JP3447066B2 - 水性溶液の形で保護された及び保護されていないジ− 及びオリゴペプチドの酵素による製造方法 - Google Patents
水性溶液の形で保護された及び保護されていないジ− 及びオリゴペプチドの酵素による製造方法Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、均一な、高度に濃縮さ
れた、水性溶液の形で保護されたジ- 又はオリゴペプチ
ドの酵素による製造方法に関する。
れた、水性溶液の形で保護されたジ- 又はオリゴペプチ
ドの酵素による製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】合成短鎖ペプチドは、薬理学で及び腸管
外栄養補給でますます使用されている。薬理学的に有効
なジペプチドに関する例として、キオトルフィン(L-
Tyr- Arg)が挙げられ、これはエンケフアリン─
─これは内因性物質であり、すなわち脳内に痛覚麻痺性
及び鎮静作用性効果を有する(ヒューズ、1975)─
の遊離を必要とする。
外栄養補給でますます使用されている。薬理学的に有効
なジペプチドに関する例として、キオトルフィン(L-
Tyr- Arg)が挙げられ、これはエンケフアリン─
─これは内因性物質であり、すなわち脳内に痛覚麻痺性
及び鎮静作用性効果を有する(ヒューズ、1975)─
の遊離を必要とする。
【0003】それ故に、この様な使用に準備されるペプ
チドの化学的及び光学的純度は、極めて重要である。し
たがってすべての場合に領域- 及び立体特異的に進行す
る酵素によるペプチド合成が、常にしばしば好ましく使
用される。その際ほとんどがN- 保護されたアミノ酸ア
ルキルエステルを、加水分解酵素の存在下に遊離アミノ
基を有するアミノ酸- 又はジ- 又はオリゴペプチド誘導
体と、動的に調節された反応で反応させる。水の存在下
での反応の実施で、アルキルエステルの熱力学的に好都
合な、アルキルエステルの加水分解が、融合反応として
生じる。この方法の欠点は、酵素が水の存在下にしか活
性かつ安定でなく、及び使用される基質は一般に僅かな
水溶性しか有しないという事実である。溶解媒体として
有機溶剤を添加する場合、一般に酵素の少なくとも部分
的不活性化及び安定性の減少を考慮しなければならな
い。したがって従来ほとんど最高100mMの基質濃度
でしか処理されなかった。選択性- 及びしたがって収量
増加のために、従来更に求核試薬成分を多過剰(2−2
0倍)で使用する。液相中での短鎖ペプチドの化学的合
成に比較して──この際基質及び求核試薬は実際上化学
量論量で及び高濃度で使用する──、この様な処理は、
酵素による合成で従来実施されなかった。
チドの化学的及び光学的純度は、極めて重要である。し
たがってすべての場合に領域- 及び立体特異的に進行す
る酵素によるペプチド合成が、常にしばしば好ましく使
用される。その際ほとんどがN- 保護されたアミノ酸ア
ルキルエステルを、加水分解酵素の存在下に遊離アミノ
基を有するアミノ酸- 又はジ- 又はオリゴペプチド誘導
体と、動的に調節された反応で反応させる。水の存在下
での反応の実施で、アルキルエステルの熱力学的に好都
合な、アルキルエステルの加水分解が、融合反応として
生じる。この方法の欠点は、酵素が水の存在下にしか活
性かつ安定でなく、及び使用される基質は一般に僅かな
水溶性しか有しないという事実である。溶解媒体として
有機溶剤を添加する場合、一般に酵素の少なくとも部分
的不活性化及び安定性の減少を考慮しなければならな
い。したがって従来ほとんど最高100mMの基質濃度
でしか処理されなかった。選択性- 及びしたがって収量
増加のために、従来更に求核試薬成分を多過剰(2−2
0倍)で使用する。液相中での短鎖ペプチドの化学的合
成に比較して──この際基質及び求核試薬は実際上化学
量論量で及び高濃度で使用する──、この様な処理は、
酵素による合成で従来実施されなかった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明の目
的は、酵素反応を比較的に高濃度で水性媒体中でも実施
し、これに必要な過剰の求核試薬成分を十分に還元する
という方法を発展させることである。
的は、酵素反応を比較的に高濃度で水性媒体中でも実施
し、これに必要な過剰の求核試薬成分を十分に還元する
という方法を発展させることである。
【0005】
【課題を解決するための手段】この目的は、本発明によ
れば、求電子試薬として一般式I X−E−R1 I (式中EはX及びR1 に関連して、 N- 末端がXで、C- 末端がR1 で置換されたアミノ酸
又はそのジ−又はオリゴペプチドを示し、 R1 は、C 原子数1〜4のエステル化アルキル基を示
し、これは場合によりアリール基を置換基として有し、
Xは、反応に適用されたpH値でX=Hである化合物に
比べて水への溶解度を >5のファクターに増加させる基
である。)の化合物と求核試薬として一般式II H2 N−Q−R2 II (式中QはH2 N及びR2 に関連して、C- 末端がR2-
基を有するアミノ酸又はそのジ- 又はオリゴペプチドを
示し、但し、R2 は遊離の酸末端、場合により置換基と
してアリール基を有するC1-ないしC4-アルキルエステ
ル化又はアミド化を -NH3 R4 によって示し、その残
基R3 及びR4 は夫々相互に無関係にC1-ないしC4-ア
ルキル基、そのアリールアルキル基又はアリール基を示
す。)の化合物とを、水性溶液の形で加水分解酵素の下
に反応させ、その際求電子試薬(I)は、X=マレイル
である場合100mMより大きいか又はこれに等しい濃
度で使用し、場合により反応混合物から分離された反応
生成物から保護基を除くことによって達成される。
れば、求電子試薬として一般式I X−E−R1 I (式中EはX及びR1 に関連して、 N- 末端がXで、C- 末端がR1 で置換されたアミノ酸
又はそのジ−又はオリゴペプチドを示し、 R1 は、C 原子数1〜4のエステル化アルキル基を示
し、これは場合によりアリール基を置換基として有し、
Xは、反応に適用されたpH値でX=Hである化合物に
比べて水への溶解度を >5のファクターに増加させる基
である。)の化合物と求核試薬として一般式II H2 N−Q−R2 II (式中QはH2 N及びR2 に関連して、C- 末端がR2-
基を有するアミノ酸又はそのジ- 又はオリゴペプチドを
示し、但し、R2 は遊離の酸末端、場合により置換基と
してアリール基を有するC1-ないしC4-アルキルエステ
ル化又はアミド化を -NH3 R4 によって示し、その残
基R3 及びR4 は夫々相互に無関係にC1-ないしC4-ア
ルキル基、そのアリールアルキル基又はアリール基を示
す。)の化合物とを、水性溶液の形で加水分解酵素の下
に反応させ、その際求電子試薬(I)は、X=マレイル
である場合100mMより大きいか又はこれに等しい濃
度で使用し、場合により反応混合物から分離された反応
生成物から保護基を除くことによって達成される。
【0006】(求電子試薬の)アミノ酸又はペプチドア
ルキルエステルの水溶性を、特定のN- 末端、特に極性
又は帯電する保護基によって極度に増加し(たとえばチ
ロシンエチルエステルに対して5- ないし100- 倍
に)、高い基質濃度>50mM、好ましくは>100m
M、少なくと1Mまで、しかもそれ以上(たとえば4M
まで)で均一相中で処理することができるばかりでな
く、更にこの高い基質濃度が驚くべきことに極度に高め
られた酵素活性を導くことが認められた。N- 末端保護
基として極性基、好ましくは帯電しているものが適す
る。極性とは、基のその電子分布が上記条件を満たすの
に適する電気双極子モーメントを与える様な官能基を意
味する。この様な基は、水に対する親和性を制限し、こ
れによって物質の親水性質を増加させるので、純粋に水
性の溶液の形で処理することができる。
ルキルエステルの水溶性を、特定のN- 末端、特に極性
又は帯電する保護基によって極度に増加し(たとえばチ
ロシンエチルエステルに対して5- ないし100- 倍
に)、高い基質濃度>50mM、好ましくは>100m
M、少なくと1Mまで、しかもそれ以上(たとえば4M
まで)で均一相中で処理することができるばかりでな
く、更にこの高い基質濃度が驚くべきことに極度に高め
られた酵素活性を導くことが認められた。N- 末端保護
基として極性基、好ましくは帯電しているものが適す
る。極性とは、基のその電子分布が上記条件を満たすの
に適する電気双極子モーメントを与える様な官能基を意
味する。この様な基は、水に対する親和性を制限し、こ
れによって物質の親水性質を増加させるので、純粋に水
性の溶液の形で処理することができる。
【0007】したがって本発明による方法によって、非
常に高い空時収量を達成することができる。これは従来
技術に比して、たとえば保護されたTyr- Argの合
成に関してフアクター10以上にある(図1)。十分に
高められた基質濃度の他の効果として、驚くべきことに
求核試薬成分の割合を等モル量まで、選択性が加水分解
反応に比して著しく低下することなく減少させることが
できることを確認した。式IIの化合物を式Iの化合物
に対して、モル割合<1.5、特に0.8〜1.2、特
に約1.0で使用するのが好ましい。
常に高い空時収量を達成することができる。これは従来
技術に比して、たとえば保護されたTyr- Argの合
成に関してフアクター10以上にある(図1)。十分に
高められた基質濃度の他の効果として、驚くべきことに
求核試薬成分の割合を等モル量まで、選択性が加水分解
反応に比して著しく低下することなく減少させることが
できることを確認した。式IIの化合物を式Iの化合物
に対して、モル割合<1.5、特に0.8〜1.2、特
に約1.0で使用するのが好ましい。
【0008】合成にあたり、特に天然のα- アミノ酸か
ら由来する反応成分を使用する。
ら由来する反応成分を使用する。
【0009】帯電する保護基の選択で、荷電(陽性/陰
性)の種類は、大した役に立たない。N- 末端カルボキ
シ置換されたアシル基、たとえばフタリル又はマレイ
ル、並びにその誘導体又は同族体を使用することができ
る。これらは、化学的に容易に導かれ、ペプチド合成を
行った後穏やかな条件下に、たとえば酸接触作用で再び
離脱することができる。
性)の種類は、大した役に立たない。N- 末端カルボキ
シ置換されたアシル基、たとえばフタリル又はマレイ
ル、並びにその誘導体又は同族体を使用することができ
る。これらは、化学的に容易に導かれ、ペプチド合成を
行った後穏やかな条件下に、たとえば酸接触作用で再び
離脱することができる。
【0010】少し前に、α- キモトリプシンの基質特異
性に対する試験──この場合N- マレイルアミノ酸エス
テルもジペプチド合成に使用する(V.シエルレンベル
ガー,U.シエルレンベルガー、H.−D.ヤクブケ、
Coll. Czech. Chem. Commun. 53(1988),28
84)──を実施するが、従来水中で通常の低い基質濃
度0.01〜最高95mMでしか処理されず、荷電する
保護基の導入によって可能な、基質濃度の増加の法外に
大きい陽性作用は認められなかった。
性に対する試験──この場合N- マレイルアミノ酸エス
テルもジペプチド合成に使用する(V.シエルレンベル
ガー,U.シエルレンベルガー、H.−D.ヤクブケ、
Coll. Czech. Chem. Commun. 53(1988),28
84)──を実施するが、従来水中で通常の低い基質濃
度0.01〜最高95mMでしか処理されず、荷電する
保護基の導入によって可能な、基質濃度の増加の法外に
大きい陽性作用は認められなかった。
【0011】陽性に電荷した保護基を有する求電子反応
成分としてたとえば一般式IV
成分としてたとえば一般式IV
【0012】
【化4】
【0013】
【化5】
【0014】式中X、E及びR1 は、上述の意味を有
し、Yは、C- 原子数1−4のアルキレン基、アリーレ
ン- 又はアラルキレン基であり、R7 ,R8 及びR
9 は、夫々相互に無関係にC- 原子数1−4のアルキル
基又はアリール基であり、これは場合により置換されて
いてよい。)なる従来知られていないN- ベタニル- ア
ミノ酸- 又はジ- 又はオリゴペプチドアルキルエステル
を使用することができる。この誘導体は、対応するハロ
ゲンアシル化合物をトリアルキルアミンでアミノリシス
によって製造することができる。Y= -CH2-を有する
ベタニル化合物は、たとえば文献上公知のN−クロルア
セチル−アミノ酸アルキルエステルとトリアルキルアミ
ンとを反応させることによって入手することができる。
し、Yは、C- 原子数1−4のアルキレン基、アリーレ
ン- 又はアラルキレン基であり、R7 ,R8 及びR
9 は、夫々相互に無関係にC- 原子数1−4のアルキル
基又はアリール基であり、これは場合により置換されて
いてよい。)なる従来知られていないN- ベタニル- ア
ミノ酸- 又はジ- 又はオリゴペプチドアルキルエステル
を使用することができる。この誘導体は、対応するハロ
ゲンアシル化合物をトリアルキルアミンでアミノリシス
によって製造することができる。Y= -CH2-を有する
ベタニル化合物は、たとえば文献上公知のN−クロルア
セチル−アミノ酸アルキルエステルとトリアルキルアミ
ンとを反応させることによって入手することができる。
【0015】酵素として、ペプチド合成に適するすべて
の加水分解酵素(E.C.3....)、たとえばα- キモ
トリプシン、サブチリシン;カルボキシペプチターゼ -
W、-C及び -Y;トリプシン;パパイン、フシン、ブ
ロメラニンを使用することができる。求電子試薬とし
て、芳香族アミノ酸のN- 末端誘導体、たとえばチロシ
ン、フエニルアラニン又はトリプトフアンを使用する場
合、α- キモトリプシンが特に選ばれる。生成物溶液の
後処理に関して都合のよい式IIによる遊離酸の反応に
関してパパインが、公知条件下で特に適している。
の加水分解酵素(E.C.3....)、たとえばα- キモ
トリプシン、サブチリシン;カルボキシペプチターゼ -
W、-C及び -Y;トリプシン;パパイン、フシン、ブ
ロメラニンを使用することができる。求電子試薬とし
て、芳香族アミノ酸のN- 末端誘導体、たとえばチロシ
ン、フエニルアラニン又はトリプトフアンを使用する場
合、α- キモトリプシンが特に選ばれる。生成物溶液の
後処理に関して都合のよい式IIによる遊離酸の反応に
関してパパインが、公知条件下で特に適している。
【0016】基質濃度を、1M以上4−5Mまで増加す
ることができるが、特に0.5〜1Mの範囲の濃度で処
理する。
ることができるが、特に0.5〜1Mの範囲の濃度で処
理する。
【0017】本発明による方法は、一般に求電子試薬/
加水分解酵素- 割合105 〜107(M/M)で処理す
ることができるか、反応時間は割合が通常102 〜10
4 である慣用方法に比して著しく長くならない。加水分
解酵素としてパパインの場合、割合>10 3(M/A)
が好ましい。
加水分解酵素- 割合105 〜107(M/M)で処理す
ることができるか、反応時間は割合が通常102 〜10
4 である慣用方法に比して著しく長くならない。加水分
解酵素としてパパインの場合、割合>10 3(M/A)
が好ましい。
【0018】本発明による方法は、連続的にも、非連続
的にも実施することができる。連続的処理法で、たとえ
ば酵素- 膜- 反応器(EMR)中で、本発明による方法
を用いると>95%の変換率が<20分の滞留時間で得
ることができる。
的にも実施することができる。連続的処理法で、たとえ
ば酵素- 膜- 反応器(EMR)中で、本発明による方法
を用いると>95%の変換率が<20分の滞留時間で得
ることができる。
【0019】Xに関して、一般式III
【0020】
【化6】
【0021】(式中R5 及びR6 は夫々相互に無関係に
H、C1-C4 アルキル- 、アリール-、ヘテロアリール-
、アリールアルキル- 、ヘテロアリールアルキル基又
は二重結合を取り込んで一緒になって場合により置換さ
れた芳香族又は脂環式環を形成し、この環は場合により
飽和されていてもよい。)なる基が適する。
H、C1-C4 アルキル- 、アリール-、ヘテロアリール-
、アリールアルキル- 、ヘテロアリールアルキル基又
は二重結合を取り込んで一緒になって場合により置換さ
れた芳香族又は脂環式環を形成し、この環は場合により
飽和されていてもよい。)なる基が適する。
【0022】R5 及びR6 がHである場合、求電子試薬
は、100mMより大きいか又は等しい濃度で存在しな
ければならない。
は、100mMより大きいか又は等しい濃度で存在しな
ければならない。
【0023】驚くべきことに、一般式I中のEがチロシ
ン、フエニルアラニン又はトリプトフアンである場合及
び一般式I中のXが、場合により低級アルキル化(すな
わちC1-C4 アルキル化)マレイル- 又は場合より置換
されたフタリル残基であり、求核試薬としてアルギニン
アルキルエステルを使用した場合、保護されたジペプチ
ド誘導体を一般にそのまま水性反応溶液から沈殿させ、
したがって容易に分離することができる。
ン、フエニルアラニン又はトリプトフアンである場合及
び一般式I中のXが、場合により低級アルキル化(すな
わちC1-C4 アルキル化)マレイル- 又は場合より置換
されたフタリル残基であり、求核試薬としてアルギニン
アルキルエステルを使用した場合、保護されたジペプチ
ド誘導体を一般にそのまま水性反応溶液から沈殿させ、
したがって容易に分離することができる。
【0024】求核試薬の水溶性を限定する場合、本発明
による方法の進行に於て、反応に使用されたpH- 値で
帯電する基、たとえばコリンエステル基の導入によって
この水溶性を増加することができる。
による方法の進行に於て、反応に使用されたpH- 値で
帯電する基、たとえばコリンエステル基の導入によって
この水溶性を増加することができる。
【0025】
【実施例】次に、本発明を例によって詳細に説明する:
〔例1〕N- マレイルアミノ酸エチルエステルの合成
N- マレイルアミノ酸エチルエステルの製造は、アタシ
(Atassi)等(Methodsof Enzymology 25(1972),
546)の方法に従って行われる。チロシン、フエニル
アラニン、トリプトフアン、アラニン及びアルギニンの
エチルエステルを変換する。
(Atassi)等(Methodsof Enzymology 25(1972),
546)の方法に従って行われる。チロシン、フエニル
アラニン、トリプトフアン、アラニン及びアルギニンの
エチルエステルを変換する。
【0026】H2 O 500ml中に夫々200mmo
lのアミノ酸エステルヒドロクロリドを溶解し、次いで
溶液をNaOHでpH8.2に調整する。室温で、無水
マレイン酸300mmolを少しづつ加え、この際pH
を5NNaOHを用いてpH8.2に保つ。添加の終了
後、反応溶液を尚更に30分室温で及びpH8.2で撹
拌する。反応調節は、HPLCで行われ、多くの場合定
量的変換を示す。
lのアミノ酸エステルヒドロクロリドを溶解し、次いで
溶液をNaOHでpH8.2に調整する。室温で、無水
マレイン酸300mmolを少しづつ加え、この際pH
を5NNaOHを用いてpH8.2に保つ。添加の終了
後、反応溶液を尚更に30分室温で及びpH8.2で撹
拌する。反応調節は、HPLCで行われ、多くの場合定
量的変換を示す。
【0027】得られた溶液を、そのまま酵素による合成
に移行させることができる。固形の、塩化ナトリウム及
びマレイン酸で汚染された生成物は、凍結乾燥によって
得られる。
に移行させることができる。固形の、塩化ナトリウム及
びマレイン酸で汚染された生成物は、凍結乾燥によって
得られる。
【0028】水中での溶解性試験(単一pH- 値)は、
次の結果をもたらす: Mal-Tyr-OEt :>600mM Mal-Ala-OEt :190
0mM Mal-Phe-OEt :>700mM Mal-Arg-OEt :100
0mM Mal-Trp-OEt :>700mM 〔例2〕N- シトラコニル- アミノ酸エチルエステルの合成 製造を、例1と同様に行うが、無水マレイン酸の代りに
無水シトラコニル酸を使用する。
次の結果をもたらす: Mal-Tyr-OEt :>600mM Mal-Ala-OEt :190
0mM Mal-Phe-OEt :>700mM Mal-Arg-OEt :100
0mM Mal-Trp-OEt :>700mM 〔例2〕N- シトラコニル- アミノ酸エチルエステルの合成 製造を、例1と同様に行うが、無水マレイン酸の代りに
無水シトラコニル酸を使用する。
【0029】水中での溶解性試験(単一pH- 値)は、
次の結果をもたらす: Cit-Tyr-OEt :1000mM Cit-Phe-OEt :1000mM Cit-Trp-OEt : 900mM 〔例3〕N- フタリルアミノ酸エステルの合成 製造を、例1と同様に行うが、無水マレイン酸の代りに
無水フタル酸を使用する。チロシン、アラニン及びアル
ギニンのエチルエステルを変換する。
次の結果をもたらす: Cit-Tyr-OEt :1000mM Cit-Phe-OEt :1000mM Cit-Trp-OEt : 900mM 〔例3〕N- フタリルアミノ酸エステルの合成 製造を、例1と同様に行うが、無水マレイン酸の代りに
無水フタル酸を使用する。チロシン、アラニン及びアル
ギニンのエチルエステルを変換する。
【0030】水中での溶解性試験(単一pH- 値)は、
次の結果をもたらす: Phthal-Tyr-OEt: 800mM Phthal-Ala-OEt:1800mM Phthal-Arg-OEt: 800mM 〔例4〕N- トリメリチルアミノ酸エステル(TMS- エステ
ル)の合成 製造を、例1と同様に行うが、無水マレイン酸の代りに
無水トリメリット酸を使用する。チロシンのエチルエス
テルを変換する。溶解度>1000mMが、認められ
る。
次の結果をもたらす: Phthal-Tyr-OEt: 800mM Phthal-Ala-OEt:1800mM Phthal-Arg-OEt: 800mM 〔例4〕N- トリメリチルアミノ酸エステル(TMS- エステ
ル)の合成 製造を、例1と同様に行うが、無水マレイン酸の代りに
無水トリメリット酸を使用する。チロシンのエチルエス
テルを変換する。溶解度>1000mMが、認められ
る。
【0031】〔例5〕N-(トリメチルアンモニウム- アセチル)-アミノ酸エチ
ルエステル- ヒドロクロリドの合成 KPG- 撹拌器、冷却器、温度計及びガス導入管を有す
る3- 頚フラスコ500ml中に、THF250ml中
に溶解された対応するクロルアセチル化合物(ClAc
- Tyr- OEt50mmol;Clac- Phe- O
Et100mmol)を予め存在させ、トリメチルアミ
ンをガス状で導入する。反応溶液を夫々6時間還流し、
その際夫々のベタインアミノ酸エチルエステル- ヒドロ
クロリドが沈殿する。反応の終了後、濾過し、THFで
十分に洗滌し、P2 O5 で乾燥する。 N-(トリメチルアンモニウム- アセチル)-L- チロシン
- エチルエステル- クロリド(C16H25ClN
2 O4 ): 収入率:理論値の35% 計算値:C 55.73 H 7.31 N 8.12 Cl 10.29 測定値:C 55.56 H 7.31 N 8.41 Cl 10.42 1 H- NMR(CDCl 3 ): 1.15(t,3H), 2.70-3.00(m,2H), 3.17(s,9H), 4.08 (q,2H), 4.17(d, 1H), 4.27(d,1H), 4.45(m,1H), 6.66(d,2H), 7.03(d,2H), 9.35(br,s,2H). N-(トリメチルアンモニウム- アセチル)-L- フエチル
アラニン- エチルエステル- クロリド (C16 H 25 ClN
2 O3): 収率:理論値の58% 計算値:C 58.44 H 7.66 N 8.51 Cl 10.79 測定値:C 58.39 H 7.89 N 8.61 Cl 10.89 1 H- NMR(CDCl 3 ): 1.27(t,3H), 3.00-3.35(m,2H), 3.32(s,9H), 4.18 (q,2H), 4.51(d,1H), 4.69(m,1H), 4.94(d,1H), 7.12-7.30(m,3H), 7.42(m,2H), 9.90(d,1H). N-(トリメチルアンモニウム- アセチル)-L- トリプト
フアン- エチルエステル- クロリド (C18H26ClN3
O3): 収率:理論値の100% 計算値:C 58.77 H 7.12 N 11.42 Cl 9.65 測定値:C 57.96 H 7.56 N 10.69 Cl 9.42 1 H- NMR(CDCl 3 ): 1.26(t,3H), 3.05(s,9H), 3.20-3.45(m,2H), 4.18 (q,2H), 4.38(d,1H), 4.58(d,1H), 4.72(m,1H), 7.08(m,2H), 7.38(m,1H), 7.54(m,2H), 9.37(d,1H) , 9.91(s,1H). 溶解性試験は、3つのベタインアミノ酸エチルエステル
- ヒドロクロリドすべてに関して溶解度>4Mを提供す
る。
ルエステル- ヒドロクロリドの合成 KPG- 撹拌器、冷却器、温度計及びガス導入管を有す
る3- 頚フラスコ500ml中に、THF250ml中
に溶解された対応するクロルアセチル化合物(ClAc
- Tyr- OEt50mmol;Clac- Phe- O
Et100mmol)を予め存在させ、トリメチルアミ
ンをガス状で導入する。反応溶液を夫々6時間還流し、
その際夫々のベタインアミノ酸エチルエステル- ヒドロ
クロリドが沈殿する。反応の終了後、濾過し、THFで
十分に洗滌し、P2 O5 で乾燥する。 N-(トリメチルアンモニウム- アセチル)-L- チロシン
- エチルエステル- クロリド(C16H25ClN
2 O4 ): 収入率:理論値の35% 計算値:C 55.73 H 7.31 N 8.12 Cl 10.29 測定値:C 55.56 H 7.31 N 8.41 Cl 10.42 1 H- NMR(CDCl 3 ): 1.15(t,3H), 2.70-3.00(m,2H), 3.17(s,9H), 4.08 (q,2H), 4.17(d, 1H), 4.27(d,1H), 4.45(m,1H), 6.66(d,2H), 7.03(d,2H), 9.35(br,s,2H). N-(トリメチルアンモニウム- アセチル)-L- フエチル
アラニン- エチルエステル- クロリド (C16 H 25 ClN
2 O3): 収率:理論値の58% 計算値:C 58.44 H 7.66 N 8.51 Cl 10.79 測定値:C 58.39 H 7.89 N 8.61 Cl 10.89 1 H- NMR(CDCl 3 ): 1.27(t,3H), 3.00-3.35(m,2H), 3.32(s,9H), 4.18 (q,2H), 4.51(d,1H), 4.69(m,1H), 4.94(d,1H), 7.12-7.30(m,3H), 7.42(m,2H), 9.90(d,1H). N-(トリメチルアンモニウム- アセチル)-L- トリプト
フアン- エチルエステル- クロリド (C18H26ClN3
O3): 収率:理論値の100% 計算値:C 58.77 H 7.12 N 11.42 Cl 9.65 測定値:C 57.96 H 7.56 N 10.69 Cl 9.42 1 H- NMR(CDCl 3 ): 1.26(t,3H), 3.05(s,9H), 3.20-3.45(m,2H), 4.18 (q,2H), 4.38(d,1H), 4.58(d,1H), 4.72(m,1H), 7.08(m,2H), 7.38(m,1H), 7.54(m,2H), 9.37(d,1H) , 9.91(s,1H). 溶解性試験は、3つのベタインアミノ酸エチルエステル
- ヒドロクロリドすべてに関して溶解度>4Mを提供す
る。
【0032】〔例6〕N-(トリメチルアンモニウム- プロピル、ベットプロ
プ)-アミノ酸エチルエステル- ヒドロクロリドの合成 製造を例5と同様に行うが、クロルアセチル- 化合物の
代りに対応するクロルプロピル化合物を使用する。チロ
シンのエチルエステルを変換する。水溶性>1000m
Mが認められる。
プ)-アミノ酸エチルエステル- ヒドロクロリドの合成 製造を例5と同様に行うが、クロルアセチル- 化合物の
代りに対応するクロルプロピル化合物を使用する。チロ
シンのエチルエステルを変換する。水溶性>1000m
Mが認められる。
【0033】〔例7〕N-(トリメチルアンモニウム- ブチル、ベトブト)-アミ
ノ酸エチルエステル- ヒドロクロリドの合成 製造を例5と同様に行うが、クロルアセチル化合物の代
りに、対応するクロルブチル化合物を使用する。再びチ
ロシンのエチルエステルを変換する。水溶性>2200
mMが認められる。
ノ酸エチルエステル- ヒドロクロリドの合成 製造を例5と同様に行うが、クロルアセチル化合物の代
りに、対応するクロルブチル化合物を使用する。再びチ
ロシンのエチルエステルを変換する。水溶性>2200
mMが認められる。
【0034】〔例8〕N- マレイル- 、N- シトラコニ
ル- 、N- フタリル- 、N- トリメチル- 、N-(トリメ
チルアンモニウムアセチル)-、N-(トリメチルアンモニ
ウムプロピル)-及びN-(トリメチルアンモニウムブチ
ル)-アミノ酸エチルエステルとアルギニン、アルギニン
エチルエステル及びアルギニンアミドとの酵素反応の活
性及び選択性を測定 酵素によるジペプチド合成 酵素として、α- キモトリプシン(CT)、カルボキシ
ペプチターゼY(CPD- Y)及びパパインを使用し、
ジペプチド合成に対してそのpH- 及び温度最適条件は
知られている(pH9.5、CTに関してT=25℃;
pH9.0、CPD- Y及びパパインに関してT=25
℃)。したがって、すべてのジペプチド合成を、この反
応条件下で夫々等モルの基質- 及び求核試薬濃度の使用
下に実施する。
ル- 、N- フタリル- 、N- トリメチル- 、N-(トリメ
チルアンモニウムアセチル)-、N-(トリメチルアンモニ
ウムプロピル)-及びN-(トリメチルアンモニウムブチ
ル)-アミノ酸エチルエステルとアルギニン、アルギニン
エチルエステル及びアルギニンアミドとの酵素反応の活
性及び選択性を測定 酵素によるジペプチド合成 酵素として、α- キモトリプシン(CT)、カルボキシ
ペプチターゼY(CPD- Y)及びパパインを使用し、
ジペプチド合成に対してそのpH- 及び温度最適条件は
知られている(pH9.5、CTに関してT=25℃;
pH9.0、CPD- Y及びパパインに関してT=25
℃)。したがって、すべてのジペプチド合成を、この反
応条件下で夫々等モルの基質- 及び求核試薬濃度の使用
下に実施する。
【0035】基質- 及び求核試薬濃度は、Arg- NH
2 の使用で夫々500又は300mM、Arg- OEt
の使用で600又は300mMである。付加的に遊離ア
ルギニン300mMとの反応を、パパインを用いて実施
する。基質/酵素- 割合(M/M)は、求核試薬として
Arg- NH2 の場合1,1・107 (CT)又は3・
105 (CPD- Y)、Arg- OEtで2,4・10
7 (CT)及びArg- OHで5,3・103 (パパイ
ン)である。
2 の使用で夫々500又は300mM、Arg- OEt
の使用で600又は300mMである。付加的に遊離ア
ルギニン300mMとの反応を、パパインを用いて実施
する。基質/酵素- 割合(M/M)は、求核試薬として
Arg- NH2 の場合1,1・107 (CT)又は3・
105 (CPD- Y)、Arg- OEtで2,4・10
7 (CT)及びArg- OHで5,3・103 (パパイ
ン)である。
【0036】基準方法によるこの反応パラメーターで確
認される出発活性及び選択性は、次表中に挙げる。
認される出発活性及び選択性は、次表中に挙げる。
【0037】
ジペプチド 酵素 選択性 最初の活性
1 Mal-Tyr-Arg-NH2 α- CT 47% 1500U/mg
2 Mal-Phe-Arg-NH2 α- CT 18% 155U/mg
3 Cit-Trp-Arg-NH2 α- CT 22% 410U/mg
4 Mal-Trp-Arg-NH2 α- CT 42% 1420U/mg
5 Bet-Tyr-Arg-NH2 α- CT 29% 800U/mg
6 Bet-Phe-Arg-NH2 α- CT 42% 2200U/mg
7 Cit-Phe-Arg-NH2 α- CT 41% 1100U/mg
8 Bet-Trp-Arg-NH2 α- CT 13% 195U/mg
9 Mal-Tyr-Arg-OEt α- CT 80% 3750U/mg
10 Cit-Tyr-Arg-NH2 α- CT 78% 2700U/mg
11 Bet-Tyr-Arg-NH2 CPD- Y 44% 57U/mg
12 Bet-Phe-Arg-NH2 CPD- Y 52% 185U/mg
13 Bet-Trp-Arg-NH2 CPD- Y 29% 29U/mg
14 Phthal-Tyr-Arg-NH2 α- CT 90% 900U/mg
15 Phthal-Tyr-Arg-OEt α- CT 70% 190U/mg
16 TMS-Tyr-Arg-NH2 α- CT 85% 18U/mg
17 TMS-Tyr-Arg-OEt α- CT 70% 12U/mg
18 BetProp-Tyr-Arg-NH2 α- CT 50% 2200U/mg
19 BetBut-Tyr-Arg-NH2 α- CT 70% 2500U/mg
20 Phthal-Ala-Arg パパイン 63%
反応14〜19の場合、反応を夫々濃度300mMで実
施する。その時基質/酵素- 割合(M/M)は、Arg
- NHで6.3・106(CT)及びArg- OEtで
8.3・106(CT)である。
施する。その時基質/酵素- 割合(M/M)は、Arg
- NHで6.3・106(CT)及びArg- OEtで
8.3・106(CT)である。
【0038】〔例9〕Mal- Tyr- OEtの酵素による合成
ガラスビーカー100ml中に、求電子試薬としてMa
l- Tyr- OEt.及び求核試薬としてLys- OE
t.2HClを、触媒としてCTを用いてMal- Ly
s- OEtを製造する。短時間後、生成物が白色沈殿と
して沈殿し、濾過し、水洗し、50℃で減圧乾燥する。
条件及び結果を、次表中にまとめる: 求電子試薬- 求核試薬- 割合: 1:1 基質濃度: 0.4Mずつ 基質- 酵素- 割合: 1.5・106 pH- 値: 9.5 温度: 25℃ 反応時間: 10分 単離収量: 81% 空時収量: 19.5kg/l.d 比酵素活性: 40412/mg 求核試薬として、本発明によれば保護されていないジペ
プチドも使用することができる。
l- Tyr- OEt.及び求核試薬としてLys- OE
t.2HClを、触媒としてCTを用いてMal- Ly
s- OEtを製造する。短時間後、生成物が白色沈殿と
して沈殿し、濾過し、水洗し、50℃で減圧乾燥する。
条件及び結果を、次表中にまとめる: 求電子試薬- 求核試薬- 割合: 1:1 基質濃度: 0.4Mずつ 基質- 酵素- 割合: 1.5・106 pH- 値: 9.5 温度: 25℃ 反応時間: 10分 単離収量: 81% 空時収量: 19.5kg/l.d 比酵素活性: 40412/mg 求核試薬として、本発明によれば保護されていないジペ
プチドも使用することができる。
【0039】〔例10〕Mal- Tyr- Ala- Glnの製造
触媒としてCTを用いて、求電子試薬としてMal- T
yr- OEt及び求核試薬としてジペプチドAla- T
yr- Ala- Glnを製造する。反応時間は20分で
あり、6分後HPLC中にもはやAla- Glnの減少
は記録されなかった。生成物をアニオン交換体M600
(レヴアタイト(Lewatit)) によってAla- Glnか
ら分離し、 1H- メソコ(溶剤:D2 O)によって同定
する。収率は、71.5%である。
yr- OEt及び求核試薬としてジペプチドAla- T
yr- Ala- Glnを製造する。反応時間は20分で
あり、6分後HPLC中にもはやAla- Glnの減少
は記録されなかった。生成物をアニオン交換体M600
(レヴアタイト(Lewatit)) によってAla- Glnか
ら分離し、 1H- メソコ(溶剤:D2 O)によって同定
する。収率は、71.5%である。
【0040】
求電子試薬- 求核試薬- 割合: 1:1
基質濃度: 0.43Mずつ
基質- 酵素- 割合: 2.9・105
pH- 値: 9.5
温度: 25℃
求核試薬として、本発明によれば非タンパク質のアミノ
酸も使用することができる: 〔例11〕Mal- Tyr- Orn- OEtの製造 求電子試薬としてMal- Tyr- OEt及び求核試薬
としてOrn- OEt.2HClを、触媒としてのα-
CTと反応させる。20分の反応時間後、溶液を蒸発
し、酵素を限外濾過によってMWCO10.000を有
する膜を介して分離し、溶解された部分を凍結乾燥す
る。Mal- Tyr- Orn及びOrn- デルタ- ラク
タム- 環化生成物を、分取HPLCによって単離し、 1
H- NMRによって同定する。2つの生成物(約1:
1)の収率は、一緒に約45−50%である。
酸も使用することができる: 〔例11〕Mal- Tyr- Orn- OEtの製造 求電子試薬としてMal- Tyr- OEt及び求核試薬
としてOrn- OEt.2HClを、触媒としてのα-
CTと反応させる。20分の反応時間後、溶液を蒸発
し、酵素を限外濾過によってMWCO10.000を有
する膜を介して分離し、溶解された部分を凍結乾燥す
る。Mal- Tyr- Orn及びOrn- デルタ- ラク
タム- 環化生成物を、分取HPLCによって単離し、 1
H- NMRによって同定する。2つの生成物(約1:
1)の収率は、一緒に約45−50%である。
【0041】
求電子試薬- 求核試薬- 割合: 1:1
基質濃度: 0.26Mずつ
基質- 酵素- 割合: 6.5/105
pH- 値: 9.5
温度: 25℃
求核試薬として、本発明によれば非塩基性アミノ酸も使
用することができる。
用することができる。
【0042】〔例12〕H- Tyr- Cit- OEtの製造
酵素α- CT及び求電子試薬としてMal- Try- O
Et並びに求核試薬としてシトルリンエチルエステル
(Cit- OEt)を用いて、ガラスビーカー100m
l中でTyr- Cit- OEtを製造する。30分の反
応時間後、生成物を出発化合物Mal- Tyr- OEt
及びCit- OEt並びにH- Tyr- OEtと共に同
一割合でLC- MSを介して検出する。
Et並びに求核試薬としてシトルリンエチルエステル
(Cit- OEt)を用いて、ガラスビーカー100m
l中でTyr- Cit- OEtを製造する。30分の反
応時間後、生成物を出発化合物Mal- Tyr- OEt
及びCit- OEt並びにH- Tyr- OEtと共に同
一割合でLC- MSを介して検出する。
【0043】
求電子試薬- 求核試薬- 割合: 1:1
基質濃度: 0.12Mずつ
基質- 酵素- 割合: 1.5・105
pH- 値: 10.2
温度: 25℃
酵素として、本発明によればセリンプロテアーゼと共に
チオールプロテアーゼ(パパイン)も使用することがで
き並びに保護されたペプチド(Mal- Tyr- Lys
- OEt)を求核試薬として使用することができる。
チオールプロテアーゼ(パパイン)も使用することがで
き並びに保護されたペプチド(Mal- Tyr- Lys
- OEt)を求核試薬として使用することができる。
【0044】〔例13〕Mal- Tyr- Lys- Ala- OMeの製造
求電子試薬としてMal- Tyr- Lys- OEt及び
求核試薬としてAla- OMeから、触媒としてパパイ
ンを用いて水性懸濁液中で生成物を製造する。75分の
反応時間後、更に49%Mal- Tyr- Lys- OE
tが存在する。懸濁液の濾液を、10.000MWCO
膜係数によって限外濾過し、生成物をLC- MCによっ
て検出する。
求核試薬としてAla- OMeから、触媒としてパパイ
ンを用いて水性懸濁液中で生成物を製造する。75分の
反応時間後、更に49%Mal- Tyr- Lys- OE
tが存在する。懸濁液の濾液を、10.000MWCO
膜係数によって限外濾過し、生成物をLC- MCによっ
て検出する。
【0045】
求電子試薬- 求核試薬- 割合: 1:1
基質濃度: 0.13Mずつ
基質- 酵素- 割合: 1.9・103
pH- 値: 9.6
温度: 25℃
〔例14〕Mal- Tyr- Arg- OEtの連続的酵素による合
成 酵素- 膜- 反応器10ml中に、連続的に7時間かけて
Mal- Tyr- Arg- OEtを製造する。作業条件
を、次表中にまとめる。
成 酵素- 膜- 反応器10ml中に、連続的に7時間かけて
Mal- Tyr- Arg- OEtを製造する。作業条件
を、次表中にまとめる。
【0046】
酵素: α- キモトリプシン
酵素濃度: 0.2mg/ml
Mal- Tyr- OEt: 600mM
Arg- OEt: 600mM
pH- 値: 9.5
温度: 25℃
滞留時間: 12分
容量流量: 50ml/時間
反応器容量: 10ml
平均変換率: 約98%
平均選択率: 約80%
空時収量: 13.36kg/
(L・d) 酵素消費量: 97mg/kg生成
物 使用された滞留時間に基づき、この試験で得られうる変
換率及び選択率を、第2図中に示す。
(L・d) 酵素消費量: 97mg/kg生成
物 使用された滞留時間に基づき、この試験で得られうる変
換率及び選択率を、第2図中に示す。
【0047】流出する生成物溶液から、予め冷却された
受器用フラスコ中に保護されたジペプチドガ沈殿し、濾
過し、数回水洗した後に純度>97%を有する。
受器用フラスコ中に保護されたジペプチドガ沈殿し、濾
過し、数回水洗した後に純度>97%を有する。
【0048】 1H- NMR(D2 O+DCl):1.08(t,
3H), 1.42(m,2H), 1.57(m,1H), 1.72(m,2H), 2.89(m,2
H), 3.02(m,2H), 4.01(q,2H), 4.21(m,1H), 4.46(m,1
H), 6.18(d,1H),6.34(d,1H), 6.69(d,1H), 7.01(d,1H). 〔例15〕バッチ(300ml)中で、Mal- Tyr
- OEt(0.25M)及びArg- OEt(0.25
M)を、pH9.5及び25℃でα- キモトプシン
(0.025mg/ml)と反応させる。2時間後、沈
殿の濾過及び水洗によって、HPLC- 純度>97%を
有するMal- Tyr- Arg- OEt26.0kg
(理論値の75%)が得られる。
3H), 1.42(m,2H), 1.57(m,1H), 1.72(m,2H), 2.89(m,2
H), 3.02(m,2H), 4.01(q,2H), 4.21(m,1H), 4.46(m,1
H), 6.18(d,1H),6.34(d,1H), 6.69(d,1H), 7.01(d,1H). 〔例15〕バッチ(300ml)中で、Mal- Tyr
- OEt(0.25M)及びArg- OEt(0.25
M)を、pH9.5及び25℃でα- キモトプシン
(0.025mg/ml)と反応させる。2時間後、沈
殿の濾過及び水洗によって、HPLC- 純度>97%を
有するMal- Tyr- Arg- OEt26.0kg
(理論値の75%)が得られる。
【0049】
【発明の効果】上記の本発明による方法は、N- 末端が
保護されたアミノ酸エステルとアミノ酸- 又はジ- 又は
オリゴペプチドエステル又は -アミドあるいは対応する
遊離酸との反応によってジ- 及びオリゴペプチドを経済
的に製造するのに最適である。
保護されたアミノ酸エステルとアミノ酸- 又はジ- 又は
オリゴペプチドエステル又は -アミドあるいは対応する
遊離酸との反応によってジ- 及びオリゴペプチドを経済
的に製造するのに最適である。
【図1】種々の保護基及び酵素で(滞留時間15分及び
対応する酵素濃度で)得られる空時収量を示す。
対応する酵素濃度で)得られる空時収量を示す。
【図2】滞留時間に対する変換率と選択率の変化を示
す。
す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 クリステイアン・ウアントライ
ドイツ連邦共和国、ユーリッヒ、ウオル
フスホーフエネル・ストラーセ、139
(72)発明者 ギユンター・クナップ
ドイツ連邦共和国、ブル−フケーベル、
フリートホ−フストラーセ、8
(72)発明者 アンドレアス・ボムマリウス
ドイツ連邦共和国、フランクフルト70、
ノーベルリング、3
(72)発明者 カルル−ハインツ・ドラウツ
ドイツ連邦共和国、フライゲリヒト、、
ツール・マリーンルーヘ、13
(56)参考文献 スイス国特許出願公開615542(CH,
A3)
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12P 21/00 - 21/02
C07K 1/00
BIOSIS/WPI(DIALOG)
Claims (8)
- 【請求項1】 求電子試薬として一般式I X−E−R1 I (式中EはX及びR1 に関連して、 N- 末端がXで、C- 末端がR1 で置換されたアミノ酸
又はそのジ−又はオリゴペプチドを示し、 R1 は、C- 原子数1〜4のエステル化アルキル基を示
し、これは場合によりアリール基を置換基として有し、Xは、マレイル又はC 1 −C 4 アルキル化されたマレイ
ル、置換された又は置 換されていないフタリル、トリメ
リチル、シトラコニル、又はトリメチルア ンモニウム−
アセチル、−プロピル又は−ブチリルである。 )の化合
物と求核試薬として一般式II H2 N−Q−R2 II (式中QはH2 N及びR2 に関連して、C- 末端がR2-
基を有するアミノ酸又はそのジ- 又はオリゴペプチドを
示し、但し、R2 は遊離の酸末端、場合により置換基と
してアリール基を有するC1-ないしC4-アルキルエステ
ル化又はアミド化を -NH3 R4 によって示し、その残
基R3 及びR4 は夫々相互に無関係にC1-ないしC4-ア
ルキル基、そのアリールアルキル基又はアリール基を示
す。)の化合物とを、水性溶液の形で加水分解酵素の存
在下に反応させ、その際求電子試薬(I)は、X=マレ
イルである場合100mMより大きいか又はこれに等し
い濃度で使用し、場合により反応混合物から分離された
反応生成物から保護基を除くことを特徴とする、保護さ
れた又は保護されていないジ- 又はオリゴペプチドの製
造方法。 - 【請求項2】 一般式Iの化合物を>50mM、特に1
00mM−1000mMの濃度で使用する請求項1記載
の方法。 - 【請求項3】 一般式IIの求核試薬を、一般式Iの化
合物に対するモル割合<1.5で使用する請求項1又は
2記載の方法。 - 【請求項4】 105 (M/M)より大きい又は等しい
式Iの化合物/加水分解酵素割合で処理する、請求項1
ないし3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 反応を、連続的に滞留時間<20分で実
施する、請求項1ないし4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 一般式II中のR2 は帯電するエステル
基である請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 一般式I中のEは、芳香族アミノ酸、特
にL- チロシン、L- フエニルアラニン、L- トリプト
フアンであり、α- キモトリプシンを加水分解酵素とし
て使用する請求項1ないし6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 一般式IV 【化1】 【化2】 式中X、E及びR1 は、上述の意味を有し、 Yは、C- 原子数1−4のアルキレン基、アリーレン-
又はアラルキレン基であり、 R7 ,R8 及びR9 は、夫々相互に無関係にC- 原子数
1−4のアルキル基又はアリール基であり、これは場合
により置換されていてよい。)なるN- ベタニル- アミ
ノ酸- 又はジ- 又はオリゴペプチドアルキルエステル
を、請求項1〜7のいずれか1つに記載の方法にしたが
ってペプチドの製造に使用する方法。
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