JPH09502520A

JPH09502520A - 蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ

Info

Publication number: JPH09502520A
Application number: JP7508205A
Authority: JP
Inventors: ダバリアン、ダリウッシュ; シン、ラジェンドラ; ウルマン、エドウィン・エフ
Original assignee: ベーリングヴェルケ・アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-08-29
Publication date: 1997-03-11
Anticipated expiration: 2019-02-23
Also published as: JP3498960B2; ATE177842T1; US5616719A; DE69417242T2; DE69417242D1; EP0716746A1; US5807675A; EP0716746B1; CA2170873A1; ES2135597T3; WO1995006877A1

Abstract

(57)【要約】分析物を含有する疑いのある媒体中の分析物を測定する方法を開示するものである。１つの方法は、分析物を含有する疑いのある媒体を、分析物がもし存在する場合、分析物を光増感剤および光活性インジケーター前駆体分子が極めて近接した状態になるような条件下で処理することを含んでなる。光増感剤は、光活性インジケーター前駆体が光活性インジケーター分子を産生するように活性化する一重項酸素を産生するものである。光を照射すると、光活性インジケーター分子は、光を生成するので、これを測定する。光活性インジケーターにより生成された光量は、媒体中の分析物の量と相関する。組成物類、キット類、および化合物類も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】蛍光酸素チャンネリングイムノアッセイ発明の背景発明の分野本発明は、試料中の分析物を測定するための方法、組成物、およびキットに関するものである。特に、本発明は、一重項酸素と反応して蛍光生成物を生成できる光活性インジケーター前駆体を利用する特異的結合アッセイに関するものである。臨床診断分野は、容易かつ正確に測定し得る物質（分析物）の種類、並びに、測定方法の両方に関して、近年大きな広がりを見せている。液体中に低濃度で存在する物質を測定するための好便で信頼でき、かつ有害でない方法が望まれている。臨床化学において、これらの物質は、体液中に１０^-12モル以下の濃度で存在することもある。これら低濃度の物質を検出する困難さは、利用し得る試料サイズが比較的小さい場合に増大する。アッセイを開発する際には、多くの考慮すべき問題が存在する。１つの考慮点は、分析物の濃度変化に対するシグナル応答である。第２の考慮点は、実施に際してのアッセイプロトコールの容易さである。第３の考慮点は、試料間の干渉の多様性である。有用なアッセイを開発する際の更なる考慮点には、試薬類の製造および精製の容易さ、設備の利用可能性、自動化の容易さ、および対象物質との相互作用がある。広い技術範疇の一つが、分析物存在の関数として、標識化リガンドの特定の空間的および極性の構成に特異的に結合できる受容体の使用に関する。受容体が結合することにより観察される効果は、標識によって変わるものである。ある場合には、受容体が結合することにより、単に、結合標識化リガンドと非結合標識化リガンドとの分子量の相異を生ずる。他の場合には、受容体の結合が、結合標識化リガンドの遊離標識化リガンドからの分離を容易ならしめるものであったり、または、標識化リガンドに結合する受容体の量に応じてシグナルが変化するように標識から得られたシグナルの性質に影響を及ぼすこともある。受容体を標識化し、リガンドを標識化しないというような更なるバリエーションもある。別法として、受容体およびリガンドの双方を標識化するか、または異なる受容体を２つの異なる標識で標識化するが、その際、標識は、極めて近接している場合に相互作用し、かつ存在するリガンドの量は、受容体の標識が相互作用し得る度合に影響を与えるものである。依然として、広範囲の様々なリガンド類に適用できるか、または他の方法が容易に適用可能でない特定の場合に使用できる、新規かつ正確な技術に対する要望がある。結合標識と非結合標識を分離する必要のない均一系イムノアッセイは、小分子の場合には、既に報告されている。これらのアッセイには、シバのＦＲＡＴ（登録商標）アッセイ、ＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ、酵素チャンネリングイムノアッセイ、および、蛍光エネルギー転移イムノアッセイ（ＦＥＴＩ）；酵素阻害因子イムノアッセイ（ホフマン・ラロッシュおよびアボット・ラボラトリーズ）；蛍光分極化（fluorescence polarization）イムノアッセイ（ダンドリッカー）、その他がある。これらの方法は全て、感度に限界があり、ＦＥＴＩおよび酵素チャンネリングを含む２、３の方法のみが、大分子多エピトープ性分析物に適している。分離工程を必要とする不均一系イムノアッセイは、一般に、小分子および大分子の双方に対して有用である。酵素類（ＥＬＩＳＡ）、蛍光標識（ＦＩＡ）、放射線標識（ＲＩＡ）、化学発光標識（ＣＬＡ）等を含む、様々な標識が使用されている。蛍光化合物類および化学発光化合物類などの発光化合物類は、その光放出能力のため、アッセイ分野において広く応用されている。この理由から、発光物質は、核酸アッセイおよびイムノアッセイのようなアッセイにおける標識として利用されてきた。例えば、特異的結合対の一員を発光物質とコンジュゲートとさせて、様々なプロトコールを採用する。発光物質コンジュゲートは、分析物を含有する疑いのある試料中の分析物の量と相関して、固相および液相間に分配され得る。いずれかの相の発光を測定することにより、観察される発光のレベルを試料中の分析物の濃度に対して関係づけることができる。ラテックス・ビーズおよびリポソームなどの粒子類も、各アッセイに利用されている。例えば、均一系アッセイにおいて、酵素を、抗体または抗原で標識したリポソームの水性相に封じ込めることができる。試料および補体の存在下で、リポソームは、酵素を放出することになる。抗体または抗原標識化リポソームで、水性相内に封入された水溶性蛍光または非蛍光染料、または脂質小胞の脂質二重層に溶解した脂溶性染料を有するものは、表面結合抗体または抗原との免疫化学反応に参入する能力のある分析物をアッセイするのにも利用されている。染料をリポソームの水性相から放出するために合成洗剤が使用されている。粒子を蛍光染料で染色し、イムノアッセイにおける標識として使用する。非染色粒子も用いられる（例えば、ラテックス凝集）。関連技術ヨーロッパ公開特許出願第０３４５７７６号（マックカプラ）は、標識として感光剤を利用する特異的結合アッセイを開示している。感光剤は、１またはそれ以上の波長の放射による励起、またはその他の化学的または物理的刺激（例えば、電子転移、電気分解、エレクトロルミネセンス、またはエネルギー転移）により刺激したときに、（ａ）一重項分子酸素を産生する分子酸素との相互作用の際に、または（ｂ）分子酸素と相互作用して過酸化水素が生じることによりその元の非励起状態に戻され得る還元型を呈するロイコ染料との相互作用の際に、励起状態に達する、あらゆる部位を含む。励起した感光剤とのいずれかの相互作用は、試薬の添加により、検出可能なシグナルを産生するものである。ヨーロッパ公開特許出願第０４７６５５６号（モッゼンボッカー）は、調整した光による光源物質(lumigenic substance)−光感受性物質溶液の照射を採用して、光感受性物質の濃度と相関して短波長光を産生する、光感受性物質の測定法を開示している。イムノアッセイの発光物質レベルは、マックカプラ等、ジャーナル・オブ・バイオルミネセンス・アンド・ケミルミネセンス（１９８９年）、４巻、５１−５８頁に記載されている。ヨーロッパ公開特許出願第０５１５１９４号（ウルマン等）は、分析物を含有する疑いのある培地中の分析物を測定する方法を開示している。かかる開示方法の一つは、分析物を含有する疑いのある培地を、分析物が存在する場合に光増感剤と化学発光化合物を極めて近接せしめるような条件下で、処理することを含んで成るものである。光増感剤は、一重項酸素を産生し、それが極めて近接している場合に該化学発光化合物を活性化する。その結果、活性化された化学発光物質は、一重項酸素による活性化の光を生じる。生じた光の量は、培地中の分析物量と相関する。この方法では、産生された各一重項酸素は、たった１つの化学発光化合物としか反応できず、また、たった１つの光子しか放射できない。従って、該方法の感度は、化学発光化合物の化学ルミネセンス量子効果によって、かつ、更に重要には、一重項酸素との反応の際に放出される限られた数の光子を検出する能力によって、制限される。発明の概要本発明は、分析物の測定法、分析物のアッセイを行うためのキット類、および該方法およびアッセイに有用な化合物類に関する。本発明の一態様は、特異的結合対(ｓｂｐ)の一員である分析物を測定する方法である。この態様の一実施態様では、該方法は、分析物を含有する疑いのある媒体；その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし該光増感剤は、ｓｂｐ構成員に結合（associated）しているものである；および一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし該光活性インジケーター前駆体はｓｂｐ構成員に結合しているものである、の組み合わせを提供する第１段階；次いで、光の照射により光増感剤を励起させる第２段階；および、光活性インジケーターの蛍光を測定する最終段階、を含んで成る。ｓｂｐ構成員の少なくとも１つは、分析物または分析物と相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合する能力がある。測定された蛍光は、媒体中の分析物の量と相関する。別の実施態様では、該方法は、分析物を含有する疑いのある試料；その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤を含む懸濁可能な第１粒子、ただし該粒子は自身に結合した特異的結合対（ｓｂｐ）構成員を有する；および一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体を含む懸濁可能な第２粒子、ただし該粒子は自身に結合したｓｂｐ構成員を有する、を水性媒体中で組み合わせる第１段階；媒体を照射して、光増感剤を励起させ、一重項酸素を産生する第２段階；および光活性インジケーターの蛍光を測定する最終段階、を含んで成る。各ｓｂｐ構成員は、分析物または分析物と相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合する能力がある。測定された蛍光は、媒体中の分析物の量と相関する。その他の実施態様では、該方法は、分析物を含有する疑いのある媒体；その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし該光増感剤はｓｂｐ構成員に結合しているものである；および自身に結合したｓｂｐ構成員を有する懸濁可能な粒子、ただし該懸濁可能な粒子は一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体を含む、の組み合わせを提供する第１段階；該組み合わせに光を照射して光増感剤を励起させる第２段階；および、光活性インジケーターの蛍光を測定する最終段階を含んで成る。各ｓｂｐ構成員は、分析物または分析物と相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合する能力がある。測定された蛍光は、媒体中の分析物の量と相関する。本発明の他の態様は、分析物の測定法である。該方法は、分析物を含有する疑いのある媒体；その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし該光増感剤は第１ｓｂｐ構成員に結合しているものである；および一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし該光活性インジケーター前駆体は第２ｓｂｐ構成員に結合しているものである、の組み合わせを提供する第１段階；該組み合わせに光を照射して光増感剤を励起させる第２段階；および、光活性インジケーターの蛍光を測定する最終段階、を含んで成る。各ｓｂｐ構成員は、分析物または分析物と相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合する能力がある。測定された蛍光は、媒体中の分析物の量と相関する。本発明のその他の態様は、ポリヌクレオチド分析物を測定する方法である。該方法は、分析物；１またはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ（ただし、各プローブは、分析物のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つのプローブは、該相補的ヌクレオチド配列とは異なる特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合していするものである）；その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤（ただし、該光増感剤は、該プローブのヌクレオチド配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドに結合しているものである）；および一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし該光活性インジケーター前駆体は該プローブに結合したｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員に結合するものである、を水性媒体中で組み合わせる第１段階；該媒体に光を照射して光増感剤を励起させて一重項酸素を産生させる第２段階；および、光活性インジケーターの蛍光を測定する第３段階、を含んで成る。蛍光は、媒体中の分析物の量と相関する。分析物を測定する方法は、（Ａ）分析物がポリヌクレオチドである場合、（ａ）水性媒体中で、（１）該分析物；（２）１またはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ、ただし各プローブは該分析物のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含有し、かつプローブの少なくとも１つは、特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している該ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものであり、該ｓｂｐ構成員は、該相補的ヌクレオチド配列とは異なるものである；（３）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している該該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する粒子に結合しているか、または組み込まれているものであり；および(４)一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし該光活性インジケーター前駆体は該プローブと結合している該ｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している該プローブと結合している該ｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである、を組み合わせ、（ｂ）該媒体に光を照射し、該光増感剤を励起させて一重項酸素を産生し；そして（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定する；ここで該蛍光は該媒体中の該分析物の量と相関するものである、を含んで成るか；または（Ｂ）分析物がポリヌクレオチド以外である場合、（ａ）（１）分析物を含有する疑いのある媒体；（２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし該光増感剤は第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；および（３）一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし該光活性インジケーター前駆体は第２ｓｂｐ構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している第２ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである、の組み合わせを用意し、（ｂ）該組み合わせに光を照射して、該光増感剤を励起させ；そして（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定すること；ここで、各ｓｂｐ構成員は、該分析物または該分析物に相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合する能力があり、かつ該蛍光は該媒体中の該分析物の量と相関し、該光増感剤は所望により該第１ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部であり、該光活性インジケーター前駆体は所望により該第２ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部である、を含んで成る。本発明の別の態様は、光活性インジケーター前駆体が結合した平均直径２０ないし４０００ナノメーターの懸濁可能な粒子を含んで成る組成物であり、該光活性インジケーター前駆体は、セレニウムまたはテルリウム原子を含有するものである。本発明のまた別の態様は、分析物のアッセイを行うためのキットである。該キットは、パッケージした組み合わせ物中に、該光活性インジケーター前駆体を含む懸濁可能粒子、ただし該光活性インジケーター前駆体はセレニウムまたはテルリウム原子を含有し、かつ該粒子はそれに結合したｓｂｐ構成員を有する；およびｓｂｐ構成員と結合している光増感剤、ただしこれはその励起状態において酸素をその一重項状態に活性化する能力があり、ｓｂｐ構成員の少なくとも１つは、分析物にまたは分析物と相補的なｓｂｐ構成員に結合する能力があるものである、を含んで成る。本態様の別の実施態様では、該キットは、パッケージした組み合わせ物中に、セレニウムまたはテルリウム原子を含有する光活性インジケーター前駆体を含む懸濁可能な第１粒子、ただしこの第１粒子はそれに結合したｓｂｐ構成員を有する；および光増感剤を含む懸濁可能な第２粒子、ただしこの第２粒子はそれに結合したｓｂｐ構成員を有する、を含む組成物を含んで成る。このｓｂｐ構成員の少なくとも１つは、分析物に、または分析物と相補的なｓｂｐ構成員に結合する能力がある。本態様の別の実施態様では、キットは、パッケージした組み合わせ物中に、セレニウムまたはテルリウム原子を含有する光活性インジケーター前駆体、ただしこの光活性インジケーター前駆体は第１ｓｂｐ構成員と結合しているものである；および、その励起状態において酸素をその一重項状態に活性化する能力があり、第２ｓｂｐ構成員と結合しているものである光増感剤を含んで成る。このｓｂｐ構成員は、分析物に、または分析物と結合する能力のあるｓｂｐ構成員に結合する能力がある。本発明の別の態様は、ｓｂｐ構成員である分析物の結合アッセイである。このアッセイは、分析物を含有する疑いのある媒体を、分析物にまたは分析物と相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合する能力のあるｓｂｐ構成員と組み合わせる第１段階；分析物または相補的ｓｂｐ構成員に対するｓｂｐ構成員の結合を検出する第２段階、ただしこの検出は媒体中の光活性インジケーター前駆体を一重項酸素にさらして光活性インジケーターを生成させることを含む；および光活性インジケーターの蛍光を測定する最終段階、を含んで成る。本発明の他の態様は、下記の構造：式中、Ｈは、ＸＲ基に対してシスであり；Ｘは、セレニウムまたはテルリウムであり；Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはスズ原子によりＸに結合している有機または有機金属基であり；そして、Ａは、炭素−炭素基と一緒になるとき（所望により、１またはそれ以上の芳香環と縮合した）脂環式環、または複素環を形成し；一重項酸素を有する化合物と反応すると、ＨおよびＸＲ基が、炭素−炭素二重結合に換わって、その最大吸収で少なくとも１０,０００Ｍ^-1cm^-1 の消光係数、および少なくとも０.１の蛍光放出量子収率を有する蛍光分子が得られる、を含む、光活性インジケーター前駆体として有用な化合物類である。本発明の他の態様は、光活性インジケーター分子の調製法である。この方法は、本発明の化合物（上記のとおり）を一重項酸素と反応させて、その最大吸収で少なくとも１０,０００Ｍ^-1cm^-1の消光係数、および少なくとも０.１の蛍光放出量子収率を有する光活性インジケーターを得ることを含んで成る。本発明の利点の１つは、蛍光光活性インジケーター（光活性インジケーター前駆体と一重項酸素との反応から生じる）が、ヨーロッパ公開特許出願第０５１５１９４号に記載された方法に使用された化学発光化合物の少なくとも１０⁵倍多くの光子を産生できることである。これは、たいてい単一蛍光光活性インジケーター分子を、それが崩壊する前に、１０⁵倍まで励起させることができるからである。従って、本発明において形成される蛍光光活性インジケーター分子は、照射により１万の光子を生成できる。それ故に、この蛍光の検出によって、より高感度のアッセイを提供できる。更に、本発明における光活性インジケーター分子の蛍光の測定では、標準蛍光計の使用が可能であり、一方、前記したアッセイにおける化学発光化合物の活性化により生じる化学発光の検出は、より専門的な分光計を必要とする。図面の簡単な説明図１は、ＤＮＡ検出アッセイ結果のグラフ表示である。各アッセイの結果は、異なる記号で表している。発明の詳細な説明定義本明細書および添付の請求の範囲に使用する下記用語は、特記しない限り、指示した意味を有する： “アルキル”とは、脂環式炭化水素から水素原子１つを除去することにより生じる一価分枝状、または非分枝状基を意味し；低級アルキルおよび高級アルキルの両方を含む。 “低級アルキル”とは、１ないし５の炭素原子を含有するアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル、および同種物を意味する。 “高級アルキル”とは、６以上の炭素原子、通常、６ないし２０の炭素原子を含有するアルキル基、例えば、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、および同種物を意味する。 “アルキリデン”とは、アルキル基の２つの水素原子を同一の炭素原子から取ることによって生じる二価有機基、例えば、エチリデン、および同種物を意味する。 “アルキレン”とは、アルキル基の２つの水素原子を異なる炭素原子から取ることによって生じる二価有機基を意味する。 “脂環式環”とは、不飽和であってもよく、部分的に飽和していてもよい、炭素長５ないし７の環状炭化水素基を意味する。 “アリール”とは、芳香族炭化水素から１原子を除くことにより生じ、１またはそれ以上の芳香環、通常は、１ないし４の芳香環を含有する有機基、例えば、フェニル（ベンゼン由来）、ナフチル（ナフタレン由来）、および同種物を意味する。 “アラルキル”とは、アリール基が結合したアルキル基を有する有機基、例えば、ベンジル、フェネチル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルエチル、および同種物を意味する。 “アルコキシ”とは、式−ＯＲ_aで、Ｒ_aがアルキル基である基、例えば、メトキシ、エトキシ、および同種物を意味する。 “アリールオキシ”とは、式−ＯＲ_bで、Ｒ_bがアリール基である基、例えば、フェノキシ、ナフトキシ、および同種物を意味する。 “アラルコキシ”とは、式−ＯＲ_cで、Ｒ_cがアラルキル基である基、例えば、ベンジルオキシ、１−ナフチルエトキシ、および同種物を意味する。 “アルキルチオ”とは、式−ＳＲ_aで、Ｒ_aがアルキル基である基、例えば、メチルチオ、エチルチオ、および同種物を意味する。 “アリールチオ”とは、式−ＳＲ_bで、Ｒ_bがアリール基である基、例えば、フェニルチオ、ナフチルチオ、および同種物を意味する。 “複素環”とは、炭素原子、および窒素、酸素、および硫黄から成る群から選択される１から３のヘテロ原子からなり、飽和か不飽和かのいずれかであり、その中で、窒素、炭素、または硫黄原子は、所望により酸化されていてもよく、かつ、窒素原子は、所望により４級化されていてもよい、安定な単環、二環、または三環式環系を意味し、上記定義の複素環系のどれもがベンゼン環と縮合しているようなあらゆる環系を含む。複素環系は、任意のヘテロ原子、または炭素原子で置換されていてもよく、その結果、安定な構造を生じる。このような複素環系の例には、ピペリジン、ピペラジン、２−オキソピペラジン、２−オキソピペリジン、２−オキソピロリジン、２−オキソアゼピン、アゼピン、ピロール、４− ピペリドン、ピロリジン、ピラゾール、ピラゾリジン、イミダゾール、イソダゾリン、イミダゾリジン、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、オキサゾール、オキサゾリジン、インダン、イソキサゾール、イソキサゾリジン、モルホリン、チアゾール、チアゾリジン、イソチアゾール、キヌクリジン、イソチアゾリジン、インドール、イソインゾール、インドリン、イソインドリン、オクタヒドロインドール、オキタヒドロイソインドール、キノリン、イソキノリン、デカヒドロイソキノリン、ベンズイミダゾール、チアジアゾール、ジヒドロベンゾフラン、ベンゾフラン、ベンゾピラン、１,４−ベンゾピロン、１,２−ベンゾピロン、ベンゾチアゾール、ベンゾキサゾール、フラン、テトラヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、チアモルホリン、チアモルホリンスルホキシド、チアモルホリンスルホン、およびオキサジアゾールがあるが、これらに限定されるわけではない。本発明の目的に好ましい複素環は、ベンゾピロン類である。 “置換された”とは、分子の水素原子が、ハロゲン等のような単一原子であり得る他の原子、または、有機基などの原子群の一部で置き換わった状況を意味する。 “電子供与基”とは、分子に結合したとき、電子供与基が電子貧弱になって、分子のその他の部分と比べて正に荷電するように分子を分極化する能力がある、即ち、電子密度を低減する置換基を意味する。かかる基は、例示説明であって限定ではないが、アミン類、エーテル類、チオエーテル類、ホスフィン類、ヒドロキシ、オキシアニオン類、メルカプタン類、およびそれらのアニオン類、スルフィド類等であり得る。 “有機基”とは、基内の原子の原子価を満たすのに必要な必須数の水素原子以外の１ないし５０の原子を有する置換基を意味する。一般に、かかる基における主要原子は、炭素（Ｃ）であるが、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）であっても良く、存在するならば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＰは、炭素と、またはお互いの１またはそれ以上と、または水素と、または金属原子と結合して、様々な官能基、例えば、カルボン酸類、アルコール類、チオール類、カルボキサミド類、カルバメート類、カルボン酸エステル類、スルホン酸類、スルホン酸エステル類、リン酸、リン酸エステル類、尿素類、カルバメート類、ホスホルアミド類、スルホンアミド類、エーテル類、スルファイド類、チオエーテル類、オレフィン類、アセチレン類、アミン類、ケトン類、アルデヒド類、ニトリル類、および同等物を形成することができる。このような有機基の例には、アルキル、アルキリジン、アリール、アラルキル、およびヘテロサイクリルがあり、ここで、アルキル、アルキリジン、アリール、アラルキル、またはヘテロサイクリル基は、上記官能基の１またはそれ以上で置換されていてもよいが、これらは例示であって限定ではない。 “有機金属基”とは、金属原子と連結した（上記定義の）有機基を含有する基を意味する。 “分析物”とは、検出すべき化合物または組成物を意味する。分析物は、特異的結合対（ｓｂｐ）の一員を含んで成ることができ、リガンドであっても良く、一価（モノエピトープ性）または多価（多エピトープ性）であり、普通は、抗原性またはハプテン性であり、共通のエピトープ部位または決定因子部位の少なくとも１つを共有する単一化合物または複数の化合物である。分析物は、バクテリアなどの細胞、またはＡ、Ｂ、Ｏ等のような血液型抗原、またはＨＬＡ抗原を持つ細胞、または微生物、例えば、バクテリア類、真菌類、原生動物類、またはウイルスなどの細胞の一部であることができる。多価リガンド分析物は、通常、ポリ（アミノ酸）、即ち、ポリペプチド類およびタンパク質類、ポリサッカライド類、核酸類およびそれらの組み合わせである。このような組み合わせは、バクテリアの成分類、ウイルス類、染色体類、遺伝子類、ミトコンドリア、核、細胞膜、および同等物を含む。ほとんどの場合、当該発明を適用できる多エピトープ性リガンド分析物は、少なくとも約５,０００、より普通には、少なくとも約１０,０００の分子量を有する。ポリ（アミノ酸）の範疇では、対象となるポリ（アミノ酸）は、一般に、分子量約５,０００から５,０００,０００、より普通には、分子量約２０,０００から１,０００,０００である；対象となるホルモン類の間では、分子量は、普通、約５,０００から６０,０００の範囲である。類似の構造的特徴を有するタンパク質類、特定の生物学的機能を有するタンパク質類、特定の微生物、特に疾病を生ぜしめる微生物に関するタンパク質類、等のファミリーについて、タンパク質の多様さを考慮することができる。このようなタンパク質には、例えば、免疫グロブリン類、サイトカイン類、酵素類、ホルモン類、癌抗原、栄養学的マーカー類（nutritional markers）、組織特異的抗原等がある。本発明において対象となる、タンパク質類、血液凝固因子、タンパク質系ホルモン類、抗原性ポリサッカライド類、微生物類、および他の病原体の種類は、米国特許第４,６５０,７７０号に詳細に開示されており、これらの開示は、その全体を本明細書に参照して組み込んである。モノエピトープ性リガンド分析物類は、一般に、分子量約１００から２,０００であり、より普通には、分子量１２５から１,０００である。分析物には、薬剤類、代謝物類、農薬、汚染物質、および同等物がある。対象となる薬剤類の中には、アルカノイド類が含まれる。アルカノイド類の中には、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストロメトルファン、それらの誘導体および代謝物類を含むモルヒネアルカロイド類；コカイン、およびベンジルエクゴニン、それらの誘導体類および代謝物類を含むコカインアルカロイド類；リセルグ酸のジエチルアミドを含む麦角アルカロイド類；ステロイドアルカロイド類；イミナゾイルアルカロイド類；キナゾリンアルカロイド類；イソキノリンアルカロイド類；キニンおよびキニジン、それらの誘導体および代謝物を含むキノリンアルカロイド類がある。薬剤類の次のグループは、エストロゲン類、アンドロゲン類、副腎皮質ステロイド類、胆汁酸類、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンを含む強心性グリコシド類およびアグリコン類、サポニン類およびサポゲニン類、それらの誘導体、および代謝物を含むステロイド類を含む。また、ジエチルスチルベストロールなどのステロイド疑似物質も含む。薬剤類の次のグループは、５から６の環員を有するラクタム類であり、バルビチュレート類、例えば、フェノバルビタールおよびセコバルビタール、ジフェニルヒダントイン、プリミドン、エトスクシイミド、およびそれらの代謝物を含む。薬剤類の次のグループは、炭素原子２から３のアルキルを伴うアミノアルキルベンゼン類であり、アンフェタミン類；エフェドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリンを含むカテコールアミン類；ナルセイン；パパベリン；およびこれらの代謝物を含む。薬剤類の次のグループは、オキサゼパン、クロルプロマジン、テグレトール、それらの誘導体および代謝物を含むベンズ複素環類であり、該複素環は、アゼピン類、ジアゼピン類、およびフェノチアジン類である。薬剤類の次のグループは、プリン類であり、テオフィリン、カフェイン、それらの代謝物類および誘導体類を含む。薬剤類の次のグループは、マリジュアナから誘導されるものを含み、カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールを含む。薬剤類の次のグループは、チロキシン、コルチゾール、トリヨードチロニン、テストステロン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロンなどのホルモン類、アンギオテンシン、ＬＨＲＨなどのポリペプチド類、およびシクロスポリン、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸、その他などの免疫抑制物質である。薬剤類の次のグループは、ビタミン類、例えば、Ａ、Ｂ（例えば、Ｂ₁₂）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＫ、葉酸、チアミンを含む。薬剤類の次のグループは、プロスタグランジン類であるが、水酸化および不飽和の程度および部位によって異なる。薬剤類の次のグループは、トリ環状抗鬱薬類であり、イミプラミン、ジスメチルイミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、トリイミプラミン、クロミプラミン、ドキセピン、およびデスメチルドキセピンを含む。薬剤類の次のグループは、抗腫瘍薬であり、メトトレキセートを含む。薬剤類の次のグループは、抗生物質であり、ペニシリン、クロロマイセチン、テトラサイクリン、テトラマイシン、代謝物類および誘導体類を含む。薬剤類の次のグループは、ヌクレオシド類およびヌクレオチド類であり、適切な糖の付いたＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、アデノシン、グアノシン、チミジン、およびシチジンおよびそれらのリン酸置換体を含む。薬剤類の次のグループは、メタドン、メプロバメート、プロプラノロール、グリセオフルビン、バルプロン酸（valproic acid）、ブチロフェノン類、抗ヒスタミン類、クロラムフェニコール、アトロピンなどの抗コリン作用薬、それらの代謝物類および誘導体類を含む多方面にわたる個々の薬剤類である。疾患状態に関連した代謝物は、スペルミン、ガラクトース、フェニルピルビン酸、および１型ポルフィリンを含む。薬剤類の次のグループは、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、およびアミカシンなどのアミノグルコシド類である。対象となる農薬類の中には、ポリハロゲン化ビフェニル類、リン酸エステル類、チオホスフェート類、カルバメート類、ポリハロゲン化スルフェンアミド類、それらの代謝物類および誘導体類がある。受容体分析物の場合、分子量は、一般に、１０,０００から２×１０⁸、より普通には、１０,０００から１０⁶の範囲である。免疫グロブリン類、ＩgＡ、ＩgＧ、ＩgＥ、およびＩgＭの場合、分子量は、一般に、約１６０,０００から約１０⁶ で変わる。酵素類は、通常、分子量約１０,０００から１,０００,０００の範囲である。天然の受容体は、広範囲に変わるが、一般に、少なくとも分子量約２５ ,０００であり、１０⁶、またはそれ以上の分子量であることもあり、アビジン、ストレプトアビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、チロキシン結合グロブリン、チロキシン結合プリアルブミン、トランスコルチン、等などの物質類を含む。分析物の用語は、更に、下記に定義するポリヌクレオチド類のようなポリヌクレオチド分析物を含む。これらは、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖分子等を含む。また、分析物の用語は、例えば、制限酵素類、アクチベーター類、レプレッサー類、ヌクレアーゼ類、ポリメラーゼ類、ヒストン類、修復酵素類、化学療法薬、および同種物などのポリヌクレオチド結合成分類である受容体を含む。分析物は、宿主由来の体液のような試料中に直接見い出された分子であり得る。この試料は、直接調べることができ、分析物をより容易に検出可能にするために前処理することもできる。更に、対象となる分析物は、対象となる分析物に相補的な特異的結合対構成員などの、対象となる分析物の存在証拠となる成分を検出することにより、測定でき、これらの存在は、対象となる分析物が試料中に存在する場合のみ、検出される。従って、分析物の存在証拠となる成分が、アッセイにおいて検出される分析物となるのである。体液は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、たん、脳脊髄液、涙、粘液、および同等物であることができる。 “特異的結合対（ｓｂｐ）構成員”とは、他の分子の特定の空間的および極性の構成と特異的に結合し、それによって、他の分子の特定の空間的および極性の構成と相補的なものとして定義される領域を表面上または腔内に有する、１または２つの異なる分子を意味する。特異的結合対の一員は、リガンドおよび受容体（アンチリガンド）として表す。これらは、普通、抗原−抗体などの免疫学的ペアの一員であり、一方、ビオチン−アビジン、ホルモン類−ホルモン受容体類、核酸二本鎖分子、ＩgＧ−プロテインＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどのポリヌクレオチド対、および同等物などの他の特異的結合対は、免疫学的ペアではないが、本発明、およびｓｂｐ構成員の定義に含まれる。 “ポリヌクレオチド”とは、天然状態で、約６ないし５００,０００またはそれ以上のヌクレオチドを有し、かつ単離状態で、約６ないし５０,０００またはそれ以上のヌクレオチド、普通は、約６ないし２０,０００ヌクレオチド、より頻繁には、６ないし１０,０００ヌクレオチドを有する、ポリマーヌクレオチドである化合物または組成物を意味する。“ポリヌクレオチド”の用語は、天然に生じる、または合成的に生成される、任意の供給源由来の、精製または非精製形態の、ＤＮＡ（dsＤＮＡおよびssＤＮＡ）およびＲＮＡ、普通はＤＮＡを含む、オリゴヌクレオチド類および核酸類も含み、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、クロロプラストＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド類、またはそれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド類、微生物類、例えば、バクテリア、酵母類、ウイルス類、ウイロイド類、糸状菌、真菌、植物、動物、ヒトなどの生物学的物質のゲノム、それらのフラグメント類および同等物であり得る。 “ポリヌクレオチドプローブ”とは、標的ポリヌクレオチド分析物の塩基配列と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸分子を意味する。プローブ類は、一般に、化学的に合成された長さ６から２００塩基対のＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド類から成り、標的ポリヌクレオチド分析物と安定なハイブリダイゼーション複合体を形成できなければならない。 “リガンド”とは、受容体が天然に存在するか、または調製できる、あらゆる有機化合物を意味する。また、リガンドの用語は、修飾リガンド類であるリガンド類似体を含み、普通は分子量１００以上の、普通は有機基、または分析物類似体であるリガンド類似体であり、受容体に対する類似リガンドと拮抗でき、該修飾により、リカンド類似体を他の分子に結合させる手段を提供するものである。リガンド類似体は、必要ではないが、より多くの水素が、リガンド類似体をハブまたは標識に連結させる結合で置換されている点で、普通、リガンドとは異なる。リガンド類似体は、リガンドに対するのと同様の方法で受容体に結合できる。類似体は、例えば、リガンドに対する抗体のイディオタイプを指向する抗体であってもよい。 “受容体”または“アンチリガンド”とは、分子の特定の空間的および極性の構成、例えば、エピトープ性部位または決定因子部位を認識する能力のあるあらゆる化合物または組成物を意味する。例示的な受容体類には、天然に生じる受容体類、例えば、チロキシン結合グロブリン、抗体類、酵素類、Ｆabフラグメント類、レクチン類、核酸類、アビジン類、プロテインＡ、バースター（barstar）、補体成分Ｃlq、および同等物がある。アビジンは、卵白アビジンおよび他の供給源由来のビオチン結合タンパク質類、例えば、ストレプトアビジンを含むことを意図する。 “特異的結合”とは、２つの異なる分子のうちの１つが、もう一方の分子に対し、その他の分子類の場合の実質的に低い認識と比べて、特異的に認識することを意味する。一般に、この分子は、その表面上、または腔内に、２つの分子間の特異的認識を生ぜしめる領域を有する。特異的結合の例は、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用、およびその他である。 “非特異的結合”とは、特異的表面構造から比較的独立している分子間の非共有結合を意味する。非特異的結合は、分子間の疎水相互作用を含む幾つかの要因から生じ得る。 “抗体”とは、もう一方の分子の特定の空間的および極性の構成に特異的に結合し、それによって、もう一方の分子の特定の空間的および極性の構成と相補的であると定義される免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができ、当業者にはよく知られた技術、例えば、宿主の免疫感作、および血清（ポリクローナル）の収集により、または連続的ハイブリッド細胞ラインを調製し、分泌タンパク質（モノクローナル）を調製することにより、または、クローニングして、天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列またはその変異バージョンを発現させることにより、調製できる。抗体類は、完全な免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントを含み、免疫グロブリン類には、様々な分類およびアイソタイプがあり、例えば、ＩgＡ、ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧ1、ＩgＧ2a、ＩgＧ2b、ＩgＧ3、Ｉg Ｍ、等である。それらのフラグメント類は、Ｆab、ＦvおよびＦ(ab')₂、Ｆab'、および同等物を含むと考えられる。加えて、免疫グロブリン類またはそれらのフラグメントの凝集体類、ポリマー類、およびコンジュゲート類は、特定分子の結合親和性を維持するのに十分適切な場合に、使用することができる。 “連結基”とは、分子間の共有結合を意味する。連結基は、分子、例えば、光増感剤、光活性インジケーター前駆体、ｓｂｐ構成員、または連結されている粒子または粒子の一部と結合した分子、の性質に依存して変わる。光増感剤または光活性インジケーター前駆体に普通に存在するか、または導入される官能基類は、これらの分子をｓｂｐ構成員に、またはリポソームまたは油滴の脂肪親和性成分、ラテックス粒子、シリコン粒子、金属ゾル、または染料クリスタライトなどの粒子に連結させるために採用されるものである。ほとんどの場合、カルボニル官能性が連結基として有用であり、例えば、オキソカルボニル基、例えば、アルドヒド類、アセチルおよびカルボキシ基、および非オキソカルボニル基（窒素および硫黄類似体を含む）、例えば、アミジン、アミデート、チオカルボキシ、およびチオノカルボキシである。オキソ以外の別の官能性もまた、連結基として有用であり、例えば、ハロゲン、ジアゾ、メルカプト、オレフィン（特に、活性化オレフィン）、アミノ、ホスホロ、および同種物である。連結基の詳しい説明は、米国特許第３,８１７,８３７号に見ることができ、この開示は、本明細書に参照して組み込んである。連結基は、結合であってもよいし、１から１００原子の鎖、普通は、約１ないし７０原子の鎖、好ましくは１ないし５０原子の鎖、より好ましくは１ないし２０原子の鎖であってもよく、それぞれ独立して、通常は、炭素、酸素、硫黄、窒素、およびリンからなる群から選択される。連結基におけるヘテロ原子の数は、通常、約０から２０の範囲であり、普通は、約１から１５、より好ましくは２ないし６の範囲である。鎖中の原子は、有機基のところで記載したのと同様の方法により水素以外の原子で置換することができる。一般則として、特定の連結基の長さは任意に選択することができ、合成の好便さを提供し、結合ｓｂｐ構成員の相互干渉を最少化し、蛍光エネルギーアクセプターなどの所望の基、重金属などの項間交差の触媒、および同種物の組み込みを可能にすることができる。連結基は、脂肪族、または芳香族であり、ジアゾ基を伴う場合でも、芳香族基は、通常含まれる。ヘテロ原子が存在するとき、酸素は、通常、炭素、硫黄、窒素、またはリンと結合したオキソまたはオキシとして存在し；窒素は、通常、炭素、酸素、硫黄、またはリンと結合したニトロ、ニトロソ、またはアミノとして存在し；硫黄は、酸素に倣うものであるが；リンは、炭素、硫黄、酸素、または窒素に結合しており、通常、ホスホン酸およびリン酸モノまたはジエステルとして存在している。連結基とコンジュゲートされた分子との間の共有結合形成における共通の官能性は、アルキルアミン、アミジン、チオアミド、エーテル、尿素、チオウレア、グアニジン、アゾ、チオエーテル、およびカルボキシレート、スルホネート、およびリン酸エステル類、アミド類およびチオエステル類である。たいていは、本発明の光増感剤および光活性インジケーター前駆体が、粒子、表面、ｓｂｐ構成員と連結している場合、それらは、非オキソカルボニル基（窒素および硫黄類似体を含む）、ホスフェート基、アミノ基、アルキル化剤（例えば、ハロまたはトシルアルキルなど）、エーテル基（ヒドロキシを含む）、チオエーテル基（メルカプトを含む）、オキソカルボニル基（例えば、アルデヒドまたはケトン）、または活性オレフィン、例えば、ビニルスルホン、またはα,β −不飽和エステルまたはアミドを有する。これらの官能性は、アミン基、カルボキシル基、活性オレフィン、またはアルキル化剤、例えば、ブロモアセチルなどの官能性を有する粒子、表面、またはｓｂｐ構成員に連結するものである。アミノおよびカルボン酸、またはその窒素誘導体、またはリン酸を連結させると、アミド類、アミジン類、およびホスホルアミド類が形成される。メルカプタンおよび活性化オレフィンを連結させると、チオエーテル類が形成される。メルカプタンとアルキル化剤を連結させると、チオエーテル類が形成される。アルデヒドおよびアミンを還元条件下で連結させると、アルキルアミンが形成される。カルボン酸またはリン酸、およびアルコールを連結させると、エステルが形成される。 “親水性または水溶解度を分与する基または官能性”とは、親水性官能性を意味し、水による固体の湿潤度、および結合する化合物の水への溶解度を増大するものである。このような官能基または官能性は、有機基であることができ、スルホネート、スルフェート、ホスフェート、アミジン、ホスホネート、カルボキシレート、ヒドロキシル、特にポリオール類、アミン、エーテル、アミド、および同等物であり得る。官能基の例は、カルボキシアルキル、スルホノキシアルキル、ＣＯＮＨＯＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＣＯ−（グリコサミン）、糖類、デキストラン、シクロデキストリン、ＳＯ₂ＮＨＣＨ₂ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＣＯＮＨＣＨ₂ＣＨ₂ ＳＯ₃Ｈ、ＰＯ₃Ｈ₂、ＯＰＯ₃Ｈ₂、ヒドロキシル、カルボキシル、ケトン、およびそれらの組み合わせである。上記官能性の殆どは、光増感剤または光活性インジケーター前駆体のｓｂｐ構成員または支持体への付着を可能にする付着基としても利用できる。 “親油性または脂質溶解度を分与する基または官能性”とは、親油性官能性を意味し、水による表面の湿潤度、および結合する化合物の水への溶解度を低減するものである。このような官能基または官能性は、１ないし５０またはそれ以上の原子、普通は、水素またはハロゲンで置換された炭素原子、を含有でき、アルキル、アルキリデン、アリール、およびアラルキルであることができる。親油性基または官能性は、通常、１ないし６の直鎖状または分枝状の、少なくとも炭素原子６、さらに普通には、少なくとも炭素原子１０、さらに、好ましくは少なくとも炭素原子１２で、普通は炭素原子３０を越えない、脂肪族基を有するものである。脂肪族基は、脂環式、複素環式、または芳香環式であり得る５員環ないし６員環に結合している場合もある。 “光増感剤”とは、本発明の場合、準安定状態、普通は三重項状態、に励起され得る分子を意味し、分子酸素が近くにある場合に、直接または間接的にそのエネルギーを、酸素に転移でき、同時に、しばしば一重項酸素または¹Ｏ₂（¹△_g）として表される酸素の高反応性励起状態まで酸素を励起させることができるものである。光増感剤は、普通、光の吸収により、または適切な励起状態の供与体からのエネルギー転移により、励起されるが、化学励起、電子化学活性化、または他の手段によっても励起され得る。光増感剤の励起は、普通、外部供給源からの光の照射によって引き起こされるものである。本発明の光増感剤は、普通、２５０ないし１１００nm、好ましくは３００ないし１０００nm、より好ましくは４５０ないし９５０nmの範囲の波長で吸収極大を有し、その吸収極大で、５００Ｍ^-1 cm^-1以上、好ましくは少なくとも５０００Ｍ^-1cm^-1、より好ましくは少なくとも５０,０００Ｍ^-1cm^-1の消光係数を伴う。光増感剤による光の吸収の後に生じる励起状態、普通は三重項状態、の寿命は、普通、酸素不在下で少なくとも１００ nsec、好ましくは少なくとも１μsecである。一般に、寿命は、酸素へエネルギーを転移させるのに十分に長くなければならず、普通は、１０^-5ないし１０^-3Ｍ（媒体によって変わる）の範囲の濃度で存在するものである。光増感剤の励起状態は、普通、その基底状態とは異なるスピン量子数（Ｓ）を有するものであり、普通は、通常の場合のように基底状態が一重項（Ｓ＝０）であるとき、三重項（Ｓ＝１）状態である。好ましくは、光増感剤は、高い項間交差収率を持つ。即ち、光増感剤の励起は、少なくとも１０％、望ましくは少なくとも４０％、好ましくは８０％以上の効率で長い生存状態（普通は三重項）を生じる（量子収率は、普通０.５以下、好ましくは０.１以下）。本発明の光増感剤は、比較的光安定性であり、産生された一重項分子酸素と効率良く反応しない。最も有用な光増感剤には、幾つかの構造的特徴が存在する。多くの光増感剤は、堅く固定された、少なくとも１つ、頻繁には、３つまたはそれ以上のコンジュゲート化二重結合または三重結合、多くは芳香性構造、を有する。それらは、項間交差を加速する少なくとも１つの基、例えば、カルボニルまたはイミン基、または周期表の３列から６列から選択される重原子、特に、ヨウ素または臭素、を含有することが多いか、またはそれらは、多芳香性構造を有することが多い。典型的な光増感剤には、アセトン、ベンゾフェノン、および９− チオキサントンなどのケトン類；エオシンおよびローズベンガルなどのキサンテン類；ブクミンステルフレレンおよび９,１０−ジブロモアンスラセンなどの多芳香族化合物類；ヘマトポルフィリンおよびクロロフィルなどの金属ポルフィリン類を含むポルフィリン類；オキサジン類；シアニン類；スクアレート染料類；フタロシアニン類；メロシアニン類；メチレンブルー等などのチアジン類、およびこれらの化合物の項間交差を高め、それらの化合物をより親油性またはより親水性にさせるために、および／または、例えば、ｓｂｐ構成員に付着させるための付着基として、有機基により置換された、それらの化合物の誘導体類がある。本発明において利用され得るその他の光増感剤の例は、上記特性を有するもの、およびＮ.Ｊ.ツロ、“モレキュラー・フォトケミストリー”、１３２頁、Ｗ.Ａ. ベンジャミン社、ニューヨーク、１９６５年に列挙されているものである。本発明の光増感剤は、光増感剤を、油滴、リポソーム、ラテックス粒子、および同等物などの懸濁可能な粒子に組み込む場合に、親油性成分への溶解を確実にするため、好ましくは、相対的に非極性である。 “光活性インジケーター前駆体”とは、一重項酸素と反応して、光活性インジケーターを形成する、または結果的に光活性インジケーターに変換される補助化合物と反応できる化合物を形成するような分子を意味する。光活性インジケーター化合物を導く化合物類を与え得る一重項酸素の反応には、数種の型がある。採用する反応の型、および望まれる光活性インジケーターの選択は、本発明で採用される光活性インジケーター前駆体および補助化合物類の構造に対する指針を提供するものである。光活性インジケーター前駆体は、好ましくは、非常に迅速、普通は、少なくとも１０⁴ないし１０⁶sec^-1、好ましくは、少なくとも１０⁶ないし１０⁸sec^-1、より好ましくは、＞１０⁸sec^-1である一重項酸素との反応を受けるものである。反応の初期生成物は、反応することにより光活性前駆体を与える中間体であり、この中間体は、好ましくは、一重項酸素を形成してから、光にさらすことによって光活性インジケーターから放出される蛍光を検出する間の所望の時間に比べて短い寿命を有するものである。一重項酸素産生と蛍光検出を同時に行うためには、寿命は、普通、１０^-3ないし１０秒、好ましくは１０^-3秒である。一重項酸素の産生と蛍光検出が連続している場合、寿命は、１０^-3秒から３０分またはそれ以上、好ましくは＜１秒ないし６０秒で変わり得る。一重項酸素の高速度の反応は、一重項酸素反応性基を、電子豊富な光活性インジケーター前駆体中に提供することにより、達成される。これらの基は、普通、オレフィンまたはアセチレン、ヒドラジンおよびヒドロキシルアミン誘導体類、セレナイド類およびテルライド類であるが、これらの基に限定されるわけではない。例えば、テルライド類は、迅速に一重項酸素と反応して、オレフィンを生成することから、特に有用であることが見い出されている。反応速度は、テルリウムの電子利用可能性（酸化電位）に依存している。例えば、アリール環上の電子供与基をテルリウム原子上に置換すると、速度を増大できる。テルリウムをセレニウム（次により低いカルコゲニド）に変えると、速度は減少するが、分子の酸化安定性は増大する。光活性インジケーター前駆体が、ヒドラジンまたはヒドラジドを含有するとき、一重項酸素との反応により、二重結合を生成できる。例えば、一重項酸素は、下記反応に例示するように、ヒドラジド類を直接、蛍光光活性インジケーター類に変換できる：ヒドラジンの酸化電位は、高速反応を提供するのに重要な要因である。アシル基（例えば、ヒドラジドにおけるように）などの電子求引基類は、反応を遅くするにもかかわらず、本発明においては、光活性インジケーター前駆体としてアシルヒドラジド類およびジアシルヒドラジド類を依然使用できる。反応が十分に迅速である場合は、しばしば、反応を塩基の存在下で加速させることができる。例えば、３−アミノフタロイルヒドラジドは、強塩基の存在下で、電子豊富であり、かつ一重項酸素と迅速に反応して光活性インジケーターとしての３−アミノフタレートを形成できるアニオンを形成する。しかしながら、ヒドロキシルイオンは、懸濁可能な粒子が疎水性マトリックス内に光活性インジケーター前駆体を含有する場合、塩基として使用できない。その代わり、アガロースなどの親水性粒子類を使用して、ヒドロキシルイオンへのアクセスを可能にすることができる。普通、粒子が親水性であるとき、光活性インジケーター前駆体は、懸濁可能な粒子と共有結合するものである。有用な一重項酸素反応のまた別の例は、ヨーロッパ公開特許出願第０５１５１９４号に記載されているような電子豊富オレフィンとの反応である。２つの基本的な型の反応が記載されている。これらの１つは、下記トランスホーメーションにより例示される“エゾ”反応である：この反応は、二重結合の位置をシフトし、ヒドロペルオキシドを生成する。シフトした二重結合は、光活性インジケーター前駆体の２つの助色団基のコンジュゲーションを引き起こすことができ、そうして、蛍光光活性インジケーターを生成できる。他の光活性インジケーター前駆体は、一重項酸素と反応することにより、酸化可能基と本質的に反応して蛍光光活性インジケーターを生じることができるヒドロペルオキシド類を形成する。かかる前駆体、および、続く反応および生成物の一例には、下記がある：別法として、一重項酸素と光活性インジケーター前駆体との反応により形成されたヒドロペルオキシド、例えば、１,３−ジフェニルプロペンは、蛍光光活性インジケーターを形成するための補助化合物として存在するロイコ型の染料を酸化するように働くことができる。このヒドロペルオキシドは、補助化合物におけるＶ群元素を酸素化して、関連する蛍光化合物の電子供与消光剤として働かせることができる。例えば、補助化合物：は、蛍光性が乏しいが、ヒドロペルオキシドにより酸素化して、より高度の蛍光化合物：とすることができる。これとは別に、補助化合物は、ヒドロペルオキシドと反応することにより、後に除去されて蛍光光活性インジケーターを形成し得る中間体を生成し得る、セレニウムまたはテルリウム原子を有していてもよい。別法として、光活性インジケーター前駆体は、一重項酸素とゆっくりと反応するか、または全く反応しないが、一重項酸素のヒドロペルオキシド反応生成物および補助分子とは反応する。例えば、下記反応において、補助化合物を一重項酸素と反応させてヒドロペルオキシドを形成し、次いで、式(Ｉk)の光活性インジケーター前駆体と反応させて、蛍光光活性インジケーターを形成する：これらの各例において、補助化合物および光活性インジケーター前駆体を、共有結合的に連結させることができる。このような場合、生じた分子を光活性インジケーター前駆体として表す。オレフィン類と一重項酸素との第２の典型的な反応は、ジオキセタンを形成する２＋２付加である。この反応は、結合破壊（bond breaking）を導くことができ、従って、基本的な蛍光分子から消光基（quenching group）を分離できる。これとは別に、結合破壊工程により、蛍光物質であり得るか、または蛍光分子を導き得る後の反応を受けることができる、ケトン、アルデヒド、またはエステルを導くことができる。上記全てのオレフィン反応において、オレフィンをエーテル類、チオエーテル類、アミン類、および同種物などの電子供与基で置換すれば、その速度は速まる。一重項酸素のまた別の型の反応は、ジエン類を用いる４＋２付加環化である。かかる反応は、最初、エンドペルオキシド類を導く。ある場合において、エンドペルオキシド類は、適切に配置された基と反応して、蛍光物質であり得るラクトンまたはラクタムを提供できる活性エステル類または無水物類に転位できる。例えば、下記反応式において形成されたエンドペルオキシドは、転位して蛍光ラクトンを形成する：別法として、エンドペルオキシド類は、上記ヒドロペルオキシド類のところで十分に記載したとおり、光活性インジケーター前駆体を酸化できる。蛍光光活性インジケーター分子を生成するための、光活性インジケーター前駆体と一重項酸素との反応の更なる例は、以下に例示説明する：従って、光活性インジケーター前駆体の構造は、採用する特定の一重項酸素反応に依存するものであり、普通は、光活性インジケーターを生成するのに必要な一重項酸素との反応により開始される後の反応が、比較的迅速に進むことが確実であるように設計されている。加えて、光活性インジケーター前駆体の構造は、所望の吸収および放出波長を有し、比較的高い、好ましくは、＞０.１、より好ましくは０.４以上の蛍光量子収率、および所望の励起波長で高い、好ましくは＞１０００Ｍ^-1cm^-1、より好ましくは＞１０,０００Ｍ^-1cm^-1の消光係数を有する、光活性インジケーターの形状を導くものである。本発明の好ましい光活性インジケーター前駆体は、下記構造（Ｉ）：式中、Ｈは、ＸＲ基に対してシスであり；Ｘは、セレニウムまたはテルリウム原子であり；Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはスズ原子によりＸに結合する有機または有機金属基であり；および、Ａは、炭素−炭素基と一緒になるとき（所望により、１またはそれ以上の芳香環と縮合した）脂環式環、または複素環を形成し；一重項酸素を有する化合物と反応すると、ＨおよびＸＲ基が、炭素−炭素二重結合に換わって、その吸収極大で少なくとも１０,０００^-1cm^-1の消光係数、および少なくとも１０％の蛍光量子効率を有する蛍光分子を生ずる、を含有する化合物類を含む。これらの化合物類の中で特に好ましいのは、Ｘがテルリウムである化合物類である。最も好ましいのは、下式の化合物である：式中、Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはスズ原子によりＸに結合する有機または有機金属基であり；Ｒ¹は、水素またはアルキルであり；残りの水素原子の４つまでが、一緒になって１またはそれ以上の脂環式環または芳香環式環を形成し得るアルキルまたはアルキレン置換基により置換されてもよい。本明細書に開示した構造（Ｉ）を含有する化合物類は、その構造の誘導体類、例えば、式（Ｉａ）の化合物、式（Ｉｆ）の化合物、または式（Ｉｋ）の化合物として本明細書には表している。Ｘがテルリウムであるような化合物類、およびこの化合物と一重項酸素との反応により形成される蛍光光活性インジケーター分子の例を下記に与える：目下、本発明の好ましい光増感インジケーター前駆体は、上記式（Ｉｅ）および（Ｉｆ）の化合物類である。これらの化合物類におけるフェニルテルリジルラジカル（−ＴeＣ₆Ｈ₅）を、他のテルリウム誘導体類、例えば、ＴeＳiＣ(ＣＨ₃)₃、およびＴeＳn((ＣＨ₂)₃ ＣＨ₃)₃に換えることができ、また、フェニル基を、好ましくは−Ｎ(ＣＨ₃)₂および−ＯＣＨ₃などの電子供与基で置換することができる。Ｘがセレニウムである場合は、セレニウムを強電子供与基または原子、例えばスズなどによって置換するのが好ましい。他の分類の光活性インジケーター前駆体も本発明に使用できる。例えば、一重項酸素との反応において化学発光する化合物類は、本発明の光活性インジケーターとして働くことができる蛍光生成物に変換されることが多い。このような光活性インジケーター前駆体、および一重項酸素との反応の際に生成される光活性インジケーターの例には、下記がある： “光活性インジケーター”とは、波長２５０ないし１１００nm、好ましくは３００ないし９５０nmの光を吸収した後、蛍光または燐光、好ましくは蛍光により光を放出するか、またはその励起エネルギーをアクセプター分子に伝達し、その際に蛍光または燐光により光を放出する分子を意味する。好ましくは、放出量子数は、高く、普通は少なくとも０.１、好ましくは少なくとも０.４、より好ましくは０.７以上であり、吸収極大の消光係数は、普通、５０００m^-1cm^-1である。本発明の光活性インジケーターは、代表的なものとして、蛍光化合物、例えば、典型的には、３００および４００ナノメーターの間の光を吸収し、４００および５００ナノメーターを放出する蛍光増白剤などの蛍光化合物類；ロダミンおよびフルオレセインなどのキサンテン類；ビマン類；ウンベリフェロンなどのクマリン類；ダンシルなどの芳香族アミン類；スクアレート染料類；ベンゾフラン類；シアニン類、メロシアニン類、希土キレート類、および同等物などである。燐光物質である光活性インジケーター類は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、ピレン、アンスラセン、およびアセナフテンなどの多芳香族化合物類を含む。光活性インジケーターは、クロメン類を含む。アクセプター分子にエネルギーを伝達できる光活性インジケーターは、普通、２５０ないし５５０nmで吸収するものである。かかるアクセプター分子は、発光物質であり、上記発光物質および燐光光活性インジケーター類のいずれもを含むことができる。 “蛍光を測定する”とは、光の照射による励起の際に本発明の光活性インジケーターから放出された光の量の検出および算出を意味する。光活性インジケーターの蛍光は、普通、光の照射により光活性インジケーターを励起させ、同時に、そこから放出される光（即ち、蛍光）を検出することにより、測定されるものであるが、その他の蛍光検出方法も本発明により実施される。蛍光の測定は、光が直接的に吸収されるのか、または間接的に吸収されるのかどうか、または放出が励起一重項状態から起こるのか、またはより高い多重項の状態から起こるのかどうかにかかわらず、光の照射と同時に、または照射後直ちに光活性インジケーターにより放出される光の検出を含むことを意図されている。蛍光の測定は、光増感剤による光の吸収により開始される化学励起以外の化学励起により励起された供与体からのエネルギーの伝達後に光活性インジケーターから放出される光の測定もまた含むことを意図されている。例えば、光活性インジケーターの蛍光の測定は、例えば、過酸化水素とペルオキシダーゼをルミノールに添加することによる化学発光分子の活性化、およびルミノール反応生成物から光活性インジケーターへのエネルギー伝達の結果として光活性インジケーターから放出される光の測定を含む。 “支持体”または“表面”とは、多孔性または非多孔性水不溶性物質を含んでなる表面を意味する。この表面は、多くの形、例えば、ストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子、および同等物のいずれか１つを持つことができる。この表面は、親水性か、または親水性にさせる能力があるものであり、シリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナなどの無機粉末；天然ポリマー物質、特にセルロース物質およびセルロースから誘導される物質、例えば、紙、例えば、濾紙、クロマトグラフ用ペーパー等を含む繊維；合成または修飾化天然由来ポリマー類、例えば、ニトムセルロース、セルロース、アセテート、ポリ(ビニルクロリド)、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ(４−メチルブテン)、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ(エチレンテレフタレート)、ナイロン、ポリ(ビニルブチレート)、等；これらは、単独で、または他の物質と併せてのいずれかで使用される；バイオガラスとして利用できるガラス、セラミック類、金属類、および同等物を含む。リポソーム、脂質小胞、および細胞などの天然または合成アセンブリーも採用できる。支持体または表面へのｓｂｐ構成員の結合は、一般に文献から入手できるよく知られた技術により達成され得る。例えば、“インモビライズド・エンザイムス ”、千畑一郎、ハルステッド・プレス、ニューヨーク（１９７８年）、およびクアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２４巻、３０５９頁（１９７０年）参照。表面は、普通、多官能性であるか、または、多官能性化される能力があるか、または、特異的または非特異的結合または非共有相互作用により、ポリヌクレオチド、ｓｂｐ構成員、光増感剤、および／または光活化学発光化合物を結合する能力がある。広範囲の官能基が利用でき、また組み込むことができる。官能基には、カルボン酸類、アルデヒド類、アミノ基類、シアノ基類、エチレン基類、ヒドロキシル基類、メルカプト基類、および同等物がある。広範囲の化合物類を表面に連結させる方法は、よく知られており、文献に詳細に例示説明されている。例えば、クアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２４巻、３０５９頁（１９７０年）参照。オリゴヌクレオチドまたはｓｂｐ構成員に対する連結基の長さは、連結される化合物の性質、連結される化合物と特異的結合特性に関する表面との距離の影響、その他に依存して、広範囲に変わる。 “懸濁可能な粒子”とは、少なくとも２０nmで直径約２０ミクロン以下であり、普通は、少なくとも約４０nmで約１０ミクロン未満、好ましくは、約０.１０から２.０ミクロンであり、かつ普通は、約４ピコリットル未満の容量を有する、水に懸濁させることができる粒子を意味する。懸濁可能な粒子は、有機物または無機物、膨張性または非膨張性、多孔性または非多孔性であることができ、好ましくは、密度近似水（一般に約０.７から１.５ｇ／ml）のものであり、透明、部分的に透明、または不透明であり得る物質から成る。懸濁可能な粒子は、普通、荷電しており、好ましくは負に荷電している。この懸濁可能な粒子は、固体（例えばネポリマー、金属、ガラス、有機物および鉱物、塩類、およびケイソウなどの無機物）、油滴（例えば、炭化水素、フルオロカーボン、シリコン液）、または小胞（例えば、合成物、例えばリン脂質、または他の脂質、例えば、リン酸ジアルキル類、または天然物、例えば、細胞およびオルガネラ）であることができる。懸濁可能な粒子は、ラテックス粒子または有機または無機ポリマーから成る他の粒子；脂質小胞、例えば、リポソーム；リン脂質小胞；油滴；シリコン粒子；金属ゾル；細胞；および染料クリスタライトであっても良い。有機物の場合は、懸濁可能な粒子は、ポリマー類、付加または縮合ポリマーのいずれかであることができ、アッセイ媒体に容易に懸濁可能である。有機懸濁可能粒子は、また、その表面でｓｂｐ構成員と（直接的、または間接的のいずれかで）結合し、かつ光増感剤または光活性インジケーター前駆体と、その表面で結合するか、その容量内で組み込むために、吸着性であるか、または官能性を与えることができるものである。この懸濁可能な粒子は、天然由来物質、合成的に修飾される天然由来物質、および合成物質から誘導できる。脂質二重層のような天然または合成アセンブリー、例えば、リポソーム類、および非リン脂質小胞が好ましい。対象となる粒子の有機ポリマーの中には、ポリサッカライド類、特に、架橋ポリサッカライド類、例えば、セファロースとして入手できるアガロース、セファデックスおよびセファクリルとして入手できるデキストラン、セルロース、スターチ、および同等物；付加ポリマー類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリレートおよびメタクリレートの誘導体類のホモポリマー類およびコポリマー類、特にエステル類、およびハイドロゲルを含む遊離のヒドロキシル官能性を有するアミド類、および同等物がある。無機ポリマーには、バイオガラスとして入手できるガラス類および同等物がある。ゾルは、金、セレニウム、および他の金属類を含む。懸濁可能な粒子は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、等のような分散させた水不溶性染料であっても良く、光増感剤として働くこともできる。懸濁可能な粒子は、ケイソウ、細胞、ウイルス粒子、油滴、アルキルトリグリセライドなどの脂肪粒子、マグネトソーム、細胞核、および同等物を含む場合もある。非ポリマー性粒子を使用する場合、この粒子サイズは、粉砕、超音波処理、振動などの機械的手段により大きい粒子を小さい粒子に砕くことによって変わり得る。上記定義の表面または支持体同様、懸濁可能な粒子は、普通、多官能性であるか、または多官能性にさせることができるか、または、特異的、非特異的共有または非共有相互作用により、ｓｂｐ構成員、光増感剤、または光活性インジケーター前駆体に結合させることができる。広範囲の官能基が利用でき、また組み込むことが出来る。官能基の例には、カルボン酸類、アルデヒド類、アミノ基類、シアノ基類、エチレン基類、ヒドロキシル基類、メルカプト基類、および同等物がある。この粒子とｓｂｐ構成員、化学発光化合物、または光増感剤との共有結合を採用する場合、連結法は、よく知られており、文献に十分に例示説明されいる。例えば、クアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２４巻、３０５９頁（１９７０年）参照。連結基の長さは、連結される化合物の性質、連結される化合物と特異的結合特性に関する表面との距離の影響、分析物、その他に依存して、広範囲に変わる。光増感剤および／または光活性インジケーター前駆体は、懸濁可能な粒子に溶解するか、または共有結合するものを選択できるが、ただし、光増感剤および光活性インジケーター前駆体は、同一の粒子に結合しない。非共有結合のとき、この化合物と粒子は、普通、全て疎水性であり、化合物が粒子から分離する能力および同一粒子に結合する能力を低減する。光増感剤と光活性インジケーターの両方が同一粒子に結合するという問題は、化合物の１つまたは両方のいずれかを粒子に共有結合させ、それによって、各化合物を親水性か、または疎水性にさせることにより最小限度に押さえることができる。各粒子に結合した光増感剤または光活性インジケーター前駆体分子の数は、少なくとも１つであって良く、粒子が光増感剤または光活性インジケーター前駆体分子全体からなるために十分に高い数であり得る。分子の好ましい数は、アッセイにおけるバックグラウンドに対して最も高いシグナルを提供するように経験的に選択される（シグナルは、粒子がお互いに結合するような条件で決められ、バックグラウンドは、粒子が結合しない場合のものである）。通常、光増感剤および光活性インジケーター前駆体の粒子中の濃度は、１０^-8から５Ｍ、普通は、１０^-5から１０^-1Ｍ、好ましくは、１０^-3から１０^-1Ｍの範囲である。 “油滴”とは、例えば、リン脂質、スフィンゴミエリン、アルブミン、その他などの両親媒性分子である乳化剤でコートされ、安定化された親油性化合物を含んで成る液体またはワックス状粒子を意味する。リン脂質は、脂肪族ポリオールの脂肪族カルボン酸エステルを基礎とするものであり、少なくとも１つのヒドロキシル基が、約８から３６、より普通には、約１０から２０の炭素原子のカルボン酸エステルで置換されており、０から３のエチレン不飽和部位、より普通には、０から１のエチレン不飽和部位、および、ホスフェートで置換されリン酸エステルを形成する少なくとも１つの、普通は１つのみのヒドロキシル基を持つ。ホスフェート基を、さらに、ジまたはより多い官能性であり、一般にヒドロキシルまたはアミノ基を有する小さい脂肪族化合物で置換する場合もある。油滴は、適切なリン脂質化合物を界面活性剤、アニオン、カチオン、または非イオンと合わせ、ただし、界面活性剤は、混合物の約０.１から０.４重量パーセント、より普通には、約０.１から２０重量パーセントである、さらに、水性媒質中の混合物を超音波処理またはボルテキシングなどの振動処理にかけることにより、常法に従い作成できる。例示的なリン親油性化合物には、炭化水素油類、フルオロカーボンを含むハロカーボン類、アルキルフタレート類、トリアルキルホスフェート類、トリグリセライド類、等がある。ｓｂｐ構成員は、普通、油滴の表面に吸着するか、または油滴の表面成分に直接的、または間接的に結合するものである。ｓｂｐ構成員を液体粒子調製中または調製後に液体粒子に組み込むことができる。ｓｂｐ構成員は、普通、粒子表面に存在する分子の約０.５から１００モルパーセント、より普通には、１ないし９０モルパーセント、頻繁には、約５から８０モルパーセント、および好ましくは、約５０から１００モルパーセントで存在するものである。以下に、油滴を安定化させるために利用できる両親媒性化合物を列挙するか、例示であって、限定ではない：ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン、ジアパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチド酸、カルジオリピン、レシチン、ガラクトセレブロシド、スフィンゴミエリン、ジセチルホスフェート、ホスファチジルイノシトール、２−トリヘキサデシルアンモニウムエチルアミン、１,３−ビス(オクタデシルホスフェート)−プロパノール、ステアロイルオキシエチレンホスフェート、リン脂質類、ジアルキルホスフェート類、ドデシル硫酸ナトリウム、カチオン性洗浄剤類、アニオン性洗浄剤類、アルブミンなどのタンパク質類、非イオン性洗浄剤、等。油滴の安定化は、ポリシアノアクリレート類などのポリマー、デキストラン、アルブミンなどのポリマー化タンパク質類、ヒドロキシブチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、および同等物でコーティングすることによっても達成できる。親油性基を有する、既に記載した他の化合物類を使用してもよい。ほとんどの場合、これらの化合物類は、直鎖または分枝状であり得る、炭素原子６ないし２０のアルキル基、普通はアルキル基類の混合物、を有するアルキルベンゼン類であり、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ポリオキシアルキレン基（炭素原子２から３のアルキレン）、カルボキシル基、スルホン酸基、またはアミノ基を有する。脂肪族脂肪酸は、通常、炭素原子約１０から３６、より普通には、約１２から２０であるものを使用できる。また、脂肪酸に対して指示される炭素制限を有する脂肪アルコール、同様の炭素制限の脂肪アミン、および様々なステロイドもまたその用途を見い出すことができる。油滴は、フルオロカーボン油またはシリコン油（シリコン粒子）を含むことができる。このような小滴は、ギアエバーによって、米国特許第４,６３４,６８１号および４,６１９,９０４号（これらの開示は、本明細書全体に組み込んである）に記載されている。これらの小滴は、フルオロカーボン油またはシリコン油を水性相中に分散させることにより生成する。小滴は、選択した油（一般に、商業的に入手可能な油など）の少量を、より多い量の水性相を含む容器に入れることにより調製される。液体系を振動処理にかけ、乳化を起こさせ、次いで遠心分離する。均一相を除去し、残った小滴を水性緩衝液媒質に再度懸濁する。上記遠心分離およびデカンテーション工程を１回以上繰り返すことができ、その後小滴を利用する。多くの方法でｓｂｐ構成員を小滴に結合させることができる。ギウエバーにより記載されているとおり、特定のｓｂｐ構成員、特に、タンパク質性ｓｂｐ構成員を、乳化工程の前後に過剰のｓｂｐ構成員を水性媒質中に導入することにより、小滴上に被覆することができる。洗浄工程は、過剰のｓｂｐ構成員を除去するために望ましい。油の官能性化により、上記ｓｂｐ構成員に連結するための官能性が導入される。かかる官能性は、光増感剤または光活性インジケーター前駆体に小滴を連結するために採用することもできる。一方、光増感剤または光活性インジケーター前駆体は、油滴の油相に可溶性であるように選択されることが多く、共有結合されない。油がフルオロカーボンであるとき、フッ素化光増感剤または光活性インジケーター前駆体は、対応する非フッ素化派生体よりも可溶性であることが多い。 “リポソーム”とは、ほぼ球状形の微小胞を意味し、本発明において用いるのに好ましい物質の１つである。リポソームは、少なくとも約２０nmであって約２０ミクロンを越えない、普通は、少なくとも約４０nmであって約１０ミクロン以下の直径を有する。好ましくは、リポソームの直径は、沈澱または浮遊を制限するために約２ミクロン以下である。リポソームの外部殻は、多量の水または水性溶液を封入する両親媒性二重層からなる。二重層を１つ以上有するリポソームは、多重ラメラ小胞と呼ばれる。二重層を１つだけ有するリポソームは、単ラメラ小胞と呼ばれる。親油性光増感剤または光活性インジケーター前駆体を使用する場合、多重ラメラ小胞が本発明においては好ましく、なぜなら、多重ラメラ小胞は、これらの物質を単ラメラ小胞よりも多量に組み込む能力を持つからである。両親媒性二重層は、リン脂質から成ることが多い。本発明において有用な粒子の調製に使用されるリン脂質は、レクチンを含む天然膜中に見い出されたリン脂質またはリン脂質混合物、または飽和または不飽和１２−炭素または２４−炭素直鎖脂肪酸の合成グリセリルホスフェートジエステルであることができ、そのホスフェートは、モノエステルとして、または極性アルコール、例えば、エタノールアミン、コリン、イノシトール、セリン、グリセロール、および同等物のエステルとして存在し得る。特定の好ましいリン脂質は、Ｌ−α−パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジル−グリセロール（ＰＯＰＧ）、Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルグリセロール、Ｌ−α−（ジオレオイル）−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびＬ−α−（ジオレオイル）−ホスファチジルβ−(４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン− １−カルボキシアミド)エタノール（ＤＯＰＥ−ＭＣＣ）である。二重層におけるリン脂質に、コレステロールを追加してもよく、また、普通は荷電している極性ヘッド基、および普通は２つの直鎖状炭化水素鎖からなる疎水性部を有する他の両親媒性化合物で置換してもよい。このような置換物の例には、ジアルキルホスフェート、アルキル基が直鎖状の１２ないし２０の炭素原子鎖を有するジアルコキシプロピルホスフェート類、Ｎ−(２,３−ジ−(９−(Ｚ)− オクタ−デセニルオキシ))−プロプ−１−イル−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、スフィンゴミエリン、カルジオリピン、および同等物がある。本発明に使用するリポソーム類は、好ましくは、懸濁液を安定化し、自然凝集を妨ぐために高い負電荷密度を有する。リポソームは、水和、および乾燥させたリン脂質またはリン脂質置換物の水性溶液中への機械分散を含む様々な方法によって製造できる。こうして調製したリポソームは、様々な寸法、組成、および性質を有する。機械的に分散させたリポソームの性質の不均一性および不調和性を低減する一つの方法は、超音波処理である。かかる方法は、平均リポソームサイズを小さくする。別法として、押出成型は、リポソーム製造中の最終段階として利用可能である。米国特許第４,５２９,５６１号は、サイズの単一性を改善するためにリポソームを単一な孔サイズ膜を通して加圧下で押出成型する方法を開示している。本発明において使用する場合、リポソームは、ｓｂｐ構成員に結合する能力を持ち、かつ水性または非水性層に結合させた光増感剤または光活性インジケーター前駆体を有する能力を持つべきである。本発明において使用されるリポソームは、普通、脂質の外部表面に結合するｓｂｐ構成員を有するものである。脂質二重層に溶解させた疎水性または両親媒性光増感剤または光活性インジケーター前駆体を含有するリポソームの調製は、オルセン等、バイオケミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ、５５７（９）、１９７９年に記載されている方法を含む、様々な方法で実施できる。概略を述べると、クロロホルムなどの有機溶媒中適切な化合物を含有する脂質の混合物を、ガラス容器壁上で薄フィルム状に乾燥させる。脂質フィルムを、振盪またはボルテキシングすることにより適切な緩衝液で水和する。その後、脂質懸濁液を順番に小さくなる孔サイズ、例えば、２. ０、１.０、０.８、０.６、０.４、および０.２ミクロン、を有する一連のポリカーボネートフィルター膜を通して押出成型する。どの篩過も、特に最も小さいフィルターを通す篩過を繰り返すことが望ましい。リポソームを、例えば、セファクリルＳ−１０００のカラムを通すようなゲル濾過により精製できる。カラムを緩衝液で溶出し、リポソームを集めることができる。冷所に貯蔵すると、この方法で製造したリポソームの貯蔵寿命は、伸びる。これとは別に、光増感剤または光活性インジケーター前駆体をリポソーム調製後に液体懸濁液に加えることができる。小滴およびリポソームの標識化は、例えば、脂質二重層を構成する分子にチオールまたはマレイミドまたはビオチン基を加入させることを、しばしば含む。次いで、その表面に、光増感剤、光活性インジケーター前駆体分子、またはｓｂｐ構成員を、粒子と、スルフヒドリル反応試薬、スルフヒドリル基、またはアビジンにそれぞれ結合しているこれらの物質の１つとの反応により結合させる。スルフヒドリル反応基は、ブロモアセトアミドおよびマレイミドなどのアルキル化試薬を含む。ｓｂｐ構成員は、弱い疎水性相互作用により、リポソーム粒子の表面に引き寄せることができるが、このような相互作用は、一般に、インキュベーションおよび洗浄中に遭遇する剪断力に抵抗するのに十分なものではない。ｓｂｐ構成員を、例えば、上記に示したＤＯＰＥ−ＭＣＣの使用により、該リポソームをメルカプタン基で官能化したｓｂｐ構成員から選択したものと結合させることにより、官能化したリポソーム粒子に共有結合させるのが好ましい。例えば、ｓｂｐ構成員が抗体であるならば、Ｓ−アセチル−メルカプト無水コハク酸（ＳＡＭＳＡ）と反応させ、加水分解して、スルフヒドリル修飾化抗体を提供することができる。 “ラテックス粒子”とは、普通、直径２０nmないし２０mm、より好ましくは１００ないし１０００nmの粒子寸法を有する特定の水懸濁可能水不溶性ポリマー物質を意味する。ラテックスは、以下のような置換ポリエチレンであることが多い；ポリスチレン−ブタジエン、ポリアクリルアミドポリスチレン、アミノ基を有するポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、アクリロニトリルブタジエン、スチレンコポリマー、ポリビニルアセテート−アクリレート、ポリビニルピリジン、ビニル−クロリドアクリレートコポリマー類、および同等物。スチレンおよびカルボキシル化スチレン、または他の活性基、例えば、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン、および同等物で官能化したスチレンの非架橋化ポリマー類が好ましい。ブタジエンなどのジエンで置換されたスチレン類のコポリマーを使用することも多い。本発明において使用される光増感剤または光活性インジケーター前駆体とラテックス粒子との結合は、重合により粒子を形成する間に組み込むことができ、普通は、予め形成した粒子中へ、普通は、粒子内への非共有溶解（noncovalent di ssolution）により組み込まれるものである。普通は、光活性インジケーター前駆体または光増感剤の溶液を採用する。使用し得る溶媒には、アルコール類（エタノールを含む）、エチレングリコール、およびベンジルアルコール；ジメチルホルムアミド、ホルムアミド、アセトアミド、およびテトラメチル尿素、および同種物などのアミド類；ジメチルスルホキシドおよびスルホランなどのスルホキシド類；およびカルビトール、エチルカルビトール、ジメトキシエタン、および同種物などのエーテル類、および水が含まれる。粒子が不溶性である高沸点溶媒を用いることは、粒子中への化合物類の溶解を容易にさせる高めの温度の使用を可能とし、特に適している。溶媒類は、単独で、または組み合わせて使用することができる。光増感剤を組み込むために特に好ましい溶媒類は、光増感剤の三重項励起状態を失活しないようなものであり、なぜならば、それらの溶媒の内在特性のため、または、それらの溶媒が、粒子中に不溶性である水などの溶媒に自身が溶解されるという能力によって実質的に粒子から除去できるためである。芳香族溶媒類、一般に、粒子に可溶性である溶媒類が好ましい。粒子内の光活性インジケーター前駆体を組み込むためには、溶媒は、それらの内在特性または粒子から除去される能力のため、生じた光活性インジケーターの蛍光と干渉しないようなものを選択するべきである。芳香族溶媒類は、また頻繁に好まれるものである。代表的な芳香族溶媒類には、ジブチルフタレート、ベンゾニトリル、ナフトニトリル、ジオクチルテレフタレート、ジクロロベンゼン、ジフェニルエーテル、ジメトキシベンゼン、等がある。光増感剤または光活性インジケーター前駆体が粒子に共有結合している場合以外は、普通は、電子的に中性な光増感剤または光活性インジケーター前駆体を使用することが好ましい。液体媒体は、ポリマービーズを粘着性がなくなるまで軟化しないものを選択するのが好ましい。好ましい技術は、選択したラテックス粒子を、光増感剤または光活性インジケーター前駆体が少なくとも限られた溶解性を有するような液体媒体中に懸濁することを含んで成る。好ましくは、液体媒体中の光増感剤または光活性インジケーター前駆体の濃度は、一重項酸素の最高形成効率、および媒体中に生じた光活性インジケーターからの放出される最高量子収率を有する粒子を提供するように選択する。溶媒中の粒子の歪みまたは溶解は、粒子が不溶性である混和性共溶媒を加えることにより、防ぐことができる。一般に、この操作中に採用する温度は、光増感剤標識化粒子の一重項酸素形成および光活性インジケーター前駆体標識化粒子から生じる光活性インジケーターの量子収率を最大にするように、選択されるが、ただし、粒子は、選択した温度で凝集してはならない。通常は、昇温温度を採用する。この操作のための温度は、一般に、２０℃から２００℃、より普通には、５０℃から１７０℃の範囲である。室温で水にほぼ不溶性であるある化合物類が、昇温温度で、例えば、エタノール、およびエチレングレコール、および同等物などの低分子量アルコールに可溶性であることが観察されている。カルボキシル化修飾ラテックス粒子は、かかる温度で低分子量アルコールを許容することが示されている。ｓｂｐ構成員は、ラテックス粒子の表面に物理的に吸着することができ、また、粒子に共有結合することもできる。ｓｂｐ構成員がラテックス粒子の表面に弱く結合しているだけの場合、その結合は、ある場合には、インキュベーションおよび洗浄中に遭遇する粒子対粒子剪断力に耐えることができないこともある。従って、普通は、ｓｂｐ構成員をラテックス粒子に、吸着を最小限にするような条件下で共有結合させるのが好ましい。これは、ラテックスの表面を化学的に活性化することにより達成できる。例えば、表面カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成することができ、次いで、エステル基と反応するアミノ基を有するリンカーと、またはアミノ基を有するｓｂｐ構成員と直接的に、接触させる。リンカーは、普通、アッセイ成分の粒子表面に対する非特異的結合を低減するようなものを選択し、好ましくは、ラテックス粒子への結合とｓｂｐ構成員への結合の両方に対して適切な官能性を与えるものである。適切な物質には、マレイミド化アミノデキストラン（ＭＡＤ）、ポリスチレン、アミノサッカライド、および同等物がある。ＭＡＤは、フバート等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィズ、７５（７）、３１４３頁、１９７８年に記載のようにして調製できる。ある方法では、ＭＡＤを、水溶性カルボジイミド、例えば、１−(３−ジメチルアミノプロピル)−３−エチルカルボジイミドを用いて、まずカルボキシル含有ラテックス粒子に結合させる。次いで、被覆粒子を試薬類中で平衡化して、非特異的結合を保護する。このような試薬類には、ウシ血清γグロブリン（ＢＧＧ）などのタンパク質、トゥイーン２０、トリトンＸ−１００、および同等物などの洗浄剤がある。その後、スルフヒドリル基を有する、またはスルフヒドリル基を誘導するように適切に修飾したｓｂｐ構成員を粒子の懸濁液に加え、その際、ｓｂｐ構成員とＭＡＤの間の共有結合が、粒子上で形成される。次いで、過剰の未反応ｓｂｐ構成員を洗浄により除去できる。 “金属ゾル”とは、重金属、即ち、ＩＢ金属群などの原子数２０以上の金属、例えば、金または銀を含む懸濁可能な粒子を意味する。金属ゾル粒子は、例えば、リューベリングにより、米国特許第４,３１３,７３４号に記載されており、その開示は、本明細書全体に参照して組み込んである。このようなゾルは、金属、金属化合物、または金属または金属化合物で被覆されたポリマー核のコロイド状水性分散物を含む。金属ゾルは、金属類または金属化合物類、例えば、酸化金属類、水酸化金属類、および金属または金属化合物で被覆されたポリマー核の金属塩類であり得る。このような金属の例には、白金、金、銀、水銀、鉛、パラジウム、および銅があり、金属化合物類の例には、ヨウ化銀、臭化銀、水和酸化銅、酸化鉄、水酸化鉄または水和酸化鉄、水酸化アルミニウムまたは水和酸化アルミニウム、水酸化クロムまたは水和酸化クロム、酸化バナジウム、硫化ヒ素、水酸化マンガン、硫化鉛、硫化水銀、硫化バリウム、および二酸化チタンがある。一般に、これらの有用な金属類または金属化合物類は、知られている技術手段により容易に入手できることを実証できる。上記金属類または金属化合物類で被覆されたポリマー核からなる分散粒子を含んで成るゾル類を使用するのが有利なこともある。これらの粒子は、純粋な金属、または金属化合物の分散相と同様の特性を有するが、サイズ、密度、および金属接点は、所望により組み合わすことができる。金属ゾル粒子は、それ自身知られている多くの方法により調製できる。例えば、金ゾルの調製の場合、リューベリングは、文献、Ｇ.フレンのネイチャー・フィジカル・サイエンス、２４１、２０頁（１９７３年）を引用している。金属ゾル粒子は、上記ｓｂｐ構成員または光増感剤または光活性インジケーター前駆体との連結の際に記載したような様々な官能基を含有するように修飾することができる。例えば、ポリマー結合剤を用いて、多くの重金属と強力に結合するチオール基、または、例えば、磁気粒子を被覆するためのアドバンスド・マグネティックスにより、ヨーロッパ公開特許出願８４４００９５２.２に記載されているように金属粒子とトリアルコキシアミノアルキルシランとの反応により結合してポリマーコーティングを形成できるシリル化剤を含有するポリマーなどの粒子を、被覆できる。 “染料クリスタライト”とは、純粋または混合固体水不溶性染料の微結晶であり、好ましくは、上記光増感剤として働くことができる染料である。本発明に有用な染料クリスタライトは、２０nmないし２０μmのサイズ範囲を持つ。染料クリスタライトを調製する１つの方法は、米国特許第４,３７３,９３２号（グリブノー等）に記載されており、その開示は、本明細書全体に組み込んである。グリブノーは、コロイド状染料粒子および疎水性染料または顔料の水性分散物を記載しており、直接的、または間接的に結合した免疫化学的に反応性の成分を有することができる。染料粒子は、一般に、染料を水に分散させ、次いで、遠心分離することにより、調製する。染料ペレットを得、水に再懸濁させて、これにガラスビーズを加える。この懸濁液を数日間室温でころがした。液体をデカントし、遠心分離して、液体を吸引後、染料粒子を得る。染料クリスタライトを調製するその他の方法は、水混和性溶媒中の染料の溶液を水にゆっくりと添加するものである。他の方法は、水中の固体染料懸濁液を超音波処理するものである。ｓｂｐ構成員の染料粒子への結合は、直接または間接吸着または化学共有結合により達成できる。後者は、コーティング物質中、および染料中の適切な官能基の存在に左右される。例えば、ジアゾ化芳香族アミノ基を含有する化合物および所望の官能基を、染料のフェノール基、またはアニリン基にカップリングすることにより、官能基を染料クリスタライトの表面上に導入できる。染料がカルボキシル基を有する場合、染料クリスタライトをカルボジイミドにより活性化し、第１級アミノ成分に結合させることができる。例えば、臭化シアンまたはハロゲン置換ジまたはトリアジン類により、脂肪族第１級アミノ基およびヒドロキシル基を活性化することができ、その後、第１級アミノ成分との、または、例えば、−ＳＨまたは−ＯＨ基との結合を起こすことができる。二官能性反応性化合物を使用することもできる。例えば、グルタルアルデヒドを、染料およびｓｂｐ構成員の第１級アミノ成分の相互カップリングのために使用でき、また、例えば、ヘテロ−二官能性試薬、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−(２− ピリジルジチオ)プロピオネートを、第１級アミノ成分をチオール基を含有する生物にカップリングさせるために採用できる。 “全体にまたは部分的に連続して”とは、本発明の方法の各成分を付随的に（同時に）合わせるのではないときに、１またはそれ以上を残りの１またはそれ以上の成分と合わせて、副組み合わせを作るような条件を意味する。その後、それぞれの副組み合わせを、本発明方法の１またはそれ以上の工程に付すことができる。従って、それぞれの副組み合わせを、１またはそれ以上の所望の結果を達するような条件下でインキュベートできる。本発明に従うアッセイでは、様々な補助物質が採用されることが多い。例えば、緩衝液は、通常、アッセイ媒体の安定剤およびアッセイ成分と共に、アッセイ媒体中に存在するものである。しばしば、これらの補助物質に加えて、アルブミンなどのタンパク質類、ホルムアミドなどの有機溶媒類、第４級アンモニウム塩類、硫酸デキストランなどのポリカチオン類、界面活性剤類、特定の非イオン性界面活性剤類、結合増強剤、例えば、ポリアルキレングリコール、または同等物が、含まれることもある。特定の実施態様の記載一般に、本発明は、選択された媒体中の分析物を測定する方法に関する。該方法は、分析物を含有する疑いのある媒体を、もし分析物が存在するならば、光増感剤および光活性インジケーター前駆体の量に分析物が影響を及ぼせるような条件下で処理することを含み、ここで、この光増感剤と光活性インジケーターは極めて近接した状態になることができ、光増感剤により産生される短命な一重項酸素が、一重項酸素の自然崩壊前に光活性インジケーター前駆体と反応して、光活性インジケーターを生成できるものである。この方法は、更に、生じた光活性インジケーターを励起させるために、光増感剤を励起させるのに使用した光と同一または異なる波長であり得る光にさらすこと、および励起の際に光活性インジケーターから放出された蛍光の強度を測定することを含む。生じた蛍光の強度は、媒体中の分析物量と相関する。光活性インジケーターは、光活性インジケーター前駆体と光増感剤により産生された一重項酸素が反応すると生成する。光増感剤は、普通、光励起、その後の分子酸素へのエネルギー伝達に応答して、一重項酸素の産生を触媒するものである。光増感剤および光活性インジケーター前駆体の一方または両方は、しばしば、各種表面に結合するが、均一系アッセイにおいては、その表面とは好ましくは懸濁可能な粒子の表面である。均一系アッセイの場合、本発明は、アッセイ媒体の大部分の溶液中で、光増感剤と光活性インジケーター前駆体の分子を互いの平均距離よりも近接させるか、またはそれを妨げる分析物に基いて説明される。この区分は、分析される試料中に存在する分析物の量によって変わるものである。光活性インジケーター前駆体と結合しない光増感剤分子は、水性媒体中で光活性インジケーター前駆体と崩壊前に反応できない一重項酸素を生成する。しかしながら、光増感剤および光活性インジケーター前駆体が、分析物の存在に応答して、互いに極めて近接した状態になると、光増感剤を照射すると生成する一重項酸素が光活性インジケーター前駆体と反応して、崩壊前に光活性インジケーターを生成する。多くの光活性インジケーター前駆体分子および／または光増感剤分子は、ある表面に結合できるか、またはその表面を含んでなる物質内に組み込むことができるので、表面が光増感剤および光活性インジケーター前駆体と共に存在すると、崩壊前に光活性インジケーター前駆体と反応する一重項酸素の効率または作用を増大できる。従って、光活性インジケーター前駆体と光増感剤ペアの一構成員を、分析物存在の関数として他の一構成員を組み込んでいる一表面と近接した状態にすることが好ましい。対象となるアッセイは、簡便で能率良く再現可能な方法で、広範囲の分析物を検出および測定する好便な方法を提供するものであり、単純な装置を採用して、反応中に生じる光の量を測定できる。光活性インジケーター前駆体に極めて近接した状態になる光増感剤の量は、光増感剤および光活性インジケーター前駆体それぞれがｓｂｐ構成員に結合するため、分析物の存在によって影響される。これは、多くの方法で達成することができ、それによって“結合（アソシエート）する”という用語が、定義される。光増感剤および光活性インジケーター前駆体は、ｓｂｐ構成員と共有結合するための官能性を含むことができ、ｓｂｐ構成員は、光増感剤および／または光活性インジケーター前駆体に結合するための官能性を含むことができる。この結合は、２つの分子間の直接結合、または、ｓｂｐ構成員と光増感剤または光活性インジケーター前駆体の間に使用され得る連結基を介する結合により、達成できる。その他の実施態様では、光増感剤および光活性インジケーター前駆体のいずれか、または両方は、表面に結合できるか、または粒子内、これもまたｓｂｐ構成員に結合する、に組み込むことができる。両方の場合とも、ｓｂｐ構成員のそれぞれが、直接的または間接的に、分析物、または、その濃度が分析物の存在によって影響されるアッセイ成分に結合する能力がある。光増感剤および光活性インジケーター前駆体のいずれか、または両方を、粒子の少なくとも一相に溶解させることにより、粒子内に組み込むことができ、この場合、溶質は、大量アッセイ媒体中よりも高い濃度で、粒子内にある。別法として、光増感剤および光活性インジケーター前駆体のいずれかまたは両方を、結合される成分に連結官能基を与えるか、または粒子を含むポリマー内に光増感剤または光活性インジケーター前駆体を組み込むかのいずれかによって、粒子に共有結合させることができる。粒子が油滴またはリポソームである場合、光増感剤および光活性インジケーター前駆体を、１またはそれ以上の、それぞれ一般に少なくとも１０ないし３０の炭素原子を有する長鎖炭化水素に結合させることができる。粒子がフルオロカーボンの油滴である場合、これらの粒子に組み込まれた光増感剤または光活性インジケーター前駆体をフッ素化して溶解性を高め、他の標識と結合した他の粒子内へ入れ換わるのを低減することができ、また、好ましくは連結のために使用した炭化水素鎖を、フルオロカーボン鎖に換える。シリコン液粒子の場合は、光増感剤および光活性インジケーター前駆体をポリシロキサンに結合させることができる。１粒子当たりの光増感剤または光活性インジケーター前駆体の数を最大にするために、普通は、光増感剤または光活性インジケーター前駆体が粒子の非水性部内に残るように、その電荷および極性を最小にすることが望まれる。粒子がリポソームであり、光増感剤または光活性インジケーター前駆体がリポソームの水性相に保持されることを望む場合は、極性が高いか、または荷電している光増感剤または光活性インジケーター前駆体を使用することが好ましい。光増感剤および光活性インジケーター前駆体がそれらのそれぞれのｓｂｐ構成員とどのように結合しようとも、どちらの化合物も、アッセイ過程中にそのｓｂｐ構成員から解離することができず、また、他の光増感剤および光活性インジケーター前駆体対構成員と結合したｓｂｐ構成員とは結合できないことが重要である。従って、これらの化合物類のそれらのそれぞれのｓｂｐ構成員からの解離は、アッセイに必要な時間に比べて短くなければならない。光活性インジケーター前駆体は、分析物に、またはその濃度が分析物の存在によって影響されるアッセイ成分に、直接的または間接的に、結合する能力があるｓｂｐ構成員に結合する場合もある。“直接的または間接的に、結合する能力がある”という用語は、所定のものが、そのものに特異的に結合できる（直接的に）か、または他のものに結合できる特異的結合対構成員または２またはそれ以上のｓｂｐ構成員の複合体に特異的に結合できる（間接的に）ことを意味する。一般に、表面は、それに結合しているｓｂｐ構成員を有する。好ましくは、光活性インジケーター前駆体は、普通は懸濁可能な粒子内の、表面と結合する。このｓｂｐ構成員は、一般に、分析物に、または分析物の受容体に、直接的または間接的に、結合する能力がある。光増感剤および光活性インジケーター前駆体に結合しているｓｂｐ構成員が、いずれも分析物と結合する能力がある場合は、サンドイッチアッセイプロトコールを用いることができる。光増感剤または光活性インジケーター前駆体と結合しているｓｂｐ構成員の１つが、分析物と分析物類似体の両方に結合できる場合は、競合アッセイプロトコールを用いることができる。光活性インジケーター前駆体の表面への結合、または粒子内組み込みは、一般に、光増感剤の粒子への結合、または組み込みの所で記載したのと同一の原理によって左右されるものである。光増感剤は、普通、光活性インジケーター前駆体を、これらの反応物を含有する媒体に光を照射することにより、活性化させるものである。光活性インジケーター前駆体を光で励起させるのが望ましくない場合が多いため、光増感剤を活性化するために使用する光の波長は、実質的に光活性インジケーター前駆体により吸収される最長波長よりも長いものである。しかしながら、この媒体には、光増感剤を励起状態に転換させ、それによって分子酸素を一重項酸素へと活性化できるようにさせるに十分なエネルギーを有する十分に短い波長を照射しなければならない。分子酸素を励起させることができる光増感剤の励起状態は、一般に、光増感剤の基底状態よりもエネルギーの高い約２０Kcal／mol以上、普通は、少なくとも２３Kcal/molである三重項状態である。好ましくは、媒体に、約４５０ないし９５０nmの波長を有する光を照射するが、より短い波長、例えば、２３０ないし９５０nmを使用することもでき、また、二光子励起を与えるために十分に強い光を与えることにより、２０００nmまでのより長い波長を使用することもできる。普通は、光増感剤に能率良く吸収される波長の光を照射することにより、光増感剤を励起させるのが好ましいが、他の励起手段、例えば、エネルギー供与体の励起状態からのエネルギー伝達を用いることもできる。エネルギー供与体を用いる場合は、光の波長は、光増感剤には能率良く吸収されないが、エネルギー供与体には能率良く吸収されるようなものを使用できる。エネルギー供与体は、光増感剤と結合するかまたは結合するようになるアッセイ成分に結合することができ、例えば、表面に結合するか、光増感剤を有する粒子に組み込まれる。エネルギー供与体を用いるとき、その最低エネルギー一重項および／または三重項状態は、それぞれ、普通、光増感剤の最低エネルギー一重項および／または三重項状態よりも高いエネルギーのものである。こうして生成された一重項酸素は、光活性インジケーター前駆体と反応して、蛍光物質である光活性インジケーターを生成する。生じた光活性インジケーターの蛍光は、光活性インジケーターの電子励起の後に検出され得る。通常は、電磁放射、好ましくは光を用いて、光活性インジケーターを励起させるが、他の手段、例えば、化学励起が上記一重項酸素反応と別個であるときは、化学励起などにより励起されている分子からのエネルギー伝達も使用できる。光活性インジケーターを励起させるのに使用する光の波長は、光増感剤を励起させるのに使用する光の波長と同一でもよく、また異なっていてもよい。普通は、光活性インジケーターにより放出される光が、光増感剤の蛍光よりも短い波長であるのが好ましい。従って、好ましくは、光増感剤が蛍光物質であるとき、光活性インジケーターを励起させるのに使用する光は、光増感剤を活性化するのに使用するものよりも短い波長であり、普通は、少なくとも５０nm短く、好ましくは、少なくとも２００nm短いものである。励起した光活性インジケーターから放出される蛍光は、それらの量を測定するための写真的、可視的、または測光的常法によって測定でき、これは、媒体中の分析物量と相関している。光増感剤の照射および光活性インジケーターの励起は、同時に実施できるが、好ましくは、光増感剤を励起させるのに使用する光が蛍光測定と干渉しないように連続的に実施する。光活性インジケーター前駆体は、実質的に、一重項酸素を産生するのに使用する波長で光を吸収してはならず、従って、普通は、光増感剤よりも短い波長で吸収する。加えて、光活性インジケーター前駆体は、光活性インジケーターを励起させるのに必要な波長で顕著に吸収しないのが好ましく、従って、普通は、光活性インジケーターよりも短い波長で吸収する。本発明の方法および組成物類は、リガンド−受容体などのｓｂｐ構成員に関係する殆どのアッセイ、例えば、抗原−抗体反応、ポリヌクレオチド結合アッセイ、その他、に適用できる。これらのアッセイは、均一系または非均一系、競合的または非競合的であってよい。アッセイ成分、光活性インジケーター前駆体、および光増感剤は、多くの方法で、受容体、リガンド、または、採用するならば、表面に結合（アソシエート）することができる。その結合は、共有または非共有結合を含み得る。当業者ならば、上記、および下記に例示の説明から望ましい特定のアッセイによって変わる適切な結合を選択できる。試料は、必要ならば、不要物質を除去するために前処理してもよい。非競合的サンドイッチ型アッセイの反応は、分析物に相補的で、かつ光活性インジケーター前駆体に結合しているｓｂｐ構成員（例えば、抗体、ポリヌクレオチドプローブ、受容体、またはリガンド）；分析物に相補的であるｓｂｐ構成員（例えば、抗体、ポリヌクレオチドプローブ、受容体、またはリガンド）に結合する光増感剤；対象となる試料；および必要な補助試薬を含む。競合的プロトコールでは、１方のｓｂｐ構成員は、分析物の誘導体であることができ、他方のｓｂｐ構成員は、分析物と相補的、例えば、抗体であることができる。いずれのプロトコールにおいても、その成分は、同時に、または全体にまたは部分的に連続して、合わせることができる。活性化した光増感剤により産生された一重項酸素が、光活性インジケーター前駆体と反応して光活性インジケーターを生成する能力は、ｓｂｐ構成員が分析物に結合することによって左右される。よって、分析物の存在または量は、照射により生じた光活性インジケーターを活性化させると放出される光の量を測定することにより、測定できる。結合反応、およびその度合いの検出の両方を、分離することなく均一溶液中で実施することができ、好ましくは、光増感剤および光活性インジケーター前駆体の一方または両方を、ｓｂｐ構成員が結合している粒子に組み込む。これが、化学発光を利用する従来技術法を越える本発明の利点である。不均一系アッセイプロトコールでは、ｓｂｐ構成員の一方を、それをアッセイ媒体から分離するために設けた支持体、または他の手段に結合させることが多い。支持体は、非分散性表面、または粒子のいずれかであることができる。一実施態様では、その支持体または粒子は、それと結合している光活性インジケーター前駆体および光増感剤から成る群の一構成員を有する。もう一方のｓｂｐ構成員は、それと結合する群の他の一構成員を有するものであり、そのｓｂｐ構成員は、独立して、直接的または間接的に、分析物または分析物の受容体に結合できる。これらの成分は、一般に、同時に、または全体にまたは部分的に連続して、合わせる。次いで、粒子の表面を液相から分離し、いずれかを、普通は分離した相を照射することにより、光増感剤および生じた光活性インジケーターを活性化する条件にかけて放出された蛍光量を測定する。これとは別に、本発明の不均一系アッセイは、第１ｓｂｐ構成員を液体アッセイ媒体から分離するための表面のような手段を提供し、さらに、光増感剤と結合しており、かつ媒体中の分析物量の関数として第１ｓｂｐ構成員に結合する第２ｓｂｐ構成員を提供することにより実施できる。次いで、分析物を含有する疑いのある試料を第１および第２ｓｂｐ構成員と、同時に、または全体にまたは部分的に連続して合わせ、そして第１ｓｂｐ構成員を媒体から分離する。その後、光活性インジケーター前駆体と結合している第３ｓｂｐ構成員を、分離した第１ｓｂｐ構成員と合わせるが、ここで第３ｓｂｐ構成員は、第２ｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合する能力がある。次いで、その合わせたものを照射し、光増感剤を活性化して、生じた光活性インジケーターの蛍光を測定する。分析物のアッセイにおける結合反応は、通常、一般に最適アッセイ感度を与える穏やかなｐＨで水性媒体中で行うものである。好ましくは、光増感剤の活性化も水性媒体中で行う。しかしながら、分離工程を採用する場合、例えば、アセトニトリル、アセトン、トルエン、ベンゾニトリル、等のような非水性媒体、および非常に高い、即ち１０.０以上のｐＨ値、または非常に低い、即ち４.０以下のｐＨ値を持つ、好ましくは非常に高いｐＨ値を持つ水性媒体を使用できる。上記に説明した通り、このアッセイは、アッセイ成分または生成物を分離しない（均一系）か、または分離する（不均一系）かのいずれかで実施できる。水性媒体は、水だけであってもよく、または、０.０１から８０容量パーセントの共溶媒を含んでいてもよいが、タンパク質であるｓｂｐ構成員を使用する場合は、普通４０％以下の共溶媒を含む。結合反応の媒体のｐＨは、普通、約４ないし１１の範囲であり、より普通には、約５ないし１０の範囲、好ましくは約６ .５ないし９.５の範囲である。このｐＨは、普通、結合構成員が最適に結合するｐＨとシグナル産生およびアッセイのその他の試薬の安定性に最適なｐＨとの中間である。普通、シグナル産生には、ｐＨ変化は何ら必要ではないが、所望ならば、酸または塩基試薬を添加する工程を結合反応と一重項酸素の産生および／またはシグナル生成の間に挿入できる。普通、均一系アッセイにおいては、最終ｐＨは、５ないし１３の範囲である。不均一系アッセイの場合、上記のとおり、非水性媒体を使用することもでき、主に溶媒が一重項酸素と能率良く反応しないことを考慮すればよい。所望のｐＨを達成し、そのｐＨをアッセイ中維持するために、様々な緩衝液を使用できる。緩衝液の例には、ボレート、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール、および同種物がある。採用した特定の緩衝液が本発明に対して絶対的なのではなく、個々のアッセイにおいて１つまたはもう１つの緩衝液が好まれ得る。アッセイにおいてタンパク質性リガンドや受容体の結合反応を実施する場合、通常は、穏やかな温度が採用され、普通、測定期間中一定温度、好ましくは２５ ℃ないし４０℃である。結合反応のためのインキュベーション温度は、通常、約５℃から４５℃、普通は、約１５℃から４０℃、より普通には、２５℃ないし４０℃の範囲である。アッセイ中に核酸の結合が起こる場合は、より高い温度、普通は、２０℃ないし９０℃、より普通には、３５℃ないし７５℃を使用することが多い。測定中、即ち、一重項酸素の産生および光検出中の温度は、一般に、約２０℃から１００℃、より普通には、約２５℃から５０℃、より普通には、２５ ℃ないし４０℃の範囲である。アッセイすることができる分析物の濃度は、一般に、約１０^-4から１０^-16Ｍ未満、より普通には、約１０^-6から１０^-14Ｍの範囲で変わる。アッセイが定性的、半定量的、または定量的である場合、普通は特定の検出技術、対象となる分析物の濃度、最大所望インキュベーション時間などを考察することによって様々な試薬の濃度を決定する。競合的アッセイでは、一般に、アッセイ媒体中の様々な試薬の濃度は、対象となる分析物の濃度範囲により決定され、各試薬の最終濃度は、通常、その範囲でアッセイ感度が最大になるように経験的に決定される。即ち、重要である分析物の濃度のバリエーションが、正確に測定可能なシグナル差を与えるべきである。ｓｂｐ構成員の濃度は、分析物濃度、所望の結合速度、およびｓｂｐ構成員が非特異的に結合する度合によって変わるものである。普通、ｓｂｐ構成員は、少なくとも予想される最低の分析物濃度、好ましくは、少なくとも予想される最高分析物濃度で存在するものであり、非競合的アッセイの場合、その濃度は、最高分析物濃度の１０ないし１０⁶倍であることができるが、普通は、１０^-4Ｍ以下、好ましくは１０^-6Ｍ以下、頻繁には、１０^-11と１０^-7Ｍの間である。ｓｂｐ構成員と結合している光増感剤または光活性インジケーター前駆体の量は、普通、少なくとも１ｓｂｐ構成員当たり１モルであり、光増感剤または光活性インジケーター前駆体分子が粒子に組み込まれている場合は、１０⁵と高いこともあり、普通は、少なくとも１０ないし１０⁴である。添加順序は、広範囲に変わり得るが、アッセイの性質に依存するある優先順位がある。最も簡易な添加順序は、材料全てを同時に加えることである。別法として、試薬類を、全体にまたは部分的に連続して、合わせることができる。アッセイが競合的である場合、しばしば、試料および分析物に結合する能力のあるｓｂｐ構成員を合わせた後に、分析物類似体を加えることが望まれる。所望により、インキュベーション工程を、試薬を合わせた後、一般には、約３０秒から６時間の範囲、より普通には、約２分から１時間後に行う場合もあり、その後、光増感剤に一重項酸素を産生させ、光活性インジケーターに蛍光を発生させる。特に好ましい添加順序においては、分析物と相補的および／または同族的であるｓｂｐ構成員の第一セットを、分析物と合わせ、ついで第１特異的結合対構成員と相補的な特異的結合対構成員を添加するが、それらはいずれも光増感剤および光活性インジケーター前駆体よりなる群の異なる構成員と結合しているものである。このアッセイ混合物、またはその分離されたコンポネントは、まず照射して一重項酸素を産生させ、それから後に測定可能な蛍光を生成させる。均一系アッセイでは、すべての試薬を合わせた後、必要ならインキュベートできる。それから、組み合わせ物を照射（必要な波長の光で）し、生成する放出された蛍光を測定する。放出された蛍光は試験した試料中の分析物の量と相関する。不均一系アッセイで採用される本発明の試薬の量は、分析物の性質によって変わる。一般に、本発明の均一系アッセイは、既知のアッセイ、例えばＥＭＩＴ（登録商標）アッセイより高い感度を示す。この利点は、第一に本発明の方法において得られる、ノイズ比率の改善されたシグナルによるものである。以下のアッセイは、当業者に本発明の範囲を理解せしめ、過重な実験を経ることなく実施できるようにするための例示説明のために示すものであって限定するものではない。分析物、光増感剤、光活性インジケーター前駆体、各表面、粒子類、および反応条件の選択は、以下の実施例における開示により当業者には示唆されていることが理解されるであろう。本発明のある実施態様では、下記一般式（Ｉｍ）：の光活性インジケーター前駆体が、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）に対する抗体と共有結合して試薬１を与える。この光活性インジケーター前駆体は、カルボキシル基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルで官能性をもたせ、抗体のアミノ基と反応させる。連結基はカルボキサミドである。用いる光増感剤はローズベンガルであるが、それは大きさが平均０.５ミクロンのラテックス粒子に共有結合しているものである。このラテックス粒子とローズベンガルは、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ９７巻：３７４１（１９７５）に記載されているように、ラテックス粒子上でクロロメチル基の手段により、互いに共有結合してエステル連結基を与える。ラテックス粒子はさらに、ラテックス上でＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル基の手段によりＨＣＧに対する第２抗体に連結され、試薬２を与える。使用した両抗体は、標準ハイブリッド・セルライン技術によって調製されたモノクローナル抗体である。ある抗体はＨＣＧのαサブユニットを認識し、他のものはＨＣＧのβサブユニットを認識する。アッセイを進めるに際し、ＨＣＧの含有が疑われる血清試料を患者から得る。試料の５０マイクロリットルを、トリス緩衝液でｐＨ８.０に緩衝化した５００マイクロリットルの水性媒体中で、上記試薬１および試薬２と合わせる。試薬１と試薬２の量は、各抗体の濃度が約１０^-9モルとなるのに十分な量とする。反応混合物を次いで２５℃で１時間インキュベートし、それから３０分間５６０nm の光を照射する。次に、溶液の蛍光を３５０mで照射し４４０nmで検出して測定し、同様の操作で既知濃度のＨＣＧを含有する試料について得た値と比較し、未知の試料のＨＣＧ濃度を測定する。上記に基づく別のやり方では、試薬２は第２抗体に共有結合したローズベンガルであり、ラテックス粒子は使用しない。上記に基づくさらに別のやり方では、試薬２は第２抗体に共有結合したローズベンガルであり、試薬１は、第１抗体が共有結合しているラテックス粒子に共有結合した光活性インジケーター前駆体である。上記に基づくさらに別のやり方では、試薬１は直前に記載したとおりのものであり、試薬２は、アビジンが共有結合しているラテックス粒子に共有結合したローズベンガルであり、そしてビオチンに共有結合している第２抗体である３番目の試薬（試薬２Ａ）が用いられる。試薬１と３番目の試薬を試料と合わせ、インキュベートする。そして、過剰の試薬２を加えるが、残りの操作は上記と同様である。本発明の他の実施態様では、油滴（試薬３）の第１セットを光増感剤とクロロフィルの鉱物油溶液から、前記ジェーバーに従って調製する。油滴、直径０.１から２ミクロンの範囲内のもの、をＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）に対するモノクローナル抗体に結合している機能化された表面活性剤で被覆する。クロロフィルは親油性であり、それ故親油性油滴中に溶解する。油滴（試薬４）の第２セットも同様にして調製する。この油滴セットでは、油滴はＣＲＰに対する第２モノクローナル抗体、それは上記した第１モノクローナル抗体で認識されるものとは異なるＣＲＰ分子の部分を認識するものである、で同様に被覆する。９−ベンザル−１０−メチルアクリジンは、アクリジンのフェニール基の一つに結合したＮ,Ｎ−ジドデシルカルボキサミド基を導入することにより、親油性油滴中に非可逆的に溶解する。モノクローナル抗体は、標準ハイブリッドセルライン技術によって調製する。ＣＲＰ（５０マイクロリットル）の含有が疑われる血清試料を、緩衝化水性媒体（５００μL）中、ｐＨ７.５で試薬３および試薬４の過剰量と合わせる。この媒体を分離することなく、６３３nmでＨe／Ｎeレーザーを用いて２０分間照射し、溶液の蛍光を、３６０nmで照射し４４０nmで放出された光を検出することにより、測定した。蛍光の強さを、既知量のＣＲＰを含有する試料から得られたものと比較し、数値を比較して未知試料中のＣＲＰ量を測定した。このようにして、便利で感度のよい均一系ＣＲＰのイムノアッセイが行われる。上記に基づく別のやり方では、試薬３はＣＲＰに対する抗体の代わりにフルオレセインに対する抗体を有し、付加的試薬（試薬３Ａ）がフルオレセインに結合したＣＲＰ抗体を有する。試薬４は第２ＣＲＰ抗体の代わりにアビジンを有し、４番目の試薬（試薬４Ａ）はビオチンに共有結合している第２抗体を有する。このアッセイでは、試薬４Ａと試薬３Ａを試料と合わせ、インキュベートする。それから、試薬３および４を加え、インキュベートする。次いで、前記同様にしてアッセイ操作の残部を実施する。本発明の他の実施態様では、リポソーム（試薬５）（直径０.２ミクロン）の１セットを、その目的に設計された市販機器を用い、ｐＨ７.４の緩衝液中でリン脂質懸濁液を、０.２ミクロンの多孔性膜を通して高圧押出して形成する。チロキシン同族体は、リポソーム上に最初に形成されるメルカプトアセトアミド基により、リポソーム中でフォスファチジルエタノールアミンとメチルカルボキシメチルジスルフィドＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応、次いでジチオエリスリトールとの反応により、リポソームと共有結合させる。ブロモアセチルチロキシンは、次いでスルフヒドリル化リポソームと反応させる。メタロ−ポルフィリン染料はリポソームの親油性部分中に溶解させる。他のリポソームセット（試薬６）は、チロキシンに対するモノクローナル抗体と結合させるのに用いる。この抗体は、チロキシンの結合と同様の手段で共有結合する。下記構造式：の光活性インジケーター前駆体は、カルボキサミド連結基の手段でリポソーム表面に共有結合する。試薬５および試薬６は、ｐＨ８.０に緩衝化した水性アッセイ媒体（５００μＬ）中で、チロキシンの含有が疑われる血清試料とともに合わせるが、この試料は下記構造式：のチロキシン解離因子を、結合タンパク質（５０マイクロリットル）からチロキシンを引き離すために含有しているものである。アッセイ媒体は、次いで室温で１時間インキュベートする。媒体を６５０nmで１分間照射し、蛍光を前記各例と同様に測定する。得られた値を既知量のチロキシンについて同様にアッセイを行って得た値と比較する。このようにして、血清試料中のチロキシン量を定量する。上記に基づく別のやり方では、試薬６はチロキシンに対する抗体の代わりにアビジンを有する。付加的試薬（試薬６Ａ）はビオチンに共有結合しているチロキシンに対する抗体を有する。試薬５はチロキシンの代わりにフルオレセインに対する抗体を有し、付加的試薬（試薬５Ａ）はフルオレセインに共有結合しているチロキシンを有する。アッセイにおいて、試薬５Ａおよび試薬６Ａは、試料と合わせてインキュベートする。それから、試薬５および６を加え、混合物をインキュベートし、さらにアッセイ操作の残部を続ける。別の実施態様では、グリブノーにより記載されたのと同様の方法で、２−ヒドロキシ−９,１０−ジブロモ−アントラセンが、染料クリスタライト中に形成される。Ｂ型肝炎ＲＮＡの配列を認識する２５量体オリゴヌクレオチドプローブをカルバメート連結基により染料クリスタライトに共有結合させる。Ｂ型肝炎ＲＮＡに対する第２の２５量体オリゴヌクレオチドプローブをアミド連結基により９ −(ベンザル−９Ｈ−キサンテン)に共有結合させる。染料クリスタライトは、平均で粒子サイズ２ミクロンを有する。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、標準自動合成技術により調製する。Ｂ型肝炎を有する疑いのある患者由来の試料（５０μl）を、水性アッセイ媒体（５００μl）中ｐＨ７.０で過剰の染料クリスタライトおよび上記第２プローブと合わせる。次いで、アッセイ媒体を５０℃で３０分間インキュベートし、その後、３３０nmで照射し、３９０nmで検出することによって蛍光を測定する。Ｂ型肝炎ＲＮＡが試料中に存在すると、それぞれのオリゴヌクレオチドがＲＮＡと結合するため、染料クリスタライトと９−(ベンザル−９Ｈ−キサンテン)が極めて近接するようになる。媒体を照射すると、９,１０−ジブロモアントラセンが励起され、基底状態酸素が一重項酸素に転換する。一重項酸素がキサンテンと反応して、蛍光物質であるキサントンを生成する。蛍光を光度計により測定し、ある域値レベルを越える光の量により、試料中にＢ型肝炎ＲＮＡが存在することが示される。媒体の照射を室温で行い、このアッセイを均一系手法で行って、Ｂ型肝炎ＲＮＡのアッセイを得る。また別の実施態様では、そのアッセイは、赤血球表面の特定の血液型抗原、即ち、Ａ型抗原を測定するためのものである。上記の通り調製した粒子サイズ１５０ないし５００nmを有するラテックス粒子を利用する。ラテックス粒子は、ラテックス粒子に共有結合している、Ａ型抗原に対する抗体を有する。粒子は、式（Ｉｆ）：の光活性インジケーター前駆体を有し、これは、ラテックスに溶解している。このラテックス粒子試薬を水性媒体（５００μl）中で全血液（１００μl）および１×１０^-4Ｍの光増感剤、これは、下式：の疎水性染料である、と合わせる。この疎水性染料は、試料中に存在する赤血球中に組み込まれる。媒体を２５℃で１０分間インキュベートし、次いで、タングステン源を用いて＞６５０nmで３０秒間照射する。その後、３６０nmで照射し、４４０nmで検出することにより、溶液の蛍光を測定する。媒体から放出された光を測定し、Ａ型抗原赤血球細胞のないことが分かっている試料で得られた光の量と比較する。こうして、域値レベルを越える光の量により、Ａ型血液抗原の存在が示される。本発明は、更に、光活性インジケーター前駆体を含む平均直径２５ないし４０００ナノメーターの懸濁可能な粒子を含む組成物を包含する。光活性インジケーター前駆体は、粒子マトクリックスに共有結合することができるか、またはマトリックスに溶解するかまたはマトリックスに溶解している溶媒に溶解することができる。この粒子は、好ましくは、ポリマー性であるか、または油滴またはリポソームなどの小胞である。粒子がリポソームである場合、光活性インジケーター前駆体は、脂質二重層に結合しているか、またはリポソームの水性内部に溶解している。お互いに結合する２つの相補的なｓｂｐ構成員、ただし一方が光増感剤に結合し、もう一方が光活性インジケーター前駆体に結合している、を含む組成物もまた包含する。本発明の他の態様は、分析物を含有する疑いのある試料中の分析物の存在または量を測定する本発明のアッセイ法を好便に実施するのに有用なキットに関連する。対象となる発明の使用用途を増大するために、試薬類を、試薬の比率がその方法およびアッセイを実質的に最適化するように、同じかまたは別の容器に入れてパッケージした組み合わせ物内に用意することができる。この試薬類は、それぞれ、別の容器中に入れてもよく、または、試薬の交差反応性および安定性によって変わるが、様々な試薬を１またはそれ以上の容器に合わせて入れてもよい。キットは、（１）光活性インジケーター前駆体を含む懸濁可能な粒子であって、自身に結合しているｓｂｐ構成員を有する粒子を含む組成物、および（２）光増感剤を含んで成る。光増感剤は、ｓｂｐ構成員に結合することができるか、またはｓｂｐ構成員が結合している粒子に結合することができる。キットは、さらに、補助試薬、およびその他を含むアッセイを行うための別個にパッケージした他の試薬を含む。本発明に従うキットの他の実施態様は、パッケージした組み合わせ中に、第１ｓｂｐ構成員と結合している光活性インジケーター前駆体、および第２ｓｂｐ構成員に結合している、その励起状態で酸素をその一重項状態に活性する能力のある光増感剤を含む。実施例下記例示の実施例により、本発明を更に説明する。本明細書に使用した、部およびパーセントは、特記しない限り、重量によるものである。温度は、セ氏温度（℃）である。下記略語を実施例において使用している： “アミノ−ＧＡＴＴＡＧ”− 下記に示した配列：を有し、５'末端に、下記：に例示したとおり置換されたヌクレオチド（クロンテック・ラボラトリーズ、ナンバー５２０２−１）を持つ、修飾化４２量体オリゴヌクレオチド。 “ビオチン−３０量体”− 下記に示した配列：を有し、５'末端に、下記に示した連結基：により、修飾化シトシン（５−メチルシトシン）と結合したビオチンを持つ、修飾化３０量体オリゴヌクレオチド。 “ＣＴＡＡＴＣ−３０量体”− 下記に示した配列：を有する、修飾化テール化（tailed）３０量体オリゴヌクレオチド。 “ＤＭＦ”− ジメチルホルムアミド。 “ＥＤＡＣ”− １−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミドヒドロクロリド。 “ＥＤＴＡ”− エチレンジアミンテトラ酢酸。 “ＧＡＴＴＡＧ−ＳＨ”− 下記に示した配列：を有し、下記：に例示したとおり置換された５'末端ヌクレオチドを持つ、修飾化４２量体オリゴヌクレオチド。 “ＭＥＳ”− ２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸。 “ＳＰＤＰ”− Ｎ−スクシンイミジル３−(２−ピリジルチオ)−プロピオネート。 “スルホ−ＳＭＣＣ”− ４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート。 “ＴＣＥＰ”− トリス−カルボキシエチルホスフィン。 “ＴＨＦ”− テトラヒドロフラン。実施例１光活性インジケーター前駆体の調製Ａ．酢酸エチル（１５０ml）中クマリン−１（１１.０g、４７.５ミリモル）の溶液をパール式容器（parr bottle）中１０％Ｐd/Ｃ（１００mg）で処理した。次いで、懸濁液を８０psi、８０℃で６時間水素化した。懸濁液をセライトベッドを通して濾過し、Ｐd/Ｃを除去して、セライトベッドを温酢酸エチル（１００ml ）で洗浄した。濾液を濃縮し、真空下で乾燥して、３,４−ジヒドロクマリン（２）１１.０g（１００％）を油状物として得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣl₃、２５０ＭＨz）：δ７.０２（ｄ，Ｊ＝８.５Ｈz，１Ｈ）；６.４２（dd，Ｊ＝８.５Ｈz，１.７Ｈz，１Ｈ）；６.３５（ｄ，Ｊ＝１. ７Ｈz，１Ｈ）；４.０７（ｑ，Ｊ＝７.０Ｈz，４Ｈ）；３.０６（ｍ，１Ｈ）；２.８０（dd，Ｊ_gem＝１５.６Ｈz，Ｊ_vic＝５.４Ｈz，１Ｈ）；２.５１（dd，Ｊ_gem ＝１５.６Ｈz，Ｊ_vic＝７.７Ｈz，１Ｈ）；１.２８（ｄ，Ｊ＝７.０Ｈz，３Ｈ）；１.１５（ｔ，Ｊ＝７.０Ｈz，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＩ）Ｃ₁₄Ｈ₁₉ＮＯ₂としての計算値２３３：実測値２３３（Ｍ⁺，４０％）；２１８（Ｍ⁺−ＣＨ₃，１００％）。Ｂ．無水ＴＨＦ（２０ml）中、３,４−ジヒドロクマリン２（１.６８g、７.２０ミリモル）の溶液をアルゴン下−７８℃まで冷却した。この撹拌溶液にＴＨＦ中リチウムジイソプロピルアミド（１.０Ｍの８.０ml、８.０ミリモル）を加え、生じた黄色の溶液を更に１時間撹拌した。続いて、ＴＨＦ（１０ml）に溶解したフェニルセレニルクロリド（１.５０g、７.８ミリモル）をエノレート溶液に加えた。混合物のオレンジ色が素早く消えて、黄色溶液が得られた。この溶液を３時間撹拌し、水性ＮＨ₄Ｃl（１％の１０ml）で反応を止めた。約１０分後、ジクロロメタン（１００ml）を加え、有機相を分離した。更に、水性部はＣＨ₂Ｃl₂（２×２０ml）で抽出し、有機部は集め合わせた。集め合わせた有機部を塩水（２０ml）で洗浄し、無水Ｎa₂ＳＯ₄（２５g）で乾燥し、濃縮して、黄色油状物２. １０gを得た。油状物を、ジクロロメタン中ヘキサンの勾配を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、クマリン−３−フェニルセレニド３を白色粉末として、１.８０g（６７％）得た。熱ヘキサンからの結晶化により、３を白色針状物、融点９９−１０１℃として１.３０g得た。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｃ₆Ｄ₆，２５０ＭＨz）δ７.６５（ｍ，２Ｈ）；６.９２（ｍ，３Ｈ）；６.７４（ｄ，Ｊ＝８.０Ｈz，１Ｈ）；６.３８（ｄ，Ｊ＝１.５Ｈz，１Ｈ）；６.２５（dd，Ｊ＝８.０Ｈz，１.５Ｈz，１Ｈ）；３.８８（ｄ，Ｊ＝２Ｈ z，１Ｈ）；３.０２（ｍ，１Ｈ）；２.８４（ｑ，Ｊ＝７.０Ｈz，４Ｈ）；０.９６（ｄ，Ｊ＝７.０Ｈz，３Ｈ）；０.８０（ｔ，Ｊ＝７.０Ｈz，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＩ）Ｃ₂₀Ｈ₂₃ＮＯ₂Ｓeとしての計算値３８９：実測値３８９（Ｍ⁺，１００％）；２３２（Ｍ⁺−Ｃ₆Ｈ₅Ｓe，７０％）；２１８（６０％）；２０２（４５％）；ＵＶ−Ｖis（トルエン）３００nm（４６００）；３１０nm（４６００）；３３０nm（２１００）。実施例２光活性インジケーター前駆体の調製乾燥ＴＨＦ（１５０ml）中、テルリウム粉末（１００メッシュ、１３.０ｇ、０.１０モル）の撹拌懸濁液に、エーテル−ヘキサン中、フェニルリチウム（１. ８Ｍの６０ml、０.１０モル）の溶液を加えた。懸濁液を室温で２時間撹拌し、次いで、１時間還流した。懸濁液を冷まし、水（１００ml）を加え、その後一晩撹拌した。この懸濁液に酸素ガスを３時間泡立たせた。塩化メチレン（２００ml ）を加え、有機相を分離した。更に、水相はＣＨ₂Ｃl₂（２×１００ml）で抽出し、集め合わせたものを塩水（１００ml）で洗浄し、無水Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥させた。乾燥させた溶液をシリカ（３００g）の栓に通し；そうして得られた濾液を濃縮して、熱エタノールから結晶化して、ジフェニルジテルライド４を橙赤色針状物、融点６３−６５℃（文献値６３.５−６５℃）として、１３.２g得た。ＭＳ（ＥＩ）Ｃ₁₂Ｈ₁₀Ｔe₂としての計算値４１４：実測値４１４（２５％）；４１２（４５％）；４１０（５０％）；４０８（４０％）；２０７（４０％）。ジフェニルジテルライド４（１.０g、２.５ミリモル）をＴＨＦ（１０.０ml）に溶解し、０℃まで冷却した。ＴＨＦ（５.０ml）中臭素（１２５μl、２.５ミリモル）を加え、溶液を０℃で１時間撹拌し、室温に到達させた。反応混合物を、出発物質が分析用薄層クロマトグラフィーによりもはや検出されなくなるまで、室温で撹拌し、化合物５を得た。Ｂ．無水ＴＨＦ（１０ml）中、３,４−ジヒドロクマリン（２４０mg、１.０ミリモル）の溶液をアルゴン下−７８℃まで冷却した。ＴＨＦ中リチウムジイソプロピルアミド（１.０Ｍの１.１ml、１.１ミリモル）を加え、この溶液を−７８℃で１時間撹拌した。ＴＨＦ中５の溶液（３ミリモル、上記のようにして調製したもの）をエノール酸エステルにカニューレで挿入し、この混合物を−７８℃で２時間撹拌し、室温まで到達させた。この反応混合物を水性ＮＨ₄Ｃl（１％、５ml）を用いて反応を止め、更に５分間撹拌した。次いで、反応混合物をＣＨ₂Ｃl₂（３.２５ml）で抽出し、集め合わせた有機部を塩水（２０ml）で洗浄し、無水Ｎa₂ ＳＯ₄（２０g）で乾燥させた。濃縮後、ＣＨ₂Ｃl₂を用いる（やわらかな光の下での）シリカフラッシュクロマトグラフィーにより、黄色油状物１９０mg（４３％）を得た。シクロヘキサンから結晶化して、クマリンテルライド６を明黄色固体として、１６５mg得た。 ¹Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣl₃，２５０ＭＨz）δ７.８２（dd，Ｊ＝７.０Ｈz，１.２Ｈz，２Ｈ）；７.３１（ｍ，１Ｈ）；７.２６（ｍ，２Ｈ）；６.９１（ｄ，Ｊ＝８.５Ｈz，１Ｈ）；６.３８（dd，Ｊ＝８.５Ｈz，２.５Ｈz，１Ｈ）；６.２５（ｄ，Ｊ＝２.５Ｈz，１Ｈ）；４.０５（ｄ，２.０Ｈz，１Ｈ）；３.３３（ｑ，Ｊ＝７.０Ｈz，４Ｈ）；３.２５（ｍ，１Ｈ）；１.２３（ｄ，Ｊ＝７.０Ｈz，３Ｈ）；１.１６（ｔ，Ｊ＝７.０Ｈz，６Ｈ）；ＭＳ（ＥＩ）Ｃ₂₀Ｈ₂₃ＮＯ₂Ｔeとしての計算値４３９（¹³⁰Ｔeを用いる）：実測値４３９（Ｍ⁺、２０％）；２３２（Ｍ⁺−Ｃ₆Ｈ₅Ｔe、１００％）；２１７（２５％）；２０２（３５％）；ＵＶ−Ｖis（トルエン）３１０nm（３８６０）；３３０nm（２４００）；３７０nm（５１０）。実施例３光活性インジケーター前駆体の調製Ａ．無水ＴＨＦ（２００ml）中、ｐ−ブロモ−Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン（１０.０ g、５０.０ミリモル）の溶液をアルゴン下−７８℃まで冷却した。この冷却溶液に、ペンタン中ｔ−ブチルリチウム（１.８Ｍの５６ml、１００ミリモル）を注意深く加え、生じた黄色懸濁液を−７８℃で１時間撹拌した。微細に砕いたテルリウム粉末（６.５０g、５０ミリモル）をアルゴン流下で加えた。次いで、反応混合物を室温に到達させ、その時間までに（〜２時間）、ほとんどのテルリウムは溶解した。反応混合物を水（２０ml）で反応を止め、水性Ｋ３[Ｆe(ＣＮ)₆]溶液（２００ml中１７g、０.０５２モル）に注いだ。混合物を１時間撹拌し、次いで、ＣＨ₂Ｃl₂（３×２００ml）で抽出した。集め合わせた有機部を塩水（１００ml）で洗浄し、無水Ｎa₂ＳＯ₄（１００g）で乾燥させた。乾燥させた物質をシリカ（３００g）の栓に通し、濾液を濃縮して、橙赤色ペースト１２.２gを得た。エタノールから結晶化して、ジテルライド７を橙赤色粉末として８.６g得た。もう一方のバッチ（２.２g）を母液から回収した。ＭＳ（ＥＩ）Ｃ₁₆Ｈ₂₀Ｎ₂Ｔe₂としての計算値５００：実測値５００（２０％）；４９８(４０％)；４９６(４５％)；２５０(１００％)；２４０(９８％)。このジテルライド７（１.７０g、３.４ミリモル）を最少量の無水ＴＨＦに溶解し、０℃まで冷却した。溶液を臭素（１７５μl、３.４ミリモル）で処理し、混合物を０℃で３時間撹拌し、所望の生成物８を含有する溶液を得た。Ｂ．次いで、生成物８をアルゴン下、ＴＨＦ中ジヒドロクマリン２（８００mg、３ .４ミリモル）およびリチウムジイソプロピルアミド（１.０Ｍの３.５ml、３.５ミリモル）の溶液にカニューレで挿入した。得られた橙赤色混合物を室温に到達させ、水性ＮＨ₄Ｃl（１.０％の１０ml）で反応を止めた。続いて、混合物をＣＨ₂Ｃl₂(３×５０ml）で抽出し、集めた有機部を塩水（５０ml）および無水Ｎa₂ ＳＯ₄で乾燥させた。濃縮し、その後、ＣＨ₂Ｃl₂を用いる（やわらかい光の下での）シリカフラッシュクロマトグラフィーにより、クマリン３−(４−ジメチルアミノ)フェニルテルライド９の５１０mgを、出発物質のジヒドロクマリン２の１１０mgと一緒に得た。９の収率は、回収した出発物質に基づくと３７％であった。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣl₃，２５０ＭＨz）δ７.６５（ｄ，Ｊ＝８.０Ｈz，２Ｈ）；６.９２（ｄ，Ｊ＝８.５Ｈz，１Ｈ）；６.５２（ｄ，Ｊ＝８.０Ｈz，２Ｈ）；６.４１（dd，Ｊ＝８.５Ｈz，１.５Ｈz，１Ｈ）；６.２４（ｄ，Ｊ＝１.５Ｈz ，１Ｈ）；４.０３（ｄ，２Ｈz，１Ｈ）；３.３８（ｑ，Ｊ＝７.０Ｈz，４Ｈ）；３.２５（ｍ，Ｈ）；２.９５（ｓ，６Ｈ）；１.１９（ｄ，Ｊ＝７.０Ｈz，３Ｈ）；１.１４（ｔ，Ｊ＝７.０Ｈz，６Ｈ）。ＭＳ（ＥＩ）Ｃ₂₂Ｈ₂₈Ｎ₂Ｏ₂Ｔeとしての計算値４８２（¹³⁰Ｔeを用いる）：実測値４８２（Ｍ⁺，２０％）；２５２（２０％）；２３２（Ｍ⁺−Ｃ₈Ｈ₁₀Ｔe，１００％；ＵＶ−Ｖis（トルエン）３００nm（１８０００）；３２０nm（１３６００）；３３０nm（８４００）。実施例４光活性インジケーター前駆体粒子の調製（アクセプタービーズ）クマリン−３−(４−ジメチルアミノ)フェニルテルライド９の０.３Ｍ溶液を脱気したエトキシエーテル中で穏やかに暖めることにより調製した。エチレングリコール（１ml）を４mlバイアル中で１０５−１１０℃まで加熱した。ストックのラテックス懸濁液（水中１０％固体の２００μl）をバイアルに加え、混合物をアルゴン下で磁気撹拌した。クマリン−３−(４−ジメチルアミノ)フェニルテルライド９（２００μl、エトキシエタノール中０.３Ｍ）をこの混合物にゆっくりと加え、生じた混合物を５分間撹拌し、次いで、アルゴン下で室温まで到達させた。冷却後、懸濁液をエタノール（３ml）で処理し、遠心管に移した。次いで、混合物を１５,０００rpm（ソルバル、ＳＡ６００ローター）で１時間遠心分離した。上清を注意深くデカントして、ペレットを超音波処理により、水性エタノール（４.０ml）に懸濁した。上清を１５,０００rpmで１時間遠心分離した。上清をもう一度除去し、ペレットを水（４ml）に再懸濁した。最終の遠心分離および上清の除去の後、ペレットを水に再懸濁して、最終容量２mlにして、光活性インジケーター前駆体粒子懸濁液１０mg／mlを得た。実施例５ストレプトアビジン−光活性インジケーター前駆体の調製染色粒子上記実施例４で調製した光活性インジケーター前駆体粒子（１０mg／mlの１ml ）懸濁液をＥＤＡC溶液（０.５mg／ml、０.０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６.０の１ ml）に加え、０℃まで冷却した。懸濁液をアルゴン下で３０分間撹拌した。その後、懸濁液を、ボレート緩衝液（０.２Ｍ、ｐＨ９.０）中ストレプトアビジン溶液（５mg／ml、１ml）に滴下して加え、〜０℃に維持した。懸濁液を１時間撹拌し、室温まで暖めさせた。水（１ml）を加え、混合物を１５,０００rpmで１時間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを超音波処理により水（４ml）に懸濁した。試料を超音波処理により水（４ml）中で再遠心分離し、最後に１５,０００r pmで３０分間遠心分離した後、得られたペレットを水（５ml）に懸濁した。これにより、ストレプトアビジン−光活性インジケーター前駆体粒子の懸濁液２mg／ mlを得た。ストレプトアビジンの存在は、³Ｈビオチン結合により確認し、２５００±２５０ストレプトアビジン／粒子であると定量した。実施例６マレイミド化デキストラン光増感剤の調製粒子Ａ．粒子の染色ベンジルアルコール中、クロロフィルａ（２.０mＭ）とテトラブチルスクアレート（４.０mＭ）の染料混合物を調製した。エチレングリコール（８０ml）を１２５mlエーレンマイヤーフラスコに入れ、実験用ホットプレートで１２５℃まで暖めた。次いで、ベンジルアルコール中の染料混合物（８ml）を加え、直ちに、ストックのラテックス懸濁液（１０％固体の１０ml）を加えた。加熱を止め、フラスコとその内容物を室温まで到達させた。冷却後、混合物を等しい容量のエタノールで希釈して、直ちに、１５,０００rpmで２時間遠心分離した。青みがかった緑色の上清を廃棄し、ペレットを超音波処理によりエタノール５０mlに懸濁した。懸濁液を１５,０００rpmで１時間遠心分離し、微かに青色の上清を廃棄した。ペレットを超音波処理により、５０％水性エタノール（５０ml）に再懸濁して、粒子を分散させた。１５,０００rpmでの遠心分離を１時間繰り返した。上清を廃棄し、ペレットを超音波処理により水に再懸濁した。最終の遠心分離の後、ペレットを水に再懸濁し、最終容量２０mlにした。Ｂ．マレイミド化デキストラン光増感剤粒子の調製アミノデキストラン（５００mg）を、スルホ−ＳＭＣＣ（１５７mg、１０mlＨ₂ Ｏ）と反応させることにより、部分的にマレイミド化した。スルホ−ＳＭＣＣをアミノデキストラン（０.０５ＭＮa₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７.５、４０ml中）の溶液に加え、生じた混合物を１.５時間インキュベートした。反応混合物を次いでＭＥＳ／ＮaＣl(２×２Ｌ、１０mＭＭＥＳ、１０mＭＮaＣl、ｐＨ６.０、４℃) に対して透析した。マレイミド化デキストランを１５,０００rpmで１５分間遠心分離し、上清を集めた。次いで、上清デキストラン溶液（５４ml）をＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６.０）中イミダゾール（１.０Ｍ溶液の７ml）で処理し、この撹拌溶液に、染色した光増感剤粒子（１０mg／mlの１０ml）を加えた。１０分間撹拌後、懸濁液をＥＤＡＣ（１０mＭ、ｐＨ６.０のＭＥＳ中７ミリモル）で処理し、この懸濁液を３０分間撹拌した。その後、サーハァクトアンプス（登録商標）（ピアス社）トゥイーン−２０（１０％、０.７８０ml）を反応混合物に加えて、最終濃度０.１％にした。次いで、粒子を１５,０００rpmで４５分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを超音波処理によりＭＥＳ／ＮaＣl（ｐＨ６.０、１０m Ｍ、１００ml）に再懸濁した。１５,０００rpmで４５分間の遠心分離、その後、上清廃棄後のペレット再懸濁を２回実施した。マレイミド化デキストラン光増感剤粒子を１０mg／ml懸濁液として水中に貯蔵した。実施例７ＧＡＴＴＡＧ−光増感剤粒子の調製水中、アミノ−ＧＡＴＴＡＧ（１８０μl、５０ナノモル）（下記実施例８に記載のようにして調製したもの）を０.２５Ｍボラックス（５０μl）で処理して、ｐＨ９.２にした。ＳＰＤＰ（乾燥ＤＭＦ中５０mg／ml）を、０、１０、２０、および３０分で、４部加えた（合計３３.８マイクロモル）。反応混合物を２時間静置した。氷冷エタノール（２.１ml）を加え、生成物を冷凍庫の中に一晩置いた。濁った生成物混合物を２つのエッペンドルフ管に分配し、最大スピードで１０分間遠心分離した。上清を注意深く除去し、ペレットをＨ₂Ｏ４００μlに溶解した。この溶液に、２.５Ｍ酢酸塩緩衝液（２０μl、２.５Ｍ、ｐＨ５.３）を加えた。蒸留水中ＴＣＥＰ(１０μl、２０mＭ)を加え、室温で３０分間還元させた。無水エタノール(１.２ml)を加え、反応混合物を冷凍庫に２時間入れた。反応混合物を冷室中、全開スピードで遠心分離し、沈澱したＧＡＴＴＡＧ−ＳＨオリゴヌクレオチドをペレットとして除去した。このペレットを２０mＭＥＤＴＡを含有する５０mＭＮa₂ＨＰＯ₄緩衝液２００μl（ｐＨ６.８５）に溶解した。この溶液を脱気し、アルゴン下に維持した。次いで、この溶液をマレイミド化デキストラン光増感剤粒子（１４.２mg／１.５ml）（上記実施例６において調製された）に加え、反応混合物を一晩静置した。混合物を１５,０００rpmで１時間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを水（２ml）に再懸濁し、１５,０００rpmで１時間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを水（２ml）に再懸濁した。最終の遠心分離の後、ＧＡＴＴＡＧ−光増感剤粒子を懸濁液として、水溶液２ml中で貯蔵した。実施例８ＤＮＡを検出するためのアッセイＡ．下記に示した配列を有する標的６５量体オリゴヌクレオチド：およびＣＴＡＡＴＣ−３０量体およびアミノ−ＣＡＴＴＡＧを、標準固相ホスホルアミダイト法を用いるミリゲン・バイオサーチ・ＤＮＡ自動合成機（モデル・ナンバー８７５０）で調製した（オリゴヌクレオチド・シンセシス−ア・プラクティカル・アプローチ（１９８４年）、ゲイ・Ｍ.Ｊ.編、ＩＲＬプレス・オックスホード、参照）。このプトロコールは、簡単に言えば、（ａ）ジクロロ酢酸を用いる、固体支持体に結合させたヌクレオシド上の５'−ジメトキシトリチル基の除去；（ｂ）触媒として、テトラゾールを用いる、加えたヌクレオシド、これは、５'−ヒドロキシル保護基（好ましくは、ジメトキシトリチル）および３'− ヒドロキシル保護基（好ましくは、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）を含む、のカップリング；（ｃ）無水酢酸を用いるキャッピング工程；および（ｄ）ホスファイトトリエステルをホスフェートトリエステルに変換するためのヨウ素酸化から成る。合成の最後に、水酸化アンモニウムを用いて、（ａ）合成したポリヌクレオチドを支持体から切り離し；（ｂ）ホスホリル保護基（β−シアノエチル）をはずし；さらに（ｃ）塩基保護基をはずした。オリゴヌクレオチドは、最終的にＨＰＬＣにより精製した。Ｂ．ビオチン−３０量体を、最後に加えるヌクレオチドの塩基が、下記に示したような保護化アミン修飾剤（アメリカン・バイオネティックス、ナンバーＡＢＮ２５９９）の付いた５−メチル−シトシンである以外は上記と同様にして調製する：脱保護の後、遊離のアミンを、０.１ＭＮaＨＣＯ₃、ｐＨ９.０中１：６０モル比率の２つの試薬で、ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（ピエス、ナンバ−２１３３５Ｇ）と反応させた。室温で一晩インキュベーションした後、得られたオリゴヌクレオチドを分析し、１２％変性ポリアクリルアミドゲルで精製した。Ｃ．１.５mlエッペンドルフ管に入れたトリス／ＥＤＴＡ／ＮaＣl溶液（ｐＨ８. ０、それぞれ１００mＭ、０.１mＭ、０.３０Ｍ）中で、様々な容量（２１nＭの０〜８０μl）の標的６５量体オリゴヌクレオチドをＣＴＡＡＴＣ−３０量体（１５nＭの２００μl）およびビオチン−３０量体（１５nＭの２００μl）と混合することにより、アッセイを実施した。３０量体プローブを、冷却の際、標的６５量体オリゴヌクレオチド上のそれらの相補部分とハイブリダイズさせ得るために、容量を０.５mlにし、溶液を５５℃で３０分間アニール化した。反応混合物を室温まで冷まし、次いで、ストレプトアビジン−光活性インジケーター前駆体粒子（１００μg／mlの１００μl）、続いてＧＡＴＴＡＧ−光増感剤粒子（１００μg／mlの４００μl）で処理した。混合物を穏やかに旋回させ、室温で２時間インキュベートした。次いで、懸濁液を１２×７５mm試験管に移し、５分間、６１０nmカットオフフィルターを装備したドーラン−ジュネーランプ（タングステン）を照射した。試料を等量（１ml）の緩衝液で処理し、蛍光計に移した。３６０ＮＢフィルターおよび４２０ＮＢフィルター放出（エミッション）での励起に対応する蛍光単位を記録した。２つの個々のアッセイについて得られた標準曲線は、図１に示している。上述の発明は、明瞭さおよび理解を求める目的で例示説明および実施例を用いて幾分詳細に記載しているが、添付の請求の範囲内である種の変形または修飾を適用し得ることは明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年９月１８日【補正内容】請求の範囲１．特異的結合対（ｓｂｐ）構成員である分析物を測定する方法であって：（ａ）組み合わせで：（１）分析物を含有する疑いのある媒体；（２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、ｓｂｐ構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している該ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；および（３）一重項酸素との反応に際し、光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、ｓｂｐ構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している該ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれている；を用意し；（ｂ）光の照射により該光増感剤を励起させ；さらに、（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定する；ことを含んで成り、該ｓｂｐ構成員の少なくとも１つは、直接的または間接的に、該分析物に、または該分析物と相補的なｓｂｐ構成員に結合することができるものであり、さらに、該蛍光が該媒体中の該分析物の量と相関するものである、方法。２．該光増感剤が、ケトン類、多芳香族化合物類、シアニン類、メロシアニン類、フタロシアニン類、スクアレート染料類、ポルフィリン類、キサンテン類、チアジン類、およびオキサジン類からなる群から選択されるものである、請求の範囲第１項記載の方法。３．該光活性インジケーターが、その吸収極大で少なくとも１０,０００Ｍ^-1c m^-1の消光係数、および少なくとも０.１の蛍光放出量子収率を有するものである、請求の範囲第１項記載の方法。４．光増感剤または光活性インジケーター前駆体のいずれも、粒子に結合していないか、または組み込まれていない方法であって、かつ工程（ｂ）の前に、該光増感剤および該光活性インジケーター前駆体のうちの少なくとも１つを特異的結合対結合の手段により表面に結合させることを含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法。５．懸濁可能な粒子が該表面を含んでおり、該粒子が、ラテックス粒子類、脂質小胞類、油滴類、シリカ粒子類、金属ゾル類、および染料クリスタライト類からなる群から選択されるものである、請求の範囲第４項記載の方法。６．該分析物が、薬剤、タンパク質、ポリヌクレオチド、受容体、および微生物からなる群から選択されるものである、請求の範囲第１項記載の方法。７．分析物を測定する方法であって：（Ａ）分析物がポリヌクレオチドである場合、（ａ）水性媒体中で：（１）該分析物；（２）１またはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ、ただし各プローブは該分析物のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、プローブの少なくとも１つは、特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している該ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものであり、該ｓｂｐ構成員は、該相補的ヌクレオチド配列とは異なるものである；（３）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合されている該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものであり；および、（４）一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、該プローブと結合している該ｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合されている該プローブと結合している該ｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；を組み合わせ；（ｂ）該媒体に光を照射し、該光増感剤を励起させて一重項酸素を産生し；そして、（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定する；ことを含んで成り、該蛍光は該媒体中の該分析物の量と相関するものである、方法であるか、または（Ｂ）分析物がポリヌクレオチド以外のものである場合、（ａ）組み合わせで：（１）分析物を含有する疑いのある媒体；（２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；および（３）一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、第２ｓｂｐ構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している第２ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；を用意し；（ｂ）該組み合わせに光を照射して該光増感剤を励起させ；そして、（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定する；ことを含んで成り、各ｓｂｐ構成員は、直接的または間接的に該分析物に、または該分析物と相補的なｓｂｐ構成員に結合することができ、かっ、該蛍光が、該媒体中の該分析物の量と相関しており、また、該光増感剤が所望により該第１ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部であり、該光活性インジケーター前駆体が所望により該第２ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部である、方法。８．一重項酸素と反応して光活性インジケーターを形成する光活性インジケーター前駆体が結合している平均直径２０ないし４０００ナノメーターの懸濁可能な粒子を含み、特異的結合対（ｓｂｐ）構成員である分析物を測定する方法において使用される組成物であって、ただし、該光活性インジケーター前駆体がセレニウムまたはテルリウム原子を含み、該光活性インジケーターがセレニウムまたはテルリウム原子を含まないものである組成物。９．分析物のアッセイを行うためのキットであって、パッケージした組み合わせ中に：（ａ）セレニウムまたはテルリウム原子を含む光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している第１ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれている；（ｂ）その励起状態で酸素をその一重項状態まで活性化する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、第２ｓｂｐ構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している第２ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれている；を含み、該ｓｂｐ構成員は、該分析物に、または該分析物と結合可能なｓｂｐ構成員に結合することができ、さらに、該光活性インジケーター前駆体が、所望により、該第１ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部であり、また、該光増感剤が、所望により、該第２ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部である、キット。 10．特異的結合対（ｓｂｐ）構成員である分析物の結合アッセイであって：（ａ）該分析物を含有する疑いのある媒体を、該分析物に、または該分析物と相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合できるｓｂｐ構成員と合わせ；そして、（ｂ）該ｓｂｐ構成員と、該分析物または該相補的なｓｂｐ構成員との結合を検出する、ただし、該検出は、該媒体中の光活性インジケーター前駆体を一重項酸素にさらして光活性インジケーターを生成させ、該光活性インジケーターの蛍光を測定することを含むものである、を含んで成るアッセイ。 11．下記構造：式中、Ｈは、ＸＲ基に対してシスであり；Ｘは、セレニウムまたはテルリウム原子であり；Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはスズ原子によりＸに結合する有機または有機金属基であり；さらに、Ａは、炭素−炭素基と一緒になるとき（所望により、１またはそれ以上の芳香環と縮合した）脂環式環、または複素環を形成し；一重項酸素を有する化合物と反応すると、ＨおよびＸＲ基が、炭素−炭素二重結合に換わって、その吸収極大で少なくとも１０,０００Ｍ^-1cm^-1の消光係数、および少なくとも０.１の蛍光放出量子収率を有する蛍光分子が得られる、を含有する化合物。 12．下式：式中、Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはスズ原子を介してＸに結合する有機または有機金属基であり；Ｒ¹は、水素またはアルキルであり；残りの水素原子の４つまでが、一緒になって１またはそれ以上の脂環式環または芳香環式環を形成し得るアルキルまたはアルキレン置換基により置換されてもよい、を有する、請求の範囲第１１項記載の化合物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウルマン、エドウィン・エフアメリカ合衆国94025カリフォルニア州アサートン、セルビー・レーン135番

Claims

【特許請求の範囲】１．特異的結合対（ｓｂｐ）構成員である分析物を測定する方法であって：（ａ）組み合わせで：（１）分析物を含有する疑いのある媒体；（２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、ｓｂｐ構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している該ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；および（３）一重項酸素との反応に際し、光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、ｓｂｐ構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している該ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれている；を用意し；（ｂ）光の照射により該光増感剤を励起させ；さらに、（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定する；ことを含んで成り、該ｓｂｐ構成員の少なくとも１つは、直接的または間接的に、該分析物に、または該分析物と相補的なｓｂｐ構成員に結合することができるものであり、さらに、該蛍光が該媒体中の該分析物の量と相関するものである、方法。２．該光増感剤が、ケトン類、多芳香族化合物類、シアニン類、メロシアニン類、フタロシアニン類、スクアレート染料類、ポルフィリン類、キサンテン類、チアジン類、およびオキサジン類からなる群から選択されるものである、請求の範囲第１項記載の方法。３．該光活性インジケーターが、その吸収極大で少なくとも１０,０００Ｍ^-1c m^-1の消光係数、および少なくとも０.１の蛍光放出量子収率を有するものである、請求の範囲第１項記載の方法。４．光増感剤または光活性インジケーター前駆体のいずれも、粒子に結合していないか、または組み込まれていない方法であって、かつ工程（ｂ）の前に、該光増感剤および該光活性インジケーター前駆体のうちの少なくとも１つを特異的結合対結合の手段により表面に結合させることを含んで成る、請求の範囲第１項記載の方法。５．懸濁可能な粒子が該表面を含んでおり、該粒子が、ラテックス粒子類、脂質小胞類、油滴類、シリカ粒子類、金属ゾル類、および染料クリスタライト類からなる群から選択されるものである、請求の範囲第４項記載の方法。６．該分析物が、薬剤、タンパク質、ポリヌクレオチド、受容体、および微生物からなる群から選択されるものである、請求の範囲第１項記載の方法。７．分析物を測定する方法であって：（Ａ）分析物がポリヌクレオチドである場合、（ａ）水性媒体中で：（１）該分析物；（２）１またはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ、ただし各プローブは該分析物のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、プローブの少なくとも１つは、特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している該ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものであり、該ｓｂｐ構成員は、該相補的ヌクレオチド配列とは異なるものである；（３）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合されている該プローブのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものであり；および、（４）一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、該プローブと結合している該ｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合されている該プローブと結合している該ｓｂｐ構成員と相補的なｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；を組み合わせ；（ｂ）該媒体に光を照射し、該光増感剤を励起させて一重項酸素を産生し；そして、（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定する；ことを含んで成り、該蛍光は該媒体中の該分析物の量と相関するものである、方法であるか、または（Ｂ）分析物がポリヌクレオチド以外のものである場合、（ａ）組み合わせで：（１）分析物を含有する疑いのある媒体；（２）その励起状態で一重項酸素を産生する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または、自身に組み込まれているかまたは結合している第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；および（３）一重項酸素と反応すると光活性インジケーターを形成する能力のある光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、第２ｓｂｐ構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している第２ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれているものである；を用意し；（ｂ）該組み合わせに光を照射して該光増感剤を励起させ；そして、（ｃ）該光活性インジケーターの蛍光を測定する；ことを含んで成り、各ｓｂｐ構成員は、直接的または間接的に該分析物に、または該分析物と相補的なｓｂｐ構成員に結合することができ、かつ、該蛍光が、該媒体中の該分析物の量と相関しており、また、該光増感剤が所望により該第１ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部であり、該光活性インジケーター前駆体が所望により該第２ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部である、方法。８．一重項酸素と反応して光活性インジケーターを形成する光活性インジケーター前駆体が結合している平均直径２０ないし４０００ナノメーターの懸濁可能な粒子を含む組成物であって、該光活性インジケーター前駆体がセレニウムまたはテルリウム原子を含み、該光活性インジケーターがセレニウムまたはテルリウム原子を含まないものである、組成物。９．分析物のアッセイを行うためのキットであって、パッケージした組み合わせ中に：（ａ）セレニウムまたはテルリウム原子を含む光活性インジケーター前駆体、ただし、該光活性インジケーター前駆体は、第１特異的結合対（ｓｂｐ）構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している第１ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれている；（ｂ）その励起状態で酸素をその一重項状態まで活性化する能力のある光増感剤、ただし、該光増感剤は、第２ｓｂｐ構成員に結合しているか、または自身に組み込まれているかまたは結合している第２ｓｂｐ構成員を有する粒子に結合しているかまたは組み込まれている；を含み、該ｓｂｐ構成員は、該分析物に、または該分析物と結合可能なｓｂｐ構成員に結合することができ、さらに、該光活性インジケーター前駆体が、所望により、該第１ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部であり、また、該光増感剤が、所望により、該第２ｓｂｐ構成員が結合している懸濁可能な粒子の一部である、キット。 10．特異的結合対（ｓｂｐ）構成員である分析物の結合アッセイであって：（ａ）該分析物を含有する疑いのある媒体を、該分析物に、または該分析物と相補的なｓｂｐ構成員に、直接的または間接的に結合できるｓｂｐ構成員と合わせ；そして、（ｂ）該ｓｂｐ構成員と、該分析物または該相補的なｓｂｐ構成員との結合を検出する、ただし、該検出は、該媒体中の光活性インジケーター前駆体を一重項酸素にさらして光活性インジケーターを生成させ、該光活性インジケーターの蛍光を測定することを含むものである、を含んで成るアッセイ。 11．下記構造：式中、Ｈは、ＸＲ基に対してシスであり；Ｘは、セレニウムまたはテルリウム原子であり；Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはスズ原子によりＸに結合する有機または有機金属基であり；さらに、Ａは、炭素−炭素基と一緒になるとき（所望により、１またはそれ以上の芳香環と縮合した）脂環式環、または複素環を形成し；一重項酸素を有する化合物と反応すると、ＨおよびＸＲ基が、炭素−炭素二重結合に換わって、その吸収極大で少なくとも１０,０００Ｍ^-1cm^-1の消光係数、および少なくとも０.１の蛍光放出量子収率を有する蛍光分子が得られる、を含有する化合物。 12．下式：式中、Ｒは、不飽和炭素原子、シリコン原子、またはスズ原子を介してＸに結合する有機または有機金属基であり；Ｒ¹は、水素またはアルキルであり；残りの水素原子の４つまでが、一緒になって１またはそれ以上の脂環式環または芳香環式環を形成し得るアルキルまたはアルキレン置換基により置換されてもよい、を有する、請求の範囲第１１項記載の化合物。