JP3097035B2 - アリールスルファターゼ - Google Patents
アリールスルファターゼInfo
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- JP3097035B2 JP3097035B2 JP02279490A JP27949090A JP3097035B2 JP 3097035 B2 JP3097035 B2 JP 3097035B2 JP 02279490 A JP02279490 A JP 02279490A JP 27949090 A JP27949090 A JP 27949090A JP 3097035 B2 JP3097035 B2 JP 3097035B2
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- sulfatase
- enzyme
- etoposide
- streptomyces
- sulfate
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- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
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- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
- A61K47/6899—Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy [ADEPT]
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、スルフアターゼ及びその醗酵法による製造
法に関する。本発明は特にストレプトミセス属から単離
されたスルフアターゼに関する。
法に関する。本発明は特にストレプトミセス属から単離
されたスルフアターゼに関する。
（従来技術） ヒトの癌の化学療法における大きな問題は、抗腫瘍剤
による非特異的な作用によつて正常細胞にも望ましくな
い傷害を起こすことにある。細胞毒活性を有する薬物を
選択的に腫瘍部あるいはその近傍に送り込むことによつ
て、正常の組織への毒作用を最小限にする多くの試みが
なされてきた。この領域での多くの努力が細胞毒活性を
有する薬物を第二の成分（この成分は正常細胞よりも腫
瘍細胞により大きな親和性を持つもので、例えば抗体、
ホルモン、レクチン又はポリマーなどである）に結合せ
しめることに費やされてきた。
による非特異的な作用によつて正常細胞にも望ましくな
い傷害を起こすことにある。細胞毒活性を有する薬物を
選択的に腫瘍部あるいはその近傍に送り込むことによつ
て、正常の組織への毒作用を最小限にする多くの試みが
なされてきた。この領域での多くの努力が細胞毒活性を
有する薬物を第二の成分（この成分は正常細胞よりも腫
瘍細胞により大きな親和性を持つもので、例えば抗体、
ホルモン、レクチン又はポリマーなどである）に結合せ
しめることに費やされてきた。
極く最近、腫瘍を保持する宿主に抗体−酵素（ab−en
z）コンジユゲートと一緒に抗腫瘍剤のプロドラツグを
投与するという異なつた方法が提案されている（参照、
例えば、P.D.Senter,et al.欧州特許出願第302,473号、
1989年２月８日発行）。そのコンジユゲートは、そのプ
ロドラツグを活性な母体化合物に転化させることのでき
る酵素と、その酵素がそのプロドラツグに作用するとこ
ろの腫瘍細胞の表面に酵素を運ぶ役目をする腫瘍特異抗
体とからなるものである。このように、この方法は、そ
のab−enzコンジユゲートが結合している腫瘍の近傍で
い濃度の抗腫瘍薬物を作り出すことができる可能性が
ある。そのab−enzコンジユゲート／プロドラツグ法を
用いるためには、腫瘍部位で酵素に遭遇するまでプロド
ラツクのまま保たれるようそれがい濃度で血流中に存
在しないような酵素であることが好ましい。そのプロド
ラツグ自体は、母体薬剤に比べてかなりの程度細胞毒活
性は少ないものである；その細胞毒性を有する薬物は、
普通に抗腫瘍剤として用いられるものであつてよくその
抗腫瘍剤は修飾されてプロドラツグを形成しうるような
もので、そのプロドラツグは酵素によつて母体薬剤を生
ずるようなものである。
z）コンジユゲートと一緒に抗腫瘍剤のプロドラツグを
投与するという異なつた方法が提案されている（参照、
例えば、P.D.Senter,et al.欧州特許出願第302,473号、
1989年２月８日発行）。そのコンジユゲートは、そのプ
ロドラツグを活性な母体化合物に転化させることのでき
る酵素と、その酵素がそのプロドラツグに作用するとこ
ろの腫瘍細胞の表面に酵素を運ぶ役目をする腫瘍特異抗
体とからなるものである。このように、この方法は、そ
のab−enzコンジユゲートが結合している腫瘍の近傍で
い濃度の抗腫瘍薬物を作り出すことができる可能性が
ある。そのab−enzコンジユゲート／プロドラツグ法を
用いるためには、腫瘍部位で酵素に遭遇するまでプロド
ラツクのまま保たれるようそれがい濃度で血流中に存
在しないような酵素であることが好ましい。そのプロド
ラツグ自体は、母体薬剤に比べてかなりの程度細胞毒活
性は少ないものである；その細胞毒性を有する薬物は、
普通に抗腫瘍剤として用いられるものであつてよくその
抗腫瘍剤は修飾されてプロドラツグを形成しうるような
もので、そのプロドラツグは酵素によつて母体薬剤を生
ずるようなものである。
エトポシド（I a）及びテニポシド（I b）は、抗腫瘍
剤として臨床的に用いられる化合物で、一般的には４′
−デメチルエピポドフイロトキシングルコシド（DEPG）
として知られたものである。４′−デメチルエピポドフ
イロトキシングルコシドの一般式は、式（Ｉ）で示され
る。
剤として臨床的に用いられる化合物で、一般的には４′
−デメチルエピポドフイロトキシングルコシド（DEPG）
として知られたものである。４′−デメチルエピポドフ
イロトキシングルコシドの一般式は、式（Ｉ）で示され
る。
（上式中R1は、例えばC1−C10アルキル、２−チエニ
ル、フリルまたはフエニルであつてよい） DEPGのヒドロキシ基及びフエノール基は誘導体化さ
れ、ab−enzコンジユゲートのための基質として適した
プロドラツグを与える。事実、エトポシド ４′−ホス
フエートをモノクローナル抗体−アルカリ性ホスフアタ
ーゼと組み合わせると有効なことは、マウス中のヒト結
腸癌異種移植モデルにおいて示された〔Senter,et al.
同上〕。
ル、フリルまたはフエニルであつてよい） DEPGのヒドロキシ基及びフエノール基は誘導体化さ
れ、ab−enzコンジユゲートのための基質として適した
プロドラツグを与える。事実、エトポシド ４′−ホス
フエートをモノクローナル抗体−アルカリ性ホスフアタ
ーゼと組み合わせると有効なことは、マウス中のヒト結
腸癌異種移植モデルにおいて示された〔Senter,et al.
同上〕。
エトポシド ４′−ホスフエートに加えて、エトポシ
ドサルフエートも従来知られたものである。これらの誘
導体は、特開昭63−192,793号に開示され、下記式（I
I）を有する。
ドサルフエートも従来知られたものである。これらの誘
導体は、特開昭63−192,793号に開示され、下記式（I
I）を有する。
（上式中Ａ、Ｂ及びＸのうちの一つは、−SO3H基で、他
の基はＨである） エトポシド ４′−サルフエート（Ａ＝Ｂ＝H;X＝−S
O3H）は、エトポシド自体よりもかなり細胞毒活性が少
なく、エトポシドと同じ程度の活性を達成するために
は、かなり多くの量を投与することが必要である。この
ことは、エトポシド ４′−サルフエートは、in vivo
でエトポシドに効率よく転化されるものでなく、ab−en
zコンジユゲートと一緒にプロドラツグとして用いられ
るのにより適していることを示している。エトポシド
４′−サルフエートをエトポシドに変えるのに必要とさ
れる酵素はスルフアターゼで、それは次のようにしてサ
ルフエートエルテルを加水分解して相当するヒドロキシ
化合物にすることを触媒する： 数種のスルフアターゼがこれまで研究されており、それ
らとしては、タイプＩ及びタイプIIアリールスルフアタ
ーゼ、ステロイドスルフアターゼ、グルコスルフアター
ゼ、コリンスルフアターゼ、アルキルスルフアターゼ、
ミロスルフアターゼがあげられる。（スルフアターゼ類
に関しては、「The Hydrolysis of Sulfate Esters」A.
B.Roy著「The Enzymes」Vol.V,pp.1−19.P.D.Boyer,編,
Academic Press,1971参照）。これらのうちアリールス
ルフアターゼ（アリールサルフエートスルホヒドロラー
ゼ、EC3.1。6.1）は、Ｒが芳香族環である上記の反応を
触媒し、各種の動物組織及び微生物から単離され、非常
に広く研究されている（アリールスルフアターゼ類に関
しては、「Arylsulfatases」R.G.Nicholls及びＡ。Ｂ。
Roy著，同上、pp.21−41参照）。数多くのスルフアター
ゼが報告されてはいるが、均一な状態にまで精製された
ものは極くわずかであることは注目すべきことである。
例えば、ウサギ肝臓から得られるアリールスルフアター
ゼＡは分子量約70KD（モノマー）で、pH7.4でダイマー
を形成し、pH4.8でテトラマーを形成し、10,000倍まで
精製されている（G.D.Lee及びR.L.Van Etten;Arch,Bioc
hem,Biophys.,166,280−294,1975）；雄ウシ肝臓から単
離されたアリールスルフアターゼは分子量107KD（モノ
マー）を有するグリコプロテインである（L.W.Nichol及
びA.B.Roy;J.Biochem.,55,643−651,1964及びE.R.B.Gra
ham及びA.B.Roy;Biochim.Biophys.Acta,329,88−92,197
3）。
の基はＨである） エトポシド ４′−サルフエート（Ａ＝Ｂ＝H;X＝−S
O3H）は、エトポシド自体よりもかなり細胞毒活性が少
なく、エトポシドと同じ程度の活性を達成するために
は、かなり多くの量を投与することが必要である。この
ことは、エトポシド ４′−サルフエートは、in vivo
でエトポシドに効率よく転化されるものでなく、ab−en
zコンジユゲートと一緒にプロドラツグとして用いられ
るのにより適していることを示している。エトポシド
４′−サルフエートをエトポシドに変えるのに必要とさ
れる酵素はスルフアターゼで、それは次のようにしてサ
ルフエートエルテルを加水分解して相当するヒドロキシ
化合物にすることを触媒する： 数種のスルフアターゼがこれまで研究されており、それ
らとしては、タイプＩ及びタイプIIアリールスルフアタ
ーゼ、ステロイドスルフアターゼ、グルコスルフアター
ゼ、コリンスルフアターゼ、アルキルスルフアターゼ、
ミロスルフアターゼがあげられる。（スルフアターゼ類
に関しては、「The Hydrolysis of Sulfate Esters」A.
B.Roy著「The Enzymes」Vol.V,pp.1−19.P.D.Boyer,編,
Academic Press,1971参照）。これらのうちアリールス
ルフアターゼ（アリールサルフエートスルホヒドロラー
ゼ、EC3.1。6.1）は、Ｒが芳香族環である上記の反応を
触媒し、各種の動物組織及び微生物から単離され、非常
に広く研究されている（アリールスルフアターゼ類に関
しては、「Arylsulfatases」R.G.Nicholls及びＡ。Ｂ。
Roy著，同上、pp.21−41参照）。数多くのスルフアター
ゼが報告されてはいるが、均一な状態にまで精製された
ものは極くわずかであることは注目すべきことである。
例えば、ウサギ肝臓から得られるアリールスルフアター
ゼＡは分子量約70KD（モノマー）で、pH7.4でダイマー
を形成し、pH4.8でテトラマーを形成し、10,000倍まで
精製されている（G.D.Lee及びR.L.Van Etten;Arch,Bioc
hem,Biophys.,166,280−294,1975）；雄ウシ肝臓から単
離されたアリールスルフアターゼは分子量107KD（モノ
マー）を有するグリコプロテインである（L.W.Nichol及
びA.B.Roy;J.Biochem.,55,643−651,1964及びE.R.B.Gra
ham及びA.B.Roy;Biochim.Biophys.Acta,329,88−92,197
3）。
リグノスルホネートからサルフエートを遊離するとこ
ろのアリールスルフアターゼ活性は、ストレプトミセス
属、Ｌ（Streptomyces sp.L.）の無細胞抽出液中で示さ
れる；しかし、その酵素自体は精製されておらず、その
性状も不明である（Y.L.Steinitz.Eur.J.Appl.Microb.B
iotechnol.,13,216−221,1981）。
ろのアリールスルフアターゼ活性は、ストレプトミセス
属、Ｌ（Streptomyces sp.L.）の無細胞抽出液中で示さ
れる；しかし、その酵素自体は精製されておらず、その
性状も不明である（Y.L.Steinitz.Eur.J.Appl.Microb.B
iotechnol.,13,216−221,1981）。
各種の原料から単離されたアリールスルフアターゼは
市販されて手に入れることができる。これらの酵素は基
質としてエトポシド ４′−サルフエートを用いて検定
されたが、殆んどのものは、この化合物に対して何らの
加水分割活性を示さないかあるいはほんのわずかの加水
分解活性を示すにすぎなかつた。さらにまた、市販され
て入手しうるスルフアターゼのうちには何ら均一なもの
はなく、あるものは望ましくない性質、例えば大きな分
子量、低い全適pH等を示し、臨床用途には不適当な性質
を持つていた。
市販されて手に入れることができる。これらの酵素は基
質としてエトポシド ４′−サルフエートを用いて検定
されたが、殆んどのものは、この化合物に対して何らの
加水分割活性を示さないかあるいはほんのわずかの加水
分解活性を示すにすぎなかつた。さらにまた、市販され
て入手しうるスルフアターゼのうちには何ら均一なもの
はなく、あるものは望ましくない性質、例えば大きな分
子量、低い全適pH等を示し、臨床用途には不適当な性質
を持つていた。
このような従来技術の問題に対し、４′−デメチルエ
ピポドフイロトキシングルコシド ４′−サルフエート
を加水分解して、相当する４′−デメチルエピポドフイ
ロトキシングルコシドを形成することのできる微生物由
来のアリールスルフアターゼを検索することを開始し
た。こうした努力の結果、本発明をなすに至つた。
ピポドフイロトキシングルコシド ４′−サルフエート
を加水分解して、相当する４′−デメチルエピポドフイ
ロトキシングルコシドを形成することのできる微生物由
来のアリールスルフアターゼを検索することを開始し
た。こうした努力の結果、本発明をなすに至つた。
（課題の解決） 本発明は、４′−デメチルエピポドフィロトキシング
ルコシド ４′−サルフェート（４′−demethylepipod
ophyllotoxin glucoside 4′−sulfate）を４′−デメ
チルエピポドフィロトキシングルコシド（４′−demeth
ylepipodophyllotoxin glucoside）に変換する反応を触
媒することができるスルファターゼであり、該スルファ
ターゼはSDS−PAGEで測定したとき約45kDの分子量も
ち、そして約5.6の等電点もち、その至適pHが約9.0であ
り、そしてその至適温度が約30℃であることを特徴とす
る放線菌から単離された実質的に精製したスルファター
ゼを提供するものである。
ルコシド ４′−サルフェート（４′−demethylepipod
ophyllotoxin glucoside 4′−sulfate）を４′−デメ
チルエピポドフィロトキシングルコシド（４′−demeth
ylepipodophyllotoxin glucoside）に変換する反応を触
媒することができるスルファターゼであり、該スルファ
ターゼはSDS−PAGEで測定したとき約45kDの分子量も
ち、そして約5.6の等電点もち、その至適pHが約9.0であ
り、そしてその至適温度が約30℃であることを特徴とす
る放線菌から単離された実質的に精製したスルファター
ゼを提供するものである。
本発明の別の目的は、上記スルファターゼを産生する
ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）に属する菌を
同化性炭素及び窒素源を含有する培地中で液内好気条件
下で培養し、このスルファターゼを採取可能な量まで産
生させ、その後にこのスルファターゼを採取する方法を
提供するものである。
ストレプトミセス属（Streptomyces sp.）に属する菌を
同化性炭素及び窒素源を含有する培地中で液内好気条件
下で培養し、このスルファターゼを採取可能な量まで産
生させ、その後にこのスルファターゼを採取する方法を
提供するものである。
また、本発明の別の目的は、上記スルファターゼを産
生する微生物菌であるストレプトミセス属T109−３（St
reptomyces sp.T109−３）又はその変異体（バリアン
ト）又はその突然変異体（ミュータント）を提供するこ
とにある。
生する微生物菌であるストレプトミセス属T109−３（St
reptomyces sp.T109−３）又はその変異体（バリアン
ト）又はその突然変異体（ミュータント）を提供するこ
とにある。
以下本発明を更に詳しく説明する。
本発明は、本明細書においてEs−２と命名されたとこ
ろのスルフアターゼを提供するもので、そのスルフアタ
ーゼEs−２は、放線菌、特にストレプトミセス属T109−
３から単離されたものである。そのスルファターゼはSD
S−PAGEで測定したとき約45kDの分子量もち、そして約
5.6の等電点もち、その至適pHが約9.0であり、そしてそ
の至適温度が約30℃である特徴をもつ。その酵素は、
４′−デメチルエピポフイロトキシングルコシド ４′
−サルフエートを４′−デメチルエピポドフイロトキシ
ングルコシドに下記に示すようにして変換する反応を触
媒することができる。
ろのスルフアターゼを提供するもので、そのスルフアタ
ーゼEs−２は、放線菌、特にストレプトミセス属T109−
３から単離されたものである。そのスルファターゼはSD
S−PAGEで測定したとき約45kDの分子量もち、そして約
5.6の等電点もち、その至適pHが約9.0であり、そしてそ
の至適温度が約30℃である特徴をもつ。その酵素は、
４′−デメチルエピポフイロトキシングルコシド ４′
−サルフエートを４′−デメチルエピポドフイロトキシ
ングルコシドに下記に示すようにして変換する反応を触
媒することができる。
（上式中R1及びR2はそれぞれ（C1−C10）アルキルまた
はR2はＨでR1はC1−C10アルキル、フリル、チエニル及
びフエニルからなる群から選ばれ;R3及びR4はそれぞれ
独立にＨまたはアシル基で、ＭはＨまたはアルカリ金属
イオンである） アシル基としては、ホルミル、アセチル、及びベンゾ
イルがあげられるが、それらに限定されるものではな
い。アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウム、
ナトリウム、及びカリウムがあげられる。Es−２の基質
としては、特にエトポシド ４′−サルフエートまたは
そのアシル化誘導体があげられる。
はR2はＨでR1はC1−C10アルキル、フリル、チエニル及
びフエニルからなる群から選ばれ;R3及びR4はそれぞれ
独立にＨまたはアシル基で、ＭはＨまたはアルカリ金属
イオンである） アシル基としては、ホルミル、アセチル、及びベンゾ
イルがあげられるが、それらに限定されるものではな
い。アルカリ金属イオンとしては、例えば、リチウム、
ナトリウム、及びカリウムがあげられる。Es−２の基質
としては、特にエトポシド ４′−サルフエートまたは
そのアシル化誘導体があげられる。
本明細書中で使用されるうち、「実質的に純粋にされ
た」酵素としては、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一のバンドを示す酵素を示す。
た」酵素としては、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一のバンドを示す酵素を示す。
I.産生微生物 インド国マハラシトラ（Maharashtra）州で採取され
た土壌サンプルから放線菌株No.109−３が単離された。
このストレプトミセス属（Streptomyces sp.）T109−３
株と命名された微生物の生物学的に純粋な培養物は、ブ
タペスト条約に基づきアメリカン タイプ カルチャー
コレクシヨン（American Type Culture Collection）
Rockville.MD,U.S.A.に寄託番号ATCC 53948のもとに寄
託されている。
た土壌サンプルから放線菌株No.109−３が単離された。
このストレプトミセス属（Streptomyces sp.）T109−３
株と命名された微生物の生物学的に純粋な培養物は、ブ
タペスト条約に基づきアメリカン タイプ カルチャー
コレクシヨン（American Type Culture Collection）
Rockville.MD,U.S.A.に寄託番号ATCC 53948のもとに寄
託されている。
（ａ） 形態学的性状 そのT109−３株は、分枝した基生菌糸及び分節してい
ない基生菌糸上に豊富な気菌糸を形成する。長い胞子鎖
及び閉じたらせん状の胞子鎖は、気菌糸の端に単一柄と
して生ずる。その胞子鎖は10〜50の胞子をその鎖当たり
含んでいる。その胞子は細長く（0.6−0.8×1.0−1.2μ
ｍ）、運動性はなく突がつた表面を有する。菌核（スク
レロチア、sclerotia）あるいは胞子嚢（スポランギ
ア、sporangia）様の本体は形成されない。
ない基生菌糸上に豊富な気菌糸を形成する。長い胞子鎖
及び閉じたらせん状の胞子鎖は、気菌糸の端に単一柄と
して生ずる。その胞子鎖は10〜50の胞子をその鎖当たり
含んでいる。その胞子は細長く（0.6−0.8×1.0−1.2μ
ｍ）、運動性はなく突がつた表面を有する。菌核（スク
レロチア、sclerotia）あるいは胞子嚢（スポランギ
ア、sporangia）様の本体は形成されない。
（ｂ） 培養特性 そのT109−３株はISP培養及びツアペツク（Czapek'
s）シユクロース−硝酸塩寒天のすべてでよく生育す
る。気菌子は、胞子形成後オリーブグレイまたはブラウ
ニツシユグレイに変化する。基生菌子は無色または輝黄
色である。メラニン及びその他の識別しうる色素は生成
されない。T109−３株の培養特性は表Ｉに示してある。
s）シユクロース−硝酸塩寒天のすべてでよく生育す
る。気菌子は、胞子形成後オリーブグレイまたはブラウ
ニツシユグレイに変化する。基生菌子は無色または輝黄
色である。メラニン及びその他の識別しうる色素は生成
されない。T109−３株の培養特性は表Ｉに示してある。
（ｃ） 生理的な特徴 T109−３株はゼラチンを加水分解し、ナイトレートレ
ダクターゼ及びチロシナーゼを形成しない。糖の利用性
状は次の通りである： シユクロース、ラフイノース、Ｄ−メレジトース、イノ
シトール及びＤ−マンニトールに対しては、陽性;L−ア
ラビノース及びＬ−ラムノースに対しては陰性;T109−
３株の生理的な特性については表IIに示してある。
ダクターゼ及びチロシナーゼを形成しない。糖の利用性
状は次の通りである： シユクロース、ラフイノース、Ｄ−メレジトース、イノ
シトール及びＤ−マンニトールに対しては、陽性;L−ア
ラビノース及びＬ−ラムノースに対しては陰性;T109−
３株の生理的な特性については表IIに示してある。
（ｄ） 細胞の化学的性状 細胞全体の加水分解物はLL−ジアミノピメリン酸を含
有している。ホスホリピド類のうちには、二つのホスフ
アチジルエタノールアミン類（PE）、ホスフアチジルグ
リセロール（PG）及びホスフアチジルイノシトール（P
I）が含まれている。したがつて、本菌はタイプＩの細
胞壁とタイプIIのホスホリピドのうちに属するものであ
る。
有している。ホスホリピド類のうちには、二つのホスフ
アチジルエタノールアミン類（PE）、ホスフアチジルグ
リセロール（PG）及びホスフアチジルイノシトール（P
I）が含まれている。したがつて、本菌はタイプＩの細
胞壁とタイプIIのホスホリピドのうちに属するものであ
る。
T109−３株の胞子鎖の形態及びその細胞の化学的性状
に基づき、本菌はストレプトミセス属に属するとされ
た。Pridham及びTresner〔Pridham,T.G.及びH.D.Tresne
r:ストレプトミセス属Waksman及びHEnrici,pp.748−82
9,R.E.Buchanan及びN.E.Gibbons（Ed.）Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology,8th Ed.,1974,Willi
ams ＆ Wilkins Co.,発行〕による分類指標に従えば、
本菌は、グレイ（gray,G）、スパイラ（Spira,S）、色
素原性を有しない（nonchromogenic,C）そして多くの突
起を有する（spiny,SPY）ものとされる。Pridham及びTr
esnerによつて記載された上記の群のもののうち24種の
公知の種のうちで、その糖の利用性ではT109−３菌は、
S.アルボスピヌス（S.albospinus）M750−G1、S.アルブ
ルス（S.albulus）ATCC 12757、S.チヤタノオゲンシス
（S.chattanoogensis）ATCC 13358、及びS.ノウルセイ
（S.noursei）ATCC 11455に類似している。上記４つの
種の菌とT109−３菌とをさらに比較してみると、T109−
３菌はS.ノウルセイ（S.noursei）に類似したものであ
る。しかしながら、T109−３菌は、表IIIで示してある
ようないくつかの性質でS.ノウルセイ（Ｓ。noursei）
とは異なつている。かくして、T109−３菌は、ストレプ
トミセス属の新しい菌株であるとされた。
に基づき、本菌はストレプトミセス属に属するとされ
た。Pridham及びTresner〔Pridham,T.G.及びH.D.Tresne
r:ストレプトミセス属Waksman及びHEnrici,pp.748−82
9,R.E.Buchanan及びN.E.Gibbons（Ed.）Bergey's Manua
l of Determinative Bacteriology,8th Ed.,1974,Willi
ams ＆ Wilkins Co.,発行〕による分類指標に従えば、
本菌は、グレイ（gray,G）、スパイラ（Spira,S）、色
素原性を有しない（nonchromogenic,C）そして多くの突
起を有する（spiny,SPY）ものとされる。Pridham及びTr
esnerによつて記載された上記の群のもののうち24種の
公知の種のうちで、その糖の利用性ではT109−３菌は、
S.アルボスピヌス（S.albospinus）M750−G1、S.アルブ
ルス（S.albulus）ATCC 12757、S.チヤタノオゲンシス
（S.chattanoogensis）ATCC 13358、及びS.ノウルセイ
（S.noursei）ATCC 11455に類似している。上記４つの
種の菌とT109−３菌とをさらに比較してみると、T109−
３菌はS.ノウルセイ（S.noursei）に類似したものであ
る。しかしながら、T109−３菌は、表IIIで示してある
ようないくつかの性質でS.ノウルセイ（Ｓ。noursei）
とは異なつている。かくして、T109−３菌は、ストレプ
トミセス属の新しい菌株であるとされた。
II.酵素の産生 本発明のアリールスルフアターゼEs−２は、ストレプ
トミセス属に属するEs−２産生菌を培養することにより
得られる。特に本発明のアリールスルフアターゼEs−２
は、ストレプトミセス属に属する菌株T109−３またはそ
の変異株を水性栄養培地中で深部好気条件下培養するこ
とにより得られる。その酵素産生菌は、資化性炭素源、
例えば資化性炭水化物を含有する栄養培地中で生育せし
められる。適切な炭素源の例としては、セレロース（ce
relose）、フルクトース、可溶性デン粉及びグリセロー
ルがあげられる。栄養培地はまた魚肉ミール、酵母エキ
スまたはアンモニウム塩のような資化性窒素源を含有す
べきである。塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、炭酸カルシウム、リン酸塩類等のような無機
の塩及び銅、マンガン、鉄、亜鉛等の微量元素をもし必
要なら培地に加えるかあるいはそれらを他の培地成分の
不純物として存在せしめることもできる。培養温度は、
その産生菌が生育でき、所望の目的物を産生できる温度
であればいかなる温度でもよく、例えば約18℃〜約39℃
でよいが、好ましくは約25℃〜35℃で醗酵させることが
でき、さらに好ましくは約25℃〜30℃で行なうことがで
きる。好ましくは中性のpHの培地が使用され、その酵素
の産生は約４〜８日間行なわれる。通常最適な産生は約
５〜６日目に達成される。比較的少ない量の酵素を製造
するにあたつては、振とう用フラスコあるいは表面で培
養することが利用されるが、沢山の量を得るためには、
無菌タンク内での深部好気培養が好ましい。タンク培養
醗酵がなされた場合、その菌の胞子を培養液に接種して
栄養培地中に休止期にある接種物を作らせ、若い活性を
有する休止期の接種物を得たら、その接種物を無菌的に
その醗酵タンク培地中に移されることが好ましい。さら
に機械式のインペラーでもつて激しく攪拌してもよい。
ラード油またはシリコン油のような消泡剤も必要により
加えることができる。
トミセス属に属するEs−２産生菌を培養することにより
得られる。特に本発明のアリールスルフアターゼEs−２
は、ストレプトミセス属に属する菌株T109−３またはそ
の変異株を水性栄養培地中で深部好気条件下培養するこ
とにより得られる。その酵素産生菌は、資化性炭素源、
例えば資化性炭水化物を含有する栄養培地中で生育せし
められる。適切な炭素源の例としては、セレロース（ce
relose）、フルクトース、可溶性デン粉及びグリセロー
ルがあげられる。栄養培地はまた魚肉ミール、酵母エキ
スまたはアンモニウム塩のような資化性窒素源を含有す
べきである。塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグ
ネシウム、炭酸カルシウム、リン酸塩類等のような無機
の塩及び銅、マンガン、鉄、亜鉛等の微量元素をもし必
要なら培地に加えるかあるいはそれらを他の培地成分の
不純物として存在せしめることもできる。培養温度は、
その産生菌が生育でき、所望の目的物を産生できる温度
であればいかなる温度でもよく、例えば約18℃〜約39℃
でよいが、好ましくは約25℃〜35℃で醗酵させることが
でき、さらに好ましくは約25℃〜30℃で行なうことがで
きる。好ましくは中性のpHの培地が使用され、その酵素
の産生は約４〜８日間行なわれる。通常最適な産生は約
５〜６日目に達成される。比較的少ない量の酵素を製造
するにあたつては、振とう用フラスコあるいは表面で培
養することが利用されるが、沢山の量を得るためには、
無菌タンク内での深部好気培養が好ましい。タンク培養
醗酵がなされた場合、その菌の胞子を培養液に接種して
栄養培地中に休止期にある接種物を作らせ、若い活性を
有する休止期の接種物を得たら、その接種物を無菌的に
その醗酵タンク培地中に移されることが好ましい。さら
に機械式のインペラーでもつて激しく攪拌してもよい。
ラード油またはシリコン油のような消泡剤も必要により
加えることができる。
本発明は、上記した特に好ましいストレプトミセス属
に属する菌株T109−３あるいは前記したことに答えられ
る微生物の使用に限定されないことは、理解されるべき
である。特に通常の方法、例えばＸ線照射、紫外線照
射、ナイトロジエンマスタードによる処理、フアージに
さらすこと等により産生させることができ且つ本発明の
アリールスルフアターゼEs−２を産生する能力を保持し
ている上記菌のその他の菌株または変異株もそのうちに
含まれる。
に属する菌株T109−３あるいは前記したことに答えられ
る微生物の使用に限定されないことは、理解されるべき
である。特に通常の方法、例えばＸ線照射、紫外線照
射、ナイトロジエンマスタードによる処理、フアージに
さらすこと等により産生させることができ且つ本発明の
アリールスルフアターゼEs−２を産生する能力を保持し
ている上記菌のその他の菌株または変異株もそのうちに
含まれる。
III.酵素の単離及び精製 本発明のアリールスルフアターゼは、醗酵ブロスから
通常のタンパク質分離法、例えば透析、限外濾過法、ゲ
ル濾過法、イオン交換クロマトグラフイー法及びアフイ
ニテイクロマトグラフイー法によつて単離されることが
できる。これらの方法を順次組み合わせて、普通均一な
ものとなるまでタンパク質が精製される。好ましくはタ
ンパク質の精製法は、減圧下、好ましくは約０゜−５℃
でなされる。その単離精製法は、UVまたはHPLC法のよう
な物理的方法または、基質としてｐ−ニトロフエニルス
ルフアターゼまたはその他の適当なアリールサルフエー
ト類を用いた酵素活性測定法によりモニターされたり、
導びかれて行なわれる。代表的な単離精製方法は、下記
にそれを具体的に説明するためにだけの目的で示される
が、その他の方法を用いた異なつた方法もそのタンパク
質が高い純度で且つ生物学的活性を保持したままなされ
る限り用いることができるということが当業者には認め
られよう。
通常のタンパク質分離法、例えば透析、限外濾過法、ゲ
ル濾過法、イオン交換クロマトグラフイー法及びアフイ
ニテイクロマトグラフイー法によつて単離されることが
できる。これらの方法を順次組み合わせて、普通均一な
ものとなるまでタンパク質が精製される。好ましくはタ
ンパク質の精製法は、減圧下、好ましくは約０゜−５℃
でなされる。その単離精製法は、UVまたはHPLC法のよう
な物理的方法または、基質としてｐ−ニトロフエニルス
ルフアターゼまたはその他の適当なアリールサルフエー
ト類を用いた酵素活性測定法によりモニターされたり、
導びかれて行なわれる。代表的な単離精製方法は、下記
にそれを具体的に説明するためにだけの目的で示される
が、その他の方法を用いた異なつた方法もそのタンパク
質が高い純度で且つ生物学的活性を保持したままなされ
る限り用いることができるということが当業者には認め
られよう。
そのストレプトミセス属T109−３の醗酵ブロスは濾過
せしめられ、不溶性物質が除去せしめられ、その濾液の
容量は限外濾過法を用い室温で小さくせしめられる。濃
縮された溶液は、硫酸アンモニウムで処理されて、その
タンパク質が沈殿せしめられる。硫酸アンモニウムは70
％〜90％飽和になるまで、好ましくは80％飽和になるま
で加えられる。その溶液を約４℃で数時間静置し、その
沈殿を約４℃で遠心して集める。沈殿固形物を適当な緩
衝液に溶解し、例えば約7.5のpHのTris−HCl緩衝液に溶
解し、次に1mM CaCl2を含有する同じ緩衝液に対して透
析した。沈殿を遠心して除き、上清液をサルフエート化
セルロースのような吸着剤を用いての陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフイーにかけ精製する。そのカラムをpH
7.5の1M Tris HClのような適当な緩衝液で溶出する。ス
ルフアターゼ活性を有する分画を集めて一緒にし、さら
にDEAE−セルロースのような適当な陰イオン交換剤を用
いての陰イオン交換クロマトグラフイーによつて精製し
た。溶出緩衝液としてpH約7.5の適当なTris−HClを用
い、50mM〜500mMの濃度のリニア−グラジエントとす
る。活性のある分画を一緒にしたものを、再度サルフエ
ート化セルロースカラムのクロマトグラフイーにかけ、
約7.5のpHのTris−HCl緩衝液の50mM〜1.5Mの濃度のリニ
ア−グラジエントにかける。活性のある分画を集め、限
外濾過法で濃縮し、本発明のスルフアターゼを得る。
せしめられ、不溶性物質が除去せしめられ、その濾液の
容量は限外濾過法を用い室温で小さくせしめられる。濃
縮された溶液は、硫酸アンモニウムで処理されて、その
タンパク質が沈殿せしめられる。硫酸アンモニウムは70
％〜90％飽和になるまで、好ましくは80％飽和になるま
で加えられる。その溶液を約４℃で数時間静置し、その
沈殿を約４℃で遠心して集める。沈殿固形物を適当な緩
衝液に溶解し、例えば約7.5のpHのTris−HCl緩衝液に溶
解し、次に1mM CaCl2を含有する同じ緩衝液に対して透
析した。沈殿を遠心して除き、上清液をサルフエート化
セルロースのような吸着剤を用いての陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフイーにかけ精製する。そのカラムをpH
7.5の1M Tris HClのような適当な緩衝液で溶出する。ス
ルフアターゼ活性を有する分画を集めて一緒にし、さら
にDEAE−セルロースのような適当な陰イオン交換剤を用
いての陰イオン交換クロマトグラフイーによつて精製し
た。溶出緩衝液としてpH約7.5の適当なTris−HClを用
い、50mM〜500mMの濃度のリニア−グラジエントとす
る。活性のある分画を一緒にしたものを、再度サルフエ
ート化セルロースカラムのクロマトグラフイーにかけ、
約7.5のpHのTris−HCl緩衝液の50mM〜1.5Mの濃度のリニ
ア−グラジエントにかける。活性のある分画を集め、限
外濾過法で濃縮し、本発明のスルフアターゼを得る。
精製工程中スルフアターゼ活性は、ｐ−ニトロフエニ
ルサルフエートがｐ−ニトロフエノールに変換されるの
を分光測定装置を用いて測定することによりモニターす
る。50μのｐ−ニトロフエニルサルフエート溶液（50
mM Tris−HCl、pH7.5、液中の1mg/ml）、50μの検体
及び100μの50mM Tris−HCl、pH7.5液を混合し、30分
間37℃でインキユベーシヨン処理する。もし活性が弱い
場合は、インキユベーシヨン時間を18時間まで延ばす。
遊離せしめられたｐ−ニトロフエノールは、415nmで光
学測定装置で測定せしめられる。ｐ−ニトロフエノール
とタンパク質濃度との標準曲線より、酵素mg当たりのユ
ニツト数または比活性を計算する。タンパク質濃度は精
製処理中280nmでの吸収を測定して決められ、均一な状
態のタンパク質の場合には、標準タンパク質として牛血
清アルブミンを用いてのBradford法〔Bradford,M.,et a
l.,Anal,Biochem。,1976,72;248−254〕によつて決めら
れる。１ユニツトのスルフアターゼ活性とはpH7.5、37
℃で１分間に１ナノモルのｐ−ニトロフエノールサルフ
エートをｐ−ニトロフエノールに加水分解することので
きる酵素の量として定義される。
ルサルフエートがｐ−ニトロフエノールに変換されるの
を分光測定装置を用いて測定することによりモニターす
る。50μのｐ−ニトロフエニルサルフエート溶液（50
mM Tris−HCl、pH7.5、液中の1mg/ml）、50μの検体
及び100μの50mM Tris−HCl、pH7.5液を混合し、30分
間37℃でインキユベーシヨン処理する。もし活性が弱い
場合は、インキユベーシヨン時間を18時間まで延ばす。
遊離せしめられたｐ−ニトロフエノールは、415nmで光
学測定装置で測定せしめられる。ｐ−ニトロフエノール
とタンパク質濃度との標準曲線より、酵素mg当たりのユ
ニツト数または比活性を計算する。タンパク質濃度は精
製処理中280nmでの吸収を測定して決められ、均一な状
態のタンパク質の場合には、標準タンパク質として牛血
清アルブミンを用いてのBradford法〔Bradford,M.,et a
l.,Anal,Biochem。,1976,72;248−254〕によつて決めら
れる。１ユニツトのスルフアターゼ活性とはpH7.5、37
℃で１分間に１ナノモルのｐ−ニトロフエノールサルフ
エートをｐ−ニトロフエノールに加水分解することので
きる酵素の量として定義される。
IV.スルフアターゼEs−２の特性 Ａ。分子量（MW）の測定 （ａ） ゲル濾過法 精製されたスルフアターゼEs−２を、マーカー（標
準）タンパク質すなわち、キモトリプシノーゲン（MW:2
5,000）、卵白アルブミン（MW:45,000）、牛血清アルブ
ミン（MW:67,000）及びブルーデキストランと共に、TSK
−GEL（TOYOPEARL、HW−55F、TOSOH（東ソー）、φ2.5
×70cm:Vt、展開溶媒:250mM Tris−HCl、pH7.5）のクロ
マトグラフイーにかけた。溶出液を1mlづつの分画にわ
けた。ブルーデキストランはフラクシヨン番号110（V
o）で、キモトリプシノーゲンはフラクシヨン番号118
（Ve）で、卵白アルブミンはフラクシヨン番号173（V
e）で、牛血清アルブミンはフラクシヨン番号168（Ve）
でそしてEs−２はフラクシヨン番号171（Ve）でそれぞ
れ溶出した。Kavは式（１）により計算され、Es−２のM
Wは、KavをMWに対してプロツトしたものからの読みで求
められた。この方法では、Es−２の分子量は、約45KDで
あるとされた。
準）タンパク質すなわち、キモトリプシノーゲン（MW:2
5,000）、卵白アルブミン（MW:45,000）、牛血清アルブ
ミン（MW:67,000）及びブルーデキストランと共に、TSK
−GEL（TOYOPEARL、HW−55F、TOSOH（東ソー）、φ2.5
×70cm:Vt、展開溶媒:250mM Tris−HCl、pH7.5）のクロ
マトグラフイーにかけた。溶出液を1mlづつの分画にわ
けた。ブルーデキストランはフラクシヨン番号110（V
o）で、キモトリプシノーゲンはフラクシヨン番号118
（Ve）で、卵白アルブミンはフラクシヨン番号173（V
e）で、牛血清アルブミンはフラクシヨン番号168（Ve）
でそしてEs−２はフラクシヨン番号171（Ve）でそれぞ
れ溶出した。Kavは式（１）により計算され、Es−２のM
Wは、KavをMWに対してプロツトしたものからの読みで求
められた。この方法では、Es−２の分子量は、約45KDで
あるとされた。
Kav＝（Ve−Vo）÷（Vt−Vo） （１） （ｂ） SDS−PAGE スルフアターゼEs−２（Tris−HCl（50mM、40μ、p
H7.5）液中の25μｇ）、10％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS、10μ）、及び50％グリセリン（５μ、0.05
％のブロモフエノールブルーを含有している）の混合物
を98℃で１分間加熱した。反応混合物をSDS−ポリアク
リルアミドゲルのウエル中に付与した。Tris−HCl（0.3
1％、pH8.4）、グリセリン1.44％及びSDS0.1％の溶液中
で電気泳動を行なつた。25℃で２時間40mAの条件下に行
なつた。次にそのゲルをクマツシーブリリアントブルー
（Coomassie Brilliant Blue）R250で染色し、７％の酢
酸で洗つた。そのスルフアターゼの分子量は、既知分子
量を持つマーカータンパク質と比較することにより約45
KDとされた。精製されたスルフアターゼEs−２の２−メ
ルカプトエタノール処理SDS−PAGEは、２−メルカプト
エタノールで処理してないタンパク質調製物と同じ位置
を示すたつた１個のタンパク質バンドのものを与えた。
H7.5）液中の25μｇ）、10％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS、10μ）、及び50％グリセリン（５μ、0.05
％のブロモフエノールブルーを含有している）の混合物
を98℃で１分間加熱した。反応混合物をSDS−ポリアク
リルアミドゲルのウエル中に付与した。Tris−HCl（0.3
1％、pH8.4）、グリセリン1.44％及びSDS0.1％の溶液中
で電気泳動を行なつた。25℃で２時間40mAの条件下に行
なつた。次にそのゲルをクマツシーブリリアントブルー
（Coomassie Brilliant Blue）R250で染色し、７％の酢
酸で洗つた。そのスルフアターゼの分子量は、既知分子
量を持つマーカータンパク質と比較することにより約45
KDとされた。精製されたスルフアターゼEs−２の２−メ
ルカプトエタノール処理SDS−PAGEは、２−メルカプト
エタノールで処理してないタンパク質調製物と同じ位置
を示すたつた１個のタンパク質バンドのものを与えた。
B.等電点の測定 等電点は、クロマトフオーカシングゲル（Chromatofo
cusing gel）PBE94（Pharmacia−LKB、Biotechnology）
を用いてのカラムクロマトグラフイーによつて決められ
た。そのタンパク質はゲルカラムの頂部にかけられた。
そのゲルカラムは前もつて25mMイミダゾール−HCl、pH
7.4で平衡化されていた。次にカラムをポリバツフア（p
olybuffer）74−HCl、pH4.0で溶出した。各分画の280nm
でのpH及び吸収を測定した。そのスルフアターゼの等電
点をこの方法を用いることにより約5.6であるとした。
cusing gel）PBE94（Pharmacia−LKB、Biotechnology）
を用いてのカラムクロマトグラフイーによつて決められ
た。そのタンパク質はゲルカラムの頂部にかけられた。
そのゲルカラムは前もつて25mMイミダゾール−HCl、pH
7.4で平衡化されていた。次にカラムをポリバツフア（p
olybuffer）74−HCl、pH4.0で溶出した。各分画の280nm
でのpH及び吸収を測定した。そのスルフアターゼの等電
点をこの方法を用いることにより約5.6であるとした。
C.酵素活性特性 （ａ） 至適pH 酵素溶液（50μの50mM Tris−HCl液（pH7.5）中の
0.6u）を次の緩衝液のそれぞれ100μと混合した:500m
M酢酸ナトリウム（pH4.0−5.5）、500mMトリス−マレエ
ート（pH5.5−7.7）、500mM Tris−HCl（pH7.5−9.0）
及び500mMグリシン−NaOH（pH9.0−10.0）。基質ｐ−ニ
トロフエニルサルフエートを上記緩衝液（1mg/ml）のそ
れぞれに同様に溶解した。該酵素液からの検体（150μ
）を同じ緩衝液中の基質液（50μ）と混合し、混合
物を30分間37℃でインキユベーシヨンした。それぞれの
緩衝液中での酵素活性を415nmでのUVによつて光学的に
測定した。本酵素の至適pHは約9.0（図.1A）であると決
定された。
0.6u）を次の緩衝液のそれぞれ100μと混合した:500m
M酢酸ナトリウム（pH4.0−5.5）、500mMトリス−マレエ
ート（pH5.5−7.7）、500mM Tris−HCl（pH7.5−9.0）
及び500mMグリシン−NaOH（pH9.0−10.0）。基質ｐ−ニ
トロフエニルサルフエートを上記緩衝液（1mg/ml）のそ
れぞれに同様に溶解した。該酵素液からの検体（150μ
）を同じ緩衝液中の基質液（50μ）と混合し、混合
物を30分間37℃でインキユベーシヨンした。それぞれの
緩衝液中での酵素活性を415nmでのUVによつて光学的に
測定した。本酵素の至適pHは約9.0（図.1A）であると決
定された。
（ｂ） pH安定性 貯蔵酵素溶液を水に対して透析し、塩を取り除いた。
酵素液をTris−HCl緩衝液（pH7.5）で0.6u/10μにあ
わせた。この溶液（10μ）を上記（ａ）であげた緩衝
液のそれぞれ40μと混合し、30℃で30分間インキユベ
ーシヨンした。酵素検体（50μ）を500mM Tris−HCl
（pH9.0）の100μ及び基質水溶液（1mg/ml）の50μ
と混合し、その混合物を37℃で30分間インキユベーシヨ
ンし、残つている酵素活性を測定した。本酵素はpH約8.
5で最大の安定性を示した（図1B）。
酵素液をTris−HCl緩衝液（pH7.5）で0.6u/10μにあ
わせた。この溶液（10μ）を上記（ａ）であげた緩衝
液のそれぞれ40μと混合し、30℃で30分間インキユベ
ーシヨンした。酵素検体（50μ）を500mM Tris−HCl
（pH9.0）の100μ及び基質水溶液（1mg/ml）の50μ
と混合し、その混合物を37℃で30分間インキユベーシヨ
ンし、残つている酵素活性を測定した。本酵素はpH約8.
5で最大の安定性を示した（図1B）。
（ｃ） 至適温度 50mM Tris−HCl（pH9.0）の150μ中の酵素（0.6u）
を同じ緩衝液（pH9.0）中のｐ−ニトロフエニルサルフ
エート（1mg/ml、50μ）と共に30分間種々の温度下
（それぞれ200μ）にインキユベーシヨンした酵素活
性の至適温度は、約30℃であることが示された（図2
A）。
を同じ緩衝液（pH9.0）中のｐ−ニトロフエニルサルフ
エート（1mg/ml、50μ）と共に30分間種々の温度下
（それぞれ200μ）にインキユベーシヨンした酵素活
性の至適温度は、約30℃であることが示された（図2
A）。
（ｄ） 温度に対する安定性 50mM Tris−HCl（150μ、pH9.0）の酵素調製物（0.
6u）を15分間種々の温度下にインキユベーシヨン処理
し、次に氷浴で冷却した。ｐ−ニトロフエニルサルフエ
ート（1mg/ml、50μ）を酵素溶液中に加え、混合物を
37℃で30分間インキユベーシヨンした。酵素はpH9.0の
もと30℃以下で安定であつた（図2B）。
6u）を15分間種々の温度下にインキユベーシヨン処理
し、次に氷浴で冷却した。ｐ−ニトロフエニルサルフエ
ート（1mg/ml、50μ）を酵素溶液中に加え、混合物を
37℃で30分間インキユベーシヨンした。酵素はpH9.0の
もと30℃以下で安定であつた（図2B）。
（ｅ） イオンの影響 酵素（0.6u）、ｐ−ニトロフエニルサルフエート4mM
及びイオン1mMを200μのTris−HCl（50mM）中に溶解
せしめた。溶液を37℃で30分間インキユベーシヨンし
た。ｐ−ニトロフエノールの遊離を、415nmのUVを測定
して分光的測定をなした。酵素活性に対するイオンの影
響を表IVに示す。酵素を10mMのEDTA液で処理し、次に水
に対して透析した時、そのスルフアターゼ活性がなくな
つた。1mMのCa++をそのEDTA処理酵素に加えると、スル
フアターゼ活性が再び回復された（図３）。
及びイオン1mMを200μのTris−HCl（50mM）中に溶解
せしめた。溶液を37℃で30分間インキユベーシヨンし
た。ｐ−ニトロフエノールの遊離を、415nmのUVを測定
して分光的測定をなした。酵素活性に対するイオンの影
響を表IVに示す。酵素を10mMのEDTA液で処理し、次に水
に対して透析した時、そのスルフアターゼ活性がなくな
つた。1mMのCa++をそのEDTA処理酵素に加えると、スル
フアターゼ活性が再び回復された（図３）。
（ｆ） 酵素阻害剤の効果 上記（ｅ）で用いられた方法を、1mMの酵素阻害剤を
金属イオンに代えて用いること以外用いて行なつた。そ
の結果を下記表Ｖに示す。
金属イオンに代えて用いること以外用いて行なつた。そ
の結果を下記表Ｖに示す。
（ｇ） 塩類の影響 上記（ｅ）で用いられた方法を5mMの塩を1mMの金属イ
オンの代わりに用いることを除いて行なつた。そのスル
フアターゼ活性はリン酸塩によつて強く阻害されたが、
サルフエートイオンでは単に普通の阻害程度であつた。
その結果を表VIに示す。
オンの代わりに用いることを除いて行なつた。そのスル
フアターゼ活性はリン酸塩によつて強く阻害されたが、
サルフエートイオンでは単に普通の阻害程度であつた。
その結果を表VIに示す。
（ｈ） 基質特異性 本発明のスルフアターゼに対する基質として４種のエ
トポシド誘導体を用いて試験した。その基質は；エトポ
シド４′−サルフエート（III）、２″,3″−ジ−Ｏ−
アセチル−エトポシド−４′−サルフエート（IV）、エ
トポシド ２″−サルフエート（Ｖ）、及びエトポシド
３″−サルフエート（VI）；である。その基質（50μ
、1mg/ml、MeOH:H2O＝1:1、pH9.0）及び酵素（50μ
、0.6u、50mM Tris−HCl、pH7.5）を混合し、37℃で
30分間インキユベーシヨンした。混合物を次にシリカゲ
ルTLCプレート上でクロロホルム−メタノール（10:1V/
V）からなる溶媒系を用いて分析した。その得られた結
果は、試験条件下化合物（Ｉ）及び（II）はその酵素の
基質となつたが、化合物（III）及び（IV）は基質とな
らなかつた。その基質、化合物（III）、（Ｖ）及び（V
I）は、特開昭63−192,793号及び米国特許出願第264,94
0号（1988年10月31日出願）に記載された公知化合物で
ある。化合物（III）、（Ｖ）及び（VI）の製造に関し
て米国特許出願第264,940号の記載の一部は、本明細書
において参考として含められる。化合物（IV）は次の方
法に従つて製造される： ２″,3″−ジ−Ｏ−アセチルエトポシド（170mg、0.2
5mmol）のピリジン（5ml）液に、ジメチルアミノピリジ
ン（DMAP、3mg、0.025mmol）及び三酸化硫黄−ピリジン
コンプレツクス（199mg、1.25mmol）を加え、混合物を
室温で３日間攪拌した。この混合物にさらにDMAP（3m
g、0.0025mmol）及び三酸化硫黄−ピリジンコンプレツ
クス（80mg、0.5mmol）を加え、混合物を室温で１日間
攪拌した。さらなる量の三酸化硫黄−ピリジンコンプレ
ツクス（199mg、1.25mmol）を加え、混合物をさらに２
日間攪拌した。反応混合物を減圧下40℃以下で濃縮し、
シリカゲルTLCプレートで二つのスポツト（Rf0.9及び0.
2、メチレンクロライド：メタノール＝5:1）を示す粗製
固体を得た。この粗製混合物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフイー（メチレンクロライド；メタノール＝5:
1）にかけ、出発物質（51mg、Rf0.9）と所望サルフエー
ト体（115mg、60％、Rf0.2）を得た。このサルフエート
体（40mg、0.054mmol）を重炭酸ナトリウム（4.5mg、0.
054mmol）の水溶液（4ml）に溶解し、溶液を凍結乾燥
し、無色粉末としてナトリウム ２″,3″−ジ−Ｏ−ア
セチルエトポシド−４′−サルフエート（41mg）を得
た。MP201℃−230℃.IRνmax（KBr）cm-13350（br）、1
750、1600. 上記で用いられた２″,3″−ジ−Ｏ−アセチルエトポ
シドは米国特許出願第362,555号（1989年６月７日出
願）に示された方法に従つて製造された。この化合物の
製造を開示した部分を参考として本明細書に含めるもの
である。
トポシド誘導体を用いて試験した。その基質は；エトポ
シド４′−サルフエート（III）、２″,3″−ジ−Ｏ−
アセチル−エトポシド−４′−サルフエート（IV）、エ
トポシド ２″−サルフエート（Ｖ）、及びエトポシド
３″−サルフエート（VI）；である。その基質（50μ
、1mg/ml、MeOH:H2O＝1:1、pH9.0）及び酵素（50μ
、0.6u、50mM Tris−HCl、pH7.5）を混合し、37℃で
30分間インキユベーシヨンした。混合物を次にシリカゲ
ルTLCプレート上でクロロホルム−メタノール（10:1V/
V）からなる溶媒系を用いて分析した。その得られた結
果は、試験条件下化合物（Ｉ）及び（II）はその酵素の
基質となつたが、化合物（III）及び（IV）は基質とな
らなかつた。その基質、化合物（III）、（Ｖ）及び（V
I）は、特開昭63−192,793号及び米国特許出願第264,94
0号（1988年10月31日出願）に記載された公知化合物で
ある。化合物（III）、（Ｖ）及び（VI）の製造に関し
て米国特許出願第264,940号の記載の一部は、本明細書
において参考として含められる。化合物（IV）は次の方
法に従つて製造される： ２″,3″−ジ−Ｏ−アセチルエトポシド（170mg、0.2
5mmol）のピリジン（5ml）液に、ジメチルアミノピリジ
ン（DMAP、3mg、0.025mmol）及び三酸化硫黄−ピリジン
コンプレツクス（199mg、1.25mmol）を加え、混合物を
室温で３日間攪拌した。この混合物にさらにDMAP（3m
g、0.0025mmol）及び三酸化硫黄−ピリジンコンプレツ
クス（80mg、0.5mmol）を加え、混合物を室温で１日間
攪拌した。さらなる量の三酸化硫黄−ピリジンコンプレ
ツクス（199mg、1.25mmol）を加え、混合物をさらに２
日間攪拌した。反応混合物を減圧下40℃以下で濃縮し、
シリカゲルTLCプレートで二つのスポツト（Rf0.9及び0.
2、メチレンクロライド：メタノール＝5:1）を示す粗製
固体を得た。この粗製混合物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフイー（メチレンクロライド；メタノール＝5:
1）にかけ、出発物質（51mg、Rf0.9）と所望サルフエー
ト体（115mg、60％、Rf0.2）を得た。このサルフエート
体（40mg、0.054mmol）を重炭酸ナトリウム（4.5mg、0.
054mmol）の水溶液（4ml）に溶解し、溶液を凍結乾燥
し、無色粉末としてナトリウム ２″,3″−ジ−Ｏ−ア
セチルエトポシド−４′−サルフエート（41mg）を得
た。MP201℃−230℃.IRνmax（KBr）cm-13350（br）、1
750、1600. 上記で用いられた２″,3″−ジ−Ｏ−アセチルエトポ
シドは米国特許出願第362,555号（1989年６月７日出
願）に示された方法に従つて製造された。この化合物の
製造を開示した部分を参考として本明細書に含めるもの
である。
本発明のアリールスルフアターゼは、癌の化学療法に
おいて臨床応用するに特に適した性状を有し、それは腫
瘍の近傍に運搬され、そしてそこで比較的細胞毒活性の
ない４′−デメチルエピポドフイロトキシングルコシド
４′−サルフエートから、比較的大きな細胞毒活性を
有する母体形態のものに変化させる働きを有する。その
酵素を腫瘍近くに運ぶ一つの方法としてはその酵素を腫
瘍関連抗原に対する抗体に結合させるものがある。この
ものは当該分野で普通に行なわれる方法、例えばヘテロ
原子含有二官性リンカーを用いて行なわれ、そのヘテロ
原子含有二官能性リンカーの例としては、Ｎ−マレイミ
ドベンゾイルコハク酸イミドエステル、Ｎ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート及
びスクシンイミジル・４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレートがあげられるが、
それに限定されるものではない。この方法はSenter et
al 上述に具体的に示されている。
おいて臨床応用するに特に適した性状を有し、それは腫
瘍の近傍に運搬され、そしてそこで比較的細胞毒活性の
ない４′−デメチルエピポドフイロトキシングルコシド
４′−サルフエートから、比較的大きな細胞毒活性を
有する母体形態のものに変化させる働きを有する。その
酵素を腫瘍近くに運ぶ一つの方法としてはその酵素を腫
瘍関連抗原に対する抗体に結合させるものがある。この
ものは当該分野で普通に行なわれる方法、例えばヘテロ
原子含有二官性リンカーを用いて行なわれ、そのヘテロ
原子含有二官能性リンカーの例としては、Ｎ−マレイミ
ドベンゾイルコハク酸イミドエステル、Ｎ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート及
びスクシンイミジル・４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルボキシレートがあげられるが、
それに限定されるものではない。この方法はSenter et
al 上述に具体的に示されている。
そのab−enzコンジユゲート及びプロドラツグは、い
かなる通常の方法でも投与されることができ、例えば静
脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、経口投与、リンパ
系内投与、腹腔内投与及び腫瘍内投与されることができ
る。好適な投与ルートとしては静脈内投与があげられ
る。コンジユゲートとプロドラツグとは、適宜の時間的
タイミングで投与することができるが、好ましくは宿主
中にそのプロドラツグを導入する前にそのコンジユゲー
トを投与しておくことが好ましい。処理される宿主への
最適な投与量及び治療スケジユールは、選ばれたプロド
ラツグ及びコンジユゲートによつて変えられ、そして製
剤化された組成物の特定の形態、投与ルート、治療を受
ける宿主及び病気の特定の状況に従つて変えられる。該
治療薬の作用に影響を与える多くの因子を考慮され、そ
のようなものとしては、年令、体重、性別、食事、投与
時間、投与ルート、排泄速度、患者の状態、薬剤の組み
合わせ、反応に対する感受性、病気の程度などがあげら
れる。
かなる通常の方法でも投与されることができ、例えば静
脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、経口投与、リンパ
系内投与、腹腔内投与及び腫瘍内投与されることができ
る。好適な投与ルートとしては静脈内投与があげられ
る。コンジユゲートとプロドラツグとは、適宜の時間的
タイミングで投与することができるが、好ましくは宿主
中にそのプロドラツグを導入する前にそのコンジユゲー
トを投与しておくことが好ましい。処理される宿主への
最適な投与量及び治療スケジユールは、選ばれたプロド
ラツグ及びコンジユゲートによつて変えられ、そして製
剤化された組成物の特定の形態、投与ルート、治療を受
ける宿主及び病気の特定の状況に従つて変えられる。該
治療薬の作用に影響を与える多くの因子を考慮され、そ
のようなものとしては、年令、体重、性別、食事、投与
時間、投与ルート、排泄速度、患者の状態、薬剤の組み
合わせ、反応に対する感受性、病気の程度などがあげら
れる。
本発明の酵素を使用するにあたつては、先ず第一に抗
体と結合せしめられ、得られたab−enzコンジユゲート
をプロドラツグと組み合わせて癌の治療に用いることが
あげられるが、本スルフアターゼの他の使用法もそれを
なすことができる。例えば、本発明のスルフアターゼ
は、リグノスルホネートすなわちパルプ及び製紙工業で
生ずる水の汚染源を分解したり、するのに用いられて有
用である。
体と結合せしめられ、得られたab−enzコンジユゲート
をプロドラツグと組み合わせて癌の治療に用いることが
あげられるが、本スルフアターゼの他の使用法もそれを
なすことができる。例えば、本発明のスルフアターゼ
は、リグノスルホネートすなわちパルプ及び製紙工業で
生ずる水の汚染源を分解したり、するのに用いられて有
用である。
次なる実施例は、本発明を具体的に説明するためのも
のであつて、いかなる意味でも本発明の範囲を制限する
ようなことは意図するものではない。
のであつて、いかなる意味でも本発明の範囲を制限する
ようなことは意図するものではない。
実施例 1. ストレプトミセス属T109−３株の醗酵 寒天斜面（可溶性デンプン0.5％、グルコース0.5％、
魚肉エキス0.1％、酵母エキス0.1％、NZ−ケース0.2
％、NaCl0.2％、CaCO30.1％及び寒天1.6％、pH7.2から
成る）上で生育させたストレプトミセス属T109−３株
を、グルコース１％及び酵母エキス１％（pH7.0）から
なる液体培地に移し、200rpmにセツトされた回転振とう
器上で27℃で４日間インキユベーシヨンした。1ml量の
培養物を、ソルビトール２％、酵母エキス２％、麦芽エ
キス２％及びCaCO30.1％、pH7.2からなる培地の100mlを
入れた500mlのエルレンマイヤーフラスコ中に接種し
た。そして200rpmにセツトされた回転式振とう器上で27
℃で５日間培養した。
魚肉エキス0.1％、酵母エキス0.1％、NZ−ケース0.2
％、NaCl0.2％、CaCO30.1％及び寒天1.6％、pH7.2から
成る）上で生育させたストレプトミセス属T109−３株
を、グルコース１％及び酵母エキス１％（pH7.0）から
なる液体培地に移し、200rpmにセツトされた回転振とう
器上で27℃で４日間インキユベーシヨンした。1ml量の
培養物を、ソルビトール２％、酵母エキス２％、麦芽エ
キス２％及びCaCO30.1％、pH7.2からなる培地の100mlを
入れた500mlのエルレンマイヤーフラスコ中に接種し
た。そして200rpmにセツトされた回転式振とう器上で27
℃で５日間培養した。
実施例 2. アリールスルフアターゼの単離精製 60個のフラスコから得られた醗酵ブロスを濾過し、5.
14の濾液（ステージ１）を得、この濾液を主に6000の
分子量でカツトオフする限外濾過モジユール（旭化成工
業（株））を用いて室温で限外濾過して、350ml（ステ
ージ２）に濃縮した。硫酸アンモニウムをこの濃縮タン
パク質溶液に加え、80％（W/V）飽和とした。そしてそ
の溶液を１晩４℃に保持した。15分間４℃で13,000rpm
の遠心を行ないタンパク質を集めた。次に沈殿を集め、
50mM Tris−HCl、pH7.5に溶解し、1mM CaCl2を含有す
る同じ緩衝液に対し数回その液を変えて透析を行ない、
15分間13,000rpmで遠心した。上清液（25ml、ステージ
３）をサルフエート−セルロフアイン（Sulfate−Cellu
lofine）（生化学工業（株）のカラム（1.5×6cm）にか
けた。そのカラムは50mM Tris−HCl緩衝液、pH7.5で平
衡化されていた。そのカラムを1M Tris−HCl緩衝液pH
7.5で溶出し、溶出液を5mlずつ集めた。酵素活性を含む
分画を一緒にし（35ml、ステージ４）、50mM Tris−HC
l緩衝液pH7.5で平衡化したDEAE−セスロースのカラム
（1.5×6cm）（生化学工業（株））にかけた。カラムを
Tris−HCl、pH7.5の50mM〜500mMの濃度のリニア−グラ
ジエントで展開した。酵素活性を含んでいる分画を一緒
にし（100ml、ステージ５）、再度50mM Tris−HCl、pH
7.5で平衡化したサルフエートセルロフアインのカラム
（1.5×4.5cm）にかけた。そのカラムをTris−HCl、pH
7.5の50mM〜1.5Mの濃度のリニア−グラジエントで溶出
した。酵素を含有している分画を一緒にし、限外濾過モ
ジユールUHP−43（Advantec Co.）を用いて10ml（ステ
ージ６）に濃縮した。この調製物はSDS−PAGE分析で単
一のタンパク質バンドを示した。
14の濾液（ステージ１）を得、この濾液を主に6000の
分子量でカツトオフする限外濾過モジユール（旭化成工
業（株））を用いて室温で限外濾過して、350ml（ステ
ージ２）に濃縮した。硫酸アンモニウムをこの濃縮タン
パク質溶液に加え、80％（W/V）飽和とした。そしてそ
の溶液を１晩４℃に保持した。15分間４℃で13,000rpm
の遠心を行ないタンパク質を集めた。次に沈殿を集め、
50mM Tris−HCl、pH7.5に溶解し、1mM CaCl2を含有す
る同じ緩衝液に対し数回その液を変えて透析を行ない、
15分間13,000rpmで遠心した。上清液（25ml、ステージ
３）をサルフエート−セルロフアイン（Sulfate−Cellu
lofine）（生化学工業（株）のカラム（1.5×6cm）にか
けた。そのカラムは50mM Tris−HCl緩衝液、pH7.5で平
衡化されていた。そのカラムを1M Tris−HCl緩衝液pH
7.5で溶出し、溶出液を5mlずつ集めた。酵素活性を含む
分画を一緒にし（35ml、ステージ４）、50mM Tris−HC
l緩衝液pH7.5で平衡化したDEAE−セスロースのカラム
（1.5×6cm）（生化学工業（株））にかけた。カラムを
Tris−HCl、pH7.5の50mM〜500mMの濃度のリニア−グラ
ジエントで展開した。酵素活性を含んでいる分画を一緒
にし（100ml、ステージ５）、再度50mM Tris−HCl、pH
7.5で平衡化したサルフエートセルロフアインのカラム
（1.5×4.5cm）にかけた。そのカラムをTris−HCl、pH
7.5の50mM〜1.5Mの濃度のリニア−グラジエントで溶出
した。酵素を含有している分画を一緒にし、限外濾過モ
ジユールUHP−43（Advantec Co.）を用いて10ml（ステ
ージ６）に濃縮した。この調製物はSDS−PAGE分析で単
一のタンパク質バンドを示した。
各精製工程における結果を次に示す。
図１はpHの関数としてEs−２スルフアターゼの活性及び
安定性の様子を示すものである。 図２は、温度の関数としてEs−２スルフアターゼの活性
及び安定性の様子を示すものである。 図３は、Ca2+を添加することによるEDTA処理Es−２スル
フアターゼの酵素活性の回復の様子を示すものである。
安定性の様子を示すものである。 図２は、温度の関数としてEs−２スルフアターゼの活性
及び安定性の様子を示すものである。 図３は、Ca2+を添加することによるEDTA処理Es−２スル
フアターゼの酵素活性の回復の様子を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:765） (72)発明者 富田 康二 東京都世田谷区上用賀５―２―３ (72)発明者 深川 泰男 神奈川県鎌倉市今泉台３―９―２ (72)発明者 沖 俊一 神奈川県横浜市栄区庄戸４―20―10 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/16 C12N 1/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (7)
- 【請求項１】４′−デメチルエピポドフィロトキシング
ルコシド ４′−サルフェートを４′−デメチルエピポ
ドフィロトキシングルコシドに変換する反応を触媒する
ことができるスルファターゼであり、該スルファターゼ
はSDS−PAGEで測定したとき約45kDの分子量もち、そし
て約5.6の等電点もち、その至適pHが約9.0であり、そし
てその至適温度が約30℃であることを特徴とする放線菌
から単離された実質的に精製したスルファターゼ。 - 【請求項２】ストレプトミセス属T109−３又はその変異
体又はその突然変異体から単離された請求項１記載のス
ルファターゼ。 - 【請求項３】エトポシド ４′−サルフェートをエトポ
シドに変換する反応を触媒することができるスルファタ
ーゼであり、該スルファターゼはSDS−PAGEで測定した
とき約45kDの分子量もち、そして約5.6の等電点もち、
その至適pHが約9.0であり、そしてその至適温度が約30
℃であることを特徴とするストレプトミセス属T109−３
から単離された実質的に精製したスルファターゼ。 - 【請求項４】２″,3″−ジ−Ｏ−アセチルエトポシド
４′−サルフェートを２″,3″−ジ−Ｏ−アセチルエト
ポシドに変換する反応を触媒することができるスルファ
ターゼであり、該スルファターゼはSDS−PAGEで測定し
たとき約45kDの分子量もち、そして約5.6の等電点も
ち、その至適pHが約9.0であり、そしてその至適温度が
約30℃であることを特徴とするストレプトミセス属T109
−３から単離された実質的に精製したスルファターゼ。 - 【請求項５】ストレプトミセス属に属するスルファター
ゼ生産菌を培地中で培養し、得られた請求項１に記載す
るスルファターゼを採取することを特徴とする請求項１
に記載するスルファターゼを製造する方法。 - 【請求項６】ストレプトミセス属T109−３又はその変異
体又はその突然変異体を同化性炭素及び窒素源を含有す
る培地中で液内好気条件下で培養し、請求項１に記載の
スルファターゼを採取可能な量まで産生させ、該スルフ
ァターゼを採取することを特徴とする請求項１に記載す
るスルファターゼを製造する方法。 - 【請求項７】請求項１に記載するスルファターゼを産生
することができる、ATCC53948の同定特性をもつストレ
プトミセス属T109−３の生物学的に純粋な培養物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US42437689A | 1989-10-20 | 1989-10-20 | |
| US424376 | 1989-10-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03155781A JPH03155781A (ja) | 1991-07-03 |
| JP3097035B2 true JP3097035B2 (ja) | 2000-10-10 |
Family
ID=23682406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02279490A Expired - Lifetime JP3097035B2 (ja) | 1989-10-20 | 1990-10-19 | アリールスルファターゼ |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0423818B1 (ja) |
| JP (1) | JP3097035B2 (ja) |
| KR (1) | KR0144351B1 (ja) |
| AT (1) | ATE162217T1 (ja) |
| AU (1) | AU638283B2 (ja) |
| CA (1) | CA2027977C (ja) |
| DE (1) | DE69031932T2 (ja) |
| DK (1) | DK0423818T3 (ja) |
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