JP3108006B2 - Ｊｍ１株、環境修復方法、有機化合物の分解方法、微生物の取得方法、微生物の検出方法、及び微生物の検出キット - Google Patents
Ｊｍ１株、環境修復方法、有機化合物の分解方法、微生物の取得方法、微生物の検出方法、及び微生物の検出キットInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は有機化合物を分解可
能な新規微生物、それを用いた有機化合物の分解方法及
びそれを用いた環境修復方法に関する。
能な新規微生物、それを用いた有機化合物の分解方法及
びそれを用いた環境修復方法に関する。
【０００２】また本発明はオキシゲナーゼを構成的に有
する微生物の取得方法、及びそれによって取得された微
生物を用いた環境修復方法に関する。
する微生物の取得方法、及びそれによって取得された微
生物を用いた環境修復方法に関する。
【０００３】更に本発明はオキシゲナーゼを構成的に有
する微生物の検出方法に関する。
する微生物の検出方法に関する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】近年、生体に対し有害
でかつ難分解性である有機塩素化合物による環境汚染が
大きな問題となってきている。特に、国内外の紙・パル
プ工業や半導体製造工場内等の土壌中にはテトラクロロ
エチレン（ＰＣＥ）やトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、
ジクロロエチレン（ＤＣＥ）等の有機塩素化合物による
汚染がかなりの範囲で拡がっていると考えられており、
実際に環境調査等で検出された事例が多数報告されてい
る。
でかつ難分解性である有機塩素化合物による環境汚染が
大きな問題となってきている。特に、国内外の紙・パル
プ工業や半導体製造工場内等の土壌中にはテトラクロロ
エチレン（ＰＣＥ）やトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、
ジクロロエチレン（ＤＣＥ）等の有機塩素化合物による
汚染がかなりの範囲で拡がっていると考えられており、
実際に環境調査等で検出された事例が多数報告されてい
る。
【０００５】これらの有機塩素化合物は土壌中に残留し
たものが雨水等により、地下水中に溶解して周辺地域一
帯に拡がるとされている。このような化合物は発癌性の
疑いがあり、また環境中で非常に安定であるため、特に
飲料水の水源として利用されている地下水の汚染は大き
な社会問題とされている。
たものが雨水等により、地下水中に溶解して周辺地域一
帯に拡がるとされている。このような化合物は発癌性の
疑いがあり、また環境中で非常に安定であるため、特に
飲料水の水源として利用されている地下水の汚染は大き
な社会問題とされている。
【０００６】このようなことから、有機塩素化合物の除
去、分解による、汚染地下水等の水性媒体や土壌および
それに伴う周辺の気相の浄化は、環境保全の視点から重
要な課題であり、浄化に必要な技術の開発が行われてき
ている。
去、分解による、汚染地下水等の水性媒体や土壌および
それに伴う周辺の気相の浄化は、環境保全の視点から重
要な課題であり、浄化に必要な技術の開発が行われてき
ている。
【０００７】このような有機塩素化合物に対する浄化処
理方法として近年微生物による分解が報告され、その実
用化に向けた研究がなされ始めている。即ち、微生物を
用いた生物分解処理では、用いる微生物を選択すること
で有機塩素化合物を無害な物質までに分解できること、
基本的に特別な薬品が不要であること、メンテナンスに
かかる労力やコストを軽減できること等の利点がある。
理方法として近年微生物による分解が報告され、その実
用化に向けた研究がなされ始めている。即ち、微生物を
用いた生物分解処理では、用いる微生物を選択すること
で有機塩素化合物を無害な物質までに分解できること、
基本的に特別な薬品が不要であること、メンテナンスに
かかる労力やコストを軽減できること等の利点がある。
【０００８】例えば、ＴＣＥ分解菌としては、Welchia
alkenophila sero 5 (USP 4877736,ATCC 53570)、Welch
ia alkenophila sero 33 (USP 4877736, ATCC 53571)
、Methylocystis sp. strain M (Agric. Biol. Chem.,
53,2903(1989) 、Biosci. Biotech. Biochem., 56,486
(1992) 、同56,736(1992)) 、Methylosinus trichospor
ium OB3b (Am. Chem. Soc. Natl. Meet. Dev. Environ.
Microbiol., 29,365(1989)、Appl. Environ. Microbio
l., 55,3155(1989)、Appl. Biochem. Biotechnol., 28,
877(1991)、特開平02-92274号公報、特開平03-292970
号公報）、Methylomonas sp. MM2 (Appl. Environ. Mic
robiol., 57,236(1991) ）、Alcaligenesdenitrificans
ssp. xylosoxidans JE75 (Arch. microbiol., 154,410
(1990))、Alcaligenes eutrophus JMP134 (Appl. Envir
on. Microbiol., 56,1179(1990))、Mycobacterium vacc
ae JOB5 (J. Gen. Microbiol., 82,163(1974) 、Appl.
Environ. Microbiol., 54,2960(1989)、ATCC 29678) 、
Pseudomonas putida BH(下水道協会誌，24,27(1987))、
Acinetobactor sp. strain G4 (Appl. Environ. Microb
iol., 52,383(1986)、同53,949(1987)、同54,951(198
9)、同56,279(1990)、同57,193(1991)、USP 4925802, A
TCC 53617 、この菌は初めPseudomonas cepacia と分類
されていたが、Acinetobactor sp. に変更された）、Ps
eudomonas mendocina KR-1 (Bio/Technol., 7,282(198
9))、Pseudomonas putida F1 (Appl. Environ. Microbi
ol., 54,1703(1988) 、同54,2578(1988))、Pseudomonas
fluorescens PFL12 (Appl. Environ. Microbiol., 54,
2578(1988))、Pseudomonas putidaKWI-9（特開平06-707
53号公報）、Pseudomonas cepacia KK01（特開平06-227
769 号公報）、Nitrosomonas europaea (Appl. Enviro
n. Microbiol., 56,1169(1990))、Lactobacillus fruct
ivorans RE (Int. J. Syst. Bacteriol., 30,313(1980)
、J. Appl. Bacteriol., 34,541(1971))、Lactobacill
us vaginalis sp.nov(Int. J. Syst. Bacteriol., 39,3
68(1989)、ATCC 49540）等を挙げることができる。
alkenophila sero 5 (USP 4877736,ATCC 53570)、Welch
ia alkenophila sero 33 (USP 4877736, ATCC 53571)
、Methylocystis sp. strain M (Agric. Biol. Chem.,
53,2903(1989) 、Biosci. Biotech. Biochem., 56,486
(1992) 、同56,736(1992)) 、Methylosinus trichospor
ium OB3b (Am. Chem. Soc. Natl. Meet. Dev. Environ.
Microbiol., 29,365(1989)、Appl. Environ. Microbio
l., 55,3155(1989)、Appl. Biochem. Biotechnol., 28,
877(1991)、特開平02-92274号公報、特開平03-292970
号公報）、Methylomonas sp. MM2 (Appl. Environ. Mic
robiol., 57,236(1991) ）、Alcaligenesdenitrificans
ssp. xylosoxidans JE75 (Arch. microbiol., 154,410
(1990))、Alcaligenes eutrophus JMP134 (Appl. Envir
on. Microbiol., 56,1179(1990))、Mycobacterium vacc
ae JOB5 (J. Gen. Microbiol., 82,163(1974) 、Appl.
Environ. Microbiol., 54,2960(1989)、ATCC 29678) 、
Pseudomonas putida BH(下水道協会誌，24,27(1987))、
Acinetobactor sp. strain G4 (Appl. Environ. Microb
iol., 52,383(1986)、同53,949(1987)、同54,951(198
9)、同56,279(1990)、同57,193(1991)、USP 4925802, A
TCC 53617 、この菌は初めPseudomonas cepacia と分類
されていたが、Acinetobactor sp. に変更された）、Ps
eudomonas mendocina KR-1 (Bio/Technol., 7,282(198
9))、Pseudomonas putida F1 (Appl. Environ. Microbi
ol., 54,1703(1988) 、同54,2578(1988))、Pseudomonas
fluorescens PFL12 (Appl. Environ. Microbiol., 54,
2578(1988))、Pseudomonas putidaKWI-9（特開平06-707
53号公報）、Pseudomonas cepacia KK01（特開平06-227
769 号公報）、Nitrosomonas europaea (Appl. Enviro
n. Microbiol., 56,1169(1990))、Lactobacillus fruct
ivorans RE (Int. J. Syst. Bacteriol., 30,313(1980)
、J. Appl. Bacteriol., 34,541(1971))、Lactobacill
us vaginalis sp.nov(Int. J. Syst. Bacteriol., 39,3
68(1989)、ATCC 49540）等を挙げることができる。
【０００９】しかしこれらの菌は全てＴＣＥ分解能を発
現させる為に誘導物質として例えば芳香族化合物やメタ
ン等の化学物質を必要とする。
現させる為に誘導物質として例えば芳香族化合物やメタ
ン等の化学物質を必要とする。
【００１０】例えば上記の微生物を用いてＴＣＥの分解
を行なうときにフェノールやトルエンといった芳香族化
合物は非常に有効な誘導物質であるが、その化合物自体
が環境汚染物質であり、環境中に放出する際には煩雑な
操作とモニタリングが必要となる。また、メタンも有効
な誘導物質であるが、可燃性の気体であり、環境中に導
入して制御することは危険と困難を伴う。また、誘導物
質と分解対象物質との間に競合関係が生じるため、分解
の効率が悪いことも問題である。又この問題は塩素化芳
香族化合物、例えばＰＣＰやＰＣＢを微生物分解する場
合も同様に生じるものである。ＰＣＰ分解に対するフェ
ノール、ＰＣＢ分解に対するビフェニルも同様である。
を行なうときにフェノールやトルエンといった芳香族化
合物は非常に有効な誘導物質であるが、その化合物自体
が環境汚染物質であり、環境中に放出する際には煩雑な
操作とモニタリングが必要となる。また、メタンも有効
な誘導物質であるが、可燃性の気体であり、環境中に導
入して制御することは危険と困難を伴う。また、誘導物
質と分解対象物質との間に競合関係が生じるため、分解
の効率が悪いことも問題である。又この問題は塩素化芳
香族化合物、例えばＰＣＰやＰＣＢを微生物分解する場
合も同様に生じるものである。ＰＣＰ分解に対するフェ
ノール、ＰＣＢ分解に対するビフェニルも同様である。
【００１１】これらの問題を解決するため、ネルソンら
は有機塩素化合物の分解誘導物質としてアミノ酸の一種
であるトリプトファンを用いる方法を開発した（特開平
４−５０２２７７号）。
は有機塩素化合物の分解誘導物質としてアミノ酸の一種
であるトリプトファンを用いる方法を開発した（特開平
４−５０２２７７号）。
【００１２】しかしトリプトファンは非常に高価な物質
である。またこの方法によればその誘導物質固有の問題
である毒性及び危険性はある程度回避されるが特定の物
質を環境中に導入し、その後それを制御していくという
煩雑さは何ら解決されていない。
である。またこの方法によればその誘導物質固有の問題
である毒性及び危険性はある程度回避されるが特定の物
質を環境中に導入し、その後それを制御していくという
煩雑さは何ら解決されていない。
【００１３】さらに言えば、このような誘導物質によっ
て発現させられている、オキシゲナーゼ等のＴＣＥ分解
酵素の酵素活性は通常数時間から一日程度しか維持され
ず、その後はまた誘導物質が必要となり、かつＴＣＥ分
解が誘導物質の存在により拮抗阻害を起こすという問題
も抱えている。
て発現させられている、オキシゲナーゼ等のＴＣＥ分解
酵素の酵素活性は通常数時間から一日程度しか維持され
ず、その後はまた誘導物質が必要となり、かつＴＣＥ分
解が誘導物質の存在により拮抗阻害を起こすという問題
も抱えている。
【００１４】そこでこのようなＴＣＥ分解酵素であるオ
キシゲナーゼをコードする遺伝子領域を含むＤＮＡ断片
を組み込んだプラスミドを宿主細菌に導入し、無害な誘
導物質により、或いは誘導物質が存在しない状況でも構
成的にＴＣＥ分解活性を発現させようとする試みがなさ
れている。ＤＮＡ断片の由来となる菌株としてはシュー
ドモナスメンドシナＫＲ−１（特開平２−５０３８６
６）、シュードモナスプチダＫＷＩ−９（特開平６−１
０５６９１）及びシュードモナスプチダＢＨ（地下水・
土壌汚染とその防止対策に関する研究集会第３回講演
集、２１３（１９９４））が挙げられる。
キシゲナーゼをコードする遺伝子領域を含むＤＮＡ断片
を組み込んだプラスミドを宿主細菌に導入し、無害な誘
導物質により、或いは誘導物質が存在しない状況でも構
成的にＴＣＥ分解活性を発現させようとする試みがなさ
れている。ＤＮＡ断片の由来となる菌株としてはシュー
ドモナスメンドシナＫＲ−１（特開平２−５０３８６
６）、シュードモナスプチダＫＷＩ−９（特開平６−１
０５６９１）及びシュードモナスプチダＢＨ（地下水・
土壌汚染とその防止対策に関する研究集会第３回講演
集、２１３（１９９４））が挙げられる。
【００１５】しかしこれらの組み換え菌株は、誘導物質
として非常に高価な物質であるＩＰＴＧ（イソプロピル
チオガラクトピラノシド）が必要であったり、プラスミ
ドの宿主菌株に対する安定性が充分でない等の様々な問
題を伴う。その上、組み換え菌株を環境中に放出するこ
とがパブリック・アクセプタンスの上からも規制は免れ
ない。
として非常に高価な物質であるＩＰＴＧ（イソプロピル
チオガラクトピラノシド）が必要であったり、プラスミ
ドの宿主菌株に対する安定性が充分でない等の様々な問
題を伴う。その上、組み換え菌株を環境中に放出するこ
とがパブリック・アクセプタンスの上からも規制は免れ
ない。
【００１６】又、別の試みとしてシールズ等はアシネト
バクター・スピーシズＧ４株（ＡＴＣＣへの寄託に於て
シュードモナス・セパシアＧ４株からアシネトバクター
・スピーシズＧ４株に変更された）をトランスポゾンを
用いた手段で変異させて誘導物質を必要としない、ＴＣ
Ｅ分解に必要なオキシゲナーゼを本来的に有している菌
株を取得した（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，５８，３９７７（１９９２），ＷＯ９２／
１９７３８号）。
バクター・スピーシズＧ４株（ＡＴＣＣへの寄託に於て
シュードモナス・セパシアＧ４株からアシネトバクター
・スピーシズＧ４株に変更された）をトランスポゾンを
用いた手段で変異させて誘導物質を必要としない、ＴＣ
Ｅ分解に必要なオキシゲナーゼを本来的に有している菌
株を取得した（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，５８，３９７７（１９９２），ＷＯ９２／
１９７３８号）。
【００１７】しかしＧ４株の変異株に関しては、ＴＣＥ
分解活性として十分でなく、又トランスポゾンを用いて
いるためその安定性に問題を含んでいる。また、トラン
スポゾン自体がカナマイシン等の耐性遺伝子を含んでい
るため、環境中に放出した場合、他の菌への水平伝達に
よる悪影響も考えられる。
分解活性として十分でなく、又トランスポゾンを用いて
いるためその安定性に問題を含んでいる。また、トラン
スポゾン自体がカナマイシン等の耐性遺伝子を含んでい
るため、環境中に放出した場合、他の菌への水平伝達に
よる悪影響も考えられる。
【００１８】上記した様に従来の、誘導物質を必要とし
ない微生物は、その取得の為に熟練した技術者及び高価
な設備が必要であり、又汚染物質の分解能力も十分でな
かった。
ない微生物は、その取得の為に熟練した技術者及び高価
な設備が必要であり、又汚染物質の分解能力も十分でな
かった。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明は、誘導物質を用
いることなく有機化合物を効率よく分解することができ
る新規微生物を提供することを目的とするものである。
いることなく有機化合物を効率よく分解することができ
る新規微生物を提供することを目的とするものである。
【００２０】また本発明は、誘導物質無しで有機化合物
の分解能を有し、且つ容易に取得できる新規微生物を用
いて有機化合物を分解する方法、及びその微生物を用い
た環境修復方法を提供することを他の目的とする。
の分解能を有し、且つ容易に取得できる新規微生物を用
いて有機化合物を分解する方法、及びその微生物を用い
た環境修復方法を提供することを他の目的とする。
【００２１】また本発明は誘導物質無しで有機化合物の
分解能を有する微生物の取得方法を提供することを他の
目的とする。
分解能を有する微生物の取得方法を提供することを他の
目的とする。
【００２２】また本発明は誘導物質無しで有機化合物の
分解能を示す微生物の検出方法を提供することを他の目
的とする。
分解能を示す微生物の検出方法を提供することを他の目
的とする。
【００２３】
【発明の実施の形態】本発明の１実施態様によれば、誘
導物質無しで有機化合物を分解することのできるＪＭ１
株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）が得られる。
導物質無しで有機化合物を分解することのできるＪＭ１
株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）が得られる。
【００２４】本発明の他の１実施態様によれば、オキシ
ゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微生物に変異
源を用いた変異誘発処理を施して得られた、オキシゲナ
ーゼを構成的に発現しているＪＭ１株を用いて有機化合
物を分解せしめる工程を有することを特徴とする有機化
合物の生分解方法が得られる。
ゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微生物に変異
源を用いた変異誘発処理を施して得られた、オキシゲナ
ーゼを構成的に発現しているＪＭ１株を用いて有機化合
物を分解せしめる工程を有することを特徴とする有機化
合物の生分解方法が得られる。
【００２５】本発明の１実施態様によれば、オキシゲナ
ーゼを誘導的に発現する能力を備えた微生物に変異源を
用いた変異誘発処理を施して得られた、オキシゲナーゼ
を構成的に発現しているＪＭ１株を用いて環境中の汚染
物質を分解させる工程を有することを特徴とする環境修
復方法が得られる。
ーゼを誘導的に発現する能力を備えた微生物に変異源を
用いた変異誘発処理を施して得られた、オキシゲナーゼ
を構成的に発現しているＪＭ１株を用いて環境中の汚染
物質を分解させる工程を有することを特徴とする環境修
復方法が得られる。
【００２６】本発明の実施態様によれば、オキシゲナー
ゼを構成的に発現している第１の微生物とオキシゲナー
ゼを誘導的に発現する能力を有する第２の微生物とが共
存し、且つ該第２の微生物にオキシゲナーゼを発現させ
ることのできる誘導物質を含む環境から前記オキシゲナ
ーゼを構成的に発現している微生物を選択的に取得する
方法であって、該第１の微生物及び該第２の微生物が共
存している微生物の混合物を、オキシゲナーゼで酸化さ
れることで検出可能な変化を呈する酸化物を生じ、且つ
該誘導物質としても機能する前駆物質を含む培地上で培
養し、該培地上にて微生物を増殖させてコロニーを形成
させ、該コロニーの成長と該コロニー内の該酸化物の生
戒との間に実質的な時間差のないコロニーを該第１の微
生物によつて形成されたコロニーとして分離する工程； を有し、前記第１の微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３５２）を含み、前記第２の微生物がＪ１株（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むことを特徴とするオキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物の取得方法が得
られる。
ゼを構成的に発現している第１の微生物とオキシゲナー
ゼを誘導的に発現する能力を有する第２の微生物とが共
存し、且つ該第２の微生物にオキシゲナーゼを発現させ
ることのできる誘導物質を含む環境から前記オキシゲナ
ーゼを構成的に発現している微生物を選択的に取得する
方法であって、該第１の微生物及び該第２の微生物が共
存している微生物の混合物を、オキシゲナーゼで酸化さ
れることで検出可能な変化を呈する酸化物を生じ、且つ
該誘導物質としても機能する前駆物質を含む培地上で培
養し、該培地上にて微生物を増殖させてコロニーを形成
させ、該コロニーの成長と該コロニー内の該酸化物の生
戒との間に実質的な時間差のないコロニーを該第１の微
生物によつて形成されたコロニーとして分離する工程； を有し、前記第１の微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３５２）を含み、前記第２の微生物がＪ１株（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むことを特徴とするオキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物の取得方法が得
られる。
【００２７】本発明の１実施態様によれば、オキシゲナ
ーゼを構成的に発現している微生物の検出方法であっ
て、オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微
生物とオキシゲナーゼを構成的に発現している微生物と
をオキシゲナーゼで酸化されることで検出可能な変化を
呈する酸化物を生じ、且つ該誘導物質としても機能する
前駆物質の存在下で培養して増殖させたときにオキシゲ
ナーゼを構成的に発現している微生物のコロニーの成長
と該コロニー内の該酸化物の生成を示す部分の発現との
間に時間差がなく、オキシゲナーゼを誘導的に発現する
能力を備えた微生物のコロニーの成長と該コロニー内の
該酸化物の生成を示す部分の発現との間に時間差が有る
ように各々の微生物を増殖させるような培地を用意する
工程；及びオキシゲナーゼを構成的に発現している微生
物とオキシゲナーゼを誘導的に発現している微生物とが
共存している可能性の有る微生物の混合物を該前駆物質
を含む該培地で培養してコロニーを形成させ、コロニー
の成長と該コロニー内の該酸化物の生成との間に実質的
な時問差が無いコロニーをオキシゲナーゼを構成的に発
現している微生物によるコロニーとして検出する工程；
を有し、前記オキシゲナーゼを構成的に発現している微
生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）を含み、
前記オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微
生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むこと
を特徴とするオキシゲナーゼを構成的に発現している微
生物の検出方法が得られる。
ーゼを構成的に発現している微生物の検出方法であっ
て、オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微
生物とオキシゲナーゼを構成的に発現している微生物と
をオキシゲナーゼで酸化されることで検出可能な変化を
呈する酸化物を生じ、且つ該誘導物質としても機能する
前駆物質の存在下で培養して増殖させたときにオキシゲ
ナーゼを構成的に発現している微生物のコロニーの成長
と該コロニー内の該酸化物の生成を示す部分の発現との
間に時間差がなく、オキシゲナーゼを誘導的に発現する
能力を備えた微生物のコロニーの成長と該コロニー内の
該酸化物の生成を示す部分の発現との間に時間差が有る
ように各々の微生物を増殖させるような培地を用意する
工程；及びオキシゲナーゼを構成的に発現している微生
物とオキシゲナーゼを誘導的に発現している微生物とが
共存している可能性の有る微生物の混合物を該前駆物質
を含む該培地で培養してコロニーを形成させ、コロニー
の成長と該コロニー内の該酸化物の生成との間に実質的
な時問差が無いコロニーをオキシゲナーゼを構成的に発
現している微生物によるコロニーとして検出する工程；
を有し、前記オキシゲナーゼを構成的に発現している微
生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）を含み、
前記オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微
生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むこと
を特徴とするオキシゲナーゼを構成的に発現している微
生物の検出方法が得られる。
【００２８】本発明の１実施態様によれば、有機化合物
を分解する為の酵素を構成的に発現している第１の微生
物と該酵素を誘導的に発現する能力を有する第２の微生
物とが共存し、且つ第２の微生物に該酵素を発現させる
ことのできる誘導物質を含む環境から前記第１の微生物
を選択的に取得する方法であって、前記第１の微生物及
び前記第２の微生物が共存している可能性のある微生物
の混合物を該酵素の作用によって検出可能な特性を呈す
る物質を生じ、且つ該誘導物質でもある前駆物質を含む
培地上で培養し、該培地上にて微生物を増殖させてコロ
ニーを形成させ、該コロニーの成長と該コロニー内の該
物質の生成との間に実質的な時間差のないコロニーを該
第１の微生物によって形成されたコロニーとして分離す
る工程； を有し、前記第１の微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３５２）を含み、前記第２の微生物がＪ１株（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むことを特徴とする有機化
合物を分解する能力を本来的に有している微生物の取得
方法が得られる。
を分解する為の酵素を構成的に発現している第１の微生
物と該酵素を誘導的に発現する能力を有する第２の微生
物とが共存し、且つ第２の微生物に該酵素を発現させる
ことのできる誘導物質を含む環境から前記第１の微生物
を選択的に取得する方法であって、前記第１の微生物及
び前記第２の微生物が共存している可能性のある微生物
の混合物を該酵素の作用によって検出可能な特性を呈す
る物質を生じ、且つ該誘導物質でもある前駆物質を含む
培地上で培養し、該培地上にて微生物を増殖させてコロ
ニーを形成させ、該コロニーの成長と該コロニー内の該
物質の生成との間に実質的な時間差のないコロニーを該
第１の微生物によって形成されたコロニーとして分離す
る工程； を有し、前記第１の微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ
−５３５２）を含み、前記第２の微生物がＪ１株（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むことを特徴とする有機化
合物を分解する能力を本来的に有している微生物の取得
方法が得られる。
【００２９】本発明の１実施態様によれば、有機化合物
を分解可能な酵素を構成的に発現している微生物の検出
方法であって、該酵素を誘導的に発現する能力を備えた
微生物と該酵素を構成的に発現している微生物とを、該
酵素の作用によって検出可能な変化を呈する物質を生
じ、且つ誘導物質としても機能する前駆物質の存在下で
培養して増殖させたときに該酵素を構成的に発現してい
る微生物のコロニーの成長と該コロニー内の該物質の生
成を示す部分の発現との間に時間差が無く、該酵素を誘
導的に発現する能力を備えた微生物のコロニーの成長と
該コロニー内の該物質の生成を示す部分の発現との間に
時間差が有るように各々の微生物を増殖させる様な培地
を用意する工程；及び該酵素を構成的に発現している微
生物と該酵素を誘導的に発現している微生物とが共存し
ている可能性のある微生物の混合物を該前駆物質を含む
該培地で培養してコロニーを形成させ、コロニーの成長
と該コロニー内の該物質の生成との間に実質的な時間差
がないコロニーを該酵素を構成的に発現している微生物
のコロニーとして検出する工程； を有し、前記有機化合物を分解可能な酵素を構成的に発
現している微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５
２）を含み、該酵素を誘導的に発現する能力を備えた微
生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むこと
を特徴とする有機化合物を分解可能な酵素を本来的に有
している微生物の検出方法が得られる。
を分解可能な酵素を構成的に発現している微生物の検出
方法であって、該酵素を誘導的に発現する能力を備えた
微生物と該酵素を構成的に発現している微生物とを、該
酵素の作用によって検出可能な変化を呈する物質を生
じ、且つ誘導物質としても機能する前駆物質の存在下で
培養して増殖させたときに該酵素を構成的に発現してい
る微生物のコロニーの成長と該コロニー内の該物質の生
成を示す部分の発現との間に時間差が無く、該酵素を誘
導的に発現する能力を備えた微生物のコロニーの成長と
該コロニー内の該物質の生成を示す部分の発現との間に
時間差が有るように各々の微生物を増殖させる様な培地
を用意する工程；及び該酵素を構成的に発現している微
生物と該酵素を誘導的に発現している微生物とが共存し
ている可能性のある微生物の混合物を該前駆物質を含む
該培地で培養してコロニーを形成させ、コロニーの成長
と該コロニー内の該物質の生成との間に実質的な時間差
がないコロニーを該酵素を構成的に発現している微生物
のコロニーとして検出する工程； を有し、前記有機化合物を分解可能な酵素を構成的に発
現している微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５
２）を含み、該酵素を誘導的に発現する能力を備えた微
生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を含むこと
を特徴とする有機化合物を分解可能な酵素を本来的に有
している微生物の検出方法が得られる。
【００３０】本発明の１実施態様によれば、オキシゲナ
ーゼを構成的に発現している微生物とオキシゲナーゼを
誘導的に発現する能力を備えた微生物とが共存している
環境からの前記オキシゲナーゼを構成的に発現している
微生物の検出の為のキットであって、オキシゲナーゼに
よる酸化によって呈色される呈色物質を含む培地上で前
記オキシゲナーゼを構成的に発現している微生物と前記
オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を有する微生物
とを含む微生物の混合物を培養して前記微生物のコロニ
ーを形成させたときに、前記コロニーの成長と前記コロ
ニー内の該呈色物質の生成による変色部分の発現との間
に実質的な時間差の無いコロニーと時間差のあるコロニ
ーとが生じるように前記微生物を増殖させるような栄養
を含む培地；及び該呈色物質を備え、前記オキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３５２）を含み、前記オキシゲナーゼを誘導
的に発現する能力を備えた微生物がＪ１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１０２）を含むことを特徴とするオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物の検出キットが得られ
る。
ーゼを構成的に発現している微生物とオキシゲナーゼを
誘導的に発現する能力を備えた微生物とが共存している
環境からの前記オキシゲナーゼを構成的に発現している
微生物の検出の為のキットであって、オキシゲナーゼに
よる酸化によって呈色される呈色物質を含む培地上で前
記オキシゲナーゼを構成的に発現している微生物と前記
オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を有する微生物
とを含む微生物の混合物を培養して前記微生物のコロニ
ーを形成させたときに、前記コロニーの成長と前記コロ
ニー内の該呈色物質の生成による変色部分の発現との間
に実質的な時間差の無いコロニーと時間差のあるコロニ
ーとが生じるように前記微生物を増殖させるような栄養
を含む培地；及び該呈色物質を備え、前記オキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５３５２）を含み、前記オキシゲナーゼを誘導
的に発現する能力を備えた微生物がＪ１株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１０２）を含むことを特徴とするオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物の検出キットが得られ
る。
【００３１】本発明の１実施態様によれば、請求項６５
に記載の方法により取得された微生物を用いて有機化合
物を分解することを特徴とする微生物を用いた有機化合
物の分解方法が得られる。
に記載の方法により取得された微生物を用いて有機化合
物を分解することを特徴とする微生物を用いた有機化合
物の分解方法が得られる。
【００３２】本発明の１実施態様によれば、汚染物質で
汚染された環境を微生物を用いて修復する方法におい
て、請求項６５に記載の方法で取得した微生物を用いて
該汚染物質を分解せしめる工程を有することを特徴とす
る環境修復方法が得られる。
汚染された環境を微生物を用いて修復する方法におい
て、請求項６５に記載の方法で取得した微生物を用いて
該汚染物質を分解せしめる工程を有することを特徴とす
る環境修復方法が得られる。
【００３３】なお本発明に於て「微生物の増殖と前駆物
質の酸化物の発現との間に実質的に時間差が無い」と
は、微生物を検出する為の公知の手段で微生物の存在が
検出できる様になった時点で該酸化物の存在が確認でき
れば「時間差が無い」ものとする。
質の酸化物の発現との間に実質的に時間差が無い」と
は、微生物を検出する為の公知の手段で微生物の存在が
検出できる様になった時点で該酸化物の存在が確認でき
れば「時間差が無い」ものとする。
【００３４】さらにまた本発明において「構成的にオキ
シゲナーゼを発現している微生物」とは、例えば特定の
有機化合物を微生物のオキシゲナーゼによって分解させ
るにあたって、該微生物にオキシゲナーゼを発現させる
為の他の有機化合物との接触が不要な微生物のことを指
すものである。
シゲナーゼを発現している微生物」とは、例えば特定の
有機化合物を微生物のオキシゲナーゼによって分解させ
るにあたって、該微生物にオキシゲナーゼを発現させる
為の他の有機化合物との接触が不要な微生物のことを指
すものである。
【００３５】また「構成的に有機化合物を分解可能な酵
素を発現している微生物」とは、例えば特定の有機化合
物を微生物の酵素の作用を用いて分解させるにあたっ
て、該微生物に該酵素を発現させる為の他の有機化合物
との接触が不要な微生物のことを指すものである。
素を発現している微生物」とは、例えば特定の有機化合
物を微生物の酵素の作用を用いて分解させるにあたっ
て、該微生物に該酵素を発現させる為の他の有機化合物
との接触が不要な微生物のことを指すものである。
【００３６】本発明者らは芳香族化合物（フェノール、
トルエン、クレゾール等）や塩素化脂肪族炭化水素化合
物を誘導物質を用いることで分解できる特定の微生物
（ブタペスト条約に基づく国際寄託の番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１０２／識別の為の表示：コリネバクテリウム
・スピーシズＪ１株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐ．Ｊ１））（以下「Ｊ１株」と称す。）を変異源を
用いた変異操作によって変異させ分解対象の化学物質以
外の化合物、例えば従来から誘導物質として知られてい
る化合物と接触させることなしに分解対象である化学物
質を分解する能力を有する変異株を取得した。
トルエン、クレゾール等）や塩素化脂肪族炭化水素化合
物を誘導物質を用いることで分解できる特定の微生物
（ブタペスト条約に基づく国際寄託の番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−５１０２／識別の為の表示：コリネバクテリウム
・スピーシズＪ１株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐ．Ｊ１））（以下「Ｊ１株」と称す。）を変異源を
用いた変異操作によって変異させ分解対象の化学物質以
外の化合物、例えば従来から誘導物質として知られてい
る化合物と接触させることなしに分解対象である化学物
質を分解する能力を有する変異株を取得した。
【００３７】なお上記菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２
は、当初本菌株がコリネバクテリウム属に属しているも
のとして「コリネバクテリウム・スピーシズＪ１株」と
表示したが、後の検討により本菌株が“コリネバクテリ
ウム属には属さない”と認められたため、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５１０２の識別のための表示を「Ｊ１株」と変更し
た。
は、当初本菌株がコリネバクテリウム属に属しているも
のとして「コリネバクテリウム・スピーシズＪ１株」と
表示したが、後の検討により本菌株が“コリネバクテリ
ウム属には属さない”と認められたため、ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５１０２の識別のための表示を「Ｊ１株」と変更し
た。
【００３８】又この変異株を、例えば芳香族化合物や塩
素化脂肪族有機塩素化合物で汚染された環境（例えば水
性媒体、土壌或いは気相）と接触させて汚染物質を分解
せしめて環境を修復する方法を見いだした。
素化脂肪族有機塩素化合物で汚染された環境（例えば水
性媒体、土壌或いは気相）と接触させて汚染物質を分解
せしめて環境を修復する方法を見いだした。
【００３９】先ず上記の変異株の由来株であるＪ１株の
菌学的性質を以下に示す。
菌学的性質を以下に示す。
【００４０】グラム染色性及び形態：グラム陰性桿菌 各培地における生育 ＢＨＩＡ：生育良好 ＭａｃＣｏｎｋｅｙ：生育可能 コロニーの色：クリーム色 至適温度：２５℃＞３０℃＞３５℃ 運動性：陰性（半流動培地） ＴＳＩ（ｓｌａｎｔ／ｂｕｔｔ）：アルカリ／アルカ
リ、Ｈ2 Ｓ(-) オキシダーゼ：陽性（弱） カタラーゼ：陽性 糖の発酵 グルコース：陰性 シュクロース：陰性 ラフィノース：陰性 ガラクトース：陰性 マルトース：陰性 ウレアーゼ：陽性 エスクリン加水分解（β−グルコシダーゼ）：陽性 硝酸還元：陰性 インドール産生：陰性 グルコース酸性化：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 ゼラチン加水分解（プロテアーゼ）：陰性 β−ガラクトシダーゼ：陰性 各化合物の同化 グルコース：陰性 Ｌ−アラビノース：陰性 Ｄ−マンノース：陰性 Ｄ−マンニトール：陰性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性 マルトース：陰性 グルコン酸カリウム：陰性 ｎ−カプリン酸：陽性 アジピン酸：陰性 ｄｌ−リンゴ酸：陽性 クエン酸ナトリウム：陽性 酢酸フェニル：陰性 Ｊ１株は芳香族化合物資化性の有機塩素化合物分解菌で
あり、分解にはオキシゲナーゼが関与している。そし
て、土壌等の自然環境における温度に近い１５℃という
低温においても、２０ｐｐｍ前後のＴＣＥをほぼ完全に
分解するといった卓越した有機塩素化合物分解能を有し
ているが、分解誘導物質としてフェノールやトルエン、
クレゾールといった芳香族化合物が必要である。
リ、Ｈ2 Ｓ(-) オキシダーゼ：陽性（弱） カタラーゼ：陽性 糖の発酵 グルコース：陰性 シュクロース：陰性 ラフィノース：陰性 ガラクトース：陰性 マルトース：陰性 ウレアーゼ：陽性 エスクリン加水分解（β−グルコシダーゼ）：陽性 硝酸還元：陰性 インドール産生：陰性 グルコース酸性化：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 ゼラチン加水分解（プロテアーゼ）：陰性 β−ガラクトシダーゼ：陰性 各化合物の同化 グルコース：陰性 Ｌ−アラビノース：陰性 Ｄ−マンノース：陰性 Ｄ−マンニトール：陰性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性 マルトース：陰性 グルコン酸カリウム：陰性 ｎ−カプリン酸：陽性 アジピン酸：陰性 ｄｌ−リンゴ酸：陽性 クエン酸ナトリウム：陽性 酢酸フェニル：陰性 Ｊ１株は芳香族化合物資化性の有機塩素化合物分解菌で
あり、分解にはオキシゲナーゼが関与している。そし
て、土壌等の自然環境における温度に近い１５℃という
低温においても、２０ｐｐｍ前後のＴＣＥをほぼ完全に
分解するといった卓越した有機塩素化合物分解能を有し
ているが、分解誘導物質としてフェノールやトルエン、
クレゾールといった芳香族化合物が必要である。
【００４１】これに対し、本発明で用いる変異株の菌学
的性質は、上記したＪ１株の菌学的性質と同一であるが
分解誘導物質としてのフェノールやトルエン、クレゾー
ルといった芳香族化合物が無い状態で有機塩素化合物を
分解する能力を有している。そこで、本菌株を新菌株で
あると認定し、通産省生命工学工業技術研究所に寄託し
た（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）（なお本菌
株は以降「ＪＭ１株」と称する）。
的性質は、上記したＪ１株の菌学的性質と同一であるが
分解誘導物質としてのフェノールやトルエン、クレゾー
ルといった芳香族化合物が無い状態で有機塩素化合物を
分解する能力を有している。そこで、本菌株を新菌株で
あると認定し、通産省生命工学工業技術研究所に寄託し
た（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）（なお本菌
株は以降「ＪＭ１株」と称する）。
【００４２】なお上記菌株ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２に
ついても、当初本菌株がコリネバクテリウム属に属して
いるものとして「コリネバクテリウム・スピーシズＪＭ
１株」と表示したが、“コリネバクテリウム属には属さ
ない”と認められたため、ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２の
識別のための表示を「ＪＭ１株」と変更した。
ついても、当初本菌株がコリネバクテリウム属に属して
いるものとして「コリネバクテリウム・スピーシズＪＭ
１株」と表示したが、“コリネバクテリウム属には属さ
ない”と認められたため、ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２の
識別のための表示を「ＪＭ１株」と変更した。
【００４３】前述したことからもわかるように、ＪＭ１
株は有機塩素化合物とならんでフェノールやクレゾール
といった芳香族化合物も分解し、必然的にこれらの化合
物に対する耐性を持ち合わせている。このような化合物
は通常殺菌剤として用いられていることからもわかるよ
うに、多くの微生物にとって有害であり、しかも実際に
廃液の成分として混入している場合も多い。しかしＪＭ
１株はこれらの化合物が混入していても、死滅や活性阻
害等の障害を受けることなく有機塩素化合物の分解処理
を実現することが可能である。
株は有機塩素化合物とならんでフェノールやクレゾール
といった芳香族化合物も分解し、必然的にこれらの化合
物に対する耐性を持ち合わせている。このような化合物
は通常殺菌剤として用いられていることからもわかるよ
うに、多くの微生物にとって有害であり、しかも実際に
廃液の成分として混入している場合も多い。しかしＪＭ
１株はこれらの化合物が混入していても、死滅や活性阻
害等の障害を受けることなく有機塩素化合物の分解処理
を実現することが可能である。
【００４４】また、地下水や土壌といった環境中の有機
塩素化合物を分解する際に、フェノール等の誘導物質を
必要としないから、通常の栄養素のみを導入すればよ
く、操作が簡便となる。また毒性や危険性の高い誘導物
質を環境中に放出しなければならないという問題から解
放される。
塩素化合物を分解する際に、フェノール等の誘導物質を
必要としないから、通常の栄養素のみを導入すればよ
く、操作が簡便となる。また毒性や危険性の高い誘導物
質を環境中に放出しなければならないという問題から解
放される。
【００４５】さらに、例えば塩素化脂肪族炭化水素化合
物を微生物を用いて分解する場合、該微生物がオキシゲ
ナーゼを誘導的に分解する微生物であるとフェノール等
の誘導物質を添加する必要があり、そしてオキシゲナー
ゼが誘導的に発現した該微生物は誘導物質と塩素化脂肪
族炭化水素化合物の両方を分解することになる為塩素化
脂肪族炭化水素化合物の分解効率は著しく低下してしま
う（拮抗阻害）。
物を微生物を用いて分解する場合、該微生物がオキシゲ
ナーゼを誘導的に分解する微生物であるとフェノール等
の誘導物質を添加する必要があり、そしてオキシゲナー
ゼが誘導的に発現した該微生物は誘導物質と塩素化脂肪
族炭化水素化合物の両方を分解することになる為塩素化
脂肪族炭化水素化合物の分解効率は著しく低下してしま
う（拮抗阻害）。
【００４６】これに対してオキシゲナーゼを構成的に有
している微生物は誘導物質が不要なため本来の分解対象
物である脂肪族有機塩素化合物を効率的に分解すること
ができる。
している微生物は誘導物質が不要なため本来の分解対象
物である脂肪族有機塩素化合物を効率的に分解すること
ができる。
【００４７】本発明のＪＭ１株を培養するために用いら
れる培地の栄養源としては、通常の微生物の生育に必要
とされるもので本菌が資化可能な栄養源であればいかな
る炭素源、窒素源及び無機塩類等でもよく、例えばＭ９
培地に若干の栄養源として酵母エキス等を添加したもの
で培養することが可能である。
れる培地の栄養源としては、通常の微生物の生育に必要
とされるもので本菌が資化可能な栄養源であればいかな
る炭素源、窒素源及び無機塩類等でもよく、例えばＭ９
培地に若干の栄養源として酵母エキス等を添加したもの
で培養することが可能である。
【００４８】以下にＭ９培地の組成を示す。
【００４９】 Ｎａ2 ＨＰＯ4 ： ６．２ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ： ３．０ｇ ＮａＣｌ： ０．５ｇ ＮＨ4 Ｃｌ： １．０ｇ （培地１ｌ中；ｐＨ
７．０） 培養は好気条件下で行うことができ、液体培養でも固体
培養でもよい。培養温度は３０℃前後が望ましい。
７．０） 培養は好気条件下で行うことができ、液体培養でも固体
培養でもよい。培養温度は３０℃前後が望ましい。
【００５０】次に上記変異株ＪＭ１株を取得する方法を
以下に説明する。
以下に説明する。
【００５１】前記したようにＪ１株を変異源を用いた変
異誘発処理を施すという一般的な変異処理によりＪＭ１
株を取得することができる。
異誘発処理を施すという一般的な変異処理によりＪＭ１
株を取得することができる。
【００５２】変異源としては物理的変異源や化学的変異
源として公知の物を用いることができ、具体的には物理
的変異源として紫外線、化学的変異源としてエチルメタ
ンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン、亜硝酸やアクリジン色素等が挙げられ
る。
源として公知の物を用いることができ、具体的には物理
的変異源として紫外線、化学的変異源としてエチルメタ
ンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン、亜硝酸やアクリジン色素等が挙げられ
る。
【００５３】そしてこのような変異源の使用による一般
的な変異処理によってオキシゲナーゼを構成的に有する
微生物は、従来の遺伝子組み替え技術を用いてオキシゲ
ナーゼを構成的に有する微生物を形成する場合と比較し
て極めて容易に取得でき、また微生物による環境修復に
利用する場合にも遺伝子組み替え体と比較して適用範囲
が広く好ましい物である。
的な変異処理によってオキシゲナーゼを構成的に有する
微生物は、従来の遺伝子組み替え技術を用いてオキシゲ
ナーゼを構成的に有する微生物を形成する場合と比較し
て極めて容易に取得でき、また微生物による環境修復に
利用する場合にも遺伝子組み替え体と比較して適用範囲
が広く好ましい物である。
【００５４】ところで本願出願人らは上記Ｊ１株からの
ＪＭ１株の取得にあたり、従来全く認識されてこなかっ
た技術的知見を得た。
ＪＭ１株の取得にあたり、従来全く認識されてこなかっ
た技術的知見を得た。
【００５５】それはオキシゲナーゼを誘導的に発現可能
な菌株であるＪ１株とオキシゲナーゼを構成的に発現し
ている菌株であるＪＭ１株とが共存している環境からの
ＪＭ１株の選択的な取得に関する物である。
な菌株であるＪ１株とオキシゲナーゼを構成的に発現し
ている菌株であるＪＭ１株とが共存している環境からの
ＪＭ１株の選択的な取得に関する物である。
【００５６】即ち、従来知られている誘導物質を必要と
しないトリクロロエチレン分解菌はオキシゲナーゼの酸
化作用によって呈色性酸化物を生じる様な化合物（以下
「前駆物質」と称する）を添加した培地で培養し、呈色
したコロニーを取り出すことで釣菌されている。
しないトリクロロエチレン分解菌はオキシゲナーゼの酸
化作用によって呈色性酸化物を生じる様な化合物（以下
「前駆物質」と称する）を添加した培地で培養し、呈色
したコロニーを取り出すことで釣菌されている。
【００５７】具体的にいえば、上記のＧ４株の変異株の
場合３−トリフルオロメチルカテコール（ＴＦＭＣ）の
酸化生成物である７，７，７−トリフルオロ−２−ヒド
ロキシ−６−オキソ−２，４−ヘプタジエノイック酸
（ＴＦＨＡ）が黄色に呈色することを利用して釣菌され
ており、また上記ＫＷＩ−９株の遺伝子組み替え体では
インドールの酸化生成物であるインジゴが青色を呈する
ことを利用している。なお、芳香族化合物オキシゲナー
ゼのこのような性質を利用して、インドールからインジ
ゴの生産を工業的に行う方法も開発されている（日本特
許公開平成６年２６１７７６号、日本特許公開平成６年
２６１７７７号、日本特許公開平成６年２６１７７８
号）。
場合３−トリフルオロメチルカテコール（ＴＦＭＣ）の
酸化生成物である７，７，７−トリフルオロ−２−ヒド
ロキシ−６−オキソ−２，４−ヘプタジエノイック酸
（ＴＦＨＡ）が黄色に呈色することを利用して釣菌され
ており、また上記ＫＷＩ−９株の遺伝子組み替え体では
インドールの酸化生成物であるインジゴが青色を呈する
ことを利用している。なお、芳香族化合物オキシゲナー
ゼのこのような性質を利用して、インドールからインジ
ゴの生産を工業的に行う方法も開発されている（日本特
許公開平成６年２６１７７６号、日本特許公開平成６年
２６１７７７号、日本特許公開平成６年２６１７７８
号）。
【００５８】ところが本発明者らの検討の結果、上記の
物質を含む前駆物質として用い得る公知の物質でオキシ
ゲナーゼを誘導的に発現する微生物にとっての誘導物質
として機能しないものを見出すことができなかった。
物質を含む前駆物質として用い得る公知の物質でオキシ
ゲナーゼを誘導的に発現する微生物にとっての誘導物質
として機能しないものを見出すことができなかった。
【００５９】この事はオキシゲナーゼを構成的に有する
微生物、例えばＪＭ１株とオキシゲナーゼを誘導的に発
現する微生物、例えばＪ１株とが共存する環境からオキ
シゲナーゼを構成的に有する微生物を選択的に取得する
場合に問題となる。
微生物、例えばＪＭ１株とオキシゲナーゼを誘導的に発
現する微生物、例えばＪ１株とが共存する環境からオキ
シゲナーゼを構成的に有する微生物を選択的に取得する
場合に問題となる。
【００６０】そしてこの事は従来のオキシゲナーゼを構
成的に発現している微生物の場合、その取得時の培養工
程でオキシゲナーゼを誘導的に発現する微生物と共存す
る状況は生じない為に技術課題としては認識されてこな
かった物と考えられる。
成的に発現している微生物の場合、その取得時の培養工
程でオキシゲナーゼを誘導的に発現する微生物と共存す
る状況は生じない為に技術課題としては認識されてこな
かった物と考えられる。
【００６１】したがって前駆体の酸化物の呈色を利用し
て、オキシゲナーゼを誘導的に発現する微生物とオキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物とが共存してい
る環境からオキシゲナーゼを構成的に発現している微生
物を選択的に効率よく取得する方法に関してはこれまで
何らの指針も示されてこなかった。
て、オキシゲナーゼを誘導的に発現する微生物とオキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物とが共存してい
る環境からオキシゲナーゼを構成的に発現している微生
物を選択的に効率よく取得する方法に関してはこれまで
何らの指針も示されてこなかった。
【００６２】そこで本発明者らはこの知見に対して種々
検討を行った結果、オキシゲナーゼを構成的に発現して
いる微生物の成長と呈色部分の発現との時間差とオキシ
ゲナーゼを誘導的に発現する微生物の成長と呈色部分の
発現との時間差との間に有意な差異を持たせることがで
きること、そしてそれを利用してオキシゲナーゼを構成
的に有する微生物を選択的にピックアップできることを
見出した。
検討を行った結果、オキシゲナーゼを構成的に発現して
いる微生物の成長と呈色部分の発現との時間差とオキシ
ゲナーゼを誘導的に発現する微生物の成長と呈色部分の
発現との時間差との間に有意な差異を持たせることがで
きること、そしてそれを利用してオキシゲナーゼを構成
的に有する微生物を選択的にピックアップできることを
見出した。
【００６３】具体的な方法で説明すると、例えば、寒天
プレート上でのインドールからインジゴへの酸化による
青色の呈色の場合、誘導的にオキシゲナーゼを発現する
微生物の場合は、ある程度コロニーを形成した後に中心
部より呈色が起こり、徐々にコロニー全体へと広がって
いく。これに対し、構成的にオキシゲナーゼを発現して
いる微生物の場合はコロニーの形成に伴って同時に呈色
が見られる。そこで、ある期間、すなわち構成的にオキ
シゲナーゼを発現している微生物のみの呈色が現れてい
る期間を区切ってコロニーの呈色を確認することによっ
て構成的にオキシゲナーゼを発現している微生物のみを
効率的に取得することができる。
プレート上でのインドールからインジゴへの酸化による
青色の呈色の場合、誘導的にオキシゲナーゼを発現する
微生物の場合は、ある程度コロニーを形成した後に中心
部より呈色が起こり、徐々にコロニー全体へと広がって
いく。これに対し、構成的にオキシゲナーゼを発現して
いる微生物の場合はコロニーの形成に伴って同時に呈色
が見られる。そこで、ある期間、すなわち構成的にオキ
シゲナーゼを発現している微生物のみの呈色が現れてい
る期間を区切ってコロニーの呈色を確認することによっ
て構成的にオキシゲナーゼを発現している微生物のみを
効率的に取得することができる。
【００６４】より具体的には例えばＪ１株及びＪＭ１株
とを、前駆体としてインドール及び栄養として酵母エキ
ス０．１％を含むＭ９寒天培地上で３０℃で培養したと
ころ１日経過後にＪ１株及びＪＭ１株は共に直径約１〜
２ｍｍ程度のコロニーに成長した。そしてＪＭ１株のコ
ロニーの方はインドールの酸化物であるインジゴの青色
に呈色した部分がコロニー全体に広がっているのに対
し、Ｊ１株のコロニーについてはインジゴの呈色部分は
目視では観察できなかった。更に培養開始から２〜３日
後には双方の微生物のコロニーは直径約５ｍｍとなり、
ＪＭ１株のコロニーの方はインドールの酸化物であるイ
ンジゴの青色に呈色した部分がコロニー全体に広がって
いるのに対し、Ｊ１株のコロニーについてはコロニー中
心部分に直径約１〜２ｍｍのインジゴの呈色部分が観察
された。
とを、前駆体としてインドール及び栄養として酵母エキ
ス０．１％を含むＭ９寒天培地上で３０℃で培養したと
ころ１日経過後にＪ１株及びＪＭ１株は共に直径約１〜
２ｍｍ程度のコロニーに成長した。そしてＪＭ１株のコ
ロニーの方はインドールの酸化物であるインジゴの青色
に呈色した部分がコロニー全体に広がっているのに対
し、Ｊ１株のコロニーについてはインジゴの呈色部分は
目視では観察できなかった。更に培養開始から２〜３日
後には双方の微生物のコロニーは直径約５ｍｍとなり、
ＪＭ１株のコロニーの方はインドールの酸化物であるイ
ンジゴの青色に呈色した部分がコロニー全体に広がって
いるのに対し、Ｊ１株のコロニーについてはコロニー中
心部分に直径約１〜２ｍｍのインジゴの呈色部分が観察
された。
【００６５】この結果から微生物の成長と前駆物質の酸
化物の発現との時間差のないコロニーをピックアップす
ることでＪＭ１株を選択的に取得することができる。
化物の発現との時間差のないコロニーをピックアップす
ることでＪＭ１株を選択的に取得することができる。
【００６６】上記のオキシゲナーゼを構成的に発現して
いる微生物の選択的な取得方法に於て前駆物質として
は、オキシゲナーゼによって呈色性の酸化物を生じるも
のの他に蛍光を生じるような酸化物を与える前駆物質を
用いることもできる。
いる微生物の選択的な取得方法に於て前駆物質として
は、オキシゲナーゼによって呈色性の酸化物を生じるも
のの他に蛍光を生じるような酸化物を与える前駆物質を
用いることもできる。
【００６７】前駆物質として例えば目視で検知しうるよ
うな呈色性の酸化物を生じるものを用いる場合、オキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物の選択的な取得
の為の酸化物の生成は、上記の通り、固体培地（例えば
寒天培地等）上のコロニーに生じる変色部分の発現によ
って確認できる。
うな呈色性の酸化物を生じるものを用いる場合、オキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物の選択的な取得
の為の酸化物の生成は、上記の通り、固体培地（例えば
寒天培地等）上のコロニーに生じる変色部分の発現によ
って確認できる。
【００６８】また前駆物質として蛍光を生じる酸化物を
与えるものを用いる場合、液体培養において培地中に該
前駆物質を含有させ、微生物が該前駆物質を取り込み、
オキシゲナーゼの酸化によって生ずる酸化物による菌体
の呈色（蛍光）を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）や
蛍光顕微鏡等の細胞検出手段にて検出及び単離すること
が可能である。この場合はコロニー形成のような菌体の
増殖期間を省略することが可能であり、より効率の高い
取得方法となる。具体的な例としては、インドールがオ
キシゲナーゼによって酸化され、インジゴとなる中間生
成物であるインドキシルが、緑色蛍光を発することを利
用することが可能である。
与えるものを用いる場合、液体培養において培地中に該
前駆物質を含有させ、微生物が該前駆物質を取り込み、
オキシゲナーゼの酸化によって生ずる酸化物による菌体
の呈色（蛍光）を、フローサイトメーター（ＦＣＭ）や
蛍光顕微鏡等の細胞検出手段にて検出及び単離すること
が可能である。この場合はコロニー形成のような菌体の
増殖期間を省略することが可能であり、より効率の高い
取得方法となる。具体的な例としては、インドールがオ
キシゲナーゼによって酸化され、インジゴとなる中間生
成物であるインドキシルが、緑色蛍光を発することを利
用することが可能である。
【００６９】また前記オキシゲナーゼを構成的に発現し
ている微生物の選択的な取得方法に用いる前駆物質は、
検出対象の微生物が有するオキシゲナーゼの種類に応じ
て選択することが好ましい。
ている微生物の選択的な取得方法に用いる前駆物質は、
検出対象の微生物が有するオキシゲナーゼの種類に応じ
て選択することが好ましい。
【００７０】例えば上記のＪＭ１株は有機化合物、例え
ば芳香族化合物や塩素化脂肪族炭化水素を芳香族分解経
路（ａｒｏｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｔｉｖｅ ｐａｔｈ
ｗａｙ）によって分解する芳香族化合物オキシゲナーゼ
を構成的に有していることから、前駆物質としてはイン
ドール、クレオソート、カテコール、３−メチルカテコ
ール、３−トリフルオロメチルカテコール、ｏ−アミノ
フェノール等を用いることが好ましい。
ば芳香族化合物や塩素化脂肪族炭化水素を芳香族分解経
路（ａｒｏｍａｔｉｃ ｄｅｇｒａｔｉｖｅ ｐａｔｈ
ｗａｙ）によって分解する芳香族化合物オキシゲナーゼ
を構成的に有していることから、前駆物質としてはイン
ドール、クレオソート、カテコール、３−メチルカテコ
ール、３−トリフルオロメチルカテコール、ｏ−アミノ
フェノール等を用いることが好ましい。
【００７１】またオキシゲナーゼがアルカン化合物オキ
シゲナーゼやアンモニアオキシゲナーゼである場合には
それぞれのオキシゲナーゼに適した前駆物質を用いれば
よい。
シゲナーゼやアンモニアオキシゲナーゼである場合には
それぞれのオキシゲナーゼに適した前駆物質を用いれば
よい。
【００７２】ところで上記したオキシゲナーゼを構成的
に有する微生物の取得方法は他の用途への適用も可能で
ある。
に有する微生物の取得方法は他の用途への適用も可能で
ある。
【００７３】例えば、構成的にオキシゲナーゼを発現し
ている微生物の応用として、汚染物質で汚染された環境
中に該微生物を投入して環境修復を行わせる事が予想さ
れる。
ている微生物の応用として、汚染物質で汚染された環境
中に該微生物を投入して環境修復を行わせる事が予想さ
れる。
【００７４】そして効率良く環境修復を行う上で、環境
中の該微生物を継続してモニターしていくことは重要と
考えられ、この場合処理環境中に存在している種々の土
着微生物の中から上記の構成的にオキシゲナーゼを発現
している微生物のみを区別して検出する技術が必要とな
ってくると推定される。このときに上記の方法を応用す
ることで該処理環境中のオキシゲナーゼを構成的に有す
る微生物を選択的に検出することができる。
中の該微生物を継続してモニターしていくことは重要と
考えられ、この場合処理環境中に存在している種々の土
着微生物の中から上記の構成的にオキシゲナーゼを発現
している微生物のみを区別して検出する技術が必要とな
ってくると推定される。このときに上記の方法を応用す
ることで該処理環境中のオキシゲナーゼを構成的に有す
る微生物を選択的に検出することができる。
【００７５】具体的には前駆物質を含む培地上で処理環
境中から取得した微生物の混合物を培養し、微生物の増
殖と前駆物質の酸化物の発現との間に時間差が実質的に
無い微生物を検出することで処理環境中のオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物の存在の検出を行うこ
とができる。
境中から取得した微生物の混合物を培養し、微生物の増
殖と前駆物質の酸化物の発現との間に時間差が実質的に
無い微生物を検出することで処理環境中のオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物の存在の検出を行うこ
とができる。
【００７６】なおオキシゲナーゼを構成的に有する微生
物の成長と酸化物、例えば呈色部分の発現との時間差と
オキシゲナーゼを誘導的に発現する微生物の成長と酸化
物、例えば呈色部分の発現との時間差との間の差異を、
環境中のオキシゲナーゼを構成的に有する微生物の検出
に適用する場合、該処理環境中の土着微生物が該環境中
においてオキシゲナーゼを誘導的に発現している場合も
考えられる為、該前駆体を含む培地での該環境中の微生
物混合物の培養工程に先立って、誘導物質を含まない培
地で該微生物混合物を培養してオキシゲナーゼを誘導的
に発現している微生物からオキシゲナーゼを消滅させて
おくことが好ましい。
物の成長と酸化物、例えば呈色部分の発現との時間差と
オキシゲナーゼを誘導的に発現する微生物の成長と酸化
物、例えば呈色部分の発現との時間差との間の差異を、
環境中のオキシゲナーゼを構成的に有する微生物の検出
に適用する場合、該処理環境中の土着微生物が該環境中
においてオキシゲナーゼを誘導的に発現している場合も
考えられる為、該前駆体を含む培地での該環境中の微生
物混合物の培養工程に先立って、誘導物質を含まない培
地で該微生物混合物を培養してオキシゲナーゼを誘導的
に発現している微生物からオキシゲナーゼを消滅させて
おくことが好ましい。
【００７７】また上記オキシゲナーゼを構成的に発現し
ている微生物の選択的な取得方法或はそれを用いた検出
方法に於いて、培地に加える栄養としてはオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物とオキシゲナーゼを誘
導的に発現することのできる微生物とが同程度の速度で
増殖できる様な栄養を用いる事が好ましい。
ている微生物の選択的な取得方法或はそれを用いた検出
方法に於いて、培地に加える栄養としてはオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物とオキシゲナーゼを誘
導的に発現することのできる微生物とが同程度の速度で
増殖できる様な栄養を用いる事が好ましい。
【００７８】何故ならオキシゲナーゼを構成的に発現し
ている微生物とオキシゲナーゼを誘導的に発現すること
のできる微生物との間で微生物の増殖と培地中の前駆物
質の酸化物の発現との時間差の比較を容易に行うことが
できる為である。
ている微生物とオキシゲナーゼを誘導的に発現すること
のできる微生物との間で微生物の増殖と培地中の前駆物
質の酸化物の発現との時間差の比較を容易に行うことが
できる為である。
【００７９】例えば前記したＪ１株の変異株であるＪＭ
１株をＪ１株が共存している環境から取得するような場
合には親株と子株との間には通常大きな増殖速度の差異
があるとは考え難く栄養の選択が大きな問題となること
は少ないと考えられる。
１株をＪ１株が共存している環境から取得するような場
合には親株と子株との間には通常大きな増殖速度の差異
があるとは考え難く栄養の選択が大きな問題となること
は少ないと考えられる。
【００８０】しかし処理環境中のオキシゲナーゼを構成
的に発現している微生物の検出の場合、処理環境中に存
在する微生物は種々雑多であり栄養の選択が検出精度に
影響を与えることがあり、処理環境中に存在するオキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物の存在を検出す
る方法に於いては栄養の選択はより重要である。
的に発現している微生物の検出の場合、処理環境中に存
在する微生物は種々雑多であり栄養の選択が検出精度に
影響を与えることがあり、処理環境中に存在するオキシ
ゲナーゼを構成的に発現している微生物の存在を検出す
る方法に於いては栄養の選択はより重要である。
【００８１】従って処理環境中に存在するオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物の存在を検出する方法
を実施する場合には、例えば処理に用いるオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物の種々の栄養に対する
増殖速度を調べると共に処理しようとする環境中の微生
物の種々の栄養に対する増殖速度を調べ、同程度の増殖
速度を得られる栄養を予め選択し、その栄養を培地に添
加して上記の検出方法を実施することが好ましい。
ゼを構成的に発現している微生物の存在を検出する方法
を実施する場合には、例えば処理に用いるオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物の種々の栄養に対する
増殖速度を調べると共に処理しようとする環境中の微生
物の種々の栄養に対する増殖速度を調べ、同程度の増殖
速度を得られる栄養を予め選択し、その栄養を培地に添
加して上記の検出方法を実施することが好ましい。
【００８２】ここで選択される培地は各処理環境に棲息
している微生物によって種々異なる物と考えられ一概に
決定されるものではなく、例えば酵母エキス、ペプト
ン、肉汁、麦芽エキス、等を含む天然培地や無機塩を含
む培地に炭素源及びエネルギー源を加えた合成培地等の
中から各処理環境に適応した培地を選択すればよい。
している微生物によって種々異なる物と考えられ一概に
決定されるものではなく、例えば酵母エキス、ペプト
ン、肉汁、麦芽エキス、等を含む天然培地や無機塩を含
む培地に炭素源及びエネルギー源を加えた合成培地等の
中から各処理環境に適応した培地を選択すればよい。
【００８３】更に上記のオキシゲナーゼを構成的に発現
している微生物の検出方法によって検出可能なオキシゲ
ナーゼを構成的に発現している微生物は、前記したＪＭ
１株のような変異源を用いて変異された微生物に限られ
ず、従来のオキシゲナーゼを構成的に発現している微生
物、例えばシュードモナスメンドシナＫＲ−１の組み換
え菌株等も検出可能である。
している微生物の検出方法によって検出可能なオキシゲ
ナーゼを構成的に発現している微生物は、前記したＪＭ
１株のような変異源を用いて変異された微生物に限られ
ず、従来のオキシゲナーゼを構成的に発現している微生
物、例えばシュードモナスメンドシナＫＲ−１の組み換
え菌株等も検出可能である。
【００８４】次に構成的にオキシゲナーゼを発現してい
る微生物をもちいた有機化合物の分解処理方法及び環境
修復方法について説明する。
る微生物をもちいた有機化合物の分解処理方法及び環境
修復方法について説明する。
【００８５】オキシゲナーゼを構成的に発現している微
生物、例えば前記した取得方法で得た微生物（ＪＭ１
等）を用いて有機化合物、例えば芳香族化合物（フェノ
ール、トルエンやクレゾール等）や塩素化脂肪族炭化水
素化合物（トリクロロエチレンやジクロロエチレン等）
を分解処理する方法としては、該有機化合物を該微生物
と接触させることによって行うことができる。
生物、例えば前記した取得方法で得た微生物（ＪＭ１
等）を用いて有機化合物、例えば芳香族化合物（フェノ
ール、トルエンやクレゾール等）や塩素化脂肪族炭化水
素化合物（トリクロロエチレンやジクロロエチレン等）
を分解処理する方法としては、該有機化合物を該微生物
と接触させることによって行うことができる。
【００８６】そして分解処理前及び分解処理中を通じて
誘導物質を用いる必要が無い。
誘導物質を用いる必要が無い。
【００８７】該微生物と分解されるべき有機化合物との
接触は微生物が分解活性を発現し得る通常の条件であれ
ばいかなる方法でも行うことができ、バッチ法、半連続
法、連続法等種々の方法を用いて実施できる。
接触は微生物が分解活性を発現し得る通常の条件であれ
ばいかなる方法でも行うことができ、バッチ法、半連続
法、連続法等種々の方法を用いて実施できる。
【００８８】該微生物は半固定状態で或いは適当な担体
に固定化して用いることもできる。本発明にかかる、オ
キシゲナーゼを構成的に発現してなる微生物を汚染物質
として有機化合物、例えば芳香族化合物（フェノール、
トルエン、クレゾールなど）や塩素化脂肪族炭化水素化
合物（トリクロロエチレン、ジクロロエチレンなど）を
含む水性媒体と接触させることで該有機化合物の分解そ
して該水性媒体の浄化処理を行うことができる。
に固定化して用いることもできる。本発明にかかる、オ
キシゲナーゼを構成的に発現してなる微生物を汚染物質
として有機化合物、例えば芳香族化合物（フェノール、
トルエン、クレゾールなど）や塩素化脂肪族炭化水素化
合物（トリクロロエチレン、ジクロロエチレンなど）を
含む水性媒体と接触させることで該有機化合物の分解そ
して該水性媒体の浄化処理を行うことができる。
【００８９】以下に主な利用形態を述べるが、これらの
形態に限定されることなく、本菌株はいかなる水性媒体
中の有機化合物汚染の浄化処理にも利用可能である。
形態に限定されることなく、本菌株はいかなる水性媒体
中の有機化合物汚染の浄化処理にも利用可能である。
【００９０】例えば、最も簡便な方法としては、例えば
芳香族化合物や有機塩素化合物によって汚染された水性
媒体中に直接ＪＭ１株を導入して行うという方法があ
る。この場合、水性媒体のｐＨ、塩濃度、温度や汚染物
質の濃度等を調整する必要があるが、例えばＪＭ１株は
極端な酸性或いはアルカリ性、高塩濃度でない限り分解
活性は維持され、また前述のように２０ｐｐｍという高
濃度のＴＣＥも分解する能力を有している。さらに、通
常の実験室での培養温度よりも低い１５℃でも遜色なく
増殖し、十分に分解活性を維持し得る。
芳香族化合物や有機塩素化合物によって汚染された水性
媒体中に直接ＪＭ１株を導入して行うという方法があ
る。この場合、水性媒体のｐＨ、塩濃度、温度や汚染物
質の濃度等を調整する必要があるが、例えばＪＭ１株は
極端な酸性或いはアルカリ性、高塩濃度でない限り分解
活性は維持され、また前述のように２０ｐｐｍという高
濃度のＴＣＥも分解する能力を有している。さらに、通
常の実験室での培養温度よりも低い１５℃でも遜色なく
増殖し、十分に分解活性を維持し得る。
【００９１】また別の利用形態としては、培養槽を設け
そこで微生物を培養し、この培養槽に汚染された水性媒
体を所定の流量で導入し、分解させる形態がある。水性
媒体の導入及び排出は連続して行ってもよいが、処理能
力に応じて間欠的に、或いはバッチ式で処理することも
可能である。このような制御を芳香族化合物及び／或い
は有機塩素化合物の濃度に合わせてシステム制御し最適
化を図るとよい。
そこで微生物を培養し、この培養槽に汚染された水性媒
体を所定の流量で導入し、分解させる形態がある。水性
媒体の導入及び排出は連続して行ってもよいが、処理能
力に応じて間欠的に、或いはバッチ式で処理することも
可能である。このような制御を芳香族化合物及び／或い
は有機塩素化合物の濃度に合わせてシステム制御し最適
化を図るとよい。
【００９２】さらに、微生物を担体、例えば土壌粒子等
に付着させ、これを反応槽に充填し、この反応槽内に汚
染された水性媒体を導入し分解処理を行う形態がある。
この場合使用する担体には、土壌粒子に限らずいかなる
ものでも利用可能であるが、微生物の保持能力に優れ、
通気性を損なわないようなものがより望ましい。例え
ば、微生物の棲息空間を与えるような材料として、従来
より医薬品工業、食品工業、廃水処理システム等で利用
されるバイオリアクタで汎用されている様々な微生物担
体が利用できる。
に付着させ、これを反応槽に充填し、この反応槽内に汚
染された水性媒体を導入し分解処理を行う形態がある。
この場合使用する担体には、土壌粒子に限らずいかなる
ものでも利用可能であるが、微生物の保持能力に優れ、
通気性を損なわないようなものがより望ましい。例え
ば、微生物の棲息空間を与えるような材料として、従来
より医薬品工業、食品工業、廃水処理システム等で利用
されるバイオリアクタで汎用されている様々な微生物担
体が利用できる。
【００９３】より具体的には、多孔質ガラス、セラミク
ス、金属酸化物、活性炭、カオリナイト、ベントナイ
ト、ゼオライト、シリカゲル、アルミナ、アンスラサイ
ト等の無機粒子状担体、デンプン、寒天、キチン、キト
サン、ポリビニルアルコール、アルギン酸、ポリアクリ
ルアミド、カラギーナン、アガロース、ゼラチン等のゲ
ル状担体、イオン交換性セルロース、イオン交換樹脂、
セルロース誘導体、グルタルアルデヒド、ポリアクリル
酸、ポリウレタン、ポリエステル等が挙げられる。また
天然物として、綿、麻、紙類といったセルロース系のも
の、木粉、樹皮といったリグニン系のものも利用可能で
ある。
ス、金属酸化物、活性炭、カオリナイト、ベントナイ
ト、ゼオライト、シリカゲル、アルミナ、アンスラサイ
ト等の無機粒子状担体、デンプン、寒天、キチン、キト
サン、ポリビニルアルコール、アルギン酸、ポリアクリ
ルアミド、カラギーナン、アガロース、ゼラチン等のゲ
ル状担体、イオン交換性セルロース、イオン交換樹脂、
セルロース誘導体、グルタルアルデヒド、ポリアクリル
酸、ポリウレタン、ポリエステル等が挙げられる。また
天然物として、綿、麻、紙類といったセルロース系のも
の、木粉、樹皮といったリグニン系のものも利用可能で
ある。
【００９４】本発明における土壌中の汚染物質としての
有機化合物の分解処理は、土壌中に存在する該有機化合
物と微生物を接触させることによって行うことができ
る。以下に主な利用形態を述べるが、これらの形態に限
定されることなく、本菌株は芳香族化合物及び／或いは
塩素化脂肪族炭化水素化合物で汚染された土壌の様々な
浄化処理にも利用可能である。
有機化合物の分解処理は、土壌中に存在する該有機化合
物と微生物を接触させることによって行うことができ
る。以下に主な利用形態を述べるが、これらの形態に限
定されることなく、本菌株は芳香族化合物及び／或いは
塩素化脂肪族炭化水素化合物で汚染された土壌の様々な
浄化処理にも利用可能である。
【００９５】例えば、最も簡便な方法としては、汚染物
質としての有機化合物、例えば芳香族化合物や有機塩素
化合物によって汚染された土壌中に直接微生物を導入し
て行うという方法がある。導入の方法としては、土壌表
面に散布して行う方法はもとより、比較的深い地層中の
処理の場合には、地中に挿入した井戸から導入する方法
がある。
質としての有機化合物、例えば芳香族化合物や有機塩素
化合物によって汚染された土壌中に直接微生物を導入し
て行うという方法がある。導入の方法としては、土壌表
面に散布して行う方法はもとより、比較的深い地層中の
処理の場合には、地中に挿入した井戸から導入する方法
がある。
【００９６】さらに、空気や水等によって圧力をかけて
行うと広範囲に微生物が広がり、より効果的である。こ
の場合、土壌中の諸条件を処理に用いる微生物に適する
ように調整する必要があるが、微生物は土壌粒子等の担
体の存在下で増殖がより速められ、この意味で土壌中と
いう条件は好都合である。さらに、通常土壌中の平均温
度とされている１５℃でも遜色なく増殖し、十分に分解
活性を維持し得る。
行うと広範囲に微生物が広がり、より効果的である。こ
の場合、土壌中の諸条件を処理に用いる微生物に適する
ように調整する必要があるが、微生物は土壌粒子等の担
体の存在下で増殖がより速められ、この意味で土壌中と
いう条件は好都合である。さらに、通常土壌中の平均温
度とされている１５℃でも遜色なく増殖し、十分に分解
活性を維持し得る。
【００９７】さらに、微生物を担体に付着させ、これを
反応槽に充填し、この反応槽を汚染された土壌の、主に
帯水層中に導入し分解処理を行う形態がある。
反応槽に充填し、この反応槽を汚染された土壌の、主に
帯水層中に導入し分解処理を行う形態がある。
【００９８】反応槽の形態はフェンス状やフィルム状の
ような、土壌中の広範囲を網羅できるものが望ましい。
この場合使用する担体も、いかなるものでも利用可能で
あるが、微生物の保持能力に優れ、通気性を損なわない
ようなものがより望ましい。例えば、微生物の棲息空間
を与えるような材料としては前記の担体として利用可能
な材料と同様の材料を用いることができる。
ような、土壌中の広範囲を網羅できるものが望ましい。
この場合使用する担体も、いかなるものでも利用可能で
あるが、微生物の保持能力に優れ、通気性を損なわない
ようなものがより望ましい。例えば、微生物の棲息空間
を与えるような材料としては前記の担体として利用可能
な材料と同様の材料を用いることができる。
【００９９】本発明における気相中の汚染物質としての
有機化合物、例えば芳香族化合物や有機塩素化合物の分
解処理は、気相中に存在する汚染物質と微生物を接触さ
せることによって行うことができる。以下に主な利用形
態を述べるが、これらの形態に限定されることなく、本
菌株はいかなる態様の気相中の芳香族化合物及び／或い
は有機塩素化合物気相汚染の浄化処理にも利用可能であ
る。
有機化合物、例えば芳香族化合物や有機塩素化合物の分
解処理は、気相中に存在する汚染物質と微生物を接触さ
せることによって行うことができる。以下に主な利用形
態を述べるが、これらの形態に限定されることなく、本
菌株はいかなる態様の気相中の芳香族化合物及び／或い
は有機塩素化合物気相汚染の浄化処理にも利用可能であ
る。
【０１００】例えば、培養槽を設け微生物を培養し、こ
の培養槽に汚染された気体を所定の流量で導入し、分解
させる形態がある。気体の導入法については何ら制限は
ないが、気体の導入により培養液が攪拌されエアレーシ
ョンが促進される形態がより望ましい。気体の導入及び
排気は連続して行ってもよいが、処理能力に応じて間欠
的に、或いはバッチ式で処理することも可能である。こ
のような制御を有機塩素化合物の濃度に合わせてシステ
ム制御し最適化を図るとよい。
の培養槽に汚染された気体を所定の流量で導入し、分解
させる形態がある。気体の導入法については何ら制限は
ないが、気体の導入により培養液が攪拌されエアレーシ
ョンが促進される形態がより望ましい。気体の導入及び
排気は連続して行ってもよいが、処理能力に応じて間欠
的に、或いはバッチ式で処理することも可能である。こ
のような制御を有機塩素化合物の濃度に合わせてシステ
ム制御し最適化を図るとよい。
【０１０１】また別の利用形態としては微生物を担体、
例えば土壌粒子等に付着させ、これを反応槽に充填し、
この反応槽内に汚染気体を導入し分解処理を行う形態が
ある。この場合使用する担体も、土壌粒子に限らずいか
なるものでも利用可能であるが、微生物の保持能力に優
れ、通気性を損なわないようなものがより望ましい。
例えば土壌粒子等に付着させ、これを反応槽に充填し、
この反応槽内に汚染気体を導入し分解処理を行う形態が
ある。この場合使用する担体も、土壌粒子に限らずいか
なるものでも利用可能であるが、微生物の保持能力に優
れ、通気性を損なわないようなものがより望ましい。
【０１０２】例えば、微生物の棲息空間を与えるような
材料としては前記した土壌処理に用いられる担体として
例示の材料と同様の材料を用いることができる。
材料としては前記した土壌処理に用いられる担体として
例示の材料と同様の材料を用いることができる。
【０１０３】さらに、菌の保持と栄養供給を兼用できる
材料としては、農林水産業関係で利用される堆肥等にそ
の例を多く挙げることができる。即ち、麦わら等の穀物
類の藁や木鋸屑、米糠、雪花菜、砂糖黍の絞りかす等の
植物由来の乾燥物、またカニやエビの殻等の海産廃棄物
等が利用できる。
材料としては、農林水産業関係で利用される堆肥等にそ
の例を多く挙げることができる。即ち、麦わら等の穀物
類の藁や木鋸屑、米糠、雪花菜、砂糖黍の絞りかす等の
植物由来の乾燥物、またカニやエビの殻等の海産廃棄物
等が利用できる。
【０１０４】汚染気体の浄化には、担体になる物質をあ
らかじめ充填した上で菌を導入してもよいし、前培養し
てもかまわない。分解反応をより効率的に行わせるため
には、先に述べた栄養素や含水比、酸素濃度等を所望の
条件に保つとよい。また、反応槽内の担体と水分量の比
は微生物の生育と通気性から、反応槽の形態は処理する
気体の量、濃度等により適宜選択すればよいが、気体と
担体に保持される微生物との接触が促進されるように配
慮するとよい。具体的には例えば、カラム、チューブ、
タンク、箱形のものを利用することができる。さらにこ
のような形状のものを排気ダクトやフィルタ等とユニッ
ト化してもよいし、能力に合わせていくつかを直列や並
列に連続させてもよい。
らかじめ充填した上で菌を導入してもよいし、前培養し
てもかまわない。分解反応をより効率的に行わせるため
には、先に述べた栄養素や含水比、酸素濃度等を所望の
条件に保つとよい。また、反応槽内の担体と水分量の比
は微生物の生育と通気性から、反応槽の形態は処理する
気体の量、濃度等により適宜選択すればよいが、気体と
担体に保持される微生物との接触が促進されるように配
慮するとよい。具体的には例えば、カラム、チューブ、
タンク、箱形のものを利用することができる。さらにこ
のような形状のものを排気ダクトやフィルタ等とユニッ
ト化してもよいし、能力に合わせていくつかを直列や並
列に連続させてもよい。
【０１０５】汚染気体は、初め担体材料に吸着する場合
もあり、微生物利用の効果が初めのうちはうまく観察さ
れない例も稀にあるが、一定期間の後には担体材料に付
着した汚染物質が分解されて、また汚染物質の分解した
材料表面に再度汚染物質が吸着するというように、担体
材料への吸着性は再生されると考えられ、汚染除去能は
飽和することなく常に一定の分解能を維持すると推定で
きる。
もあり、微生物利用の効果が初めのうちはうまく観察さ
れない例も稀にあるが、一定期間の後には担体材料に付
着した汚染物質が分解されて、また汚染物質の分解した
材料表面に再度汚染物質が吸着するというように、担体
材料への吸着性は再生されると考えられ、汚染除去能は
飽和することなく常に一定の分解能を維持すると推定で
きる。
【０１０６】以上のような浄化処理における微生物の増
殖材料としては一般に用いられる微生物培養用の培地を
使用できる。例えば、ＪＭ１株の場合、ブイヨン培地、
Ｍ９培地、２×ＹＴ培地、Ｌ培地、或いはポリペプト
ン、酵母エキス等と糖や有機酸等の炭素源を任意に混合
した培地等が有効である。また、これらの培地は液状、
或いはアガローズを加えることによりゲル状に調製した
もの、いずれも利用可能である。
殖材料としては一般に用いられる微生物培養用の培地を
使用できる。例えば、ＪＭ１株の場合、ブイヨン培地、
Ｍ９培地、２×ＹＴ培地、Ｌ培地、或いはポリペプト
ン、酵母エキス等と糖や有機酸等の炭素源を任意に混合
した培地等が有効である。また、これらの培地は液状、
或いはアガローズを加えることによりゲル状に調製した
もの、いずれも利用可能である。
【０１０７】上記した環境修復方法は、閉鎖系、開放系
いずれの廃液処理、土壌処理、及び空気処理方法にも適
用できる。なお、微生物を担体等に固定して用いたり、
生育を促進する各種の方法を併用してもよい。
いずれの廃液処理、土壌処理、及び空気処理方法にも適
用できる。なお、微生物を担体等に固定して用いたり、
生育を促進する各種の方法を併用してもよい。
【０１０８】以上説明した様に本発明に係る各実施態様
によれば、誘導物質を用いることなく、効率の良い有機
化合物の生分解を行なうことができる。
によれば、誘導物質を用いることなく、効率の良い有機
化合物の生分解を行なうことができる。
【０１０９】又、有機化合物で汚染された環境を効率良
く、且つ処理されるべき環境に大きな影響を与えること
なく修復することができる。
く、且つ処理されるべき環境に大きな影響を与えること
なく修復することができる。
【０１１０】又、構成的（ｉｎｈｅｒｅｎｔｌｙ）に酵
素を発現してなる微生物の選択的な取得及び検出を行な
うことができる。
素を発現してなる微生物の選択的な取得及び検出を行な
うことができる。
【０１１１】
実施例１ ＪＭ１株の取得及びオキシゲナーゼ活性 寒天培地上のＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）のコ
ロニーを、酵母エキス０．１％及びフェノール２００ｐ
ｐｍを含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、坂口フラスコ
中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
ロニーを、酵母エキス０．１％及びフェノール２００ｐ
ｐｍを含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、坂口フラスコ
中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
【０１１２】次に、上記のように培養した菌液１０ｍｌ
を遠心分離して集菌し、上澄みを除去した後、２０ｐｐ
ｍのＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン）及び２００ｐｐｍのフェノールを含むＭ９
培地を５ｍｌ加え、３０℃で振盪培養を行った。菌液は
２時間から３時間で、フェノールの分解中間生成物であ
る２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド由来の黄色を
呈し始めるので、この時点の菌液を、２００ｐｐｍのイ
ンドール及び、酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地
上に塗布し、３０℃で静置培養を行った。
を遠心分離して集菌し、上澄みを除去した後、２０ｐｐ
ｍのＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン）及び２００ｐｐｍのフェノールを含むＭ９
培地を５ｍｌ加え、３０℃で振盪培養を行った。菌液は
２時間から３時間で、フェノールの分解中間生成物であ
る２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド由来の黄色を
呈し始めるので、この時点の菌液を、２００ｐｐｍのイ
ンドール及び、酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地
上に塗布し、３０℃で静置培養を行った。
【０１１３】通常インドールは、多くの芳香族分解（酸
化或いは水酸化）酵素によって変換され、インディゴと
なって青色を呈する。
化或いは水酸化）酵素によって変換され、インディゴと
なって青色を呈する。
【０１１４】培養開始から１日後培地上には直径約１〜
２ｍｍ程度のコロニーが目視で認められ、あるコロニー
は全体が濃い青色を呈しており、又あるコロニーはコロ
ニー本来の色（白色）を保っていた。培養開始から２〜
３日で殆んどのコロニーは直径が約５ｍｍにまで成長
し、コロニー全体が濃青色に着色したコロニーと、直径
約５ｍｍの白色のコロニーの中心に直径約１〜２ｍｍの
濃青色の着色部を有するコロニーとが認められた。
２ｍｍ程度のコロニーが目視で認められ、あるコロニー
は全体が濃い青色を呈しており、又あるコロニーはコロ
ニー本来の色（白色）を保っていた。培養開始から２〜
３日で殆んどのコロニーは直径が約５ｍｍにまで成長
し、コロニー全体が濃青色に着色したコロニーと、直径
約５ｍｍの白色のコロニーの中心に直径約１〜２ｍｍの
濃青色の着色部を有するコロニーとが認められた。
【０１１５】そこで全体が濃青色に着色しているコロニ
ーを坂口フラスコ中の酵母エキス０．２％のみを含むＭ
９培地２００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振盪培養
を行い、遠心分離にて分離した細胞ペレットをフレンチ
プレスにて破砕した細胞エキスを用いて、この微生物の
カテコール−１，２−オキシゲナーゼ（Ｃ１２Ｏ）及び
カテコール−２，３−オキシゲナーゼ（Ｃ２３Ｏ）を、
それぞれ分光測定により検出した（Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，６Ｂ，４６３−４７８（１９７７））。
ーを坂口フラスコ中の酵母エキス０．２％のみを含むＭ
９培地２００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振盪培養
を行い、遠心分離にて分離した細胞ペレットをフレンチ
プレスにて破砕した細胞エキスを用いて、この微生物の
カテコール−１，２−オキシゲナーゼ（Ｃ１２Ｏ）及び
カテコール−２，３−オキシゲナーゼ（Ｃ２３Ｏ）を、
それぞれ分光測定により検出した（Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，６Ｂ，４６３−４７８（１９７７））。
【０１１６】なお、蛋白定量はバイオラッドプロテイン
アッセイキットにて行った。また対照として、同様の条
件でのＪ１株の酵素活性、及び１００ｐｐｍのフェノー
ルを加えた培地で培養したＪ１株の酵素活性も併せて測
定した。結果を表１に示す。
アッセイキットにて行った。また対照として、同様の条
件でのＪ１株の酵素活性、及び１００ｐｐｍのフェノー
ルを加えた培地で培養したＪ１株の酵素活性も併せて測
定した。結果を表１に示す。
【０１１７】 表１の結果から、着色菌株は誘導物質無しで、誘導物質
であるフェノール存在下で培養したＪ１株を越えるオキ
シゲナーゼ活性を示すことから、オキシゲナーゼを本来
的に備えた、即ちオキシゲナーゼを構成的に発現してい
る微生物であり、又Ｊ１株とは別の菌株であることが分
った。
であるフェノール存在下で培養したＪ１株を越えるオキ
シゲナーゼ活性を示すことから、オキシゲナーゼを本来
的に備えた、即ちオキシゲナーゼを構成的に発現してい
る微生物であり、又Ｊ１株とは別の菌株であることが分
った。
【０１１８】そしてこの菌株の菌学的性質は下記の通り
であって、Ｊ１株の示す菌学的性質と同一であった。
であって、Ｊ１株の示す菌学的性質と同一であった。
【０１１９】グラム染色性及び形態：グラム陰性桿菌 各培地における生育 ＢＨＩＡ：生育良好 ＭａｃＣｏｎｋｅｙ：生育可能 コロニーの色：クリーム色 至適温度：２５℃＞３０℃＞３５℃ 運動性：陰性（半流動培地） ＴＳＩ（ｓｌａｎｔ／ｂｕｔｔ）：アルカリ／アルカ
リ、Ｈ2 Ｓ(-) オキシダーゼ：陽性（弱） カタラーゼ：陽性 糖の発酵 グルコース：陰性 シュクロース：陰性 ラフィノース：陰性 ガラクトース：陰性 マルトース：陰性 ウレアーゼ：陽性 エスクリン加水分解（β−グルコシダーゼ）：陽性 硝酸還元：陰性 インドール産生：陰性 グルコース酸性化：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 ゼラチン加水分解（プロテアーゼ）：陰性 β−ガラクトシダーゼ：陰性 各化合物の同化 グルコース：陰性 Ｌ−アラビノース：陰性 Ｄ−マンノース：陰性 Ｄ−マンニトール：陰性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性 マルトース：陰性 グルコン酸カリウム：陰性 ｎ−カプリン酸：陽性 アジピン酸：陰性 ｄｌ−リンゴ酸：陽性 クエン酸ナトリウム：陽性 酢酸フェニル：陰性 以上の結果から、上記の着色菌株はＪ１株に変異源を作
用させることによって誘発された、オキシゲナーゼを構
成的に発現してなる新規な、Ｊ１変異株であると認め、
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペ
スト条約に基づき下記の国際寄託当局にＦＥＲＭ ＢＰ
−５３５２として寄託した。
リ、Ｈ2 Ｓ(-) オキシダーゼ：陽性（弱） カタラーゼ：陽性 糖の発酵 グルコース：陰性 シュクロース：陰性 ラフィノース：陰性 ガラクトース：陰性 マルトース：陰性 ウレアーゼ：陽性 エスクリン加水分解（β−グルコシダーゼ）：陽性 硝酸還元：陰性 インドール産生：陰性 グルコース酸性化：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 ゼラチン加水分解（プロテアーゼ）：陰性 β−ガラクトシダーゼ：陰性 各化合物の同化 グルコース：陰性 Ｌ−アラビノース：陰性 Ｄ−マンノース：陰性 Ｄ−マンニトール：陰性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陰性 マルトース：陰性 グルコン酸カリウム：陰性 ｎ−カプリン酸：陽性 アジピン酸：陰性 ｄｌ−リンゴ酸：陽性 クエン酸ナトリウム：陽性 酢酸フェニル：陰性 以上の結果から、上記の着色菌株はＪ１株に変異源を作
用させることによって誘発された、オキシゲナーゼを構
成的に発現してなる新規な、Ｊ１変異株であると認め、
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペ
スト条約に基づき下記の国際寄託当局にＦＥＲＭ ＢＰ
−５３５２として寄託した。
【０１２０】工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城
県つくば市） 次に新たなＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を用意
し、酵母エキス０．１％及びフェノール２００ｐｐｍを
含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、坂口フラスコ中３０
℃で１８時間振盪培養を行った。
県つくば市） 次に新たなＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を用意
し、酵母エキス０．１％及びフェノール２００ｐｐｍを
含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、坂口フラスコ中３０
℃で１８時間振盪培養を行った。
【０１２１】次に、上記のように培養した菌液１０ｍｌ
を遠心分離して集菌し、上澄みを除去した後、２０ｐｐ
ｍのＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン）及び２００ｐｐｍのフェノールを含むＭ９
培地を５ｍｌ加え、３０℃で振盪培養を行った。菌液は
２時間から３時間で、フェノールの分解中間生成物であ
る２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド由来の黄色を
呈し始めるので、この時点の菌液を、２００ｐｐｍのイ
ンドール及び、酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地
上に塗布し、３０℃で静置培養を行った。
を遠心分離して集菌し、上澄みを除去した後、２０ｐｐ
ｍのＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン）及び２００ｐｐｍのフェノールを含むＭ９
培地を５ｍｌ加え、３０℃で振盪培養を行った。菌液は
２時間から３時間で、フェノールの分解中間生成物であ
る２−ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド由来の黄色を
呈し始めるので、この時点の菌液を、２００ｐｐｍのイ
ンドール及び、酵母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地
上に塗布し、３０℃で静置培養を行った。
【０１２２】ここで培養１日後に、目視で認められる全
体が濃青色に着色したコロニーと白色のコロニーのうち
全体が着色しているコロニーだけをピックアップし、そ
のコロニーを構成する微生物について上記と同様にして
オキシゲナーゼ活性及び菌学的性質を調べた結果、ＪＭ
１株と認められた。即ちＪ１株の成長とオキシゲナーゼ
の発現との間に時間差が有るのに対して、ＪＭ１株はそ
の成長とオキシゲナーゼの発現との間に時間差の無い事
を検出して、菌株の成長とオキシゲナーゼの発現との間
に時間差の無い菌株をピックアップすることでＪＭ１株
を選択的にＪ１株から取得できた。
体が濃青色に着色したコロニーと白色のコロニーのうち
全体が着色しているコロニーだけをピックアップし、そ
のコロニーを構成する微生物について上記と同様にして
オキシゲナーゼ活性及び菌学的性質を調べた結果、ＪＭ
１株と認められた。即ちＪ１株の成長とオキシゲナーゼ
の発現との間に時間差が有るのに対して、ＪＭ１株はそ
の成長とオキシゲナーゼの発現との間に時間差の無い事
を検出して、菌株の成長とオキシゲナーゼの発現との間
に時間差の無い菌株をピックアップすることでＪＭ１株
を選択的にＪ１株から取得できた。
【０１２３】実施例２から７は前駆物質を用いたＪ１株
の選択的検出を示す。
の選択的検出を示す。
【０１２４】実施例２ カテコールあるいはフェノールを用いたＪＭ１株の検出
方法 寒天培地上のＪ１株のコロニー及び実施例１のようにし
て取得したＪＭ１株のコロニーを、それぞれ酵母エキス
０．１％を含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、坂口フラ
スコ中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
方法 寒天培地上のＪ１株のコロニー及び実施例１のようにし
て取得したＪＭ１株のコロニーを、それぞれ酵母エキス
０．１％を含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、坂口フラ
スコ中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
【０１２５】次に各菌液を混合し、この混合菌液を、酸
化前駆物質としての２００ｐｐｍのカテコール及び、酵
母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地上に塗布し、３０
℃で静置培養を行った。
化前駆物質としての２００ｐｐｍのカテコール及び、酵
母エキス０．１％を含むＭ９寒天培地上に塗布し、３０
℃で静置培養を行った。
【０１２６】通常カテコールは、多くの芳香族分解（酸
化或いは水酸化）酵素によって変換され、芳香環のメタ
開裂によりヒドロキシムコン酸セミアルデヒド（ＨＭ
Ｓ）となって黄色を呈する。
化或いは水酸化）酵素によって変換され、芳香環のメタ
開裂によりヒドロキシムコン酸セミアルデヒド（ＨＭ
Ｓ）となって黄色を呈する。
【０１２７】その結果、培養開始から１日後に直径約１
〜２ｍｍの全体が黄色に着色したコロニーと、直径約１
〜２ｍｍの白色のコロニーが認められた。ここで全体が
着色したコロニーをピックアップし、その特性を実施例
１と同様にして調べた結果、ＪＭ１株と認められた。
〜２ｍｍの全体が黄色に着色したコロニーと、直径約１
〜２ｍｍの白色のコロニーが認められた。ここで全体が
着色したコロニーをピックアップし、その特性を実施例
１と同様にして調べた結果、ＪＭ１株と認められた。
【０１２８】又培養開始から１日後にはオキシゲナーゼ
の存在を示さなかったＪ１株のコロニーも培養開始から
２日目でコロニー中心部に黄色の着色部分が認められ
た。
の存在を示さなかったＪ１株のコロニーも培養開始から
２日目でコロニー中心部に黄色の着色部分が認められ
た。
【０１２９】以上の結果から、微生物の成長とオキシゲ
ナーゼの発現の時間差を利用してＪＭ１株をＪ１株と区
別して釣菌することができた。
ナーゼの発現の時間差を利用してＪＭ１株をＪ１株と区
別して釣菌することができた。
【０１３０】又、前駆物質としてフェノールを用いても
同様の結果が得られた。
同様の結果が得られた。
【０１３１】実施例３ ３−メチルカテコールあるいはｍ−クレゾールを用いた
ＪＭ１株の検出方法 酸化前駆物質としてカテコールの代わりに３−メチルカ
テコールを用いた以外は実施例２と同様にしてＪ１株及
びＪＭ１株の共存する培地を作成し、３０℃で静置培養
を行った。
ＪＭ１株の検出方法 酸化前駆物質としてカテコールの代わりに３−メチルカ
テコールを用いた以外は実施例２と同様にしてＪ１株及
びＪＭ１株の共存する培地を作成し、３０℃で静置培養
を行った。
【０１３２】通常３−メチルカテコールは、多くの芳香
族分解（酸化或いは水酸化）酵素によって変換され、芳
香環のメタ開裂により２−ヒドロキシ−６−ケトヘプタ
−２，４−ジエノイック酸（ＨＯＤ）となって黄色を呈
する。
族分解（酸化或いは水酸化）酵素によって変換され、芳
香環のメタ開裂により２−ヒドロキシ−６−ケトヘプタ
−２，４−ジエノイック酸（ＨＯＤ）となって黄色を呈
する。
【０１３３】３−メチルカテコールを２００ｐｐ、酵母
エキス０．１％を含むＭ９培地上でＪ１株を培養した場
合、培養開始から一日以内に目視で確認可能なサイズの
コロニーに成長し、培養開始から二日目に該コロニーに
ＨＯＤの存在を示す黄色の部分が発現してくる。
エキス０．１％を含むＭ９培地上でＪ１株を培養した場
合、培養開始から一日以内に目視で確認可能なサイズの
コロニーに成長し、培養開始から二日目に該コロニーに
ＨＯＤの存在を示す黄色の部分が発現してくる。
【０１３４】これに対してＪＭ１株は微生物の成長とＨ
ＯＤの発現との間に時間差が認められず、コロニーが目
視可能になった時点（培養開始から一日以内）で該コロ
ニーは黄色を呈していた。そして微生物が目視可能なサ
イズのコロニーにまで成長した時点で黄色に呈色してい
るコロニーをＪＭ１株としてＪ１株から区別して検出す
ることができた。
ＯＤの発現との間に時間差が認められず、コロニーが目
視可能になった時点（培養開始から一日以内）で該コロ
ニーは黄色を呈していた。そして微生物が目視可能なサ
イズのコロニーにまで成長した時点で黄色に呈色してい
るコロニーをＪＭ１株としてＪ１株から区別して検出す
ることができた。
【０１３５】また３−メチルカテコールに代えて前駆物
質としてｍ−クレゾールを用いても上記と同様の結果が
得られた。
質としてｍ−クレゾールを用いても上記と同様の結果が
得られた。
【０１３６】実施例４ ３−トリフルオロメチルカテコールあるいはｍ−トリフ
ルオロメチルフェノールを用いたＪＭ１株の検出方法 酸化前駆物質としてカテコールの代わりに３−トリフル
オロメチルカテコールを用いた以外は実施例２と同様に
してＪ１株及びＪＭ１株の共存する培地を作成し、３０
℃で静置培養を行った。
ルオロメチルフェノールを用いたＪＭ１株の検出方法 酸化前駆物質としてカテコールの代わりに３−トリフル
オロメチルカテコールを用いた以外は実施例２と同様に
してＪ１株及びＪＭ１株の共存する培地を作成し、３０
℃で静置培養を行った。
【０１３７】通常３−トリフルオロメチルカテコール
は、多くの芳香族分解（酸化或いは水酸化）酵素によっ
て変換され、芳香環のメタ開裂により７，７，７−トリ
フルオロ−２−ヒドロキシ−６−オキソ−２，４−ヘプ
タジエノイック酸（ＴＦＨＡ）となって黄色を呈する。
は、多くの芳香族分解（酸化或いは水酸化）酵素によっ
て変換され、芳香環のメタ開裂により７，７，７−トリ
フルオロ−２−ヒドロキシ−６−オキソ−２，４−ヘプ
タジエノイック酸（ＴＦＨＡ）となって黄色を呈する。
【０１３８】３−トリフルオロメチルカテコールを２０
０ｐｐ、酵母エキス０．１％を含むＭ９培地上でＪ１株
を培養した場合、培養開始から一日以内に目視で確認可
能なサイズのコロニーに成長し、培養開始から二日目に
該コロニーにＴＦＨＡの存在を示す黄色の部分が発現し
てくる。
０ｐｐ、酵母エキス０．１％を含むＭ９培地上でＪ１株
を培養した場合、培養開始から一日以内に目視で確認可
能なサイズのコロニーに成長し、培養開始から二日目に
該コロニーにＴＦＨＡの存在を示す黄色の部分が発現し
てくる。
【０１３９】これに対してＪＭ１株は微生物の成長とＴ
ＦＨＡの発現との間に時間差が認められず、コロニーが
目視可能になった時点（培養開始から一日以内）で該コ
ロニーは黄色を呈していた。そして微生物が目視可能な
サイズのコロニーにまで成長した時点で黄色に呈色して
いるコロニーをＪＭ１株としてＪ１株から区別して検出
することができた。
ＦＨＡの発現との間に時間差が認められず、コロニーが
目視可能になった時点（培養開始から一日以内）で該コ
ロニーは黄色を呈していた。そして微生物が目視可能な
サイズのコロニーにまで成長した時点で黄色に呈色して
いるコロニーをＪＭ１株としてＪ１株から区別して検出
することができた。
【０１４０】また３−トリフルオロメチルカテコールに
代えて前駆物質としてｍ−トリフルオロメチルフェノー
ルを用いても上記と同様の結果が得られた。
代えて前駆物質としてｍ−トリフルオロメチルフェノー
ルを用いても上記と同様の結果が得られた。
【０１４１】実施例５ クレオソートを用いたＪＭ１株の検出方法 酸化前駆物質としてカテコールの代わりにクレオソート
を用い、実施例１と同様にしてＪ１株及びＪＭ１株の共
存する培地を作成し３０℃で静置培養した。
を用い、実施例１と同様にしてＪ１株及びＪＭ１株の共
存する培地を作成し３０℃で静置培養した。
【０１４２】通常クレオソートは、多くの芳香族分解
（酸化或いは水酸化）酵素によって変換され、赤紫色を
呈する。
（酸化或いは水酸化）酵素によって変換され、赤紫色を
呈する。
【０１４３】そしてＪ１株をクレオソート２００ｐｐ
ｍ、酵母エキス０．１％を含むＭ９培地上で培養すると
培養開始から１日以内に目視可能なサイズのコロニーに
成長し、２日目に該コロニーに赤紫色の部分が発現して
くる。
ｍ、酵母エキス０．１％を含むＭ９培地上で培養すると
培養開始から１日以内に目視可能なサイズのコロニーに
成長し、２日目に該コロニーに赤紫色の部分が発現して
くる。
【０１４４】これに対しＪＭ１株は微生物の成長とクレ
オソート酸化物の発現との間に時間差が認められず、コ
ロニーが目視可能になった時点（培養開始から１日以
内）で該コロニーはクレオソート酸化物の呈色を示して
いた。そして目視可能なサイズのコロニーに成長した時
点で赤紫色に呈色しているものをＪＭ１株としてＪ１株
から区別して検出することができた。
オソート酸化物の発現との間に時間差が認められず、コ
ロニーが目視可能になった時点（培養開始から１日以
内）で該コロニーはクレオソート酸化物の呈色を示して
いた。そして目視可能なサイズのコロニーに成長した時
点で赤紫色に呈色しているものをＪＭ１株としてＪ１株
から区別して検出することができた。
【０１４５】実施例６ インドールを用いたＦＣＭによるＪＭ１株の検出方法 寒天培地上のＪ１株のコロニー及び実施例１のようにし
て取得したＪＭ１株のコロニーを、それぞれ酵母エキス
０．１％含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、前培養とし
て坂口フラスコ中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
て取得したＪＭ１株のコロニーを、それぞれ酵母エキス
０．１％含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、前培養とし
て坂口フラスコ中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
【０１４６】次に各菌液０．１ｍｌを、酸化前駆物質と
しての２００ｐｐｍのインドール及び酵母エキス０．１
％を含むＭ９培地３０ｍｌに添加し、３０℃で振盪培養
を行った。
しての２００ｐｐｍのインドール及び酵母エキス０．１
％を含むＭ９培地３０ｍｌに添加し、３０℃で振盪培養
を行った。
【０１４７】インドールは前記した様に芳香族分解酵素
（酸化或いは水酸化酵素）によってインディゴに変換さ
れるが、その過程で形成される中間生成物インドキシル
が緑色蛍光を発する。
（酸化或いは水酸化酵素）によってインディゴに変換さ
れるが、その過程で形成される中間生成物インドキシル
が緑色蛍光を発する。
【０１４８】Ｊ１株はインドールを２００ｐｐｍ、酵母
エキスを０．１％含むＭ９培地で培養すると培養開始か
ら２４時間後にインドキシル由来の緑色蛍光を発する様
になる。
エキスを０．１％含むＭ９培地で培養すると培養開始か
ら２４時間後にインドキシル由来の緑色蛍光を発する様
になる。
【０１４９】これに対し、ＪＭ１株は１０時間程度でイ
ンドキシル由来の緑色蛍光を発する様になる。
ンドキシル由来の緑色蛍光を発する様になる。
【０１５０】そこで１０時間振盪培養を行った後、この
培養液より遠心分離によって集菌したペレットを、任意
の割合で菌濃度１０5 〜１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる
ようにシース液に再分散し、ベクトンディッキンソン社
製ＦＣＭであるＦａｃｓ−Ｃａｎで菌数を測定した。そ
の結果、細胞の大きさ等に由来するＦＳＣ（前方散乱）
では同一のピークを示したものの、インドキシルの蛍光
に対応して分光検出するチャンネルの蛍光ヒストグラム
において一定幅の信号レベルでゲーティングを行い、Ｊ
Ｍ１の細胞をＪ１の細胞と区別することが可能であっ
た。
培養液より遠心分離によって集菌したペレットを、任意
の割合で菌濃度１０5 〜１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる
ようにシース液に再分散し、ベクトンディッキンソン社
製ＦＣＭであるＦａｃｓ−Ｃａｎで菌数を測定した。そ
の結果、細胞の大きさ等に由来するＦＳＣ（前方散乱）
では同一のピークを示したものの、インドキシルの蛍光
に対応して分光検出するチャンネルの蛍光ヒストグラム
において一定幅の信号レベルでゲーティングを行い、Ｊ
Ｍ１の細胞をＪ１の細胞と区別することが可能であっ
た。
【０１５１】実施例７ インドールを用いた蛍光顕微鏡によるＪＭ１株の検出及
び単離方法 寒天培地上のＪ１株のコロニー及び実施例１のようにし
て取得したＪＭ１株のコロニーを、それぞれ酵母エキス
０．１％含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、前培養とし
て坂口フラスコ中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
び単離方法 寒天培地上のＪ１株のコロニー及び実施例１のようにし
て取得したＪＭ１株のコロニーを、それぞれ酵母エキス
０．１％含むＭ９培地１００ｍｌに接種し、前培養とし
て坂口フラスコ中３０℃で１８時間振盪培養を行った。
【０１５２】次に各菌液０．１ｍｌを、酸化前駆物質と
しての２００ｐｐｍのインドール及び酵母エキス０．１
％を含むＭ９培地３０ｍｌに添加し、３０℃で１０時間
振盪培養を行った。この培養液より遠心分離によって集
菌したペレットを、任意の割合で菌濃度１０2 〜１０3
ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＭ９培地（炭素源含ま
ず）に再分散した後、９６穴マイクロプレートに限界希
釈した。
しての２００ｐｐｍのインドール及び酵母エキス０．１
％を含むＭ９培地３０ｍｌに添加し、３０℃で１０時間
振盪培養を行った。この培養液より遠心分離によって集
菌したペレットを、任意の割合で菌濃度１０2 〜１０3
ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにＭ９培地（炭素源含ま
ず）に再分散した後、９６穴マイクロプレートに限界希
釈した。
【０１５３】作成した標本は、落射蛍光顕微鏡（オリン
パス社製 ＩＭＴ−２）を使用して蛍光観察を行った。
パス社製 ＩＭＴ−２）を使用して蛍光観察を行った。
【０１５４】その結果、細胞そのものが、インドキシル
に由来すると思われる緑色の蛍光を発したものはＪＭ１
株であり、蛍光を発しない細胞はＪ１株であることが、
インドールを用いた寒天培地上でのコロニーの呈色で確
認された。
に由来すると思われる緑色の蛍光を発したものはＪＭ１
株であり、蛍光を発しない細胞はＪ１株であることが、
インドールを用いた寒天培地上でのコロニーの呈色で確
認された。
【０１５５】実施例８から１１はＪＭ１株を用いた有機
化合物の分解を示す。
化合物の分解を示す。
【０１５６】実施例８ ＪＭ１株によるＴＣＥの分解（液体培養系） 実施例１のようにして取得したＪＭ１株の寒天培地上の
コロニーを、坂口フラスコ中の酵母エキス０．２％を含
むＭ９培地２００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振盪
培養を行った。
コロニーを、坂口フラスコ中の酵母エキス０．２％を含
むＭ９培地２００ｍｌに接種し、３０℃で２４時間振盪
培養を行った。
【０１５７】次に複数本のバイアル瓶（ｖｉａｌ）を用
意し、各々にＴＣＥ１０ｐｐｍ、炭素源として０．１％
酵母エキスを含むＭ９培地５ｍｌ及び上記の様にして培
養した菌液０．１ｍｌを接種し、ブチルゴム栓（ｂｕｔ
ｙｌ ｒｕｂｂｅｒ ｓｔｏｐｐｅｒ）及びアルミニウ
ムキャップでシールし３０℃で振盪培養した。
意し、各々にＴＣＥ１０ｐｐｍ、炭素源として０．１％
酵母エキスを含むＭ９培地５ｍｌ及び上記の様にして培
養した菌液０．１ｍｌを接種し、ブチルゴム栓（ｂｕｔ
ｙｌ ｒｕｂｂｅｒ ｓｔｏｐｐｅｒ）及びアルミニウ
ムキャップでシールし３０℃で振盪培養した。
【０１５８】そしてヘッドスペース法によりガスクロマ
トグラフィーによってＴＣＥ量を経時的に測定した。対
照として、同様の実験系においてＪＭ１株を加えない系
でのＴＣＥ量の経時的な定量も併せて行い、対照のＴＣ
Ｅ量に対するＴＣＥ残存率を求めた。結果を図１に示
す。
トグラフィーによってＴＣＥ量を経時的に測定した。対
照として、同様の実験系においてＪＭ１株を加えない系
でのＴＣＥ量の経時的な定量も併せて行い、対照のＴＣ
Ｅ量に対するＴＣＥ残存率を求めた。結果を図１に示
す。
【０１５９】実施例９ ＪＭ１株によるＤＣＥの分解（液体培養系） 培地中の分解対象物質をｃｉｓ−１，２−ジクロロエチ
レン（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ）及びｔｒａｎｓ−１，
２−ジクロロエチレン（ｔｒａｎｓ−１，２−ＤＣＥ）
それぞれ１０ｐｐｍとした他は実施例８と同様の方法で
経時的にＤＣＥの減少を測定した。そして各々の対照サ
ンプルのＤＣＥ量に対するＤＣＥ残存率を求めた。結果
を図２（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ）及び図３（ｔｒａｎ
ｓ−１，２−ＤＣＥ）に示す。
レン（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ）及びｔｒａｎｓ−１，
２−ジクロロエチレン（ｔｒａｎｓ−１，２−ＤＣＥ）
それぞれ１０ｐｐｍとした他は実施例８と同様の方法で
経時的にＤＣＥの減少を測定した。そして各々の対照サ
ンプルのＤＣＥ量に対するＤＣＥ残存率を求めた。結果
を図２（ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ）及び図３（ｔｒａｎ
ｓ−１，２−ＤＣＥ）に示す。
【０１６０】実施例１０ ＪＭ１株による芳香族化合物の分解（液体培養系） 培地中の炭素源を０．１％酵母エキスとし、分解対象物
質をフェノール（濃度２００ｐｐｍ）、ｏ−クレゾール
（濃度２００ｐｐｍ）、ｍ−クレゾール（濃度２００ｐ
ｐｍ）、ｐ−クレゾール又はトルエン（濃度５０ｐｐ
ｍ）とした他は実施例８と同様の方法で経時的に各化合
物の減少を測定した。測定は、フェノール及びクレゾー
ルは液体クロマトグラフィーにて、トルエンはガスクロ
マトグラフィーにて行った。そして各々の対照サンプル
の芳香族化合物量に対する残存率を求めた。その結果を
図４に示す。
質をフェノール（濃度２００ｐｐｍ）、ｏ−クレゾール
（濃度２００ｐｐｍ）、ｍ−クレゾール（濃度２００ｐ
ｐｍ）、ｐ−クレゾール又はトルエン（濃度５０ｐｐ
ｍ）とした他は実施例８と同様の方法で経時的に各化合
物の減少を測定した。測定は、フェノール及びクレゾー
ルは液体クロマトグラフィーにて、トルエンはガスクロ
マトグラフィーにて行った。そして各々の対照サンプル
の芳香族化合物量に対する残存率を求めた。その結果を
図４に示す。
【０１６１】実施例１１ Ｊ１株とＪＭ１株の増殖及びＴＣＥ分解の比較（液体培
養系） 実施例８と同様の方法で、下記の３種類のタイプのサン
プルグループを作成して、微生物の増殖（菌数）とＴＣ
Ｅ分解（残留ＴＣＥ濃度）を経時的に測定した。
養系） 実施例８と同様の方法で、下記の３種類のタイプのサン
プルグループを作成して、微生物の増殖（菌数）とＴＣ
Ｅ分解（残留ＴＣＥ濃度）を経時的に測定した。
【０１６２】菌数の測定にはプレートカウント法を用
い、ＴＣＥ量の測定にはガスクロマトグラフィーを用い
た。そしてＴＣＥ量については対照サンプルのＴＣＥ量
に対するＴＣＥ残存率を求めた。その結果を図５に示
す。
い、ＴＣＥ量の測定にはガスクロマトグラフィーを用い
た。そしてＴＣＥ量については対照サンプルのＴＣＥ量
に対するＴＣＥ残存率を求めた。その結果を図５に示
す。
【０１６３】グループ１ 微生物：Ｊ１株 培地中の炭素源：０．１％酵母エキス 培地中の誘導物質：フェノール（濃度２００ｐｐｍ） グループ２ 微生物：Ｊ１株 培地中の炭素源：０．１％酵母エキス 培地中の誘導物質：なし グループ３ 微生物：ＪＭ１株 培地中の炭素源：０．１％酵母エキス 培地中の誘導物質：なし 実施例１２から１６はＪＭ１株を用いた汚染土壌の修復
を示す。
を示す。
【０１６４】実施例１２ ＪＭ１株による土壌中ＴＣＥの分解処理（１５℃、褐色
森林土） 実施例８においてバイアル瓶の内容物を下記（ａ）−
（ｄ）の混合物に代えた以外は実施例８と同様にしてサ
ンプルを作成し、該サンプルを実際の土壌中の温度に近
い１５℃で静置培養して、ＴＣＥ量の経時的変化をヘッ
ドスペース法によりガスクロマトグラフィによって測定
した。
森林土） 実施例８においてバイアル瓶の内容物を下記（ａ）−
（ｄ）の混合物に代えた以外は実施例８と同様にしてサ
ンプルを作成し、該サンプルを実際の土壌中の温度に近
い１５℃で静置培養して、ＴＣＥ量の経時的変化をヘッ
ドスペース法によりガスクロマトグラフィによって測定
した。
【０１６５】また対照としてＪＭ１株を加えない以外は
全く同様にして調製したサンプルを用いてＴＣＥ量の変
化を測定した。
全く同様にして調製したサンプルを用いてＴＣＥ量の変
化を測定した。
【０１６６】そして実施例１２のサンプルのＴＣＥ量の
経時的変化を対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残
存率として求めた。その結果を図６に示す。
経時的変化を対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残
存率として求めた。その結果を図６に示す。
【０１６７】（ａ）汚染物質：ＴＣＥ（２０ｐｐｍ） （ｂ）０．１％酵母エキスを含むＭ９培地１ｍｌ （ｃ）褐色森林土４ｇ （ｄ）ＪＭ１培養菌液０．１ｍｌ 実施例１３ ＪＭ１株による土壌中ＴＣＥの分解処理（１５℃、ロー
ム土） 土壌サンプルをローム土とした以外は実施例１２と同様
の方法でＴＣＥ量の減少を経時的に測定し、実施例１２
と同様に対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残存率
を求めた。その結果を図７に示す。
ム土） 土壌サンプルをローム土とした以外は実施例１２と同様
の方法でＴＣＥ量の減少を経時的に測定し、実施例１２
と同様に対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残存率
を求めた。その結果を図７に示す。
【０１６８】実施例１４ ＪＭ１株による土壌中ＴＣＥの分解処理（１５℃、細砂
土） 土壌サンプルを細砂土（シルト含有率：約１０％）とし
た以外は実施例１２と同様の方法でＴＣＥ量の減少を経
時的に測定し、実施例１２と同様に対照サンプルのＴＣ
Ｅ量に対するＴＣＥ残存率を求めた。その結果を図８に
示す。
土） 土壌サンプルを細砂土（シルト含有率：約１０％）とし
た以外は実施例１２と同様の方法でＴＣＥ量の減少を経
時的に測定し、実施例１２と同様に対照サンプルのＴＣ
Ｅ量に対するＴＣＥ残存率を求めた。その結果を図８に
示す。
【０１６９】実施例１５ ＪＭ１株による土壌中ＤＣＥの分解処理（１５℃、褐色
森林土） 実施例１２において汚染物質ＴＣＥを下記の３種類のＤ
ＣＥに代えた以外は実施例１２と同様にして経時的にＤ
ＣＥ量の減少を測定し、対照サンプルのＤＣＥ量に対す
るＤＣＥ残存率を求めた。その結果を図９に示す。
森林土） 実施例１２において汚染物質ＴＣＥを下記の３種類のＤ
ＣＥに代えた以外は実施例１２と同様にして経時的にＤ
ＣＥ量の減少を測定し、対照サンプルのＤＣＥ量に対す
るＤＣＥ残存率を求めた。その結果を図９に示す。
【０１７０】（１）ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン
（５ｐｐｍ） （２）ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロエチレン（５ｐｐ
ｍ） （３）１，１−ジクロロエチレン（５ｐｐｍ） 実施例１６ ＪＭ１株による土壌中フェノールの分解処理（１５℃、
褐色森林土） 実施例１２において汚染物質ＴＣＥをフェノールに代え
た以外は実施例１２と同様にして経時的にフェノール量
の減少を測定した。
（５ｐｐｍ） （２）ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロエチレン（５ｐｐ
ｍ） （３）１，１−ジクロロエチレン（５ｐｐｍ） 実施例１６ ＪＭ１株による土壌中フェノールの分解処理（１５℃、
褐色森林土） 実施例１２において汚染物質ＴＣＥをフェノールに代え
た以外は実施例１２と同様にして経時的にフェノール量
の減少を測定した。
【０１７１】フェノールの定量は、アミノアンチピリン
を用いて日本工業規格（ＪＩＳ Ｋ０１０２−１９９
３、２８．１）に準じて行った。
を用いて日本工業規格（ＪＩＳ Ｋ０１０２−１９９
３、２８．１）に準じて行った。
【０１７２】そして対照サンプルのフェノール量に対す
るフェノール残存率を求めた。その結果を図１０に示
す。
るフェノール残存率を求めた。その結果を図１０に示
す。
【０１７３】実施例１７から２２はＪＭ１株を用いた汚
染気体の修復を示す。
染気体の修復を示す。
【０１７４】実施例１７ ＪＭ１株を用いた、培養液曝気による気相中のＴＣＥ分
解処理 先ず実施例８と同様にしてＪＭ１株の培養菌液を作成し
た。
解処理 先ず実施例８と同様にしてＪＭ１株の培養菌液を作成し
た。
【０１７５】次に複数本のバイアル瓶を用意し、それぞ
れのバイアル瓶に０．１％酵母エキスを含むＭ９培地３
０ｍｌ及び上記ＪＭ１株の培養菌液０．１ｍｌを加え
た。その後ＴＣＥ飽和水溶液中で曝気した空気を流量６
０ｍｌ／分で各バイアル瓶の溶液中に３０分間流し、そ
の後ブチルゴム栓及びアルミシールで完全に密封し３０
℃で振とう培養を行った。
れのバイアル瓶に０．１％酵母エキスを含むＭ９培地３
０ｍｌ及び上記ＪＭ１株の培養菌液０．１ｍｌを加え
た。その後ＴＣＥ飽和水溶液中で曝気した空気を流量６
０ｍｌ／分で各バイアル瓶の溶液中に３０分間流し、そ
の後ブチルゴム栓及びアルミシールで完全に密封し３０
℃で振とう培養を行った。
【０１７６】そしてヘッドスペース法によりガスクロマ
トグラフィで定量し経時的なＴＣＥ量の減少を測定し
た。
トグラフィで定量し経時的なＴＣＥ量の減少を測定し
た。
【０１７７】また対照としてＪＭ１株を加えない以外は
上記と全く同様の方法で調製したサンプルを用いてＴＣ
Ｅ量の変化を測定した。
上記と全く同様の方法で調製したサンプルを用いてＴＣ
Ｅ量の変化を測定した。
【０１７８】そして実施例１７のサンプルのＴＣＥ量の
経時的変化を対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残
存率として求めた。その結果を図１１に示す。
経時的変化を対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残
存率として求めた。その結果を図１１に示す。
【０１７９】実施例１８ ＪＭ１株を用いた、培養液曝気による気相中のＤＣＥ分
解処理 実施例１７において各バイアル瓶中に流したＴＣＥ飽和
水溶液中で曝気した空気を、下記の（１）、（２）又は
（３）のＤＣＥ飽和水溶液中で曝気した空気に代えた以
外は実施例１７と同様にして気相中のＤＣＥ量の経時的
な減少を測定し、対照サンプルのＴＣＥ量に対する残存
率を求めた。その結果を図１２に示す。
解処理 実施例１７において各バイアル瓶中に流したＴＣＥ飽和
水溶液中で曝気した空気を、下記の（１）、（２）又は
（３）のＤＣＥ飽和水溶液中で曝気した空気に代えた以
外は実施例１７と同様にして気相中のＤＣＥ量の経時的
な減少を測定し、対照サンプルのＴＣＥ量に対する残存
率を求めた。その結果を図１２に示す。
【０１８０】（１）ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン （２）ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロエチレン （３）１，１−ジクロロエチレン 実施例１９ ＪＭ１株を用いた、培養液曝気による気相中のトルエン
分解処理 実施例１７において各バイアル瓶中に流したＴＣＥ飽和
水溶液中で曝気した空気を、トルエン飽和水溶液中で曝
気した空気に代えた以外は実施例１７と同様にして気相
中のトルエン量の経時的な減少を測定した。気相中のト
ルエン量はヘッドスペース法によりガスクロマトグラフ
ィで定量した。
分解処理 実施例１７において各バイアル瓶中に流したＴＣＥ飽和
水溶液中で曝気した空気を、トルエン飽和水溶液中で曝
気した空気に代えた以外は実施例１７と同様にして気相
中のトルエン量の経時的な減少を測定した。気相中のト
ルエン量はヘッドスペース法によりガスクロマトグラフ
ィで定量した。
【０１８１】そして実施例１７と同様に対照サンプルの
トルエン量に対するトルエン残存率を求めた。その結果
を図１３に示す。
トルエン量に対するトルエン残存率を求めた。その結果
を図１３に示す。
【０１８２】実施例２０ ＪＭ１株を用いた、土壌通気による気相中のＴＣＥの分
解処理 先ず実施例８と同様にしてＪＭ１株の培養菌液を作成し
た。
解処理 先ず実施例８と同様にしてＪＭ１株の培養菌液を作成し
た。
【０１８３】次に複数本のバイアル瓶を用意し、それぞ
れのバイアル瓶に０．１％酵母エキスを含むＭ９培地３
０ｍｌ及び上記ＪＭ１株の培養菌液０．１ｍｌを加え
た。
れのバイアル瓶に０．１％酵母エキスを含むＭ９培地３
０ｍｌ及び上記ＪＭ１株の培養菌液０．１ｍｌを加え
た。
【０１８４】次いで各バイアル瓶中に滅菌した褐色森林
土を液面まで加え、ブチルゴム栓でシールし３０℃で終
夜放置した後、ブチルゴム栓を取り、各バイアル瓶中の
過剰の培養液をデカントして取り除いた。
土を液面まで加え、ブチルゴム栓でシールし３０℃で終
夜放置した後、ブチルゴム栓を取り、各バイアル瓶中の
過剰の培養液をデカントして取り除いた。
【０１８５】次に各バイアル瓶中の土壌に、ＴＣＥ飽和
水溶液中を通過させて曝気した空気を流量６０ｍｌ／分
で３０分間流し、その後各バイアル瓶をブチルゴム栓及
びアルミキャップで完全にシールし、３０℃で静置培養
した。
水溶液中を通過させて曝気した空気を流量６０ｍｌ／分
で３０分間流し、その後各バイアル瓶をブチルゴム栓及
びアルミキャップで完全にシールし、３０℃で静置培養
した。
【０１８６】そして、実施例１７と同様に対照サンプル
のＴＣＥ量に対するＴＣＥ残存率を求めた。その結果を
図１４に示す。
のＴＣＥ量に対するＴＣＥ残存率を求めた。その結果を
図１４に示す。
【０１８７】実施例２１ ＪＭ１株を用いた、培養液中連続曝気による気相中ＴＣ
Ｅの分解処理 複数本のバイアル瓶を用意し、その各々に実施例１７と
同様のＪＭ１株の菌液０．１ｍｌ及び、０．１％酵母エ
キスを含む３０ｍｌのＭ９培地を加えた。次いで各バイ
アル瓶にＴＣＥ飽和溶液を通過させて曝気した空気を流
量０．５ｍｌ／分で溶液中に連続して流しながら、３０
℃で静置培養を行った。ＴＣＥ量は、流出してきた空気
中のＴＣＥをガスクロマトグラフィで定量することによ
り行い、経時的にＴＣＥ量を測定した。そして実施例１
７と同様に対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残存
率を求めた。結果を図１５に示す。
Ｅの分解処理 複数本のバイアル瓶を用意し、その各々に実施例１７と
同様のＪＭ１株の菌液０．１ｍｌ及び、０．１％酵母エ
キスを含む３０ｍｌのＭ９培地を加えた。次いで各バイ
アル瓶にＴＣＥ飽和溶液を通過させて曝気した空気を流
量０．５ｍｌ／分で溶液中に連続して流しながら、３０
℃で静置培養を行った。ＴＣＥ量は、流出してきた空気
中のＴＣＥをガスクロマトグラフィで定量することによ
り行い、経時的にＴＣＥ量を測定した。そして実施例１
７と同様に対照サンプルのＴＣＥ量に対するＴＣＥ残存
率を求めた。結果を図１５に示す。
【０１８８】実施例２２ ＪＭ１株を用いた、土壌連続曝気による気相中ＴＣＥの
分解処理 複数本のバイアル瓶を用意し、その各々に実施例１７と
同様のＪＭ１株の菌液０．１ｍｌ及び、０．１％酵母エ
キスを含む３０ｍｌのＭ９培地を加え、さらに滅菌した
褐色森林土を水面まで加えた。ブチルゴム栓で封をして
３０℃で終夜放置の後、過剰の培養液をデカントして取
り除いた。次いで各バイアル瓶中の土壌中にＴＣＥ飽和
溶液中で曝気した空気を流量０．５ｍｌ／分で連続して
流しながら、３０℃で静置培養を行った。ＴＣＥ量は、
流出してきた空気中のＴＣＥ量をガスクロマトグラフィ
ーで定量することにより行い、経時的にＴＣＥ量を測定
した。そして実施例１７と同様に対照サンプルのＴＣＥ
量に対するＴＣＥ残存率を求めた。結果を図１６に示
す。
分解処理 複数本のバイアル瓶を用意し、その各々に実施例１７と
同様のＪＭ１株の菌液０．１ｍｌ及び、０．１％酵母エ
キスを含む３０ｍｌのＭ９培地を加え、さらに滅菌した
褐色森林土を水面まで加えた。ブチルゴム栓で封をして
３０℃で終夜放置の後、過剰の培養液をデカントして取
り除いた。次いで各バイアル瓶中の土壌中にＴＣＥ飽和
溶液中で曝気した空気を流量０．５ｍｌ／分で連続して
流しながら、３０℃で静置培養を行った。ＴＣＥ量は、
流出してきた空気中のＴＣＥ量をガスクロマトグラフィ
ーで定量することにより行い、経時的にＴＣＥ量を測定
した。そして実施例１７と同様に対照サンプルのＴＣＥ
量に対するＴＣＥ残存率を求めた。結果を図１６に示
す。
【０１８９】
【発明の効果】本発明によって、誘導物質を必要としな
いで、環境汚染物質を分解することが可能になり、高価
な設備や経費を要求することなく環境浄化が可能となっ
た。
いで、環境汚染物質を分解することが可能になり、高価
な設備や経費を要求することなく環境浄化が可能となっ
た。
【図１】実施例８におけるＴＣＥの分解を示す図。
【図２】実施例９におけるｃｉｓ−ＤＣＥの分解を示す
図。
図。
【図３】実施例９におけるｔｒａｎｓ−ＤＣＥの分解を
示す図。
示す図。
【図４】実施例１０における芳香族化合物の分解を示す
図。
図。
【図５】実施例１１におけるＴＣＥの分解及び菌の増殖
を示す図。
を示す図。
【図６】実施例１２におけるＴＣＥの分解を示す図。
【図７】実施例１３におけるＴＣＥの分解を示す図。
【図８】実施例１４におけるＴＣＥの分解を示す図。
【図９】実施例１５におけるＤＣＥの分解を示す図。
【図１０】実施例１６におけるフェノールの分解を示す
図。
図。
【図１１】実施例１７におけるＴＣＥの分解を示す図。
【図１２】実施例１８におけるＤＣＥの分解を示す図。
【図１３】実施例１９におけるトルエンの分解を示す
図。
図。
【図１４】実施例２０におけるＴＣＥの分解を示す図。
【図１５】実施例２１におけるＴＣＥの分解を示す図。
【図１６】実施例２２におけるＴＣＥの分解を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 川口 正浩 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (72)発明者 川畑 祐司 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (56)参考文献 特開 昭59−17980（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (78)
- 【請求項１】 誘導物質を用いることなしに有機化合物
を分解することのできるＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
３５２）。 - 【請求項２】 該菌株が、誘導物質によってオキシゲナ
ーゼを発現することのできるＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
５１０２）の、変異源を用いた変異誘発処理を施して得
られた変異体である請求項１記載のＪＭ１株。 - 【請求項３】 該変異源が紫外線、エチルメタンスルホ
ネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン、亜硝酸及びアクリジン色素から選ばれる請求項
２記載のＪＭ１株。 - 【請求項４】 該有機化合物が該オキシゲナーゼによる
芳香族分解経路によって分解可能な物質である請求項１
記載のＪＭ１株。 - 【請求項５】 該有機化合物が芳香族化合物及び塩素化
脂肪族炭化水素化合物の少なくとも一方を含む請求項４
記載のＪＭ１株。 - 【請求項６】 該芳香族化合物がフェノール、トルエン
及びクレゾールの少なくとも１つを含み、該塩素化脂肪
族炭化水素化合物がジクロロエチレン及びトリクロロエ
チレンの少なくとも一方を含む請求項５記載のＪＭ１
株。 - 【請求項７】 オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力
を備えた微生物に変異源を用いた変異誘発処理を施して
得られた、オキシゲナーゼを構成的に発現しているＪＭ
１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）を用いて有機化合物
を分解せしめる工程を有することを特徴とする有機化合
物の生分解方法。 - 【請求項８】 該有機化合物が芳香族化合物である請求
項７記載の生分解方法。 - 【請求項９】 該芳香族化合物がフェノール、トルエン
及びクレゾールの少なくとも１つである請求項８記載の
生分解方法。 - 【請求項１０】 該有機化合物が塩素化脂肪族炭化水素
化合物である請求項７記載の生分解方法。 - 【請求項１１】 該塩素化脂肪族炭化水素化合物がトリ
クロロエチレン及びジクロロエチレンの少なくとも１つ
である請求項１０記載の生分解方法。 - 【請求項１２】 前記有機化合物を分解せしめる工程
が、該微生物と該有機化合物を含有する媒体とを接触さ
せる工程を含む請求項７記載の生分解方法。 - 【請求項１３】 該微生物と該有機化合物を含有する媒
体とを接触させる工程が、該媒体と該微生物を担持する
担体とを接触させる工程を含む請求項１２記載の生分解
方法。 - 【請求項１４】 該媒体と該微生物を担持する担体とを
接触させる工程が、該微生物を担持する担体を有する容
器の一端から該媒体を導入し他端から排出する請求項１
２記載の生分解方法。 - 【請求項１５】 該媒体が水性媒体である請求項１２記
載の生分解方法。 - 【請求項１６】 該媒体が土壌である請求項１２記載の
生分解方法。 - 【請求項１７】 該微生物と該有機化合物を含む媒体と
を接触させる工程が、該微生物を含む液体を該有機化合
物を含む土壌中に導入する工程を含む請求項１２記載の
生分解方法。 - 【請求項１８】 該微生物の増殖を促す物質を該土壌中
に導入して、該微生物を該土壌中で増殖せしめる工程を
更に含む請求項１７記載の生分解方法。 - 【請求項１９】 該微生物の増殖を促す物質が該微生物
にとっての栄養素である請求項１８記載の生分解方法。 - 【請求項２０】 該微生物の増殖を促す物質が酸素であ
る請求項１８記載の生分解方法。 - 【請求項２１】 該微生物を含む液体の該有機化合物を
含む土壌中ヘの導入を、該土壌に設けた井戸から圧力を
加えて行う請求項１７記載の生分解方法。 - 【請求項２２】 該微生物と該有機化合物を含む媒体と
を接触させる工程が、該微生物を含む液相中に該有機化
合物を含む土壌を導入する工程を含む請求項１２記載の
生分解方法。 - 【請求項２３】 該媒体が気体である請求項１２記載の
生分解方法。 - 【請求項２４】 該微生物と該有機化合物を含む媒体を
接触させる工程が、該微生物を含む液相中に該有機化合
物を含む気体を導入する工程を含む請求項１２記載の生
分解方法。 - 【請求項２５】 オキシゲナーゼを誘導的に発現する能
力を備えた微生物に変異源を用いた変異誘発処理を施し
て得られた、オキシゲナーゼを構成的に発現しているＪ
Ｍ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）を用いて環境中の
汚染物質を分解させる工程を有する環境修復方法。 - 【請求項２６】 該汚染物質が芳香族化合物である請求
項２５記載の環境修復方法。 - 【請求項２７】 該芳香族化合物がフェノール、トルエ
ン及びクレゾールの少なくとも１つである請求項２６記
載の環境修復方法。 - 【請求項２８】 該汚染物質が塩素化脂肪族炭化水素化
合物である請求項２５記載の環境修復方法。 - 【請求項２９】 該塩素化脂肪族炭化水素化合物がトリ
クロロエチレン及びジクロロエチレンの少なくとも１つ
である請求項２８記載の環境修復方法。 - 【請求項３０】 前記汚染物質を分解させる工程が、該
微生物と該汚染物質を含有する媒体とを接触させて該汚
染物質を分解させる工程を含む請求項２５記載の環境修
復方法。 - 【請求項３１】 前記微生物と該汚染物質を含有する媒
体とを接触させて該汚染物質を分解させる工程が、該媒
体と該微生物を担持する担体とを接触させる工程を有す
る請求項３０記載の環境修復方法。 - 【請求項３２】 該媒体と該微生物を担持する担体とを
接触させる工程が、該微生物を担持する担体を有する容
器の一端から該媒体を導入し他端から排出する請求項３
０記載の環境修復方法。 - 【請求項３３】 該媒体が水性媒体である請求項３０記
載の環境修復方法。 - 【請求項３４】 該媒体が土壌である請求項３０記載の
環境修復方法。 - 【請求項３５】 該微生物と該汚染物質を含有する媒体
とを接触させる工程が、該微生物を含む液体を汚染物質
を含む土壌中に導入する請求項３０記載の環境修復方
法。 - 【請求項３６】 該微生物の増殖を促す物質を該土壌中
に導入して、該微生物を該土壌中で増殖せしめる工程を
更に含む請求項３５記載の環境修復方法。 - 【請求項３７】 該微生物の増殖を促す物質が該微生物
にとっての栄養素である請求項３６記載の環境修復方
法。 - 【請求項３８】 該微生物の増殖を促す物質が酸素であ
る請求項３６記載の環境修復方法。 - 【請求項３９】 該微生物を含む液体の該汚染物質を含
む土壌中ヘの導入を、該土壌に設けた井戸から圧力を加
えて行う請求項３５記載の環境修復方法。 - 【請求項４０】 該微生物と該汚染物質を含有する媒体
とを接触させる工程が、該微生物を含む液相中に該汚染
物質を含む土壌を導入する請求項３０記載の環境修復方
法。 - 【請求項４１】 該媒体が気体である請求項３０記載の
環境修復方法。 - 【請求項４２】 該微生物と該汚染物質を含む媒体を接
触させる工程が、該微生物を含む液相中に汚染物質を含
む気体を導入する工程を有する請求項３０記載の環境修
復方法。 - 【請求項４３】 オキシゲナーゼを構成的に発現してい
る第１の微生物とオキシゲナーゼを誘導的に発現する能
力を有する第２の微生物とが共存し、且つ該第２の微生
物にオキシゲナーゼを発現させることのできる誘導物質
を含む環境から前記オキシゲナーゼを構成的に発現して
いる微生物を選択的に取得する方法であって、 該第１の微生物及び該第２の微生物が共存している微生
物の混合物を、オキシゲナーゼで酸化されることで検出
可能な変化を呈する酸化物を生じ、且つ該誘導物質とし
ても機能する前駆物質を含む培地上で培養し、該培地上
にて微生物を増殖させてコロニーを形成させ、該コロニ
ーの成長と該コロニー内の該酸化物の生成との間に実質
的な時間差のないコロニーを該第１の微生物によつて形
成されたコロニーとして分離する工程； を有し、 前記第１の微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５
２）を含み、 前記第２の微生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０
２）を含む ことを特徴とするオキシゲナーゼを構成的に
発現している微生物の取得方法。 - 【請求項４４】 オキシゲナーゼを構成的に発現してい
る微生物の検出方法であって、 オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微生物
とオキシゲナーゼを構成的に発現している微生物とをオ
キシゲナーゼで酸化されることで検出可能な変化を呈す
る酸化物を生じ、且つ該誘導物質としても機能する前駆
物質の存在下で培養して増殖させたときにオキシゲナー
ゼを構成的に発現している微生物のコロニーの成長と該
コロニー内の該酸化物の生成を示す部分の発現との間に
時間差がなく、オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力
を備えた微生物のコロニーの成長と該コロニー内の該酸
化物の生成を示す部分の発現との間に時間差が有るよう
に各々の微生物を増殖させるような培地を用意する工
程；及びオキシゲナーゼを構成的に発現している微生物
とオキシゲナーゼを誘導的に発現している微生物とが共
存している可能性の有る微生物の混合物を該前駆物質を
含む該培地で培養してコロニーを形成させ、コロニーの
成長と該コロニー内の該酸化物の生成との間に実質的な
時問差が無いコロニーをオキシゲナーゼを構成的に発現
している微生物によるコロニーとして検出する工程； を有し、 前記オキシゲナーゼを構成的に発現している微生物がＪ
Ｍ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）を含み、 前記オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微
生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を含む こと
を特徴とするオキシゲナーゼを構成的に発現している微
生物の検出方法。 - 【請求項４５】 前記混合物の培養工程に先立って、該
誘導物質を含まない培地上で該混合物を培養せしめる工
程を有する請求項４４記載の検出方法。 - 【請求項４６】 該前駆物質がオキシゲナーゼの酸化に
よって呈色性酸化物を生じる物である請求項４４記載の
検出方法。 - 【請求項４７】 該前駆物質がインドールである請求項
４６記載の検出方法。 - 【請求項４８】 該前駆物質がクレオソートである請求
項４６記載の検出方法。 - 【請求項４９】 該前駆物質がｏ−アミノフェノールで
ある請求項４６記載の検出方法。 - 【請求項５０】 該前駆物質がカテコール骨格を有する
物質である請求項４６記載の検出方法。 - 【請求項５１】 該物質がカテコール、３−メチルカテ
コール及び３−トリフルオロカテコールから選ばれる少
なくとも１つである請求項５０記載の検出方法。 - 【請求項５２】 該前駆物質がフェノールである請求項
４６記載の検出方法。 - 【請求項５３】 該前駆物質が３−トリフルオロメチル
フェノールである請求項４６記載の検出方法。 - 【請求項５４】 該前駆物質がクレゾールである請求項
４６記載の検出方法。 - 【請求項５５】 該前駆物質がオキシゲナーゼの酸化に
よって蛍光を呈する酸化物を生じるものである請求項４
４記載の検出方法。 - 【請求項５６】 該前駆物質がインドールである請求項
５５記載の検出方法。 - 【請求項５７】 該インドールの酸化物であるインドキ
シルの蛍光を検出する請求項５６記載の検出方法。 - 【請求項５８】 有機化合物を分解する為の酵素を構成
的に発現している第１の微生物と該酵素を誘導的に発現
する能力を有する第２の微生物とが共存し、 且つ第２の微生物に該酵素を発現させることのできる誘
導物質を含む環境から前記第１の微生物を選択的に取得
する方法であって、 前記第１の微生物及び前記第２の微生物が共存している
可能性のある微生物の混合物を該酵素の作用によって検
出可能な特性を呈する物質を生じ、且つ該誘導物質でも
ある前駆物質を含む培地上で培養し、該培地上にて微生
物を増殖させてコロニーを形成させ、該コロニーの成長
と該コロニー内の該物質の生成との間に実質的な時間差
のないコロニーを該第１の微生物によって形成されたコ
ロニーとして分離する工程； を有し、 前記第１の微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５
２）を含み、 前記第２の微生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０
２）を含む ことを特徴とする有機化合物を分解する能力
を本来的に有している微生物の取得方法。 - 【請求項５９】 有機化合物を分解可能な酵素を構成的
に発現している微生物の検出方法であって、 該酵素を誘導的に発現する能力を備えた微生物と該酵素
を構成的に発現している微生物とを、該酵素の作用によ
って検出可能な変化を呈する物質を生じ、且つ誘導物質
としても機能する前駆物質の存在下で培養して増殖させ
たときに該酵素を構成的に発現している微生物のコロニ
ーの成長と該コロニー内の該物質の生成を示す部分の発
現との間に時間差が無く、該酵素を誘導的に発現する能
力を備えた微生物のコロニーの成長と該コロニー内の該
物質の生成を示す部分の発現との間に時間差が有るよう
に各々の微生物を増殖させる様な培地を用意する工程；
及び該酵素を構成的に発現している微生物と該酵素を誘
導的に発現している微生物とが共存している可能性のあ
る微生物の混合物を該前駆物質を含む該培地で培養して
コロニーを形成させ、コロニーの成長と該コロニー内の
該物質の生成との間に実質的な時間差がないコロニーを
該酵素を構成的に発現している微生物のコロニーとして
検出する工程； を有し、 前記有機化合物を分解可能な酵素を構成的に発現してい
る微生物がＪＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）を含
み、 該酵素を誘導的に発現する能力を備えた微生物がＪ１株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を含む ことを特徴とする
有機化合物を分解可能な酵素を本来的に有している微生
物の検出方法。 - 【請求項６０】 該有機化合物が芳香族化合物である請
求項５８記載の検出方法。 - 【請求項６１】 該芳香族化合物がフェノール、トルエ
ン及びクレゾールの少なくとも一つである請求項６０記
載の検出方法。 - 【請求項６２】 該有機化合物が塩素化脂肪族炭化水素
化合物である請求項５９記載の検出方法。 - 【請求項６３】 該塩素化脂肪族炭化水素化合物がトリ
クロロエチレン及びジクロロエチレンである請求項６２
記載の検出方法。 - 【請求項６４】 該酵素がオキシゲナーゼである請求項
５９記載の検出方法。 - 【請求項６５】 該前駆物質は該酵素の作用によって該
微生物のコロニー内に着色部分を形成する物質を生じさ
せるものである請求項５９記載の検出方法。 - 【請求項６６】 該前駆物質がインドールである請求項
６５記載の検出方法。 - 【請求項６７】 該前駆物質は該酵素の作用によって蛍
光を生じさせる物質をもたらすものである請求項５９記
載の検出方法。 - 【請求項６８】 該前駆物質の酵素で処理された物質の
生成を微生物の蛍光の測定によって確認する請求項６７
記載の検出方法。 - 【請求項６９】 該蛍光をフローサイトメータ（ＦＣ
Ｍ）で検出する請求項６８記載の検出方法。 - 【請求項７０】 該蛍光を蛍光顕微鏡で検出する請求項
６７記載の検出方法。 - 【請求項７１】 オキシゲナーゼを構成的に発現してい
る微生物とオキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備
えた微生物とが共存している環境からの前記オキシゲナ
ーゼを構成的に発現している微生物の検出の為のキット
であって、 オキシゲナーゼによる酸化によって呈色される呈色物質
を含む培地上で前記オキシゲナーゼを構成的に発現して
いる微生物と前記オキシゲナーゼを誘導的に発現する能
力を有する微生物とを含む微生物の混合物を培養して前
記微生物のコロニーを形成させたときに、前記コロニー
の成長と前記コロニー内の該呈色物質の生成による変色
部分の発現との間に実質的な時間差の無いコロニーと時
間差のあるコロニーとが生じるように前記微生物を増殖
させるような栄養を含む培地；及び該呈色物質を備え、 前記オキシゲナーゼを構成的に発現している微生物がＪ
Ｍ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５３５２）を含み、 前記オキシゲナーゼを誘導的に発現する能力を備えた微
生物がＪ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１０２）を含む こと
を特徴とするオキシゲナーゼを構成的に発現している微
生物の検出キット。 - 【請求項７２】 請求項５８に記載の方法により取得さ
れた微生物を用いて有機化合物を分解することを特徴と
する微生物を用いた有機化合物の分解方法。 - 【請求項７３】 該有機化合物が芳香族化合物である請
求項７２記載の分解方法。 - 【請求項７４】 該芳香族化合物がフェノール、トルエ
ン及びクレゾールの少なくとも一つである請求項７３記
載の分解方法。 - 【請求項７５】 該有機化合物が塩素化脂肪族炭化水素
化合物である請求項７２記載の分解方法。 - 【請求項７６】 該塩素化脂肪族炭化水素化合物がトリ
クロロエチレン及びジクロロエチレンの少なくとも一方
である請求項７５記載の分解方法。 - 【請求項７７】 汚染物質で汚染された環境を微生物を
用いて修復する方法において、請求項５８に記載の方法
で取得した微生物を用いて該汚染物質を分解せしめる工
程を有することを特徴とする環境修復方法。 - 【請求項７８】 該環境が土壌、水または気体である請
求項７７記載の環境修復方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08041100A JP3108006B2 (ja) | 1995-02-28 | 1996-02-28 | Ｊｍ１株、環境修復方法、有機化合物の分解方法、微生物の取得方法、微生物の検出方法、及び微生物の検出キット |
| US08/608,808 US6004772A (en) | 1995-02-28 | 1996-02-28 | Oxygenase expressing microorganism strain JM1 (FERM BP-5352) for degrading organic compounds without an inducer |
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| JP7-40380 | 1995-02-28 | ||
| JP4038095 | 1995-02-28 | ||
| JP7-40377 | 1995-02-28 | ||
| JP4037795 | 1995-02-28 | ||
| JP08041100A JP3108006B2 (ja) | 1995-02-28 | 1996-02-28 | Ｊｍ１株、環境修復方法、有機化合物の分解方法、微生物の取得方法、微生物の検出方法、及び微生物の検出キット |
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|---|---|
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