全体にまたは部分的に連続して”とは、本発明の方
法の各成分を付随的に（同時に）合わせるのではないと
きに、１またはそれ以上を残りの１またはそれ以上の成
分と合わせて、副組み合わせを作るような条件を意味す
る。その後、それぞれの副組み合わせを、本発明方法の
１またはそれ以上の工程に付すことができる。従って、
それぞれの副組み合わせを、１またはそれ以上の所望の
結果を達するような条件下でインキュベートできる。
本発明に従うアッセイでは、様々な補助物質が採用さ
れることが多い。例えば、緩衝液は、通常、アッセイ媒
体の安定剤およびアッセイ成分と共に、アッセイ媒体中
に存在するものである。しばしば、これらの補助物質に
加えて、アルブミンなどのタンパク質類、ホルムアミド
などの有機溶媒類、第４級アンモニウム塩類、硫酸デキ
ストランなどのポリカチオン類、界面活性剤類、特定の
非イオン性界面活性剤類、結合増強剤、例えば、ポリア
ルキレングリコール、または同等物が、含まれることも
ある。
特定の実施態様の記載 一般に、本発明は、選択された媒体中の分析物を測定
する方法に関する。該方法は、分析物を含有する疑いの
ある媒体を、もし分析物が存在するならば、光増感剤お
よび光活性インジケーター前駆体の量に分析物が影響を
及ぼせるような条件下で処理することを含み、ここで、
この光増感剤と光活性インジケーターは極めて近接した
状態になることができ、光増感剤により産生される短命
な一重項酸素が、一重項酸素の自然崩壊前に光活性イン
ジケーター前駆体と反応して、光活性インジケーターを
生成できるものである。この方法は、更に、生じた光活
性インジケーターを励起させるために、光増感剤を励起
させるのに使用した光と同一または異なる波長であり得
る光にさらすこと、および励起の際に光活性インジケー
ターから放出された蛍光の強度を測定することを含む。
生じた蛍光の強度は、媒体中の分析物量と相関する。光
活性インジケーターは、光活性インジケーター前駆体と
光増感剤により産生された一重項酸素が反応すると生成
する。光増感剤は、普通、光励起、その後の分子酸素へ
のエネルギー伝達に応答して、一重項酸素の産生を触媒
するものである。光増感剤および光活性インジケーター
前駆体の一方または両方は、しばしば、各種表面に結合
するが、均一系アッセイにおいては、その表面とは好ま
しくは懸濁可能な粒子の表面である。
均一系アッセイの場合、本発明は、アッセイ媒体の大
部分の溶液中で、光増感剤と光活性インジケーター前駆
体の分子を互いの平均距離よりも近接させるか、または
それを妨げる分析物に基いて説明される。この区分は、
分析される試料中に存在する分析物の量によって変わる
ものである。光活性インジケーター前駆体と結合しない
光増感剤分子は、水性媒体中で光活性インジケーター前
駆体と崩壊前に反応できない一重項酸素を生成する。し
かしながら、光増感剤および光活性インジケーター前駆
体が、分析物の存在に応答して、互いに極めて近接した
状態になると、光増感剤を照射すると生成する一重項酸
素が光活性インジケーター前駆体と反応して、崩壊前に
光活性インジケーターを生成する。多くの光活性インジ
ケーター前駆体分子および／または光増感剤分子は、あ
る表面に結合できるか、またはその表面を含んでなる物
質内に組み込むことができるので、表面が光増感剤およ
び光活性インジケーター前駆体と共に存在すると、崩壊
前に光活性インジケーター前駆体と反応する一重項酸素
の効率または作用を増大できる。従って、光活性インジ
ケーター前駆体と光増感剤ペアの一構成員を、分析物存
在の関数として他の一構成員を組み込んでいる一表面と
近接した状態にすることが好ましい。対象となるアッセ
イは、簡便で能率良く再現可能な方法で、広範囲の分析
物を検出および測定する好便な方法を提供するものであ
り、単純な装置を採用して、反応中に生じる光の量を測
定できる。
光活性インジケーター前駆体に極めて近接した状態に
なる光増感剤の量は、光増感剤および光活性インジケー
ター前駆体それぞれがsbp構成員に結合するため、分析
物の存在によって影響される。これは、多くの方法で達
成することができ、それによって“結合（アソシエー
ト）する”という用語が、定義される。光増感剤および
光活性インジケーター前駆体は、sbp構成員と共有結合
するための官能性を含むことができ、sbp構成員は、光
増感剤および／または光活性インジケーター前駆体に結
合するための官能性を含むことができる。この結合は、
２つの分子間の直接結合、または、sbp構成員と光増感
剤または光活性インジケーター前駆体の間に使用され得
る連結基を介する結合により、達成できる。その他の実
施態様では、光増感剤および光活性インジケーター前駆
体のいずれか、または両方は、表面に結合できるか、ま
たは粒子内、これもまたsbp構成員に結合する、に組み
込むことができる。両方の場合とも、sbp構成員のそれ
ぞれが、直接的または間接的に、分析物、または、その
濃度が分析物の存在によって影響されるアッセイ成分に
結合する能力がある。光増感剤および光活性インジケー
ター前駆体のいずれか、または両方を、粒子の少なくと
も一相に溶解させることにより、粒子内に組み込むこと
ができ、この場合、溶質は、大量アッセイ媒体中よりも
高い濃度で、粒子内にある。
別法として、光増感剤および光活性インジケーター前
駆体のいずれかまたは両方を、結合される成分に連結官
能基を与えるか、または粒子を含むポリマー内に光増感
剤または光活性インジケーター前駆体を組み込むかのい
ずれかによって、粒子に共有結合させることができる。
粒子が油滴またはリポソームである場合、光増感剤およ
び光活性インジケーター前駆体を、１またはそれ以上
の、それぞれ一般に少なくとも10ないし30の炭素原子を
有する長鎖炭化水素に結合させることができる。粒子が
フルオロカーボンの油滴である場合、これらの粒子に組
み込まれた光増感剤または光活性インジケーター前駆体
をフッ素化して溶解性を高め、他の標識と結合した他の
粒子内へ入れ換わるのを低減することができ、また、好
ましくは連結のために使用した炭化水素鎖を、フルオロ
カーボン鎖に換える。シリコン液粒子の場合は、光増感
剤および光活性インジケーター前駆体をポリシロキサン
に結合させることができる。１粒子当たりの光増感剤ま
たは光活性インジケーター前駆体の数を最大にするため
に、普通は、光増感剤または光活性インジケーター前駆
体が粒子の非水性部内に残るように、その電荷および極
性を最小にすることが望まれる。粒子がリポソームであ
り、光増感剤または光活性インジケーター前駆体がリポ
ソームの水性相に保持されることを望む場合は、極性が
高いか、または荷電している光増感剤または光活性イン
ジケーター前駆体を使用することが好ましい。
光増感剤および光活性インジケーター前駆体がそれら
のそれぞれのsbp構成員とどのように結合しようとも、
どちらの化合物も、アッセイ過程中にそのsbp構成員か
ら解離することができず、また、他の光増感剤および光
活性インジケーター前駆体対構成員と結合したsbp構成
員とは結合できないことが重要である。従って、これら
の化合物類のそれらのそれぞれのsbp構成員からの解離
は、アッセイに必要な時間に比べて短くなければならな
い。
光活性インジケーター前駆体は、分析物に、またはそ
の濃度が分析物の存在によって影響されるアッセイ成分
に、直接的または間接的に、結合する能力があるsbp構
成員に結合する場合もある。“直接的または間接的に、
結合する能力がある”という用語は、所定のものが、そ
のものに特異的に結合できる（直接的に）か、または他
のものに結合できる特異的結合対構成員または２または
それ以上のsbp構成員の複合体に特異的に結合できる
（間接的に）ことを意味する。
一般に、表面は、それに結合しているsbp構成員を有
する。好ましくは、光活性インジケーター前駆体は、普
通は懸濁可能な粒子内の、表面と結合する。このsbp構
成員は、一般に、分析物に、または分析物の受容体に、
直接的または間接的に、結合する能力がある。光増感剤
および光活性インジケーター前駆体に結合しているsbp
構成員が、いずれも分析物と結合する能力がある場合
は、サンドイッチアッセイプロトコールを用いることが
できる。光増感剤または光活性インジケーター前駆体と
結合しているsbp構成員の１つが、分析物と分析物類似
体の両方に結合できる場合は、競合アッセイプロトコー
ルを用いることができる。光活性インジケーター前駆体
の表面への結合、または粒子内組み込みは、一般に、光
増感剤の粒子への結合、または組み込みの所で記載した
のと同一の原理によって左右されるものである。
光増感剤は、普通、光活性インジケーター前駆体を、
これらの反応物を含有する媒体に光を照射することによ
り、活性化させるものである。光活性インジケーター前
駆体を光で励起させるのが望ましくない場合が多いた
め、光増感剤を活性化するために使用する光の波長は、
実質的に光活性インジケーター前駆体により吸収される
最長波長よりも長いものである。しかしながら、この媒
体には、光増感剤を励起状態に転換させ、それによって
分子酸素を一重項酸素へと活性化できるようにさせるに
十分なエネルギーを有する十分に短い波長を照射しなけ
ればならない。分子酸素を励起させることができる光増
感剤の励起状態は、一般に、光増感剤の基底状態よりも
エネルギーの高い約20Kcal/mol以上、普通は、少なくと
も23Kcal/molである三重項状態である。好ましくは、媒
体に、約450ないし950nmの波長を有する光を照射する
が、より短い波長、例えば、230ないし950nmを使用する
こともでき、また、二光子励起を与えるために十分に強
い光を与えることにより、2000nmまでのより長い波長を
使用することもできる。
普通は、光増感剤に能率良く吸収される波長の光を照
射することにより、光増感剤を励起させるのが好ましい
が、他の励起手段、例えば、エネルギー供与体の励起状
態からのエネルギー伝達を用いることもできる。エネル
ギー供与体を用いる場合は、光の波長は、光増感剤には
能率良く吸収されないが、エネルギー供与体には能率良
く吸収されるようなものを使用できる。エネルギー供与
体は、光増感剤と結合するかまたは結合するようになる
アッセイ成分に結合することができ、例えば、表面に結
合するか、光増感剤を有する粒子に組み込まれる。エネ
ルギー供与体を用いるとき、その最低エネルギー一重項
および／または三重項状態は、それぞれ、普通、光増感
剤の最低エネルギー一重項および／または三重項状態よ
りも高いエネルギーのものである。
こうして生成された一重項酸素は、光活性インジケー
ター前駆体と反応して、蛍光物質である光活性インジケ
ーターを生成する。生じた光活性インジケーターの蛍光
は、光活性インジケーターの電子励起の後に検出され得
る。通常は、電磁放射、好ましくは光を用いて、光活性
インジケーターを励起させるが、他の手段、例えば、化
学励起が上記一重項酸素反応と別個であるときは、化学
励起などにより励起されている分子からのエネルギー伝
達も使用できる。光活性インジケーターを励起させるの
に使用する光の波長は、光増感剤を励起させるのに使用
する光の波長と同一でもよく、また異なっていてもよ
い。普通は、光活性インジケーターにより放出される光
が、光増感剤の蛍光よりも短い波長であるのが好まし
い。従って、好ましくは、光増感剤が蛍光物質であると
き、光活性インジケーターを励起させるのに使用する光
は、光増感剤を活性化するのに使用するものよりも短い
波長であり、普通は、少なくとも50nm短く、好ましく
は、少なくとも200nm短いものである。励起した光活性
インジケーターから放出される蛍光は、それらの量を測
定するための写真的、可視的、または測定的常法によっ
て測定でき、これは、媒体中の分析物量と相関してい
る。
光増感剤の照射および光活性インジケーターの励起
は、同時に実施できるが、好ましくは、光増感剤を励起
させるのに使用する光が蛍光測定と干渉しないように連
続的に実施する。光活性インジケーター前駆体は、実質
的に、一重項酸素を産生するのに使用する波長で光を吸
収してはならず、従って、普通は、光増感剤よりも短い
波長で吸収する。加えて、光活性インジケーター前駆体
は、光活性インジケーターを励起させるのに必要な波長
で顕著に吸収しないのが好ましく、従って、普通は、光
活性インジケーターよりも短い波長で吸収する。
本発明の方法および組成物類は、リガンド−受容体な
どのsbp構成員に関係する殆どのアッセイ、例えば、抗
原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合アッセイ、その
他、に適用できる。これらのアッセイは、均一系または
非均一系、競合的または非競合的であってよい。アッセ
イ成分、光活性インジケーター前駆体、および光増感剤
は、多くの方法で、受容体、リガンド、または、採用す
るならば、表面に結合（アソシエート）することができ
る。その結合は、共有または非共有結合を含み得る。当
業者ならば、上記、および下記に例示の説明から望まし
い特定のアッセイによって変わる適切な結合を選択でき
る。
試料は、必要ならば、不要物質を除去するために前処
理してもよい。非競合的サンドイッチ型アッセイの反応
は、分析物に相補的で、かつ光活性インジケーター前駆
体に結合しているsbp構成員（例えば、抗体、ポリヌク
レオチドプローブ、受容体、またはリガンド）；分析物
に相補的であるsbp構成員（例えば、抗体、ポリヌクレ
オチドプローブ、受容体、またはリガンド）に結合する
光増感剤；対象となる試料；および必要な補助試薬を含
む。競合的プロトコールでは、１方のsbp構成員は、分
析物の誘導体であることができ、他方のsbp構成員は、
分析物と相補的、例えば、抗体であることができる。い
ずれのプロトコールにおいても、その成分は、同時に、
または全体にまたは部分的に連続して、合わせることが
できる。活性化した光増感剤により産生された一重項酸
素が、光活性インジケーター前駆体と反応して光活性イ
ンジケーターを生成する能力は、sbp構成員が分析物に
結合することによって左右される。よって、分析物の存
在または量は、照射により生じた光活性インジケーター
を活性化させると放出される光の量を測定することによ
り、測定できる。結合反応、およびその度合いの検出の
両方を、分離することなく均一溶液中で実施することが
でき、好ましくは、光増感剤および光活性インジケータ
ー前駆体の一方または両方を、sbp構成員が結合してい
る粒子に組み込む。これが、化学発光を利用する従来技
術法を越える本発明の利点である。
不均一系アッセイプロトコールでは、sbp構成員の一
方を、それをアッセイ媒体から分離するために設けた支
持体、または他の手段に結合させることが多い。支持体
は、非分散性表面、または粒子のいずれかであることが
できる。一実施態様では、その支持体または粒子は、そ
れと結合している光活性インジケーター前駆体および光
増感剤から成る群の一構成員を有する。もう一方のsbp
構成員は、それと結合する群の他の一構成員を有するも
のであり、そのsbp構成員は、独立して、直接的または
間接的に、分析物または分析物の受容体に結合できる。
これらの成分は、一般に、同時に、または全体にまたは
部分的に連続して、合わせる。次いで、粒子の表面を液
相から分離し、いずれかを、普通は分離した相を照射す
ることにより、光増感剤および生じた光活性インジケー
ターを活性化する条件にかけて放出された蛍光量を測定
する。
これとは別に、本発明の不均一系アッセイは、第1sbp
構成員を液体アッセイ媒体から分離するための表面のよ
うな手段を提供し、さらに、光増感剤と結合しており、
かつ媒体中の分析物量の関数として第1sbp構成員に結合
する第2sbp構成員を提供することにより実施できる。次
いで、分析物を含有する疑いのある試料を第１および第
2sbp構成員と、同時に、または全体にまたは部分的に連
続して合わせ、そして第1sbp構成員を媒体から分離す
る。その後、光活性インジケーター前駆体と結合してい
る第3sbp構成員を、分離した第1sbp構成員と合わせる
が、ここで第3sbp構成員は、第2sbp構成員に、直接的ま
たは間接的に結合する能力がある。次いで、その合わせ
たものを照射し、光増感剤を活性化して、生じた光活性
インジケーターの蛍光を測定する。
分析物のアッセイにおける結合反応は、通常、一般に
最適アッセイ感度を与える穏やかなpHで水性媒体中で行
うものである。好ましくは、光増感剤の活性化も水性媒
体中で行う。しかしながら、分離工程を採用する場合、
例えば、アセトニトリル、アセトン、トルエン、ベンゾ
ニトリル、等のような非水性媒体、および非常に高い、
即ち10.0以上のpH値、または非常に低い、即ち4.0以下
のpH値を持つ、好ましくは非常に高いpH値を持つ水性媒
体を使用できる。上記に説明した通り、このアッセイ
は、アッセイ成分または生成物を分離しない（均一系）
か、または分離する（不均一系）かのいずれかで実施で
きる。
水性媒体は、水だけであってもよく、または、0.01か
ら80容量パーセントの共溶媒を含んでいてもよいが、タ
ンパク質であるsbp構成員を使用する場合は、普通40％
以下の共溶媒を含む。結合反応の媒体のpHは、普通、約
４ないし11の範囲であり、より普通には、約５ないし10
の範囲、好ましくは約6.5ないし9.5の範囲である。この
pHは、普通、結合構成員が最適に結合するpHとシグナル
産生およびアッセイのその他の試薬の安定性に最適なpH
との中間である。普通、シグナル産生には、pH変化は何
ら必要ではないが、所望ならば、酸または塩基試薬を添
加する工程を結合反応と一重項酸素の産生および／また
はシグナル生成の間に挿入できる。普通、均一系アッセ
イにおいては、最終pHは、５ないし13の範囲である。不
均一系アッセイの場合、上記のとおり、非水性媒体を使
用することもでき、主に溶媒が一重項酸素と能率良く反
応しないことを考慮すればよい。
所望のpHを達成し、そのpHをアッセイ中維持するため
に、様々な緩衝液を使用できる。緩衝液の例には、ボレ
ート、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール、およ
び同種物がある。採用した特定の緩衝液が本発明に対し
て絶対的なのではなく、個々のアッセイにおいて１つま
たはもう１つの緩衝液が好まれ得る。
アッセイにおいてタンパク質性リガンドや受容体の結
合反応を実施する場合、通常は、穏やかな温度が採用さ
れ、普通、測定期間中一定温度、好ましくは25℃ないし
40℃である。結合反応のためのインキュベーション温度
は、通常、約５℃から45℃、普通は、約15℃から40℃、
より普通には、25℃ないし40℃の範囲である。アッセイ
中に核酸の結合が起こる場合は、より高い温度、普通
は、20℃ないし90℃、より普通には、35℃ないし75℃を
使用することが多い。測定中、即ち、一重項酸素の産生
および光検出中の温度は、一般に、約20℃から100℃、
より普通には、約25℃から50℃、より普通には、25℃な
いし40℃の範囲である。
アッセイすることができる分析物の濃度は、一般に、
約10-4から10-16M未満、より普通には、約10-6から10
-14Mの範囲で変わる。アッセイが定性的、半定量的、ま
たは定量的である場合、普通は特定の検出技術、対象と
なる分析物の濃度、最大所望インキュベーション時間な
どを考察することによって様々な試薬の濃度を決定す
る。
競合的アッセイでは、一般に、アッセイ媒体中の様々
な試薬の濃度は、対象となる分析物の濃度範囲により決
定され、各試薬の最終濃度は、通常、その範囲でアッセ
イ感度が最大になるように経験的に決定される。即ち、
重要である分析物の濃度のバリエーションが、正確に測
定可能なシグナル差を与えるべきである。
sbp構成員の濃度は、分析物濃度、所望の結合速度、
およびsbp構成員が非特異的に結合する度合によって変
わるものである。普通、sbp構成員は、少なくとも予想
される最低の分析物濃度、好ましくは、少なくとも予想
される最高分析物濃度で存在するものであり、非競合的
アッセイの場合、その濃度は、最高分析物濃度の10ない
し106倍であることができるが、普通は、10-4M以下、好
ましくは106M以下、頻繁には、10-11と10-7Mの間であ
る。sbp構成員と結合している光増感剤または光活性イ
ンジケーター前駆体の量は、普通、少なくとも1sbp構成
員当たり１モルであり、光増感剤または光活性インジケ
ーター前駆体分子が粒子に組み込まれている場合は、10
5と高いこともあり、普通は、少なくとも10ないし104で
ある。
添加順序は、広範囲に変わり得るが、アッセイの性質
に依存するある優先順位がある。最も簡易な添加順序
は、材料全てを同時に加えることである。別法として、
試薬類を、全体にまたは部分的に連続して、合わせるこ
とができる。アッセイが競合的である場合、しばしば、
試料および分析物に結合する能力のあるsbp構成員を合
わせた後に、分析物類似体を加えることが望まれる。所
望により、インキュベーション工程を、試薬を合わせた
後、一般には、約30秒から６時間の範囲、より普通に
は、約２分から１時間後に行う場合もあり、その後、光
増感剤に一重項酸素を産生させ、光活性インジケーター
に蛍光を発生させる。
特に好ましい添加順序においては、分析物と相補的お
よび／または同族的であるsbp構成員の第一セットを、
分析物と合わせ、ついで第１特異的結合対構成員と相補
的な特異的結合対構成員を添加するが、それらはいずれ
も光増感剤および光活性インジケーター前駆体よりなる
群の異なる構成員と結合しているものである。このアッ
セイ混合物、またはその分離されたコンポネントは、ま
ず照射して一重項酸素を産生させ、それから後に測定可
能な蛍光を生成させる。
均一系アッセイでは、すべての試薬を合わせた後、必
要ならインキュベートできる。それから、組み合わせ物
を照射（必要な波長の光で）し、生成する放出された蛍
光を測定する。放出された蛍光は試験した試料中の分析
物の量と相関する。不均一系アッセイで採用される本発
明の試薬の量は、分析物の性質によって変わる。一般
に、本発明の均一系アッセイは、既知のアッセイ、例え
ばEMIT（登録商標）アッセイより高い感度を示す。この
利点は、第一に本発明の方法において得られる、ノイズ
比率の改善されたシグナルによるものである。
以下のアッセイは、当業者に本発明の範囲を理解せし
め、過重な実験を経ることなく実施できるようにするた
めの例示説明のために示すものであって限定するもので
はない。分析物、光増感剤、光活性インジケーター前駆
体、各表面、粒子類、および反応条件の選択は、以下の
実施例における開示により当業者には示唆されているこ
とが理解されるであろう。
本発明のある実施態様では、下記一般式（I m）： の光活性インジケーター前駆体が、ヒト絨毛性ゴナドト
ロピン（HCG）に対する抗体と共有結合して試薬１を与
える。この光活性インジケーター前駆体は、カルボキシ
ル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで官能
性をもたせ、抗体のアミノ基と反応させる。連結基はカ
ルボキサミドである。用いる光増感剤はローズベンガル
であるが、それは大きさが平均0.5ミクロンのラテック
ス粒子に共有結合しているものである。このラテックス
粒子とローズベンガルは、ジャーナル・オブ・アメリカ
ン・ケミカル・ソサイエティ97巻:3741（1975）に記載
されているように、ラテックス粒子上でクロロメチル基
の手段により、互いに共有結合してエステル連結基を与
える。ラテックス粒子はさらに、ラテックス上でＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミジルエステル基の手段によりHCG
に対する第２抗体に連結され、試薬２を与える。使用し
た両抗体は、標準ハイブリッド・セルライン技術によっ
て調製されたモノクローナル抗体である。ある抗体はHC
Gのαサブユニットを認識し、他のものはHCGのβサブユ
ニットを認識する。アッセイを進めるに際し、HCGの含
有が疑われる血清試料を患者から得る。試薬の50マイク
ロリットルを、トリス緩衝液でpH8.0に緩衝化した500マ
イクロリットルの水性媒体中で、上記試薬１および試薬
２と合わせる。試薬１と試薬２の量は、各抗体の濃度が
約10-9モルとなるのに十分な量とする。反応混合物を次
いで25℃に１時間インキュベートし、それから30分間56
0nmの光を照射する。次に、溶液の蛍光を350nmで照射し
440nmで検出して測定し、同様の操作で既知濃度をHCGを
含有する試料について得た値と比較し、未知の試料のHC
G濃度を測定する。
上記に基づく別のやり方では、試薬２は第２抗体に共
有結合したローズベンガルであり、ラテックス粒子は使
用しない。上記に基づくさらに別のやり方では、試薬２
は第２抗体に共有結合したローズベンガルであり、試薬
１は、第１抗体が共有結合しているラテックス粒子に共
有結合した光活性インジケーター前駆体である。上記に
基づくさらに別のやり方では、試薬１は直前に記載した
とおりのものであり、試薬２は、アビジンが共有結合し
ているラテックス粒子に共有結合したローズベンガルで
あり、そしてビオチンに共有結合している第２抗体であ
る３番目の試薬（試薬2A）が用いられる。試薬１と３番
目の試薬を試料と合わせ、インキュベートする。そし
て、過剰の試薬２を加えるが、残りの操作は上記と同様
である。
本発明の他の実施態様では、油滴（試薬３）の第１セ
ットを光増感剤とクロロフィルの鉱物油溶液から、前記
ジェーバーに従って調製する。油滴、直径0.1から２ミ
クロンの範囲内のもの、をＣ−反応性タンパク質（CR
P）に対するモノクローナル抗体に結合している機能化
された表面活性剤で被覆する。クロロフィルは親油性で
あり、それ故親油性油滴中に溶解する。油滴（試薬４）
の第２セットも同様にして調製する。この油滴セットで
は、油滴はCRPに対する第２モノクローナル抗体、それ
は上記した第１モノクローナル抗体で認識されるものと
は異なるCRP分子の部分を認識するものである、で同様
に被覆する。９−ベンザルー10−メチルアクリジンは、
アクリジンのフェニール基の一つに結合したN,N−ジド
デシルカルボキサミド基を導入することにより、親油性
油滴中に非可逆的に溶解する。モノクローナル抗体は、
標準ハイブリッドセルライン技術によって調製する。CR
P（50マイクロリットル）の含有が疑われる血清試料
を、緩衝化水性媒体（500μＬ）中、pH7.5で試薬３およ
び試薬４の過剰量と合わせる。この媒体を分離すること
なく、633nmでHe/Neレーザーを用いて20分間照射し、溶
液の蛍光を、360nmで照射し440nmで放出された光を検出
することにより、測定した。蛍光の強さを、既知量のCR
Pを含有する試料から得られたものと比較し、数値を比
較して未知試料中のCRP量を測定した。このようにし
て、便利で感度のよい均一系CRPのイムノアッセイが行
われる。
上記に基づく別のやり方では、試薬３はCRPに対する
抗体の代わりにフルオレセインに対する抗体を有し、付
加的試薬（試薬3A）がフルオレセインに結合したCRP抗
体を有する。試薬４は第2CRP抗体の代わりにアビジンを
有し、４番目の試薬（試薬4A）はビオチンに共有結合し
ている第２抗体を有する。このアッセイでは、試薬4Aと
試薬3Aを試料と合わせ、インキュベートする。それか
ら、試薬３および４を加え、インキュベートする。次い
で、前記同様にしてアッセイ操作の残部を実施する。
本発明の他の実施態様では、リポソーム（試薬５）
（直径0.2ミクロン）の１セットを、その目的に設計さ
れた市販機器を用い、pH7.4の緩衝液中でリン脂質懸濁
液を、0.2ミクロンの多孔性膜を通して高圧押出して形
成する。チロキシン同族体は、リポソーム上に最初に形
成されるメルカプトアセトアミド基により、リポソーム
中でフォスファチジルエタノールアミンとメチルカルボ
キシメチルジスルフィドＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルとの反応、次いでジチオエリスリトールとの反
応により、リポソームと共有結合させる。ブロモアセチ
ルチロキシンは、次いでスルフヒドリル化リポソームと
反応させる。メタロ−ポルフィリン染料はリポソームの
親油性部分中に溶解させる。他のリポソームセット（試
薬６）は、チロキシンに対するモノクローナル抗体と結
合させるのに用いる。この抗体は、チロキシンの結合と
同様の手段で共有結合する。下記構造式： の光活性インジケーター前駆体は、カルボキサミド連結
基の手段でリポソーム表面に共有結合する。試薬５およ
び試薬６は、pH8.0に緩衝化した水性アッセイ媒体（500
μＬ）中で、チロキシンの含有が疑われる血清試料とと
もに合わせるが、この試料は下記構造式： のチロキシン解離因子を、結合タンパク質（50マイクロ
リットル）からチロキシンを引き離すために含有してい
るものである。アッセイ媒体は、次いで室温で１時間イ
ンキュベートする。媒体を650nmで１分間照射し、蛍光
を前記各例と同様に測定する。得られた値を既知量のチ
ロキシンについて同様にアッセイを行って得た値と比較
する。このようにして、血清試料中のチロキシン量を定
量する。
上記に基づく別のやり方では、試薬６はチロキシンに
対する抗体の大わりにアビジンを有する。付加的試薬
（試薬6A）はビオチンに共有結合しているチロキシンに
対する抗体を有する。試薬５はチロキシンの代わりにフ
ルオレセインに対する抗体を有し、付加的試薬（試薬5
A）はフルオレセインに共有結合しているチロキシンを
有する。アッセイにおいて、試薬5Aおよび試薬6Aは、試
料と合わせてインキュベートする。それから、試薬５お
よび６を加え、混合物をインキュベートし、さらにアッ
セイ操作の残部を続ける。
別の実施態様では、グリブノーにより記載されたのと
同様の方法で、２−ヒドロキシ−9,10−ジブロモ−アン
トラセンが、染料クリスタライト中に形成される。Ｂ型
肝炎RNAの配列を認識する25量体オリゴヌクレオチドプ
ローブをカルバメート連結基により染料クリスタライト
に共有結合させる。Ｂ型肝炎RNAに対する第２の25量体
オリゴヌクレオチドプローブをアミド連結基により９−
（ベンザル−9H−キサンテン）に共有結合させる。染料
クリスタライトは、平均で粒子サイズ２ミクロンを有す
る。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、標準自動合成
技術により調製する。Ｂ型肝炎を有する疑いのある患者
由来の試料（50μｌ）を、水性アッセイ媒体（500μ
ｌ）中pH7.0で過剰の染料クリスタライトおよび上記第
２プローブと合わせる。次いで、アッセイ媒体を50℃で
30分間インキュベートし、その後、330nmで照射し、390
nmで検出することによって蛍光を測定する。Ｂ型肝炎RN
Aが試料中に存在すると、それぞれのオリゴヌクレオチ
ドがRNAと結合するため、染料クリスタライトと９−
（ベンザル−9H−キサンテン）が極めて近接するように
なる。媒体を照射すると、9,10−ジブロモアントラセン
が励起され、基底状態酸素が一重項酸素に転換する。一
重項酸素がキサンテンと反応して、蛍光物質であるキサ
ントンを生成する。蛍光を光度計により測定し、ある域
値レベルを越える光の量により、試料中にＢ型肝炎RNA
が存在することが示される。媒体の照射を室温で行い、
このアッセイを均一系手法で行って、Ｂ型肝炎RNAのア
ッセイを得る。
また別の実施態様では、そのアッセイは、赤血球表面
の特定の血液型抗原、即ち、Ａ型抗原を測定するための
ものである。上記の通り調製した粒子サイズ150ないし5
00nmを有するラテックス粒子を有する。ラテックス粒子
は、ラテックス粒子に共有結合している、Ａ型抗原に対
する抗体を有する。粒子は、式（I f）： の光活性インジケーター前駆体を有し、これは、ラテッ
クスに溶解している。このラテックス粒子試薬を水性媒
体（500μｌ）中で全血液（100μｌ）および１×10-4M
の光増感剤、これは、下式： の疎水性染料である、と合わせる。この疎水性染料は、
試料中に存在する赤血球中に組み込まれる。媒体を25℃
で10分間インキュベートし、次いで、タングステン源を
用いて＞650nmで30秒間照射する。その後、360nmで照射
し、440nmで検出することにより、溶液の蛍光を測定す
る。媒体から放出された光を測定し、Ａ型抗原赤血球細
胞のないことが分かっている試料で得られた光の量と比
較する。こうして、域値レベルを越える光の量により、
Ａ型血液抗原の存在が示される。
本発明は、更に、光活性インジケーター前駆体を含む
平均直径25ないし4000ナノメーターの懸濁可能な粒子を
含む組成物を包含する。光活性インジケーター前駆体
は、粒子マトクリックスに共有結合することができる
か、またはマトリックスに溶解するかまたはマトリック
スに溶解している溶媒に溶解することができる。この粒
子は、好ましくは、ポリマー性であるか、または油滴ま
たはリポソームなどの小胞である。粒子がリポソームで
ある場合、光活性インジケーター前駆体は、脂質二重層
に結合しているか、またはリポソームの水性内部に溶解
している。お互いに結合する２つの相補的なsbp構成
員、ただし一方が光増感剤に結合し、もう一方が光活性
インジケーター前駆体に結合している、を含む組成物も
また包含する。
本発明の他の態様は、分析物を含有する疑いのある試
料中の分析物の存在または量を測定する本発明のアッセ
イ法を好便に実施するのに有用なキットに関連する。対
象となる発明の使用用途を増大するために、試薬類を、
試薬の比率がその方法およびアッセイを実質的に最適化
するように、同じかまたは別の容器に入れてパッケージ
した組み合わせ物内に用意することができる。この試薬
類は、それぞれ、別の容器中に入れてもよく、または、
試薬の交差反応性および安定性によって変わるが、様々
な試薬を１またはそれ以上の容器に合わせて入れてもよ
い。キットは、（１）光活性インジケーター前駆体を含
む懸濁可能な粒子であって、自身に結合しているsbp構
成員を有する粒子を含む組成物、および（２）光増感剤
を含んで成る。光増感剤は、sbp構成員に結合すること
ができるか、またはsbp構成員が結合している粒子に結
合することができる。キットは、さらに、補助試薬、お
よびその他を含むアッセイを行うために別個にパッケー
ジした他の試薬を含む。
本発明に従うキットの他の実施態様は、パッケージし
た組み合わせ中に、第1sbp構成員と結合している光活性
インジケーター前駆体、および第2sbp構成員に結合して
いる、その励起状態で酸素をその一重項状態に活性する
能力のある光増感剤を含む。
実施例 下記例示の実施例により、本発明を更に説明する。本
明細書に使用した、部およびパーセントは、特記しない
限り、重量によるものである。温度は、セ氏温度（℃）
である。下記略語を実施例において使用している： “アミノ−GATTAG"−下記に示した配列： を有し、5'未満に、下記： に例示したとおり置換されたヌクレオチド（クロンテ
ック・ラボラトリーズ、ナンバー5202−１）を持つ、修
飾化42量体オリゴヌクレオチド。
“ビオチン−30量体”−下記に示した配列： を有し、5'末端に、下記に示した連結基： により、修飾化シトシン（５−メチルシトシン）と結
合したビオチンを持つ、修飾化30量体オリゴヌクレオチ
ド。
“CTAATC−30量体”−下記に示した配列： を有する、修飾化テール化（tailed）30量体オリゴヌ
クレオチド。
“DMF"−ジメチルホルムアミド。
“EDAC"−１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノプ
ロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド。
“EDTA"−エチレンジアミンテトラ酢酸。
“GATTAG−SH"−下記に示した配列： を有し、下記： に例示したとおり置換された5'末端ヌクレオチドを持
つ、修飾化42量体オリゴヌクレオチド。
“MES"−２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸。
“SPDP"−Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチ
オ）−プロピオネート。
“スルホ−SMCC"−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート。
“TCEP"−トリス−カルボキシエチルホスフィン。
“THF"−テトラヒドロフラン。
実施例１ 光活性インジケーター前駆体の調製 A. 酢酸エチル（150ml）中クマリン−１（11.0g、47.5ミ
リモル）の溶液をパール式容器（parr bottle）中10％P
d/C（100mg）で処理した。次いで、懸濁液を80psi、80
℃で６時間水素化した。懸濁液をセライトベッドを通し
て濾過し、Pd/Cを除去して、セライトベッドを温酢酸エ
チル（100ml）で洗浄した。濾液を濃縮し、真空下で乾
燥して、3,4−ジヒドロクマリン（２）11.0g（100％）
を油状物として得た。
1H−NMR（CDCl3、250MHz）：δ7.02（d,J＝8.5Hz,1
H）;6.42（dd,J＝8.5Hz,1.7Hz,1H）;6.35（d,J＝1.7Hz,
1H）;4.07（q,J＝7.0Hz,4H）;3.06（m,1H）;2.80（dd,J
gem＝15.6Hz,Jvic＝5.4Hz,1H）;2.51（dd,Jgem＝15.6H
z,Jvic＝7.7Hz,1H）;1.28（d,J＝7.0Hz,3H）;1.15（t,J
＝7.0Hz,6H）； MS（EI）C14H19NO2としての計算値233:実測値233
（M+,40％）;218（M+−CH3,100％）。
無水THF（20ml）中、3,4−ジヒドロクマリン２（1.68
g、7.20ミリモル）の溶液をアルゴン下−78℃まで冷却
した。この撹拌溶液にTHF中リチウムジイソプロピルア
ミド（1.0M中の8.0ml、8.0ミリモル）を加え、生じた黄
色の溶液を更に１時間撹拌した。続いて、THF（10ml）
に溶解したフェニルセレニルクロリド（1.50g、7.8ミリ
モル）をエノレート溶液に加えた。混合物のオレンジ色
が素早く消えて、黄色溶液が得られた。この溶液を３時
間撹拌し、水性NH4Cl（１％の10ml）で反応を止めた。
約10分後、ジクロロメタン（100ml）を加え、有機相を
分離した。更に、水性部はCH2Cl2（２×20ml）で抽出
し、有機部は集め合わせた。集め合わせた有機部を塩水
（20ml）で洗浄し、無水Na2SO4（25g）で乾燥し、濃縮
して、黄色油状物2.10gを得た。油状物を、ジクロロメ
タン中ヘキサンの勾配を用いるシリカゲルクロマトグラ
フィーにより精製して、クマリン−３−フェニルセレニ
ド３を白色粉末として、1.80g（67％）得た。熱ヘキサ
ンからの結晶化により、３を白色針状物、融点99−101
℃として1.30g得た。
1H−NMR（C6D6,250MHz）δ7.65（m,2H）;6.92（m,3
H）;6.74（d,J＝8.0Hz,1H）;6.38（d,J＝1.5Hz,1H）;6.
25（dd,J＝8.0Hz,1.5Hz,1H）;3.88（d,J＝2Hz,1H）;3.0
2（m,1H）;2.84（q,J＝7.0Hz,4H）;0.96（d,J＝7.0Hz,3
H）;0.80（t,J＝7.0Hz,6H）； MS（EI）C20H23NO2Seとしての計算値389:実測値389
（M+,100％）;232（M+−C6H5Se,70％）;218（60％）;20
2（45％）； UV−Vis（トルエン）300nm（4600）;310nm（4600）;3
30nm（2100） 実施例２ 光活性インジケーター前駆体の調製 A. 乾燥THF（150ml）中、テルリウム粉末（100メッシ
ュ、13.0g、0.10モル）の撹拌懸濁液に、エーテル−ヘ
キサン中、フェニルリチウム（1.8Mの60ml、0.10モル）
の溶液を加えた。懸濁液を室温で２時間撹拌し、次い
で、１時間還流した。懸濁液を冷まし、水（100ml）を
加え、その後一晩撹拌した。この懸濁液に酸素ガスを３
時間泡立たせた。塩化メチレン（200ml）を加え、有機
相を分離した。更に、水相はCH2Cl2（２×100ml）で抽
出し、集め合わせたものを塩水（100ml）で洗浄し、無
水Na2SO4で乾燥させた。乾燥させた溶液をシリカ（300
g）の栓に通し；そうして得られた濾液を濃縮して、熱
エタノールから結晶化して、ジフェニルジテルライド４
を橙赤色針状物、融点63−65℃（文献値63.5−65℃）と
して、13.2g得た。
MS（EI）C12H10Te2としての計算値414:実測値414（25
％）;412（45％）;410（50％）;408（40％）;207（40
％）。
ジフェニルジテルライド４（1.0g、2.5ミリモル）をT
HF（10.0ml）に溶解し、０℃まで冷却した。THF（5.0m
l）中臭素（125μｌ、2.5ミリモル）を加え、溶液を０
℃で１時間撹拌し、室温に到達させた。反応混合物を、
出発物質が分析用薄層クロマトグラフィーによりもはや
検出されなくなるまで、室温で撹拌し、化合物５を得
た。
B. 無水THF（10ml）中、3,4−ジヒドロクマリン（240m
g、1.0ミリモル）の溶液をアルゴン下−78℃まで冷却し
た。THF中リチウムジイソプロピルアミド（1.0Mの1.1m
l、1.1ミリモル）を加え、この溶液を−78℃で１時間撹
拌した。THF中５の溶液（３ミリモル、上記のようにし
て調製したもの）をエノール酸エステルにカニューレで
挿入し、この混合物を−78℃で２時間撹拌し、室温まで
到達させた。この反応混合物を水性NH4Cl（１％、5ml）
を用いて反応を止め、更に５分間撹拌した。次いで、反
応混合物をCH2Cl2（3.25ml）で抽出し、集め合わせた有
機部を塩水（20ml）で洗浄し、無水Na2SO4（20g）で乾
燥させた。濃縮後、CH2Cl2を用いる（やわらかな光の下
での）シリカフラッシュクロマトグラフィーにより、黄
色油状物190mg（43％）を得た。シクロヘキサンから結
晶化して、クマリンテルライド６を明黄色固体として、
165mg得た。
1H−NMR（CDCl3,250MHz）δ7.82（dd,J＝7.0Hz,1.2H
z,2H）;7.31（m,1H）;7.26（m,2H）;6.91（d,J＝8.5Hz,
1H）;6.38（dd,J＝8.5Hz,2.5Hz,1H）;6.25（d,J＝2.5H
z,1H）;4.05（d,2.0Hz,1H）;3.33（q,J＝7.0Hz,4H）;3.
25（m,1H）;1.23（d,J＝7.0Hz,3H）;1.16（t,J＝7.0Hz,
6H）； MS（EI）C20H23NO2Teとしての計算値439（130Teを用
いる）実測値:439（M+、20％）;232（M+−C6H5Te、100
％）;217（25％）;202（35％）； UV−Vis（トルエン）310nm（3860）;330nm（2400）;3
70nm（510）。
実施例３ 光活性インジケーター前駆体の調製 A. 無水THF（200ml）中、ｐ−ブロモ−N,N−ジメチルア
ニリン（10.0g、50.0ミリモル）の溶液をアルゴン下−7
8℃まで冷却した。この冷却溶液に、ペンタン中ｔ−ブ
チルリチウム（1.8Mの56ml、100ミリモル）を注意深く
加え、生じた黄色懸濁液を−78℃で１時間撹拌した。微
細に砕いたテルリウム粉末（6.50g、50ミリモル）をア
ルゴン流下で加えた。次いで、反応混合物を室温に到達
させ、その時間までに（〜２時間）、ほとんどのテルリ
ウムは溶解した。反応混合物を水（20ml）で反応を止
め、水性K3［Fe（CN）６］溶液（200ml中17g、0.052モ
ル）に注いだ。混合物を１時間撹拌し、次いで、CH2Cl2
（３×200ml）で抽出した。集め合わせた有機部を塩水
（100ml）で洗浄し、無水Na2SO4（100g）で乾燥させ
た。乾燥させた物質をシリカ（300g）の栓に通し、濾液
を濃縮して、橙赤色ペースト12.2gを得た。エタノール
から結晶化して、ジテルライド７を橙赤色粉末として8.
6g得た。もう一方のバッチ（2.2g）を母液から回収し
た。
MS（EI）C16H20N2Te2としての計算値500:実測値500
（20％）;498（40％）;496（45％）;250（100％）;240
（98％）。
このジテルライド７（1.70g、3.4ミルモル）を最少量
の無水THFに溶解し、０℃まで冷却した。溶液を臭素（1
75μｌ、3.4ミリモル）で処理し、混合物を０℃で３時
間撹拌し、所望の生成物８を含有する溶液を得た。
B. 次いで、生成物８をアルゴン下、THF中ジヒドロクマ
リン２（800mg、3.4ミリモル）およびリチウムジイソプ
ロピルアミド（1.0Mの3.5ml、3.5ミリモル）の溶液にカ
ニューレで挿入した。得られた橙赤色混合物を室温に到
達させ、水性NH4Cl（1.0％の10ml）で反応を止めた。続
いて、混合物をCH2Cl2（３×50ml）で抽出し、集めた有
機部を塩水（50ml）および無水Na2SO4で乾燥させた。濃
縮し、その後、CH2Cl2を用いる（やわらかい光の下で
の）シリカフラッシュクロマトグラフィーにより、クマ
リン３−（４−ジメチルアミノ）フェニルテルライド９
の510mgを、出発物質のジヒドロクマリン２の110mgと一
緒に得た。９の収率は、回収した出発物質に基づくと37
％であった。
1H−NMR（CDCl3,250MHz）δ7.65（d,J＝8.0Hz,2H）;
6.92（d,J＝8.5Hz,1H）;6.52（d,J＝8.0Hz,2H）;6.41
（dd,J＝8.5Hz,1.5Hz,1H）;6.24（d,J＝1.5Hz,1H）;4.0
3（d,2Hz,1H）;3.38（q,J＝7.0Hz,4H）;3.25（m,H）;2.
95（s,6H）;1.19（d,J＝7.0Hz,3H）;1.14（t,J＝7.0Hz,
6H）。
MS（EI）C22H28N2O2Teとしての計算値482（130Teを用
いる）：実測値482（M+,20％）;252（20％）;232（M+−
C8H10Te,100％； UV−Vis（トルエン）300nm（18000）;320nm（1360
0）;330nm（8400）。
実施例４ 光活性インジケーター前駆体粒子の調製 （アクセプタービーズ） クマリン−３−（４−ジメチルアミノ）フェニルテル
ライド９の0.3M溶液を脱気したエトキシエーテル中で穏
やかに暖めることにより調製した。エチレングリコール
（1ml）を4mlバイアル中で105−110℃まで加熱した。ス
トックのラテックス懸濁液（水中10％固体の200μｌ）
をバイアルに加え、混合物をアルゴン下で磁気撹拌し
た。クマリン−３−（４−ジメチルアミノ）フェニルテ
ルライド９（200μｌ、エトキシエタノール中0.3M）を
この混合物にゆっくりと加え、生じた混合物を５分間撹
拌し、次いで、アルゴン下で室温まで到達させた。冷却
後、懸濁液をエタノール（3ml）で処理し、遠心管に移
した。次いで、混合物を15,000rpm（ソルバル、SA600ロ
ーター）で１時間遠心分離した。上清を注意深くデカン
トして、ペレットを超音波処理により、水性エタノール
（4.0ml）に懸濁した。上清を15,000rpmで１時間遠心分
離した。上清をもう一度除去し、ペレットを水（4ml）
に再懸濁した。最終の遠心分離および上清の除去の後、
ペレットを水に再懸濁して、最終容量2mlにして、光活
性インジケーター前駆体粒子懸濁液10mg/mlを得た。
実施例５ ストレプトアビジン−光活性インジケーター前駆体の調
製 染色粒子 上記実施例４で調製した光活性インジケーター前駆体
粒子（10mg/mlの1ml）懸濁液をEDAC溶液（0.5mg/ml、0.
02Mリン酸緩衝液、pH6.0の1ml）に加え、０℃まで冷却
した。懸濁液をアルゴン下で30分間撹拌した。その後、
懸濁液を、ボレート緩衝液（0.2M、pH9.0）中ストレプ
トアビジン溶液（5mg/ml、1ml）に滴下して加え、〜０
℃に維持した。懸濁液を１時間撹拌し、室温まで暖めさ
せた。水（1ml）を加え、混合物を15,000rpmで１時間遠
心分離した。上清を廃棄し、ペレットを超音波処理によ
り水（4ml）に懸濁した。試料を超音波処理により水（4
ml）中で再遠心分離し、最後に15,000rpmで30分間遠心
分離した後、得られたペレットを水（5ml）に懸濁し
た。これにより、ストレプトアビジン−光活性インジケ
ーター前駆体粒子の懸濁液2mg/mlを得た。ストレプトア
ビジンの存在は、3Hビオチン結合により確認し、2500±
250ストレプトアビジン／粒子であると定量した。
実施例６ マレイミド化デキストラン光増感剤の調製 粒子 A.粒子の染色 ベンジルアルコール中、クロロフィルａ（2.0mM）と
テトラブチルスクアレート（4.0mM）の染料混合物を調
製した。エチレングリコール（80ml）を125mlエーレン
マイヤーフラスコに入れ、実験用ホットプレートで125
℃まで暖めた。次いで、ベンジルアルコール中の染料混
合物（8ml）を加え、直ちに、ストックのラテックス懸
濁液（10％固体の10ml）を加えた。加熱を止め、フラス
コとその内容物を室温まで到達させた。冷却後、混合物
を等しい容量のエタノールで希釈して、直ちに、15,000
rpmで２時間遠心分離した。青みがかった緑色の上清を
廃棄し、ペレットを超音波処理によりエタノール50mlに
懸濁した。懸濁液を15,000rpmで１時間遠心分離し、微
かに青色の上清を廃棄した。ペレットを超音波処理によ
り、50％水性エタノール（50ml）に再懸濁して、粒子を
分散させた。15,000rpmでの遠心分離を１時間繰り返し
た。上清を廃棄し、ペレットを超音波処理により水に再
懸濁した。最終の遠心分離の後、ペレットを水に再懸濁
し、最終容量20mlにした。
B.マレイミド化デキストラン光増感剤粒子の調製 アミノデキストラン（500mg）を、スルホ−SMCC（157
mg、10mlH2O）と反応させることにより、部分的にマレ
イミド化した。スルホ−SMCCをアミノデキストラン（0.
05MNa2HPO4、pH7.5、40ml中）の溶液に加え、生じた混
合物を1.5時間インキュベートした。反応混合物を次い
でMES/NaCl（２×2L、10mM MES、10mM NaCl、pH6.0、４
℃）に対して透析した。マレイミド化デキストランを1
5,000rpmで15分間遠心分離し、上清を集めた。次いで、
上清デキストラン溶液（54ml）をMES緩衝液（pH6.0）中
イミダゾール（1.0M溶液の7ml）で処理し、この撹拌溶
液に、染色した光増感剤粒子（10mg/mlの10ml）を加え
た。10分間撹拌後、懸濁液をEDAC（10mM、pH6.0のMES中
７ミリモル）で処理し、この懸濁液を30分間撹拌した。
その後、サーハァクトアンプス（登録商標）（ピアス
社）トゥイーン−20（10％、0.780ml）を反応混合物に
加えて、最終濃度0.1％にした。次いで、粒子を15,000r
pmで45分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを超
音波処理によりMES/NaCl（pH6.0、10mM、100ml）に再懸
濁した。15,000rpmで45分間の遠心分離、その後、上清
廃棄後のペレット再懸濁を２回実施した。マレイミド化
デキストラン光増感剤粒子を10mg/ml懸濁液として水中
に貯蔵した。
実施例７ GATTAG−光増感剤粒子の調製 水中、アミノ−GATTAG（180μｌ、50ナノモル）（下
記実施例８に記載のようにして調製したもの）を0.25M
ボラックス（50μｌ）で処理して、pH9.2にした。SPDP
（乾燥DMF中50mg/ml）を、０、10、20、および30分で、
４部加えた（合計33.8マイクロモル）。反応混合物を２
時間静置した。氷冷エタノール（2.1ml）を加え、生成
物を冷凍庫の中に一晩置いた。濁った生成物混合物を２
つのエッペンドルフ管に分配し、最大スピードで10分間
遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットをH2O4
00μｌに溶解した。この溶液に、2.5M酢酸塩緩衝液（20
μｌ、2.5M、pH5.3）を加えた。
蒸留水中TCEP（10μｌ、20mM）を加え、室温で30分間
還元させた。無水エタノール（1.2ml）を加え、反応混
合物を冷凍庫に２時間入れた。反応混合物を冷室中、全
開スピードで遠心分離し、沈澱したGATTAG−SHオリゴヌ
クレオチドをペレットとして除去した。このペレットを
20mM EDTAを含有する50mM Na2HPO4緩衝液200μｌ（pH6.
85）に溶解した。この溶液を脱気し、アルゴン下に維持
した。次いで、この溶液をマレイミド化デキストラン光
増感剤粒子（14.2mg/1.5ml）（上記実施例６において調
製された）に加え、反応混合物を一晩静置した。混合物
を15,000rpmで１時間遠心分離し、上清を廃棄した。ペ
レットを水（2ml）に再懸濁し、15,000rpmで１時間遠心
分離した。上清を廃棄し、ペレットを水（2ml）に再懸
濁した。最終の遠心分離の後、GATTAG−光増感剤粒子を
懸濁液として、水溶液2ml中で貯蔵した。
実施例８ DNAを検出するためのアッセイ A.下記に示した配列を有する標的65量体オリゴヌクレオ
チド： およびCTAATC−30量体およびアミノ−CATTAGを、標準固
相ホスホルアミダイト法を用いるミリゲン・バイオサー
チ・DNA自動合成機（モデル・ナンバー8750）で調製し
た（オリゴヌクレオチド・シンセシス−ア・プラクティ
カル・アプローチ（1984年）、ゲイ・M.J.編、IRLプレ
ス・オックスホード、参照）。このプロトコールは、簡
単に言えば、（ａ）ジクロロ酢酸を用いる、固体支持体
に結合させたヌクレオシド上の5'−ジメトキシトリチル
基の除去；（ｂ）触媒として、テトラゾールを用いる、
加えたヌクレオシド、これは、5'−ヒドロキシル保護基
（好ましくは、ジメトキシトリチル）および3'−ヒドロ
キシル保護基（好ましくは、N,N−ジイソプロピルホス
ホルアミダイト）を含む、のカップリング；（ｃ）無水
酢酸を用いるキャッピング工程；および（ｄ）ホスファ
イトトリエステルをホスフェートトリエステルに変換す
るためのヨウ素酸化から成る。合成の最後に、水酸化ア
ンモニウムを用いて、（ａ）合成したポリヌクレオチド
を支持体から切り離し；（ｂ）ホスホリル保護基（β−
シアノエチル）をはずし；さらに（ｃ）塩基保護基をは
ずした。オリゴヌクレオチドは、最終的にHPLCにより精
製した。
B.ビオチン−30量体を、最後に加えるヌクレオチドの塩
基が、下記に示したような保護化アミン修飾剤（アメリ
カン・バイオネティックス、ナンバーABN2599）の付い
た５−メチル−シトシンである以外は上記と同様にして
調製する： 脱保護の後、遊離のアミンを、0.1M NaHCO3、pH9.0中
1:60モル比率の２つの試薬で、ビオチン−LC−NHS（ピ
エス、ナンバー21335G）と反応させた。室温で一晩イン
キュベーションした後、得られたオリゴヌクレオチドを
分析し、12％変性ポリアクリルアミドゲルで精製した。
C.1.5mlエッペンドルフ管に入れたトリス/EDTA/NaCl溶
液（pH8.0、それぞれ100mM、0.1mM、0.30M）中で、様々
な容量（21nMの０〜80μＬ）の標的65量体オリゴヌクレ
オチドをCTAATC−30量体（15nMの200μｌ）およびビオ
チン−30量体（15nMの200μｌ）と混合することによ
り、アッセイを実施した。30量体プローブを、冷却の
際、標的65量体オリゴヌクレオチド上のそれらの相補部
分とハイブリダイズさせ得るために、容量を0.5mlに
し、溶液を55℃で30分間アニール化した。反応混合物を
室温まで冷まし、次いで、ストレプトアビジン−光活性
インジケーター前駆体粒子（100μg/mlの100μｌ）、続
いてGATTAG−光増感剤粒子（100μg/mlの400μｌ）で処
理した。混合物を穏やかに旋回させ、室温で２時間イン
キュベートした。次いで、懸濁液を12×75mm試験管に移
し、５分間、610nmカットオフフィルターを装備したド
ーラン−ジュネーランプ（タングステン）を照射した。
試料を等量（1ml）の緩衝液で処理し、蛍光計に移し
た。360NBフィルターおよび420NBフィルター放出（エミ
ッション）での励起に対応する蛍光単位を記録した。２
つの個々のアッセイについて得られた標準曲線は、図１
に示している。
上述の発明は、明瞭さおよび理解を求める目的で例示
説明および実施例を用いて幾分詳細に記載しているが、
添付の請求の範囲内である種の変形または修飾を適用し
得ることは明らかである。
配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人 （Ａ）名宛人：シンテックス（ユー・エス・エイ）
・インコーポレイテッド （Ｂ）通り：ヒルビュー・アベニュー3401番 （Ｃ）市：パロ・アルト （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）ZIP:94304 （ii）発明の名称 蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ （iii）配列の数:5 （iv）コンピューター解読書式 （Ａ）媒体型：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパティブル （Ｃ）オペレーティング・シスフム:PC−DOS/MS−D
OS （Ｄ）ソフトウェア:PATENTIN RELEASE ＃1.0,VERS
ION ＃1.25 （vi）本出願のデータ （Ａ）出願番号:PCT/US/ （２）配列番号１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:42塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：合成物 （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:30塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：合成物 （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:66塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：合成物 （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:42塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：合成物 （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:65塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （iii）ハイポセティカル:NO （iv）アンチセンス:NO （vi）起源： （Ａ）生物名：合成物 （xi）配列：配列番号5:
フロントページの続き (72)発明者 シン、ラジェンドラ アメリカ合衆国94040カリフォルニア州 マウンテン・ビュー、デル・メディオ・ アベニュー・ナンバー134、541番 (72)発明者 ウルマン、エドウィン・エフ アメリカ合衆国94025カリフォルニア州 アサートン、セルビー・レーン135番 (56)参考文献 特開 平５−180773（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−175468（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】特異的結合対（sbp）構成員である分析物
    を測定する方法であって： （ａ）組み合わせで： （１）分析物を含有する疑いのある媒体； （２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある
    光増感剤、ただし、該光増感剤は、sbp構成員に結合し
    ているか、または、自身に組み込まれているかまたは結
    合している該sbp構成員を有する粒子に結合しているか
    または組み込まれているものである；および （３）一重項酸素との反応に際し、光活性インジケータ
    ーを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、
    ただし、該光活性インジケーター前駆体は、sbp構成員
    に結合しているか、または自身に組み込まれているかま
    たは結合している該sbp構成員を有する粒子に結合して
    いるかまたは組み込まれているものである； を用意し； （ｂ）光の照射により該光増感剤を励起させ、該光活性
    インジケーター前駆体と反応して該光活性インジケータ
    ーを産生する一重項酸素を生成し；さらに、 （ｃ）該光活性インジケーターを照射して、該光活性イ
    ンジケーターから放射される蛍光を測定する； ことを含んで成り、該sbp構成員の少なくとも一方は、
    直接的または間接的に該分析物に結合して複合体を形成
    することができ、そして該sbp構成員の他方は直接的ま
    たは間接的に該分析物に結合するか、または該sbp構成
    員が該複合体と会合するように他のsbp構成員に結合す
    ることができるものであり、さらに、該蛍光が該媒体中
    の該分析物の量と相関するものである、方法。
  2. 【請求項２】該光増感剤が、ケトン類、多芳香族化合物
    類、シアニン類、メロシアニン類、フタロシアニン類、
    スクアレート染料類、ポルフィリン類、キサンテン類、
    チアジン類、およびオキサジン類からなる群から選択さ
    れるものである、請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】該光活性インジケーターが、その吸収極大
    で少なくとも10,000M-1cm-1の消光係数、および少なく
    とも0.1の蛍光放出量子収率を有するものである、請求
    の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】光増感剤または光活性インジケーター前駆
    体のいずれも、粒子に結合していないか、または組み込
    まれていない方法であって、かつ工程（ｂ）の前に、該
    光増感剤および該光活性インジケーター前駆体のうちの
    少なくとも１つを特異的結合対結合の手段により表面に
    結合させることを含んで成る、請求の範囲第１項記載の
    方法。
  5. 【請求項５】懸濁可能な粒子が該表面を含んでおり、該
    粒子が、ラテックス粒子類、脂質小胞類、油滴類、シリ
    カ粒子類、金属ゾル類、および染料クリスタライト類か
    らなる群から選択されるものである、請求の範囲第４項
    記載の方法。
  6. 【請求項６】該分析物が、薬剤、タンパク質、ポリヌク
    レオチド、受容体、および微生物からなる群から選択さ
    れるものである、請求の範囲第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】分析物を測定する方法であって： （Ａ）分析物がポリヌクレオチドである場合、 （ａ）水性媒体中で： （１）該分析物； （２）１またはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ、
    ただし各プローブは該分析物のヌクレオチド配列と相補
    的なヌクレオチド配列を含み、プローブの少なくとも１
    つは、特異的結合対（sbp）構成員に結合しているか、
    または自身に組み込まれているかまたは結合している該
    sbp構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込
    まれているものであり、該sbp構成員は、該相補的ヌク
    レオチド配列とは異なるものである； （３）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある
    光増感剤、ただし、該光増感剤は、該プローブのヌクレ
    オチド配列と相補的なヌクレオチド配列に結合している
    か、または自身に組み込まれているかまたは結合されて
    いる該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオ
    チド配列を有する粒子に結合しているかまたは組み込ま
    れているものであり；および、 （４）一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを
    形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただ
    し、該光活性インジケーター前駆体は、該プローブと結
    合している該sbp構成員と相補的なsbp構成員に結合して
    いるか、または、自身に組み込まれているかまたは結合
    されている該プローブと結合している該sbp構成員と相
    補的なsbp構成員を有する粒子に結合しているかまたは
    組み込まれているものである； を組み合わせ； （ｂ）該媒体に光を照射し、該光増感剤を励起させて該
    光活性インジケーター前駆体と反応して該光活性インジ
    ケーターを生成する一重項酸素を産生し；そして、 （ｃ）該光活性インジケーターを照射して、該光活性イ
    ンジケーターから放射される蛍光を測定する； ことを含んで成り、該蛍光は該媒体中の該分析物の量と
    相関するものである、方法であるか、または （Ｂ）分析物がポリヌクレオチド以外のものである場
    合、 （ａ）組み合わせで： （１）分析物を含有する疑いのある媒体； （２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある
    光増感剤、ただし、該光増感剤は、第１特異的結合対
    （sbp）構成員に結合しているか、または、自身に組み
    込まれているかまたは結合している第１特異的結合対
    （sbp）構成員を有する粒子に結合しているかまたは組
    み込まれているものである；および （３）一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを
    形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただ
    し、該光活性インジケーター前駆体は、第2sbp構成員に
    結合しているか、または自身に組み込まれているかまた
    は結合している第2sbp構成員を有する粒子に結合してい
    るかまたは組み込まれているものである； を用意し； （ｂ）該組み合わせに光を照射して該光増感剤を励起さ
    せ、該光活性インジケーター前駆体と反応して該光活性
    インジケーターを生成する一重項酸素を産生し；そし
    て、 （ｃ）該光活性インジケーターを照射して、該光活性イ
    ンジケーターから放射される蛍光を測定する； ことを含んで成り、各sbp構成員は、直接的に該分析物
    に結合して複合体を形成することができ、該光増感剤お
    よび該光活性インジケーター前駆体が該複合体と会合
    し、かつ、該蛍光が、該媒体中の該分析物の量と相関し
    ている、方法。
  8. 【請求項８】一重項酸素と反応して光活性インジケータ
    ーを形成する光活性インジケーター前駆体が結合してい
    る平均直径20ないし4000ナノメーターの懸濁可能な粒子
    を含み、特異的結合対（sbp）構成員である分析物を測
    定する方法において使用される組成物であって、ただ
    し、該光活性インジケーター前駆体がセレニウムまたは
    テルリウム原子を含み、該光活性インジケーターがセレ
    ニウムまたはテルリウム原子を含まないものである組成
    物。
  9. 【請求項９】分析物のアッセイを行うためのキットであ
    って、パッケージした組み合わせ中に： （ａ）セレニウムまたはテルリウム原子を含む光活性イ
    ンジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター
    前駆体は、第１特異的結合対（sbp）構成員に結合して
    いるか、または自身に組み込まれているかまたは結合し
    ている第1sbp構成員を有する粒子に結合しているかまた
    は組み込まれている； （ｂ）その励起状態で酸素をその一重項状態まで活性化
    する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、第2s
    bp構成員に結合しているか、または自身に組み込まれて
    いるかまたは結合している第2sbp構成員を有する粒子に
    結合しているかまたは組み込まれている； を含み、該sbp構成員は、該分析物に、または該分析物
    と結合可能なsbp構成員に結合することができ、さら
    に、該光活性インジケーター前駆体が、所望により、該
    第1sbp構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部であ
    り、また、該光増感剤が、所望により、該第2sbp構成員
    が結合している懸濁可能な粒子の一部である、キット。
  10. 【請求項１０】特異的結合対（sbp）構成員である分析
    物の結合アッセイであって： （ａ）該分析物を含有する疑いのある媒体を、該分析物
    に、または該分析物と相補的なsbp構成員に、直接的ま
    たは間接的に結合できるsbp構成員と合わせ；そして、 （ｂ）該sbp構成員と、該分析物または該相補的なsbp構
    成員との結合を検出する、ただし、該検出は、本質的
    に、該媒体中の光活性インジケーター前駆体を一重項酸
    素にさらして光活性インジケーターを生成させ、該光活
    性インジケーターの蛍光を測定することからなり、該光
    活性インジケーター前駆体は、該sbp構成員または該相
    補的なsbp構成員に結合している、 を含んで成るアッセイ。
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Families Citing this family (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6251581B1 (en) 1991-05-22 2001-06-26 Dade Behring Marburg Gmbh Assay method utilizing induced luminescence
US5578498A (en) 1991-05-22 1996-11-26 Behringwerke Ag Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays
US6002000A (en) * 1992-07-20 1999-12-14 Dade Behring Marburg Gmbh Chemiluminescent compounds and methods of use
JPH07509245A (ja) * 1992-07-20 1995-10-12 デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング 新規化学発光化合物およびその使用方法
IT1275571B (it) * 1995-07-19 1997-08-07 Consiglio Nazionale Ricerche Substrati fluorogenici suscettibili di fotoattivazione previa trasformazione per via enzimatica atti alla diagnosi ed alla terapia fotodinamica dei tumori
US5811253A (en) * 1995-09-01 1998-09-22 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Use of vanadium bromoperoxidase as a signal-generating enzyme for chemiluminescent systems: test kits and analytical methods
DE69722918D1 (de) * 1996-02-19 2003-07-24 Schaffer Moshe Photoempfindliche zusammensetzung
US6143514A (en) * 1996-05-01 2000-11-07 Dade Behring Marburg Gmbh Chemiluminescent compositions and their use in the detection of hydrogen peroxide
US6432662B1 (en) * 1997-04-15 2002-08-13 Pierce Chemical Company Assay of peroxidase activity
WO1998052041A1 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Biosite Diagnostics Incorporated Rapid evaluation of the ratio of biological molecules
DE19756773A1 (de) 1997-12-19 1999-06-24 Dade Behring Marburg Gmbh Neues Verfahren und Diagnosemittel zur Hämostase-Diagnostik
DE19756782A1 (de) 1997-12-19 1999-06-24 Dade Behring Marburg Gmbh Nachweis und Bestimmung festphasenassoziierter Faktoren
AU2117599A (en) * 1998-01-20 1999-08-02 Mayo Foundation For Medical Education And Research Simplified mutation detection
EP1078265A1 (en) * 1998-02-18 2001-02-28 Dade Behring Inc. Chemiluminescent compositions for use in detection of multiple analytes
DE19811017A1 (de) * 1998-03-13 1999-09-16 Dade Behring Marburg Gmbh Neues Verfahren zur Bestimmung von Plasmaproteinen und Faktoren der Hämostase sowie ein neues, implantierbares Meßgerät
DE19846148C2 (de) * 1998-10-01 2002-10-10 Igor Popov Verfahren zur Beurteilung der oxidativen Modifikation proteinhaltiger Stoffe mittels Messung ihrer antiradikalen Aktivität
US7759133B2 (en) * 1998-12-22 2010-07-20 Alk-Abello A/S Method of detecting and/or quantifying a specific IgE antibody in a liquid sample
US20040248150A1 (en) * 1999-04-02 2004-12-09 Sharat Singh Methods employing oligonucleotide-binding e-tag probes
US6627400B1 (en) 1999-04-30 2003-09-30 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed measurement of membrane protein populations
US6322980B1 (en) * 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US7037654B2 (en) 1999-04-30 2006-05-02 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
US6673550B2 (en) 1999-04-30 2004-01-06 Aclara Biosciences, Inc. Electrophoretic tag reagents comprising fluorescent compounds
US20030235832A1 (en) * 2000-06-21 2003-12-25 Ahmed Chenna Multiplexed analysis by chromatographic separation of molecular tags
US6649351B2 (en) 1999-04-30 2003-11-18 Aclara Biosciences, Inc. Methods for detecting a plurality of analytes by mass spectrometry
US7001725B2 (en) 1999-04-30 2006-02-21 Aclara Biosciences, Inc. Kits employing generalized target-binding e-tag probes
US6703248B1 (en) * 1999-12-15 2004-03-09 Dade Behring Marburg Gmbh Particles for diagnostic and therapeutic use
EP1111050B1 (de) 1999-12-22 2007-03-14 Dade Behring Marburg GmbH Lösungen von humanem Procalcitonin
EP1110970B1 (de) 1999-12-22 2008-05-14 Dade Behring Marburg GmbH Gegen Procalcitonin gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
EP1267935A2 (en) 2000-01-12 2003-01-02 Light Sciences Corporation Novel treatment for eye disease
DE60035127T2 (de) 2000-03-06 2008-02-14 Dade Behring Marburg Gmbh Mit polysacchariden beschichtete träger, deren herstellung und verwendung
US20030207300A1 (en) * 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7160735B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
US7771929B2 (en) * 2000-04-28 2010-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Tag library compounds, compositions, kits and methods of use
US7537938B2 (en) * 2000-04-28 2009-05-26 Monogram Biosciences, Inc. Biomarker detection in circulating cells
JP4796259B2 (ja) 2000-05-04 2011-10-19 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・プロダクツ・ゲーエムベーハー 複数のアナライトの検出において使用するための組成物
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
DE10064827A1 (de) 2000-12-22 2002-06-27 Dade Behring Marburg Gmbh Nachweisverfahren
US7087395B1 (en) 2001-01-16 2006-08-08 Quest Diagnostics Investments Incorporated Vitamin D assay
AU2002251449B2 (en) * 2001-03-29 2008-01-31 Cellect Technologies Corp. Methods devices and systems for sorting and separating particles
KR20040082273A (ko) 2001-05-21 2004-09-24 아클라라 바이오사이언시스 인코퍼레이티드 단백질 분석을 위한 방법 및 조성물
WO2002094998A2 (en) 2001-05-21 2002-11-28 Aclara Biosciences, Inc. Analyzing phosphorylated proteins
US7358052B2 (en) * 2001-05-26 2008-04-15 Monogram Biosciences, Inc. Catalytic amplification of multiplexed assay signals
US7763439B2 (en) 2001-07-02 2010-07-27 Arctic Diagnostics Oy Two-photon absorbing dipyrrometheneboron difluoride dyes and their applications
US7045311B2 (en) * 2001-10-25 2006-05-16 Monogram Biosciences, Inc. Whole cell assay systems for cell surface proteases
JP2006509183A (ja) * 2002-03-05 2006-03-16 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 膜結合増感剤を用いる多重分析
DE10212960A1 (de) * 2002-03-22 2003-10-23 Gnothis Holding Sa Ecublens Verwendung von Oxazin-Farbstoffen als Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US20040229294A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US7402397B2 (en) * 2002-05-21 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US20040229299A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Badal M. Youssouf Intracellular complexes as biomarkers
US20040229293A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui Surface receptor complexes as biomarkers
US20030232401A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-18 Pugia Michael J. Bacterial test method by glycated label binding
DE10226011A1 (de) * 2002-06-12 2004-01-08 Aventis Pharma Deutschland Gmbh HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen c-reaktivem Protein und an C-reaktives Protein bindenden Komponenten
US20030232394A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-18 Aventis Pharma Deutschland Gmbh High throughput screening method and assay system for determining the interaction between C-reactive protein and components binding to it
US20040175765A1 (en) * 2002-07-05 2004-09-09 Sharat Singh Cell-screening assay and composition
CA2490654C (en) * 2002-07-25 2012-02-07 Aclara Biosciences, Inc. Detecting receptor oligomerization
JP2006508907A (ja) * 2002-07-26 2006-03-16 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 親油性電気泳動プローブ
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
US7381370B2 (en) 2003-07-18 2008-06-03 Dade Behring Inc. Automated multi-detector analyzer
NZ545873A (en) * 2003-08-11 2009-05-31 Monogram Biosciences Inc Detecting and profiling molecular complexes
WO2005085849A2 (en) * 2003-10-24 2005-09-15 U S. Genomics, Inc Biohazard identification by fluorescent immunoassay and single molecule detection
CA2543830A1 (en) * 2003-10-27 2005-05-19 Monogram Biosciences, Inc. Detecting human anti-therapeutic antibodies
EP1695083A1 (de) 2003-12-01 2006-08-30 Dade Behring Marburg GmbH Homogenes nachweisverfahren
DE102005026163A1 (de) 2004-08-24 2006-03-02 Dade Behring Marburg Gmbh Gegen den Marburg I Polymorphismus der Faktor VII aktivierenden Protease (FSAP) gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
DE102004042124B4 (de) * 2004-08-30 2006-07-06 Dade Behring Marburg Gmbh Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Gegenwart eines Überschusses von kreuzreagierenden Substanzen
US7189582B2 (en) 2005-04-27 2007-03-13 Dade Behring Inc. Compositions and methods for detection of sirolimus
DE102005022047A1 (de) 2005-05-09 2006-11-30 Dade Behring Marburg Gmbh Bindungspartner des Plazentalen Wachstumsfaktors insbesondere gegen den Plazentalen Wachstumsfaktor gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
US20060281104A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-14 Macevicz Stephen C Leuco dye particles and uses thereof
US20080312092A1 (en) * 2005-07-08 2008-12-18 The University Of Denver Photoinduced Signal Amplification Through Externally Sensitized Photofragmentation in Masked Photosensitizers
ES2544236T3 (es) 2005-11-17 2015-08-28 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Reducción de unión no específica en ensayos
US20090247420A1 (en) * 2005-12-12 2009-10-01 Kutateladze Andrei G Method for encoding and screening combinatorial libraries
US7226752B1 (en) * 2006-01-19 2007-06-05 Avago Technologies General Ip (Singapore) Pte. Ltd. Methods for detecting an analyte in a sample
US20080076139A1 (en) 2006-09-21 2008-03-27 Sharat Singh Methods and compositions for detecting the activation states of multiple signal transducers in rare circulating cells
US7790401B2 (en) 2007-08-06 2010-09-07 Siemens Healthcare Diagnostics Methods for detection of immunosuppressant drugs
WO2009026313A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Colorado Seminary, Which Owns And Operates The University Of Denver Photoinduced signal amplification through externally sensitized photofragmentation in masked photosensitizers and photoamplified fluorescence turn-off system
ES2369717T3 (es) * 2007-11-30 2011-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Estabilización de conjugados que comprenden una molécula conectora de tiourea.
US7910378B2 (en) 2007-12-14 2011-03-22 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Methods for detection of hydrophobic drugs
WO2009108637A1 (en) 2008-02-25 2009-09-03 Prometheus Laboratories, Inc. Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
US8682408B2 (en) 2008-03-28 2014-03-25 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
US8583204B2 (en) 2008-03-28 2013-11-12 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
US11730407B2 (en) 2008-03-28 2023-08-22 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
DE102008049601A1 (de) 2008-09-30 2010-04-01 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Antikörper zur Bestimmung des Prothrombin-Fragments F2/F1+2 in einem homogenen Immunoassay
AU2010273319B2 (en) 2009-07-15 2015-01-22 Nestec S.A. Drug selection for gastric cancer therapy using antibody-based arrays
CA2772020A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-03 Mbio Diagnostics, Inc. Integrated sample preparation and analyte detection
ES2637853T3 (es) 2009-10-20 2017-10-17 Diatech Holdings, Inc. Ensayos mediados por proximidad para detectar proteínas de fusión oncogénicas
KR20120115390A (ko) 2010-01-12 2012-10-17 네스텍 소시에테아노님 삼중 음성 유방암의 치료요법에 대한 반응 예측 방법
EP2395354A1 (de) 2010-06-10 2011-12-14 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Homogener Aktivitätstest zur Bestimmung von enzymatischen Reaktionen
US20110306148A1 (en) 2010-06-14 2011-12-15 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Composition for use as an assay reagent
US8329424B2 (en) 2010-06-25 2012-12-11 Siemens Healthcare Diagnostics Reduction in false results in assay measurements
JP2014503821A (ja) 2010-12-23 2014-02-13 ネステク ソシエテ アノニム 抗体ベースのアレイを用いる悪性がんの療法のための薬剤選択
EP2471945A1 (de) 2010-12-30 2012-07-04 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur Bestimmung von Inhibitoren der Gerinnung
EP2681552A2 (en) 2011-03-02 2014-01-08 Nestec S.A. Prediction of drug sensitivity of lung tumors based on molecular and genetic signatures
DK2694972T3 (en) 2011-04-04 2017-10-02 Pierian Holdings Inc PROCEDURES FOR PREVENTING AND IMPROVING GASTRIC CANCER SURVIVAL
EP2742352B1 (en) 2011-08-12 2018-02-28 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Detection of sex steroids
ES2553456T3 (es) 2011-09-02 2015-12-09 Nestec S.A. Perfilado de proteínas de ruta de señal para determinar una eficacia terapéutica
JP2015505959A (ja) 2011-12-05 2015-02-26 ネステク ソシエテ アノニム 癌を有する患者に治療を選択する方法
CN102735833B (zh) * 2012-07-09 2015-01-21 沃克(天津)生物科技有限公司 甲状腺过氧化物酶抗体均相发光免疫分析试剂盒及其检测方法
CN102798725B (zh) * 2012-08-13 2015-03-18 沃克(天津)生物科技有限公司 血清总IgE测定诊断试剂盒及制备和使用方法
KR101933620B1 (ko) * 2012-09-18 2018-12-28 삼성전자주식회사 소포를 검출하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분석하는 방법
US9121859B2 (en) 2012-12-04 2015-09-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Compounds and methods for determination of FKBP-binding immunosuppressant drugs
EP2954328A1 (en) 2013-02-05 2015-12-16 Nestec S.A. Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling
WO2014122600A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Nestec S.A. Methods of selecting combination therapy for colorectal cancer patients
EP2954068B8 (en) 2013-02-05 2018-10-31 Pierian Holdings, Inc. Drug selection for non-small cell lung cancer therapy
US20160025736A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-28 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Heterogeneous luminescent oxygen channeling immunoassays and methods of production and use thereof
DK2972245T3 (da) * 2013-03-15 2020-09-07 Siemens Healthcare Diagnostics Inc Heterogene luminescerende oxygenkanaliserende immunoassays
AU2014269946A1 (en) 2013-05-21 2015-12-03 Nestec S.A. Methods for predicting and improving the survival of colorectal cancer patients
AU2014289499A1 (en) 2013-07-09 2015-11-19 Nestec S.A. Microfluidic collaborative enzyme enhanced reactive CEER immunoassay
CA2922605A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Nestec S.A. Polyp recurrence
CA2932569A1 (en) 2013-12-03 2015-06-11 Nestec S.A. Signaling pathways in tissues from inflammatory bowel disease patients
WO2015089172A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Pretreatment agent in non-agglutination assays
EP2919013B1 (de) 2014-03-11 2016-11-02 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur Detektion von Modulatoren der GPIb-Thrombin-Interaktion
EP2955517A1 (de) 2014-06-10 2015-12-16 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur Stabilisierung von Körperflüssigkeitsproben durch die Zugabe von Detergenz
MX2018004029A (es) 2015-10-02 2018-07-06 Tgr Biosciences Pty Ltd Deteccion de analitos con multiples sustratos.
CN106093391A (zh) * 2016-05-31 2016-11-09 南方医科大学 一种基于单线态氧通道发光量子点传感器
WO2018017472A1 (en) 2016-07-18 2018-01-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Sample analyzer system with a sample vessel having opaque and translucent portions
ES2826394T3 (es) 2017-06-09 2021-05-18 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Ensayo de activación para el diagnóstico de una trombocitopenia inducida por heparina
ES2862434T3 (es) 2017-08-02 2021-10-07 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Prueba de unión para el diagnóstico de trombocitopenia inducida por heparina
MX2020002788A (es) 2017-09-13 2020-09-14 Progenity Inc Biomarcadores de preeclampsia y sistemas y metodos relacionados.
EP3514541A1 (de) 2018-01-17 2019-07-24 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur quantitativen bestimmung eines therapeutischen tnf-alpha inhibitors
US11262294B2 (en) 2018-05-04 2022-03-01 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Illumination unit with multiple light sources for generating a uniform illumination spot
WO2019231503A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 University Of Oregon Compounds for thiol-triggered cos and/or h2s release and methods of making and using the same
US20210386367A1 (en) 2018-06-01 2021-12-16 Progenity, Inc. Devices and systems for gastrointestinal microbiome detection and manipulation
EP4070113A4 (en) 2019-12-04 2023-12-20 Biora Therapeutics, Inc. ASSESSMENT OF PREECAMPSIA USING FREE AND DISSOCIATE PLACENTAL GROWTH FACTOR ASSAYS
CN112679518B (zh) * 2020-12-29 2022-11-08 华东理工大学 基于硫代色满酮衍生物的纯有机室温磷光材料及其制备方法和应用
EP4239338A1 (de) 2022-03-03 2023-09-06 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Globaltest zur feststellung des status des blutgerinnungssystems
EP4325224A1 (de) 2022-08-18 2024-02-21 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Thrombozytenaktivierungstest zur diagnose einer heparin-induzierten thrombozytopenie
EP4571417A1 (en) * 2023-12-14 2025-06-18 Arkema France Process of curing ethylenically unsaturated compounds with coumarin thioester photoinitiators
EP4585926A1 (de) 2024-01-09 2025-07-16 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren und kit zur reduzierung von interferenzen in immunoassays

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4013528A (en) * 1974-03-26 1977-03-22 Xerox Corporation Process for preparation of solid phase dispersion of photoconductive materials
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4650770A (en) * 1981-04-27 1987-03-17 Syntex (U.S.A.) Inc. Energy absorbing particle quenching in light emitting competitive protein binding assays
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
CA1180647A (en) * 1981-07-17 1985-01-08 Cavit Akin Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method
CA1294285C (en) * 1983-03-13 1992-01-14 Robert T. Buckler Optical indicator chalcogen compounds and methods for their preparation and use
US4599303A (en) * 1983-12-12 1986-07-08 Hri Associates, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing probes crosslinkable to target sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4822733A (en) * 1985-05-28 1989-04-18 Amoco Corporation Lifetime-resolved assay procedures
US4908307A (en) * 1986-12-19 1990-03-13 Karin D. Rodland Hybridization method and probe for detecting nucleic acid sequences
US4891324A (en) * 1987-01-07 1990-01-02 Syntex (U.S.A.) Inc. Particle with luminescer for assays
US4806485A (en) * 1987-02-27 1989-02-21 Cooperative Institute For Research In Environmental Sciences Univers. Of Colorado Method of improving the detection limits of UV-VIS absorbing compounds in HPLC by the use of a singlet oxygen trap
AU636110B2 (en) * 1988-06-08 1993-04-22 Nichols Institute Diagnostics Assays utilizing sensitizer-induced production of detectable signal
US5019496A (en) * 1989-02-17 1991-05-28 Gerald Oster Photopolymerization diagnostic test composition and method for immunoassay and nucleic acid assay
EP0441948A4 (en) * 1989-09-06 1992-06-03 Tropix, Inc. Synthesis of stable, water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
EP0476556A3 (en) * 1990-09-18 1992-11-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for determination of a light sensitive substance
US5340716A (en) * 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
ATE350665T1 (de) * 1991-05-22 2007-01-15 Dade Behring Marburg Gmbh Homogenes testsystem zur bestimmung eines analytes
DK0653066T3 (da) * 1992-07-31 1998-09-23 Dade Behring Marburg Gmbh Fotoaktiverbare kemiluminescerende matricer

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