JP3174492B2 - ウサギｍｍｐ−３に対するモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫学的測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗ウサギマトリッ
クスメタロプロテアーゼ−３（ＭＭＰ−３；ストロムラ
イシン１）モノクローナル抗体、及びそのモノクローナ
ル抗体を用いた酵素免疫測定法ならびに該測定法に基づ
き、検体中に存在するウサギＭＭＰ−３を定量する方法
に関する。より好ましくはヒトＭＭＰ−３とは免疫的に
交差反応しない抗ウサギマトリックスメタロプロテアー
ゼ−３（ＭＭＰ−３）モノクローナル抗体およびその用
途に関する。

【０００２】

【従来の技術】慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節
症（ＯＡ）等における軟骨損傷にマトリックスメタロプ
ロテアーゼ類（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔ
ｅｉｎａｓｅｓ；ＭＭＰｓ）が関与することが示唆され
ている（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２６１，１４２４５−１４２５５，１９８６，
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６６，６８０−６９０，１９
９２）。中でもＭＭＰ−３は、軟骨基質のプロテオグリ
カンを分解するほか、プロＭＭＰ−１（コラゲナーゼ
１）の活性化を通して、コラーゲン分解を促進すること
で軟骨損傷に重要な役割を担うと考えられている。ウサ
ギプロＭＭＰ−３の分子量は５１ｋＤａであり、トリプ
シン、４−アミノフェニル酢酸第二水銀（ＡＰＭＡ）等
で処理することにより、低分子の活性型ＭＭＰ−３に変
換される（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２６０，１２３６７−１２３７６，１９８
５）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】我々はヒトＭＭＰ−３
の測定系を開発（特開平４−２３７４９９）したが、こ
こで用いる抗ヒトＭＭＰ−３モノクローナル抗体は他の
動物種由来のＭＭＰ−３と交差反応しないことから、ヒ
ト以外のＭＭＰ−３を測定することはできない。ＲＡ、
ＯＡ等の関節疾患の動物モデルにはウサギが頻用され
る。従って、ウサギＭＭＰ−３の測定系が望まれてい
た。これまで、ウサギＭＭＰ−３の測定系としては、抗
ヒトＭＭＰ−３モノクローナル抗体と抗ウサギＭＭＰ−
３ポリクローナル抗体を用いたＭＭＰ−３測定系（Ｍｃ
ｄｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ
Ｒｈｅｕｍ．，３５，７９９−８０５，１９９２， Ｈ
ｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ
Ｒｈｅｕｍ．，３５，１２２７−１２３３，１９９
２）が報告されている。そのアッセイ系は、固相抗体に
抗ヒトＭＭＰ−３モノクローナル抗体を使用し、二次抗
体にヒツジ抗ウサギＭＭＰ−３ポリクローナル抗体とＨ
ＲＰ標識ロバ抗ヒツジポリクローナル抗体を用い発色さ
せている。この系では、一方の抗体を酵素標識していな
いため抗原抗体反応が３段階あり、動物種の異なるポリ
クローナル抗体と抗ヒトモノクローナル抗体を用いてい
ることから、より特異性の高い測定系が求められる。な
お、抗ウサギＭＭＰ−３モノクローナル抗体を得たとい
う報告はない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウサギＭ
ＭＰ−３タンパクを定性的及び定量的に測定するには、
それを特異的に認識しうるモノクローナル抗体、すなわ
ちウサギＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体を得る
べきと考え、鋭意研究の結果、ウサギＭＭＰ−３に対す
るモノクローナル抗体を作成することに成功した。そし
てその結果、抗体として抗ウサギプロＭＭＰ−３モノク
ローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測定（ＥＩ
Ａ）法を確立し、ウサギＯＡモデルの関節液中ウサギプ
ロＭＭＰ−３濃度をより特異的に測定することを可能と
した。さらにこれらモノクローナル抗体は組織や細胞の
免疫学的染色のための試薬としても有用であることを見
いだした。

【０００５】すなわち、本発明は、（１） ウサギマト
リックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−３）と特異的に
免疫反応することを特徴とするモノクローナル抗体、
（２） ヒトＭＭＰ−３と免疫的に交差反応しないこと
を特徴とする（１）記載のモノクローナル抗体、（３）
ウサギプロＭＭＰ−３と特異的に免疫反応し、ウサギ
活性型ＭＭＰ−３と免疫反応しないことを特徴とする
（１）又は（２）記載のモノクローナル抗体、（４）
ウサギＭＭＰ−３に特異的に免疫反応するモノクローナ
ル抗体であって、ウサギプロＭＭＰ−３に対して免疫反
応し且つウサギ活性型ＭＭＰ−３に対しても免疫反応す
ることを特徴とする（１）又は（２）記載のモノクロー
ナル抗体、（５） ウサギＭＭＰ−３と特異的に免疫反
応するモノクローナル抗体を測定試薬として用いること
を特徴とするウサギＭＭＰ−３の測定方法、（６） ウ
サギプロＭＭＰ−３とウサギ活性型ＭＭＰ−３とを分別
定量することを特徴とする（５）記載の方法、（７）
測定をサンドイッチ法により、酵素免疫学的に行うもの
であることを特徴とする（５）または（６）記載の方
法、および（８） ウサギＭＭＰ−３と特異的に免疫反
応するモノクローナル抗体を用いることを特徴とするウ
サギＭＭＰ−３を測定するための試薬を提供するもので
ある。

【０００６】本発明のさらに具体的な態様では（９）
（ａ）対象抗原を含有する測定試料と（ｂ）該対象抗原
と免疫学的に反応する固相抗体および（ｃ）該対象抗原
と免疫学的に反応する標識抗体とを接触させることによ
り前記対象抗原（ａ）と前記抗体（ｂ）と前記抗体
（ｃ）とからなる複合体を形成させる工程を含む免疫学
的測定法であって、前記（ｂ）の抗体と前記（ｃ）の抗
体のいずれか一方が少なくともウサギＭＭＰ−３と特異
的に免疫反応するモノクローナル抗体であることを特徴
とする方法、（１０）標識抗体の標識が酵素であること
を特徴とする（９）記載の方法、（１１）前記（ｂ）の
抗体と前記（ｃ）の抗体の双方が、ウサギＭＭＰ−３と
特異的に免疫反応するモノクローナル抗体であることを
特徴とする（９）または（１０）記載の方法、（１２）
前記（ｂ）の抗体と前記（ｃ）の抗体の双方が、ウサギ
ＭＭＰ−３と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体
であり、そのうち少なくとも一方はヒトＭＭＰ−３と免
疫的に交差反応しないものであることを特徴とする
（９）〜（１１）のいずれか一記載の方法、（１３）前
記（ｂ）の抗体と前記（ｃ）の抗体の双方が、ウサギＭ
ＭＰ−３と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体で
あり、そのうち少なくとも一方はウサギプロＭＭＰ−３
と特異的に免疫反応し且つウサギ活性型ＭＭＰ−３と免
疫反応しないものであることを特徴とする（９）〜（１
２）のいずれか一記載の方法、（１４）ウサギＭＭＰ−
３を定量測定するものであることを特徴とする（９）〜
（１３）のいずれか一記載の方法、（１５）前記（９）
〜（１４）のいずれか一記載の方法に於いて用いるもの
であり、ウサギＭＭＰ−３と特異的に免疫反応するモノ
クローナル抗体を含有していることを特徴とするウサギ
ＭＭＰ−３を測定するための試薬を提供する。特に本発
明に従えばウサギプロＭＭＰ−３のみと免疫反応するモ
ノクローナル抗体を測定試薬として用い、サンドイッチ
法により、酵素免疫学的にウサギＭＭＰ−３の測定を行
う方法及び試薬が提供される。酵素免疫測定法として
は、例えば、当該分野で広く知られた方法を制限無く適
用できるが、例えば、石川栄治監訳、P. TIJSSEN著、生
化学実験法・エンザイムイムノアッセイ、１９８９年、
株式会社東京化学同人などに記載の方法などが挙げられ
る。例えば、第一抗体固相法、二抗体法、エミット法
(Enzyme multiplied immunoassay technique; EMIT)、
エンザイムチャンネリングイムノアッセイ法、酵素活性
修飾物質イムノアッセイ法、リポソーム膜−酵素イムノ
アッセイ法、サンドイッチ法、イムノエンザイムメトリ
ックアッセイ法、酵素活性増強イムノアッセイ法などが
挙げられ、それらは競合法であっても、非競合法であっ
てもよい。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明で使用されるモノクローナ
ル抗体は、ケラー及びミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ，
Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５
６，４９５，１９７５）などにより開示されたミエロー
マ細胞を用いての細胞融合技術を利用して得られたモノ
クローナル抗体であってもよいことはいうまでもない。
本発明で使用されるモノクローナル抗体は、次のような
工程で作製できる。 １．免疫原性抗原の調製 ２．免疫原性抗原による動物の免疫 ３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 ４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 ５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクロー
ン化 ６．モノクローナル抗体の製造

【０００８】１．免疫原性抗原の調製 抗原としては、例えばウサギ組織由来あるいは培養ウサ
ギ細胞株由来のＭＭＰ−３を挙げることができる。好ま
しくはウサギプロＭＭＰ−３を挙げることができる。例
えば、ウサギ子宮頚管細胞滑膜細胞やウサギＨＩＧ−８
２滑膜細胞の培養上清より、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃ
ｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９９Ｂ，
３８１−３８５，１９９１）の方法を若干改変した方法
により精製して得られたものが挙げられる。精製されて
得られたウサギプロＭＭＰ−３を免疫抗原として用いる
ことができる。ウサギプロＭＭＰ−３は、さらに免疫原
性コンジュゲートなどにしてもよいが、そのまま適当な
アジュバントと混合して動物を免疫するのに使用でき
る。さらにウサギプロＭＭＰ−３は、それを断片化した
ものを適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と
結合させてハプテン−タンパク質の如き免疫原性コンジ
ュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを認識でき
るモノクローナル抗体をデザインするのに用いることも
できる。例えば遺伝子組換え技術を適用し、天然の細胞
から分子クローニングにより得られたＤＮＡ配列あるい
は既に知られたゲノム配列から、酵素などを用いたり、
化学合成により得られたＤＮＡ配列または修飾ＤＮＡ配
列を、微生物あるいは動物、植物、昆虫などで発現させ
て得られたリコビナント抗原や、それらの情報を利用し
液相法や固相法として知られたペプチド化学合成法によ
り得られたペプチドまたは改変ペプチドを用いることも
できる。

【０００９】ペプチドの固相合成法は、一般的には自動
ペプチド合成装置により好適に行うことが出来、例えば
ミリジェン・バイオーチ社製（ＭｉｌｌｉＧｅｎ／Ｂｉ
ｏｓｅａｒｃｈ）モデル９０５０、モデル９５００、あ
るいはエクセル（Ｅｘｃｅｌｌ）、アプライド・バイオ
システムズ社製（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）モデル４３０Ａやモデル４３１Ａ、デュポン社製
（ＤｕＰｏｎｔ）アールエイエムピーエス（ＲａＭＰ
Ｓ）、国産化学株式会社製「コックさん」、アドバンス
ド・ケムテク社製（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃ
ｈ）モデル３５０などを用いて行うことができる。ウサ
ギＭＭＰ−３のＣ末端領域、ウサギプロＭＭＰ−３のＮ
末端領域、あるいはそれら領域と実質的に同等の活性あ
るいは構造を有するペプチドを合成して免疫原性コンジ
ュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを認識でき
るモノクローナル抗体を得ることができる。

【００１０】担体タンパク質類と結合させるにあたって
は、担体タンパク質類はまず活性化されることができ
る。こうした活性化にあたり活性化結合基を導入するこ
とが挙げられる。活性化結合基としては、（１）活性化
エステルあるいは活性化カルボキシル基、例えばニトロ
フェニルエステル基、ペンタフルオロフェニルエステル
基、１−ベンゾトリアゾールエステル基、Ｎ−スクシン
イミドエステル基など、（２）活性化ジチオ基、例えば
２−ピリジルジチオ基などが挙げられる。担体タンパク
質類としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン
（ＫＬＨ），牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブ
ミン、グロブリン、ポリリジンなどのポリペプタイド、
細菌菌体成分、例えばＢＣＧなどが挙げられる。

【００１１】２．免疫原性抗原による動物の免疫 動物を免疫するには、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学 III、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て行うことができる。抗原と共に用いられるアジュバン
トとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビ
（Ｒｉｂｉ）アジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、
リピッドＡ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカ
などが挙げられる。免疫は、例えばＢＡＬＢ／ｃなどの
マウスをはじめとする動物を使用して行われる。抗原の
投与量は、例えばマウスに対して約１〜４００μｇ／動
物で、一般には宿主動物の腹腔内や皮下に注射し、以後
１〜４週間おきに、好ましくは１〜２週間ごとに腹腔
内、皮下、静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を２〜１０
回程度反復して行う。免疫用のマウスとしてはＢＡＬＢ
／ｃ系マウスの他、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスと他系マウス
とのＦ１マウスなどを用いることもできる。必要に応
じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫
の程度を確認できる。

【００１２】３．ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）の調製 細胞融合に使用される無限増殖可能株（腫瘍細胞株）と
しては免疫グロブリンを産生しない細胞株から選ぶこと
ができ、例えばＰ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１（ＮＳ−
１，Eur. J. Immunol., 6, 511〜519, 1976)、ＳＰ２／
０−Ａｇ１４（ＳＰ２，Nature, 276, 269〜270, 1978
) 、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１セルライン由来
のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１，Current to
pics in Microbiol. and Immunol., 81, 1〜7, 1978
）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３，Nature, 256, 49
5〜497, 1975 ) 、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ (６
５３，J. Immunol., 123, 1548〜1550, 1979) などを用
いることができる。８−アザグアニン耐性のマウスミエ
ローマ細胞株はダルベッコＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培
地）、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細胞培地に、例え
ばペニシリン、アミカシンなどの抗生物質、牛胎児血清
（ＦＣＳ）などを加え、さらに８−アザグアニン（例え
ば５〜４５μｇ／ｍｌ）を加えた培地で継代されるが、
細胞融合の２〜５日前に正常培地で継代して所要数の細
胞株を用意することができる。また使用細胞株は、凍結
保存株を約３７℃で完全に解凍したのちＲＰＭＩ−１６
４０培地などの正常培地で３回以上洗浄後、正常培地で
培養して所要数の細胞株を用意したものであってもよ
い。

【００１３】４．抗体産生細胞とミエローマ細胞との細
胞融合 上記２．の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは
最終免疫後、２〜５日後にその脾臓が摘出され、脾細胞
懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリンパ節細胞を
得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうし
て得られた脾細胞懸濁液と上記４．の工程に従い得られ
たミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ＭＥＭ培
地）、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの細
胞培地中に置き、細胞融合剤、例えばポリエチレングリ
コールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当
該分野で知られたものを用いることができ、この様なも
のとしては不活性化したセンダイウイルス（ＨＶＪ：Ｈ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ
Ｊａｐａｎ）などが挙げられる。好ましくは、例えば３
０〜６０％のポリエチレングリコールを０．５〜２ｍｌ
加えることができ、分子量が１，０００〜８，０００の
ポリエチレングリコールを用いることができ、さらに分
子量が１，０００〜４，０００のポリエチレングリコー
ルがより好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチ
レングリコールの濃度は、例えば３０〜６０％となるよ
うにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチル
スルホキシドなどを少量加え、融合を促進することもで
きる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエローマ
細胞株の割合は、例えば１：１〜２０：１とすることが
挙げられるが、より好ましくは４：１〜１０：１とする
ことができる。融合反応を１〜１０分間行い、次にＲＰ
ＭＩ−１６４０培地などの細胞培地を加える。融合反応
処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心
などにより細胞を分離した後選択用培地に移す。

【００１４】５．ハイブリドーマ（融合細胞）の選択及
びモノクローン化 選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地などの培地、所謂ＨＡＴ培地が挙
げられる。選択培地交換の方法は、一般的には培養プレ
ートに分注した容量と当容量を翌日加え、その後１〜３
日ごとにＨＡＴ培地で半量ずつ交換するというようにす
ることができるが、適宜これに変更を加えて行うことも
できる。また融合後８〜１６日目には、アミノプテリン
を除いた、所謂ＨＴ培地で１〜４日ごとに培地交換をす
ることができる。フィーダーとして、例えばマウス胸腺
細胞を使用することもでき、それが好ましい場合があ
る。ハイブリドーマの増殖のさかんな培養ウェルの培養
上清を、例えば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素免疫分析
（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）などの測定
系、あるいは蛍光惹起細胞分離装置（ＦＡＣＳ）など
で、ウサギＭＭＰ−３あるいはその断片ペプタイドなど
を抗原として用いたり、あるいは標識抗マウス抗体を用
いて目的抗体を測定するなどして、スクリーニングした
り分離する。目的抗体を産生しているハイブリドーマを
クローニングする。クローニングは、寒天培地中でコロ
ニーをピック・アップするか、あるいは限界希釈法によ
りなされうる。限界希釈法でクローニングがより好まし
く行うことができる。クローニングは複数回行うことが
好ましい。

【００１５】６．モノクローナル抗体の製造 得られたハイブリドーマ株は、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地などの適当な増殖用培地中で培
養し、その培地上清から所望のモノクローナル抗体を得
ることが出来る。大量の抗体を得るためには、ハイブリ
ドーマを腹水化することが挙げられる。この場合ミエロ
ーマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に
各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、例えばヌー
ド・マウスなどに各ハイブリドーマを移植し、増殖さ
せ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を
回収して得ることが出来る。ハイブリドーマの移植に先
立ち、プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、ハイ
ブリドーマを増殖させ、腹水を採取すればよい。腹水液
はそのまま、あるいは従来公知の方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿法などの塩析、セファデックスなどによる
ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳
動法、透析、限外ろ過法、アフィニティ・クロマトグラ
フィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精
製してモノクローナル抗体として用いることができる。
好ましくは、モノクローナル抗体を含有する腹水は、硫
安分画した後、ＤＥＡＥ−セファロースの如き、陰イオ
ン交換ゲル及びプロテインＡカラムの如きアフィニティ
ーカラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好まし
くは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗
原タンパク質あるいはペプチド、抗体が特異的に認識す
る部位など）を固定化したアフィニティー・クロマトグ
ラフィー、プロテインＡを固定化したアフィニティー・
クロマトグラフィーなどが挙げられる。

【００１６】こうして得られたモノクローナル抗体は、
市販のアイソタイプ特異的抗マウスＩｇ抗体、例えばア
イソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体などを用いて
その抗体構成鎖の重鎖及び軽鎖のタイプについて調べる
ことができる。ウサギプロＭＭＰ−３抗原を特異的に認
識できるモノクローナル抗体としては、重鎖のタイプと
してγ鎖、特にはγ1 鎖、γ2a鎖、γ2b鎖などを持つも
の、αを持つもの、μ鎖を持つものが挙げられ、軽鎖の
タイプとしてκ鎖を持つものが挙げられる。ウサギＭＭ
Ｐ−３抗原を特異的に認識できるモノクローナル抗体と
しては、重鎖のタイプとしてγ鎖、特にはγ1 鎖、γ2a
鎖、γ3 鎖などを持つもの、μ鎖を持つものが挙げら
れ、軽鎖のタイプとしてκ鎖を持つものが挙げられる。

【００１７】またこうして大量に得られた抗体の配列を
決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコー
ドする塩基配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗
体を作製することも可能である。さらにこれら抗体をト
リプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理し
て、場合により還元して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ
（ａｂ’）₂ といった抗体フラグメントにして使用して
もよい。標識物を付与する抗体としては、ＩｇＧ画分、
例えば抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−セファ
ロースの如き、陰イオン交換ゲルで処理して得られるＩ
ｇＧ画分など、更にはペプシン消化後還元して得られる
特異的結合部Ｆａｂ’などを用いることができる。これ
らの場合の標識物の例としては、下記するように酵素
（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼあるいは
β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質
あるいは放射性同位元素などがある。

【００１８】本発明の測定は、イムノアッセイ、例えば
競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで
行うことができることは上記した通りであり、ＲＩＡ、
ＥＬＩＳＡなどを用いることができ、Ｂ−Ｆ分離を行っ
てもあるいは行わないでその測定を行うこともできる。
好ましくは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）であり、さらにサ
ンドイッチ型アッセイが挙げられる。さらにはまた標識
モノクローナル抗体試薬を用いた免疫細胞染色あるいは
免疫組織染色を行うことができる。測定は直接法でも間
接法でもよい。また間接法の変法、例えばＰＡＰ法（ペ
ルオキシダーゼ・アンチペルオキシダーゼ法）、ＡＢＣ
法（アビジン・ビオチン・コンプレックス法）、プロテ
インＡ法などを用いることもできる。例えばサンドイッ
チ型アッセイでは、ウサギＭＭＰ−３に対する抗体の一
方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の
抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化
抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーショ
ン処理し、ここで非結合抗体を分離後、標識物を測定す
る。測定された標識の量は抗原、すなわちウサギＭＭＰ
−３の量と比例する。このアッセイでは、不溶化抗体
や、標識化抗体の添加の順序に応じてワンステップサン
ドイッチ型アッセイ、フォワード（forward)サンドイッ
チ型アッセイあるいは逆サンドイッチ型アッセイなどと
呼ばれる。例えば洗浄、撹拌、震盪、ろ過あるいは抗原
の予備抽出等は、特定の状況のもとでそれら測定工程の
中で適宜採用される。特定の試薬、緩衝液等の濃度、温
度あるいはインキュベーション処理時間などのその他の
測定条件は、検体中の抗原の濃度、検体試料の性質等の
要素に従い変えることができる。当業者は通常の実験法
を用いながら各測定に対して有効な最適の条件を適宜選
定して測定を行うことが出来る。

【００１９】抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担
体が知られており、本発明ではそれらから適宜選んで用
いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに
使用されるものが種々知られており、本発明においても
勿論これらの公知のものの中から選んで使用できる。特
に好適に使用されるものとしては、例えばガラス、例え
ば活性化ガラス、多孔質ガラス、シリカゲル、シリカ−
アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金などの無機材
料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリフッ化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリメタクリ
レート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合
体、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ス
チレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタ
クリレート共重合体など、架橋化アルブミン、コラーゲ
ン、ゼラチン、デキストラン、アガロース、架橋アガロ
ース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチ
ルセルロース、セルロースアセテートなどの天然または
変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポ
リアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機
高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られたも
の、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリ
ング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられ
る。

【００２０】さらに、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、
例えば試験管、タイタープレート、タイターウェル、ガ
ラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料からなるセ
ル、ガラス棒、合成材料からなる棒、末端を太くしたり
あるいは細くしたりした棒、末端に丸い突起をつけたり
あるいは偏平な突起をつけた棒、薄板状にした棒などの
固体物質（物体）の表面などが挙げられる。これら担体
へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明
で得られるウサギマトリックスメタロプロテアーゼ３に
対し特異的に結合するモノクローナル抗体を結合させる
ことができる。担体とこれら抗原抗体反応に関与するも
のとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合
剤などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりす
る化学的な方法、さらには相互の化学的な結合反応を利
用した手法などにより行うことが出来る。

【００２１】標識としては、酵素、酵素基質、酵素イン
ヒビター、補欠分子類、補酵素、酵素前駆体、アポ酵
素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、
発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コ
ロイドなど、放射性物質などを挙げることができる。酵
素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸
化還元酵素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル
基、アシル基、リン酸基などを転移するのを触媒する転
移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテ
ル結合、ペプチド結合などを加水分解する加水分解酵
素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを挙げるこ
とができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に
利用することもできる。例えば酵素的サイクリングを利
用することもできる。

【００２２】代表的な酵素標識としては、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ、大腸菌β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなどのガラクトシダーゼ、マレエー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−フォスフェー
ト・デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
コアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、カタラー
ゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、大腸菌アルカリ
ホスファターゼなどのアルカリ・フォスファターゼなど
が挙げられる。アルカリホスファターゼを用いた場合、
４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどのウン
ベリフェロン誘導体、ニトロフェニルホスフェートなど
のリン酸化フェノール誘導体、ＮＡＤＰを利用した酵素
的サイクリング系、ルシフェリン誘導体、ジオキセタン
誘導体などの基質を使用したりして、生ずる蛍光、発光
などにより測定できる。ルシフェリン、ルシフェラーゼ
系を利用したりすることもできる。カタラーゼを用いた
場合、過酸化水素と反応して酸素を生成するので、その
酸素を電極などで検知することもできる。電極としては
ガラス電極、難溶性塩膜を用いるイオン電極、液膜型電
極、高分子膜電極などであることもできる。酵素標識
は、ビオチン標識体と酵素標識アビジン（ストレプトア
ビジン）に置き換えることも可能である。標識は、複数
の異なった種類の標識を使用することもできる。こうし
た場合、複数の測定を連続的に、あるいは非連続的に、
そして同時にあるいは別々に行うことを可能にすること
もできる。

【００２３】本発明においては、信号の形成に４−ヒド
ロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミン、テ
トラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオキシダ
ーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフェニル
ガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬の
組合わせも利用でき、ヒドロキノン、ヒドロキシベンゾ
キノン、ヒドロキシアントラキノンなどのキノール化合
物、リポ酸、グルタチオンなどのチオール化合物、フェ
ノール誘導体、フェロセン誘導体などを酵素などの作用
により形成しうるものが使用できる。

【００２４】蛍光物質あるいは化学ルミネッセンス化合
物としては、フルオレセインイソチオシアネート、例え
ばローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネートなどのローダミン誘導体、ダ
ンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミ
ン、フィコビリプロテイン、アクリジニウム塩、ルミフ
ェリン、ルシフェラーゼ、エクォリンなどのルミノー
ル、イミダゾール、シュウ酸エステル、希土類キレート
化合物、クマリン誘導体などが挙げられる。標識するに
は、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスル
フィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基
の反応などを利用して行うことができ、公知の方法ある
いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらには
それらを修飾した方法の中から適宜選択して適用でき
る。また上記免疫原性コンジュゲート作製に使用される
ことのできる縮合剤、担体との結合に使用されることの
できる縮合剤などを用いることができる。

【００２５】縮合剤としては、例えばグルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレン
ジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミ
ド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネー
ト、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミ
ジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓ
ＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）ア
ミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−
マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミ
ドカプロイルオキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ），イ
ミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオン
イミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデー
ト、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ
−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテー
トなどが挙げられる。

【００２６】本発明の測定法によれば、測定すべき物質
を酵素などで標識したモノクローナル抗体試薬と、担体
に結合された抗体とを順次反応させることもできるし、
同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選
ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチッ
クなどのビーズを用いた場合には、酵素などで標識した
モノクローナル抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試
料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後該感
作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより
測定を行うことができる。本発明の定量法においては、
免疫学的測定法が用いられるが、その際の固相の担体と
しては抗体等タンパク質を良く吸着するポリスチレン
製、ポリカーボナイト製、ポリプロピレン製あるいはポ
リビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、
微粒子あるいは試験管等の種々の材料および形態を任意
に選択し使用することができる。測定にあたっては至適
ｐＨ、例えばｐＨ約４〜９に保つように適当な緩衝液系
中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例
えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェ
ート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝
剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、
トリス−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに
任意の割合で混合して用いることができる。抗体抗原反
応は約０℃〜６０℃の間の温度で行うことが好ましい。

【００２７】酵素などで標識されたモノクローナル抗体
試薬及び担体に結合せしめられた抗体試薬、さらには測
定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達す
るまで行うことができるが、抗体抗原反応の平衡が達成
されるよりもずっと早い時点で固相と液相とを分離して
限定されたインキュベーション処理の後に反応を止める
ことができ、液相又は固相のいずれかにおける酵素など
の標識の存在の程度を測ることができる。測定操作は、
自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、
ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなど
を使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シ
グナルを検知して測定することもできる。抗体抗原反応
においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物
質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗体抗原
反応自体を安定化するように適切な手段を講ずることが
できる。さらに、非特異的な反応を除去し、阻害的に働
く影響を減らしたり、あるいは測定反応を活性化したり
するため、タンパク質、安定化剤、界面活性化剤、キレ
ート化剤などをインキュベーション溶液中に加えること
もできる。当該分野で普通に採用されていたりあるいは
当業者に知られた非特異的結合反応を防ぐためのブロッ
キング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正
常血清タンパク質、アルブミン、スキムミルク、乳発酵
物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができ
る。非特異的結合反応を防ぐ目的である限り、それらの
方法は特に限定されず用いることが出来る。

【００２８】本発明の測定方法で測定される試料として
は、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液などが使用しう
るが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば血液、血
漿、、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他の体
液、細胞培養液、組織培養液、生検検体、例えば細胞、
組織、臓器、腫瘍組織などが挙げられる。特に好ましく
は血漿、血清などが挙げられる。本発明の標識モノクロ
ーナル抗体試薬を用いた免疫細胞染色あるいは免疫組織
染色では、生検検体、例えば細胞、組織、臓器、腫瘍組
織などが好適に用いられ、それら試料は染色前に必要に
応じ固定化することができる。組織の固定化には当該分
野で広く使用されているものあるいはそれから誘導され
たものを使用できる。例えばペリオデイト−リジン−パ
ラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ブアン、ホ
ルマリン、パラホルムアルデヒド、ザンボニー、アクロ
レインなどが使用できる。またパラフィンなどで固定化
することもできる。

【００２９】

【実施例】以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実
施形態が可能であり、本発明は本明細書及び図面に開示
の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を
包含することは理解されるべきである。

【００３０】実施例１ 抗原の調製 （ａ）ウサギプロＭＭＰ−３の精製 １）子宮頚管細胞からの精製 ウサギプロＭＭＰ−３は、ウサギ子宮頚管細胞滑膜細胞
培養上清より、Ｉｔｏｅｔ ａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９９Ｂ，３８１−３８
５，１９９１）の方法を若干改変したもので精製した。
すなわち、単離した子宮頚管細胞を１０％ＦＢＳ、ペニ
シリンおよびストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地中で
培養し、細胞がコンフルエントに達した後０．２％ラク
トアルブミン水解物、０．５ｎｇ／ｍｌヒトリコンビナ
ントＩＬ−１α含有ＭＥＭ培地中で５日間培養した。培
養上清を０．１ＭＮａＣｌ，５ｍＭＣａＣｌ2、０．５
％Ｃｈａｐｓ、０．０２％ＮａＮ3含有３０ｍＭトリス
塩酸緩衝液，ｐＨ８．０で平衡化した、Ｖａｔｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９３７
４−９３８２，１９８３に記載のヒツジ抗ウサギプロＭ
ＭＰ−３（ＩｇＧ）を結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４
Ｂ（１．５×３ｃｍ）カラムにチャージした。これを６
Ｍｕｒｅａ、０．４ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３
５含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．５で溶出
し、プロＭＭＰ−３溶出画分を限外ろ過膜（ＹＭ−１
０）で濃縮した。混入したアフィニティーカラム由来Ｉ
ｇＧを除去するため、０．４ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｂ
ｒｉｊ３５含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液，ｐＨ７．
５で平衡化したＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ−４４（１．
５×１１０ｃｍ）にかけた。プロＭＭＰ−３溶出画分を
濃縮し、ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔ
ｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）後、イムノ
ブロッティングを行い５１ｋＤａの単一バンドを確認、
プロＭＭＰ−３を得た。

【００３１】２）ウサギＨＩＧ−８２滑膜細胞からの精
製 ＨＩＧ−８２細胞を１）と同様の方法で培養、培養上清
よりウサギプロＭＭＰ−３を精製し５１ｋＤａの単一標
品を得た。

【００３２】実施例２ 抗ウサギプロＭＭＰ−３モノクローナル抗体の調製 （ａ）抗体産生細胞の調製 ６週令のＢａｌｂ／ｃ雌マウスに、初回免疫として実施
例１（ａ）に記載したウサギプロＭＭＰ−３ ７５μｇ
とフロイント完全アジュバントのエマルジョン０．２５
ｍｌを腹腔内に投与し、１８日および５４日後にウサギ
プロＭＭＰ−３（８１μｇを尾静脈より注入し追加免疫
した。最終免疫の３日後マウス脾臓を取り出し、脾細胞
を調製した。

【００３３】（ｂ）細胞融合 （１）以下の材料及び方法を用いる。 ＲＰＭＩ−１６４０培地：ＲＰＭＩ−１６４０（ＪＲＨ
Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ製）に重炭酸ナトリウム（２４
ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン
Ｇカリウム（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン
（５０μｇ／ｍｌ）及び硫酸アミカシン（１００μｇ／
ｍｌ）を加え、ドライアイスでｐＨ７．２にし、０．２
２μｍミリポアフィルターで除菌ろ過する。ＮＳ−１培
地：上記ＲＰＭＩ−１６４０培地に除菌ろ過したＦＢＳ
（ＪＲＨＢｉｏｓｉｅｎｃｅｓ製）を１５％（Ｖ／Ｖ）
の濃度に加える。ＰＥＧ４０００溶液：ＲＰＭＩ−１６
４０培地にポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ
４０００，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ ＣＯ．，Ｉｎｃ．製）
５０％（Ｗ／Ｗ）無血清溶液を調製する。 ８−アザグ
アニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ２（ＳＰ２／０−Ａｇ１
４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉ
ｎＣｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．
Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇ
ｉ）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｂｄ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ（１９８０）、３５１〜３７２に記載のＯｉ ａｎｄ
Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ法を若干改変して行った。

【００３４】（２）前記（ａ）項で調製した有核脾臓細
胞（生細胞率１００％）とミエローマ細胞（生細胞率１
００％）とを６：１の割合で融合した。脾臓細胞とミエ
ローマ細胞をそれぞれ前記ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗
浄した。次に、融合させるためにそれぞれ同じ培地に懸
濁させた有核脾臓細胞６×１０⁸ とミエローマ細胞１×
１０⁸ を混合した。次に、１，０００ｒ．ｐ．ｍ．で１
０分間の遠心分離により細胞を沈澱させ上清を完全に吸
引除去した。沈澱した細胞に３７℃に加温したＰＥＧ
４，０００溶液３．３ｍｌを穏やかに撹拌しながら１分
間で滴下し、１分間撹拌し細胞を再懸濁、分散させた。
次に３７℃に加温したＲＰＭＩ−１６４０培地３．３ｍ
ｌを１分間で滴下した。この操作をさらに１回繰り返し
た後、同培地２３．１ｍｌを２〜３分間で常に撹拌しな
がら滴下し、細胞を分散させた。これを１，０００ｒ．
ｐ．ｍ．で７分間遠心分離し上清を完全に吸引除去し
た。次にこの沈澱細胞に３７℃に加温したＮＳ−１培地
３３ｍｌを速やかに加え、大きい細胞塊を注意深くピペ
ッティングで分散させた。さらに同培地６６ｍｌを加え
て希釈しポリスチレン製９６穴マイクロウエル（岩城硝
子製）にウエルあたり６×１０⁵ 個／０．１ｍｌの細胞
を加えた。このマイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％
空気中で温度３７℃、湿度１００％以下で培養した。

【００３５】（ｃ）選択培地によるハイブリドーマの選
択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。 ＨＡＴ培地：前記（ｃ）項で述べたＮＳ−１培地にさら
にヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン
（０．４μＭ）及びチミジン（１６μＭ）を加える。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。 （２）前記（ｂ）項の培養開始翌日（１日目）、細胞に
ピペットでＨＡＴ培地２滴（０．１ｍｌ）を加えた。
２，３，５，８日目に培地の半分を新しいＨＴ培地に置
き換えた。１５日目にハイブリドーマの充分な生育が観
察された全ウエルについて、次項（ｄ）記載のＥＬＩＳ
Ａにより陽性ウエルを調べた。次に、フィーダーとして
１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリ
スチレン製２４穴セルウエル（住友ベークライト製）の
各ウエルに加え、上記で検出された各陽性ハイブリドー
マの充分生育した時点でＥＬＩＳＡにより陽性を再確認
し、それぞれについて次項（ｅ）記載の限界希釈法によ
るクローニングを行った。

【００３６】（ｄ）ＥＬＩＳＡによるウサギプロＭＭＰ
−３抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，２０５〜２１
４，１９８０に記載のＲｅｎｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．の
方法を若干改変した方法を用いて行った。前記実施例１
（ａ）で精製したウサギプロＭＭＰ−３ ５０ｎｇ／ウ
エルで９６穴マイクロタイトレーションプレート（Ｆｌ
ｏｗ Ｌａｂ．製）をコートした。これに、前記（ｃ）
で得られたハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加
えて、室温で約１時間静置した。２次抗体として西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス免疫
グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．製）を加え、さら
に室温で約１時間静置した。次に基質である過酸化水素
とｏ−フェニレンジアミンを加えて発色の程度をマイク
ロプレートリーダー（ＭＲＰ−Ａ４、東ソー製）を用い
て４９２ｎｍの吸光度で測定した。

【００３７】（ｅ）クローニング 前記（ｃ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイブ
リドーマが生育している可能性があるので、限界希釈法
によりクローニングを行いモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフィー
ダーとして１０⁷ 個のマウス胸腺細胞を含むクローニン
グ培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエル、
３６ウエル、２４ウエル当りにそれぞれ５個、１個及び
０．５個のハイブリドーマを加える。５日目に全ウエル
に約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加した。１１日目に
ハイブリドーマの充分な生育が認められ、それらについ
てＥＬＩＳＡを行った。テストした全ウエルが陽性でな
い場合、抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエ
ル中に１コロニーが確認されたウエルを１個選び、再ク
ローニングする。最終的にウサギプロＭＭＰ−３に対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ６株が得られ
た。

【００３８】（ｆ）ハイブリドーマによるモノクローナ
ル抗体の大量産生 ハイブリドーマの増殖は常法によって行う。すなわち、
得られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な
培養液で培養し、その培養上清から１０〜１００μｇ／
ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。
一方、大量に抗体を得るためには脾臓細胞とミエローマ
細胞の由来マウスと同系のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に１
匹あたり０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリスタン（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．製）を腹腔内投与する。１〜３
週間後に、各ハイブリドーマ１×１０⁷ 個を同じく腹腔
内投与し、さらに、その１〜２週間後に、４〜７ｍｇ／
ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水を得ることができ
る。

【００３９】（ｇ）モノクローナル抗体のアイソタイプ 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ウサギプロＭＭＰ−３
をコートしたマイクロタイトレーションプレートに各モ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清を加え
た。０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳで洗浄した
後、アイソタイプ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚ
ｙｍｅｄ．Ｌａｂ．製）を加えた。０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ ２０含有ＰＢＳによる洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウ
サギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基質として過酸化水
素及び２，２’−アジノージ（３−エチルベンゾリン
酸）を用いて検出した。その結果得られたウサギプロＭ
ＭＰ−３に対するモノクローナル抗体のうち、４クロー
ンはＩｇＧ１／κを産生し、残り２クローンはＩｇＧ２
ｂ／κ型モノクローナル抗体を分泌した（表１）。

【００４０】

【表１】

【００４１】（ｈ）モノクローナル抗体の精製 前記(f)項で得られたＩｇＧ１抗体含有各腹水を４０％
飽和硫酸アンモニウム分画後、プロテインＡ−セルロフ
ァインカラムにより精製した。なお得られたモノクロー
ナル抗体のうち、クローン番号１４８−１Ａ３、１３７
−２Ｆ３の産生ハイブリドーマは、それぞれ工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託され（受託番号 ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５２４８，ＦＥＲＭ Ｐ−１５２４９）てい
る。

【００４２】実施例３ 抗ウサギプロＭＭＰ−３モノク
ローナル抗体の選択 前記実施例１（ａ）で得られたウサギプロＭＭＰ−３と
前記実施例２（ｈ）で得られた６株の精製各モノクロー
ナル抗体との反応性を調べた。実施例１（ａ）で調製し
たウサギＭＭＰ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、細
胞工学１＆２，１０６１−１０６８，１９８３に記載の
田部の方法に従ってウエスタンブロッティングを行い、
各モノクローンの培養上清と反応後、ＨＲＰ標識ヤギ抗
マウス免疫グロブリン（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．製）を
用い間接法によりイムノブロッティングを行った。又、
他のＭＭＰｓとの交差反応性を調べるためにヒト新生児
線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）から精製したヒトプロＭＭ
Ｐ−３（Ｋ．Ｏｂａｔａ ａｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｉｍ．Ａｃｔａ，２１１，５９−７２，１９９２）を
用い上記のイムノブロッティングを行った。これらのウ
サギプロＭＭＰ−３モノクローナル抗体（クローン１３
７−２Ｆ３、１４８−１Ａ３、１４８−２Ｅ１０、１４
８−３Ｄ７、１４９−１Ｆ３、１４９−３Ｆ５）は、ヒ
トプロＭＭＰ−３とは反応せずウサギプロＭＭＰ−３に
対して特異的に反応した。なお、同様に実施例５（ｃ）
項で記載した方法でウサギプロＭＭＰ−３抗体（標識抗
体；クローン１３７−２Ｆ３、固相抗体；１４８−１Ａ
３）を用いてヒトＭＭＰ−３との交差反応性を調べた。
ウサギプロＭＭＰ−３の３２０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ
／ｍｌのＡ492の値を１００％として、各々のＡ492値を
示した場合、ヒトＭＭＰ−３との交差反応性は認められ
なかった（表２）。

【００４３】

【表２】

【００４４】実施例４ 抗ウサギプロＭＭＰ−３モノク
ローナル抗体を用いた免疫染色 ウサギ膝関節軟骨組織をＥＤＴＡにより脱灰後、ペリオ
デイト−リジン−パラホルムアルデヒド固定し、パラフ
ィン切片を作製した。脱パラフィンしたこれら組織切片
中の内因性ＨＲＰを過酸化水素でブロックした後、実施
例２（ｈ）項で得られたそれぞれの抗ウサギプロＭＭＰ
−３モノクローナル抗体（クローン１４８−１Ａ３）と
反応させた、。次に、その切片をＰＢＳで充分洗浄しビ
オチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）と反応させた
後、さらにアビジン−ビオチン−ＨＲＰ複合体（Ｖｅｃ
ｔｏｒ Ｌａｂ．製）と反応させた。上記のようにして
得られた切片を、ＰＢＳで洗浄した後、基質としてジア
ミノベンチジン及び過酸化水素を用いて発色させたとこ
ろ、ウサギプロＭＭＰ−３は軟骨細胞中に染色された。

【００４５】実施例５ ウサギプロＭＭＰ−３の定量法 （ａ）酵素標識抗体（Ｆａｂ’−ＨＲＰの複合体）の調
製 （１）Ｆａｂ’画分の調製 実施例２（ｈ）項で得られた各精製モノクローナル抗体
（ＩｇＧ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解
し、その溶液を以下述べるようにしてペプシンで消化し
た。すなわち、上記ＩｇＧに対して２％（ｗ／ｗ）のペ
プシンを加え、３７℃、２４時間消化した。さらにその
消化物に、２Ｍトリス溶液を加えてｐＨ７．０に調製す
ることによって反応を停止させ、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４カ
ラムを用いたゲルろ過により、Ｆ（ａｂ’）2画分を分
取した。次に、このＦ（ａｂ’）2画分を５ｍＭＥＤＴ
Ａ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で透析
し、最終濃度１０ｍＭとなるようにアミノエタンチオー
ルを加え３７℃で９０分間還元した後、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化し
たウルトロゲルＡｃＡ４４カラムを用いてゲルろ過し、
Ｆａｂ’画分を分取した。

【００４６】（２）マレイミド標識ＨＲＰ画分の調製 上記（１）項の操作とは別に、以下に述べるようにして
ＨＲＰにマレイミドを標識した。すなわち、ＨＲＰを１
０ｍｇ／ｍｌの量で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し、そのＨＲＰに対して、２５倍モル量のＮ
−（ε−マレイミドカプロイロキシ）−サクシミド（Ｅ
ＭＣＳ）をＤＭＦ溶液として加え、３０分間反応させ
た。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡
化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラムでゲルろ過
し、マレイミド標識ＨＲＰ画分を分取した。

【００４７】（３）Ｆａｂ’−ＨＲＰ複合体画分の調製 前記（１）項で調製した画分中のＦａｂ’に対して、上
記（２）項で得られた画分中のマレイミド標識ＨＲＰと
して等モルになるように両画分を混合し、さらにＦａ
ｂ’及びマレイミド標識ＨＲＰの最終濃度が１００μＭ
となるように、５ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．０）で希釈した。この混合液を４℃、２
０時間反応後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマ
レイミドで未反応のチオール基をブロックした。これを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したウル
トロゲルＡｃＡ４４カラムを用いてゲルろ過し、Ｆａ
ｂ’−ＨＲＰ複合体画分を分取後、０．１％ＢＳＡ及び
０．００１％クロルヘキシジンを添加し、４℃で保存し
た。

【００４８】（ｂ）モノクローナル抗体結合担体の調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，４，２０９〜３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．の方法
に従って、実施例２（ｈ）項で得られた精製モノクロー
ナル抗体を０．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解しその濃度を１００μｇ
／ｍｌに調製した。このモノクローナル抗体を９６穴マ
イクロプレートにウエル当り１００μｌずつ加え、４
℃、２４時間静置した。次にモノクローナル抗体溶液を
除去し、１％ＢＳＡ，０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝液Ａ）を各ウエル
に３００μｌずつ加え、４℃で保存した。使用時０．０
５％Ｔｗｅｅｎ ２０及び０．１Ｍ塩化ナトリウム含有
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０洗浄緩衝液）で３回
洗浄した。

【００４９】（ｃ）サンドイッチＥＩＡ法 精製ウサギプロＭＭＰ−３（標準試料）あるいはウサギ
プロＭＭＰ−３を含む検体４５μｌを緩衝液Ａ１０５μ
ｌと混合後、その１００μｌを前記抗体固相化プレート
に添加し室温で１時間反応させ、洗浄緩衝液で３回洗浄
した。次に、前記（ａ）で調製した酵素標識抗体を２５
０ｎｇ／ｍｌとなるように洗浄緩衝液で希釈し１００μ
ｌを上記プレートに添加し室温で１時間反応させ、洗浄
緩衝液で３回洗浄した。次に、０．０２％過酸化水素含
有２０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．９）に溶
解したｏ−フェニレンジアミンをウエル当り１００μｌ
加え、室温で３０分間反応させた後、２Ｎ硫酸１００μ
ｌを添加し反応を停止させた。この反応混液のＡ492を
マイクロプレートリーダーを用いて測定し、検量線より
検体中のウサギプロＭＭＰ−３濃度を算出した。モノク
ローナル抗体（クローン１４８−１Ａ３）を固相に、モ
ノクローナル抗体（クローン１３７−２Ｆ３）を標識用
抗体（Ｆａｂ’−ＨＲＰ）として用いて得られた検量線
を図１に示した。ウサギプロＭＭＰ−３標準試料の濃度
の上昇に伴ってＡ492は直線的に増加しており、定量感
度（ゼロ点の吸光度＋２ＳＤ）は４．７ｎｇ／ｍｌ（１
４０ｐｇ／アッセイ）であり、定量範囲は１７〜１０６
７ｎｇ／ｍｌ（０．５〜３２ｎｇ／アッセイ）であっ
た。一方、ウサギプロＭＭＰ−３（６４０ｎｇ／ｍｌ）
をＡＰＭＡ処理により活性化すると、本測定法によるウ
サギプロＭＭＰ−３の反応性は経時的に減少し、２４０
分インキュベートしたサンプルでは全く検出されなくな
った（図２）。

【００５０】（ｄ）添加回収試験 前記（ｃ）項に記載した方法において以下のように添加
回収試験を行った。ウサギ半月板切除モデル関節液Ａ
（ウサギプロＭＭＰ−３、８４ｎｇ／ｍｌ）、Ｂ（ウサ
ギプロＭＭＰ−３、１０８ｎｇ／ｍｌ）各４５μｌに標
準試料液（２０、４０、８０、１６０ｎｇ／ｍｌ）各４
５μｌを添加したものを検体とし、６０μｌの緩衝液Ａ
を加えた。この混合液を抗体結合プレートに１００μｌ
加え、前記（ｃ）項に記載した方法と同様にしてウサギ
プロＭＭＰ−３濃度を測定し回収率を算出した。標準ウ
サギプロＭＭＰ−３の平均回収率は関節液Ａを用いた場
合９７±７．９（Ｓ．Ｄ．）％であり、関節液Ｂを用い
た場合１０２±１１（Ｓ．Ｄ．）％であった（表３）。
このことより、本測定系は、特異的にウサギプロＭＭＰ
−３を認識していることが示唆される。

【００５１】

【表２】

【００５２】実施例６ ウサギ活性化型ＭＭＰ−３と抗
ウサギプロＭＭＰ−３モノクローナル抗体との反応性 前記実施例で得られたウサギプロＭＭＰ−３（５１ｋＤ
ａ）を２ｍＭ ＡＰＭＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３７
℃、１５分間反応させることにより３９，３５，２７お
よび２５ｋＤａの活性型ＭＭＰ−３に変換することがＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより認められた。そこでこの反応液を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ウサギプロＭＭＰ−３
モノクローナル抗体（クローン１３７−２Ｆ３、１４８
−１Ａ３、１４８−２Ｅ１０、１４８−３Ｄ７、１４９
−１Ｆ３、１４９−３Ｆ５）を用いてウエスタンブロッ
ティングを行った。モノクローナル抗体（クローン１４
８−１Ａ３、１４８−２Ｅ１０、１４８−３Ｄ７、１４
９−１Ｆ３、１４９−３Ｆ５）はウサギプロＭＭＰ−３
及び活性化型ＭＭＰ−３を認識したが、モノクローナル
抗体（クローン１３７−２Ｆ３）はウサギプロＭＭＰ−
３（５１ｋＤａ）のみを認識した（図３）。

【００５３】実施例７ サンドイッチＥＩＡ法によるウ
サギ関節液中プロＭＭＰ−３濃度の測定 前記実施例５（ｃ）項に記載した２ステップサンドイッ
チＥＩＡ法により検体としてウサギ変形性関節症モデル
関節液中のプロＭＭＰ−３濃度を測定した（図４）。健
常ウサギ関節液（ｎ＝１８）中プロＭＭＰ−３中濃度は
検出感度（４．７ｎｇ／ｍｌ）以下であった。一方、ウ
サギ変形性関節症モデル関節液（ｎ＝１８）中濃度は１
１１±９．３（Ｓ．Ｄ．）ｎｇ／ｍｌであり、健常ウサ
ギ群に比べ高値を示した。

【００５４】

【発明の効果】本発明に従えば、２種類の抗ウサギプロ
ＭＭＰ−３に対するモノクローナル抗体を用いて２ステ
ップサンドイッチＥＩＡ法が提供される。本ＥＩＡ法は
ヒトＭＭＰ−３やアフィニティカラムでウサギＭＭＰ−
３を除去したウサギ頚管細胞培養上清（他のＭＭＰｓを
含む）と全く交差反応を示さない。本測定法の反応時間
は、例えば、１５０分で、定量感度と定量範囲はそれぞ
れ４．７ｎｇ／ｍｌと１７〜１０６７ｎｇ／ｍｌを与え
る。また、再現性試験、希釈試験、添加回収試験におい
ても、良好な結果が得られる。本ＥＩＡアッセイ法は簡
便で再現性が高い点で、従来のアッセイ法より優れてい
ると考えられる。本アッセイ法ではＡＰＭＡにより活性
化されたウサギＭＭＰ−３は検出されないことからウサ
ギプロＭＭＰ−３の測定系として特に有用である。ＭＭ
Ｐ−３はＯＡやＲＡ患者の血清、関節液中でその濃度の
有意な上昇が知られている（Ｍａｎｉｃｏｕｒｔ ｅｔ
ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，３７，１
７７４−１７８３，１９９４等）。また、ＯＡに関して
は多くの動物モデル（Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．Ａ
ｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．，２６，８７５−８６
６，１９８３等）があり、関節軟骨でのＭＭＰ−３の産
生が示唆されている。本発明に従い、本測定系を用いて
ウサギＯＡモデル関節液中のプロＭＭＰ−３濃度を測定
したところ、正常ウサギ（定量感度４．７ｎｇ／ｍｌ以
下）に比べ高値（１１１±９．３ｎｇ／ｍｌ）を示し
た。同時に行った関節軟骨の免疫染色では、ＯＡウサギ
の軟骨細胞に陽性反応が認められた。ウサギＭＭＰ−３
に対するサンドイッチＥＩＡ系を確立、本アッセイ法で
ウサギＯＡモデルの関節液とウサギ頸管細胞培養上清中
のプロＭＭＰ−３濃度の定量が可能となった。ウサギを
用いた基礎的医学研究や医薬品開発に本アッセイ法は有
用な手段になると考えられる。さらにこれらモノクロー
ナル抗体は組織や細胞の免疫学的染色のための試薬とし
ても有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウサギプロＭＭＰ−３の２ステップサンドイッ
チＥＩＡ法による標準曲線を示すグラフである。

【図２】ウサギプロＭＭＰ−３をＡＰＭＡで活性化した
時の経時的な反応性を示すグラフである。

【図３】各モノクローナル抗体のウサギＭＭＰ−３での
イムノブロッティングの結果を示す図である。

【図４】健常ウサギとウサギ変形性関節症関節液中のプ
ロＭＭＰ−３測定結果を示すグラフである。

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 国沢 智巳 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市長慶寺530番地 富士薬品 工業株式会社内 (72)発明者 森 陽 東京都八王子市南陽台二丁目４番６号 (56)参考文献 Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ ｉｏｌ．，99Ｂ（２）（1991），ｐ. 381−385 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/08 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウサギマトリックスメタロプロテアーゼ
   （ＭＭＰ−３）と特異的に免疫反応し、ヒトＭＭＰ−３
   と免疫的に交差反応しないことを特徴とするモノクロー
   ナル抗体。
2. 【請求項２】 ウサギプロＭＭＰ−３と特異的に免疫反
   応し、ウサギ活性型ＭＭＰ−３と免疫反応しないことを
   特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ウサギＭＭＰ−３に特異的に免疫反応す
   るモノクローナル抗体であって、ウサギプロＭＭＰ−３
   に対して免疫反応し且つウサギ活性型ＭＭＰ−３に対し
   ても免疫反応することを特徴とする請求項１記載のモノ
   クローナル抗体。
4. 【請求項４】 ウサギＭＭＰ−３と特異的に免疫反応
   し、ヒトＭＭＰ−３と免疫的に交差反応しないことを特
   徴とするモノクローナル抗体を測定試薬として用いるこ
   とを特徴とするウサギＭＭＰ−３の測定方法。
5. 【請求項５】 ウサギプロＭＭＰ−３とウサギ活性型Ｍ
   ＭＰ−３とを分別定量することを特徴とする請求項４記
   載の方法。
6. 【請求項６】 測定をサンドイッチ法により、酵素免疫
   学的に行うものであることを特徴とする請求項４または
   ５記載の方法。
7. 【請求項７】 ウサギＭＭＰ−３と特異的に免疫反応
   し、ヒトＭＭＰ−３と免疫的に交差反応しないことを特
   徴とするモノクローナル抗体を用いることを特徴とする
   ウサギＭＭＰ−３を測定するための試薬。