JP2958444B2 - 脂肪酸の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、脂肪酸アルコールエス
テルを分解して脂肪酸を生産する方法であり、油化学工
業、医薬品工業等に広く応用できるものである。

【０００２】

【従来の技術】油脂の分解反応は、水と油の反応であり
本来混じり難くしかも酵素反応が可能な状態においては
油脂は粘性を帯び、二相に分かれてしまい反応し難いも
のである。油脂をアルコールエステル化すると、脂肪酸
が劣化しにくくなり、かつ粘度及び沸点が低下するため
に分別蒸留及び輸送に好適となる（T.Ogoshi等、JAOC
S，62，331(1985))。従って、この脂肪酸アルコールエ
ステルは石油代替燃料（バイオジーゼル燃料）としても
注目されている。脂肪酸アルコールエステルは、脂肪酸
よりも疎水性であるために、親水性基と反応する際ある
いは石鹸（脂肪酸アルカリ）をつくる際には、120℃付
近で鹸化する鹸化槽を必要とする。また、脂肪酸アルコ
ールエステルより脂肪酸を製造するためには、鹸化した
ものを酸性下で溶媒抽出しなければならない。油脂より
脂肪酸を得るプロセスを常温常圧で化学的に進行する脂
肪酸アルコールエステル化（アルコリシス）と組み合わ
せるためには、酵素的分解法が好適である。酵素による
エステル分解の試みはあるが、基質特異性を調べる過程
でバッチ式に検討したものであって、生産物と未反応物
を反応液から分離するために複雑な操作が必要である。
したがって、この方法を連続化された効率的な油化学プ
ロセスに組み込むのは難しいものであった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、粘性
を有する油脂に代えて粘度及び沸点の低い脂肪酸アルコ
ールエステルを原料として、これを常温常圧で反応する
バイオリアクターに連続的に供給して、反応生成物であ
る脂肪酸を連続的に得る脂肪酸アルコールエステル分解
法及びこの方法を用いた脂肪酸の製造方法を供給する。
そのために基質である脂肪酸アルコールエステルをリア
クター内に滞留させながら、同時に生産物である脂肪酸
を特異的に排出させる方法を開発し、本発明を完成する
に至った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、脂肪酸アルコ
ールエステルを極性溶媒含有水溶液に混合し、該極性溶
媒含有水溶液中の脂肪酸アルコールエステルを、疎水性
の担体に陰イオンを導入した陽イオン交換体であって且
つアルコール耐性リパーゼを固定した陽イオン交換体に
吸着させて分解し、分解されて生成した脂肪酸を前記極
性溶媒含有水溶液中に排出することを特徴とする脂肪酸
の製造法である。上記アルコール耐性リパーゼとして
は、バチルス属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属
あるいはクロモバクテリウム属に属する微生物由来のも
のが挙げられる。

【０００５】

【発明の実施の態様】本発明に使用するリパーゼは、脂
肪酸アルコールエステル特にメチルエステル及びその分
解物であるメタノールに耐性を有するアルコール耐性リ
パーゼであって、脂肪酸アルコールエステルの分解性の
良いものが用いられる。このアルコール耐性リパーゼ
は、バチルス属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属
あるいはクロモバクテリウム属等の細菌、糸状菌、酵母
等の微生物に由来するものが挙げられる。もし、これら
微生物由来のリパーゼであって、そのような性質を欠い
ているリパーゼについては蛋白工学あるいは分子進化工
学的に改質したものを用いても差し支えない。

【０００６】このアルコール耐性リパーゼとしては、後
述する本発明者等が土壌中より分離したアスペルギルス
・ニガーＭ２、ミクロコッカス属の細菌Ｍ６及びバチル
ス・メガテリウムＭ８の産生するアルコール耐性リパー
ゼ、市販のクロモバクテリウム・ビスコサム由来のリパ
ーゼ LP(CE)(旭化成製) 等が挙げられる。

【０００７】本発明者らはオレイン酸メチルを炭素源と
して土壌中より分離した多くの菌株の中から、オレイン
酸メチル及び発色試薬のローダミンを含む寒天培地上で
分解活性の高いハローを形成する16株を選択した。そし
て、そのうち分解活性が極めて高い、Ｍ８、Ｍ６及びＭ
２の３株についその分類学的位置を同定した。

【０００８】すなわち、この第１の微生物、Ｍ８株は次
の菌学的性質を有する。。桿菌、グラム染色陽性、胞子
（楕円形、中立−亜端立、非膨出）、運動性陽性、好気
性、カタラーゼ陽性、嫌気下で生育せず、Ｖ−Ｐ反応陽
性、グルコースからの酸の生成陽性、グルコースからの
ガスの生成陰性、ゼラチン分解陽性、澱粉分解陽性、ク
エン酸の利用陽性、プロピオン酸の利用陰性、卵黄反応
陰性、硝酸銀の還元陰性、pH8で生育（ニュートリエン
トブロス）陽性、pH5.7で生育陰性、5℃で生育陰性、10
℃で生育陽性、40℃で生育陽性、50℃で生育陰性、菌体
内DNAのGC含量39(mol%)であり、バチルス・メガテリウ
ム（Bacillus megaterium) と同定された。

【０００９】このバチルス・メガテリウムに属するＭ８
株は平成９年２月４日に工業技術院生命工学工業技術研
究所にFERM P-16061として寄託されている。本菌が産生
するリパーゼは、55℃、pH2.38付近に最適条件を持ちア
ルコール耐性であって高濃度のメチルエステルを分解す
る能力を有する優れたものであった。

【００１０】次に、第２の微生物、Ｍ２株は次の菌学的
性質を有する。この菌株をマルトエキス寒天平板培地及
びツァペックイーストエキス寒天平板培地に接種し、25
℃で3日間培養した後、生育したカビについての集落の
色調及び組織、分生子形成構造を観察した。この微生物
は柄足細胞を持つ分生子柄の先端に、球形−亜球形の頂
のうを形成する。この頂のうのほぼ全体からメトレ、フ
ィアランドを形成し、フィアランドの先端から分生子を
形成することからアスペルギルス属と同定された。更
に、分生子頭の色調が黒色−黒褐色を呈することからア
スペルギルス・ニガー（Aspergillus niger) に属する
ものであると同定された。このアスペルギルス・ニガー
に属するＭ２株は平成９年２月４日に工業技術院生命工
学工業技術研究所にFERM P-16059として寄託されてい
る。本菌が産生するリパーゼは、45℃、pH1.62に最適条
件を持ち、アルコール耐性であって高濃度のメチルエス
テルを分解する能力を有する優れたものであった。

【００１１】次に、第３の微生物、Ｍ６株は次の菌学的
性質を有する。この菌株は、球菌、グラム染色陽性、胞
子形成なし、運動性なし、好気性、オキシダーゼ陰性、
カタラーゼ陽性、嫌気下でのグルコースからの酸の生成
陰性、フラゾリドン寒天培地での生育陽性、リゾスタフ
ィン感受性耐性、菌体内DNAのGC含量73(mol)%であり、
ミクロコッカス(Micrococcus)属に属する菌であると同
定された。このミクロコッカス属に属するＭ６は平成９
年２月４日に工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM
P-16060として寄託されている。本菌が産生するリパー
ゼは、アルコール耐性であって高濃度のメチルエステル
を分解する能力を有する優れたものであった。

【００１２】本発明に使用するリパーゼを固定化する担
体としては、クリタC-356、カルボキシCPG、レパチット
CNP80、デュオライトCC-4、アンバーライトIRC-76、ア
ンバーライトIRC-84、ダイアイオンWK10、ダイアイオン
WK11、ダイアイオンWK20等の疎水性の担体に陰イオンを
導入した陽イオン交換体である。リパーゼは酸性蛋白で
あるため中性域においては静電的反発力により陽イオン
交換体に吸着しないものであるが、等電点以下において
は静電的反発力がなくなり、疎水性担体に疎水結合す
る。そこでこのリパーゼの陽イオン交換体への固定は、
カルボジイミド等の多価性反応試薬で強固に固定化され
る。すなわち、該陽イオン交換体にリパーゼを結合する
場合には、pH2-5にて水可溶性のカルボジイミド等で陽
イオン交換体を活性化し、次にpHを再び2-5に保ってリ
パーゼを結合させる。

【００１３】脂肪酸アルコールエステルを疎水性の担体
に陰イオンを導入した陽イオン交換体に結合した固定化
リパーゼで分解する際には、脂肪酸アルコールエステル
とpH2-8の溶液及び極性溶媒の混液からなる反応液を固
定化リパーゼリアクターに連続的に供給する。中性ない
し弱酸性の水溶液を用いることにより石鹸（脂肪酸アル
カリ）を含まない脂肪酸が得られる。弱アルカリにより
脂肪酸の回収が促進する場合には、弱アルカリでも用い
ることが可能であるので、反応液のpHはpH2-8の範囲の
広い範囲のものを使用できる。固定化リパーゼの担体が
疎水性であるために、疎水性の脂肪酸アルコールエステ
ルは吸着する。そこで固定化リパーゼにより分解され
る。分解されて生成された脂肪酸はpH2-8の水溶液と極
性溶媒の混液により連続的に排出される。基質の脂肪酸
アルコールエステルを懸濁させた溶媒部分が、生成物で
ある脂肪酸の排出液となり、リパーゼを固定化した陽イ
オン交換体の疎水性の担体部分が基質の吸着剤となるの
で、基質の吸着、加水分解反応及び生産物の排出があた
かも同時に起こっているかの如くに連続的に進行するの
で、連続化が容易である。なお、陰イオンを導入した陽
イオン交換体の静電的反発力により脂肪酸の排出を促進
する。

【００１４】本発明に使用する極性溶媒としては、アセ
トン、ジオキサン、イソプロピルアルコール等の水と混
和する有機溶媒である。本溶媒は、固定化したリパーゼ
を失活及び溶離させる作用を有さないとともに、疎水性
担体に吸着した脂肪酸アルコールエステルの溶離作用も
有さないことが必要である。しかも生産物である脂肪酸
の溶離は促進するものである。脂肪酸の溶離が極性溶媒
なしに起こる場合には、極性溶媒は使用しなくて良い。
また、基質が二相になるときには、二相の界面に基質供
給口を設けることにより撹拌せずに二相の混液を供給す
ることも可能である。

【００１５】本発明に使用するリアクターとしては、固
定床あるいは流動床いずれのものを用いても構わない。
脂肪酸アルコールエステルは、油脂と比較して操作しや
すいために基質と生産物のわずかの疎水性の相違により
両者の分離が可能である。固定化リパーゼの最適反応条
件に保つようなリパーゼ及び反応装置が必要である。ま
た、空気との接触は、脂肪酸の酸化を防ぐために極力避
けるべきである。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 〔実施例１〕脂肪酸アルコールエステルとしてオレイン
酸メチルを使用した。表１記載の各陽イオン交換体 1g
に水可溶性のカルボジイミド（１−シクロヘキシル−３
−（２−モルホニルエチル）−カルボジイミド・ｐ−ト
ルエンメトスルホン酸）50mgを10mLの水に溶解して加
え、6Nの塩酸でpH4-5に保ちながら室温に保持し、pHが
安定してきたら水洗してそれぞれの担体を活性化した。
次にクロモバクテリウム

【００１７】ビスコサムのリパーゼ粉末（リパーゼLP(C
E)、旭化成）100mgを2mLの水に溶解した液に、上述の如
く調製したカルボジイミドで活性化した担体を加え、pH
4-5に1-2時間室温に保持して、次いで水洗し乾燥して固
定化アルコール耐性リパーゼを調製した。0.1gの上述の
如く調製した固定化リパーゼに100μMのオレイン酸メチ
ルエステル及び100μLの水の混液を加え55℃で一夜反応
させた。反応後、イソオクタンで抽出し、その抽出物を
HPLCで分析した結果を表１に示す。

【００１８】

【表１】 ──────────────────────────────────── 担 体（陽イオン交換体） オレイン酸生成量 ──────────────────────────────────── アンバーライトIR-200 C( オルガノ) 40.7μM アンバーライトIR-76 ( オルガノ) 106.0 レパチットCNP80（バイエル） 79.4 カルボキシCPG 500（エレクトロ ヌクレオニクス） 115.8 アンバーライトIR-120 B( オルガノ) 66.0 ────────────────────────────────────

【００１９】表１により、疎水性の担体にカルボキシル
基 を導入した陽イオン交換体( アンバーライトIR-76
、レパチットCNP80、カルボキシCPG 500) あるいはス
ルホニル基を導入した陽イオン交換体( アンバーライト
IR-200 C、アンバーライトIR-120 B) に固定化したリパ
ーゼにより、オレイン酸メチルエステルが分解されるこ
と、特にアンバーライトIRC-76及びカルボキシCPG 500
に固定化したアルコール耐性リパーゼによると、100μM
の基質がほぼ完全に分解されていることを示した。

【００２０】〔実施例２〕実施例１の如くクロモバクテ
リウム・ビスコサムのリパーゼをアンバーライトIRC-76
に結合させた固定化アルコール耐性リパーゼ35gを外套
管付きのカラム（直径2cm長さ17cm）に充填した。100mM
のオレイン酸メチルエステルを懸濁させたpH6及びpH4の
マックイルベイン緩衝液及び70%のアセトン混液を毎分
0.5mLづつ上述のカラムに供給した。溶出液をイソオク
タンで抽出しHPLCで分析するとほぼ化学量論量のオレイ
ン酸が検出された。pHが6及び4でも同様に連続分解が可
能であり石鹸（オレイン酸ナトリウム）の生成も見られ
ず遊離の脂肪酸のみが得られた。

【００２１】〔実施例３〕本発明者らが土壌中より分離
した多くの菌株についてその培養液それぞれを1mL、pH6
のマックイルベイン緩衝液4mLに1Mあるいは5M濃度のオ
レイン酸メチルエステルを加えて55℃で2日間反応し
た。反応後HPLCで生成したオレイン酸の量を測定した。
その上位6株の結果を表２に示す。但しＸは1M、Ｙは5M
濃度のオレイン酸メチルエステルを加えた場合を示し
た。

【００２２】

【表２】 ──────────────────────────────────── 菌株名 オレイン酸生成量 Ｘ Ｙ ──────────────────────────────────── 分離菌１ 0.11M 0.93M アスペルギルス・ニガーＭ２ 0.37 1.46 ミクロコッカスＭ６ 0.30 1.32 バチルス・メガテリウムＭ８ 0.46 1.35 分離菌13 0.11 分離菌16 0.24 ────────────────────────────────────

【００２３】表２の結果は、バチルス・メガテリウムＭ
８、アスペルギルス・ニガーＭ２、ミクロコッカス属の
ミクロコッカスＭ６の生産するリパーゼを用いると高メ
チルエステル濃度においてのオレイン酸生成量が多いこ
とを示している。これらのリパーゼは実施例１及び２の
如く固定化して用いると良好な結果が得られた。

【００２４】

【発明の効果】本発明においては、従来の油脂に代えて
粘度及び沸点の低いさらさらとした脂肪酸アルコールエ
ステルを固定化アルコール耐性リパーゼに連続的に供給
することにより極めて容易に遊離脂肪酸を連続的に生産
できる。この場合、基質の脂肪酸アルコールエステルが
固定化アルコール耐性リパーゼに吸着しているために脂
肪酸アルコールエステルとアルコール耐性リパーゼとの
接触が常時起こり、しかも生成物だけが溶出するため
に、高いリパーゼ活性が発現できる。また、カラム中で
は脂肪酸アルコールエステルと空気との接触も完全に遮
断できるために、脂肪酸の酸化も防止でき、一方不飽和
脂肪酸等の製造も容易にできる。また、酵素反応は油脂
の化学的反応による温度６０〜８０℃で行なわれる。し
たがって、本発明の酵素反応との組み合わせにより、不
安定な脂肪酸の製造も可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６０６１ 特許権者において、実施許諾の用意がある。 (72)発明者 ケー．ムラリ マノジ インド国 ケララ 679122，パラカド デストリクト，プテンベド ショラノー ル２番地 (72)発明者 テー．スワミナトン インド国 マドラス 600036，インディ アン インスティテュート オブ テク ノロジー，デパートメント オブ ケミ カル エンジニアリング (72)発明者 エス．ケー．ラクシッド タイ国 パツム タニ 12120，クロン グ ルアング ピー．オー．ボックス ４，アジア インスティテュート オブ テクノロジー，バイオプロセス テク ノロジー プログラム (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 7/64

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 脂肪酸アルコールエステルを極性溶媒含
   有水溶液に混合し、該極性溶媒含有水溶液中の脂肪酸ア
   ルコールエステルを、疎水性の担体に陰イオンを導入し
   た陽イオン交換体であって且つアルコール耐性リパーゼ
   を固定した陽イオン交換体に吸着させて分解し、分解さ
   れて生成した脂肪酸を前記極性溶媒含有水溶液中に排出
   することを特徴とする脂肪酸の製造法。
2. 【請求項２】 アルコール耐性リパーゼが、バチルス
   属、アスペルギルス属、ミクロコッカス属あるいはクロ
   モバクテリウム属に属する微生物由来のアルコール耐性
   リパーゼであることを特徴とする請求項１記載の脂肪酸
   の製造方法。