PT95625B - Processo para a preparacao de arilsulfatase - Google Patents

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Description

A presente invenção refere-se a uma sulfatase e a um processo para a sua preparação por fermentação. Refere-se, especialmente, a uma sulfatase isolada a partir de uma espécie de Streptomyces.
Um dos principais problemas na quimioterapia do cancro humano reside na acção não específica dos agentes anti-tumorais que podem causar danos indesejáveis nas células normais. Fizeram-se numerosas tentativas para libertar de um modo mais selectivo um agente citotóxi co num sítio onde se localiza o tumor ou próximo deste, minimizando, deste modo, a toxicidade para os tecidos normais. Nesta área fizeram-se grandes esforços no sentido de se ligar um agente citotóxico a um segundo compo nente que tenha uma maior afinidade para as células turno rais do que para as células normais, por exemplo, um anticorpo, uma hormona, uma lectina ou um polimero. Mais recentemente, foi proposta uma abordagem diferente que envolve a administração a um hospedeiro portador de um
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tumor de um pró-fármaco de um agente anti-tumoral conjun tamente com conjugado anticorpo-enzima (ab-enz) (ver, por Exemplo, P.D. senter, e outros, pedido de patente de invenção europeia n2 302 473, publicado a 8 de Fevereiro de 1989). 0 conjugado consiste num enzima capaz de converter o pró-fármaco no composto de origem (parent) activo e de um anticorpo especifico de tumor que serve para levar o enzima até á superfície celular onde o enzi ma pode actuar sobre o pró-fármaco. Este método pode, deste modo, criar potencialmente, uma concentração mais elevada de fármaco anti-tumoral na vizinhança do tumor ao qual está ligado o conjugado ab-enz. Para utilização na abordagem conjugado ab-enz/pró-fármaco, o enzima deve rá ser, de preferência, um que não se encontre presente na corrente sanguínea em concentrações muito elevadas, para que o pró-fármaco possa permanecer intacto até encontrar o enzima no sítio em que se localiza o tumor. 0 próprio pró-fármaco pode ser consideravelmente menos citotóxico que o fármaco de origem; o fármaco citotóxico pode ser um dos fármacos usualmente utilizados como agen tes anti-tumorais, que seja susceptível de se modificar de modo a produzir um pró-fármaco que possa regenerar o fármaco de origem por via enzimática.
O etoposido (la) e o teniposido (Ib) são dois fármacos confirmadamente anti-tumorais que pertencem a uma classe de compostos geralmente conhecida por
4'-desmetilepipodofilotoxina-glucósidos (DEPG). Indica-se, adiante, a estrutura genérica dos 4' -desmetilepipodofilotoxina-glucósidos, como a fórmula geral (I) na qual o R^ representa, por exemplo, um grupo alquilo C^-C^ , 2-tienilo, furilo ou fenilo:
Ia: R^=CH2 lb: R^=2-tienilo
Pode converter-se o grupo hidroxilo e o grupo fenol de DEPG, para se obter um pró-fármaco adequa do, como substrato para o conjugado ab-enz. De facto, a eficácia do etoposido 4‘-fosfato em associação com um conjugado, anticorpo monoclonal-fosfatase alcalina, foi demonstrada num modelo de xeno-enxerto de carcinoma de cólon humano, no murino. (Senter e outros, supra).
Para além do 4’-fosfato de etoposido, os sulfatos de etoposido são também compostos conhecidos na especialidade. Estes derivados foram descritos na
-Ί patente de invenção japonesa Kokai 88/192 793 e represen tam-se pela fórmula geral
na qual um dos símbolos k, B e X representa um gru po -SO^H e os outros representam, cada um, um átomo de hidrogénio.
4’-sulfato de etoposido (A=B=H;X=-SO3H) parece ser muito menos citotóxico que o próprio etoposido, sendo necessária uma dose muito grande para se obter o mesmo grau de actividade do etoposido. Este facto pode indicar que o 4‘-sulfato de etoposido não é facilmente convertido em etoposido in vivo e, por isso, pode ser utilizado de um modo mais adequado como um pró-fármaco em associação com um conjugado ab-enz. 0 enzima necessário para efectuar a conversão de 4'-sulfato de etoposido
em etoposido seria uma sulfatase que catalisasse a hidró lise de um éster de sulfato no composto hidroxilo corres pondente, tal como se segue:
sulfatase „ R-O-SO3“ + H20 -------------> R-OH + S04
Estudaram-se extensivamente diversos tipos de sulfatases, incluindo as arilsulfatases de Tipo I e de Tipo II, sulfatases esteróides, glico-sulfatases, colino-sulfatases, alquilsúlfatases e miro-sulfatases.
(Para uma revisão das sulfatases, ver The Hydrolysis of Sulfate Esters por A. B. Roy in The Enzymes, P. D.Boyer, Ed., Academic Press, 1971, vol. V, pp. 1-19). Entre estas isolaram-se as arilsulfatases (arilsulfato-sulfo-hidrolase, EC 3.1.6.1.) que catalisam a reacção anterior, em que o símbolo R representa um núcleo aromático, a partir de diversos tecidos animais, assim como de fontes microbianas, e estudaram-se de um modo mais extensivo (para uma revisão das arilsulfatases ver ”Arylsulfatases por R.G. Nicholls e A. 3. Roy, ibid., pp. 21-41). 2 digno de nota que, apesar de se terem feito referências a muitas sulfatases, poucas foram purificadas até a homogeneidade. Por exemplo, a arilsulfatase A de fígado de coelho possui um peso molecular de aproximadamente 7C KD (monómero) , forma um dímero a pH 7,4 e um tetrâmero a pH , ο
e foi purificada 10 000 vezes (G. D. Lee e R. L. Van Etten, Arch. Biochem. Biophys., 166, (1975) 280-294; a arilsulfatase isolada a partir do fígado de boi consiste numa glicoproteina que possui um peso molecular de 107 KD (monómero)/~L. W. Nichol e A. B. Roy, J, Biochem. 55, (1964) 643-651, e Ξ. R. B. Graham e A. B. Roy, Biochim. Biophys. Acta, 329, (1973) 88-92/.
A actividade da arilsulfatase, na libertação de sulfato, a partir de ligno-sulfonato foi demonstrada em extractos isentos de células de 5treptpmyces sp. L.. No entanto, o próprio emzima não foi purificado nem caracterizado (Y. L. Steinitz, Eur. J, Appl. Microb. Biotechnol., U, (1981) 216-221).
Encontram-se comercialmente disponíveis arilsulfatases isoladas a partir de diversas fontes.
Observaram-se estes enzimas utilizando 4’-sulfato de eto posido como substrato. No entanto, a maioria deles demonstrou pouca ou nenhuma actividade hidrolítica contra este composto. Além disso, nenhuma das sulfatases comercialmente disponíveis é homogénea e algumas delas possuem características desfavoráveis tais como peso molecular elevado, um pH óptimo baixo, etc, o que as torna inadequadas para uso clínico.
Em função destes antecedentes, iniciou-se um programa para se efectuar o rastreio de arilsulfatases microbianas capazes de hidrolisarem um 4'-sulfato de
4’-desmetilepipodofilotoxina-glucósido. 0 resultado deste esforço constitui a base da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Na Figura 1 indicam-se as características de actividade e ae estabilidade da suifatase Es-2 em função do pH.
Na Figura 2 indicam-se as características de actividade e de estabilidade da suifatase Es-2 em tunção da temperatura.
Na Figura 3 apresenta-se a recuperação da actividade enzimática de suifatase Es-2 tratada com EDTA, 2+ por adição de Ca
RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO
A presente invenção proporciona uma sulfatase susceptível de catalisar a conversão de um 4’-fosfato de 41-desmetilepipodofilotoxina-glucósido no compo^s to 4 *-desmetilepipodofilotoxina-glucósido correspondente .
Um outro aspecto da presente invenção proporciona um processo para a preparação de sulfatases gue compreende a cultura aeróbia de Streptomyces sp. produtor de um enzima num meio gue contém uma fonte de carbono e de azoto assimiláveis aré se formar uma guantidade recuperável de enzima e a recuperação da referida sulfatase.
Ainda num outro aspecto, a presente invenção proporciona um microrganismo, Streptomyces sp. T109-3, produtor de sulfatase ou um seu mutante, ou uma sua variante.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO
A presente invenção proporciona uma sulfatase, que aqui se designa por Es-2, isolada a partir de um actinomiceto, especificamente de Streptomyces sp. T-109-3; a referida sulfatase tem um peso molecular de cerca de 45KD, tal como foi determinado por análise SDS-?AGE, e um ponto isoeléctrico de cerca de 5,6. 0 enzima é susceptível de catalisar a conversão de um 4'-sulfato de 41-desmetilepipodofilotoxina-glucósido em 4’-aes metilepipodofilotoxina-glucósido, tal como se indica a seguir:
em que e R2 representam, cada um, um grupo alquilo
C^-C^q ou R2 representa um átomo de hidrogénio e R^ representa um grupo alquilo C]_-C]_q/ furilo, tienilo ou fenilo; Rg e representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo acilo; e o símbolo M representa um átomo de hidrogénio ou um ião de metal alcalino. 0 grupo acilo pode incluir, não se limitando, os grupos formilo, acetilo e benzoílo. 0 ião de metal alcalino, é por exemplo, um ião de lítio, de sódio ou de potássio. De um modo particular, o substrato de Es-2 é o 4’-sulfato de etoposido ou um seu derivado acilado.
Tal como se utiliza na presente invenção, enzima substancialmente purificado representa um enzima que apresenta uma banda única em electroforese SDS sobre gel de poliacrilamida.
-L. Organismo Produtor
Isolou-se um actinomiceto, estirpe NS T100 -3, a partir de uma amostra de solo recolhida no Estado de Maharashtra, índia. Depositou-se uma cultura biologicamente pura do microrganismo designado por Streptomyces sp., estirpe T1O9-3, na American Type Culture Collection, Rockville, MD, á qual foi atribuído o número de acesso da ATCC 53948.
(a) Morfologia. A estirpe T1O9-3 forma um abundante micélio aéreo sobre o micélio do substrato ramificado e.
não fragmentado. Nascem cadeias de esporos longas e de. espiral fechada, no monopódio da extremidade da hifa aérea. As cadeias de esporos contém 10 a 50 esporos por cadeia. Os esporos são oblongos (0,6-0,8 x 1,0-1,2 jim) , não móveis e possuem uma superfície espinhosa. Não se formam corpos semelhantes a esporângios ou escleróticos.
(b) Características de Cultura. A estirpe T1O9-3 desenvolve-se bem em todos os meios ISP e de sacarose-nitrato de agar de Czapek. 0 micélio aéreo torna-se cin zento azeitona ou cinzento acastanhado após a esporulação. 0 micélio do substrato é incolor ou amarelo claro. Não se produz melanina nem outros pigmentos distintos.
No Quadro I encontram-se descriminadas as características de cultura da estirpe T1O9-3.
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Agar de glicerol Moderado Fraco: branco a Incolor a Nenhum
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Quadro I (continuação)
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/ (c) Características Físicas. A estirpe T1O9-3 hidrolisa a gelatina e não se formam nitrato-redutase e tirosinase. As características de utilização do açúcar, são as seguintes: positivo para a sacarose, rafinose, D-malezitose, inositol e D-manitol; negativo para L-arabinose e L-ramnose. As características físicas da estirpe T109-3 indicam-se no Quadro II.
Quadro II Características Fisiológicas da Estirpe
T1O9-3
Hidrólise de: Utilização de:*
Gelatina + Gliceroi +
Amido + D-Arabinose -
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Coagulação do leite - D-Xilose + (w)
Peptonização do leite + D-Ribose +
L-Ramnose -
Produção de: D-Glucose +
D-Gal actose +
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Tirosinase - D-M anose +
L-Sordose -
Tolerância a: Sacarose +
Lactose +
Lisózima, 0,01% - Celobiose +
NaCl, i%-9% + Melibiose +
10% ou superior - Trealose +
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Quadro II (continuação)
pH, 5,0-10,7 + Rafinose +
D-Melezítose +
Temperatura: Amido solúvel +
Celulose -
Intervalo de Crescimento 14°C-41°C Dulcitol -
Crescimento óptimo 32°C-38°C Inositol +
Sem desenvolvimento 11,5°C e D-Manitol +
43°C D-Sorbitol -
Salicina + (w)
*Meio Basal: Meio inorgânico de Pridham-Gottlieb (ISP N29).. + (w): (fracamente positivo) (d) Química Celular. 0 bidrolisado celular completo contém ácido LL-diaminopimélico. Os fosfolípidos contêm duas fosfatidiletanolaminas (PE), fosfatidilglicerol (PG) e fosfaditilinositol (PI). Além disso, a estirpe pertence ao Tipo I de parede celular e ao Tipo II de fosfolípidos.
Com base na morfologia da cadeia de esporos e na química celular da estirpe T1O9-3, classificou-se a estirpe no género Streptomyces. De acordo com as chaves de classificação de Streptomyces por Pridham e Tresner / Pridham, T. G., e K. D. Tresnsr: Genus
Streptomyces haksman e Henrici, no. 748-829 in R. Ξ
Buchanan e N. Ξ. Gíbbons (Ed.) Bergey1s Manual of Determinative Bacteriology, Sth Ed., 1974, Williams & Wilkins
Spira(S), não cromogénica (C-) e do grupo espinhoso (SPY). Entre 24 espécies conhecidas do anterior grupo de espécies descrito por Pridham e Tresner, a estirpe T109 é similar ao S .albospinus M75O-G1, S.albulus ATCC 12757,
S. chattanoogensis ATCC 13358 e S. noursei ATCC 11455 no que se refere às suas características de utilização de açúcar. Outras comparações da estirpe T1O9-3 com as quatro espécies anteriores indicaram que a estirpe T109-3 é semelhante a S. noursei. No entanto, a estirpe T1O9-3 difere de S. noursei em diversas características, tal como se indica no Quadro III. Deste modo, designou-se a estirpe T109-3 como uma nova estirpe de Streptomyces sp.
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II. Produção de Enzimas
Produziu-se a arilsulfatase da presente invenção cultivando Streptomyces sp., estirpe T1O9-3 ou um seu mutante sob condições de submersão num meio nutri, tivo aquoso. Desenvolveu-se o organismo produtor num meio nutritivo que continha uma fonte de carbono assimilável, como por exemplo um hidrato de carbono assimilável. Nos exemplos de fontes de cartono apropriadas incluem-se a cereluose, a frutose, o amido solúvel e o glicerol. 0 meio nutritivo também pode conter uma fonte de azoto assimilável tal como farinha de peixe, extracto de levedura ou sais de amónio. Adicionam-se ao meio, se necessário, ou podem estar presentes como impurezas de outros componentes do meio, sais inorgânicos, tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio, carbonato de cálcio, fosfatos, etc, e oligoelementos, tais como o cobre, o magnésio, o ferro, o zinco, etc.. A tempe ratura de incubação deverá ser qualquer temperatura â qual a estirpe produtora seja capaz de se desenvolver e de produzir o produto desejado, por exemplo, uma tempera tura compreendida entre cerca de 18°C e cerca de 39°C, mas será preferível efectuar a fermentação a uma tempera tura compreendida entre 25°C e 35°C com maior preferência entre cerca de 25°C e 30°C. Emprega-se, de preferência, um pH neutro, no meio, e efectua-se, geralmente a produção de enzima durante um período de cerca de 4a 8 dias.
Habitualmente, atinge-se uma produção óptima dentro de cerca de 5 a 6 dias. Para a preparação de quantidades relativamente pequenas de enzima, pode utilizar-se um balão de agitação ou superfícies de cultura, mas para a preparação de grandes quantidades, dá-se preferência a culturas aeróoias submersas em tanques esterilizados. Quando se pretende utilizar um tanque de rermentação será aconselhável produzir-se um inoculo vegetativo num cálcio nutritivo, por inoculação do caldo com esporos do organismo e, quando se obtiver um inóculo vegetativo,activo jovem, transferir-se o inóculo assepticamente para o meio contido no tanque de fermentação: Pode agitar-se subsequentemente, utilizando um rotor mecânico. Também se podem utilizar, se necessário, agentes anti-espumantes, tais como banha de porco ou óleo de silicone.
Deverá ter-se em conta que a presente invenção não se limita à utilização do Streptomyces sp., estirpe T1O9-3, especialmente preferida, e anteriormente descrita ou a organismos que correspondam totalmente â descrição anterior. Pretende-se incluir, em especial, outras espécies ou mutantes do referido organismo que possam ser produzidas de acordo com meios convencionais, tais como, radiação por Raios X, radiação por ultra-viole ta, tratamento com mostradas de azoto, exposição a bacte riófagos e similares, e que conservem a capacidade de produzir a arilsulfatase Es-2 da presente invenção.
III. Isolamento e Purificação do Enzima a
Pode isolar-se a arilsulfatase da presente invenção a partir de caldos de fermentação, utilizando metodologias convencionais de separação de proteínas, tais como diálise, ultrafiltração, filtração através de gel, precipitação isoeléctrica, salga (salting out), cromatografia de permuta iónica e cromatografia de afini dade. Utiliza-se, geralmente, uma associação sequencial destas técnicas, para se purificar a proteína até uma homogeneidade aparente. Preferencialmente, leva-se a efei to a purificação da proteína a uma temperatura reduzida, de preferência a uma temperatura compreendida entre 0° e 5°C. Pode controlar-se e orientar-se o processo de isola mento e purificação por um ensaio de actividade enzimática utilizando, como substrato, jo-nitrofenilsulfato ou outros arilsulfatos, ou utilizando métodos físicos tais como técnicas de UV ou HPLC. Apresenta-se, a seguir uma sequência típica de purificação, apenas com fins ilustra tivos e o especialista verificará que também se poderão utilizar outras sequências, utilizando outros métodos, desde que se obtenha a proteína com elevado grau de pureza e que conserve as suas actividades. biológicas.
Filtra-se o caldo de fermentação de Streptomyces sp. T1O9-3, para se remover a massa insolúvel e reduz-se o volume do filtrado, à temperatura ambien te, mediante uma ultrafiltração. Trata-se a solução con20
centrada com sulfato de amónio para precipitar a proteína. Adiciona-se sulfato de amónio até se atingir 70% a 90% da saturação, de preferência 80% da saturação. Deixa -se a solução em repouso durante algumas horas, a uma temperatura de cerca de 4°C e recolhe-se o precipitado por centrifugação a cerca de 4°C. Dissolve-se o sedimento num tampão adequado, como, por exemplo, Tris-HCl, a pH de cerca de 7,5, e depois dializa-se contra o mesmo tampão contendo CaCl2 lmM. Remove-se o precipitado por centrifugação e submete-se o sobrenadante a purificação por cromatografia em coluna de permuta de catiões utilizando um adsorvente, tal como celulose sulfatada. Elui-se a coluna com um tampão adequado tal como Tris-HCl IM, a pH 7,5. Reunem-se as fracções que têm actividade de sulfatase e purifica-se, subsequentemente, por cromatografia de permuta de aniões, utilizando um permutador de aniões adequado tal como DEAS-celulose. 0 tampão de eluição adequado poderá ser Tris-HCl a um pH de cerca de 7,5, utilizado num gradiente de concentração linear de 50 mM até 500 mM. Efectua-se novamente a cromatografia das fracções activas reunidas, numa coluna de celulose sulfatada, utilizando um gradiente de concentração linear de tampão Tris-HCl a um pH de cerca de 7,5 de 50 mM até 1,5 M. Reunem-se as fracções activas e concentram-se por ultrafiltração para se obter a sulfatase da presente invenção.
Observa-se a actividade da sulfatase du21
rante a purificação mediante determinação da conversão de p-nitrofenilsulfato em p-nitrofenol utilizando meios espectrofotométricos. Utiliza-se especificamente o seguin te método de ensaio. Misturam-se 50 jal de uma solução de p-nitrofenilsulfato (1 mg/ml em Tris-KCl 50 mM, pH 7,5), 50 μΐ de uma amostra e 100 jil de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e incuba-se durante 30 minutos a 37°C. Se a actividade evidenciada fôr fraca, prolonga-se o tempo de incubação até 18 horas. Determina-se espectrofotometricamente a 415 nm o p-nitrifenol libertado. A partir de curvas -padrão de p-nitrofenol e de concentrações -padrão de prote_í na, calcula-se a unidade ou actividade específica por mg de enzima. Determina-se a concentração de proteína medin do a absorção a 280 nm ao longo da purificação e, no caso de uma proteína homogénea, de acordo com o método de Bradford / Bradford, M., e outros, Anal. Biochem,, 72 (1976) 248-25£/ utilizando albumina de soro de bovino como a proteína-padrão. Define-se uma unidade de actividade da sulfatase como a quantidade de enzima que é capaz de hidrolisar uma nanomole de p-nitrofenilsulfato em p-nitrofenol, num minuto, a 37°G, a pH 7,5.
IV. Caracterização da Sulfatase Es-2
A. Determinação do Peso Molecular (PM) .
a) Por filtração em gel. Efectuou-se a cromatografia de sulfatase Es-2 num TSK-GEL (TCYPEARL·, HV/-55F,
TOSOU, J 2,5 χ 70 cm: Vt, dissolvente de desenvolvimento: Tris-HCl 25o mM, pH 7,5) cónjuntamente com proteínas-padrão, quimiotripsinogénio (PM: 25 000), albumina do ovo (PM: 45 000), albumina de soro de bovino (PM: 67 000) e dextrano azul. Fraccionou-se o eluido em fracções de 1 ml Eluiu-se o dextrano azul na fracção ns no (Vo), o quimio tripsinogénio na fracção ns 188 (Ve), a albumina do ovo na fracção n2 173 (Ve), a albumina de soro de bovino na fracção ns 168 (Ve) e Es-2 na fracção ns 171 (Ve) . Calculou-se K de acordo com a eouação (1) e leu-se o PM av de Es-2 a partir da curva de K em função de PM. De 3V acordo com este método, determinou-se que o peso molecular de Es-2 era, aproximadamente, de 45 KD.
K = (Ve Vo) * (Vt Vo) (1)
b) Por SDS-PAGE. Aqueceu-se a 98°C durante 1 minuto uma mistura de sulfatase / 25 pg em Tris-HCl (5o mM, 4o pl, pH 7,5£/, dodecilsulfato de sódio a 10% (SDS, 10 pl) e 50% de glicerina (5 pl, contendo azul de bromofenol a 0,05%). Introduziu-se a mistura reaccional numa cavidaae de SDS-gel de poliacrilamida. Efectuou-se a electroforese numa solução de Tris-HCl (0,31%, a pH 8,4), glicina a 1,44% e SDS a 0,1%. As condições de operação foram, mA durante 2 horas a 25°C. Corou-se o gel com Azul Brilhante de Coomassie R25O e lavou-se com ácido acético a 7%. Determinou-se que o peso molecular da sulfatase era de cerca de 45 KD, relativamente às proteínas indica doras de pesos moleculares conhecidos.
A SDS-PAGE com 2-mercaptoetanol da preparação purificada de suifatase Es-2 originou apenas uma banda de proteína que apresentava a mesma mobilidade da preparação de proteína não tratada com 2-mercaptoetanol. Este facto indica que Es-2 está sob a forma de um monómero .
B. Determinação do ponto isoeléctrico
Calculou-se o ponto isoeléctrico por cromatografia em coluna utilizando um gel de focalização cromatográfica PBE94 (pharmacia-LKB Biotechnology). Apli cou-se a proteína no topo de uma coluna còm gel que tinha sido previamente equilibrada com imidazol-HCl 25 mM, a pH 7,4, e eluiu-se com politampão 74-HC1, pH 4,0. Mediu-se o pH e a absorção a 280 nm de cada uma das fracções. Determinou-se, utilizando este método, que o ponto isoeléctrico da suifatase era de, aproximadamente, 5,6.
C. Características da actividade enzimática.
a) pH óptimo. Misturou-se a solução de enzima (0,6 u em 50 pl de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) com 100 pl de cada um dos seguintes tampões: acetato de sódio 500 mM ( pH 4,0-5,5), Tris-maleato 500 mM (pH 5,5-7,7), Tris-HCl 500 mM (pH 7,5-9,0) e, glicina-NaOH 500 mM (pH 9,0-10,0). Dissolveu-se, de modo semelhante o substrato, p-nitrofe24 nilsulfato, em cada um dos tampões anteriormente referidos (1 mg/mll Misturou-se uma amostra (15o pl) de cada solução de enzima com o substrato (5o pl) no mesmo tampão e incubou-se a mistura durante 30 minutos, a 37°C. Determinou-se a actividade enzimática de cada um dos tam pões por espectrofotometria de UV a 415 nm. Determinou-se, assim, que o pH óptimo do enzima era de aproximadamente 9,0 (Fig. IA).
b) Estabilidade do pH Efectuou-se a diálise da solução de enzima de reserva contra água para se removerem os sais. Ajustou-se a solução de enzima para 0,6 u/10 pl com tampão Tris-HCl (pH 7,5). Misturou-se esta solução (10 pl) com 40 pl de cada um dos tampões indicados em (a) e incubou-se durante 30 minutos a 30°C. Misturou-se a amostra do enzima (5o pl) com 100 pl de Tris-HCl 500 mM (pH 9,0) e com 5o pl de substrato em água (1 mg/ml) e incubou-se a mistura a 37°C durante 30 minutos, para se determinar a actividade enzimática residual. 0 enzima apresentou uma estabilidade máxima a pH de cerca de 8,5 (Fig. 1 B) .
c) Temperatura óptima. Incubou-se enzima (0,6 u) em 15o pl de Tris-HCl 5o mM (pH 9,0) com sulfato de p-notro fenilo (1 mg/ml, 50 pl) no mesmo tampão (pH 9,0), durante 30 minutos a diversas temperaturas (200 pl de cada). Verificou-se que a temperatura óptima para a actividade enzimática era de, aproximadamente, 30°0 (Fig. 2 A).
d) Temperatura de Estabilidade. Incubaram-se preparações de enzima (0,6 u) em Tris-HCl 50 mM (15o jnl, pH 9,0)· , durante 15 minutos, a diversas temperaturas e, depois arrefeceram-se num banho de gelo. Adicionou-se sulfato de p-nitrofenilo (1 mg/ml, 50 jil) à solução de enzima e incubou-se a mistura durante 30 minutos a 37°C.
enzima manteve-se estável a uma temperatura inferior a 30°C, a pH 9,0. (Fig. 2Bj.
e) Efeito iónico. Dissolveu-se enzima (0,6 u>, sulfato de £-nitrofenilo 4 mM e um ião 1 mM, em 200 pl de Tris-HCl (50 mM). Incubou-se a solução durante 30 minutos a 37°C. Determinou-se a libertação de jo-nitrofenol, por espectrofotometria de UV a 415 nm. No Quadro IV, indica-se o efeito dos iões metálicos na actividade enzimá tica. No caso em que se tratou o enzima com EDTa 10 mM seguido de diálise contra água, a actividade da sulfata2+ se desapareceu. A adição de Ca 1 mM ao enzima tratado com EDTA restaurou completamente a actividade da sulfatase (Fig. 3).
Quadro IV. Efeitos dos Iões Metálicos na
Actividade da Suifatase
Ião Metálico Actividade Relat.(%) Inibição (%)
Nenhum 100 0
CoCl2 34 66
níci2 59 41
ZnCl2 18 82
BaCl2 83 17
CuCl2 56 44
MnCl2 34 66
FeCl2 12 88
CaCl2 213 -
HgCl2 0 100
aici3 67 33
FeCl3 51 49
f) Efeito de Inibidores enzimáticos . SeguiU-se o
protocolo utilizado em e) , exceptuando o facto de se
utilizado 1 mM de um inibidor enzimático em vez de um
iao metálico. No Quadro V, que se segue, indicam-se o
resultados
Quadro V. Efeito de Inibidores Enzimáticos na
Actividade da Sulfatase
Inibidores % Inibição
EDTA 59
1,10-fenantrolina 60
Císteina 18
Citrato 87
Ácido £-cloromercuribenzóico 78
N-Stilmaleimida 35
Ácido Iodoacético 96
2-Mercaptoetanol 22
Ditiotreitol 34
Imidazol 14
Fluoreto de fenilmetano-sulfonilo 81
g) Efeito de Sais.
Seguiu-se o protocolo utilizado em e} com a excepção de se ter utilizado 5 mM de um sal em vez de 1 mM de um ião metálico. A actividade da sulfatase foi poderosamente inibida pelo fosfato mas apenas moderadamente inibida pelos iões sulfato. Indicam-se os resultados no Quadro VI.
Quadro VI Efeito de Sais na Actividade da
Sulfatase
Sal % Inibição
Nenhum 0
K2HP04 100
NaCl 58
KC1 36
(nh4)2s°4 44
K2SO4 36
K„SOn 64
h) Especificidade do Substrato. Ensaiaram-se quatro derivados etoposídicos como substrato da sulfatase da presente invenção. Os substratos foram: 4’-sulfato de etoposido (III), 2, 3-di-0-acetil-etoposido-4’-sulfato (IV), 2h) * * * l,-sulfato de etoposido (V) e 3-sulfato de etoposido (VI). Misturou-se o substrato (50 μΐ, 1 mg/ml, MeOH:
:H20 =1:1, pH 9,0) e o enzima (50 μΐ, 0,6 u, Tris-HCl 5o mM, pH 7,5) e, incubou-se a 37°C, durante 30 minutos. Depois, analisou-se a mistura sobre uma placa de TLC de gel de sílica utilizando um sistema dissolvente constituído por uma mistura de clorofórmio metanol (10:1, v/v). 0s resultados indicaram que nestas condiçoes de ensaio, os compostos (I) e (II) eram substratos para o enzima enquanto os compostos (III) e (IV) não eram. Os substratos, compostos (III), (V) e (VI) são compostos conheci29
dos, descritos na patente õe invenção japonesa Kokai 88/ /192 793 e no pedido de patente conjuntamente pendente da Requerente, USSN 264 940, depositado a 31 de Outubro de 1988. Incluem-se aqui, a título de referência as partes da descrição de USSN 264 940 que se referem à preparação dos compostos (III), (V) e (VI) . preparou-se o composto (IV) de acordo com o seguinte procedimento:
A uma solução de 2“, 3“ -di-C-acetiletoposido (170 mg 0,25 mmole) em piridina (5 ml) adicionou-se dimetilaminopiridina (DMAP, 3 mg, 0,025 mmole) e o complexo trióxido de enxofre-piridina (199 mg, 1,25 mmole) e agitou-se a mistura durante 3 dias à temperatura ambiente. A esta mistura adicionou-se posteriormente DMAP (3 mg, 0,0025 mmole) e complexo trióxido de enxofre-piridina (80 mg, 0,5 mmole) e agitou-se a mistura ã temperatura ambiente durante 1 dia. Adicionou-se uma quantidade adicional de complexo trióxido de enxofre-piridina (199 mg, 1,25 mmole) e agitou-se a mistura durante mais dois dias. Concentrou-se a mistura reaccional sob vazio, a uma tempe ratura inferior a 40°C, obtendo-se um produto sólido bruto que apresentava duas manchas numa placa de TLC de gel de sílica (Rf 0,9 e 0,2, cloreto de metileno/metanol a 5:1). Submeteu-se a mistura em bruto a cromatografia sobre uma coluna de gel de sílica (cloroto de m.etileno/m.etaftcl a 5:1) para se obter o composto inicial (51 mg, Rf 0,9) e o sulfato desejado (115 mg, 60%, Rf 0,2). Dssolveu-se este sulfato (40 mg, 0,054 mmole) numa solução de hidrogeno carbonato de sódio (4,5 mg, 0,054 mmole) em água (4ml) e liofilizou-se a solução para se obter 2, 3-di-0-acetiletoposido-4’-sulfato (41 mg) sob a forma de um pó incolor. IVvmax (KBr) cm 335o (largo), 1750, 1600.
Preparou-se o 2'*, 3”-di-O-acetiletoposido, anteriormente utilizado, de acordo com o procedimento des crito no pedido de patente co-pendente da Requerente USSN 362 555, depositado a 7 de Junho de 1987, inclui-se aqui como referência, a parte que descreve a preparação deste composto.
As características da arilsulfatase da presente invenção tornam-na particularmente adequada ao uso terapêutico na quimioterapia dos cancros na qual pode ser libertada na proximidade do tumor, onde actua de modo a converter um 4’-sulfato de 4’-desmetilepipodofilotoxina-glucósido, relativamente não citotóxido, na sua forma aparentada mais citotóxica. Um dos meios para se fazer chegar o enzima o mais próximo possível do tumor consiste em ligar o enzima. a um anticorpo dirigido contra um antígeno associado ao tumor. Pode efectuar-se esta operação empregando técnicas de prática comum, tais como o uso de ligantes heterobifuncionais, cujos exemplos in31
cluem, mas não se limitam a, éster succinimídico de N-maleimidobenzoílo, N-succinimidil-3-(2-piridiltio)-propionato e 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidilo. Este método encontra-se ilustrado em
Senter e outros, supra.
Pode administrar-se o conjugado ab-enz e o pró-fármaco, por qualquer das vias de administração convencionais, tais como a via intravenosa, intramuscular, intra-arterial, oral, intra-linfática, intraperitoneal e intratumoral. Dá-se preferência ã administração por via intravenosa. Pode-se administrar o conjugado e o pró-fár maco simultaneamente, mas, de preferência, administra-se o conjugado antes da introdução do pró-fármaco no hospedeiro. As dosagens e os esquemas de tratamento óptimos para um dado hospedeiro dependerão, como é evidente, do pró-fármaco e do conjugado escolhidos e variarão de acor do com a composição específica formulada, com a via de administração, com a localização, com o hospedeiro e com a doença que se pretende tratar. Devem levar-se em conta diversos factores que modificam a acção dos agentes tera pêuticos, incluindo a idade, peso, sexo, hábitos alimentares, tempo de administração, via de administração, pro porção de excreção, situação do paciente, combinação de fármacos, reacções. de hipersensibilidade e gravidade da doença.
Embora se tenha contemplado, em primeiro lugar a utilização do enzima da presente invenção ligado a um anticorpo e a utilização do conjugado resultante ab-enz juntamente com um pró-fármaco na terapia do cancro, preconizam-se, também outras utilizações para a sulfatase. A sulfatase da presente invenção é utilizável, por exemplo, na degradação de ligno-sulfonato, um poluente das águas originado pela indústria da pasta de papel e do papel.
Apresentam-se os exemplos que se,seguem apenas com fins ilustrativos, não devendo, de modo algum, limitar o âmbito da presente invenção.
Exemplo 1. Fermentação de Streptomyces sp. T1Q9-3
Transferiu-se uma recolha efectuaaa em espiral de Streptomyces sp. T109-3 desenvolvida numa cunha de agar (constituída por amido solúvel a 0,5%, glucose a 0,5%, farinha de peixe a 0,1%, extracto de levedura a 0,1%, NZ-case a 0,2%, NaCl a 0,2% CaCO^ a 0,1% e agar a 1,6%, a pH 7,2), para um meio líquido composto de glucose a 1% e de extracto de levedura a 1% (pH 7,0) e incubou-se durante 4 dias a 27°C num misturador rotativo regula do para 200 rpm. Inoculou-se uma aliquota de 1 ml da cultura num balão de Erlenmeyer contendo 100 ml de um meio constituído por sorbitol a 2%, extracto de levedura a 2%, extracto de malte a. 2% e CaC03 a C,l%, a pH 7,2, e incubou-se durante 5 dias a 27°C num misturador rotativo regulo.c.o oara <^00 mm»
Exemplo 2, Isolamento e Purificação da Arilsulfatase
Filtrou-se o caldo de fermentação de 60 balões para se obterem 5,14 litros de filtrado (passo 1) que se concentraram até 35o ml (passo 2) por ultrafiltra ção, à temperatura ambiente, utilizando um módulo de ultrafiltração (Asahi Kasei Co) que possuía um grau de admis são de peso molecular nominal de 6 OCO. Adicionou-se sulfato de amónio a esta solução concentrada de proteínas para se atingirem 80% (p/v) da saturação e deixou-se a solução em repouso à temperatura de 4°C, durante uma noite. Recolheu-se a proteína por centrifugação a 13 000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Depois, dissolveu-se o precipi. tado em Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5, dialisou-se contra diversas mudanças do mesmo tampão contendo CaCl^ 1 mM e centrifugou-se a 13 000 rpm, durante 15 minutos. Introduziu-se o sobrenadante (25 ml, passo 3), numa coluna (1,5 x 6 cm) de Sulfat-Cellulofine (Seikagaku Kogyo Co) que se tinha equilibrado com tampão Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5. Eluiu-se a coluna com tampão Tris-HCl 1M, a pH 7,5, e recolheu-se o eluido em fracções de 5 ml. Reuniram -se as fracções que continham actividade enzimática (35 ml, passo 4) e introduziu-se numa coluna (1,5 x 6 cm) de DEAE-Celulose (Seikagaku Kogyo Cc) que se tinha equilibra do com tampão Tris-HCl 5c mM, a pH 7,5. Desenvolveu-se a coluna com um gradiente de concentração linear de Tris -HC1, pH. 7,5, desde 5o mM até 5co mM.
Reuniram-se as fracções que continham actividade enzimática (100 ml, passo 5) e introduziram-se novamente numa coluna (1,5 x 4,5 cm) de Sulfate-Cellulorine que se tinha equilibrado com Tris-HCl 50 mM, a pH 7,5. Eluiu-se a coluna com um gradiente de concentração linear de Tris-HCl, a pH 7,5, desde 50 mM até 1,5 M. Reu niram-se as fracções que continham o enzima e concentrou -se até 10 ml (passo 6) utilizando um módulo de ultrafil tração UHP-43 (Advantec Co.) . Esta preparação apresentou uma única banda de proteína por análise SDS-PAGE.
No Quadro que se segue, apresentam-se os resultados após cada passo de purificação:
ι—1 (0 -Ρ Ο Ρ
I a ο ρ 1(0 υ ρ (ΰ·^ tí 8 ra φ ο Ν Ρ Φ C > Φ £
Φ φ
Ρ (0 οι Φ £ Ό φ Φ Ρ Φ Φ ·Η Ό Ρ ζ~> •Η Ή φ ρ> Ο £ Η Φ\ -ρ an ο m^-z < Φ
Γ- ο % ΓΩ * Γ- %
Ο γω If) 10 -φ
ο σι C0 Γ- ΓΩ . γΗ
Η
σ Ο S Lf) cm ω ιη 10
1—1 r-i γ—ί *. κ *»
γΗ SP 10
σ ΙΟ SP
04 ιη
γω m κ m m *. οι
kO cn ιη Η Ο Η
γω ΓΩ SP ΓΩ Ο Μ
ΓΩ 10 •'Φ
C0 η σι σ ι—ι
Φ
Ρ Φ td w Ρ Φ Ο OJ Ο O o O
•Η Φ -Ρ z—. ιθ 04 Ο 04 04 m
> Ό Φ ρ •Η ψΐν σ r-i Ο r-i r-i Γ-
Ρ Η Ή sp ιο m 00 ΟΟ
ϋ φ f—Í Ο σ co m 1—1
< ω r4 Η tn
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C in O σ
Ή ri *► X
φ Φζ-Η sp ιθ ΟΙ LD sP O
ρ -Ρ σ co η r-i CM
ο ο ε Μ 8 ο 10 ri
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φ r-i ζ-. Ê Φ Η Ο Ο m m O O
Φ -ρ £ sp ιη οι ΓΩ O 1—i
ι—) 0 0 Α r-i η r-i
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P sP O w 1 Φ 01 r-i z Φ G Ή 1 Φ IDI 04 Φ q •H
Φ 04 P P Φ P li-l
ra 0 0 Φ 0 1 ra Φ 0
Φ p r—} sp Ψ4 1—i P 0 P ι—1
a Φ Φ £ r-i Φ < r-í r—I rt —·
Si Ό hPí - Φ r-i w Φ Φ r-i
ca O CG r-| Q r-i CG ri
£ Φ Φ Φ
• • • • u 4 u 4 U
I—f Ol ΓΩ sP 1 Lf) 1 KO 1

Claims (9)

1. — Processo' para a produção da. suifatase substancialmente purificada susceptível de catalisar a conversão de um 4'-sulfato de . 4 ' -desmetil-epipodof ilo-toxina-glucõsido num 4 ' -desmetil-epipodof ilo-toxina-glucõsido, caracterizado pelo facto de se cultivar Streptomyces sp. T109-3, ou uma sua variante, ou um seu muntante-sob condições aeróbicas por submersão num. meio contendo fontes de carbono e azoto assimiláveis até se ter produzido uma quantidade susceptível de ser recolhida da.suifatase a se recolher a referida suifatase.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-37- f
do pelo facto de se. obter uma sulf atase possuindo um peso mole_ cular de cerca de 45 KD como determinado por SDS-PAGEL e um. ponto isoelêctrico de cerca de 5,6.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se obter uma sulfatase isolada a partir de um.
actimomicete.
4·.- ' Processo de· acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo.facto de se obter uma sulfatase isolada a partir.de Streptomyces sp. T109-3, ou uma sua.variante, ou um seu mutante.
5.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a produ ção de uma sulfatase substancialmente purificada isolada a partir de um actinomicete,. sendo -a referida sulfatase· susceptível de catalisar a conversão de um 4'-sulfato de.4’-desmetil-epipo— dofilotoxina-glucõsido num 4'-desmetil-epipodofilotoxina-glucõsi do, caracterizado pelo facto de a referida sulfatase possuir um pesa molecular de cerca de 45 KD como determinado por SDS-PAGE e um ponto isoelêctrico de cerca de 5,6.
6.- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado oelo facto de se obter uma sulfatase isolada a partir de
Streptomyces sp.
ΊΊ09-3, ou uma sua variante, ou um seu mutante.
-387. — Processo de acordo .com a reivindicação 1, para, se produzir- uma suifatase· substancialmente purificada isolada a partir de Streptomyces sp.
T109-3, sendo a referida suifatase susceptí vel de catalisar a. conversão de 4.'-sulfato. de etoposido em etop£ sido, caracterizado pelo facto da .referida suifatase possuir um peso molecular de cerca .de 45 KD como determinado por SDS-PAGE e um ponto isoeléctrico de cerca de 5,6.
8. - Processo de· acordo com.a reivindicação 1, para a produção de suifatase. substancialmente purificada isolada a partir de Streptomyces sp.. T109-3, sendo a referida suifatase- susceptível de catalisar a conversão do 4'-sulfato de 2, 3-di-0-acetil-eto_ posido no 2, 3-di-0-acetil-etoposidp, caracterizado pelo facto de a suifatase referida.possuir um.peso, molecular de cerca de
45.KD como determinado :por- SDS-PAGE e um ponto isoeléctrico de cerca de 5,6.
9. - Processo dé acordo.com a reivindicação 1, caracterizado pelo f acto de se .utilizar uma cultura biologicamente pura de
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