JP2963536B2 - 合成緑膿菌線毛ペプチド及び関連するワクチン及び診断剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、抗原、免疫原及びこの様な免疫原を利用す
るワクチンに関する。更に詳しくは、本発明はポリペプ
チド抗原又は免疫原、その様な免疫原によって得られる
抗体及び緑膿菌（P.aeruginosaアエルギノーザ）感染又
は定着を防止するのに適するワクチンに関する。

本発明の背景 過去20年間、緑膿菌は、ほとんどの病院で10％と20％
の間の感染を引き起す病原体として認められている。シ
ュードモナス感染は、特に火傷、のう胞性線維症、急性
白血病、臓器移植及び静脈内−麻薬中毒の患者によく見
られる。緑膿菌は、通常の病院汚染物であり、伝染病は
病院周囲で多くの項目まで調査されている。長期間入院
する患者は、しばしばこの生物によって影響を受け、伝
染の進展が増加する危険を覚悟しなければならない。最
も重大な感染は、悪性−外耳炎、肉眼球炎、内生分生子
炎、軟膜炎、肺炎、及び敗血病を含む。シュードモナス
感染から回復する見込みは、患者のもとになる病状の難
度による。報告された緑膿菌肺炎死亡率は50−80％の高
さである。比較的新しい抗生物質が開発されても、困難
な緑膿菌感染に対して配合抗生物質治療が必要であると
いう問題が相変らず残る。

困難な緑膿菌感染の取扱いに関する別の治療は、長年
評価されている。免疫療法は、代りの療法を最も大規模
に切り開いている。この領域で、毒性因子に注目が集っ
ている。ほとんどの細菌性病原体を用いた時のように、
緑膿菌の毒性は多方面にわたりかつ多くの相互に作用す
る不定物をを有する生成物であり、これは微生物及び宿
主に関係する。文献によれば、感染の最初の結果は、粘
膜表面の上皮細胞に微生物が付着することが示唆され
〔E.H.フラッキー（Blackey）、J.Infect.Dis.,143:325
−345（1981）〕。粘膜表面に付着できない生物は、定
着しない。というのはこれらが粘膜表面洗う分泌によっ
て除かれるからである。付着工程は、細菌と上皮細胞と
の間の特異的認識による。多くのグラム陰性菌、たとえ
ば緑膿菌に関して、付着の媒介物として表面付属糸は、
“付着素”と呼ばれ、付着素に対する特異レセプターの
分布は、細菌に対して注目される多くの組織屈動性を決
定する。緑膿菌の場合、成分の表面上に存在する極性線
毛が頬側上皮細胞への付着を媒介することを示してい
る。このことに関する資料は次の通りであ：（１）非線
毛化菌株は、上皮細胞に付着しない；（２）緑膿菌のプ
ロテアーゼ処理は、上皮細胞へのこれら微生物の付着可
能性を、劇的に減少させる；（３）上皮細胞と精製され
た線毛の前インキュベートは、無傷の微生物の付着を著
しく減少させる、そして（４）精製された線毛に対する
抗体は、頬側上皮細胞への微生物の付着を妨害する。

緑膿菌線毛は、種々の臨床上分離物中で抗原的に異種
であるので、線毛の一部を保存するという文献がある
〔パランチーチ（Paranchych）等、Autibiotics Chemot
her.36:49−57（1985）参照〕。この通常の分野は、上
皮細胞と結合する点で重要であるので〔ドイグ（Doig）
等、Infestion and Immun.,56:1641−1646（1988）参
照〕、広汎に有効な緑膿菌線毛ワクチンの製造に有用で
ある。

多くのグラム陰性菌、たとえば大腸菌（Ｅ．Coliコリ
ー）、緑膿菌、ウシ型結核菌（Ｍ．bovisポビス）、淋
菌（Ｎ．gonorrhoeaeゴノロエエ）の表面は、線毛又は
繊維上構造と呼ばれる繊維状構造で被覆される。線毛は
第一にたん白（線毛）から成り、実験動物に注入される
と、抗原決定因子として作用することが分った。一般に
言及されている様にPAO,PAK,CD4、及び他のものを含む
一定の線毛は、ヒトに緑膿菌の定着を媒介する。これら
の線毛のない、いくつかの細菌細胞は、線毛遺伝子を運
ぶプラスミドの突然変異又は欠損のどちらかによって、
粘液を定着することができない。明らかに細菌の表面上
の線毛は、上皮細胞レセプターとの特異相互作用によっ
てのど及び気管の内面に付着する。緑膿菌は、線毛とア
ルギナート（緑膿菌カプセルの主な成分）と共に付着素
として利用し、ヒトの呼吸器上皮細胞への付着を媒介す
ることができる〔ドイグ等、Infection and Immun.,55:
1517−1522（1987）；ドイグ等、Infection and Immun.
56:1641−1646（1988）；マーカス（Marcus）等、Infec
tion and Immun.47:723−729（1985;ランフアル（Ramph
al）等、Infection and Immun.44：ランフアル等、Infe
ction and Immun.47:1−４（1985）；ウッズ（Woods）
等、Infection and Immun.29:1146−1151（1980）参
照。

ヒトの呼吸器上皮細胞に結合する緑膿菌の平衡分析
は、シュードモナス線毛付着素がアルギナート付着素よ
りもかなり高い明らかな親和性又は結合定数（Ka）を有
することを示す〔マックイーチラン（McEachran）等、C
an.J.Mierobiol.31:563−569（1985）、マックイーチラ
ン等、J.Microbiol.Meth.,5:99−111（1986）；ドイグ
等、Infection and Immun.,55:1517−1522（1987）〕。

これらの観察から、線毛付着素は恐らく感染の最初で
供与体シュードモナス付着素であることが示唆される。
付着−媒介された付属系は、緑膿菌による疾疾の誘発に
不可欠である。

この付着を生物学的に妨害する何かが、感染の遮断に
有効でなければならない。この様な技術は、細菌性付着
のモノクロナール抗体治療によって研究され、特許文
献、たとえば米国特許第4,443,549号明細書及び米国特
許第4,702,911号明細書及び公開されたU.S.PCT出願S.N.
PCT/US85/00565中に開示されている。細菌性付着素は特
有のものであるので、この技術は種々の他の細菌を用い
て予想することができないことが重要である。

本発明の要約 本発明の観点によれば、ポリペプチドは自然に発生す
る緑膿菌線毛たん白よりも小さく、そしてその薬学的に
妥当な塩を提供し、そのペプチドは一定に保たれた抗原
決定因子部位を緑膿菌線毛のカルボキシ−末端半分のや
や−変化しうる領域内で免疫学的に模倣することがで
き、緑膿菌感染遮断に使用可能な抗原、又は免疫原であ
ることができる。更に本発明は、この様な免疫原を含有
するワクチン及び緑膿菌感染に対する免疫法を提供す
る。本発明は、更に本発明のポリペプチド及び／又はレ
セプター、たとえばこの様なポリペプチドによってもた
らされる抗体を利用する診断法を目的するものである。

本発明の観点によれば、純粋均一なポリペプチドは、
アミノ酸残基約12個及びアミノ酸残基約20個まで含有す
る少なくとも１個のアミノ酸残基配列を有し、この配列
は緑膿菌線毛の抗原決定因子を免疫学的に模倣すること
ができる配列を限定する。このアミノ酸残基配列は、１
単位として１又は数個同一のポリ−ヘプチド分子中でく
り返すことができる。この様なくり返し単位の１タイプ
以上、及び同一タイプのくり返し単位１個以上は、本発
明を具体的に示す単一ポリペプチド分子中に存在するこ
とができる。

この様なポリペプチドは、遺伝子工学技術によって合
成されたたん白として使用することができるか又は個々
のアミノ酸残基又はアミノ酸残基ブロックから形成され
うる。

本発明の好ましい観点によれば、本発明を具体的に示
す純粋均一なポリペプチドは、アミノ酸残基配列を含む
ものとして限定され、その配列は式： の左から右へ及びアミノ−末端からカルボキシ−末端の
方向へ進む。

式中、Ｘはアミノ酸残基又はブランクである。ブラン
クがｎ＝１〜18の残基X_nとX_n+2の間に生じる場合、X_nは
アミド結合（−CONH−）によってX_n+2に結合する。この
アミド結合は、残基X_nのα−カルボキシ−末端を残基X
_n+2のα−アミノ−末端で縮合して生じる。

上記式中： X₁はアミノ酸残基システイン（Ｃ）である； X₂はグリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）よ
り成る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクであ
る； X₃はアラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）より成る
群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₄はセリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）より成る群よ
り選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₅はグリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）よ
り成る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクであ
る； X₆はセリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）より成る群か
ら選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₇はアスパラギン酸（Ｄ）、ロイシン（Ｌ）、アスパ
ラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）より成る群から選ばれた
アミノ酸残基又はブランクである； X₈はアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）
より成る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクであ
る； X₉はアミノ酸スレオニン（Ｔ）又はブランクである； X₁₀はアラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタ
ミン（Ｑ）、トリプトフアン（Ｗ）より成る群から選ば
れたアミノ酸又はブランクである； X₁₁はグリシン（Ｇ）、トリプトフアン（Ｎ）より成
る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₁₂はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
リジン（Ｋ）より成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
る； X₁₃はアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパ
ラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）より成る群から選ばれた
アミノ酸残基である； X₁₄はリジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギ
ン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）より成る群から選ばれたア
ミノ酸残基である； X₁₅はフエニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）より
成る群から選ばれたアミノ酸残基である； X₁₆はアラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシ
ン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）より成
る群から選ばれたアミノ酸残基である； X₁₇はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）である； X₁₈はアラニン（Ａ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン
（Ｎ）、セリン（Ｓ）より成る群から選ばれたアミノ酸
残基である； X₁₉はグリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオ
ニン（Ｔ）より成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
る； X₂₀はアミノ酸システイン（Ｃ）である。

上記残基のうち、特に好ましいアミノ酸残基配列は、
左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端へ進む次の
ものである： 本発明の合成ペプチドの記載は、以前に公表された配
列を示さず、頬側及び気管上皮細胞表面レセプターへの
結合に関係する決定的残基の複合体である。いくつかの
配列は公表され、かつこの複合配列の部分集合である。

図面の簡単な説明 本発明の好ましい実施態様を次の例に関して次の図面
で説明する： 第１図は、合成ペプチドAc17red及びAc17oxのヒトBEC
sへの結合を示すグラフである。

第２図は、合成ペプチドのヒトBECsへの結合の修飾さ
れたラインウィーバー−バークプロットである； 第３図は、PAK線毛のヒトBECsへの結合の修飾された
ラインウィーバー・バークプロットである； 第４図は、ニトロセルロース上でシミで汚されたBEC
たん白にPAK線毛及び合成ペプチドを結合することを示
すシミである。

第５図は、分画された繊毛TECsへのPAK線毛結合の間
接免疫蛍光局在顕微鏡写真A,B,C及びＤである。

第６図は、ヒト繊毛TECsへの合成ペプチドの結合の間
接免疫蛍光局在顕微鏡写真A,B,C,D,E及びＦである。

第７図は、PAK線毛のＣ−末端以外の領域に対して産
生されたFabフラグメントを実証する棒グラフであり、B
ECsへの線毛結合を妨害するのに有効ではない。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明のポリペプチドは、自然に発生する緑膿菌線毛
たん白より小さく、約12から約20個のアミノ酸残基、好
ましくは12から20個のアミノ酸残基を含み、緑膿菌線毛
たん白のカルボキシ−末端半分の領域で一定に保たれた
抗原決定因子部位を免疫学的に模倣する。本発明のポリ
ペプチドそのままは単独で、又は薬学的に妥当な塩とし
て、ワクチン中の有効成分として、あるいは診断法に於
ける接種物として有用である。本発明のポリペプチド
を、記載する様な種々の合成法によって製造する。目的
のポリペプチドのこの様な合成法は、純粋な材料、すな
わち少なくとも１個のいかなる異種生物学的物質を実質
上含まない均一なペプチド配列をもたらす。

ここで使用される“抗原性決定因子”なる表現とは、
同一又は関係する抗原によって誘発された対応する抗体
（免疫グロブリン）分子との特異相互作用に関与する分
子の構造上の成分を示す。本発明のポリペプチド中の抗
原決定因子は、アミノ酸残基の化学的に活性な表面残基
を有する。

ここで使用される“抗原”なる表現は、抗体によって
結合される存在物を意味する。

ここで使用される“免疫原”なる表現は、宿主動物中
で抗体産生を誘発する存在物を示す。ある場合抗原及び
免疫原は同一の存在物であり、一方他の場合２個の存在
物は別々のものである。

ここで使用される“免疫学的に模倣”なる表現は、本
発明の免疫原性ポリペプチドが天然たん白又は天然たん
白の開裂フラグメントでなく、たとえば固相合成法又は
遺伝子工学法で製造されたポリヘプチドであることを意
味する。そのポリペプチドは誘発するポリペプチドに及
びまた対応する線毛又は線毛ポリペプチドたん白に結合
する抗体の産生を誘発する。

ここで同定される、すべてのアミノ酸残基は、他に明
記しない限り、天然体又はＬ−立体配置体である。標準
のペプチド命名法に一致して、ここで使用したアミノ酸
残基に関する略号を以下に示す： ここで使用される“薬学的に妥当な塩”なる表現は、
非−毒性塩、たとえば通常医薬産業で使用されるアルカ
リ金属、アルカリ土類金属及びアンモニウム塩を表わ
し、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マ
グネシウム及びアンモニウム塩等が挙げられ、これらは
従来公知の方法で製造される。この表現は、また非毒性
酸付加塩を包含し、この塩は一般に本発明の化合物と適
当な有機酸又は無機酸との反応によって製造される。代
表的な塩は、ヒドロクロライド、ヒドロブロマイド、ス
ルフアート、ビスルフアート、アセタート、オキザラー
ト、バレアート、オレアート、ラウレアート、ボラー
ト、ベンゾアート、ラクタート、ホスフアート、トシル
ラート、シトラート、マレアート、フマラート、サクシ
ナート、タルトラート等である。前記条件に適合するポ
リペプチドは哺乳類宿主中で抗体を誘発し、線毛たん白
のカルボキシ−末端半分の領域内で所望の抗原性決定因
子部位を免疫学的に模倣すると考えられる。

前記条件に適合するアミノ酸残基１又は数種は、くり
返し単位として存在することができる。更にこの様なア
ミノ酸残基配列１又は数種を有するポリペプチドを、個
々のポリペプチド頭と尾の部分を結合することによって
比較的大きい合成部分となすことができる。

これらのポリペプチドは、アミノ−末端からカルボキ
シ末端への方向で左から右へ進むアミノ酸配列を含むも
のとして特徴づけることができ、その式は次の通りであ
る： 式中、Ｘはアミノ酸残基又はブランクである。ブラン
クがｎ＝１〜18の残基X_nとX_n+2の間に生じる場合、X_nは
アミド結合（−CONH−）によってX_n+2に結合する。この
アミド結合は、残基X_nのα−カルボキシ−末端を残基X
_n+2のα−アミノ−末端で縮合して生じる。

更に、 X₁はアミノ酸残基システイン（Ｃ）である； X₂はグリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）よ
り成る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクであ
る； X₃はアラニン（Ａ）又はイソロイシン（Ｉ）より成る
群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₄はセリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）より成る群か
ら選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₅はグリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）よ
り成る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクであ
る； X₆はセリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）より成る群か
ら選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₇はアスパラギン酸（Ｄ）、ロイシン（Ｌ）、アスパ
ラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）より成る群から選ばれた
アミノ酸残基又はブランクである； X₈はアラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）
より成る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクであ
る； X₉はアミノ酸スレオニン（Ｔ）又はブランクである； X₁₀はアラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタ
ミン（Ｑ），トリプトフアン（Ｗ）より成る群から選ば
れたアミノ酸又はブランクである； X₁₁はグリシン（Ｇ）、トリプトフアン（Ｎ）より成
る群から選ばれたアミノ酸残基又はブランクである； X₁₂はアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
リジン（Ｋ）より成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
る； X₁₃はアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパ
ラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）より成る群から選ばれた
アミノ酸残基である； X₁₄はリジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギ
ン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）より成る群から選ばれたア
ミノ酸残基である； X₁₅はフエニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）より
成る群から選ばれたアミノ酸残基である； X₁₆はアラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシ
ン（Ｌ）、アラギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）より成
る群から選ばれたアミノ酸残基である； X₁₇はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）である； X₁₈はアラニン（Ａ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン
（Ｎ）、セリン（Ｓ）より成る群から選ばれたアミノ酸
残基である； X₁₉はグリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、スレオ
ニン（Ｔ）より成る群から選ばれたアミノ酸残基であ
る； X₂₀はアミノ酸システイン（Ｃ）である。

上記残基のうち、特に好ましいアミノ酸残基配列は、
左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端へ進む次の
ものである： この配列が、パスロスケ（Pasloske）等、J.of Bacte
riology,170:3738−3741（1988）によって記載されてい
る様な緑膿菌の８個の異なる菌株から得られた線毛たん
白のカルボキシ−末端半分の領域に位置されることを見
い出した。

ここに記載した配列に関する、特に好ましい構造は、
この配列が分子内ジスルフイド結合を含有するものであ
る。これらのジスルフイド結合は、夫々の配列に含まれ
る２個のシステイン（Ｃ）残基のイオン原子を酸化カッ
プリングして生じる。

典型的な研究室製造に於て、ジ−CYS−ポリペプチド
（非酸化形でアミノ−及びカルボキシ−末端システイン
を含有する）10mgを、約８のpH値を有する0.1モル重炭
酸アンモニウム緩衝液250mg中に溶解する。次いで溶解
されたジ−CYS−ポリペプチドを、生じる溶液を約18時
間又はエルマン（Ellman）テストにより検出可能な遊離
メルカプタンが存在しなくなるまで穏やかに攪拌するこ
とによって空気酸化する。〔エルマン、Arch.Biochem.B
iopluys.82:70−77（1959）参照〕。この様に製造され
た閉環ペプチドを、次いで典型的に凍結乾燥、再溶解及
びクロマトグラフィー精製によって単離する。

この好ましい配列が、パスロスケ（Pasloske）等、J.
of Bacteriology,170:3738−3741（1988）によって記載
されている様な緑膿菌の８個の異なる菌株並びにここで
以下に定義する、抗原に関係するその変型化合物から得
られた線毛たん白のカルボキシ−末端半分の領域内に一
定に保たれることを見い出した。

前記配列１個以上を同一ポリペプチド中に存在させる
ことができ、常に他のアミノ酸残基又は他の適当な結合
基の鎖によって相互に一定の間隔に配置することができ
る。

免疫検定法からの及び異なる配列を有する解明された
Ｘ−線結晶構造、たとえばオリゴマー酵素の二量体接触
で一定に保たれたたん白−たん白相互作用との相似性か
らの生物学的証拠は、たん白−たん白認識の保存が関連
物質に関して配列の厳密な保存を要求しないことを示
す。単一アミノ酸残基変化は、置換の性質による広範な
度合へのこのような認識に影響するが、一般的条件で、
たん白−たん白（及び抗原性及び／又は免疫原性）認識
の点で２つの異なるアミノ酸配列を有する関連物質を７
つの基本的アミノ酸パラメーターの用語で表わすことが
できる： （１）疎水性； （２）極性； （３）側鎖のサイズ； （４）電荷； （５）裏返しの第二構造を好む； （６）ベータ鎖二次構造を好む； 及び （７）らせん二次構造を好む。

抗原性及び／又は免疫原性認識に関連がある配列固有
性及び抗原的に関係する変型化合物の度合を限定するた
めに、アミノ酸残基間で、実験上の類似物を用いる次の
分類が使用されうる。この分類は交換グループを明らか
にするアミノ酸残基の配列に基づく。この様なグループ
内でのアミノ酸は相互に交換するのが好ましい。したが
ってこれらは、ほとんどたん白構造への全体の影響の点
で相互に似ている。これらの実験上類似物については、
“たん白構造の原理”、チャールスR.コートン（Cauto
n）、編集者、スプリンガー出版、ニューヨーク、Inc.1
979、第14頁中に記載され、次の通りである： 本発明の目的にあたり、関係するペプチドを次の方法
で限定する： 位置X₁でシシテイン残基（Ｃ）Ｃ、次いで次のものを
有するすべてのペプチドとして、 −位置X₂でグループ２又は４のアミノ酸残基又はブラン
ク。

−位置X₃はグループ３又は４のアミノ酸残基又はブラン
ク。

−位置X₄でグループ４のアミノ酸残基又はブランク。

−位置X₅でグループ２又は４のアミノ酸残基又はブラン
ク。

−位置X₆でグループ４のアミノ酸残基又はブランク。

−位置X₇でグループ３又は４のアミノ酸残基又はブラン
ク。

−位置X₈でグループ３又は４のアミノ酸残基又はブラン
ク。

−位置X₉でグループ４のアミノ酸残基又はブランク。

−位置X₁₀でグループ４のアミノ酸残基又はブランク。

−位置X₁₁でグループ１又は４のアミノ酸残基又はブラ
ンク。

−位置X₁₂でグループ２又は４のアミノ酸残基又はブラ
ンク。

−位置X₁₃でグループ４のアミノ酸残基。

−位置X₁₄でグループ2,3又は４のアミノ酸残基。

−位置X₁₅でグループ１のアミノ酸残基。

−位置X₁₆でグループ2,3又は４のアミノ酸残基。

−位置X₁₇でグループ４のアミノ酸残基。

−位置X₁₈でグループ２又は４のアミノ酸残基。

−位置X₁₉でグループ９のアミノ酸残基。

及び位置X₂₀でシステイン残基（Ｃ）を有する。

本発明による及びここで使用されるペプチドは、高分
子量化合物に結合するのが好ましい。例えば、たん白、
例えばキーホール リンペット ヘモシアニン（KLH）
又はボビン血清アルブミン（BSA）又はトキソイドたん
白を次の方法で使用することができる。

たん白キャリヤーへのペプチド融合 ペプチドをキーホール リンペット ヘモシアニン
（KLH）又はボビン血清アルブミン（BSA）に、〔¹⁴C〕
グリシンから成るリンカー及びペプチドがまだソリッド
マトリックス上にある間で、合成の間ペプチドに添加さ
れるベンゾフエノン橋かけ結合基（ベンゾイル安息香
酸）を介して融合する。ハプテンを先ず、試験管中で水
10−20μｌに溶解する。たん白キャリヤー（10mg/100μ
ｌ）を次いで添加し、混合する。そのキャリヤーへのペ
プチドの共役結合がRPR3500Åランプを備えたRPR208分
取リアクター中で１時間４℃でUV照射によってベンゾイ
ルベンゾイル基の次の活性化を生じる。非融合ヘプテン
を8M尿素、10mM及び25mMビカルボナートに対する逐次透
析によって除去する。生成物を凍結−乾燥し、ペプチド
導入をキャリヤー１モルにつき導入された放射能を測定
して決定する。約4:1及び10:1のペプチド／たん白割合
が、酸化及び還元ペプチド関して、それぞれに得られ
る。

上記の抗原的に関係する領域を有するペプチドを含む
前記ポリペプチドの混合物を、緑膿菌に対するワクチン
又は診断法、及び／又は抗体を生じる接種物を調製する
のに使用することができる。抗−イディオタイプ抗体
が、本発明の配列に基づくワクチンとして開発できるこ
とも分かっている。この様な技術は、更に詳細にケネデ
ィ等、ワクチン86“免疫への新しいアプローチ”、コー
ルド スプリングハーベー、1986、第85頁に記載されて
いる。細菌性付着と引き続きの定着とすべての相互作用
が感染を防ぐ。緑膿菌線毛たん白のアミノ酸配列の一部
に特異的であるモノクローナル抗体は、付着素と相互作
用し、細胞付属系を妨害することができる。その代り
に、プチド又は全線毛アミノ酸配列の一部を免疫原とし
て使用し、宿主抗体を発現させることができる。この抗
体は順番に、細菌付属系及び引き続きの定着を防ぐ様に
働く。したがって、この方法は、ヒトの緑膿菌疾病の防
止及び治療のための新規の及び有用な生物剤を代表す
る。この合成ワクチンは、緑膿菌における優性免疫性又
は抗原性部位に向けられているのではなく、むしろヒト
頬側及び気管上皮細胞の表面に細菌結合に関与する部位
に結合する付着素に向けられていることに気付かねばな
らない。本発明の有効量を含有するワクチンは十分な量
で抗体の産生を誘発し、緑膿菌感染から予防接種された
個人を守る。もし必要ならば、効能促進剤を与えること
ができる。

様々の文字通りの意味で“ワクチン”なる言葉は、宿
主哺乳類の保護に関連してここで使用される。様々の文
字通りの意味で“接種物”なる言葉は、緑膿菌に免疫学
的に結合する抗体の製造に使用される有効成分として本
発明のポリペプチドを含有する組成物を示すために、こ
こで使用する。ワクチン及び接種物は、同一の成分を含
有するが、その使用は異なる。

本発明の目的に抗原又は免疫原又はその両方として適
するポリペプチドを、合成的に又は遺伝子工学技術で製
造することができ、そしてワクチン、予防接種に、又は
診断剤として使用する単量体の及び多量体の形で存在す
ることができる。ワクチン又は接種物に使用する場合、
ポリペプチドを単独で、オリゴマー又は多量体の場合の
ように使用する又は融合体として他のキャリヤー部分に
結合して使用することができる。免疫原として単独で使
用する場合、本発明のポリペプチドは、典型的に約12か
ら約20個のアミノ酸残基を含有する。この様なポリペプ
チドは、したがってポリペプチドを自然に生じるポリペ
プチドから単離する場合に経験するような外部物質を含
まずに、純粋で均一である。

特に有用な融合体キャリヤーは、キーホール リンペ
ット ヘモシアニン（KLH）、テスヌス トキソイド、
ポリ−Ｌ−（LYS:GLU）：ピーナッツアグルチニン、ポ
リ−Ｄ−リジン、ジフテリア トキソイド、オバアルブ
ミン、大豆アグルチニン、ボビン血清アルブミン（BS
A）又はヒト血清アルブミン等々を包含する。ここで使
用される“製造された”なる表現は、ポリペプチド分子
又はポリペプチドくり返し単位が、合成的に化学手段に
よって形成される、即ち化学的合成される又はヒトを媒
介とする生物学的手段によって、例えば組み換えDNA及
びワクチン抗原に対するベクターとしてワクチニアウイ
ルスを包含する遺伝子工学技術によって形成される。こ
のような後者の技術は、ジェラルド クイナン（Gerald
Quinnan）、“工場の進歩”、11月11−13、1984Elsevi
er、第27頁。

組み換えDNA技術による合成、ワクチン抗原及び他の
形に対するベクターの使用によるワクチン接種及び対象
のポリペプチドのDNA発現に関する要求は、望ましい対
象のポリペプチドをコード化したDNA配列及びその同族
体の使用に基づいている。当業者が十分に認識するよう
に、本発明のポリペプチドをコード化したDNA配列は、
速やかに当業者によって決定され、適する発現システム
によって試験管内で又は生体内で表示され、所望のポリ
ペプチドを産生する。

所望のポリペプチドを合成する目的には、適する微生
物宿主中で選択されたDNA配列の標準発現が、役立つ。
本発明の所望のポリペプチド配列を生じるのを望む当業
者は、所望のポリペプチド配列をコード化する必須のDN
A配列を、速やかに決定しかつ選択することができる。
選択されたDNA配列を、適合する宿主微生物中での発現
に適するベクター中に入れ、所望のポリペプチドを、商
業的量に生じる。対象のDNA配列を、遺伝子及びその生
成物の発現を理解するために及び機能分析用の多量のポ
リペプチドの産生、抗体産生及び患者の治療を行うため
に、多くの研究で取り上げることができる。配列の変化
は、相対量、組織特異性及び機能性質によって発現パタ
ーンを変化させる又はさせない。対象のたん白をコード
化する一部又は全部−長さのDNA配列を細菌発現ベクタ
ー、たとえばpRIT（ニルソン（Nilsson）等、EMBOJ.4:1
075−1080（1985）、pGEX（スミス アンド ジョンソ
ン、Gene67:31−40（1988））又はpATH（スピンドラー
（Spindler）等、J.Virol.49:132−141（1984））プラ
スミドに結合させ、このプラスミドを標準たん白精製処
理に従って単離される対応するポリペプチドの産生のた
めの大腸菌に導入することができる。DNA配列を、その
存在する状況から他のクローニング媒体、たとえば他の
プラスミド、バクテリオフアージ、コスミド、動物ウィ
ルス、イースト人工クロモゾーム（YAC）（ブルケ（Bur
ke）等、サイエンス236:806−812、（1987））、体細
胞、及び他の単一又は複合生物、たとえば細菌、カビ
（チィムバーラーケ（Timberlake）及びマーシヤル（Ma
rShall）、サイエンス244:1313−1317（1989）、無脊椎
動物、植物（ガーサー（Gasser）及びフラリー（Frale
y）、サイエンス244:1293（1989）、及び豚（プーセル
（Pursel）等、サイエンス244:1281−1288（1989））へ
伝達することもできる。

哺乳類の細胞中の発現に関して、DNA配列を、異種プ
ロモーター、たとえばシミアンウィルス（SV）40、pSU2
ベクター中のプロモーター（ムリガン（Mulligan）及び
バーグ（Berg）、Proc.Natl.Acad.Sci DSA、78:2072−2
076（1981）〕に結合させ、細胞、たとえばモンキーCOS
−１細胞（グルツマン（Gluzman）、細胞、23:175−182
（1981）に導入し、中間体又は長期発現を行う。キメラ
遺伝子構造の安定な統一を、哺乳類の細胞中で生物化学
的選択、たとえばネオマイシン〔サウザーン（Souther
n）及びバーグ（Berg）、J.Mol.Appln.Genet.1:327−34
1（1982）〕及びマイコホエノン酸〔ムリガン（Mulliga
n）及びバーグ、supra〕によって保つ。

DNA配列を標準処理、たとえば制限酵素消化、DNAポリ
メラーゼによる充填、エキソスクレアーゼによる欠失、
末端デオキシスクレオチドトランスフエラーゼによる延
長、合成又はクローン化DNA配列の連結、一本鎖バクテ
リオフアーゼ中間体を経て部位特異的配列−変化によっ
てうまく処理することができる。

DNA配列を、常法で真核発現ベクターに導入する。こ
れらのベクターを、真核細胞の転写を可能にするように
作成し、DNAの転写を開始し、高め、その適度のスプラ
イシング及びポリアデニル化を保証する制御配列を提供
する。シミランウイルス（SV）40のプロモーター及びエ
ンハンサー領域又はロウスサルコマ（Rous Sarcoma）ウ
イルスの長い末端くり返し（LTR）及びSV40からのポリ
アデル化及びスプライシングを有するベクターは、容易
に入手できる（ムリガン等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
8:1078−2076、（1981）；コーマン（Gorman）等Proc N
atl.Acad.Sci USA79:6777−6781（1982）〕。DNAの発現
レベルを、このタイプのベクターで用いてうまく処理す
ることができるが、それは異なる活性剤を有するプロモ
ーターを用いるか（たとえば、パクロウイルス（Paculo
virus）pAC373は高いレベルでS.frungiperaエス フギ
ルンペラ細胞中でDNAを発現することができる〔M.D.サ
マーズ（Summers）及びG.E.スミス（B.フィールズ（Fie
s）等、eds.）第22巻、no319−328、コールドスプリン
グハーバーラバトリープレス、コールドスプリングハー
バー、ニューヨーク、1985〕あるいは変調に耐えられる
プロモーターを含有するベクター、たとえばマウス乳房
腫瘍ウイルスからのグルココルチコイド−敏感なプロモ
ーター〔リー（Lee）等、ネイチャー294:228（1982）〕
を含有するベクターを用いるかによる。DNAの発現を導
入後24ないし72時間受容体細胞中で追跡することができ
る（一過性発現）。更に、いくつかのベクターは、選択
可能な標識〔たとえばgpt〔上記ムリガン及びバーグ〕
又はneo〔サウザン及びバーグJ.Mol Appln.Gnet1:327−
341（1982）〕の細菌性遺伝子を含有し、それは受容体
細胞中でベクター（及びしたがってDNA）の安定な、長
い期間の発現を有する化学的選択によって、細胞の単離
を可能にする。ベクターを、エピゾマールとして細胞中
に維持することができ、これはウイルスの制御要素、た
とえばパピローマ〔サーバー（Sarver）等Mol.Cell Bio
l.1:486（1981）〕又はエプスタイン−バール（スグデ
ン（Sugden）等Mol.Cell Biol.5:410（1985）〕を用い
ることによって、存在物を自由に複製する。別にあるも
のは、ベクターをゲノムDNAと結びつける細胞系も生じ
ることができる。これらのタイプの細胞系の両方は連続
基体上で遺伝子生成物を産生する。あるものはベクター
の（及びしたがって同様にDNAの）コピー数を増大し、
高いレベルのポリペプチドを産生することができる細胞
系を作り出す細胞系も生じることができる〔アルト（Al
t）等、J.Biol.Chem.253:1357（1978）〕。

DNAの真核性、特にヒト又は他の哺乳類細胞への転移
は、現在ありふれた方法である。ベクターを、純粋DNA
として受容体細胞へ導入する（トランスフエクション）
する。これはたとえばリン酸カルシウム（グラハム（Gr
aham）及びベンダー（Vander）Eb,Virology52:466（197
3）又はリン酸ストロンチウム〔ブラシュ（Brash）等Mo
l.Ccll Biol.7:2013（1987）〕での沈殿、エレクトロポ
ラーション〔ニューマン（Neumann）等EMBOJ1:841（198
2）〕、リポフエクション〔フエルグナー（Felgner）等
Proc Natl.Acad.SciUSA8:7413（1987）〕、DEAE デキ
ストラン〔マックタン等J.Natl.Cancer Inst.41:351（1
968）〕、マイクロインジエクション〔シャフナー（Sch
afner）、Proc Natl.Aca.Sci USA72:2163〕又はペレッ
トガン〔クライン（Klein）等、Nature327:70（198
7）〕によって行われる。この代りにDNAを、ウイルスベ
クターで感染させて導入することができる。いろいろな
系が、その使用、たとえばレトロウイルス〔ベルンスタ
イン（Bernstein）等、遺伝子工学7:235、（1985）〕、
アデノウイルス（アーマド（Ahmad）等J.Virol157:267
（1986）〕又はヘルペスウイルス（スバート（Spaete）
等細胞30:295（1982）〕を発展させている。

本発明による組み換えクローン化ベクターは、その時
本発明のDNA配列を有する、適する宿主中での発現のた
めに選択されたDNAから成る。そのDNAはベクター中で発
現コントロール配列と効果的に連結して、ポリペプチド
を発現することができる。発現コントロール配列を、原
核又は真核細胞又はそのウイルス及びその組合せ物の遺
伝子の発現を制御する配列から成る群から選択する。発
現コントロール配列を、1ac系、trp系、tac系、trc系、
ランダフアージの主要オペレーター及びプローモーター
範囲、fdコートたん白の制御範囲、SU40の早期及び終期
プロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウ
イルス、バクロウイルス及びシミランウイルスから由来
するプロモーター、３−ホスホノグリセラートキナーゼ
のためのプロモーター、イースト酸ホスフアターゼのプ
ロモーター、イーストアルフアーマチングフアクターの
プロモーター及びそれらの組合せより成る群から特異的
に選ぶ。

本発明のベクターがトランスフエクションされる宿主
細胞を、大腸菌、シュードモナス、枯草菌、バシラス
ステアロサーモフイリス又は他のバシラス；他の細菌：
イースト；カビ；昆虫；マウス又は他の動物；又は植物
宿主；又はヒト組織細胞より成る群から選択する。

本発明の種々のポリペプチドをコード化するDNA配列
及び対応するRNA配列は、当業者によって容易に挙げら
れるが、参考のために、好ましいポリペプチド配列に関
するDNA配列は標準命名に従って次の通りである。そこ
ではポリペプチド配列を、２組の命名によって夫々好ま
しい配列の第一及び第二表示で同定し、対応するRNA配
列を第三列中に示す。

これらの配列のいくつかは、完全な線毛ペプチドの研
究に関する先行文献中で公表されている。それはたとえ
ばブリテイン（Brittain）L.等“緑膿菌PAK線毛遺伝子
のクローン化及び配列化”、FEBS2489、第183巻、No.
2、第408−412頁（1985）；パリミ（Parimi）、サスト
リー（Sastry）A.等“緑膿菌PAK及びPAOから由来する線
毛のアミノ酸及びヌクレオチド配列の比較研究、Journa
l of Bacteriology、164;571−577（1985）；ブリテイ
ンL.等“同一線毛配列を有する胆のう繊維症患者から緑
膿菌の連続的単離”、感染及び免疫56:665−672（198
2）及びブリテイン、L.等、“ノート緑膿菌の異なる単
離物から得られる２つの通常の線毛配列：Journal of B
acteriology170:3738−3741（1988）。

アミノ酸配列の保存に於いて可能な変化についての前
記議論によれば、多くのアミノ酸残基置換を、前述のよ
うに行う。したがってDNA配列中での対応する変化は、
本発明の所望のポリペプチドをコード化させる。更に代
りのアミノ酸配列を連結する又は連結しない所望のポリ
ペプチド配列の適切な倍数を、所望のポリペプチド配列
をコード化するDNA配列及び別の配列をコード化するPNA
配列の対応する倍数によって表わす。

産生されたポリペプチドに基づくワクチンの開発より
もむしろ、生体内で、守られるヒト又は動物に於てワク
チン抗原を発現することができる。これは、前記のクイ
ンマン“工場の進歩”中に記載した方法に従って行わ
れ、上記によればウイルスベクター中の本発明の所望の
ワクチン抗原を患者に投与して発現させる。参考文献に
記載された方法によれば、本発明の所望のワクチン抗原
をコード化する、選択されたDNA配列を、ワクシニアウ
イルス用ウイルスベクターに入れ、作成されたワクシニ
アウイルスのくり返しの注射によって患者に感染させ
る。

その代りに、ワクチンウイルスを、適合する細菌性プ
ラスミド又はフアージ中でのDNAの発現によってヒト又
は動物の患者で発現する。ワクチン抗原を細菌に入れる
この方法は、S.N.チャトフィールド（Chatfield）等、
“異種抗原決定因子のワクチン及びキャリヤーとしての
生サルモネラ”ワクチン7:498（1989）中に徹底的に議
論されている。患者に所望のワクチン抗原を産生させる
弱毒化細菌の使用のもっと一般的議論については、ドー
ガン（Dongan）等、“異種抗原に対するキャリヤーとし
て細菌性生ワクチン及びその適用”、Advaces in Veter
inary Science and Comparitive Medicine、第33巻に挙
げられている。

ワクシニアウイルス方法を用いる様に、経口細菌予防
接種は、患者に本発明の所望のワクチン抗原をコード化
するDNA配列を使用する。したがって選択されたDNA配列
を適当なベクター、たとえば宿主微生物と適合するプラ
スミド中で組立る。微生物を培養して、プラスミドの倍
数複写で選択されたDNA配列を複製する。微生物を培養
物から除き、経口投与で患者に与える。経口投与によっ
て、微生物は再産生し、患者のシステムへ、患者が有効
な免疫応答を有する所望のワクチン抗原を放出する。し
たがって、本発明によれば、適する媒体中で、たとえば
患者に感染して、本発明の所望の対応するワクチン抗原
を患者に放出するウイルス又は細菌中で発現するDNA配
列及びその同族体を使用することである。

かくて、本発明を具体化する製造されたポリペプチド
は、天然に生じるたん白及びそのフラグメントを含まな
い。ブロックされたアミノ酸残基を連続方法で加え、所
望のポリペプチドを得るよく知られた固相化学合成が、
合成の好ましい方法であり、以下に一層詳細に説明す
る。

上述の様に、本発明の目的にかなうポリペプチドを、
よく知られた固相法によって合成することができる。た
とえばメリフィールド（Merrifield）、J.Am.Chem.Soc.
85:2149−2154（1963）、ホーテン（Houghten）等、In
t.J.Pept.Proc.Res.16:311−320（1980）及びパーカー
（Parker）及びホッジ（Hodges）、J.Prot.Chem.3:465
−478（1985）、これらの方法の完全な説明に関して、
参照。ポリペプチド合成の固相法を、ベックマンモデル
990Bペプチド合成器を用いて実施することができ、これ
はベックマン機器社、バークレン、カルフオルニア、米
国から市場で入手できる。

上記固相法によって本発明の合成ポリペプチドを製造
する場合、アミノ酸残基を、カルボキシ−末端残基から
アミド結合によってレジン（固相）に結合させる。

夫々添加されたアミノ酸のアルフアーアミノ基を、ア
ミノ酸が生長するポリペプチド鎖に加えられる前に、第
三−ブトキシ−カルボニル（ｔ−Boc）によって主とし
て保護する。次いでｔ−Boc基を、次のアミノ酸が生長
するポリペプチド鎖に加えられる前に除く。反応性アミ
ノ酸側鎖も、ポリペプチドの合成の間に保護する。残存
するアミノ酸残基に使用される通常の側−鎖保護基は次
の通りである： チロシンに対してｏ−（ｐ−プロモベンジオキシカル
ボニル）、スレオニン、セリン、アスパラギン酸及びグ
ルタミン酸に対してＯ−ベンジル、及びシステインに対
してＳ−メトキシ−ベンジル、リジン及びホルミルトリ
プトフアンに対して２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル。保護されたアミノ酸を適当な溶剤から再結晶し、薄
層クロマトグラフィーによってシングルスポットを生じ
る。カップリングを一般的に、２−倍モル過剰の保護さ
れたアミノ酸及びジシクロヘキシルカルボジイミド両方
を用いてミリ−当量数の最初のＮ−末端アミノ酸を超え
て実施する。アスパラギン及びグルタミンに対しては、
等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールを保護
されたアミノ酸に加え、ジメチル−ホルムアミドを溶剤
として使用する。すべてのカップリング反応は、ギシン
（Gisin）、Anal Chem.Acta,58:248−249（1972）のピ
クリン酸テスト又はニンヒドリンテスト、サリン（Sari
n）等、Anal.Biochem.117:114−157（1981）によってほ
とんど99％以上完全である。

生じる、保護された、レジン−結合したポリペプチド
の一部（１グラム）を、2mのアニソールで処理し、無
水フッ化水素20mをドライアイス温度で反応容器中で
凝縮する。生じる混合物を4⁰で1.0時間攪拌し、保護す
る基を切断し、ポリペプチドをレジンから除く。フッ化
水素を40℃の温度でN₂流を用いて蒸発した後、残留物を
無水ジエチルエーテルで３回抽出し、アニソールを除
き、残留物を減圧乾燥する。

減圧乾燥された物質を、純粋なトリフルオロ酢酸で抽
出する（３回、夫々10m）。抽出物は、レジン不含ポ
リペプチドを分離する。水で10−20％の酢酸の濃度に希
釈後、生じる溶液を凍結乾燥し、単量体の非酸化ポリペ
プチドを生じる。次いでレジンから遊離されたペプチド
を、公知の標準クロマトグラフィー処理によって精製
し、次いで酸化して、単量体の、分子内で環化した生成
物を生じる。

典型的な研究室の製造で、ジ−Cysポリペプチド10mg
（非酸化形でアミノ−及びカルボキシ−末端システイン
残基を含有する）を、約８のpH値を有する0.1モル重炭
酸アンモニウム250m中に溶解する。次いで溶解された
ジ−Cysポリ−ペプチドを、約18時間生じる溶液を穏や
かに攪拌して、又はエルマン（Ellman）テスト〔エルマ
ン、Arch.Biochem.Biophys.82:70−77（1959）参照〕に
よって遊離メルカプタンが検出できなくなるまで空気酸
化する。

この環状酸化ペプチドを、頭と尾から次の処理で重合
することもできる。その方法に於て、環状ポリペプチド
を、ジメチルホルムアミド（1mg/m）中に溶解し、ベ
ンゾチアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミ
ノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフアート（1.1モ
ル量）及びジイソプロピルエチルアミン（100μｌ）を
加え、室温度で約８時間反応させる。この方法で製造さ
れた多量体ポリペプチドを、溶剤の蒸発及びクロマトグ
ラフィー分離によって単離する。次いでベンジル保護基
を、アニソール及び無水フッ化水素で−10℃で110時間
ポリマーを処理して除く。−10℃でN₂流を用いてフッ化
水素を除去した後、残留物を無水ジエチルエーテルで３
回抽出し、アニソール及び残留物を除く。酸化された環
状単量体単位を含有するポリペプチド多量体を、緑膿菌
に対するワクチンの製造に使用する。この方法で、合成
法は、アサートン（Atherton）等、J.C.S.バーキン（Pe
rkin）１:538−546（1981）によって開発された公知の
固−相法に従う。この文献は、ここに参考として記載す
る。この方法を、LKBバイオクロム社、ケンブリッジ、
英国から市場で入手できるLKB Biolynxモデル417Tペプ
チド合成器を用いて実施することができる。

上記固−相法による本発明の合成ポリペプチドの製造
で、アミノ酸残基をカルボキシ−末端残基からエステル
結合によってレジン（固−相）に結合させる。

夫々添加されたアミノ酸のアルフア−アミノ基を主と
して、アミノ酸が生長するポリペプチド鎖上に加わる前
に、９−フルオロエチル−メトキシカルボニル（FMOC）
によって保護する。次いでFMOC基を、次のアミノ酸が生
長するポリペプチド鎖に添加される前に除く。反応性ア
ミノ酸側鎖も、ポリペプチドの合成の間に保護する。残
存するアミノ酸残基に使用される通常の側−鎖保護基は
次の通りである： チロシンに対してｏ−（ｐ−ブロモベンジルオキシカ
ルボニル）、スレオニン及びセリンに対してＯ−ベンジ
ル、アスパラギン酸に対して−フエナシル、グルタミン
酸に対してベンジル、システインに対してＳ−ｔ−ブチ
ル及びリジンに対して２−クロロベンジルオキシ−カル
ボニル。カップリングを、２杯モノ過剰の保護されたア
ミノ酸及び１当量のジシクロヘキシルカルボジイミドを
用いて、最初のＮ−末端アミノ酸のミリ当量の数を越え
て一般的に実施する。アスパラギン（Ｎ）及びグルタミ
ン（Ｑ）に対して、２モル量のＮ−ヒドロキシベンゾト
リアゾール及びジシクロヘキシルカルボジイミドを使用
する。すべてのカップリング反応を、サリン（Sari
n）、Anal.Biochem.117:147−157（1981）のニンヒドリ
ンテストによって一般に追跡し、ほとんど99％以上完全
である。

このレジンの一部を切断して、ペプチドを酸化及び重
合のために放出する。部分的に保護されていないペプチ
ドを放出する開裂を、95％トリフルオロ酢酸（5m/50m
gレジン）を用いる次の方法で行う。レジン（50mg）
を、アニソール（３容量％）、エタンジチオール（１容
量％）及びエチルメチルスルフイド（１容量％）を含有
する95％トリフルオロ酢酸中に懸濁し、反応を室温で２
−３時間進める。レジンを濾過して、ペプチド及びスカ
ベンジャーを除き、レジンを純粋なトリフルオロ酢酸
（３−5m）で洗滌する。一緒にされた濾液を、減圧下
蒸発し、残留物をジエチルエーテルで粉砕する。最後
に、残留物を水中の0.5％トリフルオロ酢酸中に溶解
し、凍結乾燥する。

この粗ペプチドを、公知の逆−相HPLC法で精製し、精
製されたペプチドを上延の様に約18時間約８のpHを有す
る0.1モル重炭酸アンモニウム中で空気酸化して環化す
る。酸化処理からの環化した生成物の単離は、公知のク
ロマトグラフィー法に従う。ポリマーポリペプチドの合
成は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジ
メチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフアー
ト（1.1モル量）及びジイソプロピルエチルアミン（100
m）を用いて、室温で約８時間、遊離アミノ及びカル
ボキシ−末端のヘットトウテイルカップリングによって
行われる。次いで多量体の精製を、公知のサイズ排除ク
ロマトグラフィーを用いて行う。残存するベンジル側鎖
保護基の開裂は、多量体をアルソール（1m）含有無水
フッ化水素（9m）で約１時間約−10℃で処理して行わ
れる。脱保護された多量体の単離を、約−10℃で温度を
保ちながらN₂ガス流下にフッ化水素の蒸発によって行
う。次いで生成物を、ジエチルエーテルで粉砕し、スカ
ベンジャーを除き、水性0.5％トリフルオロ酢酸中に溶
解して、凍結乾燥する。

その代り、配列がベンジル保護されたセリン及びスレ
オニンをｔ−ブチルシステインと共同で含有する場合、
環化前の開裂はアニソール（1m）及びエタンジチオー
ル（25μｌ）を含有する液体無水フッ化水素（9m）中
で行われる。この開裂に続いて、環化及び重合が多量体
ポリペプチドを生じる。合成に於ける夫々の段階での精
製は、従来公知のクロマトグラフィー法によって行われ
る。

別に、上記方法によって得られた、精製された環状ポ
リペプチドを、従来公知で、J.P.Tam,Proc.Natl.Acad.S
ci.U.S.A.85:5409−5413（1988）によって記載された多
重抗原ペプチドシステム（MAP）と呼ばれるコアマトリ
ックスに直接連結する。環状単量体ポリペプチドの連結
は、８当量のベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリ
ス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホス
フアート及びジイソプロピルエチルアミン（100μｌ）
を含有するジメチルホルムアミド中で8:1モル割合のポ
リペプチドとコアマトリックスを用いて行われる。

本発明のワクチン及び接種物を、注射、通常筋肉内又
は皮下に、エンテリックカプセル又は錠剤による経口
で、エンテリックカプセル又は錠剤による経口で、他の
投与に適する経路によって投与する。ヒトの患者に対し
て、ポリペプチドの適する投薬量は、部分的に選ばれた
投与経路及び多くの他のフアクターに依存する。これら
のフエクターとして、免疫化される哺乳類の体重、使用
時のキャリヤー、使用時のアジュバント、及び使用され
る所望のワクチン接種の数が挙げられる。

ヒトの患者に対する個々のワクチン接種は、ポリペプ
チドが結合するすべてのキャリヤーを除いて、約10ミリ
グラムないし約100ミリグラムの単位投薬量を一般に含
有する。所望の場合、一連の投薬量を最適な免疫時間に
わたって投与する。ワクチンの単位投薬形は、所望の場
合、上記量のポリペプチドを含有することもできる。

いかなる場合も、ワクチン又は接種物中に含有される
免疫原は、“有効量”で存在し、その量は免疫学的方法
でよく知られた種々のフアクターによる。たとえば免疫
化される哺乳類の体重、使用されるキャリヤー部分、使
用されるアジュバント求められる保護の持続、及び望ま
れる免疫計画による。

本発明のポリペプチドを増加させる抗体全体、及び実
質的抗体全体及びこの様な抗体から製造された抗体結合
部位は、まだ本発明の他の様相を構成する。これらの分
子は、集合的にレセプターとしてみなされる。

レセプターを、哺乳類、たとえばウサギ、ヤギ、馬等
々中で前記接種物を用いて免疫化して高められる。免疫
操作は、効力のあるアジュバント、たとえば完全なフロ
イントアジュバント（CFA）及び／又は不完全なフロン
トアジュバント（IFA）を除いてワクチン接種に使用さ
れる操作と実質的に同一である。これらのアジュバント
はヒトへの使用に認められていないが、動物接種物中に
ふくまれうることが通常知られている。

典型的な接種貯蔵液を、CFA、IFA又はミョウバンを用
いて次の様に製造する：ワクチン接種につきポリペプチ
ドの所望の、有効な量を提供するのに充分なポリペプチ
ド、合成ポリペプチド−複合体又はポリマーポリペプチ
ドの量を7.2のpH値でPBS中に溶解する。次いでCFA又はI
FAの等容量をポリペプチド溶液と混合し、水と油の割合
が約1:1でポリペプチド、水及びアジュバントを含有す
る接種物を生じる。その後、混合物を均一化し、接種貯
蔵液を生じる。ミョウバンを使用する場合、複合体200
ミリグラムをミョウバン約４ミリグラム上に吸収させ、
貯蔵接種物を製造する。

ウサギをこの際使用して、抗ポリペプチド抗体を増加
させることができる。これを使用する場合、一般に宿主
ウサギに、CFA中で乳化されたポリペプチド複合体（ポ
リペプチド＋キャリヤー）200ミリグチム;IFA中のポリ
ペプチド複合体200ミリグラムを皮下に；ポリペプチド
複合体200ミリグラムとミョウバン４ミリグラムを腹腔
内に夫々免疫化スケジュールの0,14及び21日目に注射す
る。夫々のワクチン接種（免疫化）は、接種物の４つの
注射から成る。マウスを同様な方法で注射につき上記投
薬量の約10分の１を用いて免疫化する。

動物から、最初の注射後４及び15週間一般に採血す
る。コントロールプレ−免疫血清が夫々の動物から最初
の免疫化のすぐ前で採血して得られる。

コントロール接種貯蔵液も、キーホールリンペットヘ
モシアニン（KLH）、CFA又はIFA中のKLH、又はIFA、KLH
−ミョウバン吸収、KLH−ミョウバン−吸収百日咳、エ
デスチン、チログロブリン、テタヌストキソイド、IFA
中のテタヌストキソイド、コレラトキソイド及びIFA中
のコレラトキソイド等々を用いて製造することができ
る。

上記免疫化処理の効果を、一般にELISAによって測定
する。その方法で本発明の免疫性ポリペプチドを、抗原
として使用し、上記採血から得られた希釈された血清中
に存在する抗体量を測定する。少なくとも約1:160の抗
−ポリペプチド抗体力価（希釈）を生じる血清が、本発
明の抗体を提供するのに有用であると考えられる。一般
に使用されるELISAテストは、ビトル（Bittle）等、Nat
ure298、30−33（1982）中に極めて詳細いに記載されて
いる。

適するモノクローナルセプター、一般に抗体全体も、
ニマン（Niman）等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4949−
4953（1983）中に開示されているハイブリドーマテクノ
ロジーによって製造する。モノクロナールレセプターを
ハイブリドーマ上澄みから単に得る必要があるだけでな
く、所望のハイブリドーマが導入された哺乳類の腹水液
から通常大量に得られる。腹水液を用いてモノクローナ
ル抗体を製造することはよく知られており、ここでは更
に論じない。本発明のレセプターは、これを高めるポリ
ペプチドにも、対応する線毛たん白にも結合し、その抗
原性決定因子部位は本発明のポリペプチドを免疫学的に
模倣する。かくて、本発明のポリペプチドは、免疫原で
も抗原でもある。本発明のレセプターは、天然に生じる
ポリクロナール抗体のサブセットである。というのはこ
れらは完全な線毛分子の小さいフラグメントを模倣する
免疫原に惹起されるからである。したがって、本発明の
レセプターはポリペプチドのエピトープ（これは線毛分
子の一部である）に結合し、一方シュードモナス線毛に
惹起される天然に生じる抗体は、線毛分子を通してエピ
トープと結合する。

ポリペプチド、抗体及びこれらのペプチドによって提
供される抗体結合部位及び本発明の方法を、診断テス
ト、たとえば免疫検査方にも使用できる。この様な診断
方としては、たとえば酵素免疫検定法、酵素増殖免疫検
定法（EMIT）酵素−連結免疫ソルベント検定法（ELIS
A）、放射線免疫検定法（RIA）、蛍光免疫検定法、一又
は二重抗体法及び抗体結合部位又は抗原がある検出可能
なタグで標識される他の方法が挙げられる。一般にマジ
オ（Maggio）、酵素免疫検定法、CRCプレス、クリーブ
ランド、オハイオ（1981）及びゴールドマン、M.,蛍光
抗体法、アカデミックプレス、ニューヨーク、N.Y.（19
80）参照。

緑膿菌を検出するための本発明を具体化する、実例と
なる診断システムは、レセプター分子、たとえば抗体、
実質上抗体全体、又は抗体結合部位を含有し、これらは
本発明のポリペプチドに惹起される。システムも、レセ
プターと抗原との間の免疫反応の存在を目立たせる指示
手段を包含する。指示手段は、免疫反応を検出させる。
人体サンプル、たとえば喀痰と混合した場合、レセプタ
ーは線毛抗原と免疫反応し、免疫反応成分を形成し、そ
の時指示手段は免疫反応をシグナルする。

１つのこの様な典型的な具体例は、喀痰塗抹標本が平
らな顕微鏡スライドにアセトン固定されている免疫蛍光
検定法である。本発明に従って高められた、たとえばウ
サギ中で高められた抗体の一部、一般に約10ミリグラム
ないし約500ミリグラムを、公知方法によってスライド
上でインキュベートする。

非免疫反応抗体を洗浄除去し、たん白、たとえばBSA
で非−特異性結合部位をスライド上でブロックした後、
第二抗体たとえばヤギ抗−ウサギ抗体を所望の場合、テ
ストスライド上でインキュベートする。第二抗体を、フ
ルオロクロム染料、たとえばフルオレッセンイソチオシ
アナート（FITC）に連結することによって標識する。

この第二インキュベーションの後、いくらか過剰の第
二抗体を洗浄し、テストスライド上で第一抗体に結合し
たFITC−標識されたヤギ抗−ウサギ抗体が残存する。FI
TC−標識された抗体の存在を、フルオレッセン顕微鏡検
査によって検出し、それによってシュードモナス感染の
存在をシグナルする。

レセプター分子に対する完全な、生物学的有効な抗体
全体の使用は、多くの診断システム、たとえば上記の免
疫蛍光検定法で不必要である。むしろ抗体分子の免疫学
的に有効なイディオタイプ含有、抗原結合及び認識レセ
プター部位、すなわち抗体結合部位しか使用されない。
この様な抗体結合部位の例は、従来公知の方法によって
製造されたFab及びＦ（ab′）_２抗体一部として従来公
知のものである。

本発明の他の診断法はELISA検定法である。この場
合、本発明のポリペプチド抗原を、固体担体、たとえば
マイクロタイタープレートの壁上の非−特異的結合部位
を、たん白、たとえばBSAでブロックする。非結合ポリ
ペプチド及びBSAをマイクロタイターくぼみから洗浄し
て除去する。

上記の様な人体サンプルを、水性溶液中で過剰の本発
明の抗体と混合し、混合物を抗体とすべてのシュードモ
ナス線毛抗原存在との免疫反応を生じるのに十分な時間
維持する。次いでその液体混合物を上記ポリペプチド−
結合された固形担体と混合し、固及び液相を含有する第
二混合物を形成する。固／液相混合物を、前に未処理の
抗体がポリペプチド抗原と免疫反応するのに十分な時間
維持する。その後液相を、固相から分離する。次いで第
一と命名された抗体と反応する第二の、標識された抗体
の溶液を固相と混合する。典型的な第二抗体は、アルカ
リ−ホスフアターゼ−連結されたヤギ抗−ウサギIgGで
あり、そこで第一と命名された抗体がウサギ中で育成さ
れる。固相及び第二の、標識された抗体溶液から形成さ
れる混合物を、２つの抗体間の免疫反応を生じるのに十
分な時間維持する。その後、固及び液相を分離する。

その後酵素に対する基質、たとえばｐ−ニトロフエニ
ルホスフアートを含有する溶液を、固相と混合する。次
いで前選択された波長（たとえば405ナノメーター）で
の最適密度を、シュードモナス抗原が人体サンプルに存
在するかどうか決定するために、予備測定される時間的
期間を経過し、コントロールの最適密度と比較した後に
測定する。

更に、本発明を次の例によって詳細に説明する。

例1:ポリペプチド合成 シュードモナス線毛たん白の小さいセグメントに相当
するアミノ酸残基配列を有する一連の短い合成ポリペプ
チドを、メリフィールド（Merrifield）、J.Am.Chem.So
c.85:2149−2154（1963）の方法に従って、ホーテン（H
oughten）等、Int.J.Pept.Proc.Res.16:311−320（198
0）によって変化されている様に、ヘックマンモデル990
Bペプチド合成器（ベックマン機器社、バークレイ、カ
ルフォルニア、米国）を用いて合成する。対応するアミ
ノ酸配列のシュードモナス線毛たん白中のペプチド指示
及び位置を以下の表１中に示す。

例2:ポリペプチド−キャリヤーカップリング ペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニンに、
ボビン血清アルブミンでノルロイシンスペーサー及びベ
ンゾフエノン橋かけ基（ベンゾイル安息香酸）から成る
リンカーを介して融合する。リンカーは、ペプチドがま
だ固体マトリックス上にある合成の間ペプチドに添加さ
れる。たん白（3mg）を、試験管内で水10〜20μｌ中
に先ず溶解する。次いでたん白キャリヤー（10mg/100μ
ｌ）を加え、次いで混合する。ペプチドのキャリヤーへ
の共役結合は、４℃で、一時間、RPR−350mmランプを備
えたRPR208分取リアクター（レイオネト（Rayonet）、
ザ、サザンニューイングランドウルトラバイオレットC
o.,ミドルタウン、Conn.）中でUV照射して、ベンゾイル
ベンゾイル基の次の活性化を生じる。非融合ハプテン
を、8M尿素、10mM重炭酸アンモニウム、及び25mM重炭酸
アンモニウムに対して連続透析によって除去する。生成
物を凍結−乾燥する。ペプチド導入を、融合体の小サン
プルの加水分解によって及び残存ノルロイシンの割合
を、ペプチド配列中に見い出されるのでなく、キャリヤ
ー分子の配列中に含有されるアミノ酸と比較して算出す
ることによって決定する。その時この割合は、ペプチ
ド：キャリヤーのモル割合を表わす。約4:1および10:1
のペプチド／キャリヤー割合が酸化及び還元ペプチド夫
々に対して得られる。

例3:抗−ポリペプチド抗体に対するウサギ血清のスクリ
ーニング ウサギ抗−血清を、酵素結合イムノソルベント検定法
（ELISA）によって抗−ペプチド抗体の存在に関してス
クリーニングする。上記例１に記載した様に調製された
ポリペプチド抗原を、マイクロタイタープレートくぼみ
の壁上に吸収させ、固相結合目標抗体を生じる。

コート緩衝液、炭酸ナトリウム、pH9.6中に溶解され
た融合溶液（５μg/m）を使用してマイクロタイター
フレートのくぼみを被覆する。個々のくぼみを、この溶
液120μｌで、湿った空間中で４℃で16時間被覆する。
次いでこのプレートをリン酸塩緩衝液塩類液／トウィー
ンで３回洗滌する。

その後マイクロタイターくぼみ壁上の非−特異的結合
部位を、４時間37℃で湿った空間中で夫々のくぼみ中の
３％（w/v）BSA/PBS50μｌをインキュベートして、ブロ
ックする。インキュベートの後、過剰のBSAを、プレー
トをさかさにし、振とうして除く。その非−特異的結合
部位がブロックされた固体担体に結合されたポリペプチ
ドを、かくして目的抗原として使用することできる。

抗−ポリペプチド抗体の存在に関してウサギ血清を検
定するために、夫々の血清の一部を１％（w/v）BSA/PBS
中で連続的に10倍希釈する。希釈液夫々の100マイクロ
リットルを、上記調製された適当なマイクロタイターク
ボミ中の混合物によって固相結合ポリペプチドと接触さ
せる。接触を湿った空間中で約２時間37℃でくぼみをイ
ンキュベートして維持し、血清希釈液中に存在するすべ
ての抗−ポリペプチドを、固相結合されたポリペプチド
ターゲット抗原と免疫反応させる。インキュベーション
の後に、くぼみにリン酸塩緩衝された塩類溶液／トウィ
ーンを満たし、さかさにし、連続して３回振とうして固
及び液相を分離する。

抗−ポリペプチド抗体及び固−相抗原の免疫反応の存
在を検出するために、リン酸塩緩衝された塩類溶液／ト
ウィーン中でアルカリホスフアターゼで標識されたヤギ
抗−ラビットIgGの1:1000希釈液100μｌ（ベーリンガー
・マンハイムバイオケミカルス、インデアナポリス、イ
ンディアナ）を、夫々のくぼみに加え、約２時間室温で
湿った空間中でインキュベートする。くぼみを３回リン
酸塩緩衝された塩類溶液／トウィーンで連続して洗滌す
る。10％ジエタノールアミン1m中にｐ−ニトロフエニ
ルホスフアート1mgを含有する基質溶液（50μｌ）、pH
9.8を夫々のくぼみに加え、反応を室温で約45〜60分間
続ける。指示反応（発色現像）の量を405nmで夫々のく
ぼみの吸光度を測定によって計る。上記背景の0.05単位
である吸光度を示すウサギ抗血清を測定し、その結果を
表２中にまとめる。

表 ２ 終点力価−ペプチド複合体に対するウサギ抗血清を用い
る直接エライサ（Elisa）指示^１ ペプチド−複合体力価 17−R1 3.5×10−６ 17−R2 6.1×10−６ 17−O1 4.5×10−６ 17−O2 2.1×10−６ １ ４匹の異なるウサギから由来する抗血清 ２ 上記使用されたＲは、還元ペプチドに対して産出さ
れた抗血清に相当する。

３ 上記使用されたＯは、酸化ペプチドに対して産出さ
れた抗血清に相当する。

例4:抗−線毛抗体に対するウサギ血清のスクリーニング
ウサギ抗血清を、直接酵素−連結免疫吸収検定法（ELIS
A）を用いて、２つの菌株、PAK及びPAOから単離された
シュードモナス線毛に結合することでスクリーニングす
る。線毛を、バランチーチ（Paranchych）等、Can.J.Mi
crobiol.（1979）25:1175−1181に記載され及び例５中
に記載されている様に単離し、精製する。被覆緩衝炭酸
ナトリウム、pH9.6中に溶解された線毛の溶液５μg/m
を使用して、マイクロタイタープレートのくぼみを被覆
する。個々のくぼみを、本発明120μｌで湿った空間中
で４℃で16時間被覆する。次いでこれのプレートを３回
リン酸塩緩衝された塩類溶液／トウィーンで洗滌する。

したがってマイクロタイターくぼみ壁上の非−特異結
合部位を、３％（w/v）BSA/PBS50μｌを夫々のくぼみ中
で４時間37℃で湿った空間中でインキュベートして、ブ
ロックする。インキュベーションの後、過剰BSAを、プ
レートをさかさにし、振とうして除去する。その非−特
異結合部位がブロックされた固形担体に結合されたポリ
ペプチドは、ターゲット抗原として使用することができ
る。

抗−ポリペプチド抗体の存在に関してウサギ血清を検
定するために、夫々の血清の一部を、１％（w/v）BSA/P
BS中に10−倍連続して希釈する。夫々の希釈液100マイ
クロリットルを、上記調製された適切なマイクロタイタ
ーくぼみ中での混合物によって固相結合されたポリペプ
チドと接触させる。接触をくぼみを約２時間37℃で湿っ
た空間中でインキュベートして維持し、血清希釈液中に
存在する抗−ポリペプチドと固相結合ポリペプチドター
ゲット抗原と免疫反応させる。インキュベージョン後、
くぼみにリン酸塩緩衝された塩類溶液／トウィーンを満
たし、さかさにし、３回連続して振とうして固及び液相
を分離する。

抗−ポリペプチド抗体及び固−相抗原の免疫反応の存
在を検出するために、リン酸塩緩衝された塩類溶液／ト
ウィーン中でアルカリホスフアターゼで標識されたヤギ
抗−ラビットIgGの1:1000希釈液100μｌ（ベーリンガー
・マンハイムバナオケミカルス、インデアナポリス、イ
ンディアナ）を、夫々のくぼみに加え約２時間室温で湿
った空間中でインキュベートする。くぼみを３回リン酸
塩緩衝された塩類溶液／トウィーンで連続して洗滌す
る。10％ジエタノールアミン1m中にｐ−ニトロフエニ
ルホスフアート1mgを含有する基質溶液（50μｌ）、pH
9.8を夫々のくぼみに加え、反応を室温で約45〜60分間
続ける。指示反応（発色現像）の量を405nmで夫々のく
ぼみの吸光度を測定によって計る。上記背景の0.05単位
である吸光度を示すウサギ抗血清を測定し、その結果を
表３中にまとめる。

例5:線毛の精製 使用される精製処理は、パランチヒ（Paranchych）
等、Can.J.Microbiol.（1979）25:1175−1181によって
すでに開示されている。細菌を、上述の様な大きいパン
中で固体倍地上で増殖し、次いで寒天の表面をこすり、
SSC緩衝液1000m中に、36トレー（約10g含水重量）か
らの細胞を懸濁して採取する。次いで細胞を、５℃で２
時間磁気攪拌機で攪拌する。寒天の大きい細片を、ふる
いに懸濁液を通過させて除き線毛を細胞から、ソーバル
オムニミキサー（Soruall Omnimixer）で2000rpmで２分
間割合200m中に混合して除去する。10,000×ｇで15分
間遠心分離して細菌を除去した後、上澄みNaCl濃度を、
0.5Mに調整する。次いでポリエチレングリコール6000
（PEG6000）を、１％w/vの最終濃度に加え、溶液を18時
間４℃で放置する。線毛及びべん毛ともにこの条件下で
沈殿させ、7000Xgで20分間遠心分離して除去する。べん
毛の除去のために、ペレットを10％w/v（NH₄）₂SO₄溶液
（pH4.0）中に懸濁し、４℃で２時間放置する。線毛が
これらの条件下で沈殿させ、一方べん毛を懸濁液中に残
存する。残存べん毛を硫酸アンモニウム沈殿工程をくり
返して除去する。最終ペレットを、水中に再溶解し、徹
底的に透析して（NH₄）₂SO₄を除き、次いでCsCl密度勾
配遠心分離する。後者の処理は、CsCl密度が1.1から1.5
に及ぶ実施工程勾配16m上に線毛溶液20mを重層する
ことを伴う。ベックマンL2−65B超遠心分離を用いてSW2
7ローター中で20,000rpmで20時間の遠心分離後、線毛じ
ん帯（約1.3g/cm³の浮遊密度）を除き、次いで第二CsCl
密度勾配遠心分離工程にゆだねる。線毛じん帯を第二Cs
Cl勾配から除き、透析してCsClを除いた後、線毛を蒸留
水中に再懸濁し、60−Ti固定角ローター中で２時間50,0
00rpmで反復遠心分離して洗滌する。調製物のSDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動検査が強く過負荷されたサン
プルの単一たん白べん毛（サンプルにつき10μｇ線毛）
を示す時、線毛を純粋と判定する。

例6:ウエスタンブロット検定法 更に、ウサギ抗血清を、シュードモナス線毛たん白と
免疫反応するその可能性を測定するために、ウエスタン
ブロット検定法でスクリーニングする。シュードモナス
線毛たん白を、例５に記載した様に菌株PAK及びPAOから
単離する。ナトリウムドデシルスルフアート−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を、ラエミリ（Laemmli）法に
従って15％ポリアクリルアミドを用いてゲルが流動する
ことによって実施する。精製された線毛（５μｇ）及び
全−細胞溶菌液（３×10⁷細菌）を使用する。全−細胞
溶菌液を、ナトリウムドデシルスルフアート−ポリアク
リルアミドゲル上に載せられるたん白を溶解するのに使
用されるサンプル緩衝液100μｌ（0.25Mトリス中に2.5
％ナトリウムドデシルスルフアートpH6.8）中で２ない
し３分間PAK細胞を沸とうして調製する。次いで混合物
を、ベンチ−トップマイクロフュージ（benshtop Micro
fuge）上で遠心分離する；上澄10μｌを除き、ゲル上に
載せる前にサンプル緩衝液15μｌで希釈する。分離後、
たん白をトービン（Towbin）等、P.N.A.S.（USA）（197
9）76:4350−4354に従ってニトロセルロース紙上に２な
いし６時間0.2Aでトランスブロットする。ニトロセルロ
ースシートの過剰たん白−結合能力を５％ゼラチン溶液
（トリス緩衝された塩類溶液100m、トリスmM、NaCl50
0mM中の59ゼラチンpH7.5）で１時間室温でブロックす
る。次いでニトロセルロースシートを、トリス緩衝され
た塩類溶液中で0.05％トウィーン−20で２回洗滌する。
次いでシートをトウィーン−20を含有するトリス緩衝さ
れた塩類溶液中で、１％ゼラチンで希釈された抗ペプチ
ド抗血清（1:250）で、室温で16時間処理する。過剰の
血清を、トウィーン20を含有するトリス緩衝された塩類
溶液で２回洗滌して除去する。線毛べん毛を、トウィー
ン20を含有するトリス緩衝された塩類溶液中で１％ゼラ
チンで3000−倍に希釈されたヤギ抗−ウサギIgGアルカ
リホスフアターゼ融合体を使用して、イムノアッセイキ
ット（バイオラドラボラトリー、リッチモンド、カリフ
オルニア）で検出する。この融合体とのインキュベーシ
ョンを室温で１時間実施する。過剰融合体を、トウィー
ン20で含有するトリス緩衝された塩類溶液で２回洗滌
し、次いでトリス緩衝された塩類溶液単独で１回洗滌し
てシートから除去する。免疫反応成分を、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフアートトルイジン塩
の存在下にｐ−ニトロブルーテトラゾリウムクロライド
を用いて検出する。免疫反応成分は、紫赤バンドとして
表われる。その結果を表４中に示す。

例7:類側上皮細胞調製 BEC'Sを、10人の健康なタバコを吸ない男性ボランテ
ィアから、頬の内側上をやさしくこする木製適用スティ
ックによって、頬につき３つの木製適用スティックで集
める。これらのスティックを、静かに相互にリン酸塩緩
衝された塩類溶液30m中でこすり、BEC'Sを懸濁する。
これらの細胞を、３回リン酸塩緩衝された塩類溶液30m
で洗滌し、引き続き遠心分離（650×ｇスピン）し再
懸濁する。最終ペレットを、pH7.2でリン酸塩緩衝され
た塩類溶液5m中で懸濁する。この懸濁液を濾過し（前
もって湿らせた70μｍナイロンメッシュ）、細胞をpH7.
2でリン酸塩緩衝された塩類溶液中で２×10⁵細胞/mの
最終濃度に希釈する。この懸濁液を使用するまで４℃で
保存する。

例8:気管上皮細胞調製 ヒトの繊毛のある気管上皮細胞（TECs）を、フランク
リン（Franklin）等、感染及び免疫（1987）55、1523−
1525に記載されている様に、気管支粘膜の気管支鏡ブラ
シングによって、トロントジエネラル病院で外科の集中
治療室の患者から得る。

TECsは、外科の患者（全身麻酔下）、挿管された集中
治療室（ICU）の患者、及び健康なボランティアから気
管支鏡法によって得られる。

外科の及びICUの患者に関して、気管支鏡法を気管内
チューブを通して挿入される柔軟なオンパスタイプ2BF
気管支鏡で行う。細胞診断ブラシを、気管−気管支粘膜
をすり取るのに使用し、TECsを、１％クエン酸ナトリウ
ムを含有する、高−グルコースダルベコ（Dulbecco）変
性されたイーガル（Eagle）培地中に集める。

気管支鏡法によって得られた細胞懸濁液は、粘液、赤
血球、顆粒球、細胞汚物の種々の量に加えて、繊毛のあ
る及び繊毛のない立方体及び円柱の上皮細胞ともに含有
し、付着検定法に直接使用するには不適当である。細胞
懸濁液を、簡単に渦動し、連続的に70−及び30−μ−穴
−サイズ−ヌッシュナイロンスクリーンを通過させ、２
回0.01Mリン酸塩−緩衝された塩類溶液（pH7.2）（PB
S）で洗滌（500×ｇ、15分間４℃）し、次いでPBS1m
中に再懸濁する。次いで細胞懸濁液を、PBS−実施され
る（48,000×ｇ、40分間４℃）65％（容量／容量）パコ
ール勾配で密度勾配遠心分離（15分間４℃でスウィンギ
ングバケットローター中で500×ｇ）によって分画す
る。TECバンドを集め、第二パーコール勾配に付与す
る。繊毛のあるTBCバンドを、第二勾配から集め、細胞
を一度PBS中で洗滌し、次いでPBS1.5m中で再懸濁す
る。直接細胞カウントを、血球計算機で行う；細胞生存
度をトリパンブル−青染料排他律によって決定する。細
胞分画処理は主として（2.08±0.34）×10⁵細胞（平均
±標準誤差）を生じ、そのうち32.8±6.5％は繊毛のあ
るTECsである。これらの細胞の大多数は生存し、多くの
場合繊毛はまだ動く。上皮細胞だけ含有する分画された
TECsは、実質上汚染する粘膜がなく、直接付着検定法に
使用される。

例9:BECsに結合するPAK128−144 免疫検定法を、PAK128−144red及びPAK128−144oxのB
ECsへの結合を評価するために行う。BECs（2.0×10⁵BEC
s/mで0.2m）を、PBS中の合成ペプチドの等容量（0n
mol/mないし120nmol/m）に加え、37℃でインキュベ
ートし、300rpmで攪拌する。１時間後、BECs遠心分離
（13,000Xg2時間、室温）して集め、５回PBSで洗滌す
る。モノクロナール抗体PK99H（力価10⁶を有する精製さ
れたIgGのPBS中で10^-3希釈0.2m）を、BECペレットに
加え、上記の様に１時間インキュベートする。次いでBE
Csを遠心分離（13,000Xg2分間室温）して集め、５回PBS
で洗滌する。ヤギ抗−マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）免疫グロブ
リンＧ−パーオキシダーゼ融合体（ジャクソン研究所）
を、BECペレット（PBS中で1:1000希釈0.2m）に加え、
混合物を上述の様に１時間インキュベートする。BECsを
遠心分離（13,000Xg、２分間室温）して集め、５回PBS
で洗滌する。ペレットを、クエン酸塩緩衝液pH4.2±0.0
3％パーオキサイド中の1mM ABTS（2,2′−アジノ−ジ−
（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）0.2−ｍ
中に懸濁し、きれいなチューブ中に移す。セイヨウワサ
ビパーオキシダーゼ酵素反応を、4mM NaN₃0.2mの添加
を止め、405nmで光学的密度を、遠心分離によってBECs
の除去後測定する。夫々のチューブ中のBEC濃度を、遠
心分離によるBECsの除去前に検定の最後に血球計算機で
測定する。結果を第１図中に示し、そこにはヒトBECsへ
の合成ペプチドAc17red（■）と合成ペプチドAc170x
（＋）の結合をプロットする。Ac17red及びAc170Xは夫
々、残基128から残基144すべての基準シユードモナス線
毛たん白の配列から成る、還元及び酸化合成17−merペ
プチドに相当する。BECsへの合成ペプチドの結合を、全
細胞ELISA検定法によってモノクロナール抗体PK99H（こ
れはAc17px及びAc17redに結合する）を用いて、BECsの
表面に結合する合成ペプチドの量を定量して測定する。

例10:BECsへの線毛のPAK128−144抑制 免疫検定法を、BECsに結合する線毛上のPAK128−144r
edの作用を評価するために行う。BECs（2.0×10⁵BEC/m
で0.2m）及び合成ペプチドPAK128−144red（合成ペ
プチドの0,40,80又は120nmol/mの最終濃度が得られる
0.1m）を、30分間室温で前もってインキュベートす
る。次いで線毛（０μg/mないし100μg/mの0.1m
）を、合成ペプチドの濃度を変化させて（120nmol m
に対して0,40,80）、BECsに添加する。次いで混合物
を300rpmで撹拌しながら２時間37℃でインキュベートす
る。次いでBECs及び結合した線毛を、遠心分離（13,000
xg 2分間）して集め、５回PBSで洗滌し、非結合線毛を
除去する。次いでモノクロナール抗体PK3B（PBS中−10⁴
希釈0.1m）（この抗体はPAK線毛を認識するが、合成
ペプチドPAK128−144と反応する）を、BECsに結合した
線毛と共に加え、１時間上述の様にインキュベートす
る。免疫検定法の他の部分は、BECsに結合する線毛に対
して記載したのと同じである。結果を第２図中に示し、
そこにはヒトBECsへの合成ペプチドAc17red（■）及びA
c17ox（＋）の結合の変化されたラインウィーバー−バ
ークプロットをプロットし、及び第３図中、そこには合
成ペプチドAc17redの０（Ｘ）,40（Ｘ）,80（Ｄ）及び1
20（）mmol/mの存在下でヒトBECsへのPAK線毛の結合
の変化されたラインウィバー−バークプロットをプロッ
トする。

例11:TECsに結合する線毛及びPAK128−144 TECs（１×10⁵細胞/mの0.1m）を等容量のPAK線毛
（345g/m）、PAK128−144red（10nmol/m）、PAK128
−144OX（50nmol/m）又はPBSと混合する。次いでTECs
を遠心分離（6,000xg1分間、室温）して集め、３回PBS
で洗滌する。抗−線毛モノクロナール抗体PK3B（PBS中
で力価10⁸を有する精製されたIgGの10^-4希釈の0.1m）
又はモノクロナール抗体PK99H（PBS中で力価10⁶を有す
る精製されたIgGの10^-3希釈0.1m）を、線毛又は合成
ペプチドPAK128−144red及びPAK128−144ox夫々と共に
インキュベートされたTECsに加える（PK3Bは線毛結合活
性なしにPAK線毛と反応するが、PK3BはPAK128−144red
又はPAK128−144oxのどちらとも反応しない）。コント
ロール調製物は、モノクロナール抗体PK3B及びPK99H及
び線毛及び合成ペプチドの存在なしにPBS中でインキュ
ベートされたTECsを含む。ウサギ抗−マウスIgG、PBS
（1/100希釈0.1m）中でフルオレッセンイソチオシア
ナート（セダーレーン研究所）に融合されたIgG（Ｈ＋
Ｌ）親和性精製されたIgGを、洗滌されたTECs調製物に
加え、30分間37℃でインキュベートし、300rpmで撹拌す
る。TECsを３回上述の様に洗滌し、PBS0.1m中に再懸
濁する。湿ったマウントを調製し、MPS4カメラシステム
を備えたライツレーバーラックス（Leitz Laborlux）を
用いて、エピフルオレッセン及び位相差顕微鏡によって
調べる。写真をコダョクＴ−Maxフィルムを用いて撮
る。結果を第４図中に示し、そこには分画された繊毛の
あるTECsに結合するPAK線毛の間接的 免疫蛍光局在化
Ａ）結合したPAK線毛を有するTECの位相差顕微鏡;B）A,
C及びＤで位相差顕微鏡によって可視化された同一の繊
毛のあるTECsの細胞質膜の線毛及びルミナール部分に第
一に結合されたPAK線毛の免疫蛍光マイクログラフは、P
AK線毛に触れるのではなく、モノクロナール抗体PK3B及
びFITCを融合した抗−マウスに触れたコントロールTEC
の位相差イメージ及び免疫蛍光イメージである。更に結
果を第５図中に示し、そこで合成ペプチドAc17ox（Ａ及
びＢ）及びAc17red（Ｃ及びｄ）のヒト繊毛のあるTECs
への結合の間接免疫蛍光局在化を示す。マイクログラフ
Ｅ及びＦは、合成ペプチドに触れたのではなく、モノク
ロナール抗体PK99H及びFITCを融合した抗−マウスIgGに
触れたコントロール調製物である。図A,C及びＥ図B,D及
びＦ中に免疫蛍光顕微鏡によって可視される同一細胞の
位相差マイクログラフである。合成ペプチドAc17ox及び
Ac17redともにTECsの細胞質膜の線毛及びルミナール部
分に第一に結合することを注目したい。TECsへのAc17ox
の明白な、制限された結合は、ペプチドの還元形に比し
てペプチドの酸化形がモノクロナール抗体PK99Hにより
小さい親和性を示すためである。

例12:BECブロットへのPAK128−144結合 ラエンリ（Laemmli）及びファブレ（Favre）、J.Mol.
Biol.（1973）80:575−599によって記載された非連続の
ナトリウムドデシルスルフアートポリアクリルゲル電気
泳動（SDS−PAGE）を使用する。BECsのSDS−PAGEを８％
アルリルアミドゲルを用いて上記の様に行う。BECs（２
×10⁵細胞/m）を、0.625mMトリス緩衝液pH6.8中の100
℃で15分間、２％（重量／容量）SDS、５％（容量／容
量）β−メルカプトエタノール、10％（容量／容量）グ
リセロール中に溶解する。溶解されたBECs（25μｌ）を
ゲル上に載せ、20mA/ゲル（一定電流）で電気泳動す
る。電気泳動で分離された物質をトーウビン（Towbin）
等、P.N.A.S.（U.S.A）（1979）76:4350−4354によって
記載されている様に電気泳動トランスフアーによってニ
トロセルロース（シュラヒヤー＆シウエル）に移す。ト
ランスフアーニトロセルロースブロットを:50mMトリス
緩衝液pH7.5中の３％（重量／容量）BSA、0.25％（重量
／容量）ゼラチン、0.1％（容量／容量）正常ウサギ血
清、0.05％（容量／容量）ノニデットＰ−40、5mM EDT
A、150mM塩化ナトリウムで37℃で少なくとも３時間ブロ
ックする。

使用する前に、ブロットをPBSで洗滌する。次いでブ
ロットを、PAK128−144red（０ないし20nmol/m）で37
℃で100rpmで振とうしてインキュベートする。２時間
後、ブロットを３回BBBB（TTBS）（洗滌する。マウスモ
ノクロナール抗体PK99H（TTBS中の10^-4希釈）（このモ
ノクロナール抗体は、PAK128−144合成ペプチドを認識
する。）を、ブロットで37℃で１時間100rpmでインキュ
ベートする。次いでブロットを３回TTBSで洗滌する。TT
BS中のヤギ抗−マウスIgG（Ｈ＋Ｌ）免疫グロビン−ア
ルカリホスフアターゼ融合体（ジャクソン研究所）を加
え、上述の様に１時間インキュベートする。ブロットを
３回TTBSで、１回トリス緩衝された塩類溶液で洗滌す
る。100mMトリス緩衝液pH9.5中の0.33mg/mニトロブル
ーテトラゾリウムクロライド、0.165mg/m５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−ホスフアート、100mM
塩化ナトリウム、5mM塩化マグネシウムから成る基質溶
液（NBT/BCIP）を加え、蒸留水中でブロットを洗浄して
発色現像を止める。結果を第４図中に示し、そこでニト
ロセルロース上で、PAK線毛及び合成ペプチドAc17redの
ブロットされたBECたん白への結合をプロットする。合
成ペプチドの免疫たん白への結合を、標準イムノブロテ
ィング法に従って、モノクロナール抗体PK99H（又はPAK
線毛に対するモノツロナール抗体PK3B）を用いて評価す
る（BSAを用いるニトロセルロースの次のブロック）。1
50μg/m（レーン１）でPAK線毛、20（レーン２）、10
（レーン３）、５（レーン４）又は０（レーン５）nmol
/mでAc17redを、ブロットされたBECたん白とインキュ
ベートする。Ac17red（レーン６）又は緩衝液（レーン
７）20nmol/mでインキュベートする前にBECたん白を3
0mM過ヨウ素酸塩にさらして酸化し、次いで水素化ホウ
素で還元する。最初に20mmol/mでAc17redとモノクロ
ナール抗体PK99HのFabフラグメント100μg/m（これは
合成ペプチドAc17redに結合する）（レーン８）を反応
させる又は合成ペプチドAc17redに結合しないモノクロ
ナール抗体PK41CのFabフラグメント100μg/m（レーン
９）を反応させる。アミドブブックはBECたん白を着色
する（レーン10）。標準分子量マーカーは、アミドブラ
ックで着色する（レーンＳ）。

例13:BECブロットの過ヨウ素酸塩酸化 BECブロットの化ヨウ素酸塩酸化（30mM過ヨウ素酸塩
酸化）及び次いで水素化ホウ素カリウム還元を、ウッド
ワード（Woodward）等、J.Immunol.Meth.,78:143−153
（1985）によって記載されている様に行う。酸化−還元
の１又は２サイクルを前もってブロックされたブロット
上で行う。ブロットを、例12で上述した様に合成ペプチ
ド結合に関して評価する。また結果を第４図中に示す。

例14:BECsへの線毛結合の抑制 PBS中の種々の合成ペプチド−BSA融合体に特異的な親
和性精製IgGのFabフラグメントの等容量（0.3−0.61mg/
mで0.1m）を、精製APK線毛（100μg/mで0.1m）
に加え、室温で30分間インキュベートする。このBECs
（2.0×105BECs/mで0.2m）を添加し、混合物を37℃
でニューブルスヴィックグリロシエーカー（New Brunsw
ick gyroshaker）中で300rpmで振とうしながらインキュ
ベートする。２時間後BECsを遠心分離（13000xg2分間）
して集め５回で洗浄する。モノクロナール抗体PK3B（PB
S中で10−４希釈0.2m）を、BECペレットに加え、上述
の様に１時間インキュベートする。次いでBECsを遠心分
離によって集め５回PBSで洗滌する。ヤギ抗−マウスIgG
Fc−特異性免疫グロブリンＧ−パーオキシダーゼ融合
体（ジャクソン研究所）を、上述の様に30分間インキュ
ベートされた混合物に加える。BECsを、遠心分離によっ
て集め５回PBSで洗滌する。ペレットを、クリン酸塩緩
衝液pH4.2＋0.03％パーオキシド中のABTS（2,2′−アジ
ノ−ジ−（３−エチルベンチアゾリンスルホン酸））0.
2m中に再懸濁し、きれいなチューブ中に移す。反応を
4mM NaN₃0.2mの添加によって止め、405nmでの光学的
密度を、遠心分離によってBECsの除去後測定する。夫々
のチューブ中のBEC濃度を、遠心分離によってBECsの除
去後測定する。夫々のチューブ中のBEC濃度を、遠心分
離によってBECsの除去前の検定の最後に血球計算機で測
定する。

例15:FABフラグメントの調製 Fabフラグメントを、固定化パパイン（Pierce）を用
いて調製する。簡単に親和性精製された抗体を20mMリン
酸ナトリウム緩衝液pH6.2中の20mMシスティンHCl、20mM
テトラゾジウムエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）に
対して透析する。抗体（約2mg抗体を含有する1m）
を、固定化パパイン0.5m中に加え、37℃で20時間150r
pmで振とうしながらインキュベートする。固定化パパイ
ンを遠心分離して除去し、Fabフラグメントを含有する
上澄液をPBS1mで希釈する。FabフラグメントをPBSで
溶離されたたん白Ｇカラムを用いてHPLCで精製する。Fa
bフラグメントを、流れを通して集め、一方。Fcフラグ
メントを、グリシン10mMpH2.75を有するカラムから溶離
する。Fabフラグメントを、透析管（分子量遮断＜800
0）中でFab溶離液を入れ、ポリエチレングリケール（分
子量15,000−20,000）を用いて透析サックから液体を抽
出して、濃縮する。次いでフラグメントをPBSに対して
透析する。Fabの活性をELISAによって調べ、FABの製造
がSDS−PAGEによって確認される。

例16:PAK線毛上のPAK線毛のアミノ酸配列に対応して合
成ペプチド融合体へのFABフラグメントの作用 ヒト頬側細胞（BECs）への結合 Fabフラグメントを、BECsの添加（１×105細胞/m最
終濃度）及び線毛結合をモノクロナール抗体PK3Bを用い
て検出する前に線毛と前もってインキュベートする。す
べてのFabsを、PAK線毛に対してELISAによって測定され
るその最終力価が103である様に希釈する。結果を第７
図中の棒グラフに示す。棒グラフは、PAK線毛のＣ−末
端以外の領域に対して製造されるFabフラグメントが、B
ECsに結合する線毛を妨害するのに無効であることを例
示する。最も有効なフラグメントは、r1、r2、o1及びo2
であって、線毛結合をコントロール及び前免疫血清の40
％ないし70％に減少させる残基128−144に関する。これ
は、このＣ−末端領域にも関係する抗−PAK線毛モノク
ロナール抗体PK99Hから製造されるFab99Hによって示さ
れる作用と類似する。このグラフは、Ｃ−末端ループ領
域、残基128−144がBECsに結合する線毛に特異的に関係
すること例示するのを助ける。第７図に適用できる説明
は、次の通りである:22＝残基22−33に対して製造され
たFebフラグメント、41＝残基41−49に対して製造され
たFabフラグメント、58＝残基58−70に対して製造され
たFebフラグメント、75＝残基75−84に対して製造され
たFabフラグメント、89＝残基89−99に対して製造され
たFabフラグメント、107＝残基107−116に製造されたFa
bフラグメント、117＝残基117−125に対して製造された
Fabフラグメント、r1＝還元状態にシスティン残基を有
する残基128−144に対して製造されたFabフラグメン
ト、r2＝還元状態にシスティン残基を有する残基128−1
44に対して製造されたFabフラグメント、o1＝酸化状態
にシスティン残基を有する残基128−144に対して製造さ
れたFabフラグメント、o2＝酸化状態にシスティン残基
を有する残基128−144に対して製造されたFabフラグメ
ント、Pre＝前免疫された血清から製造されたFabフラグ
メント、99H＝抗−PAK線毛モノクロナール抗体PK99Hか
ら製造されたFabフラグメント、Cont＝添加されるFabフ
ラグメントなし。

本発明の好ましい実施態様は、ここに詳細に記載する
が、当業者によって本発明の意図又は付随の請求の範囲
から離脱することなく変化させることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー・コーク・ケィ カナダ国、アルバータ、ティー６ジェィ ２ジェィ９、エドモントン、ユニバー シティ・ホール、１―３ (72)発明者 パラミ・サストリー・エィ カナダ国、アルバータ、ティー６ジェィ ４ゼット２、エドモントン、ストリー ト、2451―115 (72)発明者 アービン・ランダール・ティー カナダ国、オンタリオ、エル５エル ２ シー２、ミッシスサウガ、フェゼント・ ラン、411 (72)発明者 ドィグ・ピーター・シー カナダ国、オンタリオ、エム４ワィ １ アール５、トロント、アプト1612、チャ ールス・ストリート・ウエスト、30 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 7/08 A61K 39/00 G01N 33/569 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 から成る群から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド
   に於て： （ａ）２個のCys（Ｃ）残基の間でジスルフィド連結； （ｂ）ヒト頬側又はヒト気管上皮細胞に特異結合； （ｃ）ヒト頬側細胞に結合する緑膿菌線毛を抑制するこ
   とができる抗体の産生を刺激する能力によって特徴づけ
   られる上記ペプチド。
2. 【請求項２】次の配列： のうち１つを有する、請求の範囲１記載のペプチド。
3. 【請求項３】（ｉ）−（iii）配列のうち１つを有す
   る、請求の範囲１記載のペプチド。
4. 【請求項４】（Ａ） から成る群から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド
   に於て： （ａ）２個のCys（Ｃ）残基の間でジスルフィド連結、 （ｂ）ヒト頬側又はヒト気管上皮細胞に特異結合、及び （ｃ）ヒト頬側細胞に結合する緑膿菌線毛を抑制するこ
   とができる抗体の産生を刺激する能力よって特徴づけら
   れる上記ペプチド；及び （Ｂ）ペプチドを保持する滅菌生物適合媒体から成る、
   シュードモナス感染に対するワクチンとして使用するた
   めの薬学的組成物。
5. 【請求項５】次の配列： のうち１つを有する、請求の範囲４記載の薬学的組成
   物。
6. 【請求項６】ペプチドを結合する免疫原キャリヤーを更
   に含む、請求の範囲４記載の薬学的組成物。
7. 【請求項７】ペプチドは、ヒト頬側細胞に結合する緑膿
   菌線毛を抑制することができる抗体の産生を刺激するこ
   とができる、シュードモナス感染に対するワクチンとし
   て使用するための、請求の範囲４記載の薬学的組成物。
8. 【請求項８】システムが（ａ） から成る群から選ばれたアミノ酸配列を有するペプチド
   によって、動物宿主中で誘発されるレセプター分子；及
   び（ｂ）上記レセプター分子と線毛たん白との免疫反応
   をシグナルすることができる指示手段から成る、緑膿菌
   線毛たん白検定に適する、検定法。