JPWO2005097985A1 - 1,3−特異性リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用 - Google Patents
1,3−特異性リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Rhizomucor miehei由来の1,3−特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が10質量%以下であるリパーゼ粉末、該リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物、及びpHが6〜7.5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを含むリパーゼ粉末の製造方法。本発明により1,3−選択性が向上したリパーゼ粉末が提供される。
Description
本発明は、各種油脂のエステル交換反応などに好適に使用することができる1,3−特異性リパーゼ粉末、その製造方法、1,3−特異性リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成物、該リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法などに関するものである。
(発明の背景)
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約70℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、リパーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂(特許文献1)、フェノール吸着樹脂(特許文献2)、疎水性担体(特許文献3)、陽イオン交換樹脂(特許文献4)、キレート樹脂(特許文献5)等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約70℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、リパーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂(特許文献1)、フェノール吸着樹脂(特許文献2)、疎水性担体(特許文献3)、陽イオン交換樹脂(特許文献4)、キレート樹脂(特許文献5)等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。
このように、従来はリパーゼを固定化してエステル交換反応に用いていたが、かかる固定化リパーゼは固定化処理による本来のリパーゼ活性の損失を伴うだけでなく、多孔性担体を用いた場合は細孔に原料や生成物が詰まり、結果としてエステル交換率の低下を招いていた。さらに、従来の固定化リパーゼを用いたエステル交換反応においては、担体が保持する水分が反応系に持ち込まれるため、副反応、たとえば油脂類のエステル交換反応におけるジグリセリドやモノグリセリドの生成等を避けることは困難であった。
このような状況に鑑み、リパーゼ粉末を用いる各種技術が開発されている。例えば、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の90%以上を1〜100μmの範囲の粒径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている(特許文献6)。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている(特許文献7)。
しかしながら、さらに1,3−特異性リパーゼの1,3−選択性が向上したリパーゼ粉末が求められている。
このような状況に鑑み、リパーゼ粉末を用いる各種技術が開発されている。例えば、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の90%以上を1〜100μmの範囲の粒径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている(特許文献6)。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている(特許文献7)。
しかしながら、さらに1,3−特異性リパーゼの1,3−選択性が向上したリパーゼ粉末が求められている。
本発明は、1,3−特異性リパーゼの1,3−選択性が向上したリパーゼ粉末を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成物を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法を提供することを目的とする。
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成物を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法を提供することを目的とする。
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。
Rhizomucor miehei由来の1,3−特異性リパーゼは極めて1,3選択性が高いリパーゼであり、陰イオン交換樹脂に固定化されて用いられているが、これを、固定用担体を用いずに、球状で、水分含量が10質量%以下の粉末状にすると、その1,3選択性がさらに向上するとの知見に基づいて本発明はなされたのである。
すなわち、本発明は、Rhizomucor miehei由来の1,3−特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が10質量%以下であることを特徴とするリパーゼ粉末を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物を提供する。
本発明は、又、pHが6〜7.5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを特徴とする、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を含有するエステル交換用リパーゼを提供する。
本発明は、又、上記エステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステル交換方法を提供する。
すなわち、本発明は、Rhizomucor miehei由来の1,3−特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が10質量%以下であることを特徴とするリパーゼ粉末を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物を提供する。
本発明は、又、pHが6〜7.5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを特徴とする、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を含有するエステル交換用リパーゼを提供する。
本発明は、又、上記エステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステル交換方法を提供する。
本発明で対象とする1,3特異性リパーゼは、リゾムコール属(Rhizomucor sp.)に属するリゾムコール ミーヘイ(Rhizomucor miehei)由来の1,3−特異性リパーゼである。尚、従来、リゾムコール ミーヘイ(Rhizomucor miehei)は、ムコール属(Mucor sp.)として扱われていた場合もある。
本発明では、このリパーゼを、形状が球状であって、水分含量が10質量%以下である粉末として使用する。
水分含量は10質量%以下とするが、6.5〜8.5質量%であるのが好ましい。
本発明のリパーゼ粉末の粒径は任意とすることができるが、リパーゼ粉末の90質量%以上が粒径1〜100μmであるのが好ましい。又、平均粒径は20〜80μmが好ましく、より好ましくは20〜50μmである。
リパーゼ粉末の粒径は、例えば、HORIBA社の粒度分布測定装置(LA−500)を用いて測定することができる。
このようなリパーゼ粉末は、例えば、リパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥(スプレードライ)することによって容易に調製することができる。
ここで、リパーゼ含有水溶液としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養液、これらから得たリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販のリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好ましい。
リパーゼ培養液としては、例えば、大豆粉、ペプトン、コーン・ステープ・リカー、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4・7H2O等含有する水溶液があげられる。これらの濃度としては、大豆粉0.1〜20質量%、好ましくは1.0〜10質量%、ペプトン0.1〜30質量%、好ましくは0.5〜10質量%、コーン・ステープ・リカー0.1〜30質量%、好ましくは0.5〜10質量%、K2HPO4 0.01〜20質量%、好ましくは0.1〜5質量%である。又、(NH4)2SO4は0.01〜20質量%、好ましくは0.05〜5質量%、MgSO4・7H2Oは0.01〜20質量%、好ましくは0.05〜5質量%である。培養条件は、培養温度は10〜40℃、好ましくは20〜35℃、通気量は0.1〜2.0VVM、好ましくは0.1〜1.5VVM、攪拌回転数は100〜800rpm、好ましくは200〜400rpm、pHは3.0〜10.0、好ましくは4.0〜9.5に制御するのがよい。
本発明では、このリパーゼを、形状が球状であって、水分含量が10質量%以下である粉末として使用する。
水分含量は10質量%以下とするが、6.5〜8.5質量%であるのが好ましい。
本発明のリパーゼ粉末の粒径は任意とすることができるが、リパーゼ粉末の90質量%以上が粒径1〜100μmであるのが好ましい。又、平均粒径は20〜80μmが好ましく、より好ましくは20〜50μmである。
リパーゼ粉末の粒径は、例えば、HORIBA社の粒度分布測定装置(LA−500)を用いて測定することができる。
このようなリパーゼ粉末は、例えば、リパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥(スプレードライ)することによって容易に調製することができる。
ここで、リパーゼ含有水溶液としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養液、これらから得たリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販のリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好ましい。
リパーゼ培養液としては、例えば、大豆粉、ペプトン、コーン・ステープ・リカー、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4・7H2O等含有する水溶液があげられる。これらの濃度としては、大豆粉0.1〜20質量%、好ましくは1.0〜10質量%、ペプトン0.1〜30質量%、好ましくは0.5〜10質量%、コーン・ステープ・リカー0.1〜30質量%、好ましくは0.5〜10質量%、K2HPO4 0.01〜20質量%、好ましくは0.1〜5質量%である。又、(NH4)2SO4は0.01〜20質量%、好ましくは0.05〜5質量%、MgSO4・7H2Oは0.01〜20質量%、好ましくは0.05〜5質量%である。培養条件は、培養温度は10〜40℃、好ましくは20〜35℃、通気量は0.1〜2.0VVM、好ましくは0.1〜1.5VVM、攪拌回転数は100〜800rpm、好ましくは200〜400rpm、pHは3.0〜10.0、好ましくは4.0〜9.5に制御するのがよい。
菌体の分離は、遠心分離、膜濾過などで行うのが好ましい。また、塩類や糖等の低分子成分の除去は、UF膜処理により行うことができる。具体的には、UF膜処理を行い、リパーゼを含有する水溶液を1/2量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のリン酸バッファーを添加するという操作を1〜5回繰り返すことにより、低分子成分を除去したリパーゼ含有水溶液を得ることができる。
遠心分離は200〜20,000×g、膜濾過はMF膜、フィルタープレスなどで圧力を3.0kg/m2以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザー、ワーリングブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーの攪拌回転数は500〜30,000rpm、好ましくは1,000〜15,000rpm、ワーリングブレンダーの回転数は500〜10,000rpm、好ましくは1,000〜5,000rpmである。攪拌時間は0.5〜10分、好ましくは1〜5分がよい。超音波破砕は1〜50KHz、好ましくは10〜20KHzの条件で行うのが良い。ボールミルは直径0.1〜0.5mm程度のガラス製小球を用いるのがよい。
本発明では、リパーゼ含有水溶液としては、固形分として5〜30質量%含むものを用いるのが好ましい。
ここで、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、例えば、糖度計((株)シー・アイ・エス社製 BRX−242)を用いてBrix.%として求めることができる。
遠心分離は200〜20,000×g、膜濾過はMF膜、フィルタープレスなどで圧力を3.0kg/m2以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザー、ワーリングブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーの攪拌回転数は500〜30,000rpm、好ましくは1,000〜15,000rpm、ワーリングブレンダーの回転数は500〜10,000rpm、好ましくは1,000〜5,000rpmである。攪拌時間は0.5〜10分、好ましくは1〜5分がよい。超音波破砕は1〜50KHz、好ましくは10〜20KHzの条件で行うのが良い。ボールミルは直径0.1〜0.5mm程度のガラス製小球を用いるのがよい。
本発明では、リパーゼ含有水溶液としては、固形分として5〜30質量%含むものを用いるのが好ましい。
ここで、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、例えば、糖度計((株)シー・アイ・エス社製 BRX−242)を用いてBrix.%として求めることができる。
噴霧乾燥(スプレードライ)などの乾燥工程の直前に、リパーゼ含有水溶液のpHを6〜7.5に調整するのが好ましい。特にpHを7.0以下に、さらにpHを6.5〜7.0の範囲となるように調整するのが好ましい。pH調整は、噴霧乾燥(スプレードライ)などの乾燥工程の前のいずれかの工程において行ってもよく、乾燥工程の直前のpHが上記範囲内となるように、予めリパーゼ含有水溶液のpHを調整しておいてもよい。pH調整には、各種アルカリ剤や酸を用いることができるが、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物を用いるのが好ましい。
又、乾燥工程前の途中の工程において、リパーゼ含有水溶液を濃縮してもよい。濃縮方法は、特に限定されるものではないが、エバポレーター、フラッシュエバポレーター、UF膜濃縮、MF膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等があげられる。好ましくはUF膜濃縮、エバポレーターがよい。UF膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量3,000〜100,000、好ましくは6,000〜50,000の平膜または中空糸膜、材質はポリアクリルニトリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。
又、乾燥工程前の途中の工程において、リパーゼ含有水溶液を濃縮してもよい。濃縮方法は、特に限定されるものではないが、エバポレーター、フラッシュエバポレーター、UF膜濃縮、MF膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等があげられる。好ましくはUF膜濃縮、エバポレーターがよい。UF膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量3,000〜100,000、好ましくは6,000〜50,000の平膜または中空糸膜、材質はポリアクリルニトリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。
噴霧乾燥(スプレードライ)は、例えば、ノズル向流式、デイスク向流式、ノズル並流式、デイスク並流式等の噴霧乾燥機を用いて行うのがよい。好ましくはデイスク並流式が良く、アトマイザー回転数は4,000〜20,000rpm、加熱は入口温度100〜200℃、出口温度40〜100℃で制御して噴霧乾燥(スプレードライ)するのが好ましい。
このようにして調製されたリパーゼ粉末はそのまま使用することができるが、油脂に浸漬又は浸潤させたリパーゼ組成物として用いるのが取り扱い性の点から好ましい。ここで、リパーゼ組成物中の油脂の質量は、リパーゼ粉末に対し0.1〜20倍であるのが好ましく、1〜20倍であるのがより好ましい。
このようにして調製されたリパーゼ粉末はそのまま使用することができるが、油脂に浸漬又は浸潤させたリパーゼ組成物として用いるのが取り扱い性の点から好ましい。ここで、リパーゼ組成物中の油脂の質量は、リパーゼ粉末に対し0.1〜20倍であるのが好ましく、1〜20倍であるのがより好ましい。
このリパーゼ組成物は、噴霧乾燥(スプレードライ)などにより製造されたリパーゼ粉末に油脂を添加し、スターラーやスリーワンモーター等で均一に攪拌する方法やスプレードライヤーの粉末回収部に予め油脂を添加しておき、回収後に均一に攪拌し、濾過により過剰の油脂を除去する方法により容易に得ることができる。
リパーゼ粉末に含浸又は浸潤させる油脂としては、特に限定されず、菜種油、大豆油、ハイオレイックヒマワリ油、オリーブ油、サフラワー油、コーン油、ヤシ油、ゴマ油などの植物油、トリオレイン(グリセリン トリオレエート)、トリカプリリン(グリセリン トリオクタノエート)、トリアセチン(グリセリン トリアセテート)、トリブチリン(グリセリン トリブチレート)などのトリアシルグリセロール、脂肪酸エステル、ステロールエステルなどの1種又は2種以上の混合物があげられる。
このリパーゼ粉末を用い、常法により、油脂などのエステル交換反応を効率的に行うことができる。
本発明によれば、1,3特異性リパーゼの1,3選択性が各段に向上し、原料トリグリセリド2位の脂肪酸残基を極めて高い割合で、エステル交換製品中に保持することができる。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
リパーゼ粉末に含浸又は浸潤させる油脂としては、特に限定されず、菜種油、大豆油、ハイオレイックヒマワリ油、オリーブ油、サフラワー油、コーン油、ヤシ油、ゴマ油などの植物油、トリオレイン(グリセリン トリオレエート)、トリカプリリン(グリセリン トリオクタノエート)、トリアセチン(グリセリン トリアセテート)、トリブチリン(グリセリン トリブチレート)などのトリアシルグリセロール、脂肪酸エステル、ステロールエステルなどの1種又は2種以上の混合物があげられる。
このリパーゼ粉末を用い、常法により、油脂などのエステル交換反応を効率的に行うことができる。
本発明によれば、1,3特異性リパーゼの1,3選択性が各段に向上し、原料トリグリセリド2位の脂肪酸残基を極めて高い割合で、エステル交換製品中に保持することができる。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
[実施例1]
水溶液にリパーゼが溶解・分散した形態にあるノボザイムズ ジャパン(株)社製のRhizomucor miehei由来のリパーゼ(商品名Palatase 20000L)を、UFモジュール(旭化成工業(株)社製SIP−0013)を用いて低分子成分を除去してリパーゼ含有水溶液(固形分濃度10.6質量%)を得た。詳しくは、液状リパーゼ(パラターゼ20000L))を氷冷下でUF膜処理を行い、1/2量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のpH7の0.01Mリン酸バッファーを添加した。得られた溶液について、同じようにUF膜処理後リン酸バッファーを添加する操作を3回繰り返し、リパーゼ含有水溶液(リパーゼ濃縮液:バッファーの体積比は1:1)を得た。
このリパーゼ含有水溶液のpHを水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH6.8〜6.9に調整した。
この液を、スプレードライヤー(SD−1000型:東京理化器械(株)社製)を用い、入口温度130℃、乾燥空気量0.7〜1.1m3/min、噴霧圧力11〜12kpaの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。リパーゼ粉末粒子の形状は球状で、リパーゼ粉末の90質量%以上が粒径1〜100μmの範囲内にあり、平均粒径は8.2μmであった。粒径は、HORIBA社の粒度分布測定装置(LA−500)を用いて測定した。105℃、1時間の乾熱乾燥の方法により測定した水分含量は7.9質量%であった。
尚、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、糖度計((株)シー・アイ・エス社製 BRX−242)を用いてBrix.%として求めた。
水溶液にリパーゼが溶解・分散した形態にあるノボザイムズ ジャパン(株)社製のRhizomucor miehei由来のリパーゼ(商品名Palatase 20000L)を、UFモジュール(旭化成工業(株)社製SIP−0013)を用いて低分子成分を除去してリパーゼ含有水溶液(固形分濃度10.6質量%)を得た。詳しくは、液状リパーゼ(パラターゼ20000L))を氷冷下でUF膜処理を行い、1/2量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のpH7の0.01Mリン酸バッファーを添加した。得られた溶液について、同じようにUF膜処理後リン酸バッファーを添加する操作を3回繰り返し、リパーゼ含有水溶液(リパーゼ濃縮液:バッファーの体積比は1:1)を得た。
このリパーゼ含有水溶液のpHを水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH6.8〜6.9に調整した。
この液を、スプレードライヤー(SD−1000型:東京理化器械(株)社製)を用い、入口温度130℃、乾燥空気量0.7〜1.1m3/min、噴霧圧力11〜12kpaの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。リパーゼ粉末粒子の形状は球状で、リパーゼ粉末の90質量%以上が粒径1〜100μmの範囲内にあり、平均粒径は8.2μmであった。粒径は、HORIBA社の粒度分布測定装置(LA−500)を用いて測定した。105℃、1時間の乾熱乾燥の方法により測定した水分含量は7.9質量%であった。
尚、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、糖度計((株)シー・アイ・エス社製 BRX−242)を用いてBrix.%として求めた。
比較例1
Rhizomucor miehei由来のリパーゼが陰イオン交換樹脂に固定化されてなるノボザイムズ ジャパン(株)社製のリポザイムRM IMを比較例1として用いた。
Rhizomucor miehei由来のリパーゼが陰イオン交換樹脂に固定化されてなるノボザイムズ ジャパン(株)社製のリポザイムRM IMを比較例1として用いた。
比較例2
噴霧乾燥(スプレードライ)を行う代わりに、フリーズドライを行った以外は、実施例1と同様にしてリパーゼ粉末を得た。フリーズドライは、pHが6.8〜6.9に調整されたリパーゼ含有水溶液をナスフラスコに入れ、ドライアイスメタノールで凍結後、東京理化器械(株)社製のフリーズドライヤー(FDU−830)を用い、0.15Torrで1日凍結乾燥を行った。乾燥後、乳鉢で軽く粉砕しリパーゼ粉末を得た。得られたリパーゼ粉末の形状は無定形で、水分含量は11.3質量%であった。
実施例1、比較例1、及び比較例2のリパーゼ粉末の1,3−選択性を以下の方法で測定した。実施例1及び比較例1の1,3−選択性の測定結果を表1に示す。なお、比較例2で得られたリパーゼ粉末は、エステル交換活性が全くなかった。
噴霧乾燥(スプレードライ)を行う代わりに、フリーズドライを行った以外は、実施例1と同様にしてリパーゼ粉末を得た。フリーズドライは、pHが6.8〜6.9に調整されたリパーゼ含有水溶液をナスフラスコに入れ、ドライアイスメタノールで凍結後、東京理化器械(株)社製のフリーズドライヤー(FDU−830)を用い、0.15Torrで1日凍結乾燥を行った。乾燥後、乳鉢で軽く粉砕しリパーゼ粉末を得た。得られたリパーゼ粉末の形状は無定形で、水分含量は11.3質量%であった。
実施例1、比較例1、及び比較例2のリパーゼ粉末の1,3−選択性を以下の方法で測定した。実施例1及び比較例1の1,3−選択性の測定結果を表1に示す。なお、比較例2で得られたリパーゼ粉末は、エステル交換活性が全くなかった。
1,3−選択性の測定方法
反応基質としてGRYCERYL−1,3−PALMITATE−2−OLEATE(POP)1mol及びOCTANOIC ETHYL(C8Et)3molを用い、酵素活性に応じて、基質の0.5〜5w%となるようにリパーゼ粉末を添加し、60℃で反応を行い、経時的にサンプリングしヘキサンで希釈した。このサンプルをGC分析し以下の式により1・3位(C16:0Et)と2位(C18:1Et)の反応率を求めた。
C16:0Et(%)={C16:0Et aria/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100
C18:1Et(%)={C18:1Et area/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100
各時間における各々の反応率から解析ソフト(orijin ver.6.1)により反応速度定数Kを求めた。この時の最終反応率の値は可変とする。2位の反応性を1とした時の1,3位の反応性を求めた。
<GC条件>
カラム :DB−1ht 5m
注入量 :1μl
キャリアガス:ヘリウム
気化室温度:360℃
検出器温度:370℃
カラム温度:初期50℃、昇温15℃/min、最終370℃
反応基質としてGRYCERYL−1,3−PALMITATE−2−OLEATE(POP)1mol及びOCTANOIC ETHYL(C8Et)3molを用い、酵素活性に応じて、基質の0.5〜5w%となるようにリパーゼ粉末を添加し、60℃で反応を行い、経時的にサンプリングしヘキサンで希釈した。このサンプルをGC分析し以下の式により1・3位(C16:0Et)と2位(C18:1Et)の反応率を求めた。
C16:0Et(%)={C16:0Et aria/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100
C18:1Et(%)={C18:1Et area/(C16Et+C18:1Et area+C8Et area)}×100
各時間における各々の反応率から解析ソフト(orijin ver.6.1)により反応速度定数Kを求めた。この時の最終反応率の値は可変とする。2位の反応性を1とした時の1,3位の反応性を求めた。
<GC条件>
カラム :DB−1ht 5m
注入量 :1μl
キャリアガス:ヘリウム
気化室温度:360℃
検出器温度:370℃
カラム温度:初期50℃、昇温15℃/min、最終370℃
[実施例2]
実施例1で得られたリパーゼ粉末に、5倍量の菜種油を加えて、菜種油にリパーゼ粉末を含浸・浸潤させ、濾過により過剰の油脂を除去し、リパーゼ粉末/菜種油の重量が55/45であるリパーゼ組成物を調製した。
実施例1で得られたリパーゼ粉末に、5倍量の菜種油を加えて、菜種油にリパーゼ粉末を含浸・浸潤させ、濾過により過剰の油脂を除去し、リパーゼ粉末/菜種油の重量が55/45であるリパーゼ組成物を調製した。
Claims (12)
- Rhizomucor miehei由来の1,3−特異性リパーゼであって、球状で、水分含量が10質量%以下であることを特徴とするリパーゼ粉末。
- pHが6〜7.5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液が噴霧乾燥されて製造されたものである請求項1記載のリパーゼ粉末。
- pHが6.5〜7に調整されてなるリパーゼ含有水溶液が噴霧乾燥されて製造されたものである請求項2記載のリパーゼ粉末。
- リパーゼ含有水溶液が、菌体を除去したリパーゼ培養液またはその精製培養液である請求項2又は3項に記載のリパーゼ粉末。
- リパーゼ含有水溶液が、UF膜処理されたものである請求項2〜4のいずれか1項記載のリパーゼ粉末。
- リパーゼ粉末の90質量%以上が粒径1〜100μmである請求項1〜5のいずれか1項記載のリパーゼ粉末。
- 水分含量が6.5〜8.5質量%である請求項1〜6のいずれか1項記載のリパーゼ粉末。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載のリパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物。
- 前記リパーゼ組成物中の油脂の質量が、リパーゼ粉末に対し0.1〜20倍である請求項8記載のリパーゼ組成物。
- pHが6〜7.5に調整されてなるリパーゼ含有水溶液を噴霧乾燥することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項記載のリパーゼ粉末の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項記載のリパーゼ粉末を含有するエステル交換用リパーゼ。
- 請求項11記載のエステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステル交換方法。
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