JP3376189B2 - キクわい化ウイロイドの検出方法 - Google Patents
キクわい化ウイロイドの検出方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はキクわい化ウイロイ
ド（ＣＳＶｄ）の検出方法、さらに詳しくは、該ウイロ
イドの遺伝子工学的検出方法に関する。また、本発明
は、該遺伝子工学的検出に使用するプライマーに関す
る。
ド（ＣＳＶｄ）の検出方法、さらに詳しくは、該ウイロ
イドの遺伝子工学的検出方法に関する。また、本発明
は、該遺伝子工学的検出に使用するプライマーに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】キクわい病（chrysanthemum stunt dise
ase）は、キクに発生する病害の一つであり、農作業中
のはさみの使用や植物個体間の摩擦によって伝搬され
る。１９７３年に、本病の病原は、ウイロイドであるこ
とが確認された［ウイロロジー（Virology）、第５１
巻、９４−１０１頁（１９７３）］。本病は、これまで
英国［アニュアル・オブ・アプライド・バイオロジー
（Annual of Applied Biology）、第７４巻、第３３３
−３４８頁、（１９７３）］、アフリカ［プラント・デ
ィジーズ（Plant Disease）、第６８巻、４８５−４８
８頁（１９８４）］、ブラジル［プラント・パソロジー
（Plant Pathology）、第３９巻、６３６−６３７頁、
（１９９０）］、中国［チャイニーズ・ジャーナル・オ
ブ・ウイロロジー（Chinese Journal of Virology）、
第４巻、３６６−３７０頁（１９８８）］等、世界中に
分布していることが報告されている。日本では、大沢ら
［日本植物病理会報、第４３巻、３７２頁（１９７
７）］が接ぎ木によって初めてその発生を確認し報告し
た。その後、香川、栃木、北海道、静岡、和歌山、愛知
などの各地より報告されている。
ase）は、キクに発生する病害の一つであり、農作業中
のはさみの使用や植物個体間の摩擦によって伝搬され
る。１９７３年に、本病の病原は、ウイロイドであるこ
とが確認された［ウイロロジー（Virology）、第５１
巻、９４−１０１頁（１９７３）］。本病は、これまで
英国［アニュアル・オブ・アプライド・バイオロジー
（Annual of Applied Biology）、第７４巻、第３３３
−３４８頁、（１９７３）］、アフリカ［プラント・デ
ィジーズ（Plant Disease）、第６８巻、４８５−４８
８頁（１９８４）］、ブラジル［プラント・パソロジー
（Plant Pathology）、第３９巻、６３６−６３７頁、
（１９９０）］、中国［チャイニーズ・ジャーナル・オ
ブ・ウイロロジー（Chinese Journal of Virology）、
第４巻、３６６−３７０頁（１９８８）］等、世界中に
分布していることが報告されている。日本では、大沢ら
［日本植物病理会報、第４３巻、３７２頁（１９７
７）］が接ぎ木によって初めてその発生を確認し報告し
た。その後、香川、栃木、北海道、静岡、和歌山、愛知
などの各地より報告されている。
【０００３】本病の病徴は、キクの品種によって異なる
が、一般には次のようなものである。 （１）若い茎葉は、健全のものよりも淡緑色を帯び、ま
た、茎と大きく開いた角度をなして成長するよりはむし
ろ直立して成長する傾向がある。 （２）罹病植物は、植えてから２〜３週間後にわい化を
示し、成熟期にも健全キクの半分の高さにとどまること
がしばしばである。 （３）罹病のキクは、健全キクより１週間ぐらい早く開
花する。 （４）赤い色素を持つ品種では、赤い色素の成分が退色
する。 （５）ある品種では、花が非常に小さくなる。
が、一般には次のようなものである。 （１）若い茎葉は、健全のものよりも淡緑色を帯び、ま
た、茎と大きく開いた角度をなして成長するよりはむし
ろ直立して成長する傾向がある。 （２）罹病植物は、植えてから２〜３週間後にわい化を
示し、成熟期にも健全キクの半分の高さにとどまること
がしばしばである。 （３）罹病のキクは、健全キクより１週間ぐらい早く開
花する。 （４）赤い色素を持つ品種では、赤い色素の成分が退色
する。 （５）ある品種では、花が非常に小さくなる。
【０００４】本病は、直接キクの商品価値に影響するの
で、早期診断、ウイロイドフリー苗の作出、検疫に役立
つ高感度診断法が必要とされている。本病の原因となる
キクわい化ウイロイド（chrysanthemum stunt viroid、
以下、ＣＳＶｄと略す）としては、これまでにオースト
ラリア分離株［ヌクレック・アシッズ・リサーチ（Nucl
eic Acids Research）、第９巻、２７４１−２７５２
頁、（１９８１）］とイングランド分離株［ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European
Journal of Biochemistry）、第１２１巻、２４９−２
５７頁、（１９８２）］との２種が報告されており、両
者の塩基配列には高い相同性が存在している。ＣＳＶｄ
感染の診断法には、特定の検定植物に接種して病徴観察
を行う生物診断法のほか、リターンポリアクリルアミド
電気泳動法、ＣＳＶｄのｃＤＮＡやｃＲＮＡを標識した
プローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーショ
ン法等がある。近年、ポリメラーゼ・チェーン・リアク
ション（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ）法を利
用したＲＴ−ＰＣＲ法による診断も試みられている［関
西病虫研報、第３５巻、７−１２頁、（１９９３）］。
で、早期診断、ウイロイドフリー苗の作出、検疫に役立
つ高感度診断法が必要とされている。本病の原因となる
キクわい化ウイロイド（chrysanthemum stunt viroid、
以下、ＣＳＶｄと略す）としては、これまでにオースト
ラリア分離株［ヌクレック・アシッズ・リサーチ（Nucl
eic Acids Research）、第９巻、２７４１−２７５２
頁、（１９８１）］とイングランド分離株［ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（European
Journal of Biochemistry）、第１２１巻、２４９−２
５７頁、（１９８２）］との２種が報告されており、両
者の塩基配列には高い相同性が存在している。ＣＳＶｄ
感染の診断法には、特定の検定植物に接種して病徴観察
を行う生物診断法のほか、リターンポリアクリルアミド
電気泳動法、ＣＳＶｄのｃＤＮＡやｃＲＮＡを標識した
プローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーショ
ン法等がある。近年、ポリメラーゼ・チェーン・リアク
ション（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ）法を利
用したＲＴ−ＰＣＲ法による診断も試みられている［関
西病虫研報、第３５巻、７−１２頁、（１９９３）］。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ウイロイド分子は、小
さく、抗原性が無いため、抗体を用いた血清診断法では
検出できない。生物診断法は、時間がかかるばかりでな
く、温室や高温条件を必要とし、多数の検体の場合には
実用性に欠けている。電気泳動法は、数日間で結果がわ
かるが、低ウイロイド試料では検出が難しく、また、ウ
イロイドが混合感染した試料では、バンドの有無だけで
ウイロイドを同定できない場合がある。放射性同位体
（ＲＩ）で標識したプローブを用いたハイブリダイゼー
ション法は、感度が高く、比較的多数の検定試料を同時
に検定することができるが、プローブの半減期、安全性
の面で問題があり、その実用性が限定されている。ビオ
チンやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したｃＤＮＡまた
はｃＲＮＡプローブを用いたドットブロットハイブリダ
イゼーション法も報告されたが、ＲＩ標識した場合に比
べて感度が低く、感染初期のようなウイロイド濃度の低
い試料では検出できない可能性が考えられる。このよう
に、さらに検出感度の高い診断法の開発が望まれてい
る。
さく、抗原性が無いため、抗体を用いた血清診断法では
検出できない。生物診断法は、時間がかかるばかりでな
く、温室や高温条件を必要とし、多数の検体の場合には
実用性に欠けている。電気泳動法は、数日間で結果がわ
かるが、低ウイロイド試料では検出が難しく、また、ウ
イロイドが混合感染した試料では、バンドの有無だけで
ウイロイドを同定できない場合がある。放射性同位体
（ＲＩ）で標識したプローブを用いたハイブリダイゼー
ション法は、感度が高く、比較的多数の検定試料を同時
に検定することができるが、プローブの半減期、安全性
の面で問題があり、その実用性が限定されている。ビオ
チンやジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識したｃＤＮＡまた
はｃＲＮＡプローブを用いたドットブロットハイブリダ
イゼーション法も報告されたが、ＲＩ標識した場合に比
べて感度が低く、感染初期のようなウイロイド濃度の低
い試料では検出できない可能性が考えられる。このよう
に、さらに検出感度の高い診断法の開発が望まれてい
る。
【０００６】ＣＳＶｄの特徴的な塩基配列を遺伝子増幅
法により増幅すれば、ウイロイドの存在を直接的に、ま
た高感度かつ迅速に確定することができる。さらに、感
染初期の植物でも検出できることが期待される。本発明
の目的は、遺伝子増幅法によりＣＳＶｄを検出する際
に、より効率良く増幅できるプライマーを設計するため
のＣＳＶｄ上の特定の領域を明らかにし、高感度なＣＳ
Ｖｄの検出方法を提供することにある。
法により増幅すれば、ウイロイドの存在を直接的に、ま
た高感度かつ迅速に確定することができる。さらに、感
染初期の植物でも検出できることが期待される。本発明
の目的は、遺伝子増幅法によりＣＳＶｄを検出する際
に、より効率良く増幅できるプライマーを設計するため
のＣＳＶｄ上の特定の領域を明らかにし、高感度なＣＳ
Ｖｄの検出方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の第１の発明は、
遺伝子増幅によるキクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）の
検出方法において、配列表の配列番号１で示される塩基
配列、とりわけ配列表の配列番号２で示される塩基配列
に相補的な塩基配列のうち、連続した１５塩基以上から
なる配列もしくはその変異配列を含有するプライマーを
用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製する工程を包
含することを特徴とするＣＳＶｄ検出方法を提供するも
のである。
遺伝子増幅によるキクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）の
検出方法において、配列表の配列番号１で示される塩基
配列、とりわけ配列表の配列番号２で示される塩基配列
に相補的な塩基配列のうち、連続した１５塩基以上から
なる配列もしくはその変異配列を含有するプライマーを
用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製する工程を包
含することを特徴とするＣＳＶｄ検出方法を提供するも
のである。
【０００８】本発明の第２の発明は、第１の発明を用い
て得られるｃＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号３で
示される塩基配列、とりわけ配列表の配列番号４、５、
および６で示される塩基配列のうち、連続した１５塩基
以上からなる配列もしくはその変異配列を含有するプラ
イマーを用いて遺伝子増幅反応を行う工程を包含するこ
とを特徴とするＣＳＶｄ検出方法を提供するものであ
る。
て得られるｃＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号３で
示される塩基配列、とりわけ配列表の配列番号４、５、
および６で示される塩基配列のうち、連続した１５塩基
以上からなる配列もしくはその変異配列を含有するプラ
イマーを用いて遺伝子増幅反応を行う工程を包含するこ
とを特徴とするＣＳＶｄ検出方法を提供するものであ
る。
【０００９】本発明の第３の発明は、第１の発明に示さ
れた方法で検体植物のＣＳＶｄ感染の有無を診断するた
めのキットであって、第１の発明および第２の発明に示
されたプライマーを含有することを特徴とするＣＳＶｄ
感染の診断用キットを提供するものである。
れた方法で検体植物のＣＳＶｄ感染の有無を診断するた
めのキットであって、第１の発明および第２の発明に示
されたプライマーを含有することを特徴とするＣＳＶｄ
感染の診断用キットを提供するものである。
【００１０】本明細書において、「変異配列を含有する
プライマー」とは、ＣＳＶｄの検出が可能な範囲で、上
記のプライマーの設計に用いられる塩基配列の一部に塩
基の欠失、置換、挿入または付加などの変異を導入した
配列を含有するプライマーをいう。
プライマー」とは、ＣＳＶｄの検出が可能な範囲で、上
記のプライマーの設計に用いられる塩基配列の一部に塩
基の欠失、置換、挿入または付加などの変異を導入した
配列を含有するプライマーをいう。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の検出方法の対象となるキ
クわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）は、特に限定するもの
ではないが、例えば、オーストラリア分離株［ヌクレッ
ク・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、
第９巻、２７４１−２７５２頁、(１９８１）］があ
り、その全塩基配列は公知である。配列表の配列番号７
に該ウイロイドの全塩基配列を示す。ＣＳＶｄは環状の
ＲＮＡ分子であり、その検出が可能な遺伝子増幅法の一
例としてはＲＴ−ＰＣＲ法があり、該方法にはウイロイ
ドＲＮＡよりｃＤＮＡを合成するための逆転写プライマ
ーおよびそれと共に増幅反応に用いるＰＣＲプライマー
が必要である。両プライマーともＣＳＶｄの塩基配列を
もとにしてその配列を設計し、化学的に合成することが
できる。また、その長さに関して特に制約はなく、ＣＳ
Ｖｄが検出できる範囲で適当な長さのものを使用しても
問題ない。
クわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）は、特に限定するもの
ではないが、例えば、オーストラリア分離株［ヌクレッ
ク・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、
第９巻、２７４１−２７５２頁、(１９８１）］があ
り、その全塩基配列は公知である。配列表の配列番号７
に該ウイロイドの全塩基配列を示す。ＣＳＶｄは環状の
ＲＮＡ分子であり、その検出が可能な遺伝子増幅法の一
例としてはＲＴ−ＰＣＲ法があり、該方法にはウイロイ
ドＲＮＡよりｃＤＮＡを合成するための逆転写プライマ
ーおよびそれと共に増幅反応に用いるＰＣＲプライマー
が必要である。両プライマーともＣＳＶｄの塩基配列を
もとにしてその配列を設計し、化学的に合成することが
できる。また、その長さに関して特に制約はなく、ＣＳ
Ｖｄが検出できる範囲で適当な長さのものを使用しても
問題ない。
【００１２】本明細書に記載のプライマーは、全て２０
塩基の合成オリゴデオキシヌクレオチドであり、各プラ
イマーの名称は、そのＣＳＶｄ分子での対応する位置を
示す。プライマーの名称のうち、Ｒを冠したものは、ゲ
ノムＲＮＡに相補的な配列を持つものを、Ｆを冠したも
のは、ゲノムＲＮＡと相同的な配列を持つものをそれぞ
れ示す。数字は、配列表の配列番号７に示したＣＳＶｄ
の塩基配列上でそれぞれのプライマーの５'−末端の塩
基が対応する塩基の位置を示す。例えば、プライマーＦ
１３４は、配列表の配列番号７に示した塩基配列中、１
３４番目から１５３番目にかけての配列と相同的な配列
を持つ２０塩基の合成オリゴデオキシヌクレオチドであ
り、プライマーＲ２１は、配列表の配列番号７に示した
塩基配列中、２１番目から２番目にかけての配列と相補
的な配列を持つ２０塩基の合成オリゴデオキシヌクレオ
チドである。本発明において、Ｒを冠したプライマーは
逆転写プライマーとして、Ｆを冠したプライマーはＰＣ
Ｒプライマーとして使用する。
塩基の合成オリゴデオキシヌクレオチドであり、各プラ
イマーの名称は、そのＣＳＶｄ分子での対応する位置を
示す。プライマーの名称のうち、Ｒを冠したものは、ゲ
ノムＲＮＡに相補的な配列を持つものを、Ｆを冠したも
のは、ゲノムＲＮＡと相同的な配列を持つものをそれぞ
れ示す。数字は、配列表の配列番号７に示したＣＳＶｄ
の塩基配列上でそれぞれのプライマーの５'−末端の塩
基が対応する塩基の位置を示す。例えば、プライマーＦ
１３４は、配列表の配列番号７に示した塩基配列中、１
３４番目から１５３番目にかけての配列と相同的な配列
を持つ２０塩基の合成オリゴデオキシヌクレオチドであ
り、プライマーＲ２１は、配列表の配列番号７に示した
塩基配列中、２１番目から２番目にかけての配列と相補
的な配列を持つ２０塩基の合成オリゴデオキシヌクレオ
チドである。本発明において、Ｒを冠したプライマーは
逆転写プライマーとして、Ｆを冠したプライマーはＰＣ
Ｒプライマーとして使用する。
【００１３】ＣＳＶｄ分子のいくつかの部分を選んで逆
転写用プライマー、ＰＣＲプライマーを作製し、それら
を組み合わせてＣＳＶｄを含む試料と共に逆転写、およ
びＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を行い、反応後のＤ
ＮＡ増幅の有無を調べることによって、その検出感度を
知ることができる。このＲＴ−ＰＣＲ反応には、ＲＮＡ
−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いることができる。
ＣＳＶｄを遺伝子増幅する場合には、その第一段階とな
るＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応の効率が増幅効率
全体、すなわち、ウイロイドの検出感度を大きく左右す
る。このため、例えば、種々の逆転写プライマーを用い
た場合の検出感度を比較することにより、逆転写の効率
に優れたプライマーを選ぶと同時に、逆転写プライマー
の設計に適したＣＳＶｄ上の領域を決定する必要があ
る。
転写用プライマー、ＰＣＲプライマーを作製し、それら
を組み合わせてＣＳＶｄを含む試料と共に逆転写、およ
びＰＣＲ反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を行い、反応後のＤ
ＮＡ増幅の有無を調べることによって、その検出感度を
知ることができる。このＲＴ−ＰＣＲ反応には、ＲＮＡ
−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いることができる。
ＣＳＶｄを遺伝子増幅する場合には、その第一段階とな
るＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応の効率が増幅効率
全体、すなわち、ウイロイドの検出感度を大きく左右す
る。このため、例えば、種々の逆転写プライマーを用い
た場合の検出感度を比較することにより、逆転写の効率
に優れたプライマーを選ぶと同時に、逆転写プライマー
の設計に適したＣＳＶｄ上の領域を決定する必要があ
る。
【００１４】後の実施例に示すように、本発明において
作製された逆転写用プライマーのうち、プライマーＲ２
７４およびＲ２６４を用いた場合には、特異的な増幅産
物が得られるのに対し、その両側に位置するプライマー
Ｒ１８６およびＲ３４８では、増幅が見られないことか
ら、該プライマーで挟まれる領域、すなわち、配列表の
配列番号７に示されるＣＳＶｄの塩基配列のうち、１８
７番目から３２８番目かけての塩基配列が逆転写プライ
マーの設計に適していることが示された。この領域の塩
基配列を配列表の配列番号１に示す。
作製された逆転写用プライマーのうち、プライマーＲ２
７４およびＲ２６４を用いた場合には、特異的な増幅産
物が得られるのに対し、その両側に位置するプライマー
Ｒ１８６およびＲ３４８では、増幅が見られないことか
ら、該プライマーで挟まれる領域、すなわち、配列表の
配列番号７に示されるＣＳＶｄの塩基配列のうち、１８
７番目から３２８番目かけての塩基配列が逆転写プライ
マーの設計に適していることが示された。この領域の塩
基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００１５】さらに、配列表の配列番号１に示される上
記の逆転写プライマーの設計に適した領域について、種
々の逆転写プライマーを作製し、同様にしてＣＳＶｄの
検出感度を調べることにより、逆転写プライマーの設計
に特に適した領域を決定する。配列表の配列番号７に示
されるＣＳＶｄの塩基配列のうち、２３０番目から２７
９番目の配列をもとに設計した逆転写プライマーは、す
べて高い検出感度を示し、この領域が逆転写プライマー
の設計に特に適していることがわかる。配列表の配列番
号２に上記の逆転写プライマーの設計に特に適した領域
の塩基配列を示す。
記の逆転写プライマーの設計に適した領域について、種
々の逆転写プライマーを作製し、同様にしてＣＳＶｄの
検出感度を調べることにより、逆転写プライマーの設計
に特に適した領域を決定する。配列表の配列番号７に示
されるＣＳＶｄの塩基配列のうち、２３０番目から２７
９番目の配列をもとに設計した逆転写プライマーは、す
べて高い検出感度を示し、この領域が逆転写プライマー
の設計に特に適していることがわかる。配列表の配列番
号２に上記の逆転写プライマーの設計に特に適した領域
の塩基配列を示す。
【００１６】上記の領域の塩基配列より設計した逆転写
プライマーを用いてｃＤＮＡ合成を行っても、ＰＣＲプ
ライマーの選択が不適切な場合には、期待されるような
高感度が得られない。上記の領域より設計したある逆転
写プライマーに対して、いくつかのＰＣＲプライマーを
組み合わせた場合の検出感度を比較し、増幅効率に優れ
たＰＣＲプライマーおよびその設計に適したＣＳＶｄ上
の領域を決定する必要がある。
プライマーを用いてｃＤＮＡ合成を行っても、ＰＣＲプ
ライマーの選択が不適切な場合には、期待されるような
高感度が得られない。上記の領域より設計したある逆転
写プライマーに対して、いくつかのＰＣＲプライマーを
組み合わせた場合の検出感度を比較し、増幅効率に優れ
たＰＣＲプライマーおよびその設計に適したＣＳＶｄ上
の領域を決定する必要がある。
【００１７】また、後の実施例に示すように、逆転写プ
ライマーにＲ２６４またはＲ２７４を用いた場合には、
ＰＣＲプライマーＦ１９６とＦ３２６とで挟まれる領
域、すなわち、配列表の配列番号７に示されるＣＳＶｄ
の塩基配列のうち、１番目から１９５番目および３４６
番目から３５６番目にかけての塩基配列がＰＣＲプライ
マーの設計に適していた。配列表の配列番号３に上記の
ＰＣＲプライマーの設計に適した領域の塩基配列を示
す。さらに、逆転写プライマーの場合と同様にしてＰＣ
Ｒプライマーの設計に特に適した領域を決定した。配列
表の配列番号４、５、および６にＰＣＲプライマーの設
計に特に適した領域の塩基配列を示す。
ライマーにＲ２６４またはＲ２７４を用いた場合には、
ＰＣＲプライマーＦ１９６とＦ３２６とで挟まれる領
域、すなわち、配列表の配列番号７に示されるＣＳＶｄ
の塩基配列のうち、１番目から１９５番目および３４６
番目から３５６番目にかけての塩基配列がＰＣＲプライ
マーの設計に適していた。配列表の配列番号３に上記の
ＰＣＲプライマーの設計に適した領域の塩基配列を示
す。さらに、逆転写プライマーの場合と同様にしてＰＣ
Ｒプライマーの設計に特に適した領域を決定した。配列
表の配列番号４、５、および６にＰＣＲプライマーの設
計に特に適した領域の塩基配列を示す。
【００１８】上記の各領域の塩基配列をもとに作製され
た逆転写プライマー、ＰＣＲプライマーを使用するＲＴ
−ＰＣＲ法によるＣＳＶｄの検出感度は従来の検出方
法、すなわち、既知のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ
法または遺伝子増幅法以外の検出方法（リターンポリア
クリルアミドゲル電気泳動法、およびドットブロットハ
イブリダイゼーション法）に比べて高い検出感度を有し
ている。以上に説明したように、本発明により、ＣＳＶ
ｄを遺伝子増幅法で感度良く検出する際に、逆転写プラ
イマーおよびＰＣＲプライマーを設計するために適する
ＣＳＶｄ上の領域が決定できた。
た逆転写プライマー、ＰＣＲプライマーを使用するＲＴ
−ＰＣＲ法によるＣＳＶｄの検出感度は従来の検出方
法、すなわち、既知のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ
法または遺伝子増幅法以外の検出方法（リターンポリア
クリルアミドゲル電気泳動法、およびドットブロットハ
イブリダイゼーション法）に比べて高い検出感度を有し
ている。以上に説明したように、本発明により、ＣＳＶ
ｄを遺伝子増幅法で感度良く検出する際に、逆転写プラ
イマーおよびＰＣＲプライマーを設計するために適する
ＣＳＶｄ上の領域が決定できた。
【００１９】本発明の検出方法に供する検体としては、
特に限定するものではないが、ＣＳＶｄ感染の疑いのあ
るキク、トマト、ジャガイモ、ジヌラ、シネラリアなど
が挙げられる。本発明に使用する遺伝子増幅法自体は、
ＣＳＶｄのＲＮＡゲノムからｃＤＮＡを合成する工程
と、該ｃＤＮＡを適当なプライマー対を用いて増幅する
工程とを含む方法の全てが適応可能であり、公知の方法
および条件が採用でき、本明細書に示したＲＴ−ＰＣＲ
法のほか、ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅する方法
（特開平２−５８６４号）や鎖置換増幅法（米国特許第
５,４２２,２５２号）等が使用できる。
特に限定するものではないが、ＣＳＶｄ感染の疑いのあ
るキク、トマト、ジャガイモ、ジヌラ、シネラリアなど
が挙げられる。本発明に使用する遺伝子増幅法自体は、
ＣＳＶｄのＲＮＡゲノムからｃＤＮＡを合成する工程
と、該ｃＤＮＡを適当なプライマー対を用いて増幅する
工程とを含む方法の全てが適応可能であり、公知の方法
および条件が採用でき、本明細書に示したＲＴ−ＰＣＲ
法のほか、ＲＮＡポリメラーゼを用いて増幅する方法
（特開平２−５８６４号）や鎖置換増幅法（米国特許第
５,４２２,２５２号）等が使用できる。
【００２０】プライマーは、上記の領域の塩基配列をも
とに任意に設計することができるが、その設計にあたっ
てはプライマーが分子内で二次構造を形成しないような
配列を選ぶとともに、プライマーと鋳型との融解温度
（Ｔｍ値）が適当な温度になるよう注意することは言う
までもない。また、プライマーの３'−末端付近は、シ
トシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の割合が高くなるように
設計することが望ましい。ＣＳＶｄの検出が可能であれ
ば、プライマーは、その配列の一部に塩基の欠失、置
換、挿入または付加などの変異を有していてもよい。な
お、プライマー伸長反応の効率に大きく影響を与えるプ
ライマーの３'−末端付近については変異がないように
するか、あるいは、あっても最小限にとどめることが好
ましく、より好ましくはその５'−末端に変異を有する
ようプライマーを設計する。プライマーは、必要に応じ
て適当な修飾を施して使用することが可能である。ビオ
チンやジゴキシゲニンのようなリガンドや蛍光物質など
を付したプライマーは、増幅反応後の産物の検出を容易
にする。また、プライマーの５'−側にＣＳＶｄの塩基
配列由来ではない適当な塩基配列を付してもよい。たと
えば、ＲＮＡポリメラーゼを用いた増幅を行う場合には
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を、また、鎖置
換法を使用する場合には使用する制限酵素の認識配列
を、それぞれプライマーの５’−側に付しておく必要が
ある。
とに任意に設計することができるが、その設計にあたっ
てはプライマーが分子内で二次構造を形成しないような
配列を選ぶとともに、プライマーと鋳型との融解温度
（Ｔｍ値）が適当な温度になるよう注意することは言う
までもない。また、プライマーの３'−末端付近は、シ
トシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）の割合が高くなるように
設計することが望ましい。ＣＳＶｄの検出が可能であれ
ば、プライマーは、その配列の一部に塩基の欠失、置
換、挿入または付加などの変異を有していてもよい。な
お、プライマー伸長反応の効率に大きく影響を与えるプ
ライマーの３'−末端付近については変異がないように
するか、あるいは、あっても最小限にとどめることが好
ましく、より好ましくはその５'−末端に変異を有する
ようプライマーを設計する。プライマーは、必要に応じ
て適当な修飾を施して使用することが可能である。ビオ
チンやジゴキシゲニンのようなリガンドや蛍光物質など
を付したプライマーは、増幅反応後の産物の検出を容易
にする。また、プライマーの５'−側にＣＳＶｄの塩基
配列由来ではない適当な塩基配列を付してもよい。たと
えば、ＲＮＡポリメラーゼを用いた増幅を行う場合には
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を、また、鎖置
換法を使用する場合には使用する制限酵素の認識配列
を、それぞれプライマーの５’−側に付しておく必要が
ある。
【００２１】増幅産物の検出は、常法に従い、増幅反応
後の反応液の一部をとって電気泳動を行い、エチジウム
ブロマイドでＤＮＡを染色することにより行うことがで
きる。上記の修飾を付したプライマーを使用した場合に
はその修飾に応じた適当な検出方法を使用することもで
きる。また、増幅される塩基配列、またはその一部の配
列を含むＤＮＡ、またはＲＮＡを標識しておけばハイブ
リダイゼーションによって増幅産物を検出することも可
能である。
後の反応液の一部をとって電気泳動を行い、エチジウム
ブロマイドでＤＮＡを染色することにより行うことがで
きる。上記の修飾を付したプライマーを使用した場合に
はその修飾に応じた適当な検出方法を使用することもで
きる。また、増幅される塩基配列、またはその一部の配
列を含むＤＮＡ、またはＲＮＡを標識しておけばハイブ
リダイゼーションによって増幅産物を検出することも可
能である。
【００２２】本発明により得られる逆転写プライマー、
ＰＣＲプライマー（またはこれらの誘導体）を含むキッ
トを構築し、植物におけるＣＳＶｄ感染の診断に用いる
ことができる。このようなキットは、増幅反応に用いる
ための緩衝液や酵素を含むことができ、さらに簡便に診
断を行うためには、植物細胞からの核酸試料の調製や増
幅産物の検出に使用される試薬類を含んでいてもよく、
常法に従い、適宜の剤形とすることができる。
ＰＣＲプライマー（またはこれらの誘導体）を含むキッ
トを構築し、植物におけるＣＳＶｄ感染の診断に用いる
ことができる。このようなキットは、増幅反応に用いる
ための緩衝液や酵素を含むことができ、さらに簡便に診
断を行うためには、植物細胞からの核酸試料の調製や増
幅産物の検出に使用される試薬類を含んでいてもよく、
常法に従い、適宜の剤形とすることができる。
【００２３】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ （１）ＣＳＶｄ感染キクからの低分子ＲＮＡの抽出 液体窒素で冷凍された１グラムのＣＳＶｄ感染キクの葉
を乳鉢で磨砕し、１．５ｍｌの１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4と１０
μｌのメルカプトエタノールを入れて、さらに磨砕す
る。磨砕液を遠心分離して得られる上清の一部を１．５
ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、等量のCartrimo
x-１４TM溶液（ＲＮＡアイソレーション・キット、アイ
オワ・バイオテクノロジー社製）を加え、ボルテックス
ミキサーで２分間撹拌する。１２０００ｒｐｍ、５分間
遠心して回収される沈殿を１００μｌのGuanidinium溶
液（ＲＮＡアイソレーション・キット、アイオワ・バイ
オテクノロジー社製）に充分に溶かし、１００μｌの水
飽和フェノール：クロロホルム（１：１）を加えて撹拌
した後、遠心して回収した上層にイソプロパノールを加
えて沈殿を回収した。さらに、メトキシエタノール処理
により多糖類を除去後、臭化セチルトリメチルアンモニ
ウム（ＣＴＡＢ）処理により全核酸を回収した。最後に
２Ｍ ＬｉＣｌ処理により高分子ＲＮＡを除去し、エタ
ノール沈殿を行って回収した低分子ＲＮＡを適当な量の
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．３）に溶かしてこれを原液とし、１０倍希
釈シリーズを作って以下の実験に用いるＣＳＶｄ含有試
料とした。また、ＣＳＶｄに感染していない健全キクか
らの低分子ＲＮＡの調製は上記の罹病組織からの調製と
同じ方法で行った。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ （１）ＣＳＶｄ感染キクからの低分子ＲＮＡの抽出 液体窒素で冷凍された１グラムのＣＳＶｄ感染キクの葉
を乳鉢で磨砕し、１．５ｍｌの１Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4と１０
μｌのメルカプトエタノールを入れて、さらに磨砕す
る。磨砕液を遠心分離して得られる上清の一部を１．５
ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、等量のCartrimo
x-１４TM溶液（ＲＮＡアイソレーション・キット、アイ
オワ・バイオテクノロジー社製）を加え、ボルテックス
ミキサーで２分間撹拌する。１２０００ｒｐｍ、５分間
遠心して回収される沈殿を１００μｌのGuanidinium溶
液（ＲＮＡアイソレーション・キット、アイオワ・バイ
オテクノロジー社製）に充分に溶かし、１００μｌの水
飽和フェノール：クロロホルム（１：１）を加えて撹拌
した後、遠心して回収した上層にイソプロパノールを加
えて沈殿を回収した。さらに、メトキシエタノール処理
により多糖類を除去後、臭化セチルトリメチルアンモニ
ウム（ＣＴＡＢ）処理により全核酸を回収した。最後に
２Ｍ ＬｉＣｌ処理により高分子ＲＮＡを除去し、エタ
ノール沈殿を行って回収した低分子ＲＮＡを適当な量の
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．３）に溶かしてこれを原液とし、１０倍希
釈シリーズを作って以下の実験に用いるＣＳＶｄ含有試
料とした。また、ＣＳＶｄに感染していない健全キクか
らの低分子ＲＮＡの調製は上記の罹病組織からの調製と
同じ方法で行った。
【００２４】（２）ＣＳＶｄの種々の領域で作成したプ
ライマー対でのＣＳＶｄ検出感度の比較 配列表の配列番号７に示された配列に基にして、１０個
の逆転写プライマーと、１０個のＰＣＲプライマーを合
成した。逆転写プライマー、Ｒ２１、Ｒ５４、Ｒ８０、
Ｒ８９、Ｒ１３３、Ｒ１６６、Ｒ１８６、Ｒ２６４、Ｒ
２７４、Ｒ３４８の配列を配列表の配列番号８−１７に
示す。また、ＰＣＲプライマー、Ｆ８、Ｆ７０、Ｆ９
４、Ｆ１３４、Ｆ１９６、Ｆ２３３、Ｆ２５７、Ｆ２９
７、Ｆ３２６の配列をそれぞれ配列表の配列番号１８−
２６に示す。作製された各逆転写プライマーに対して、
増幅されるＤＮＡ断片（増幅産物）が１６０−２２０ｂ
ｐとなるようなＰＣＲプライマーを選んで対にし、各プ
ライマー対を用いた場合のＣＳＶｄの検出感度をＲＮＡ
−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用い、キット添付の説
明書に従って以下のように調べた。
ライマー対でのＣＳＶｄ検出感度の比較 配列表の配列番号７に示された配列に基にして、１０個
の逆転写プライマーと、１０個のＰＣＲプライマーを合
成した。逆転写プライマー、Ｒ２１、Ｒ５４、Ｒ８０、
Ｒ８９、Ｒ１３３、Ｒ１６６、Ｒ１８６、Ｒ２６４、Ｒ
２７４、Ｒ３４８の配列を配列表の配列番号８−１７に
示す。また、ＰＣＲプライマー、Ｆ８、Ｆ７０、Ｆ９
４、Ｆ１３４、Ｆ１９６、Ｆ２３３、Ｆ２５７、Ｆ２９
７、Ｆ３２６の配列をそれぞれ配列表の配列番号１８−
２６に示す。作製された各逆転写プライマーに対して、
増幅されるＤＮＡ断片（増幅産物）が１６０−２２０ｂ
ｐとなるようなＰＣＲプライマーを選んで対にし、各プ
ライマー対を用いた場合のＣＳＶｄの検出感度をＲＮＡ
−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用い、キット添付の説
明書に従って以下のように調べた。
【００２５】実施例１−（１）で得られたＣＳＶｄ感染
植物より抽出した低分子ＲＮＡ試料をＴＥ緩衝液で１０
4倍希釈したＣＳＶｄ含有試料３．５μｌ（４５０ｎｇ
の葉に相当する）、終濃度１ｐｍｏｌ／μｌの逆転写プ
ライマーおよび上記のキット中の１０倍濃度ＲＮＡ−Ｐ
ＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ混合物、塩化マグネシウム、ＲＮ
ａｓｅインヒビター、逆転写酵素を加えた２０μｌの反
応液を調製し、３０℃、１０分間加温した後、５５℃、
３０分間反応させた。反応終了後、９９℃、５分の熱処
理により逆転写酵素を失活させ、冷却した後、１０倍濃
度ＲＮＡ-ＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウム、タックＤ
ＮＡポリメラーゼ、終濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌのＰＣ
Ｒプライマーを加えて全量を１００μｌとした。この反
応液の上層に１００μｌのミネラルオイル（宝酒造社
製）を加え、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー４
８０（Thermal Cycler ４８０、パーキンエルマー社
製）により増幅反応を行った。反応条件は９４℃、３０
秒の変性→５５℃、１分のアニーリング→７２℃、１分
の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクルの反応を行
った。反応後、反応液の１０μlを取り、２％ Ｌ０３ア
ガロース（宝酒造社製）を用いたゲル電気泳動を行い、
エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して増幅したＤＮ
Ａを確認した。その結果を表１に示す。表中、−は特異
的な遺伝子増幅のないこと、＋は特異的な遺伝子の増幅
があること、＋＋は強い特異的増幅があることを示す。
植物より抽出した低分子ＲＮＡ試料をＴＥ緩衝液で１０
4倍希釈したＣＳＶｄ含有試料３．５μｌ（４５０ｎｇ
の葉に相当する）、終濃度１ｐｍｏｌ／μｌの逆転写プ
ライマーおよび上記のキット中の１０倍濃度ＲＮＡ−Ｐ
ＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ混合物、塩化マグネシウム、ＲＮ
ａｓｅインヒビター、逆転写酵素を加えた２０μｌの反
応液を調製し、３０℃、１０分間加温した後、５５℃、
３０分間反応させた。反応終了後、９９℃、５分の熱処
理により逆転写酵素を失活させ、冷却した後、１０倍濃
度ＲＮＡ-ＰＣＲ緩衝液、塩化マグネシウム、タックＤ
ＮＡポリメラーゼ、終濃度０．２ｐｍｏｌ／μｌのＰＣ
Ｒプライマーを加えて全量を１００μｌとした。この反
応液の上層に１００μｌのミネラルオイル（宝酒造社
製）を加え、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー４
８０（Thermal Cycler ４８０、パーキンエルマー社
製）により増幅反応を行った。反応条件は９４℃、３０
秒の変性→５５℃、１分のアニーリング→７２℃、１分
の伸長反応を１サイクルとし、３０サイクルの反応を行
った。反応後、反応液の１０μlを取り、２％ Ｌ０３ア
ガロース（宝酒造社製）を用いたゲル電気泳動を行い、
エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して増幅したＤＮ
Ａを確認した。その結果を表１に示す。表中、−は特異
的な遺伝子増幅のないこと、＋は特異的な遺伝子の増幅
があること、＋＋は強い特異的増幅があることを示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】（３）逆転写用プライマーの設計に適した
領域の決定 表１に示した結果より、逆転写プライマー、Ｒ１８６と
Ｒ３４８とではさまれた領域の塩基配列より作成された
プライマー、たとえば逆転写プライマーＲ２６４、Ｒ２
７４を用いた場合には感度良くＣＳＶｄを検出できるこ
とが示された。この領域の塩基配列を配列表の配列番号
２に示す。
領域の決定 表１に示した結果より、逆転写プライマー、Ｒ１８６と
Ｒ３４８とではさまれた領域の塩基配列より作成された
プライマー、たとえば逆転写プライマーＲ２６４、Ｒ２
７４を用いた場合には感度良くＣＳＶｄを検出できるこ
とが示された。この領域の塩基配列を配列表の配列番号
２に示す。
【００２８】次に、この検出感度が各々のプライマーの
塩基配列によるものか、プライマーがアニーリングする
ＣＳＶｄ上の領域の性質によるのかを調べるため、特に
高い増幅効率を示したプライマーＲ２６４、Ｒ２７４の
アニーリングする領域周辺についてさらに詳細な検討を
行った。プライマーＲ２６４を基本にＣＳＶｄ上でのア
ニーリング位置を３塩基ずつ５'−末端側にずらした５
種のプライマーＲ２６１、Ｒ２５８、Ｒ２５５、Ｒ２５
２、Ｒ２４９と、逆に３'−末端側に３塩基ずつずらし
た５種のプライマーＲ２６７、Ｒ２７０、Ｒ２７３、Ｒ
２７６、Ｒ２７９を合成した。プライマーＲ２４９、Ｒ
２５２、Ｒ２５５、Ｒ２５８、Ｒ２６１、Ｒ２６７、Ｒ
２７０、Ｒ２７３、Ｒ２７６、Ｒ２７９の塩基配列をそ
れぞれ配列表の配列番号２７〜３６に示す。これらの逆
転写プライマーをそれぞれＰＣＲプライマーＦ９４と組
み合わせ、実施例１−（２）と同様にしてＣＳＶｄの検
出感度を調べた。この結果、上記の１０種類の逆転写用
プライマーのどれを用いた場合も予想される大きさのＤ
ＮＡ断片の増幅が確認され、肉眼観察でその増幅量を比
べてもＲ２６４を用いた場合と顕著な差は見られなかっ
た。また、健全なキクより調製した試料を用いた反応で
は、どのプライマーを用いた場合でもＤＮＡの増幅は見
られなかった。
塩基配列によるものか、プライマーがアニーリングする
ＣＳＶｄ上の領域の性質によるのかを調べるため、特に
高い増幅効率を示したプライマーＲ２６４、Ｒ２７４の
アニーリングする領域周辺についてさらに詳細な検討を
行った。プライマーＲ２６４を基本にＣＳＶｄ上でのア
ニーリング位置を３塩基ずつ５'−末端側にずらした５
種のプライマーＲ２６１、Ｒ２５８、Ｒ２５５、Ｒ２５
２、Ｒ２４９と、逆に３'−末端側に３塩基ずつずらし
た５種のプライマーＲ２６７、Ｒ２７０、Ｒ２７３、Ｒ
２７６、Ｒ２７９を合成した。プライマーＲ２４９、Ｒ
２５２、Ｒ２５５、Ｒ２５８、Ｒ２６１、Ｒ２６７、Ｒ
２７０、Ｒ２７３、Ｒ２７６、Ｒ２７９の塩基配列をそ
れぞれ配列表の配列番号２７〜３６に示す。これらの逆
転写プライマーをそれぞれＰＣＲプライマーＦ９４と組
み合わせ、実施例１−（２）と同様にしてＣＳＶｄの検
出感度を調べた。この結果、上記の１０種類の逆転写用
プライマーのどれを用いた場合も予想される大きさのＤ
ＮＡ断片の増幅が確認され、肉眼観察でその増幅量を比
べてもＲ２６４を用いた場合と顕著な差は見られなかっ
た。また、健全なキクより調製した試料を用いた反応で
は、どのプライマーを用いた場合でもＤＮＡの増幅は見
られなかった。
【００２９】このように、上記のプライマーがアニーリ
ングする領域（配列表の配列番号７に示される塩基配列
中の２３０番目から２７９番目にかけての領域に対応す
る）の塩基配列をもとに、逆転写プライマーを作製する
ことによりＣＳＶｄを極めて高感度に検出できることが
明らかになった。配列表の配列番号２に上記の領域の塩
基配列を示す。
ングする領域（配列表の配列番号７に示される塩基配列
中の２３０番目から２７９番目にかけての領域に対応す
る）の塩基配列をもとに、逆転写プライマーを作製する
ことによりＣＳＶｄを極めて高感度に検出できることが
明らかになった。配列表の配列番号２に上記の領域の塩
基配列を示す。
【００３０】（４）ＰＣＲプライマーの設計に適したプ
ライマー領域の決定 逆転写用プライマーＲ２６４、Ｒ２７４に対してＰＣＲ
プライマーＦ８、Ｆ７０、Ｆ９４、Ｆ１３４、Ｆ１９
６、Ｆ２９７、およびＦ３２６をそれぞれ組み合わせ、
実施例１−（２）と同じようにしてＣＳＶｄの検出感度
を調べた。表２にその結果を示す。表中、−は特異的な
遺伝子増幅がないこと、±は特異的な遺伝子の増幅があ
るが弱いこと、＋は特異的な遺伝子の増幅があること、
＋＋は強い特異的増幅があることを示す。
ライマー領域の決定 逆転写用プライマーＲ２６４、Ｒ２７４に対してＰＣＲ
プライマーＦ８、Ｆ７０、Ｆ９４、Ｆ１３４、Ｆ１９
６、Ｆ２９７、およびＦ３２６をそれぞれ組み合わせ、
実施例１−（２）と同じようにしてＣＳＶｄの検出感度
を調べた。表２にその結果を示す。表中、−は特異的な
遺伝子増幅がないこと、±は特異的な遺伝子の増幅があ
るが弱いこと、＋は特異的な遺伝子の増幅があること、
＋＋は強い特異的増幅があることを示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】表２に示したように、Ｒ２７４、Ｒ２６４
のどちらを用いて逆転写反応を行っても、Ｆ１９６とＦ
３２６とではさまれた領域の塩基配列から作製されたＰ
ＣＲプライマー、たとえばＦ１３４、Ｆ９４、Ｆ８と組
み合わせた場合は、他のプライマーを用いた場合に比べ
て増幅能が高いことが明らかになった。この領域の塩基
配列を配列表の配列番号３に示す。この領域中で特に高
い増幅能が得られる領域を探すため、プライマーＦ９４
を基本にＣＳＶｄ上でのアニーリング位置を３塩基ずつ
５'−末端側、あるいは３'−末端側にずらしたプライマ
ー、Ｆ９１、Ｆ８８、Ｆ８５、Ｆ８２、およびＦ９７、
Ｆ１００、Ｆ１０３を合成した。プライマーＦ８２、Ｆ
８５、Ｆ８８、Ｆ９１、Ｆ９７、Ｆ１００、Ｆ１０３の
塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号３７〜４３に示
す。これらのＰＣＲプライマーと逆転写プライマーＲ２
６４とを組み合わせた場合のＣＳＶｄの検出感度を、実
施例１−（２）と同様にして調べた。この結果、上記の
７種類のＰＣＲプライマーのどれを用いた場合も予想さ
れる大きさのＤＮＡ断片の増幅が確認され、その増幅量
についてもＰＣＲプライマーにＦ９４、あるいはＦ８を
用いた場合と顕著な差は見られなかった。また健全のキ
クより調製した試料を用いた反応では、ＤＮＡの増幅は
見られなかった。
のどちらを用いて逆転写反応を行っても、Ｆ１９６とＦ
３２６とではさまれた領域の塩基配列から作製されたＰ
ＣＲプライマー、たとえばＦ１３４、Ｆ９４、Ｆ８と組
み合わせた場合は、他のプライマーを用いた場合に比べ
て増幅能が高いことが明らかになった。この領域の塩基
配列を配列表の配列番号３に示す。この領域中で特に高
い増幅能が得られる領域を探すため、プライマーＦ９４
を基本にＣＳＶｄ上でのアニーリング位置を３塩基ずつ
５'−末端側、あるいは３'−末端側にずらしたプライマ
ー、Ｆ９１、Ｆ８８、Ｆ８５、Ｆ８２、およびＦ９７、
Ｆ１００、Ｆ１０３を合成した。プライマーＦ８２、Ｆ
８５、Ｆ８８、Ｆ９１、Ｆ９７、Ｆ１００、Ｆ１０３の
塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号３７〜４３に示
す。これらのＰＣＲプライマーと逆転写プライマーＲ２
６４とを組み合わせた場合のＣＳＶｄの検出感度を、実
施例１−（２）と同様にして調べた。この結果、上記の
７種類のＰＣＲプライマーのどれを用いた場合も予想さ
れる大きさのＤＮＡ断片の増幅が確認され、その増幅量
についてもＰＣＲプライマーにＦ９４、あるいはＦ８を
用いた場合と顕著な差は見られなかった。また健全のキ
クより調製した試料を用いた反応では、ＤＮＡの増幅は
見られなかった。
【００３３】このように、配列表の配列番号４に示す上
記の７種類のＰＣＲプライマーがアニーリングする領
域、配列表の配列番号５に示すＰＣＲプライマーＦ８が
アニーリングする領域、および配列表の配列番号６に示
すＰＣＲプライマーＦ１３４がアニーリングする領域の
塩基配列よりＰＣＲプライマーを作製することにより、
ＣＳＶｄの検出感度がさらに向上することが明らかにな
った。
記の７種類のＰＣＲプライマーがアニーリングする領
域、配列表の配列番号５に示すＰＣＲプライマーＦ８が
アニーリングする領域、および配列表の配列番号６に示
すＰＣＲプライマーＦ１３４がアニーリングする領域の
塩基配列よりＰＣＲプライマーを作製することにより、
ＣＳＶｄの検出感度がさらに向上することが明らかにな
った。
【００３４】実施例２
既知のＣＳＶｄ検出方法との比較
（１）プライマー対ＣＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１との検
出感度の比較 関西病虫研報、第３５巻、７−１２頁、（１９９３）に
はＣＳＶｄ検出用プライマー対として逆転写プライマー
ＣＳＶＣ−１、およびＰＣＲプライマーＣＳＶＳ−１が
報告されている。これら両プライマーの塩基配列を配列
表の配列番号４４および４５に示す。このプライマー対
でのＣＳＶｄ検出感度を本発明のプライマー対のものと
比較した。比較には実施例１で得られたプライマー対、
Ｒ２６４／Ｆ１３４、Ｒ２６４／Ｆ９４、Ｒ２６４／Ｆ
７０、Ｒ２６４／Ｆ８および実施例１ではＣＳＶｄを検
出できなかったプライマー対、Ｒ３４８／Ｆ１９６を用
いた。実施例１−（１）で得られたＣＳＶｄ感染植物よ
り抽出した低分子ＲＮＡをＴＥ緩衝液でそれぞれ１
０4、１０5、１０6、１０7倍希釈したＣＳＶｄ含有試料
３．５μｌ（４５０ｎｇ、４５ｎｇ、４．５ｎｇ、４５
０ｐｇの葉に相当する）を使用した他は実施例１−
（２）に述べた条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ただ
し、プライマー対ＣＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１について
は、プライマーのＴｍ値が本発明のプライマーのものよ
り低いことを考慮し、アニーリング温度を５１℃とした
場合の検出感度も調べた。結果を表３に示す。表中、Ｎ
Ｔは実験していないことを、（）内の数字はプライマー
のＴｍ値を、５１℃と５５℃はＰＣＲ反応時のアニーリ
ング温度を示す。
出感度の比較 関西病虫研報、第３５巻、７−１２頁、（１９９３）に
はＣＳＶｄ検出用プライマー対として逆転写プライマー
ＣＳＶＣ−１、およびＰＣＲプライマーＣＳＶＳ−１が
報告されている。これら両プライマーの塩基配列を配列
表の配列番号４４および４５に示す。このプライマー対
でのＣＳＶｄ検出感度を本発明のプライマー対のものと
比較した。比較には実施例１で得られたプライマー対、
Ｒ２６４／Ｆ１３４、Ｒ２６４／Ｆ９４、Ｒ２６４／Ｆ
７０、Ｒ２６４／Ｆ８および実施例１ではＣＳＶｄを検
出できなかったプライマー対、Ｒ３４８／Ｆ１９６を用
いた。実施例１−（１）で得られたＣＳＶｄ感染植物よ
り抽出した低分子ＲＮＡをＴＥ緩衝液でそれぞれ１
０4、１０5、１０6、１０7倍希釈したＣＳＶｄ含有試料
３．５μｌ（４５０ｎｇ、４５ｎｇ、４．５ｎｇ、４５
０ｐｇの葉に相当する）を使用した他は実施例１−
（２）に述べた条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ただ
し、プライマー対ＣＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１について
は、プライマーのＴｍ値が本発明のプライマーのものよ
り低いことを考慮し、アニーリング温度を５１℃とした
場合の検出感度も調べた。結果を表３に示す。表中、Ｎ
Ｔは実験していないことを、（）内の数字はプライマー
のＴｍ値を、５１℃と５５℃はＰＣＲ反応時のアニーリ
ング温度を示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】表３に示すように、Ｒ２６４／Ｆ１３４、
Ｒ２６４／Ｆ９４、Ｒ２６４／Ｆ８の３つのプライマー
対は、プライマー対ＣＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１に比べ
て約１００倍高い検出感度を示した。またこれらのプラ
イマー対ではＣＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１に見られた非
特異的増幅は認められなかった。なお、プライマー対Ｃ
ＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１についてアニーリング温度を
５１℃としても、５５℃の場合に比べて顕著な検出感度
の増加は見られなかったが、非特異的増幅は若干増加し
た。
Ｒ２６４／Ｆ９４、Ｒ２６４／Ｆ８の３つのプライマー
対は、プライマー対ＣＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１に比べ
て約１００倍高い検出感度を示した。またこれらのプラ
イマー対ではＣＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１に見られた非
特異的増幅は認められなかった。なお、プライマー対Ｃ
ＳＶＣ−１／ＣＳＶＳ−１についてアニーリング温度を
５１℃としても、５５℃の場合に比べて顕著な検出感度
の増加は見られなかったが、非特異的増幅は若干増加し
た。
【００３７】（２）遺伝子増幅法以外のＣＳＶｄ検出方
法との比較 本発明のＣＳＶｄ検出方法の検出感度を、リターンポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Ｒ−ＰＡＧＥ）法［フィ
トパソロジー（Phytopathology）、第７７巻、１５８８
−１５９１頁（１９８７）］、およびドットブロットハ
イブリダイゼーション法［ジャーナル・オブ・ウイロロ
ジカル・メソッズ（Journal of Virological Method
s）、第２０巻、１８５−１９３頁（１９８８）］と比
較した。本発明の方法はプライマー対Ｒ２６４／Ｆ９４
を用い、実施例１−（２）に示した方法で、また、Ｒ−
ＰＡＧＥ法は上記引用文献に示されたとおりの操作で行
った。また、ドットブロットハイブリダイゼーション法
は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社製）にＣＳＶｄ
全長のｃＤＮＡをクローニングしたものを鋳型とし、Ｄ
ＩＧ−ＲＮＡラベリングキット（ベーリンガー社製）を
用いて調製したＤＩＧ標識ｃＲＮＡプローブを用いて、
日本植物病理学報、第６１巻、第９３−１０２頁（１９
９５）に記載の方法に従って行った。
法との比較 本発明のＣＳＶｄ検出方法の検出感度を、リターンポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Ｒ−ＰＡＧＥ）法［フィ
トパソロジー（Phytopathology）、第７７巻、１５８８
−１５９１頁（１９８７）］、およびドットブロットハ
イブリダイゼーション法［ジャーナル・オブ・ウイロロ
ジカル・メソッズ（Journal of Virological Method
s）、第２０巻、１８５−１９３頁（１９８８）］と比
較した。本発明の方法はプライマー対Ｒ２６４／Ｆ９４
を用い、実施例１−（２）に示した方法で、また、Ｒ−
ＰＡＧＥ法は上記引用文献に示されたとおりの操作で行
った。また、ドットブロットハイブリダイゼーション法
は、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社製）にＣＳＶｄ
全長のｃＤＮＡをクローニングしたものを鋳型とし、Ｄ
ＩＧ−ＲＮＡラベリングキット（ベーリンガー社製）を
用いて調製したＤＩＧ標識ｃＲＮＡプローブを用いて、
日本植物病理学報、第６１巻、第９３−１０２頁（１９
９５）に記載の方法に従って行った。
【００３８】実施例１−（１）に示したＣＳＶｄ感染キ
クより調製したＣＳＶｄ含有試料を用いてそれぞれの方
法の検出感度を測定した結果、本発明のプライマー対Ｒ
２６４／Ｆ９４を用いたＲＴ−ＰＣＲ法では４．５ｎｇ
のキク葉に相当する試料からも検出可能であったのに対
し、ドットハイブリダイゼーション法では４．５μｇ、
Ｒ−ＰＡＧＥ法では４．５ｍｇのキク葉に相当する量の
試料を必要とした。すなわち、遺伝子増幅に基づく本発
明のＣＳＶｄ検出方法は、ドットハイブリダイゼーショ
ン法の約１０3倍、またＲ−ＰＡＧＥ法の約１０6倍の検
出感度を有することが確かめられた。
クより調製したＣＳＶｄ含有試料を用いてそれぞれの方
法の検出感度を測定した結果、本発明のプライマー対Ｒ
２６４／Ｆ９４を用いたＲＴ−ＰＣＲ法では４．５ｎｇ
のキク葉に相当する試料からも検出可能であったのに対
し、ドットハイブリダイゼーション法では４．５μｇ、
Ｒ−ＰＡＧＥ法では４．５ｍｇのキク葉に相当する量の
試料を必要とした。すなわち、遺伝子増幅に基づく本発
明のＣＳＶｄ検出方法は、ドットハイブリダイゼーショ
ン法の約１０3倍、またＲ−ＰＡＧＥ法の約１０6倍の検
出感度を有することが確かめられた。
【００３９】
【発明の効果】本発明により、遺伝子増幅法の特長を最
大限に発揮して、これまで報告された検出法より高い感
度で試料中のＣＳＶｄを検出する事が可能となった。本
発明により提供されるＣＳＶｄの検出方法、および検出
用プライマーはＣＳＶｄのモニタリング、感染初期の植
物の早期診断、植物検疫、ウイロイドフリー種苗の作成
による病害予防等の分野において有用である。
大限に発揮して、これまで報告された検出法より高い感
度で試料中のＣＳＶｄを検出する事が可能となった。本
発明により提供されるＣＳＶｄの検出方法、および検出
用プライマーはＣＳＶｄのモニタリング、感染初期の植
物の早期診断、植物検疫、ウイロイドフリー種苗の作成
による病害予防等の分野において有用である。
【００４０】
【００４１】配列番号：１
配列の長さ：１４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ
配列：
UUCCUUUAGU UUCCUUCCUC UCCUGGAGAG GUCUUCUGCC CUAGCCCGGU CUUCGAAGCU 60
UCCUUUGGCU ACUACCCGGU GGAAACAACU GAAGCUUCAA CGCCUUUUUU UCCAACCUUC 120
UUUAGCACCG GGCCAGGGAG UU 142
【００４２】配列番号：２
配列の長さ：５０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic RNA
配列：
GCCCGGUCUU CGAAGCUUCC UUUGGCUACU ACCCGGUGGA AACAACUGAA 50
【００４３】配列番号：３
配列の長さ：２０６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ
配列：
ＵＡＵＵＧＵＵＣＣＣ ＵＣＧＧＧＡＣＵＵＡ ＣＵＵＧＵＧＧＵＵＣ ＣＵＧ
ＵＧＧＵＧＣＡ ＣＵＣＣＵＧＡＣＣＣ ＵＧＣＵＧＣＵＡＵＡ ６０ ＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡ ＡＧＡＡＡＵＧＡＧＧ ＣＧＡＡＧＡＡＧＵＣ ＣＵＵ
ＣＡＧＧＧＡＵ ＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡ ＡＣＣＵＧＧＡＧＧＡ １２０ ＡＧＵＣＣＧＡＣＧＡ ＧＡＵＣＧＣＧＧＵＵ ＧＧＧＧＣＵＵＡＧＧ ＡＣＣ
ＣＣＡＣＵＣＣ ＵＧＣＧＡＧＡＣＡＧ ＧＡＧＵＡＡＵＣＣＵ １８０ ＡＡＡＣＡＧＧＧＵＵ ＵＵＣＡＣＣＣＵＵＣ ＣＵＵＵＡＧ
２０６
ＵＧＧＵＧＣＡ ＣＵＣＣＵＧＡＣＣＣ ＵＧＣＵＧＣＵＡＵＡ ６０ ＧＣＡＡＡＧＡＡＡＡ ＡＧＡＡＡＵＧＡＧＧ ＣＧＡＡＧＡＡＧＵＣ ＣＵＵ
ＣＡＧＧＧＡＵ ＣＣＣＣＧＧＧＧＡＡ ＡＣＣＵＧＧＡＧＧＡ １２０ ＡＧＵＣＣＧＡＣＧＡ ＧＡＵＣＧＣＧＧＵＵ ＧＧＧＧＣＵＵＡＧＧ ＡＣＣ
ＣＣＡＣＵＣＣ ＵＧＣＧＡＧＡＣＡＧ ＧＡＧＵＡＡＵＣＣＵ １８０ ＡＡＡＣＡＧＧＧＵＵ ＵＵＣＡＣＣＣＵＵＣ ＣＵＵＵＡＧ
２０６
【００４４】配列番号：４
配列の長さ：４１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic RNA
配列：
UCAGGGAUCC CCGGGGAAAC CUGGAGGAAG UCCGACGAGA U 41
【００４５】配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic RNA
配列：
UACUUGUGGU UCCUGUGGUG 20
【００４６】配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic RNA
配列：
CUUAGGACCC CACUCCUGCG 20
【００４７】配列番号：７
配列の長さ：３５６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：環状
配列の種類：Genomic RNA
配列：
CGGGACUUAC UUGUGGUUCC UGUGGUGCAC UCCUGACCCU GCUGCUAUAG CAAAGAAAAA 60
GAAAUGAGGC GAAGAAGUCC UUCAGGGAUC CCCGGGGAAA CCUGGAGGAA GUCCGACGAG 120
AUCGCGGUUG GGGCUUAGGA CCCCACUCCU GCGAGACAGG AGUAAUCCUA AACAGGGUUU 180
UCACCCUUCC UUUAGUUUCC UUCCUCUCCU GGAGAGGUCU UCUGCCCUAG CCCGGUCUUC 240
GAAGCUUCCU UUGGCUACUA CCCGGUGGAA ACAACUGAAG CUUCAACGCC UUUUUUUCCA 300
ACCUUCUUUA GCACCGGGCC AGGGAGUUAG CCCUUGGAAC CUUAGUAUUG UUCCCU 356
【００４８】配列番号：８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
AGGAACCACA AGTAAGTCCC 20
【００４９】配列番号：９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTTGCTATAG CAGCAGGGTC 20
【００５０】配列番号：１０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGACTTCTTC GCCTCATTTC 20
【００５１】配列番号：１１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ATCCCTGAAG GACTTCTTCG 20
【００５２】配列番号：１２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCCCAACCGC GATCTCGTCG 20
【００５３】配列番号：１３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ATTACTCCTG TCTCGCAGGA 20
【００５４】配列番号：１４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGGTGAAAAC CCTGTTTAGG 20
【００５５】配列番号：１５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGGGTAGTAG CCAAAGGAAG 20
【００５６】配列番号：１６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTGTTTCCAC CGGGTAGTAG 20
【００５７】配列番号：１７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ATACTAAGGT TCCAAGGGCT 20
【００５８】配列番号：１８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ＴＡＣＴＴＧＴＧＧＴ ＴＣＣＴＧＴＧＧＴＧ
２０
２０
【００５９】配列番号：１９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ＣＧＡＡＧＡＡＧＴＣ ＣＴＴＣＡＧＧＧＡＴ
２０
２０
【００６０】配列番号：２０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGGGAAACCT GGAGGAAGTC 20
【００６１】配列番号：２１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CTTAGGACCC CACTCCTGCG 20
【００６２】配列番号：２２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTTCCTTCCT CTCCTGGAGA 20
【００６３】配列番号：２３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CGGTCTTCGA AGCTTCCTTT 20
【００６４】配列番号：２４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ACTACCCGGT GGAAACAACT 20
【００６５】配列番号：２５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TCCAACCTTC TTTAGCACCG 20
【００６６】配列番号：２６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GTTAGCCCTT GGAACCTTAG 20
【００６７】配列番号：２７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGAAGCTTCG AAGACCGGGC 20
【００６８】配列番号：２８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
AAAGGAAGCT TCGAAGACCG 20
【００６９】配列番号：２９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GCCAAAGGAA GCTTCGAAGA 20
【００７０】配列番号：３０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GTAGCCAAAG GAAGCTTCGA 20
【００７１】配列番号：３１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GTAGTAGCCA AAGGAAGCTT 20
【００７２】配列番号：３２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CACCGGGTAG TAGCCAAAGG 20
【００７３】配列番号：３３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTCCACCGGG TAGTAGCCAA 20
【００７４】配列番号：３４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ＴＧＴＴＴＣＣＡＣＣ ＧＧＧＴＡＧＴＡＧＣ
２０
２０
【００７５】配列番号：３５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ＡＧＴＴＧＴＴＴＣＣ ＡＣＣＧＧＧＴＡＧＴ
２０
２０
【００７６】配列番号：３６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTCAGTTGTT TCCACCGGGT 20
【００７７】配列番号：３７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TCAGGGATCC CCGGGGAAAC 20
【００７８】配列番号：３８
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GGGATCCCCG GGGAAACCTG 20
【００７９】配列番号：３９
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ATCCCCGGGG AAACCTGGAG 20
【００８０】配列番号：４０
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
CCCGGGGAAA CCTGGAGGAA 20
【００８１】配列番号：４１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
GAAACCTGGA GGAAGTCCGA 20
【００８２】配列番号：４２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
ACCTGGAGGA AGTCCGACGA 20
【００８３】配列番号：４３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TGGAGGAAGT CCGACGAGAT 20
【００８４】配列番号：４４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
TTCTTTCAAA GCAGCAGGGT 20
【００８５】配列番号：４５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
AAAGAAATGA GGCGAAGAAG 20
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 大場 利治
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(72)発明者 浅田 起代蔵
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(72)発明者 加藤 郁之進
滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒
造株式会社中央研究所内
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】 遺伝子増幅によるキクわい化ウイロイド
（ＣＳＶｄ）の検出方法において、配列表の配列番号２
で示される塩基配列のうち、連続した１５塩基以上から
なる配列またはその変異配列を含有するプライマーを用
いて逆転写反応を行ってｃＤＮＡを調製する工程を包含
することを特徴とするＣＳＶｄの検出方法。 - 【請求項２】 配列表の配列番号７に示される塩基配列
の８番目から１５３番目にかけての配列のうち、連続し
た１５塩基以上からなる配列またはその変異配列を含有
するプライマーを用い、請求項１記載の方法で得られた
ｃＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応を行う工程を包含
する請求項１記載のＣＳＶｄの検出方法。 - 【請求項３】 遺伝子増幅反応工程が、配列表の配列番
号４、５および６で示される塩基配列のうち、連続した
１５塩基以上からなる配列またはその変異配列を含有す
るプライマーを用いて請求項１記載方法で得られたｃＤ
ＮＡを鋳型として行う請求項２記載のＣＳＶｄの検出方
法。 - 【請求項４】 請求項１記載のＣＳＶｄの検出方法を用
いて検体植物のＣＳＶｄ感染の有無を診断するためのキ
ットであって、請求項１および請求項２に記載のプライ
マーを含有することを特徴とするＣＳＶｄ感染診断キッ
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30726195A JP3376189B2 (ja) | 1995-11-27 | 1995-11-27 | キクわい化ウイロイドの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30726195A JP3376189B2 (ja) | 1995-11-27 | 1995-11-27 | キクわい化ウイロイドの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09140383A JPH09140383A (ja) | 1997-06-03 |
| JP3376189B2 true JP3376189B2 (ja) | 2003-02-10 |
Family
ID=17966987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30726195A Expired - Fee Related JP3376189B2 (ja) | 1995-11-27 | 1995-11-27 | キクわい化ウイロイドの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3376189B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102719561B (zh) * | 2012-06-12 | 2013-09-25 | 中国检验检疫科学研究院 | 筛查马铃薯纺锤形块茎类病毒属类病毒的芯片及其应用 |
-
1995
- 1995-11-27 JP JP30726195A patent/JP3376189B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09140383A (ja) | 1997-06-03 |
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