JP2886902B2

JP2886902B2 - 酵素含有物及びそれを用いた固定化酵素

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Publication number: JP2886902B2
Application number: JP1206263A
Authority: JP
Inventors: 穣二高橋; 文紀木村
Original assignee: NIPPON BAIRIIN KK
Current assignee: NIPPON BAIRIIN KK
Priority date: 1989-08-08
Filing date: 1989-08-08
Publication date: 1999-04-26
Anticipated expiration: 2014-04-26
Also published as: JPH0367586A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はリパーゼを用いたエステル合成反応及びエス
テル交換反応を行うのに適した酵素含有物及びそれを用
いた固定化酵素に関する。

［従来の技術］リパーゼは水の存在下において油脂の加水分解酵素と
して働くが、特定の条件下では加水分解の逆反応である
エステル合成反応を触媒する作用があることが知られて
いる。

このエステル合成反応については、1985年マサチュー
セッツ工科大学のクリバノフらが、グラムスケールでの
研究を行ない、その結果を報告している（Journal of A
merican Chemical Society1985.vol107,［24］,7072−7
076）。クリバノフらによれば、ほとんど水を含まない
ヘキサンまたはエーテルなどの有機溶媒の系で、リパー
ゼの存在下で、アルコールと脂肪酸とを反応させること
により、エステルがリパーゼの触媒作用を受けて効率よ
く合成されること、アルコールとエステルとを反応させ
ることにより、エステル交換反応が触媒されること及び
その際に高い立体特異性を示すことが報告されている。

ところで、リパーゼが触媒作用をするためには、リパ
ーゼの活性部位に水が存在していることが必要である。
上記の研究においては、反応系内に水が加えられていな
いが、グラムスケールの反応であるため、リパーゼが常
態において吸着している水、すなわち含有水分がこの働
きをしていると考えられる。つまり、反応に必要なごく
微量の水分を含む有機溶媒系（以下「微水系」という）
において、リパーゼはエステル合成反応やエステル交換
反応に対して触媒機能を発揮する。

しかしながら、このエステル合成反応をスケールアッ
プして実用化しようとすると、リパーゼの含有水分量だ
けでは不足して反応を十分に進めることはできなかっ
た。このため、反応系内に水を補給する必要があるが、
この水分量は微量の変動で反応速度や立体特異性に影響
を及ぼすので、水分量の調節が難しく、有効な水の供給
手段がなかった。

また、上記のクリバノフらの方法ではリパーゼは固定
化されずにフリーの状態にあるため、一度反応に使用す
ると回収して再使用するのは困難であった。

［発明が解決しようとする課題］本発明は上記従来技術の問題点を解消するべくなされ
たものであり、リパーゼを用いたエステル合成反応やエ
ステル交換反応において、反応系内での水分量を必要な
量に保つことができ、反応効率が高く、しかも取り扱い
が容易で、繰り返し使用することが可能な固定化酵素を
提供することを課題とする。

［課題を解決するための手段］本発明においては、上記の課題を解決するために、リ
パーゼと水と疎水性有機溶媒とを主成分とするペースト
状物からなる酵素含有物を不織布に付着せしめることに
より、固定化酵素を作成した。

［作用］すなわち、本発明はリパーゼ、疎水性有機溶媒、水を
所定量で混合すると、リパーゼがエステル合成反応やエ
ステル交換反応を触媒するのに適した量の水を水和状態
で保持したペースト状の酵素含有物が得られることを見
出してなされたものであり、この酵素含有物を繊維が三
次元的に交絡した不織布に付着させることにより、反応
基質との接触面積を飛躍的に増大させて反応効率を高め
るとともに、酵素を実質的に固定化することによって取
り扱い易く、かつ繰り返し利用することを可能にしたも
のである。なお、この酵素含有物中のリパーゼはエステ
ル合成反応をさせるためにアルコールや脂肪酸などの反
応基質と接触させても、反応生成物のエステルと接触さ
せても、酵素含有物中から外部へは溶出せず、しかも酵
素含有物中においてはフリーの酵素と同等の高い活性を
有する。

本発明に用いるリパーゼはとくに限定されないが、エ
ステル合成反応やエステル交換反応において、位置選択
性などの選択機能を持つものが望ましい。この様なリパ
ーゼとしては、例えば、すい臓リパーゼ、カンジダ系、
リゾプス系、ムコール系、アスペルギルス系起源のリパ
ーゼなどがある。リパーゼはできるだけ精製度の高いも
のを用いることが望ましい。

また、本発明の疎水性有機溶媒には、酵素であるリパ
ーゼの安定性を維持するために溶解度係数が９以下の有
機溶媒が使用される。この様な有機溶媒としては、例え
ばエーテル、炭素数６〜10のアルコール、炭素数５〜10
の炭化水素などが適しており、単独又は混合して用いら
れる。また、疎水性有機溶媒はアルコール、脂肪酸など
の反応基質や反応生成物であるエステルを溶解しやすい
ものであることが望ましい。

本発明に使用する水には、いわゆる純水を用いても良
いが、リパーゼの活性が高くなる至適pHの緩衝液を用い
るのがより望ましい。緩衝液としては、pH7.5〜8.0のリ
ン酸バッファー、ホウ酸バッファー、トリスバッファー
などが使われる。

次に、本発明の酵素含有物を製造する方法について述
べる。まず、上述のリパーゼ１重量部に対して水２〜５
重量部、疎水性有機溶媒15〜20重量部とを混合して撹拌
する。すると、溶液中にペースト状物が形成されるの
で、余剰の溶液を除去すれば酵素含有物が得られる。

この際、リパーゼに対する水の量が上記範囲より少な
かったり、疎水性有機溶媒の量が上記範囲より多くなる
とペースト状物は形成されない。また、リパーゼに対す
る水の量が上記範囲より多かったり、疎水性有機溶媒の
量が上記範囲より少なかったりすると、微粒子状のもの
が均一に分散した、いわゆるハードエマルジョンとなっ
てしまう。

なお、ペースト状物が形成された後、除去される溶液
中には、疎水性有機溶媒と水とが含まれていると考えら
れ、リパーゼと水と疎水性有機溶媒の比率は、酵素含有
物を製造する際の初期の配合比と、酵素含有物中の組成
比では異なる。

この様にして得られるペースト状の酵素含有物は、水
和したリパーゼが疎水性有機溶媒に包まれた構造になっ
ているものと推定され、リパーゼがエステル合成反応や
エステル交換反応を触媒できるように、反応系内を微水
系状態に保つことができる。また、この時リパーゼはペ
ースト内においては実質的に拘束を受けないので、フリ
ーの酵素と同等の活性を示す。

ペースト状の酵素含有物の組成は、リパーゼ１重量部
に対して、水0.9〜2.0重量部、疎水性有機溶媒0.8〜2.0
重量部であり、この範囲をはずれると微水系状態を保て
なくなったり、ペースト状を維持できなくなったりす
る。

本発明においては、上記酵素含有物によるエステル合
成やエステル交換反応を実用化するために、繊維が三次
元的に交絡した不織布に付着させて固定化酵素としてい
る。

ここで、繊維が三次元的に交絡した不織布とは、例え
ばニードルパンチ、水流絡合、気流絡合などの繊維絡合
手段により製造された不織布をいうが、とくに強度など
を要求される場合には、バインダーや接着性繊維などの
結合手段を併用してもよい。

上記不織布の見掛け密度は0.01〜0.1g/cm³の範囲にあ
ることが望ましく、見掛け密度がこれより大きいと酵素
含有物のペーストの保持量が少なくなる上に、ペースト
が不織布内部に均一に行き渡らなかったり、目詰りして
反応基質や生成物の通過が困難になったりすることがあ
り、一方、見掛け密度がこれより小さいとペーストが不
織布内に十分保持されず、反応時の撹拌などによって反
応系へ分散されるおそれがある。とくに望ましい不織布
の見掛け密度は0.04〜0.06g/cm³である。

また、上記不織布の厚みは0.3〜5.0mm、好ましくは1.
0〜3.0mmの範囲にあることが望ましい。これは、不織布
の厚みが0.3mm未満では酵素含有物のペーストを保持で
きるスペースが小さく、反応に必要な酵素量が得られな
いからであり、一方、厚みが5.0mmを超えるとペースト
の均一塗布ができず、反応基質の透過も悪くなるからで
ある。

なお、不織布を構成する繊維は、とくに限定されない
が、有機溶媒中での反応に使用するので、耐有機溶媒性
の高いものが好ましく、また、反応基質とのなじみやす
さや余剰水分の排除のしやすさの点から疎水性繊維であ
ることが望ましい。この様な繊維としては、例えばポリ
プロピレン繊維、ポリエチレン繊維、アクリル繊維、ポ
リエステル繊維などがある。

不織布に、ペースト状の酵素含有物を付着させる方法
はとくに限定されないが、不織布全体にできるだけ均一
に、かつ目詰りが生じないように付着させることが望ま
しい。この様な方法としては、例えば、不織布の両面に
酵素含有物のペーストをできるだけ均一に塗布した後、
不織布を離型性のフィルムで挟み、これをマングルなど
によって加圧する方法がある。

上記の様にして得られた固定化酵素は、三次元的な絡
合構造の不織布に酵素含有物が略均一に分布して付着し
ているため、反応基質との接触面積が大きく、また付着
している酵素の量も従来の担体結合法による酵素の平均
的な付着量約30mgに比して3gと約100倍も多い。しか
も、酵素含有物内は微水系に保たれ、酵素含有物内に含
まれるリパーゼは、酵素含有物から外部へはほとんど出
ることがないように固定化されているうえに、酵素含有
物内では拘束を受けないため、フリーの酵素と同等の高
い活性を有している。このため、本発明の固定化酵素は
大量のエステルを合成したり、エステル交換により油脂
の改質をするのに利用でき、実用化に向けて処理能力の
スケールアップを図ることができる。また、リパーゼを
含む酵素含有物は不織布に付着固定されているため、通
常の不織布を取り扱うのと同様に簡便に取り扱うことが
でき、繰り返し使用することも可能であるので、工業的
にも利用しやすい。

（実施例１）カンジダ系酵母（Candida cylindracea）由来のリパ
ーゼ（名糖産業社製、360000Units/g）8.0g、ｎ−オク
タノール（和光純薬社製、特級）148g、pH7.7のリン酸
バッファー20gを300ml容のセパラブルフラスコに入れ、
温度を37℃に保ち、40mm標準型４枚平羽根で250rpmの速
度で120分間攪拌して、ペースト状の酵素含有物25.47g
を得た。

このペースト状の酵素含有物を見掛け密度0.04g/c
m³、厚み2mmのポリプロピレン繊維製ニードルパンチ不
織布に塗布した後、不織布をポリエステルフィルムに挟
み、スチール・スチールマングルに通して固定化酵素を
得た。この固定化酵素の酵素量は2.7g/80cm²であった。

この固定化酵素を用いて、以下の手順でエステル合成
を行なった。

まず、直径45mm、20メッシュ金網製の円筒状支持体の
外側に、本実施例の固定化酵素を取り付けたものを、30
0ml容のセパラブルフラスコに入れた。次に、このフラ
スコに反応基質であるｎ−オクタノール88mlと２−ブロ
モ酪酸（東京化成社製、特級）12mlを加えた。この後、
温度を37℃に保ち、40mm標準型４枚平羽根で250rpmの速
度で攪拌してエステル合成反応を行なった。

活性は、アルカリ滴定法により、反応液中に存在する
有機酸の経時的な減少量からエステルの合成率を計算し
て求め、結果を第１表に示した。また、この固定化酵素
を繰り返し使用し、その機能の維持できる回数も合せて
第１表に示した。なお、反応形式は反復回分法を採用し
た。

（実施例２〜５）リパーゼ、ｎ−オクタノール、リン酸バッファーの配
合量を第１表に示すように変更したこと以外は、実施例
１と同様にして固定化酵素を作成し、活性と繰返し使用
回数を求めて第１表に示した。

（比較例１〜４）リパーゼ、ｎ−オクタノール、pH7.7のリン酸バッフ
ァーの配合量を第２表に示すように変更したこと以外
は、実施例１と同様にして酵素含有物を作成した。

ところが、比較例１はｎ−オクタノールの過剰から、
比較例３はリン酸バッファー、すなわち水の不足から、
ペースト状の酵素含有物は形成されなかった。

また、比較例２はｎ−オクタノールの不足から、比較
例４は水の過剰から、ハードエマルジョンになった。た
だし、比較例２、４のエマルジョンは実施例１で用いた
不織布への付着が可能であったので、実施例１と同様に
して固定化酵素を作成し、活性と繰返し使用回数を求め
て第２表に示した。

第２表から明らかなように、比較例２、４の活性は実
施例１より低く、また繰返し使用回数も、比較例２、４
の酵素含有物が担体である不織布から容易にはく離し
て、繰返し使用に耐えないため極めて低い値であった。

［発明の効果］本発明の酵素含有物及びそれを用いた固定化酵素は上
述のような構成からなるため、以下に示す効果を奏す
る。

本発明の酵素含有物は微水系であるため、リパーゼが
エステル合成反応やエステル交換反応を触媒する働きを
する。

従って、本発明の酵素含有物及び固定化酵素はエステ
ルの合成やエステル交換による油脂の改質に利用でき
る。

また、リパーゼの位置選択性などの選択機能を利用し
て、光学的に活性なエステルを合成するといった、有機
化合物のラセミ体の合成的分割にも利用できる。

本発明の酵素含有物は水分量をリパーゼの活性に必要
な一定量に保ち、微水系を維持できるため、煩雑な水の
供給手段をとる必要がない。

また、本発明の酵素含有物では、リパーゼは酵素含有
物から外部へはほとんど出ないように固定化されている
が、酵素含有物内での自由度は大きく、フリーのリパー
ゼと同等の高い活性を有する。

本発明の固定化酵素は、三次元的な絡合構造の不織布
に酵素含有物が略均一に分布して付着した構造になって
おり、反応基質との接触面積が大きく、付着している酵
素の量も多い。

このため、大量のエステルの合成反応に使用でき、処
理能力のスケールアップを計ることができる。

本発明の固定化酵素は、酵素含有物が不織布に付着固
定されているため、通常の不織布を取り扱うのと同様に
簡便に取り扱うことができる。

また、固定化されていることにより、繰り返し使用す
ることも可能である。

このように、本発明の固定化酵素は、エステル合成や
エステル交換反応に利用するのに極めて有用なものであ
る。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】リパーゼと水と疎水性有機溶媒とを主成分
とするペースト状物からなることを特徴とする酵素含有
物。
【請求項２】リパーゼ１重量部に対する水の割合が0.9
〜2.0重量部である請求項１に記載の酵素含有物。
【請求項３】リパーゼ１重量部と水２〜５重量部と疎水
性有機溶媒15〜20重量部とを混合してペースト状物を形
成した後、溶液を除去することを特徴とするペースト状
の酵素含有物の製造方法。
【請求項４】請求項１または２に記載の酵素含有物が不
織布に付着していることを特徴とする固定化酵素。