JP2952579B2 - 耐熱性キチナーゼ - Google Patents
耐熱性キチナーゼInfo
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- chitinase
- chitin
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はキトオリゴ糖の大量
生産に適した耐熱性キチナーゼに関する。
生産に適した耐熱性キチナーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】キチナ
ーゼは動物、植物及び微生物内に広く存在する酵素であ
り、そのうちの何種類かはすでに精製・取得されている
〔Ｅ．Ｃａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，１６１，４６０−５０１（１９８
８）〕。そしてこれらのキチナーゼは、カビの細胞壁の
研究、キチンからのキトオリゴ糖の製造、転移又は縮合
反応によるキトオリゴ糖誘導体の製造などに利用されて
いる。
ーゼは動物、植物及び微生物内に広く存在する酵素であ
り、そのうちの何種類かはすでに精製・取得されている
〔Ｅ．Ｃａｂｉｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，１６１，４６０−５０１（１９８
８）〕。そしてこれらのキチナーゼは、カビの細胞壁の
研究、キチンからのキトオリゴ糖の製造、転移又は縮合
反応によるキトオリゴ糖誘導体の製造などに利用されて
いる。
【０００３】しかしながら、従来のキチナーゼはいずれ
も取得するためには多くの精製ステップを経なくてはな
らず、少量しか得られないという欠点を有していた。ま
た、その上、５０℃前後までの耐熱性しか有さないた
め、キチンからのキトオリゴ糖の製造時に失活したりし
てしまい、産業分野での利用は不可能な状態にあった。
も取得するためには多くの精製ステップを経なくてはな
らず、少量しか得られないという欠点を有していた。ま
た、その上、５０℃前後までの耐熱性しか有さないた
め、キチンからのキトオリゴ糖の製造時に失活したりし
てしまい、産業分野での利用は不可能な状態にあった。
【０００４】従って、簡易な方法によって得られる耐熱
性キチナーゼの開発が望まれていた。
性キチナーゼの開発が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは、キトオリゴ糖の大量生産に適した耐熱性キ
チナーゼを得るべく、鋭意研究したところ、特開昭６３
−７７９２号記載のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕ
株の培養液から新規な耐熱性に優れた４種類のキチナー
ゼを精製・取得することに成功し、これらをキチナーゼ
Ｉ、II、III及びIVと命名した。このうちキチナーゼI
I、III及びIVの３種は分子量が少し異なるのみで、他の
物性は同一である。
発明者らは、キトオリゴ糖の大量生産に適した耐熱性キ
チナーゼを得るべく、鋭意研究したところ、特開昭６３
−７７９２号記載のバチルス・リケニフォルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕ
株の培養液から新規な耐熱性に優れた４種類のキチナー
ゼを精製・取得することに成功し、これらをキチナーゼ
Ｉ、II、III及びIVと命名した。このうちキチナーゼI
I、III及びIVの３種は分子量が少し異なるのみで、他の
物性は同一である。
【０００６】従って、本発明はこの３種類の新規な耐熱
性キチナーゼを提供するものである。
性キチナーゼを提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明の耐熱性キチナーゼを生産
する微生物であるバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕ
は、温泉より採取された微生物であり、本菌は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８８１０号（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．８８１０）として寄託されている。
する微生物であるバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕ
は、温泉より採取された微生物であり、本菌は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８８１０号（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ．８８１０）として寄託されている。
【０００８】本発明の耐熱性キチナーゼを得るには、通
常バチルス属に属する微生物の培養に用いられる培地
に、前記バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕ株を接種
し、常法に従って回転振盪培養又は通気攪拌培養を行な
えばよい。
常バチルス属に属する微生物の培養に用いられる培地
に、前記バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕ株を接種
し、常法に従って回転振盪培養又は通気攪拌培養を行な
えばよい。
【０００９】本発明の酵素生産のためには培地中に炭素
源としてキチンを含有させることが必須であり、更にＮ
−アセチルグルコサミンを添加することが好ましい。ま
た、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム等の無機化合物或いはコーンスチープリカー、酵母エ
キス等の有機窒素化合物がともに使用できるが、特に酵
母エキスが好ましい。無機塩としてはＮａ2ＨＰＯ4・Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2
・２Ｈ2Ｏ等が用いられる。
源としてキチンを含有させることが必須であり、更にＮ
−アセチルグルコサミンを添加することが好ましい。ま
た、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム等の無機化合物或いはコーンスチープリカー、酵母エ
キス等の有機窒素化合物がともに使用できるが、特に酵
母エキスが好ましい。無機塩としてはＮａ2ＨＰＯ4・Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2
・２Ｈ2Ｏ等が用いられる。
【００１０】培地のpHは５〜１０、好ましくは７〜９で
あり、培養温度は４０℃以上６０℃未満、好ましくは５
０℃である。斯かる培養条件で２４〜９６時間培養を行
なえば、培養液中に本発明のキチナーゼが蓄積する。
あり、培養温度は４０℃以上６０℃未満、好ましくは５
０℃である。斯かる培養条件で２４〜９６時間培養を行
なえば、培養液中に本発明のキチナーゼが蓄積する。
【００１１】斯くして得られた培養液中の耐熱性キチナ
ーゼの精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じ
て行なうことができる。すなわち、まず遠心分離又は濾
過等の通常の固液分離手段により、又は、必要に応じて
塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により、粗酵
素を得る。次いでブチルトヨパール（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ，東ソー（株））カラムクロマトグラフ
ィーにより粗酵素を分画すると、耐熱性キチナーゼＩが
単品として分離でき、残りの画分をＱ−セファロースフ
ァーストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ，ファルマシア（株））カラムクロマトグラフ
ィーにより分画すると、本発明耐熱性キチナーゼIIを単
品として分離できる。更に残りの画分をセファクリル
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００（ファルマシア
（株））カラムクロマトグラフィーにかけると、本発明
耐熱性キチナーゼIII及び耐熱性キチナーゼIVを単品と
して分離することができる。
ーゼの精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じ
て行なうことができる。すなわち、まず遠心分離又は濾
過等の通常の固液分離手段により、又は、必要に応じて
塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段により、粗酵
素を得る。次いでブチルトヨパール（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯ
ＹＯＰＥＡＲＬ，東ソー（株））カラムクロマトグラフ
ィーにより粗酵素を分画すると、耐熱性キチナーゼＩが
単品として分離でき、残りの画分をＱ−セファロースフ
ァーストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ，ファルマシア（株））カラムクロマトグラフ
ィーにより分画すると、本発明耐熱性キチナーゼIIを単
品として分離できる。更に残りの画分をセファクリル
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００（ファルマシア
（株））カラムクロマトグラフィーにかけると、本発明
耐熱性キチナーゼIII及び耐熱性キチナーゼIVを単品と
して分離することができる。
【００１２】斯くして得られる、本発明の耐熱性キチナ
ーゼII、III及びIVの酵素化学的諸性質について、以下
に説明する。尚、酵素活性測定、タンパク質の定量及び
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）は次に示す方法により行なった。
ーゼII、III及びIVの酵素化学的諸性質について、以下
に説明する。尚、酵素活性測定、タンパク質の定量及び
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）は次に示す方法により行なった。
【００１３】＜酵素活性測定法＞ ｉ）グリコールキチン水解活性 （反応液） １．０ml ０．１％グリコールキチン水溶液*1 ０．２ml ０．２Ｍホウ酸緩衝液（pH１０．０） ０．３ml 酵素溶液 *1：Ｓ．Ｈｉｒａｎｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１６１，４０８（１９９８）に記載のものを使用し
た。
ｌ．１６１，４０８（１９９８）に記載のものを使用し
た。
【００１４】上記反応液で５０℃にて３０分間反応後、
生じた還元糖をＴ．Ｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｋ．Ｙａｇｉ
ｓｈｉｔａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３
５，１１５４（１９７１）に記載の方法により定量し
た。酵素１単位（Ｕｎｉｔ）は、上記の条件で１分間に
１μｍｏｌｅのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに相当
する還元力を生成する酵素量と定義した。 ii）ｐ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
キトビオシド水解活性 （反応液） ０．１ml ５mM ｐ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−キトビオシド（焼津水産化学製Ｌｏｔ Ｎ
ｏ．８８１２０５０） ０．２ml ０．２Ｍ リン酸緩衝液（pH６．０） ０．１ml 酵素溶液 上記反応液で３７℃にて５分間反応後、０．２Ｍ Ｎａ
2ＣＯ3水溶液０．４mlを加えて反応を止め、生じたｐ−
ニトロフェノールを４００nmの吸光度から定量した（吸
光係数１８．１cm2／μｍｏｌｅ）。酵素１単位（Ｕｎ
ｉｔ）は、上記の条件で１分間に１μｍｏｌｅのｐ−ニ
トロフェノールを生成する酵素量と定義した。
生じた還元糖をＴ．Ｉｍｏｔｏ ａｎｄ Ｋ．Ｙａｇｉ
ｓｈｉｔａ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３
５，１１５４（１９７１）に記載の方法により定量し
た。酵素１単位（Ｕｎｉｔ）は、上記の条件で１分間に
１μｍｏｌｅのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに相当
する還元力を生成する酵素量と定義した。 ii）ｐ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−
キトビオシド水解活性 （反応液） ０．１ml ５mM ｐ−ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチ
ル−β−Ｄ−キトビオシド（焼津水産化学製Ｌｏｔ Ｎ
ｏ．８８１２０５０） ０．２ml ０．２Ｍ リン酸緩衝液（pH６．０） ０．１ml 酵素溶液 上記反応液で３７℃にて５分間反応後、０．２Ｍ Ｎａ
2ＣＯ3水溶液０．４mlを加えて反応を止め、生じたｐ−
ニトロフェノールを４００nmの吸光度から定量した（吸
光係数１８．１cm2／μｍｏｌｅ）。酵素１単位（Ｕｎ
ｉｔ）は、上記の条件で１分間に１μｍｏｌｅのｐ−ニ
トロフェノールを生成する酵素量と定義した。
【００１５】＜蛋白質の定量＞精製酵素について得られ
た２８０nmにおける吸光係数Ｅ1% 1cm（耐熱性キチナー
ゼII＝１８．８、耐熱性キチナーゼIII＝１７．０、耐
熱性キチナーゼIV＝１８．８）を用いて測定した。
た２８０nmにおける吸光係数Ｅ1% 1cm（耐熱性キチナー
ゼII＝１８．８、耐熱性キチナーゼIII＝１７．０、耐
熱性キチナーゼIV＝１８．８）を用いて測定した。
【００１６】＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞ラムリーの不連続緩
衝液系を用いた方法（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２７７，６８０（１９７０））に従った。すな
わち、耐熱性キチナーゼII、III及びIVをそれぞれ５μ
ｇずつテフコゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥミニグラジェントゲ
ル（ＴＥＦＣＯ−Ｇｅｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｍｉｎｉ
ＧＲＡＤＩＥＮＴＧｅｌ）８〜１６％を用いて１２mA
定電流で泳動した。次いで０．１％クーマーシーブルー
（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）２５０、４０％メタ
ノール、１０％酢酸水溶液で染色後、１０％メタノー
ル、７．５％酢酸水溶液で脱色した。分子量マーカーと
しては、ファルマシア製 ロウ モレキュラーウェイト
カリブレーション キット（Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ；ホスホリラーゼｂ９４，０００、アルブミン６７，
０００、オボアルブミン４３，０００、カルボニックア
ンヒドラーゼ３０，０００、トリプシンインヒビター２
０，１００、α−ラクトアルブミン１４，４００）を用
いた。
衝液系を用いた方法（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２７７，６８０（１９７０））に従った。すな
わち、耐熱性キチナーゼII、III及びIVをそれぞれ５μ
ｇずつテフコゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥミニグラジェントゲ
ル（ＴＥＦＣＯ−Ｇｅｌ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｍｉｎｉ
ＧＲＡＤＩＥＮＴＧｅｌ）８〜１６％を用いて１２mA
定電流で泳動した。次いで０．１％クーマーシーブルー
（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）２５０、４０％メタ
ノール、１０％酢酸水溶液で染色後、１０％メタノー
ル、７．５％酢酸水溶液で脱色した。分子量マーカーと
しては、ファルマシア製 ロウ モレキュラーウェイト
カリブレーション キット（Ｌｏｗ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉ
ｔ；ホスホリラーゼｂ９４，０００、アルブミン６７，
０００、オボアルブミン４３，０００、カルボニックア
ンヒドラーゼ３０，０００、トリプシンインヒビター２
０，１００、α−ラクトアルブミン１４，４００）を用
いた。
【００１７】＜酵素化学的諸性質＞ １）作用 耐熱性キチナーゼII、III及びIVともにキチンを加水分
解してキトオリゴ糖を生成する。 ２）基質特異性 キチナーゼII、III及びIVはコロイダルキチンを加水分
解して、Ｎ−アセチルグルコサミン（以下ＧｌｃＮＡｃ
と記す）及びＮ−アセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ
のダイマー＝（ＧｌｃＮＡｃ）2）を生成する。耐熱性
キチナーゼII、III及びIVともにグリコールキチンを加
水分解し、還元糖を生成する。またｐ−ニトロフェニル
−ジ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−キトビオシド（以下「ｐ
ＮＰ−キトビオシド」と略称する）を加水分解し、ｐ−
ニトロフェノールを生成する。
解してキトオリゴ糖を生成する。 ２）基質特異性 キチナーゼII、III及びIVはコロイダルキチンを加水分
解して、Ｎ−アセチルグルコサミン（以下ＧｌｃＮＡｃ
と記す）及びＮ−アセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ
のダイマー＝（ＧｌｃＮＡｃ）2）を生成する。耐熱性
キチナーゼII、III及びIVともにグリコールキチンを加
水分解し、還元糖を生成する。またｐ−ニトロフェニル
−ジ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−キトビオシド（以下「ｐ
ＮＰ−キトビオシド」と略称する）を加水分解し、ｐ−
ニトロフェノールを生成する。
【００１８】ｐＮＰ−キトビオシドを基質としたときの
Km及びＶの値を表１に示す。
Km及びＶの値を表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】３）至適pH ０．２Ｍマクイルベン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液
（pH２．５〜７．５）又は０．２Ｍホウ酸緩衝液（pH
７．５〜１１．０）０．２ml、０．１％基質水溶液（グ
リコールキチン）１．０ml、酵素液０．３ml（耐熱性キ
チナーゼII：１２．７μｇ、耐熱性キチナーゼIII：１
４．３μｇ、耐熱性キチナーゼIV：１２．７μｇ）から
なる反応液を５０℃で３０分間反応させ、活性を測定し
た。至適pHは、いずれも１０．０付近であった。
（pH２．５〜７．５）又は０．２Ｍホウ酸緩衝液（pH
７．５〜１１．０）０．２ml、０．１％基質水溶液（グ
リコールキチン）１．０ml、酵素液０．３ml（耐熱性キ
チナーゼII：１２．７μｇ、耐熱性キチナーゼIII：１
４．３μｇ、耐熱性キチナーゼIV：１２．７μｇ）から
なる反応液を５０℃で３０分間反応させ、活性を測定し
た。至適pHは、いずれも１０．０付近であった。
【００２１】４）pH安定性 耐熱性キチナーゼII、III及びIVの各酵素液０．０１ml
（耐熱性キチナーゼII：２５．４μｇ、耐熱性キチナー
ゼIII：３０．７μｇ、耐熱性キチナーゼIV：３１．８
μｇ）に０．２Ｍマクイルベン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）
緩衝液（pH３．０〜７．５）又は０．２Ｍホウ酸緩衝液
（pH７．５〜１１．０）０．０４mlを加え、３５℃で２
４時間保存した。次いで保存液０．０４mlに脱イオン水
０．０６ml、０．２Ｍホウ酸緩衝液（pH１０．０）０．
４ml、０．１％グリコールキチン水溶液１．０mlを加え
て、５０℃で３０分間反応させ、活性を測定したところ
耐熱性キチナーゼII、III及びIVともにpH４．０〜８．
０の範囲で９０％以上の残存活性を示した。
（耐熱性キチナーゼII：２５．４μｇ、耐熱性キチナー
ゼIII：３０．７μｇ、耐熱性キチナーゼIV：３１．８
μｇ）に０．２Ｍマクイルベン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）
緩衝液（pH３．０〜７．５）又は０．２Ｍホウ酸緩衝液
（pH７．５〜１１．０）０．０４mlを加え、３５℃で２
４時間保存した。次いで保存液０．０４mlに脱イオン水
０．０６ml、０．２Ｍホウ酸緩衝液（pH１０．０）０．
４ml、０．１％グリコールキチン水溶液１．０mlを加え
て、５０℃で３０分間反応させ、活性を測定したところ
耐熱性キチナーゼII、III及びIVともにpH４．０〜８．
０の範囲で９０％以上の残存活性を示した。
【００２２】５）至適温度 耐熱性キチナーゼII、III及びIVの各酵素液０．３ml
（耐熱性キチナーゼII：６．４μｇ、耐熱性キチナーゼ
III：７．２μｇ、耐熱性キチナーゼIV：６．４μ
ｇ）、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）０．２
ml及び０．１％グリコールキチン水溶液１．０mlからな
る反応液を３０〜８０℃の各温度で３０分間反応させ、
活性を測定したところ、至適温度は耐熱性キチナーゼI
I、III及びIVともに８０℃であった。
（耐熱性キチナーゼII：６．４μｇ、耐熱性キチナーゼ
III：７．２μｇ、耐熱性キチナーゼIV：６．４μ
ｇ）、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）０．２
ml及び０．１％グリコールキチン水溶液１．０mlからな
る反応液を３０〜８０℃の各温度で３０分間反応させ、
活性を測定したところ、至適温度は耐熱性キチナーゼI
I、III及びIVともに８０℃であった。
【００２３】６）温度安定性 耐熱性キチナーゼII、III及びIVの各酵素液〔０．２Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にそれぞれ耐熱性キチ
ナーゼII：２５．４μｇ、耐熱性キチナーゼIII：２
８．７μｇ、耐熱性キチナーゼIV：２５．５μｇの酵素
を溶かしたもの〕０．１mlを３０〜８０℃の各温度で３
０分間保温した。次いで、保温液０．１mlに０．２Ｍホ
ウ酸緩衝液（pH１０．０）０．２ml、脱イオン水０．２
ml及び０．１％グリコールキチン水溶液１．０mlを加
え、５０℃で３０分間反応させ、活性を測定したとこ
ろ、耐熱性キチナーゼII、III及びIVともに８０℃以下
では８０％以上の残存活性を示した。
トリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にそれぞれ耐熱性キチ
ナーゼII：２５．４μｇ、耐熱性キチナーゼIII：２
８．７μｇ、耐熱性キチナーゼIV：２５．５μｇの酵素
を溶かしたもの〕０．１mlを３０〜８０℃の各温度で３
０分間保温した。次いで、保温液０．１mlに０．２Ｍホ
ウ酸緩衝液（pH１０．０）０．２ml、脱イオン水０．２
ml及び０．１％グリコールキチン水溶液１．０mlを加
え、５０℃で３０分間反応させ、活性を測定したとこ
ろ、耐熱性キチナーゼII、III及びIVともに８０℃以下
では８０％以上の残存活性を示した。
【００２４】７）分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）の結果（図６）を基に、対数（分子量）−移動
度のプロットより算出した。分子量はキチナーゼII、II
I、IVの順に７６，０００、６６，０００、５９，００
０であった。キチナーゼII、III及びIVはＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより単一のバンドを示したので、それぞれが単一
の物質であると思われた。しかし、これらをＳＤＳを用
いないポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたとこ
ろ、キチナーゼII、III及びIVの全てにおいて相互に近
接した二本のバンドを示した。これらは分子量が同一で
電荷が僅かに異なる分子種が存在することを示唆する。
ＡＧＥ）の結果（図６）を基に、対数（分子量）−移動
度のプロットより算出した。分子量はキチナーゼII、II
I、IVの順に７６，０００、６６，０００、５９，００
０であった。キチナーゼII、III及びIVはＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより単一のバンドを示したので、それぞれが単一
の物質であると思われた。しかし、これらをＳＤＳを用
いないポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけたとこ
ろ、キチナーゼII、III及びIVの全てにおいて相互に近
接した二本のバンドを示した。これらは分子量が同一で
電荷が僅かに異なる分子種が存在することを示唆する。
【００２５】８）糖転移反応 キトテトラオース（（ＧｌｃＮＡｃ）4）にキチナーゼI
I、III又はIVを作用させると加水分解反応によりキトビ
オースを生成する一方、糖転移反応によるキトヘキサオ
ース（（ＧｌｃＮＡｃ）6）を生成することが、反応液
をＨＰＬＣで分析することにより判明した。
I、III又はIVを作用させると加水分解反応によりキトビ
オースを生成する一方、糖転移反応によるキトヘキサオ
ース（（ＧｌｃＮＡｃ）6）を生成することが、反応液
をＨＰＬＣで分析することにより判明した。
【００２６】なお、反応式は次の通りである。
【００２７】
【化１】 (GlcNAc)4＋(GlcNAc)4→(GlcNAc)6＋(GlcNAc)2
【００２８】上記本発明キチナーゼの糖転移反応性を利
用すれば、種々のヌクレオシド、テルペン類等を配糖体
に変換せしめることができる。
用すれば、種々のヌクレオシド、テルペン類等を配糖体
に変換せしめることができる。
【００２９】すなわち、抗癌作用を有するヌクレオシド
類、例えばアラビノシルシトシン、５−フルオロラウシ
ル等とキトテトラオース等のキトオリゴ糖とを本発明キ
チナーゼの存在下に反応させれば、これらのヌクレオシ
ド類の配糖体が得られる。得られたヌクレニシド配糖体
は、安全性の高い抗癌剤として有用である。
類、例えばアラビノシルシトシン、５−フルオロラウシ
ル等とキトテトラオース等のキトオリゴ糖とを本発明キ
チナーゼの存在下に反応させれば、これらのヌクレオシ
ド類の配糖体が得られる。得られたヌクレニシド配糖体
は、安全性の高い抗癌剤として有用である。
【００３０】すなわち、Ｍｉｃｈａｅｌらの報告（Ｍｉ
ｃｈａｅｌ Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ（１９８７），Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．，４７，４６３４〜４６４１）によ
り、ヒト卵巣ガンは正常細胞に比べ細胞外に多くのβ−
Ｎ−アセチルグリコサミニダーゼを出していることが分
かった。従って、Ｎ−アセチルグルコサミンで保護され
た抗癌剤を投与すれば、ガン細胞の周辺で酵素によりＮ
−アセチルグルコサミンが脱離し、副作用を生ずること
なく抗癌活性が発現する。
ｃｈａｅｌ Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ（１９８７），Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．，４７，４６３４〜４６４１）によ
り、ヒト卵巣ガンは正常細胞に比べ細胞外に多くのβ−
Ｎ−アセチルグリコサミニダーゼを出していることが分
かった。従って、Ｎ−アセチルグルコサミンで保護され
た抗癌剤を投与すれば、ガン細胞の周辺で酵素によりＮ
−アセチルグルコサミンが脱離し、副作用を生ずること
なく抗癌活性が発現する。
【００３１】
【発明の効果】本発明の耐熱性キチナーゼII、III及びI
Vはいずれも従来のキチナーゼに比較して高温度におけ
る安定性が良好である。従って、本発明の耐熱性キチナ
ーゼはキチンからのキトオリゴ糖の大量生産に非常に適
している。また、従来のキチナーゼよりも精製工程が簡
便であり、産業上有用なものである。更に本発明のキチ
ナーゼは糖転移反応性を有し、種々のキトオリゴ糖及び
配糖体の製造に適している。
Vはいずれも従来のキチナーゼに比較して高温度におけ
る安定性が良好である。従って、本発明の耐熱性キチナ
ーゼはキチンからのキトオリゴ糖の大量生産に非常に適
している。また、従来のキチナーゼよりも精製工程が簡
便であり、産業上有用なものである。更に本発明のキチ
ナーゼは糖転移反応性を有し、種々のキトオリゴ糖及び
配糖体の製造に適している。
【００３２】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明する。
説明する。
【００３３】実施例１ バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕを下記組成の培地を
用いて培養し、キチン水解活性を有する培養液を得た。使用培地 ｉ）前培養用液体培地 エルリッヒ肉エキス （極東製薬製、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＤＣ９２２７） ３．０ｇ ポリペプトン （日本製薬製、Ｌｏｔ Ｎｏ．０５５９ＷＢ） ３．０ｇ ＮａＣｌ ０．６ｇ Ｈ2Ｏ ３００ml １Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＨＣｌを用いてpH７．０に調
整 ii）酵素生産用液体培地 コロイダルキチン １０．０ｇ （焼津水産化学製のキチンＰＳＬ、 Ｌｏｔ Ｎｏ．８８０２１３０を用いて調整） Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン １０．０ｇ （東京化成製、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＡＺ０１） 酵母エキス ２．０ｇ （ＤＩＦＣＯ社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．７６０８０５） Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ ６．８ｇ ＮＨ4ＮＯ3 ４．０ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ２．０ｇ ＮａＣｌ １．０ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２ｇ Ｈ2Ｏ ２０００ml １Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＨＣｌを用いてpH７．０に調
整
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｘ−７ｕを下記組成の培地を
用いて培養し、キチン水解活性を有する培養液を得た。使用培地 ｉ）前培養用液体培地 エルリッヒ肉エキス （極東製薬製、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＤＣ９２２７） ３．０ｇ ポリペプトン （日本製薬製、Ｌｏｔ Ｎｏ．０５５９ＷＢ） ３．０ｇ ＮａＣｌ ０．６ｇ Ｈ2Ｏ ３００ml １Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＨＣｌを用いてpH７．０に調
整 ii）酵素生産用液体培地 コロイダルキチン １０．０ｇ （焼津水産化学製のキチンＰＳＬ、 Ｌｏｔ Ｎｏ．８８０２１３０を用いて調整） Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン １０．０ｇ （東京化成製、Ｌｏｔ Ｎｏ．ＡＺ０１） 酵母エキス ２．０ｇ （ＤＩＦＣＯ社製、Ｌｏｔ Ｎｏ．７６０８０５） Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ ６．８ｇ ＮＨ4ＮＯ3 ４．０ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ２．０ｇ ＮａＣｌ １．０ｇ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２ｇ Ｈ2Ｏ ２０００ml １Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ ＨＣｌを用いてpH７．０に調
整
【００３４】培養方法 前培養培地３００mlを５００ml三角フラスコ２本に１５
０mlずつ分注し、本菌株１白金耳を接種後、５０℃、２
４時間回転振盪培養（１５０rpm）を行なった。次いで
培養液３００mlを遠心分離（１４，０００rpm、２０mi
n）にかけ、集菌した菌を０．０５Ｍリン酸緩衝液８０m
lに懸濁後、酵素生産用培地２０００mlに接種した。培
養は、いわしやminiジャーファメンタＡＣＤ４を用いて
５０℃にて４８時間行なった（攪拌２５０rpm、通気量
１２００ml／min）。
０mlずつ分注し、本菌株１白金耳を接種後、５０℃、２
４時間回転振盪培養（１５０rpm）を行なった。次いで
培養液３００mlを遠心分離（１４，０００rpm、２０mi
n）にかけ、集菌した菌を０．０５Ｍリン酸緩衝液８０m
lに懸濁後、酵素生産用培地２０００mlに接種した。培
養は、いわしやminiジャーファメンタＡＣＤ４を用いて
５０℃にて４８時間行なった（攪拌２５０rpm、通気量
１２００ml／min）。
【００３５】実施例２ 実施例１で得られたキチン水解活性を有する培養液１９
５０mlを遠心分離（×８，０００ｇ、３０分、４℃）
し、その上清１８９０mlに（ＮＨ4）2ＳＯ4を終濃度１
Ｍとなるように加え、更に１Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ Ｈ
Ｃｌを用いてpH７．５に調整した後、予め０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（pH７．５；１Ｍ（ＮＨ 4）2ＳＯ4を
含む）で平衡化したブチルトヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔ
ＯＹＯＰＥＡＲＬ）６５０Ｍカラム（カラムサイズ２．
６×２０．５cm）に前記上清を流速１．８ml／分で流し
た。その後、０．８Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む、０．０
２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）を流速０．４８ml
／分で流し、カラムを洗浄した。次に０．４Ｍ（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4を含む０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）を用いて流速０．４８ml／分、１フラクション
＝５．０mlで酵素を溶出した。続いて（ＮＨ4）2ＳＯ4
を含まない０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）
を用いて流速０．４８ml／分、１フラクション＝５．０
mlで酵素を溶出したところ、グリコールキチン水解活性
及びｐＮＰ−キトビオシド水解活性を示すピークＡ画分
（フラクションＮｏ．１８〜３３）８０mlとピークＣ画
分（フラクションＮｏ．２５７〜２６２）３０ml、並び
に強いｐＮＰ−キトビオシド水解活性を示すピークＢ画
分（フラクションＮｏ．４５〜７０）１３０mlが得られ
た（図１）。
５０mlを遠心分離（×８，０００ｇ、３０分、４℃）
し、その上清１８９０mlに（ＮＨ4）2ＳＯ4を終濃度１
Ｍとなるように加え、更に１Ｎ ＮａＯＨ又は１Ｎ Ｈ
Ｃｌを用いてpH７．５に調整した後、予め０．０２Ｍト
リス−塩酸緩衝液（pH７．５；１Ｍ（ＮＨ 4）2ＳＯ4を
含む）で平衡化したブチルトヨパール（Ｂｕｔｙｌ−Ｔ
ＯＹＯＰＥＡＲＬ）６５０Ｍカラム（カラムサイズ２．
６×２０．５cm）に前記上清を流速１．８ml／分で流し
た。その後、０．８Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む、０．０
２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）を流速０．４８ml
／分で流し、カラムを洗浄した。次に０．４Ｍ（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4を含む０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）を用いて流速０．４８ml／分、１フラクション
＝５．０mlで酵素を溶出した。続いて（ＮＨ4）2ＳＯ4
を含まない０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）
を用いて流速０．４８ml／分、１フラクション＝５．０
mlで酵素を溶出したところ、グリコールキチン水解活性
及びｐＮＰ−キトビオシド水解活性を示すピークＡ画分
（フラクションＮｏ．１８〜３３）８０mlとピークＣ画
分（フラクションＮｏ．２５７〜２６２）３０ml、並び
に強いｐＮＰ−キトビオシド水解活性を示すピークＢ画
分（フラクションＮｏ．４５〜７０）１３０mlが得られ
た（図１）。
【００３６】以上のピークＡ画分、ピークＢ画分及びピ
ークＣ画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ピー
クＢ画分は単一のバンドを示したのでこの画分を以て精
製酵素標品とし、これを耐熱性キチナーゼＩと命名し
た。ピークＡ画分では２つのバンドが現れ、ピークＣ画
分ではにごりが存在したので、これらの画分を更に実施
例３に従って分離精製を行なった。
ークＣ画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ピー
クＢ画分は単一のバンドを示したのでこの画分を以て精
製酵素標品とし、これを耐熱性キチナーゼＩと命名し
た。ピークＡ画分では２つのバンドが現れ、ピークＣ画
分ではにごりが存在したので、これらの画分を更に実施
例３に従って分離精製を行なった。
【００３７】実施例３ 実施例２において得られたピークＡ画分８０mlとピーク
Ｃ画分３０mlを、それぞれアミコンＰＭ−１０膜を用い
て濃縮及び緩衝液の交換〔０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝
液（pH７．５）〕を行ない、続いてＱ−セファロースフ
ァーストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ）カラムにかけた〔カラムサイズ２．６×３０
cm、平衡化緩衝液０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）、流速０．５７ml／分、１フラクション＝５．
０ml〕。次いで０→０．５Ｍ食塩の直線濃度勾配（合計
１０００ml）で酵素を溶出したところ、ピークＣ画分の
溶出パターンでは、単一のタンパク質ピークに一致する
グリコールキチン水解活性を有するピークが６５ml得ら
れた（図２のフラクションＮｏ．１２２〜１３４）。こ
のピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、単一
バンドを与え、分子量的に均一であることが示された。
このピーク画分を精製酵素標品とし、キチナーゼIIと命
名した。また、ピークＡ画分の溶出パターンでは、タン
パク質ピークに一致する２つのグリコールキチン水解活
性を有するピークａ画分４０ml（図３のフラクションＮ
ｏ．９７〜１０４）とピークｂ画分３５ml（図３のフラ
クションＮｏ．１０５〜１１１）が得られた。
Ｃ画分３０mlを、それぞれアミコンＰＭ−１０膜を用い
て濃縮及び緩衝液の交換〔０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝
液（pH７．５）〕を行ない、続いてＱ−セファロースフ
ァーストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗ）カラムにかけた〔カラムサイズ２．６×３０
cm、平衡化緩衝液０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）、流速０．５７ml／分、１フラクション＝５．
０ml〕。次いで０→０．５Ｍ食塩の直線濃度勾配（合計
１０００ml）で酵素を溶出したところ、ピークＣ画分の
溶出パターンでは、単一のタンパク質ピークに一致する
グリコールキチン水解活性を有するピークが６５ml得ら
れた（図２のフラクションＮｏ．１２２〜１３４）。こ
のピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、単一
バンドを与え、分子量的に均一であることが示された。
このピーク画分を精製酵素標品とし、キチナーゼIIと命
名した。また、ピークＡ画分の溶出パターンでは、タン
パク質ピークに一致する２つのグリコールキチン水解活
性を有するピークａ画分４０ml（図３のフラクションＮ
ｏ．９７〜１０４）とピークｂ画分３５ml（図３のフラ
クションＮｏ．１０５〜１１１）が得られた。
【００３８】実施例４ 実施例３において得られたピークａ画分４０mlとピーク
ｂ画分３５mlを、それぞれアミコンＰＭ−１０膜を用い
て３mlになるまで濃縮した後、セファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラムにかけた〔カラムサイズ
２．６×９２．５cm、平衡化緩衝液０．０２Ｍトリス−
塩酸緩衝液（pH７．５；０．２Ｍ ＮａＣｌを含む）、
流速０．３ml／分、１フラクション＝５０ml〕。
ｂ画分３５mlを、それぞれアミコンＰＭ−１０膜を用い
て３mlになるまで濃縮した後、セファクリル（Ｓｅｐｈ
ａｃｒｙｌ）Ｓ−２００カラムにかけた〔カラムサイズ
２．６×９２．５cm、平衡化緩衝液０．０２Ｍトリス−
塩酸緩衝液（pH７．５；０．２Ｍ ＮａＣｌを含む）、
流速０．３ml／分、１フラクション＝５０ml〕。
【００３９】その結果、ピークｂの溶出パターンでは一
つの肩と一つのピークが認められた（図４）。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによりピーク画分２０ml（フラクションＮｏ．
６１〜６４）を集めたところ、単一バンドを示したので
これを精製酵素標品とし、キチナーゼIIIと命名した。
つの肩と一つのピークが認められた（図４）。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによりピーク画分２０ml（フラクションＮｏ．
６１〜６４）を集めたところ、単一バンドを示したので
これを精製酵素標品とし、キチナーゼIIIと命名した。
【００４０】また、ピークａの溶出パターンでは、大き
なピークと一つの肩とが認められた（図５）。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによりピークの方の画分２０ml（フラクション
Ｎｏ．５５〜５８）を集めたところ、単一バンドを示し
たので、これを精製酵素標品とし、キチナーゼIVと命名
した。
なピークと一つの肩とが認められた（図５）。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによりピークの方の画分２０ml（フラクション
Ｎｏ．５５〜５８）を集めたところ、単一バンドを示し
たので、これを精製酵素標品とし、キチナーゼIVと命名
した。
【００４１】実施例５ 実施例２〜４で得られた本発明耐熱性キチナーゼII、II
I及びIVの酵素活性を測定した。その結果を下記表２に
示す。なお、基質としてはグリコールキチンを用いた。
I及びIVの酵素活性を測定した。その結果を下記表２に
示す。なお、基質としてはグリコールキチンを用いた。
【００４２】
【表２】
【００４３】実施例６ ５％テトラ−Ｎ−アセチル−キトテトラオース１３５μ
ｌ、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）１５μ
ｌ、キチナーゼII溶液１２．５μｌ（６．６μｇ）から
なる反応液を５０℃に保ち、一定時間ごとに２０μｌず
つ取りだし、生成物をＨＰＬＣにより分析した。図７に
反応開始６０分後のＨＰＬＣの結果、図８に反応生成物
の時間経過による推移をしめした。なお、生成物は、Ｔ
ＳＫｇｅｌＮＨ2−６０カラム（水−アセトニトリル：
４０−７０）を用いて分離し、キトオリゴ糖のピークは
２２０nmの吸収で検出した。その結果、キトテトラオー
スはキチナーゼIIによりキトビオースに加水分解される
とともに、キトヘキサオースに転移することが判明し
た。
ｌ、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）１５μ
ｌ、キチナーゼII溶液１２．５μｌ（６．６μｇ）から
なる反応液を５０℃に保ち、一定時間ごとに２０μｌず
つ取りだし、生成物をＨＰＬＣにより分析した。図７に
反応開始６０分後のＨＰＬＣの結果、図８に反応生成物
の時間経過による推移をしめした。なお、生成物は、Ｔ
ＳＫｇｅｌＮＨ2−６０カラム（水−アセトニトリル：
４０−７０）を用いて分離し、キトオリゴ糖のピークは
２２０nmの吸収で検出した。その結果、キトテトラオー
スはキチナーゼIIによりキトビオースに加水分解される
とともに、キトヘキサオースに転移することが判明し
た。
【００４４】実施例７ キトテトラオース５０mgとアラビノシルシトシン（以
下、ＡｒａＣという）２００mgを１mlのpH１０の溶液と
し、キチナーゼの転移反応によりＡｒａＣへの配糖化を
行なった。生成物の検出は、ＨＰＬＣを用いて行なっ
た。用いたカラムはＡｓａｈｉｐａｋ−ＮＨ2−Ｐ５０
（旭化成）で、溶媒はアセトニトリル：水＝３：１で、
流速は１ml／minで行なった。検出は２８０nmの紫外吸
収を測定した。その結果、生成物は４つあり保持容量の
小さいものより化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤとした。
下、ＡｒａＣという）２００mgを１mlのpH１０の溶液と
し、キチナーゼの転移反応によりＡｒａＣへの配糖化を
行なった。生成物の検出は、ＨＰＬＣを用いて行なっ
た。用いたカラムはＡｓａｈｉｐａｋ−ＮＨ2−Ｐ５０
（旭化成）で、溶媒はアセトニトリル：水＝３：１で、
流速は１ml／minで行なった。検出は２８０nmの紫外吸
収を測定した。その結果、生成物は４つあり保持容量の
小さいものより化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤとした。
【００４５】生成物はセファデックスＧ２５で精製を行
ない、Ａ及びＢからなる分画Ｌ、Ｃ及びＤからなる分画
Ｈを得た。生成物の構造確認のため、生成物の検出に用
いたものと同じシステムを使い、それぞれのピークを単
離精製した。得られたＡ〜Ｄの構造は次の通りである。
ない、Ａ及びＢからなる分画Ｌ、Ｃ及びＤからなる分画
Ｈを得た。生成物の構造確認のため、生成物の検出に用
いたものと同じシステムを使い、それぞれのピークを単
離精製した。得られたＡ〜Ｄの構造は次の通りである。
【００４６】
【化２】
【００４７】
【００４８】Ｇ−４０１（卵巣ガンス）細胞培養上清中
のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及び市販の同酵
素により、化合物Ａ及びＢはＮ−アセチルグルコサミン
とＡｒａＣに分解された。また、Ｃは、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンと化合物Ａに分解された。また、Ｄは、Ｎ−
アセチルグルコサミンと化合物Ｂに分解された。
のβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及び市販の同酵
素により、化合物Ａ及びＢはＮ−アセチルグルコサミン
とＡｒａＣに分解された。また、Ｃは、Ｎ−アセチルグ
ルコサミンと化合物Ａに分解された。また、Ｄは、Ｎ−
アセチルグルコサミンと化合物Ｂに分解された。
【００４９】実施例８ 無血清培地セルグロッサーＰ（関東化学）１mlにＧ−４
０１細胞を５×１０4個播種し、ＡｒａＣ又はＣｈｉｔ
ｏ−Ｈ−ＡｒａＣ（実施例７の化合物Ｃ及びＤを含む分
画Ｈ）を０〜１００μＭの濃度になるように加えた。そ
のまま５日間培養を行ない、増殖抑制をもって活性を指
標とした。５日後、細胞数を測定したところ、次の表３
のようになり１０μＭでＧ−４０１細胞に対する増殖抑
制を示した。
０１細胞を５×１０4個播種し、ＡｒａＣ又はＣｈｉｔ
ｏ−Ｈ−ＡｒａＣ（実施例７の化合物Ｃ及びＤを含む分
画Ｈ）を０〜１００μＭの濃度になるように加えた。そ
のまま５日間培養を行ない、増殖抑制をもって活性を指
標とした。５日後、細胞数を測定したところ、次の表３
のようになり１０μＭでＧ−４０１細胞に対する増殖抑
制を示した。
【００５０】
【表３】
【００５１】実施例９ ＲＰＭＩ １６４０を基本とする培地Ａに、癌細胞５×
１０4個播種し、ＡｒａＣ、Ｃｈｉｔｏ−Ｌ−ＡｒａＣ
（実施例７の化合物Ａ及びＢを含む分画Ｌ）及びＣｈｉ
ｔｏ−Ｈ−ＡｒａＣ（実施例７の化合物Ｃ及びＤを含む
分画Ｈ）を０〜１００μＭの濃度となるように加えた。
そのまま３日間培養し、増殖抑制をもって活性の指標と
した。得られた結果を表４〜表７に示す。
１０4個播種し、ＡｒａＣ、Ｃｈｉｔｏ−Ｌ−ＡｒａＣ
（実施例７の化合物Ａ及びＢを含む分画Ｌ）及びＣｈｉ
ｔｏ−Ｈ−ＡｒａＣ（実施例７の化合物Ｃ及びＤを含む
分画Ｈ）を０〜１００μＭの濃度となるように加えた。
そのまま３日間培養し、増殖抑制をもって活性の指標と
した。得られた結果を表４〜表７に示す。
【００５２】 培地Ａ： ＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）４７５mlに、無菌的に ５ml Ｌ−グルタミン２００mM（×１００）（ＧＩＢＣＯ） ＭＥＭ非必須アミノ酸１０mM（×１００）（ＧＩＢＣＯ） ５ml ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液１００mM（×１００） ５ml （ＧＩＢＣＯ） ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ） ５ml 及びＦｌｏｗラボラトリーのＦＣＳ（５６℃、３５分の
処理をして不活化したもの）を５ml加えて用いた。 用いた癌細胞： Ｇ−４０１ （卵巣ガン） Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ （肝ガン） ＨｅＬａ （子宮頸部ガン） Ａ−５４９ （肺ガン）
処理をして不活化したもの）を５ml加えて用いた。 用いた癌細胞： Ｇ−４０１ （卵巣ガン） Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒ （肝ガン） ＨｅＬａ （子宮頸部ガン） Ａ−５４９ （肺ガン）
【００５３】
【表４】
【００５４】
【表５】
【００５５】
【表６】
【００５６】
【表７】
【図１】実施例２における培養液のブチルトヨパール６
５０Ｍカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す
図面である。
５０Ｍカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示す
図面である。
【図２】実施例３におけるピークＣ画分のＱ−セファロ
ース急流速カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
ース急流速カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
【図３】実施例３におけるピークＡ画分のＱ−セファロ
ース急流速カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
ース急流速カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
【図４】実施例４におけるピークｂ画分のセファクリル
Ｓ−２００カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
Ｓ−２００カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
【図５】実施例４におけるピークａ画分のセファクリル
Ｓ−２００カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
Ｓ−２００カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを
示す図面である。
【図６】本発明の精製キチナーゼのＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示
す図面である。
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示
す図面である。
【図７】実施例６における反応開始６０分後のＨＰＬＣ
の結果を示す図面である。
の結果を示す図面である。
【図８】実施例７における反応時間の経過にともなう転
移反応生成物の推移を示す図面である。
移反応生成物の推移を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤本 浩 神奈川県小田原市成田540 明治乳業ヘ ルスサイエンス研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/42 C12P 19/26 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 次の酵素化学的性質を有する耐熱性キチ
ナーゼII。 １）作用 キチンを加水分解してキトオリゴ糖を生成する。 ２）基質特異性 コロイダルキチンを加水分解してＮ−アセチルグルコサ
ミン及びＮ−アセチルキトビオースを生成する。グリコ
ールキチンを加水分解し、還元糖を生成する。またｐ−
ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−キトビオ
シドを加水分解し、ｐ−ニトロフェノールを生成する。 ３）至適pH 約１０．０ ４）pH安定性（３５℃、２４時間処理） ４．０〜８．０で９０％以上の残存活性 ５）至適温度 約８０℃ ６）温度安定性（３０分間処理） ８０℃以下で８０％以上の残存活性 ７）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法） 約７６，０００ - 【請求項２】 次の酵素化学的性質を有する耐熱性キチ
ナーゼIII。 １）作用 キチンを加水分解してキトオリゴ糖を生成する。 ２）基質特異性 コロイダルキチンを加水分解してＮ−アセチルグルコサ
ミン及びＮ−アセチルキトビオースを生成する。グリコ
ールキチンを加水分解し、還元糖を生成する。またｐ−
ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−キトビオ
シドを加水分解し、ｐ−ニトロフェノールを生成する。 ３）至適pH 約１０．０ ４）pH安定性（３５℃、２４時間処理） ４．０〜８．０で９０％以上の残存活性 ５）至適温度 約８０℃ ６）温度安定性（３０分間処理） ８０℃以下で８０％以上の残存活性 ７）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法） 約６６，０００ - 【請求項３】 次の酵素化学的性質を有する耐熱性キチ
ナーゼIV。 １）作用 キチンを加水分解してキトオリゴ糖を生成する。 ２）基質特異性 コロイダルキチンを加水分解してＮ−アセチルグルコサ
ミン及びＮ−アセチルキトビオースを生成する。グリコ
ールキチンを加水分解し、還元糖を生成する。またｐ−
ニトロフェニル−ジ−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−キトビオ
シドを加水分解し、ｐ−ニトロフェノールを生成する。 ３）至適pH 約１０．０ ４）pH安定性（３５℃、２４時間処理） ４．０〜８．０で９０％以上の残存活性 ５）至適温度 約８０℃ ６）温度安定性（３０分間処理） ８０℃以下で８０％以上の残存活性 ７）分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法） 約５９，０００
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| JP28817789 | 1989-11-06 | ||
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1997
- 1997-11-26 JP JP9324368A patent/JP2952579B2/ja not_active Expired - Lifetime
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