JP3280021B2 - 骨吸収を阻害する化合物及び組成物 - Google Patents

骨吸収を阻害する化合物及び組成物

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、骨吸収を阻害する化合物及び組成物、並び
に骨吸収を阻害するための方法に関する。特に、本発明
は、ポリペプチドPTHrP（副甲状腺ホルモン関連タンパ
ク質）のカルボキシル末端フラグメント及び骨吸収を阻
害するその誘導体に関する。
PTHrP（また、名称アデニル酸シクラーゼ刺激因子−A
CSFにより知られている）は、まず、扁平上皮癌（BEN細
胞）細胞抽出物からT.J.Martin教授及び同僚により単離
され、そして均質性に精製されたタンパク質である（Mo
seleyなど;Proc.Natl.Acad.Sci.85:5048〜5052,198
7）。PTHrPをコードする核酸がSuvaなど（Science237:8
93〜896,1987）により単離され、そして特徴づけられ
た。そのPTHrP遺伝子は、31残基シグナル配列、続いて
５残基塩基性Pro配列及び次にPTHrPの配列を有するポリ
ペプチドをコードする。ヒト遺伝子転写体は、アミノ酸
１−139、１−141又は１−173を含んで成る成熟PTHrPを
生成するために選択的スプライシングを受ける。前記１
−141形が卓越していると思われる。フロプロPTHrPのア
ミノ酸配列は図２に示されており、その図は種々のスプ
ライス変異体（＊により示される）を示す。
PTHrPは３種の主成分ドメインを含む。残基１から残
基83に拡張し、そしてＮ−末端ドメインと称するそのＮ
−末端ドメインは、PTHに関連し、そしてPTHrPのPTHレ
セプター結合官能価を含む配列を含む。その後、Ｃ−末
端方向に、残基84から106に拡張し、塩基性ペプチドと
称し、そして最後に、残基107〜141又は（他のスプライ
ス変異体における107〜107〜173）でＣ−末端ペプチド
を含む高い塩基性の領域が存在する。
PTHrPの作用は、アデニル酸シクラーゼの活性化、単
離された破骨細胞による器官培養における骨吸収のイン
ビトロ刺激、及びホスフェート排泄及び環状AMPの腎臓
形成のインビボ促進を包含するPTH（副甲状腺ホルモ
ン）の作用に密接に類似する。PTHrPポリペプチドは、
過度の骨吸収に起因する、被転移性骨破壊及び高カルシ
ウム血症に関連する。
過剰の骨吸収は、多くの非−悪性及び悪性疾患、たと
えば骨粗鬆症、骨のパジェット病、悪性の体液性高カル
シウム血症及び転移性骨疾患に関連する。さらに、宇宙
飛行士経験は、ゼロの重力の条件下で骨吸収を又めた。
過剰の骨吸収は、骨折及び破壊に対してますます敏感に
なるもろく且つ弱い骨、及び骨湾曲及び関連する姿勢の
問題を生ぜしめる体重下での奇形を導く。
高カルシウム血症はまた、器官及び組織のカルシウム
沈着化、すなわち組織及び器官内でのカルシウムの沈着
にも関連する。カルシウム沈着化は器官機能の低下及び
細胞死を導くことができる。腎臓は特に、カルシウム沈
着化に対して敏感であり、低められた機能及び究極的に
は、付随する重大な合併症を伴って、腎臓不全を導く。
少なくともアミノ酸107〜111（すなわちアミノ酸107
−111〜107−173）及びその誘導体を含んで成るPTHrPの
カルボキシル末端フラグメントは骨吸収の可能性あるイ
ンヒビターであることが現在発見された。この驚くべき
観察は、骨吸収を促進する“完全な"PTHrP及びそのＮ−
末端フラグメントの主活性とは著しく異なっている。本
発明は、この驚くべき発見に基づいて予測される。
本発明の第１の観点によれば、PTHrP107−138が特異
的に排除されている条件下で、PTHrPの少なくともアミ
ノ酸107−111又はその誘導体から成るPTHrPのカルボシ
キル末端フラグメントを含んで成る、骨吸収阻害活性を
有する化合物が供給される。
従って、本発明のこの観点によれば、前記化合物は、
アミノ酸107−111〜アミノ酸107−173のPTHrP及びその
誘導体のいづれかのカルボキシル末端フラグメント、す
なわち５〜66個のアミノ酸を含んで成るペプチド、を含
む。たとえば、そのような化合物は、PTHrP（107−11
1）、PTHrP（107−112）、PTHrP（107−119）、PTHrP
（107−132）、PTHrP（107−150）及びPTHrP（107−17
3）を含む。そのようなフラグメントのすべてはPTHrPの
アミノ酸107−111を含むので、それらは骨吸収阻害活性
を含むであろう。
PTHrPのアミノ酸107のアミノ末端は、加水分解可能な
保護基により保護され得る。用語“加水分解可能な保護
基”とは、遊離Ｎ−末端を付与するために加水分解でき
る（たとえば酸加水分解、塩基加水分解、タンパク質加
水分解性又は他の酵素による酵素加水分解及び同様の手
段により）いづれかの基を言及するためにその広い態様
で使用される。アミノ保護基は当業界において良く知ら
れており、そしてたとえばGreenなど。（1981,Protecti
ve Groups in Organic Synthesis,John Wiley ＆ Sons,
Inc.,これは引用により本明細書に組込まれる）に記載
されている。加水分解可能な保護基の例は、次のものを
包含する： アシル、特に有機アシル、たとえば置換された又は置
換されていない脂肪族炭化水素−オキシカルボニル、た
とえば アルコキシカルボニル（たとえばメトキシカルボニ
ル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブト
キシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、５−ペント
キシカルボニル）、 ハロアルコキシカルボニル（たとえばクロロメトキシ
カルボニル、トリブロモエトキシカルボニル、トリクロ
ロエトキシカルボニル）、 アルカン−又はアレン−スルホニルアルコキシカルボ
ニル（たとえば２−（メシル）エトキシカルボニル、２
−（ｐ−トルエンスルホニル）・エトキシカルボニ
ル）、 アルキルチオ−又はアリールチオアルコキシカルボニ
ル（たとえば２−（エチルチオ）エトキシカルボニル、
２−（ｐ−トリルチオ）エトキシカルボニル）、置換さ
れた又は置換されていないアルカノイル、たとえばハロ
（低級）アルカノイル（たとえばホルミル、トリフルオ
ロアセチル）、 単環性又は融合された環状−脂肪族オキシカルボニル
（たとえばシクロヘキシルオキシカルボニル、アダマン
チルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニ
ル）、 置換された又は置換されていないアルケニルオキシカ
ルボニル（たとえばアリルオキシカルボニル）、 置換された又は置換されていないアルキニルオキシカ
ルボニル（たとえば1,1−ジメチルプロパルジルオキシ
カルボニル）、 置換された又は置換されていないアリールオキシカル
ボニル（たとえばフェノキシカルボニル、ｐ−メチルフ
ェノキシカルボニル）、 置換された又は置換されていないアラルコキシカルボ
ニル（たとえばベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニル、ｐ−フェニルアゾベンジル
オキシカルボニル、ｐ−（ｐ−メトキシフェニルアゾ）
−ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキ
シカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、
α−ナフチルメトキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソ
プロポキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニ
ル）、 置換された又は置換されていないアレネスルホニル
（たとえばベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニ
ル）、 置換された又は置換されていないジアルキルホスホリ
ル（たとえばジメチルホスホリル）、 置換された又は置換されていないジアラルキルホスホ
リル（たとえば0,0−ジベンジルホスホリル）、 置換された又は置換されていないアリールオキシアル
カノイル（たとえばフェノキシアセチル、ｐ−クロロフ
ェノキシアセチル、２−ニトロフェノキシアセチル、２
−メチル−２−（２−ニトロフェノキシ）プロピオニ
ル）、 置換された又は置換されていないアリール、たとえば
フェニル、トリル； 置換された又は置換されていないアラルキル、たとえ
ばベンジル、ジフェニルメチル、トリチル又はニトロベ
ンジル、 又は１又は複数のアミノ酸、アミノ酸保護基に関して
は、PTHrPのアミノ酸106は、アミノ酸107の遊離Ｎ−末
端を生成するためにタンパク質分解によりPTHrPのカル
ボニル末端フラグメントから切断できる。本発明の化合
物がPTHrPアミノ酸106を含む場合、 〔F110;W117;D122;A133又はE141〕PTHrP106−141が特異
的に排除されることが理解される。上記から明らかなよ
うに、特にヒト身体、たとえば血流又は消化管における
条件下で加水分解できるいづれかのアミノ酸保護基が本
発明において利用され得る。
PTHrPのアミノ酸107−111は、驚くべきことには、ア
ミノ酸配列における有意な変動が骨吸収阻害活性の損失
を伴わないで耐えられることにおいて、柔軟である。本
発明の化合物の誘導体は、下記に示されるような式
（Ｉ）及び（II）により示され得る： 式中： Ａは、いづれかのアミノ酸の残基、好ましくは遊離Ｎ
−末端又は加水分解可能な保護基により保護されたＮ−
末端を有するThr,Ala又はCysであり； Ｂは、アミノ酸の塩基性残基、好ましくは、場合によ
っては、ハロゲン、C1-3アルキル及び／又はC1-3のアル
コキシにより１又は複数のメチレン基で置換されている
Arg又はホモArgであり； Ｃは、アミノ酸の非極性又は荷電されていない極性残
基、好ましくはSer,Ala,Thr又はCysであり、ここでヒド
ロキシル又はスルフィドリル基は生理学的に加水分解で
きるエステル又はエーテルを付与するために任意にエス
テル化又はエーテル化され； Ｄは、アミノ酸の非極性又は荷電されていない極性残
基、好ましくはAla,Gly,アミノイソ酪酸、Met,Ser,Thr
又はCys（任意に、生理学的に加水分解できるエステル
又はエーテルによりエステル化又はエーテル化され得
る）であり； Ｘは、芳香族アミノ酸の側鎖、好ましくはTyr,Phe,メ
チル フェニル アラニン又はナフチル アラニンであ
り、ここでいづれかのそのようなアミノ酸のフェニル環
はハロゲン、NO2,NH2,OH,C1-3アルキル及び／又はC1-3
アルコキシにより任意に置換され；そして Ｚは次のものである、 −COOR1、ここでR1はＨ又はC1-3低級アルキルであ
り； −（AA）（AA）ｎ、ここでAAはいづれかのアミノ酸で
あり、ｎは０〜40の整数であり、ここでｎが１以上であ
る場合、AAは同じであっても又は異なっていても良く、
そして好ましくは少なくとも１つのAAが分子を安定化で
きるジスルフィド結合の導入を促進するためにCysであ
り； −CH2OR2、ここでR2は水素又は生理学的に許容でき、
生理学的に加水分解できるエステル又はエーテルの残基
であり； ここで、 R3は水素、C1-3アルキル、フェニル、ベンジル又はC
9-10フェニルアルキルであり、 R4は水素、C1-3アルキル、又はR3が水素又はメチルで
ある場合、式−CH（R5）−Ｕであり、ここで R5は水素、−（CH2）２−OH又は−（CH2）３−OHであ
り、又は天然α−アミノ酸のα−炭素原子に結合する置
換基を表し；そしてＵは式 であり、 ここで R1及びR2は上記の通りであり、 R6は水素又はC1-3アルキルであり、そして R7は水素、C1-3アルキル、フェニル又はC7-10フェニ
ルアルキルであり、ここで前記基−CH（R5）−ＵがＤ−
又はＬ−配置を有し； 但し、PTHrP107−138は特異的に排除され；そしてＡ
がSerである場合、ＣはThrではない。
式（II）の化合物は、下記式を有する： DWDADSDRDT （II） 式中、W,A,S,R及びＴは標準の１文字コードを用いてア
ミノ酸を表わし、そしてＤはＤ−アミノ酸配置を示す。
塩基性非極性及び荷電されている極性残基は、当業界
において良く知られており、そしてたとえばLehninger
（Bio−chemistry、第２班、Worth Publishers Inc.197
8;これは引用により本明細書に組込まれる）に記載され
る。
式（Ｉ）のアミノ酸は、Ｄ−又はＬ−配置で存在する
が、但し、その得られるペプチドは骨吸収阻害活性を有
し、その活性は本明細書に記載されるような通常のバイ
オアッセイにより容易に試験され得る。ペプチドはＤ−
又はＬ−配置又はその組合わせでアミノ酸を含むことが
できる。好ましくは、式（Ｉ）の化合物はＬ−配置で存
在する。
前で言及したように、出願者は、アミノ酸107での遊
離Ｎ−末端が一般的に骨吸収阻害活性のために必要であ
ることを見出した。しかしながら、Ｎ−末端加水分解可
能保護基を含む本発明の化合物はまた、骨吸収阻害活性
を有し、ここで前記保護基は、動物の消化管又は血流に
おいて分解される。
対照的に、本発明の化合物のカルボキシル末端官能価
の性質は、その化合物が骨吸収阻害活性を有する限り、
重要なものではない。一般的に、カルボキシル末端官能
価は、ペプチド摂取、能力又は安定性を高めるために選
択される。これに関しては、たとえばC1-5アルキル基を
含む、生理学的に加水分解可能なエステル又はエーテル
がペプチド摂取及び／又は安定性を高めることができ
る。
本明細書で使用される場合、用語“PTHrPのカルボキ
シル末端フラグメント”とは、PTHrPのアミノ酸107−11
1〜アミノ酸107−173を言及する。これらのカルボキシ
ル末端フラグメントはまた、オステオスタチンとしても
知られている。
上記に示される式（Ｉ）及び（II）のアミノ酸107−1
11及びその誘導体を含む化合物は、それらが分子量、生
化学的性質及びPTHrPの大きな方のカルボキシル末端フ
ラグメント及びその誘導体よりも容易な合成のような性
質において従来の医薬試薬により類似するので、特に好
都合である。
低分子量ペプチド及びその合成は特に、標準の固相
（Kent,S.B.H.,Ann.Rev.Biochem〔1988〕57,957〜989）
又は液相タンパク質合成技法（Finn,F.M.,and Hofmann,
K.,The Protein,Edit Neurath,H.,Hill.R.L.,and Boede
r,C.L.,〔1976〕Academic Press New York,106〜256ペ
ージ）（それらはペプチド化学の分野において良く知ら
れている）に従う。ペプチドは、保護された又は保護さ
れていない形で２種のアミノ酸又はペプチド単位（少な
くとも１つのアミノ酸を含む）をアミド結合により連続
的に一緒に結合することによって生成される。合成ペプ
チドは、当業界で良く知られた技法、たとえばアミノ酸
分析、逆相HPLC及び細管電気泳動を用いて特徴づけられ
る。
従って、アミノ酸又はその誘導体はペプチド鎖中にア
センブルされ、式（Ｉ）の化合物が得られる。ペプチド
合成は、固体支持体上で又は溶液相において生じ、その
後、得られるペプチドは適切な試薬により処理され、保
護基が除去され、固相から切断され、そしてその後、分
子量（サイズ排除クロマトグラフィー）、電荷（カチオ
ン及びアニオン交換）、疎水性度及び同様のものに基づ
いて標準の技法により精製される。ペプチドの一般的に
均質形で供給され、又は実質的に純粋であり、すなわち
少なくとも90重量％及び好ましくは95重量％又はそれ以
上の所望するペプチドを含んで成る。
例によれば、PTHrPのカルボキシル末端フラグメント
は、Fmoc又はｔ−Boc化学（Kent,前記）、又は当業界で
良く知られている他のタンパク質合成方法に従って調製
され得る。
PTHrPカルボキシル末端フラグメント及びその誘導体
は、組換え細胞培養で構造され、特にここで、前記フラ
グメントは約15個又はそれ以上のアミノ酸を含んで成
る。それを行うためには、まず、特定のPTHrP C−末端
フラグメントをコードする核酸を確保することが必要で
ある。これは、Suvaなど．（前記）により記載されるよ
うに、標準合成方法に従ってのヌクレオチド合成によ
り、又はPTHrPをコードするヒトcDNAの操作によりもた
らされる。いったん適切なDNAフラグメントが調製され
れば、追加のクローニング又は発現のためにPTHrPをコ
ードする核酸を複製できるベクター中に挿入することは
当業者のための簡単なことである。ベクターは、適合す
る宿主細胞（宿主−ベクターシステム）と共同して２種
の機能を行うために有用である。１つの機能は、PTHrP
のカルボキシ末端フラグメントをコードする核酸のクロ
ーニングを促進し、すなわち核酸の有用な量を生成する
ことである。他の機能は、PTHrPのカルボキシ末端フラ
グメントの発現を方向づけることである。それらの機能
の１つ又は両者は、ベクター宿主システムにより行われ
得る。
発現又はクローニングベクター、並びにPTHrPのカル
ボキシ末端フラグメントの発現のために使用され得る宿
主細胞は、当業者に良く知られており、そしてたとえば
Maniatisなど．（Molecular Cloning,A Laboratory Man
ual,Cold Spring Harbor Laboratory,1982）により記載
されている。
発現及びクローニングベクターは、１又は複数の選択
された宿主細胞においてベクターの複製を可能にするヌ
クレオチド配列を含む。そのような配列は種々の細菌及
びウィルスにおいて良く知られている。
発現及びクローニングベクターは、ベクター含有細胞
の同定のための選択可能マーカーとしても知られる選択
遺伝子を含むべきである。そのような遺伝子は一般的
に、ベクターにより形質転換された宿主細胞の生存又は
増殖のために必要なタンパク質生成物をコードする。選
択可能マーカーは当業界において良く知られている。
他のクローニングベクターと違って発現ベクターは、
宿主生物により認識され、そしてPTHrPカルボキシ末端
フラグメントをコードする核酸に操作可能的に結合され
るプロモーターを含むべきである。PTHrPカルボキシ末
端フラグメントは、真核又は原核細胞、たとえば細菌、
酵母、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の複細胞生物から
の核細胞において発現され得る。
PTHrPのカルボキシ末端フラグメントは好ましくは、
分泌されたタンパク質として細胞培養物から回収される
が、但し、それらは分泌配列を伴わないで直接的に発現
される場合、宿主細胞溶解物から回収され得る。分泌さ
れ又は回収された生成物は、良く知られたタンパク質精
製段階、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー及び同様の方法により精製され得る。
PTHrPのカルボキシル末端に対応する低分子量ペプチ
ド、たとえばPTHrP（107−111）及び式（Ｉ）の化合物
が特に好ましい場合、組換え方法よりむしろペプチド合
成技法が一般的に使用されるであろう。
アミノ酸107−111及び112〜173までのPTHrPの追加の
アミノ酸を含んで成る、PTHrPのカルボキシル末端フラ
グメントはまた、特に骨吸収阻害活性に対してそれ自体
寄与しないアミノ酸112−173の領域においては、変動を
受けやすい。従って、PTHrPのアミノ酸112−173は、当
業界において良く知られた変動、たとえばアミノ酸の置
換、欠失、挿入又は変性を受けやすいが、但しそのよう
な変異体は骨吸収阻害活性を有する。
通常、誘導体は実質的な変異体であり、ここでPTHrP
のカルボキシ末端フラグメントにおける少なくとも１つ
の残基が欠失されており、そして他の残基がその位置に
挿入されている。置換は典型的には、次の表に従って行
われる： 挿入は、Ｎ−又はＣ−末端結合のいづれかで選択され
た残基に隣接して導入され、そして好ましくは、対で導
入れれる。
ほとんどの置換及び挿入は、PTHrPカルボキシ末端フ
ラグメントの特徴において基の変化を生成しないであろ
う。本発明で使用され得るPTHrPのカルボキシ末端フラ
グメントの置換及び挿入変異体は、骨吸収阻害活性を有
する。
本発明のアミノ酸配列変異体は好ましくは、野性型ア
ミノ酸配列をコードするDNA配列を変異誘発することに
よって構成される。一般的に、DNAの特定領域又は部位
が変異誘発のために標的決定され、そして従って、それ
を達成するために使用される一般的な方法は、部位特異
的突然変異誘発として言及される。その変異誘発は、DN
A変性酵素、たとえば制限エンドヌクレアーゼ（特定位
置でDNAを切断する）、ヌクレアーゼ（DNAを劣化する）
及び／又はポリメラーゼ（DNAを合成する）を用いて行
われる。
DNAの制限エンドヌクレアーゼ消化、続く連結は、Sam
brookなど．（Molecular Cloning: A Laboratory Manua
l,第２版、Cold Spring Habor Laboratory Press,New Y
ork〔1989〕のセクション15.3に記載されるように、欠
失を生成するために使用され得る。この方法を使用する
ためには、外来性DNAがプラスミドベクター中に挿入さ
れることが好ましい。外来性（挿入された）DNA及びベ
クターDNAの両者の制限地図は利用されるべきである。
又は外来性DNA及びベクターDNAの配列は知られるべきで
ある。外来性DNAは、ベクターには存在しないユニーク
制限部位を有すべきである。次に、欠失は、酵素の製造
業者により提案される条件下で適切な制限エンドヌクレ
アーゼを用いて、外来性DNAをそれらのユニーク制限部
位間で消化することによってその外来性DNAに製造され
る。使用される制限酵素がブランド末端又は適合性末端
を創造する場合、それらの末端は、Sambrookなど．（前
記）のセクション1.68に記載されるように、リガーゼ、
たとえばバクテリオファージT4 DNAリガーゼを用い、そ
してその混合物を16℃で１〜４時間、ATP及びリガーゼ
緩衝液の存在下でインキュベートすることによって直接
的に一緒に連結され得る。末端が適合性でない場合、そ
れらはまず、DNAポリメラーゼＩ又はバクテリオファー
ジT4 DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いる
ことによってブラント化されるべきであり、ここで前記
両者は、消化されたDNAのオーバーハング一本鎖端をフ
ィルインするために４種のデオキシリオヌクレオチドト
リホスフェートを要する。他方、それらの末端は、ヌク
レアーゼ、たとえばヌクレアーゼS1又はヤエナリ（mung
−bean）ヌクレアーゼを用いてブラント化され得、ここ
で前記の両者はDNAのオーバーハング一本鎖を再び切断
することによって機能する。次に、DNAはリガーゼを用
いて再連結される。得られる分子は欠失変異体である。
類似する手段が、Sambrookなど．（前記）のセクショ
ン15.3に記載しているようにして挿入変異体を構成する
ために使用され得る。ユニーク制限部位での外来性DNA
の消化の後、オリゴヌクレオチドが、外来性DNAが切断
された部位中に連結される。オリゴヌクレオチドは、挿
入されるべき所望するアミノ酸をコードするように消化
され、そしてさらに、直接的な連結が可能なように、消
化された外来性DNAの末端と適合できる５′及び３′末
端を有する。
オリゴヌクレオチド−特異的変異誘発は、本発明の置
換変異体を調製するために好ましい方法である。それ
は、欠失及び挿入変異体を便利に調製するためにも使用
され得る。この技法は、Adelmanなど.,（DNA,2:183〔19
83〕）により記載されているように、当業界においては
良く知られている。
置換された１つ以上のアミノ酸を有する変異体は、い
くつかの方法のうちの１つにより生成され得る。アミノ
酸がポリペプチド鎖に隣接して一緒に位置する場合、そ
れらは所望するアミノ酸置換のすべてをコードする１つ
のオリゴヌクレオチドを用いて同時に変異誘発され得
る。しかしながら、アミノ酸がお互い同じ距離に位置す
る場合（たとえば10個以上のアミノ酸により分離され
る）、所望する変化のすべてをコードする一本のオリゴ
ヌクレオチドを生成することはより困難である。代わり
に、２種の方法のうち１つの方法が使用され得る。第１
の方法においては、別々のオリゴヌクレオチドが置換さ
れるべき個々のアミノ酸のために生成される。次に、そ
れらのオリゴヌクレオチドが一本鎖鋳型DNAに同時にア
ニールされ、そしてその鋳型から合成されるDNAの第２
の鎖が所望するアミノ酸置換のすべてをコードするであ
ろう。他の方法は、所望する変異体を生成するために変
異誘発の複数のルートを包含する。第１のルートは、単
一変異体のために記載される通りである。第２のルート
は、鋳型として変異誘発の第１のルートで生成された変
異DNAを利用する。従って、この鋳型はすでに１又は複
数の変異を含む。次に、追加の所望するアミノ酸置換を
コードするオリゴヌクレオチドがこの鋳型にアニールさ
れ、そして得られるDNAの鎖は、変異誘発の第１及び第
２のルートの両者からの変異誘発をコードする。この得
られるDNAは、同じように、変異誘発の第３のルートに
おいて鋳型として使用され得る。
PTHrPのアミノ酸107−111〜107−173のカルボキシル
末端フラグメント及び式（Ｉ）及び（II）の化合物の誘
導体はまた、対象のフラグメントの標的決定されたアミ
ノ酸残基と、選択された鎖、末端残基又は官能基と組合
うことができる有機又は他の誘導体化剤とを反応せし
め、又は選択された組換え宿主細胞において機能する機
構又は後翻訳変性を管理することによっても生成され得
る。
システイニル残基はα−ハロアセテート（及び対応す
るアミン）、たとえばヨード酢酸又はヨードアセトアミ
ドと最も反応され、カルボキシメチル又はカルボキシア
ミドメチル誘導体が付与される。システイニル残基はま
た、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−
（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセトール
ホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−
２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスル
フィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロ
メルクリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニト
ロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応によ
り誘導体化される。確かなPTHrPはシステイン残基をほ
とんど欠いているので、有機誘導体化は、挿入性又は置
換性システイン−含有PTHrPカルボキシ末端変異体、た
とえば免疫原ペプチドへの架橋を促進するためにＮ又は
Ｃ−末端システインが挿入されているPTHrPカルボキシ
末端フラグメントによってのみ適用できる。
ヒスチジル残基は好ましくは、pH5.5〜7.0でジエチル
ピロカルボネートとの反応により誘導体化される。なぜ
ならば、その物理はヒスチジル側鎖に対して比較的特異
的であるからである。パラーブロモーフェナシルプロミ
ドまたは有用であり；その反応はpH6.0で、0.1Mのカコ
ジル酸ナトリウムにおいて行われるべきである。
シシニル及びアミノ末端残基が、無水琥珀酸又は他の
無水カルボン酸と反応せしめられる。それらの物質によ
る誘導体化は、シニニル残基の変化を逆にする効果を有
する。αアミノ含有残基を誘導体化するための他の適切
な試薬は、イミドエステル、たとえばメチルピコリンイ
ミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサー
ル；硼水素化物；トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メ
チルイソウレア;2,4−ペンタンジオン；及びグリオキシ
レートとのトランスアミナーゼ触媒化反応を包含する。
アルギニル残基は、いくつかの従来の試薬、たとえば
フェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シ
クロヘキサンジオン及びニンヒドリンの中の１つの試薬
との反応により変性される。アルギニン残基の誘導体化
は、その反応が、グアニジン官能基の高いpKaのために
アルカリ条件下で行われることを必要とする。さらに、
それらの試薬は、リシンのε−アミノ基及びアルギニン
のω−アミノ基と反応できる。
チロシル残基自体の特定の変性は、芳香族ジアゾニウ
ム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によりチロシ
ル残基中へのスペクトルラベルを導入することへの特定
の興味を伴って、集中的に研究されて来た。最も通常に
は、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタン
が、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘
導体を形成するために使用される。チロシル残基は、ラ
ジオイムノアッセイへの使用のために、ラベルされたタ
ンパク質を調製するために125I又は131Iを用いてヨウ素
化され、ここでクロラミンＴ方法がこの目的のために広
く採用される。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）
は、カルボジイミド（Ｒ′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、たと
えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−
（４）−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−
（４−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル）−カルボジ
イミドとの反応により選択的に変性される。さらに、ア
スパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオン
との反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に
転換され、ここでこれは、アスパラギン及びグルタミン
をコードするように核酸を変異誘発するもう１つの手段
である。
二官能物質による誘導体化は、免疫原性ポリペプチド
を有するタンパク質の分子間凝集物を調製するために、
並びに抗体のアッセイ又はアフィニティー精製への使用
のために水不溶性支持体マトリックス又は表面にカルボ
キシル末端フラグメントを架橋するために有用である。
通常使用される架橋剤は、1,1−ビス（ジアゾアセチ
ル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば４−アジ
ドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能価イミドエステ
ル、たとえばジスクシンイミジルエステル、たとえば3,
3′−ジチオビス（スリミンイミジル−プロピオネー
ト）、及び二官能価マレイミド、たとえばビス−Ｎ−マ
レイミド−1,8−オクタンを包含する。誘導体化剤、た
とえばメチル−３−〔（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕
プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成できる
光活性中間体を生成する。他方、反応性水不溶性マトリ
ックス、たとえば臭化シアン活性化炭水化物及びアメリ
カ特許第3,969,287号；第3,691,016号；第4,195,128
号；第4,247,642号；第4,229,537号及び第4,330,440号
に記載される反応性物質がタンパク質固定化のために使
用される。
本発明の化合物が組換え的に生成される場合、発現さ
れたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用に起因
するある後翻訳誘導体化が生じる。“組換え宿主細胞”
とは、ACSFのカルボキシル末端フラグメントを発現する
発現ベクターを含む、原核又は真核細胞、たとえばE.コ
リ、種々のタイプの酵母細胞、CHO細胞及び同様のもの
を意味する。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、
その対応するグルタミル及びアスパルチル残基に後−過
渡的に脱アミノ化され得る。他方、それらの残基は、温
和な酸性条件下で脱アミノ化される。それらの残基のい
づれかの形が、本発明の範囲内に存在する。
他の後翻訳変性は、プロリン及びリシンのヒドロキシ
ル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル化のリ
ン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のメチ
ル化（T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecul
ar Properties,W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco 79
〜86ページ〔1983〕）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、
及びＣ−末端カルボキシルのアミド化を包含する。
PTHrPのカルボキシ末端変異体又は誘導体の活性は、
その変異体又は誘導体が骨吸収阻害活性を有するかいな
かを決定するためには、通常のスクリーニングアッセイ
により容易に評価され得る。たとえば、破骨細胞は骨の
断片上に沈着され、そして試験化合物の存在下及び不在
下でインキュベートされ得る。破骨細胞は組織化学的に
決定され得、そして次に、たとえば超音波処理により、
骨断片とのインキュベーションに続いて、除去され得、
そして骨表面が単離された破骨細胞当たりに生成される
吸収ピットを測定するために顕微鏡により試験され得
る。吸収ピットの数が計数され、そしてそれらの面積
が、たとえばディジタル化された形態測定器（morphome
tey）により定量化する。骨吸収に対しての阻害活性を
有する変異体又は誘導体はもちろん、骨の吸収において
破骨細胞の活性を阻害し、このことは、骨断片の分析に
より容易に確認され得る。同様に、骨吸収の阻害に効果
を有さない又は骨吸収を刺激する変異体又は誘導体は、
骨断片上での吸収ピットの形成により明示されるであろ
う。
他の便利なアッセイがまた、PTHrPカルボキシ末端フ
ラグメントの変異体及び誘導体の活性を検出するために
使用され得る。
PTHrPのカルボキシル末端フラグメント及びその誘導
体は、ナトリウム、カリウム、ホスフェート、クロリド
及び同様のもののようなイオンとの非毒性塩として調製
され得る。一般的に、PTHrPカルボキシ末端フラグメン
トはリン酸緩衝溶液に貯蔵され、又は賦形剤、たとえば
糖アルコール、たとえばマンニトール又はソルビトー
ル；単糖類、たとえばグルコース、マンノース、ガラク
トース又はフルクトース；オリゴ糖類、たとえばマルト
ース、ラクトース又はスクロース；及びタンパク質、た
とえばヒト血清アルブミンの存在下で凍結乾燥され得
る。
前記賦形剤はまた、水性貯蔵に基づく不活性化又は沈
殿に対してのPTHrPカルボキシ末端フラグメント及び誘
導体の安定性にも寄与し、そしてそれ自体知られている
他の安定剤と一緒に使用され得る。そのような安定剤
は、キレート化剤、たとえばEDTA;酸性アミノ酸；及び
非イオン性界面活性剤、たとえばポリエチレングリコー
ル、又はポリエチレン及びポリプロピレングリコールの
ブロックコポリマーを包含する。
PTHrPカルボキシ末端フラグメントの注入又は注射の
ためのキャリヤーは、滅菌等張水溶液、たとえば注射の
ための塩溶液又は５％デオストロースであり得る。それ
らの調製物は、鼻腔内、皮下、静脈内、腹腔内又は他の
従来の投与路により注射又は注入される。
PTHrPカルボキシル末端フラグメント及びその誘導体
はまた、特効性キャリヤーにも供給され得る。適切な例
として、形状化された製品の形での半透過性ポリマーマ
トリックス、たとえば坐剤又はマイクロカプセルを挙げ
ることができる。移植できる特効性マトリックスは、Ｌ
−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートのコポ
リマー（U.Sidmanなど.,1983,“Biopolymers"22（１）:
537〜556），ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト）（R.Langerなど.,1981,“J.Biomed.Mater.Res."15:
167〜277及びR.Langer,1982,“Chem.Tech."12:98〜10
5）、エチレンビニルアセテート（R.Langerなど.,前
記）、又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（EP
133,998A）を包含する。特効性組成物はまた、リポソ
ーム的に包含されたPTHrPカルボキシ末端フラグメント
も含む。PTHrPカルボキシ末端フラグメントを含むリポ
ソームは、次に記載されるそれ自体既知の方法により調
製される:DE 3,218,121A;Epsteinなど.,1985,“Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA"82:3688−3692;Hwangなど.,1980,“Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA"77:4030−4034;EP 52322A;EP 36
676A;EP 88046A;EP 143949A;EP 142641A;日本特許出願
第83−118008号;U.S.特許第4,485,045号and第4,544,545
号；及びEP 102,324A.通常リポソームは小さな（約200
〜800Å）の単層タイプのものであり、ここで脂質含有
物は約30モル％以上のコレステロールであり、その選択
された割合は、PTHrPカルボキシ末端フラグメント結合
の最適な割合のために調節される。
本発明のもう１つの観点によれば、本明細書に記載さ
れるPTHrPのカルボキシル末端の少なくともアミノ酸107
−111又はその誘導体、並びに１又は複数の医薬的に許
容できるキャリヤー又は賦形剤を含んで成る組成物が供
給される。
本発明のもう１つの観点によれば、ジスルフィド、エ
ーテル又はアミド結合により化学的に結合された、又は
融合生成物として発現される、又は静電性、疎水性、又
は細胞毒性活性、標的決定活性（すなわち特定の細胞タ
イプのための親和性）又は骨吸収阻害活性を有する化合
物との他の同様の相互作用により関連される、PTHrPの
カルボキシル末端の少なくともアミノ酸107−111又はそ
の誘導体を含んで成るキメラ性分子が供給される。最適
な化合物は、種々の細胞タイプに結合する抗体；細胞毒
性分子、たとえばリシンのＡ−鎖及び細胞毒性薬物；及
び骨吸収阻害活性を有する化合物、たとえばカルシトニ
ンを包含する。
本発明のさらにもう１つの観点においては、骨吸収の
阻害のための方法が提供され、ここで前記方法は、PTHr
Pのカルボキシル末端の少なくともアミノ酸107−111又
はその誘導体を含んで成る化合物の骨吸収阻害効果量並
びに場合によっては、少なくとも１種の医薬的に許容で
きるキャリヤー又は賦形剤を、そのような処理の必要な
対象に投与することを含んで成る。
本発明のさらにもう１つの観点によれば、過剰骨吸収
により特徴づけられる疾病、たとえば骨粗鬆症、骨のパ
ジェット病、悪性の体液性高カルシウム血症及び転移性
骨疾患の処理方法が提供され、ここで前記方法は、PTHr
Pのカルボキシル末端の少なくともアミノ酸107−111又
はその誘導体を含んで成る化合物の骨吸収阻害効果量並
びに場合によっては、少なくとも１種の医薬的に許容で
きるキャリヤー又は賦形剤を、そのような処理の必要な
対象に投与することを含んで成る。
患者へのPTHrPのカルボキシル末端フラグメントの投
与の量、キャリヤー、頻度及びルートは、多くの要因の
中で、患者の状態、標的疾患、投与の所望するルート及
びカルボキシル末端フラグメントの活性に依存するであ
ろう。これは、治療の間、医者により容易に決定され、
そしてモニターされる。
単に例示的ではあるが、PTHrPのカルボキシル末端フ
ラグメントの骨吸収阻害有効量は、0.01μｇ〜1g又はこ
れ以上である。PTHrPのカルボキシ末端フラグメントの
投薬単位は、約0.05μｇ〜10mg、好ましくは１μg;及び
より好ましくは10μｇ〜50μｇの活性剤を含んで成る。
再び、単に例示的ではあるが、PTHrPの骨吸収阻害有効
量は、0.001μｇ〜1mgのPTHrP/Kg体重である。
PTHrPのカルボキシル末端フラグメントは、注射によ
り、たとえば静脈内、筋肉内、皮下又は腫瘍内注射によ
り患者に投与され得る。他方、投与は、鼻腔内、皮下、
静脈内、腹腔内又は他の同様のルートを用いて注入によ
り行われ得る。追加の投与は、経口、直腸、経皮、又は
薬理学的に活性な化合物の投与のために当業界において
良く知られている投与の他の従来のルートにより行われ
得る。
本発明の種々の観点は、次の図及び例により例示され
るが、それらは本発明を限定するものではない。
図１は、プレプロ−PTHrPのアミノ酸配列を示し； 図２は、ピット数／破骨細胞（OC）数として測定され
る、骨吸収に対するPTHrPペプチド１−141（対照）、10
7−139,107−139,154−173,129−139及び鶏PTHrP（107
−139）の効果を示す。ペプチドは、1nMの濃度で使用さ
れた； 図３は、図２と実質的に同じであり、そして対照（PT
HrP 1−141）及びPTHrP 107−139に比較しての、骨吸収
に対する種々の濃度でのPTHrP（107−111）の効果を示
し；そして 図４は、種々のペプチドに関する用量応答図を示し、
ここで吸収ピット／処理された破骨細胞／対照の比が対
数〔ペプチド〕モル濃度でプロットされている。
例１ 破骨細胞の単離及び骨吸収に対するアッセイ： 破骨細胞を、新生雌Wistarラットの長骨を培養培地
（HEPES−緩衝化Medium 199〔Flow Laboratoriesの商
標〕）にキューレットでかき取ることによってそのラッ
トから単離した。得られた細胞懸濁液を、すすぐ前、20
分間、除活されたウシ皮質骨の100μｍの厚さのスライ
ス上に固定した。この短い固定期間の後、大部分の汚染
細胞をすすぎ段階で除去し、機能的に純粋な破骨細胞の
集団を得た。次に、前記骨スライスを、組織培養培地
（100iu/mlのベンジルペニシリン、100μg/mlのストレ
プトマイシン及び10％の熱不活性化されたウシ胎児血清
により補充されたイーグルの最少必須培地〔Flow Labor
atories〕において、試験物質の存在下又は不在下で、9
5％空気、５％CO2下で7.3のpHで37℃でインキュベート
した。24時間後、細胞を固定し、タルトレート耐性酸ホ
スファターゼ（TRACP）と細胞化学的に反応せしめ、そ
してTRACPのために強い反応を有する複数核細胞の数
（すなわち破骨細胞）を計数した。次に、細胞を0.25M
のNH4OHにおける超音波処理によりはぎ取り、その後、
走査電子顕微鏡のために処理した。個々の骨スライスの
全表面を走査し、そして吸収ピットの数を計数した。選
択された実験においては、ピットの深さを評価する。個
々のペプチドのために個々の濃度点で最少６個の複製体
が存在した。個々の実験は少なくとも３度くり返され
た。統計学的有意性は、個々の処理と対照とを比較する
ために、Stuclent′ｓと試験を用いて決定された。骨吸
収は、ピット数/OC/骨スライス、合計の掘られる計画部
分/OC/骨スライス又は骨の合計の掘られた体積/OC/骨ス
ライスとして示され得る。そのようなアッセイは日常的
であり、そして骨吸収阻害活性のために多数の化合物の
スクリーニングに容易に従う。
例２ ペプチドの調製及び精製： 組換えhPTHrP（１−141）及び組換えhPTHrP（１−10
8）を、前に記載されたようにして調製し、そして精製
した（Suvaなど.,前記；引用により本明細書に組込まれ
る）。hPTHrP（107−139）Thr Arg Ser Ala Thp Leu As
p Ser Gly Val Thr Gly Ser Gly Leu Glu Gly Asp His
Leu Ser Asp Thr Ser Thr Thr Ser Leu Glu Leu Asp Se
r Arg−COOH,及び他のペプチドを、APplied Biosystems
Pepticle Synthesizer Model 430を用いて、カルボキ
シ−末端アミドとして合成した。HF分解に続いて、ペプ
チドを、60％（v/v）のアセトニトリル及び0.1％（v/
v）のトリフルオロ酢酸により樹脂から抽出し、そして
凍結乾燥せしめた。粗ペプチドを、0.1％のトリフルオ
ロ酢酸の存在下で、アセトニトリルグラジエントを含む
イオン交換クロマトグラフィー（2.5×90cmのカラム、C
18,20〜30μm,300Å樹脂、Vydac,California）により精
製した。合成ペプチドの組成物を、Beckman 6300アミノ
酸分析器を用いての定量アミノ酸分析により評価した。
環状AMPアッセイ；破骨細胞を上記のようにして、12−
ウェル組織培養プレート（Linbro）に分離した。その培
養物をイソブチルメチルキサンチン（1mM）により20分
間、前処理し、その後、試験ペプチドの投与を10分間に
わたって行った。環状AMPを95％（v/v）エタノール/1mM
のHClにより抽出し、そしてラジオイムノアッセイによ
り測定した。４〜６個の複製物ウェルを、個々の処理グ
ループに使用した。
例３ PTHrPのカルボキシ末端配列に対応するペプチドを、
次のようにして合成した： PTHrP（107−141） PTHrP（107−132） PTHrP（107−119） PTHrP（107−111） PTHrP（129−141） PTHrP（129−139） PTHrP（154−173）−PTHrPのもう１つのスプライシン
グに基づく配列 PTHrP（１−141） ニワトリPTHrP（107−139） それらのペプチドを、Applied Biosystems Synthesiz
erに基づいて固相技法により合成し、そしてイオン交換
クロマトグラフィー及び逆相HPLCにより精製した。ペプ
チドのアミノ酸含有量を、Beckman Amino Acid Analyze
rを用いて、加水分解の後決定した。
上記ペプチドを合成し、破骨細胞性骨吸収を担当す
る、PTHrPのカルボキシ末端領域の部分を決定した。ヒ
トPTHrP（107−139）及び（107−132）並びにニワトリP
THrP（107−139）は例１に従って決定された吸収の実質
的な阻害を生成するが、図２から明らかなように、PTHr
P（129−139）、PTHrP（154−173）又はPTHrP（１−14
1）（対照）は何の効果も示さない。
図３は、ペプチドPTHrP（107−111）が10-9〜10-15M
で破骨細胞性骨吸収の可能性あるインヒビターであるこ
とを示す。PTHrP（107−139）は、PTHrP（107−119）と
同じような活性を有する（データは示されていない）。
PTHrP（107−139）のために作動するシグナルトラン
スダクション機構は、カルシトニンのための機構とは区
別できるように思われる。サケカルシトニンに対して2.
5倍の応答に比較して、PTHrP（107−139）に対しての応
答における環状AMDの上昇は存在しなかった。
破骨細胞に対するPTHrP（107−139）の効果は、タン
パク質キナーゼＣインヒビターH7（１−（５−イソキノ
リンスルホニル）−２メチルピペラジンにより阻止され
得る。
PTHrP（107−111）による骨吸収阻害活性は、この例
から明らかである。この配列を含む、PTHrPのカルボキ
シ末端フラグメントはまた、骨吸収阻害において活性的
である。従って、アミノ酸107−111を含む、PTHrPのい
づれかのカルボキシ末端フラグメントは、破骨細胞性骨
吸収を阻害することにおいて活性的である。
例４ 効果的なアミノ末端切断及び拡張： 配列PTHrP（107−111）に対するアミノ末端切断及び
拡張を研究した。
例３の方法に従って、化合物を合成し、そして例１の
方法に従って骨吸収阻害活性についてアッセイした。効
果は表２に示される。アミノ酸は、標準の一文字アミノ
酸コードを用いて示され、そして骨吸収阻害活性は
“＋”により示され、そして不活性は“−”により示さ
れる。
ペプチドPTHrP（109−139）は活性でなく、そしてペ
プチドPTHrP（108−139）のデータも活性でないことを
示した。これは、PTHrPのアミノ酸107−111が骨吸収阻
害活性のために必要とされることを明白に示す。
アミノ酸107での遊離Ｎ−末端の臨界性を、ペプチドT
RASWへのＲ基（アルギニン）の付加により研究した。Ｒ
はPTHrPの位置106に見出されるアミノ酸である。このペ
プチドは、PTHrP（107−111）の活性の約10％を示し
た。遊離Ｎ−末端はPTHrPのカルボキシ末端フラグメン
トのアミノ酸107では必要とされないが、又はむしろ、
ペプチドPTHrP（106−111）におけるアミノ酸106が切断
され、PTHrP（107−111）を付与することがこの結果か
ら推定され得る。
上記二者択一を研究するために、Ｄ−アミノ酸形にお
けるＲをペプチドTRSAWに付加し、DRTRSAWを得た。Ｄ−
アミノ酸は、タンパク質分解酵素によりタンパク質加水
分解されない。従って、PTHrP（106−111）がアミノ酸1
07で遊離アミノ末端を生成するためにアミノ酸106の切
断により活性的になる場合、Ｄ−アミノ酸を有する誘導
体、特にDRは不活性であることが予測される。PTHrPの
カルボキシ末端フラグメントのアミノ酸107で遊離Ｎ−
アミノ酸末端が必要とされず、且つさらに、位置106で
のアミノ酸の性質が重要でない場合、誘導体DRTRSAWは
活性的であることが予測される。上記に示される結果
は、PTHrPのアミノ酸106に対応するＤ−アミノ酸の付加
がTRSAWペプチドの活性を破壊することを示す。従っ
て、アミノ酸107での遊離Ｎ−末端は必要とされる。保
護基がPTHrPカルボキシルフラグメント又はその誘導体
のアミノ酸107から切断されない場合、骨吸収阻害活性
は失われる。
さらに、この観点のための支持は、ペプチドPTRSAWに
より明らかである。Ｐにより示されるようなアミノ酸プ
ロリンは、ペプチド鎖からタンパク質分解酵素により一
般的に切断できない。予測されるように、PTHrPのカル
ボキシル末端フラグメントのアミノ酸106としてのプロ
リンの存在は、活性を破壊する。
PTHrP（106−111）に対応するペプチドRTRSAWは骨吸
収阻害活性を有するので、加水分解可能基はアミノ酸10
7のアミノ末端及びその誘導体に付加され得る。アミノ
酸107のＮ−末端へのトリフルオロ酢酸（TFA）の付加を
包含する実験はまた、そのような誘導体が骨吸収阻害活
性を示すことを示し（データは示されていない）、これ
は、そのアミノ末端からのTFAの除去によるということ
が明らかである。
例５ PTHrP（107−111）のアミノ酸誘導体を調製し、そし
て例４に従って骨吸収阻害についてアッセイし、PTHrP
のカルボキシル末端フラグメント、すなわちPTHrP（107
−111）の活性部位の相対的形成性を研究した。結果は
表３に示される。
ここで npAは３（２−ナフチル）アラニンであり、 φＧはα−フェニルグリシンであり、 meはα−メチルであり、 SuccはＮ−スクシニル−であり、 “D"はＤ−アミノ酸異性体を示す。
PTHrPのアミノ酸107−111は有意な変動に対して耐性
であり、すなわちアミノ酸置換は活性の損失を伴わない
で行われ得ることが上記結果から明らかである。
配列TRSAW（PTHrP 107−111に対応する）においてＴ
により示されるアミノ酸107はアミノ酸のいづれかの残
基である。この例において、アミノ酸107はThr,Ala,Dr
o,Ser,meSer及びSuccThrの種々である。
配列TRSAWにおいてＲにより示されるアミノ酸108は一
般的にアミノ酸の塩基性残基である。この例において特
別に示される場合、アミノ酸108はArg,Lys,His及びＤ−
Alaであり得る。
配列RSAWにおいてＳにより示されるアミノ酸109は、
アミノ酸の非極性又は荷電されていない極性残基であり
得る。この例において特別に示される場合、アミノ酸10
9はSer,Ala,Gly,Cys,Tyr及びＤ−Serであり得る。
配列TRSAWにおいてＡにより示されるアミノ酸110はま
た、アミノ酸の非極性又は電荷されていない残基であり
得る。この例において特別に例示される場合、アミノ酸
110は、Ala,MeAla,3−（２−ナフチル）−アラニン及び
Ｄ−Argであり得る。
PTHrPのカルボキシ末端フラグメントのアミノ酸111
は、一般的に芳香族アミノ酸である。アミノ酸置換は、
Tyr,α−フェニルグリシン及びα−ナフチルアラニンを
包含する。
それらの特定のアミノ酸変異体は、本発明に記載され
る発明を限定するものではない。
アミノ酸変異体及び変性を含むペプチドは、PTHrPの
カルボキシ末端フラグメントの種々の誘導体が骨吸収阻
害活性を有するかいづれかを決定するために例１に従っ
て容易に試験され得る。
アミノ酸111を越えてのカルボキシ末端の拡張は、活
性に悪影響を与えない。
驚くべきことには、レトロインバートされた（retroi
nverted）配列DWDADSDRDTは、骨吸収を阻害することに
おいて活性であることが見出された。このペプチドのレ
トロインバートされたコンホーメーションは、活性を模
倣するために、側鎖配向において配列TRSAWに十分に類
似すると思われる。
表４は、単離された破骨細胞により骨吸収を阻害する
PTHrPの能力に対するペプチドの長さ及びアミノ酸組成
物の効果を示す。
略語:AC:N−アセチル,Suc:N−スクシニル−、meA:α
メチルアラニン,phG:αフェニルグリシン,napA:3（２−
ナフチル）アラニン,ClF:パラクロロ−Ｌ−フェニルア
ラニン。
＊:EC50′ｓ（活性ペプチドのみ）は、10-16M〜10-7Mの
間での濃度を試験する少なくとも２つの用量−応答曲線
から計算された。
∞:10-9M又は10-14Mで骨吸収の阻害は見出されない。
§：天然ヒト、ラット及びマウスPTHrP〔107−111〕。
¶：天然のニワトリPTHrP〔107−111〕。‡:EC50は計算
されなかったが、しかしペプチドは10-14M及び10-9MでT
RSAWと同じように有効である。囲まれた領域は、天然の
哺乳類及びニワトリPTHrPと相同の残基を示す。
図４は、ペプチドTRSAW,RTRSAW,DWDADSDRDT及びD
RTRSAWのための用量応答図を示し、ここで吸収ビット／
処理された破骨細胞／対照の比がペプチドの対数モル濃
度に対してプロットされた。TRSAWが最も活性的なペプ
チドであり、DWDADSDRDTが最少の活性ペプチドである。
例６ 本発明の化合物のインビボ活性を、哺乳類治療のため
のモデルとして、ラットで試験した。
哺乳類血清カルシウムベルは恒常性機構により強く調
節され、そしてほとんどの変数を示さない。モデルペプ
チド、すなわちPTHrP107−139を、100ngの量で100gの体
重のラット（ｎ＝10）中に静脈内に注射し、その後、血
清カルシウムレベルを、標準方法に従って原子吸収分光
計により30及び60分で測定した。動物の対照グループ
を、正の対照、すなわちカルシトニン（血清カルシウム
レベルの低下を引き起こす）、及び塩溶液の形での負の
対照により注射した。10匹のラットの２つのグループ
を、これらの対照に使用した。
通常の塩溶液により注射された対照のラットにおいて
は、血清カルシウムレベルは、注射の後30及び60分で、
約2.58mモル濃度であった。このレベルは、正常な血清
カルシウムレベルに影響すると思われる。PTHrP 107−1
39により注射された動物に関しては、注射の後30分での
平均血清カルシウムレベルは2.35mモル濃度であった。
これは、付随する骨の改造を伴って、骨吸収の妨害又は
阻害に起因する血清カルシウムレベルの有意な低下に影
響を及ぼす。注射の後60分で、PTHrP 107−139により注
射されたラットは、約2.55mモル濃度の血清カルシウム
レベルを有した。このデータは、PTHrP 107−139が血清
カルシウムレベルの一時的な低下を引き起こし、そして
血清カルシウムレベルの正常化は、PTHrP 107−139の注
射後、約30分で達成されることを示す。
カルシトニンが100gの体重当たり100ngの量でラット
に投与される場合、類似する結果、すなわち血清カルシ
ウムの一時的な低下がPTHrP 107−139に関して見出さ
れ、そして約2.35mモル濃度に血清カルシウムの30分間
にわたっての低下が伴った。
PTHrP 107−139は、本発明の範囲内での化合物の代表
である。107−111エピトープを含むペプチドは、PTHrP
107−139と同じインビボ効果を示すことが、インビトロ
骨吸収阻害データに基づいて予測される。
インビボでの破骨細胞骨吸収に対するPTHrP 1−34の
間接的な刺激作用に比較してのPTHrP 107−111の直接的
な阻害作用がスケムＡに示される。
当業者は、本明細書に記載される発明が特別に記載さ
れた変動及び変性以外の変動及び変性に対し敏感である
ことを理解するであろう。本発明は本発明の範囲内にあ
るすべてのそのような変動及び変性を包含することが理
解されるべきである。本発明はまた、本明細書に言及さ
れ、又は示されるすべての段階、特徴、組成物及び化合
物、及びいづれか複数の前記段階又は特徴のいづれか及
びすべてを包含する。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ケンプ，ブルース イー. オーストラリア国，ビクトリア 3101, ケウ，ケレット グローブ 20 (72)発明者 ニコルソン，ジェフリー チャールズ オーストラリア国，ビクトリア 3220, ギーロング，ハイトン，レモニー アベ ニュ 32 (72)発明者 マーティン，トーマス ジェイ. オーストラリア国，ビクトリア 3101, ケウ，ストーク アベニュ ６ (72)発明者 フェントン，アンナ ジェーン オーストラリア国，ビクトリア 3220, ギーロング，ライリー ストリート（番 地なし），ギーロング ホスピタル ナ ースイズ ホーム (72)発明者 ハモンズ，アール．グレン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94705，バークレー，ノーフォーク ロ ード 7036 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K A61K C12N 15 ＢＩＯＳＩＳ ＭＥＤＬＩＮＥ

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の： （ａ）PTHrP（107−111） PTHrP（107−112） PTHrP（107−113） PTHrP（107−114） PTHrP（107−115） PTHrP（107−116） PTHrP（107−117） PTHrP（107−118） PTHrP（107−119） PTHrP（107−120） PTHrP（107−121） PTHrP（107−122） PTHrP（107−123） PTHrP（107−124） PTHrP（107−125） PTHrP（107−126） PTHrP（107−127） PTHrP（107−128） PTHrP（107−129） PTHrP（107−130） PTHrP（107−131） PTHrP（107−132） PTHrP（107−133） PTHrP（107−134） PTHrP（107−135） PTHrP（107−136） PTHrP（107−137） PTHrP（107−139） PTHrP（107−140） PTHrP（107−141） PTHrP（107−142） PTHrP（107−143） PTHrP（107−144） PTHrP（107−145） PTHrP（107−146） PTHrP（107−147） PTHrP（107−148） PTHrP（107−149） PTHrP（107−150） PTHrP（107−151） PTHrP（107−152） PTHrP（107−153） PTHrP（107−154） PTHrP（107−155） PTHrP（107−156） PTHrP（107−157） PTHrP（107−158） PTHrP（107−159） PTHrP（107−160） PTHrP（107−161） PTHrP（107−162） PTHrP（107−163） PTHrP（107−164） PTHrP（107−165） PTHrP（107−166） PTHrP（107−167） PTHrP（107−168） PTHrP（107−169） PTHrP（107−170） PTHrP（107−171） PTHrP（107−172） PTHrP（107−173）から選択されるPTHrPカルボキシ末端
    断片化合物、 （ｂ）下記配列： ARSAW TRSAY TRAAW TRSADW ARAAW WDADSDRDT TRCAWPGTC PRSAW TKSAW ARAAW TRGAW TRSme AW TRSAφＧ THSAW PRSAW TRSAnpA MeSRTAW ｛ここで“D"はＤ−アミノ酸異性体を示し；φＧはα−
    フェニルグリシンであり;Meはｎ−メチルであり；そし
    てnpAはナフチルアラニンである｝から選択される化合
    物、及び （ｃ）PTHrPの112位〜173位のアミノ酸における１又は
    数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加により上記（ａ）
    に記載の化合物から誘導され、かつ、骨吸収阻害活性を
    有する化合物、 から成る群から選ばれる、骨吸収阻害活性を有する化合
    物。但し、PTHrP（107−138）及びPTHrP（106−141）を
    除く。
  2. 【請求項２】前記PTHrPのアミノ酸107のアミノ末端が加
    水分解可能な保護基により保護された、請求項１に記載
    の化合物。
  3. 【請求項３】下記式： ｛式中： Ａは、Thr、Ala又はCysの如きいずれかのアミノ酸であ
    り； Ｂは、ハロゲン、ニトロ,C1-3アルキル及び／又はC1-3
    のアルコキシにより１又は複数のメチレン基において置
    換されることができるArg又はホモArgであり； Ｃは、Ser、Ala、Thr又はCysであり、ここでヒドロキシ
    ル又はスルフィドリル基は生理学的に加水分解可能なエ
    ステル又はエーテルを与えるためにエステル化又はエー
    テル化されることができ； Ｄは、Ala、Gly、アミノイソ酪酸、Met、生理学的に加
    水分解可能なエステル又はエーテルによりエステル化又
    はエーテル化されることができるSer、Thr又はエステル
    化又はエーテル化されることができるCysであり； Ｘは、Tyr、Phe、メチル、フェニル・アラニン又はナフ
    チル・アラニンの側鎖であり、ここで、いずれかのその
    ようなアミノ酸のフェニル環がハロゲン、NO2、NH2、O
    H、C1-3アルキル及び／又はC1-3アルコキシにより置換
    されることができ；そして Ｚは以下のものであり： −COOR1、ここで、R1はＨ又はC1-3低級アルキルであ
    り； −（AA）（AA）ｎ、ここで、AAはいずれかのアミノ酸で
    あり、ｎは０〜40の整数であり、ここでｎが１より大き
    い場合、AAは同じであっても又は異なっていてもよく、
    そして少なくとも１のAAがその分子を安定化できるジス
    ルフィド結合の導入を容易にするためのCysであること
    ができ； −CH2OR2、ここでR2は水素又は生理学的に許容され、生
    理学的に加水分解可能なエステル又はエーテルの残基で
    あり； ここで、 R3は水素、C1-3アルキル、フェニル、ベンジル又はC
    9-10フェニルアルキルであり、 R4は水素、C1-3アルキル、又はR3が水素又はメチルであ
    る場合、式−CH（R5）−Ｘであり、ここで R5は水素、−（CH2）２−OH又は−（CH2）３−OHであ
    り、又は天然α−アミノ酸のα−炭素原子に結合する置
    換基を表し；そしてＸは式 −COOR1、 であり、 ここで R1及びR2は上記の通りであり、 R6は水素又はC1-3アルキルであり、そして R7は水素、C1-3アルキル、フェニル又はC7-10フェニル
    アルキルであり、ここで前記基−CH（R5）−ＸがＤ−又
    はＬ−型を有する｝により表わされる、請求項１に記載
    の化合物。
  4. 【請求項４】前記アミノ酸残基Ａが加水分解可能な保護
    基により保護される、請求項３に記載の化合物。
  5. 【請求項５】細胞毒性剤、標的決定剤又は骨吸収阻害活
    性を有する剤から選択された剤に会合した、請求項１に
    記載の化合物を含むキメラ分子。
  6. 【請求項６】前記細胞毒性分子がリシンのＡ−鎖又は細
    胞毒性薬物である、請求項５に記載のキメラ分子。
  7. 【請求項７】前記標的決定剤がモノクローナル又はポリ
    クローナル抗体、又は特定の細胞型又は組織についての
    親和性を有する剤である、請求項５に記載のキメラ分
    子。
  8. 【請求項８】前記骨吸収阻害活性を有する剤がカルシト
    ニンである、請求項５に記載のキメラ分子。
  9. 【請求項９】場合により医薬として許容される少なくと
    も１の担体又は賦形剤とともに、骨吸収阻害有効量の請
    求項１に記載の化合物を含む、骨吸収関連疾患用医薬組
    成物。
  10. 【請求項１０】場合により医薬として許容される少なく
    とも１の担体又は賦形剤とともに骨吸収阻害有効量の請
    求項３に記載の化合物を含む、骨吸収関連疾患用医薬組
    成物。
  11. 【請求項１１】無重力に関連する骨吸収の改善のため
    の、請求項９に記載の医薬組成物。
  12. 【請求項１２】場合により医薬として許容される少なく
    とも１の担体又は賦形剤とともに、骨吸収阻害有効剤の
    請求項１に記載の化合物を含む、過剰骨吸収疾患用医薬
    組成物。
  13. 【請求項１３】場合により医薬として許容される少なく
    とも１の担体又は賦形剤とともに、骨吸収阻害有効量の
    請求項３に記載の化合物を含む、過剰骨吸収疾患用医薬
    組成物。
  14. 【請求項１４】前記疾患が、骨粗鬆症、骨のパジェット
    病、悪性の液性高カルシウム血症、及び転移性骨疾患か
    ら成る群から選択される、請求項12に記載の医薬組成
    物。
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