JPH0367586A

JPH0367586A - 酵素含有物及びそれを用いた固定化酵素

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Publication number: JPH0367586A
Application number: JP1206263A
Authority: JP
Inventors: Joji Takahashi; 高橋　穣二; Noritoshi Kimura; 文紀木村
Original assignee: Japan Vilene Co Ltd
Current assignee: Japan Vilene Co Ltd
Priority date: 1989-08-08
Filing date: 1989-08-08
Publication date: 1991-03-22
Anticipated expiration: 2014-04-26
Also published as: JP2886902B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はリパーゼを用いたエステル合成反応及びエステ
ル交換反応を行うのに適した酵素含有物及びそれを用い
た固定化酵素に関する。

［従来の技術］リパーゼは水の存在下において油脂の加水分解酵素とし
て働くが、特定の条件下では加水分解の逆反応であるエ
ステル合成反応を触媒する作用があることが知られてい
る。

このエステル合成反応については、１９８５年マサチュ
ーセッツ工科大学のクリバノフらが、ダラムスケールで
の研究を行ない、その結果を報告している（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃ、ａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
５ｏｃｉｅｔｙ１９８５、ｖｏ１１０７．［２４］、７
０７２−７０７（５）　、クリバノフらによれば、はと
んど水を含まないヘキサンまたはエーテルなとの有機溶
媒の系で、リパーゼの存在下で、アルコールと脂肪酸と
を反応させることにより、エステルがリパーゼの触媒作
用を受けて効率よく合成されること、アルコールとエス
テルとを反応させることにより、エステル交換反応が触
媒されること及びその際に高い立体特異性を示すことが
報告されている。

ところで、リパーゼが触媒作用をするためには、リパー
ゼの活性部位に水が存在していることが必要である。上
記の研究においては、反応系内に水が加えられていない
が、ダラムスケールの反応であるため、リパーゼが常態
において吸着している水、すなわち含有水分がこの働き
をしていると考えられる。つまり、反応に必要なごく微
量の水分を含む有４！！溶媒系（以下「微水系」という
）において、リパーゼはエステル合成反応やエステル交
換反応に対して触媒機能を発揮する。

しかしながら、このエステル合成反応をスケールアップ
して実用化しようとすると、リパーゼの含有水分量だけ
では不足して反応を十分に進めることはできなかった。

このため、反応系内に水を補給する必要があるが、この
水分量は微量の変動で反応速度や立体特異性に影響を及
ぼすので、水分量の調節が難しく、有効な水の供給手段
がなかった・また、上記のクリバノフらの方法ではリパーゼは固定化
されずにフリーの状態にあるため、−度反応に使用する
と回収して再使用するのは困難であった。

［発明が解決しようとする課Ｂ］本発明は上記従来技術の問題点を解消するべくなされた
ものであり、リパーゼを用いたエステル合成反応やエス
テル交換反応において、反応系内での水分量を必要な量
に保つことができ、反応効率が高く、しかも取り扱いが
容易で、繰り返し使用することが可能な固定化酵素を提
供することを課題とする。

［課題を解決するための手段］本発明においては、上記の課題を解決するために、リパ
ーゼと水と疎水性有機溶媒とを主成分とするペースト状
物からなる酵素含有物を不織布に付着せしめることによ
り、固定化酵素を作成した。

［作用］すなわち、本発明はリパーゼ、疎水性有機溶媒、水を所
定量で混合すると、リパーゼがエステル合成反応やエス
テル交換反応を触媒するのに適した量の水を水和状態で
保持したペースト状の酵素含有物が得られることを見出
してなされたものであり、この酵素含有物を繊維が三次
元的に交絡した不織布に付着させることにより、反応基
質との接触面積を飛躍的に増大させて反応効率を高める
とともに、酵素を実質的に固定化することによって取り
扱い易く、かつ繰り返し利用することを可能にしたもの
である。なお、この酵素含有物中のリパーゼはエステル
合成反応をさせるためにアルコールや脂肪酸などの反応
基質と接触させても、反応生成物のエステルと接触させ
ても、酵素含有物中から外部へは溶出せず、しかも酵素
含有物中においてはフリーの酵素と同等の高い活性を有
する。

本発明に用いるリパーゼはとくに限定されないが、エス
テル合成反応やエステル交換反応において、位置選択性
などの選択機能を持つものが望ましい。この様なリパー
ゼとしては、例えば、すい臓リパーゼ、カンジダ系、リ
ゾプス系、ムコール系、アスペルギルス系起源のリパー
ゼなどがある。

リパーゼはできるだけｌＷ製度の高いものを用いること
が望ましい。

また、本発明の疎水性有８１溶媒には、酵素であるリパ
ーゼの安定性を維持するために溶解度係数が９以下の有
８！溶媒が使用される。この様な有機溶媒としては、例
えばエーテル、炭素数６〜１０のアルコール、炭素数５
〜ｌＯの炭化水素などが適しており、単独又は混合して
用いられる。また、疎水性有機溶媒はアルコール、脂肪
酸などの反応基質や反応生成物であるエステルを溶解し
やすいものであることが望ましい。

本発明に使用する水には、いわゆる純水を用いても良い
が、リパーゼの活性が高くなる至適ｐＨの緩衝液を用い
るのがより望ましい。緩衝液としては、ｐＨ７，５〜８
．０のリン酸バッファー、ホウ酸バッフ７−、トリスバ
ッファーなどが使われる。

次に、本発明の酵素含有物を製造する方法について述べ
る。まず、上述のリパーゼ１重量部に対して水２〜５重
量部、疎水性有ａ溶媒１５〜２０重量部とを混合して攪
拌する。すると、溶液中にペースト状物が形成されるの
で、余剰の溶液を除去すれば酵素含有物が得られる。

この際、リパーゼに対する水の量が上記範囲より少なか
ったり、疎水性有４１！溶媒の量が上記範囲より多くな
るとペースト状物は形成されない、ま。

た、リパーゼに対する水の量が上記範囲より多かったり
、疎水性有４１Ｊ！溶媒の量が上記範囲より少なかった
りすると、微粒子状のものが均一に分散した、いわゆる
ハードエマルジョンとなってしまう。

なお、ペースト状物が形成された後、除去される溶ｔα
中には、疎水性有機溶媒と水とが含まれていると考えら
れ、リパーゼと水と疎水性有機溶媒０置率は、酵素含有
物を製造する際の初期の配合比と、酵素含有物中の組成
比では異なる。

この様にして得られるペースト状の酵素含有物は、水和
したリパーゼが疎水性有８１溶媒に包まれた構造になっ
ているものと推定され、リパーゼがエステル合成反応や
エステル交換反応を触媒できるように、反応系内を微水
系状態に保つことができる。また、この時リパーゼはペ
ースト内においては実質的に拘束を受けないので、フリ
ーの酵素と同等の活性を示す。

ペースト状の酵素含有物の組成は、リパーゼ・１重量部
に対して、水０．９〜２．０重量部、疎水性有機溶媒０
．８〜２．０重量部であり、この範囲をはずれると微水
系状態を保てなくなったり、ペースト状を維持できなく
なったりする。

本発明においては、上記酵素含有物によるエステル合成
やエステル交換反応を実用化するために、繊維が三次元
的に交絡した不縁布に付着させて固定化＃素としている
。

ここで、ｌａ紺が三次元的に交絡した不縁布とは、例え
ばニードルパンチ、水流絡合、気流路台などの繊維絡合
手段により製造された不縁布をいうが、とくに強度など
を要求される場合には、バインダーや接着性１ｍ紺など
の結合手段を併用してもよい。

上記不織布の見掛は密度は０．０１＝０．１Ｈ／ｃｏ＋
３の範囲にあることが望ましく、見掛は密度がこれより
大きいと酵素含有物のペーストの保持量が少なくなる上
に、ペーストが不織布内部に均一に行き渡らなかったり
、目詰りして反応基質や生成物の通過が困難になったり
することがあり、一方、見掛は密度がこれより小さいと
ペーストが不ｍ布内に十分保持されず、反応時の攪拌な
どによって反応系へ分散されるおそれがある。とくに望
ましい不織布の見掛は密度は（ＬＯ４〜０．０６１／ｅ
＋ｍ　３である。

また、上記不織布の厚みは０．３〜５．０−１好ましく
は１．０〜３．０１ｌｌｌの範囲にあることが望ましい
。これは、不織布の厚みが０．３ｍ未満では酵素含有物
のペーストを保持できるスペースが小さく、反応に必要
な酵素量が得られないからであり、一方、厚みが５．０
−を超えるとペーストの均一塗布ができず、反応基質の
透過も悪くなるからである。

なお、不縁布を構成する繊維は、とくに限定されないが
、有機溶媒中での反応に使用するので、飼育ｌａ溶媒性
の高いものが好ましく、また、反応基質とのなじみやす
さや余剰水分の排除のしやすさの点から疎水性ｉ！ｍ１
ｔｔであることが望ましい。この様な繊維としては、例
えばポリプロピレンｍ１ｔｔ、ポリエチレン繊維、アク
リル！ａｌｌＩ、ポリエステル繊維などがある。

不！ｄ布に、ペースト状の酵素含有物を付着させる方法
はとくに限定されな％＜が、不織布全体にできるだけ均
一に、かつ目詰りが生じないように付着させることが望
ましい、この様な方法としては、例えば、不ｍ布の両面
に酵素含有物のペーストをできるだけ均一に塗布した後
、不縁布を離型性のフィルムで挟み、これをマングルな
どによって加圧する方法がある。

上記の様にして得られた固定化酵素は、三次元的な絡合
揉造の不織布に酵素含有物が略均−に分布して付着して
いるため、反応基質との接触面積が大きく、また付着し
ている酵素の量も従来の担体結合法による酵素の平均的
な付着量約３０ｍｇに比して３ｇと約１００倍も多い。

しかも、酵素含有物内は微水系に保たれ、酵素含有物内
に含まれるリパーゼは、酵素含有物から外部へはほとん
ど出ることがないように固定化されているうえに、酵素
含有物内では拘束を受けないため、フリーの酵素と同等
の高い活性を有している。このため、本発明の固定化酵
素は大量のエステルを合成したり、エステル交換により
油脂の改質をするのに利用でき、実用化に向けて処理能
力のスケールアップを図ることができる。また、リパー
ゼを含む酵素含有物は不織布に付着固定されているため
、通常の不織イσを取り扱うのと同様に簡便に取り扱う
ことができ、繰り返し使用することも可能であるので、
工業的にも利用しやすい。

（実施例１）カンジダ系酵母（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃ
ｅａ）由来のリパーゼ（名糖産業社製、３６００００Ｕ
ｎｉｔｓ／ｇ）　８．０ｇ、ｎ−オクタノール（和光純
某社製、特級）１４８ｇ、ｐｆ１７．７のリン酸バッフ
ァー２０ｇを３００ｍ１容のセパラブルフラスコに入れ
、温度を３７℃に保ち、４０　ｗ　ａ　’ｊＸ型４枚乎
羽根で２５０ｒｐａ＋の速度で１２０分間１１ｚ拌して
、ペースト状の酵素含有物２５．４７ｇを得た。

このペースト状の酵素含有物を見掛は密度０．０４３／
ｗ３、厚み２１１１１１のポリプロピレン繊＆ｉｔ製二
−ドルパンチ不織布に塗布した後、不織布をポリエステ
ルフィルムに挟み、スチール・スチールマングルに通し
て固定化酵素を得た。この固定化酵素の酵素竜は２　、
７ＪＥ／８０１？Ｉｌ　”であった。

この固定化Ｂｉを用いて、以下の手順でエステル合成を
行なった。

まず、直径４５＋ｗ、２０メツシュ金ｗＪ５：！の円筒
状支持体の外側に、本実施例の固定化酵素を取り付けた
ものを、３００ｍ　ｌ容のセパラブルフラスコに入れた
。次に、このフラスコに反応基質であるｎ−オクタノー
ル８８ｆｆｉ１と２−ブロモ酪′ｒＩ！ｉ（東京化成社
製、特級）　１２ｍ１を加えた。この後、温度を３．７
℃に保ち、４０ｍ５＋ｅＡ準型４枚平羽根で２５０ｒｐ
ｍの速度で撹拌してエステル合成反応を行なった。

活性は、アルカリ滴定法により、反応（α中に存在する
有機酸の経時的な減少量からエステルの合成率を計算し
て求め、結果を第１表に示した。また、この固定化酵素
を縁り返し使用し、その機能の維持できる回数も合せて
第１表に示した。なお、反応形式は反復回分法を採用し
た。

（実施例２〜５）リパーゼ、ｎ−オクタノール、リン酸バッファーの配合
量を第１表に示すように変更したこと以外は、実施例１
と同様にして固定化酵素を作成し、活性と繰返し使用回
数を求めて第１表に示した。

第１表 ※Ｕは１　μｎ＋ｏｌ／ｎ＋ｉｎの酸の変換量（比較例
１−４）リパーゼ、ｎ−オクタノール、ｐＨ７，７のリン酸バッ
ファーの配合量を第２表に示すように変更したこと以外
は、実施例１と同様にして酵素含有物を作成した。

ところが、比較例１はｎ−オクタノールの過剰から、比
較例３はリン酸バッファー、すなわち水の不足から、ペ
ースト状の酵素含有物は形成されなかった。

また、比較例２はｎ−オクタノールの不足から、比較例
へは水の過剰から、ハードエマルジョンになった。ただ
し、比較例２．４のエマルジョンは実施例１で用いた不
織布への付着が可能であったので、実施例１と同様にし
て固定化酵素を作成し、活性と繰返し使用回数を求めて
第２表に示した。

第２表から明らかなように、比較例２．４の活性は実施
例１より低く、また繰返し使用回数も、比較例２．４の
酵素含有物が担体である不縁布から容易にはく離して、
繰返し使用に耐えないため極めて低い値であった。

第２表 ※Ｕは１　、ＩＪ　ＩＩＩｏ　ｌ　／ｒｓ　ｉ　ｎの酸
の変換量［発明の効果］本発明の酵素含有物及びそれを用いた固定化酵素は上述
のような構成からなるため、以下に示す効果を奏する。

■本発明の酵素含有物は微水系であるため、リパーゼが
エステル合成反応やエステル交換反応を触媒する働きを
する。

■従って、本発明の酵素含有物及び固定化酵素はエステ
ルの合成やエステル交換による油脂の改質に利用できる
。

■また、リパーゼの位置選択性などの選択８！能を利用
して、光学的に活性なエステルを合成するといった、有
機化合物のラセミ体の合成的分割にも利１１１できる。

■本発明の酵素含有物は水分量をリパーゼの活性に必要
な一定量に保ち、微水系を維持できるため、煩雑な水の
供給手段をとる必要がない。

■また、本発明の酵素含有物では、リパーゼは酵素含有
物から外部へはほとんど出ないように固定化されている
が、酵素含有物内での自由度は太きく、フリーのリパー
ゼと同等の高い活性を有する。

■本発明の固定化酵素は、三次元的な絡合構造の不ｉａ
布に酵素含有物が略均−に分布して付着した構造になっ
ており、反応基質との接触面積が大きく、付着している
酵素の量も多い。

■このため、大量のエステルの合成反応に使用でき、処
理能力のスケールアップを計ることができる。

■本発明の固定化酵素は、酵素含有物が不織布に付着固
定されているため、通常の不織布を取り扱うのと同様に
簡便に取り扱うことができる。

■また、固定化されていることにより、繰り返し使用す
ることも可能である。

このように、本発明の固定化酵素は、エステル合成やエ
ステル交換反応に利用するのに極めて有用なものである
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リパーゼと水と疎水性有機溶媒とを主成分とする
ペースト状物からなることを特徴とする酵素含有物。
（２）リパーゼに対する水の割合が１：０．９〜２．０
である請求項１に記載の酵素含有物。
（３）リパーゼ１重量部と水２〜５重量部と疎水性有機
溶媒１５〜２０重量部とを混合してペースト状物を形成
した後、溶液を除去することを特徴とする酵素含有物の
製造方法。
（４）請求項１または２に記載の酵素含有物が不織布に
付着していることを特徴とする固定化酵素。