CN101613691B - 一种脂肪酶的固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂肪酶的固定化方法，使用纺织物或者无纺布等薄膜状材料为基布载体，通过织物整理剂对基布载体的表面做改性处理形成疏水性的表面，将改性处理后的基布置于酶溶液或酶的浆状物中浸泡，将基布干燥处理后实现酶的固定化。基布改性处理后形成的疏水性的表面有利于实现脂肪酶活性构象的固定化，有效减少固定化过程中酶的失活现象，本发明具有固定化脂肪酶活性高、固定化脂肪酶稳定性高、基布的选择范围更大、操作简便、条件要求温和及易于实现等优点。

Description

一种脂肪酶的固定化方法

技术领域

本发明涉及脂肪酶的固定化方法，具体涉及一种将脂肪酶采用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的固定化脂肪酶的方法。

背景技术

随着脂肪酶研究的深入和脂肪酶工程的发展，脂肪酶的应用越来越广泛。将脂肪酶用物理或化学的方法固定在不溶于水的载体上，形成一种可以重复使用的脂肪酶，叫固定化脂肪酶。固定化脂肪酶既保持了脂肪酶的催化特性，又克服了游离脂肪酶的不稳定性，具有可反复或连续使用、易与反应产物分离等显著优点，广泛应用于医药、轻工、食品等行业。

固定化脂肪酶使工业用脂肪酶的稳定性提高并延长了脂肪酶的使用寿命，因此脂肪酶的固定化受到了较为广泛的关注。脂肪酶通常是被固定于不溶性的固体载体上，这有利于提高脂肪酶的热稳定性、使用稳定性、结构稳定性，从而降低其使用成本。另一方面，固定化载体也是影响固定化脂肪酶性能的一个重要的因素。载体表面的微环境对固定化脂肪酶的活力和稳定性有重要的影响，具有良好生物相容性和适度平衡亲疏水性的载体能够为脂肪酶创造适宜的微环境，减少非生物特异性的“脂肪酶-载体”相互作用，有效降低无机物及杂质的吸附。因此，选取合适的载体和恰当的表面改性方法显得尤为重要。

选用不同的材料为载体、特别是在固体粉体材料上固定化脂肪酶已有大量的报道，但载体成本高又无法回收成为一个重要的制约。以膜状物为载体有一定的报道，但这些膜，如静电纺丝膜、中空纤维膜等，虽然功能性较强，但也普遍存在成本偏高，尚不能规模化生产等限制。近年来，随着纳米技术的进一步发展，也设计开发了不少微观结构规整的纳米多孔材料，研究得较多的如：二氧化硅、碳酸钙、碳纳米管、氧化铝等。但这类无机材料本身生物相容性较差，固定化的过程易引起蛋白构象的改变，在对其的修饰改性中又容易带入新的影响脂肪酶构象的因素，而脂肪酶这类生物大分子的活性往往是基于其特定的三维结构，因此这类多孔纳米材料也还有待进一步改善。

在固定化方法上，常见的吸附法操作简单但作用力不强，吸附不牢固；共价法作用力强，但会导致脂肪酶部分位点的失活，造成脂肪酶活的降低；交联涉及多步化学反应使得成本高昂。

虽然现有的固定化脂肪酶的方法很多，但由于均存在一定的缺点，有的载体成本偏高，有的脂肪酶与载体结合不牢固，有的方法复杂等等，因此很难找到一种理想的固定化脂肪酶的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪酶的固定化方法，该方法具有固定化脂肪酶活性高的优点。

本发明的脂肪酶的固定化方法是使用一种纺织物或者无纺布等薄膜状材料为基布载体，通过织物整理剂对基布载体的表面改性形成疏水性的表面，将改性处理后的基布置于脂肪酶溶液或脂肪酶的浆状物中浸泡，将基布干燥处理后实现脂肪酶的固定化。

实现上述发明目的的技术方案如下：

1)按照织物整理剂与溶剂的体积比配制0.1-10％的织物整理剂溶液，按照织物整理剂溶液与基布的体积重量比(ml/g)为10∶1-50∶1量取织物整理剂溶液；

2)将基布浸渍于步骤1)量取的织物整理剂溶液中，在25-50℃处理0.1-2小时，将处理后的基布在40-70℃烘干；

3)将步骤2)处理后的基布置于脂肪酶溶液或脂肪酶的浆状物中3-10小时；

4)将上述载有脂肪酶的基布于干燥后即得。

其中，所述织物整理剂优选有机硅类织物整理剂，如氨基硅油聚合物，可以来源于市售商品或自制剂方。

其中，所述基布为纺织物或者无纺布或其它的薄膜材料，所述纺织物包括棉布或丝绸等，所述无纺布包括丙纶、氨纶、聚酯纤维、晴纶、涤纶或尼龙等。

其中，步骤1)所述溶剂可以是有机溶剂或水，有机溶剂如正己烷。

其中，步骤2)中基布在40-70℃烘干后，可再将基布在100-150℃烘1-2分钟。

其中，步骤3)所述脂肪酶包括脂肪酶粉、胞外产脂肪酶或细胞破壁后的发酵液。

其中，步骤3)具体为：将脂肪酶粉均匀分散溶于1-1000倍重量的水中，形成脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液，将步骤2)处理后的基布置于脂肪酶的浆状物或脂肪酶溶液中3-10小时。

本发明以廉价的纺织物或者无纺布等薄膜状材料为基布载体，借助织物整理剂对基布做改性处理后将脂肪酶固定。本发明中所用的脂肪酶的固定化方法有如下优点：

1、固定化脂肪酶的活性高：基布改性处理后形成的疏水性的表面有利于实现脂肪酶活性构象的固定化，有效减少固定化过程中酶的失活现象，同时疏水表面也有利于小分子的疏水底物靠近酶的活性中心，从而提高反应速率。

2、固定化脂肪酶的稳定性高：基布改性处理后形成的疏水改性织物作载体，脂肪酶与载体间形成强烈的疏水相互作用，有利于稳定酶的活性构象，从而使固定化脂肪酶的稳定性提高。另一方面，在脂肪酶催化的酯化反应中，水作为产物之一，容易在载体上过多的累积，从而导致固定化脂肪酶活性和稳定性的下降。而疏水改性织物能够有效的降低水在载体上的积累，从而提高了固定化脂肪酶长期操作的稳定性。

3、基布的选择范围更大：对于基布的选择可以根据应用的需要和反应器的具体情况，选择不同厚度、不同硬度等。

4、处理方法简单，条件要求温和，易于实现。

5、固定化脂肪酶形态多：固定化脂肪酶可以膜状、碎片状、筒状、条状等形态出现，适应于更广泛形式的反应器，减少压降和扩散阻力。

附图说明

图1为本发明采用织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶酯化稳定性对比图。

图2为本发明采用织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶在高水含量下酯化率对比图。

具体实施方式

下面通过实施例详细说明本发明的脂肪酶的固定化方法及其带来的技术效果。本发明中所使用的原料或组分如无特别说明均可以通过商业途径购得或按照常规方法制得。

实施例1使用氨基硅油聚合物AS2-8040表面整理载体制备固定化脂肪酶

织物整理剂氨基硅油聚合物AS2-8040，道康宁(美国)公司。

具体步骤如下：

1)称取一定体积的氨基硅油聚合物溶解于正己烷中，配制成0.5％(v/v)浓度的溶液；

2)按照丝绸质量∶整理液体积＝1∶20(g/ml)的浴比将剪成小块的织布浸泡于氨基硅油溶液中，35℃，120rpm振荡1h，整理后的织物布在70℃下干燥30分钟；

3)改性后基布置于10℃脂肪酶溶液中固定化3小时；

4)固定化脂肪酶于阴凉通风处晾干即可。

实施例2使用氨基硅油微乳液C220A的表面整理载体制备固定化脂肪酶

织物整理剂氨基硅油微乳液C220A，中国纺织科学院究院。

具体步骤如下：

1)按照织物布质量∶整理液体积＝1∶20(g/ml)的浴比将剪成小块的织物布浸泡于去离子水稀释后的微乳液中，微乳液C220A的用量为织物布质量的5％；

2)在35℃，120rpm条件下振荡1h，整理后的织物布在70℃下干燥25分钟，再在100℃下烘1分钟；

3)改性后基布置于25℃脂肪酶溶液中固定化3小时；

4)固定化脂肪酶冷冻干燥后即可。

下面通过对比来说明本发明较常规方法的优势与改进。

比较例1织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶催化水解比较

具体方法如下：

1)织物整理剂改性处理后的基布载体制备参照实施例1，将未整理和用氨基硅油聚合物AS2-8040整理后的3cm×3cm大小的丝绸各一块，浸没至5ml 10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10℃固定化3h；固定化脂肪酶于阴凉通风处晾干；

2)以35℃10分钟水解橄榄油-聚乙烯醇乳化液的方法确定固定化脂肪酶酶活。

酶活定义为：测定条件下每分钟产生1μmol脂肪酸的所需脂肪酶量，即为1个脂肪酶酶活单位，以U表示。

固定化脂肪酶酶活回收率定义为：固定化脂肪酶的表观活力/(固定化脂肪酶溶液中活力-固定化后残余脂肪酶溶液总活力)

实验结果如表1，其中直接吸附是指载体未经织物整理剂氨基硅油整理，直接在脂肪酶溶液中浸没用来固定化脂肪酶；氨基硅油改性是指采用本发明实施例1的方法得到的固定化脂肪酶。说明载体经织物整理剂改性处理后，载体表面疏水性增强，脂肪酶活力和酶活回收率明显提高。

表1本发明氨基硅油改性法与直接吸附法的固定化脂肪酶活力比较

比较例2织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶催化酯化比较

具体方法如下：

1)织物整理剂改性处理后的基布载体制备参照实施例2，将未整理和用整理剂C220A整理后的3cm×3cm大小的丝绸各一块，浸没至5mL10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10℃固定化3h，冷冻干燥固定化脂肪酶；

2)每3cm×3cm大小的固定化脂肪酶催化5mL摩尔浓度为均为500mM/L的十二酸和十二醇的正己烷溶液，40℃下反应。每次反应残余物用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪酸含量；

实验结果如表2，说明载体经织物整理剂改性处理后，载体表面疏水性增强，酯化活力明显提高。

表2织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶催化酯化比较

比较例3织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶在不同有机溶剂中的稳定性比较

具体方法如下：

1)织物整理剂改性处理后的基布载体制备参照实施例1，将未整理或用氨基硅油聚合物AS2-8040整理后的3cm×3cm大小的丝绸各一块，浸没至5mL 10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10℃固定化3h，固定化脂肪酶于阴凉通风处晾干；

2)将一定量的固定化脂肪酶分别在正己烷、甲苯、三氯甲烷、丙酮、异丙醇和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等不同极性的有机溶剂中于15℃浸泡24h，取出后按比较例1中方法测定其水解酶活；

3)以未在有机溶剂中浸泡的固定化脂肪酶的酶活为100％，计算其它固定化脂肪酶的相对酶活。

实验结果如表3。可见，疏水整理后的载体固定化脂肪酶对于不同有机溶剂的稳定性均高于未经整理的载体固定化脂肪酶，该结果进一步证明了疏水界面活化对固定化脂肪酶的改善作用，整理改性后的载体表面有利于稳定脂肪酶的活性构象，从而使其稳定性获得提高。

表3织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶在不同有机溶剂中的稳定性比较

注：Log P为有机溶剂在水和正辛烷中的分配系数。

比较例4织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶在高水含量下酯化率比较

具体方法如下：

1)织物整理剂改性处理后的基布载体制备参照实施例1，将未整理和用氨基硅油聚合物AS 2-8040整理后的3cm×3cm大小的丝绸各一块，浸没至5mL 10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10℃固定化3h，固定化脂肪酶于阴凉通风处晾干；

2)每3cm×3cm大小的固定化脂肪酶催化5mL摩尔浓度均为500mM/L的十二酸和十二醇的正己烷溶液，按照体积百分比分别向反应体系加入0-15％的去离子水。40℃下反应4h。加入20mL无水乙醇结束反应，用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪酸含量。固定化脂肪酶的酯化转化率的确定同前。

实验结果如图1。从图1可见，在相同的体系含水量下，疏水改性整理后的载体固定化脂肪酶酯化转化率(esterification)高于未改性整理的，且这种优势随着体系含水量的增大，越加明显。充分说明整理改性的织物能够避免水在载体表面过多的积累，从而为脂肪酶提供一个良好的微环境，使固定化脂肪酶保持高活性。

比较例5织物整理剂整理后载体与未整理载体固定化脂肪酶酯化稳定性比较

具体方法如下：

1)织物整理剂改性处理后的基布载体制备参照实施例1，将未整理或用氨基硅油聚合物AS2-8040整理后的3cm×3cm大小的丝绸各一块，浸没至5mL 10mg/mL脂肪酶(7000U/g)溶液中，在10℃固定化3h；固定化脂肪酶于阴凉通风处晾干；

2)每3cm×3cm大小的固定化脂肪酶催化5mL摩尔浓度为均为500mM/L的十二酸和十二醇的正己烷溶液，40℃下反应12小时。反应结束后将固定化脂肪酶投入新鲜的底物溶液中继续下一批反应。每次反应残余物用50mM/L的NaOH溶液滴定剩余的脂肪酸含量。

固定化脂肪酶的酯化转化率(conversion)定义为：测定条件下，已转化了的脂肪酸摩尔量占初始反应脂肪酸摩尔量的百分比；

实验结果如图2。从图2可见，疏水改性织物作载体，显著提高了固定化脂肪酶长期操作的稳定性。

以上实施例只是用于进一步说明本发明，而不是用来限制本发明的保护范围。凡是在本发明保护范围内所做出的具体实施方式及应用范围上的些许变动，也属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种脂肪酶的固定化方法，其特征在于包括如下步骤：

1）按照织物整理剂与溶剂的体积比配制0.1-10%的织物整理剂溶液，按照织物整理剂溶液与基布的以ml/g为单位的体积重量比为10：1－50：1量取织物整理剂溶液；所述织物整理剂为有机硅类织物整理剂，其主要有效成分为氨基硅油聚合物；所述基布为纺织物或者无纺布；

2）将基布浸渍于步骤1）量取的织物整理剂溶液中，在25-50℃处理0.1-2小时，将处理后的基布在40-70℃烘干；

3）将步骤2）处理后的基布置于脂肪酶溶液或脂肪酶的浆状物中3-10小时；

4）将上述载有脂肪酶的基布干燥后即得。

2.根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述纺织物包括棉布或丝绸。

3.根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述无纺布包括丙纶、氨纶、腈纶、涤纶或锦纶。

4.根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤1）所述溶剂为有机溶剂或水。

5.根据权利要求4所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述有机溶剂是正己烷。

6.根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤2）中所述基布在40-70℃烘干后，将基布在100-150℃烘1-2分钟。

7.根据权利要求1所述的脂肪酶的固定化方法，其特征在于步骤3）所述脂肪酶包括脂肪酶粉、胞外产脂肪酶或细胞破壁后的发酵液。

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