CN1806044A - 1,3－特异性脂肪酶粉末、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种脂肪酶粉末，该脂肪酶粉末是得自米赫根毛霉的1，3－特异性脂肪酶，为球状，水分含量为10质量％或10质量％以下；一种脂肪酶组合物，在油脂中浸渍或浸润有该脂肪酶粉末；以及一种脂肪酶粉末的制备方法，该方法包括：将pH调节到6～7.5的含有脂肪酶的水溶液进行喷雾干燥。根据本发明，可以提供一种1，3－选择性提高了的脂肪酶粉末。

Description

1，3-特异性脂肪酶粉末、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种可适用于各种油脂的酯交换反应等中的1，3-特异性脂肪酶粉末，其制备方法，1，3-特异性脂肪酶粉末浸渍或浸润于油脂中而成的脂肪酶组合物，使用该脂肪酶粉末的油脂的酯交换方法等。
背景技术
脂肪酶广泛地用于脂肪酸等各种羧酸与一元醇或多元醇等醇类的酯化反应、多个羧酸酯之间的酯交换反应等中。其中，酯交换反应不仅作为动植物油脂类的改质方法，而且作为各种脂肪酸的酯、糖酯和类固醇的制备方法是重要的技术。当将作为油脂水解酶的脂肪酶用作这些反应的催化剂时，可以在室温至约70℃左右的温和条件下进行酯交换反应，与以往的化学反应相比，不仅抑制副反应、降低能耗，而且由于作为催化剂的脂肪酶是天然物质，因此安全性也较高。另外，可以根据其底物特异性和位置特异性高效地生产目标物。然而，即使将脂肪酶粉末就那样地直接用于酯交换反应也不会充分表现出其活性，而且难以将原本为水溶性的脂肪酶均匀地分散到油性原料中，其回收也困难。因此，以往通常将脂肪酶固定到一些载体上，例如阴离子交换树脂(专利文献1)、酚醛吸附树脂(专利文献2)、疏水性载体(专利文献3)、阳离子交换树脂(专利文献4)、螯合树脂(专利文献5)等上来用于酯化和酯交换反应等中。
如上所述，以往将脂肪酶固定化后用于酯交换反应中，但是所述固定化脂肪酶不仅伴随有固定化处理导致的原有脂肪酶活性的损失，而且使用多孔性载体时原料和产物堵塞细孔，其结果带来酯交换率的降低。而且，在利用以往的固定化脂肪酶进行的酯交换反应中，由于载体所持有的水分被带入到反应体系中，因此难以避免副反应，例如在油脂类的酯交换反应中的甘油二酯或甘油一酯的生成等。
鉴于上述状况，已开发了各种使用脂肪酶粉末的技术。例如，提出了一种酯交换反应方法，其在惰性有机溶剂的存在下或不存在下，将脂肪酶粉末分散到含有酯的原料中进行酯交换反应，以使在酯交换反应时将分散脂肪酶粉末颗粒的90％或其以上保持在粒径1～100μm的范围内(专利文献6)。还提出了将含有磷脂和脂溶性维生素的酶溶液进行干燥，使用所得到的酶粉末的技术(专利文献7)。
然而，需要一种1，3-特异性脂肪酶的1，3-选择性进一步提高了的脂肪酶粉末。
专利文献1：日本专利特开昭60-98984号公报
专利文献2：日本专利特开昭61-202688号公报
专利文献3：日本专利特开平2-138986号公报
专利文献4：日本专利特开平3-61485号公报
专利文献5：日本专利特开平1-262795号公报
专利文献6：日本专利第2668187号公报
专利文献7：日本专利特开2000-106873号公报
发明内容
本发明的目的在于提供一种1，3-特异性脂肪酶的1，3-选择性提高了的脂肪酶粉末。
本发明又一目的在于提供一种将上述脂肪酶粉末浸渍或浸润到油脂中而成的脂肪酶组合物。
本发明的又一目的在于提供一种上述脂肪酶粉末的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种使用上述脂肪酶粉末来进行的油脂的酯交换方法。
本发明的这些目的和其它目的，从以下的描述将变得清楚。
本发明是基于如下发现而完成的，即，得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的1，3-特异性脂肪酶是1，3选择性极高的脂肪酶，以往将其固定在阴离子交换树脂中使用，而当不使用固定用载体地将该脂肪酶作成球状、水分含量为10质量％或10质量％以下的粉末状时，其1，3选择性进一步提高。
即，本发明提供一种脂肪酶粉末，其特征在于，该脂肪酶粉末是得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的1，3-特异性脂肪酶，为球状，水分含量为10质量％或10质量％以下。
本发明还提供一种脂肪酶组合物，在油脂中浸渍或浸润有上述脂肪酶粉末而成。
本发明还提供上述脂肪酶粉末的制备方法，其特征在于，将p H调节到6～7.5的含有脂肪酶的水溶液进行喷雾干燥。
本发明还提供一种酯交换用脂肪酶，其含有上述脂肪酶粉末。
本发明还提供一种油脂的酯交换方法，其特征在于，使用上述酯交换用脂肪酶。
具体实施方式
在本发明中作为对象的1，3-特异性脂肪酶，是得自属于根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的1，3-特异性脂肪酶。另外，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)以往也有被归属于毛霉菌属(Mucor sp.)的情况。
在本发明中，将该脂肪酶作成形状为球状、水分含量为10质量％或10质量％以下的粉末来使用。
水分含量为10质量％或10质量％以下，优选为6.5～8.5质量％。
本发明的脂肪酶粉末的粒径可以是任意的，但优选脂肪酶粉末的90质量％或90质量％以上，其粒径为1～100μm。另外，平均粒径优选为20～80μm，更优选为20～50μm。
脂肪酶粉末的粒径，可以使用例如HORIBA公司的粒度分布测定装置(LA-500)来测定。
如上所述的脂肪酶粉末，例如可以通过将含有脂肪酶的水溶液进行喷雾干燥而容易地制得。
在这里，作为含有脂肪酶的水溶液，可以列举除去了菌体的脂肪酶培养液、精制培养液、由它们获得的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中得到的溶液、市售的脂肪酶粉末再次溶解·分散在水中得到的溶液、市售的液体脂肪酶等。而且，为了进一步提高脂肪酶活性，更优选除去了盐类等低分子成分的溶液；另外，为了进一步提高粉末特性，更优选除去了糖等低分子成分的溶液。
作为脂肪酶培养液，可以列举例如，含有大豆粉、蛋白胨、玉米浸液、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O等的水溶液。作为它们的浓度，大豆粉是0.1～20质量％，优选1.0～10质量％，蛋白胨是0.1～30质量％，优选0.5～10质量％，玉米浸液是0.1～30质量％，优选0.5～10质量％，K2HPO4是0.01～20质量％，优选0.1～5质量％。另外，(NH4)2SO4是0.01～20质量％，优选0.05～5质量％，MgSO4·7H2O是0.01～20质量％，优选0.05～5质量％。培养条件最好控制如下：培养温度为10～40℃，优选20～35℃；通气量为0.1～2.0VVM，优选0.1～1.5VVM；搅拌转速为100～800rpm，优选200～400rpm；pH为3.0～10.0，优选4.0～9.5。
菌体的分离优选通过离心分离、膜过滤等进行。另外，盐类和糖等低分子成分的除去可以通过UF膜(ultrafiltrationmenbrane，超滤膜)处理来进行。具体地说，进行UF膜处理，将含有磷脂酶的水溶液浓缩至体积的1/2量，然后添加与浓缩液等量的磷酸缓冲液，将该操作重复1～5次，可以获得除去了低分子成分的含有脂肪酶的水溶液。
离心分离优选控制在200～20,000×g，膜过滤优选由MF膜(microfiltration membrane，微滤膜)、压滤机等将压力控制在3.0kg/m2以下。菌体内酶的情况下，优选用均化器、韦林掺合器、超声破碎、法式压滤壶(French press)、球磨机等将细胞破碎，用离心分离、膜过滤等除去细胞残渣。均化器的搅拌转速为500～30,000rpm，优选1,000～15,000rpm；韦林掺合器的转速为500～10,000rpm，优选1,000～5,000rpm。搅拌时间较佳为0.5～10分钟，优选1～5分钟。超声破碎较佳在1～50KHz，优选在10～20KHz的条件下进行。球磨机优选使用直径0.1～0.5mm左右的玻璃制小球。
在本发明中，作为含有脂肪酶的水溶液，优选使用含有5～30质量％固体成分的水溶液。
在这里，含有脂肪酶的水溶液中的固体成分浓度，可以使用例如糖度计((株)シ一·アイ·エス公司制造的BRX-242)，作为Brix.％(糖度％)求出。
优选在即将进行喷雾干燥等干燥工序之前，将含有脂肪酶的水溶液的pH调节到6～7.5。特别优选将pH调节到7.0或其以下，更优选将pH调节到6.5～7.0的范围内。pH调节也可以在喷雾干燥(spray drying)等干燥工序之前的任意工序中进行，也可以预先调节含有脂肪酶的水溶液的pH，以使其在即将进行干燥工序之前的pH在上述范围内。pH调节可以使用各种碱性剂和酸，优选使用氢氧化钠等碱金属氢氧化物。
另外，在干燥工序之前的中途的工序中，也可以浓缩含有脂肪酶的水溶液。浓缩方法没有特别的限制，可以列举蒸发器、闪蒸器、UF膜浓缩、MF膜浓缩、利用无机盐类的盐析、利用溶剂的沉淀法、利用离子交换纤维素等的吸附法、利用吸水性凝胶的吸水法等。较佳优选UF膜浓缩、蒸发器。作为用于UF膜浓缩中的模件，优选馏分分子量3,000～100,000、优选6,000～50,000的平膜或中空纤维膜，材质优选为聚丙烯腈类、聚磺酸类等。
喷雾干燥(spray drying)优选使用例如喷嘴逆流式、盘逆流式、喷嘴并流式、盘并流式等的喷雾干燥机进行，较佳优选盘并流式。喷雾干燥优选控制在如下条件进行：喷雾器转速为4,000～20,000rpm，加热的入口温度为100～200℃，出口温度为40～100℃。
这样制得的脂肪酶粉末可以就那样地直接使用，然而从操作性的角度出发，优选作成浸渍或浸润到油脂中的脂肪酶组合物来使用。在这里，脂肪酶组合物中的油脂的质量，相对于脂肪酶粉末优选是0.1～20倍，更优选是1～20倍。
可以通过如下方法容易地获得该脂肪酶组合物：在通过喷雾干燥等(spray drying)来制造的脂肪酶粉末中添加油脂，用搅拌器或三一电动机(three-one motor)等均匀搅拌的方法；或者在喷雾干燥器的粉末回收部预先添加油脂，回收后均匀搅拌，通过过滤除去过量油脂的方法。
作为含浸或浸润到脂肪酶粉末中的油脂，没有特别的限制，可以列举菜籽油、大豆油、高油酸向日葵油、橄榄油、红花油、玉米油、棕榈油、芝麻油等的植物油，三油酸甘油酯(甘油三油酸酯)、三辛酸甘油酯(甘油三辛酸酯)、三乙酸甘油酯(甘油三醋酸酯)、三丁酸甘油酯(甘油三丁酸酯)等的三酰基甘油类，脂肪酸酯，甾醇酯等的一种或多种的混合物。
使用该脂肪酶粉末，按照常规方法，可以有效地进行油脂等的酯交换反应。
根据本发明，可以显著提高1，3-特异性脂肪酶的1，3-选择性，可以以极高的比例将原料甘油三酯2位上的脂肪酸残基保持在酯交换制品中。
下面通过实施例更详细地描述本发明。
实施例1
脂肪酶溶解·分散于水溶液中的形态的ノボザイムズジヤパン(株)公司制造的得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶(商品名：Palatase 20000L)，将其用UF模件(旭化成工业(株)公司制造的SIP-0013)除去低分子成分，得到含有脂肪酶的水溶液(固体成分浓度10.6质量％)。具体地说，在冰冷却下对液体脂肪酶(Palatase 20000L)进行UF膜处理，浓缩到其体积的1/2量，然后添加与浓缩液等量的pH 7的0.01M磷酸缓冲液。对所得的溶液，进行同样的UF膜处理之后添加磷酸缓冲液的操作，重复该操作3次，得到含有脂肪酶的水溶液(脂肪酶浓缩液∶缓冲液的体积比是1∶1)。
使用氢氧化钠水溶液将该含有脂肪酶的水溶液的pH调节到pH 6.8～6.9。
使用喷雾干燥器(SD-1000型：东京理化器械(株)公司制造)，在入口温度130℃、干燥空气量0.7～1.1m3/min、喷雾压力11～12kpa的条件下将该溶液进行喷雾，得到脂肪酶粉末。脂肪酶粉末颗粒的形状为球状，脂肪酶粉末的90质量％或90质量％以上在粒径1～100μm的范围内，平均粒径为8.2μm。粒径是使用HORIBA公司的粒度分布测定装置(LA-500)测定的。通过在105℃下干热干燥1小时的方法测定的水分含量是7.9质量％。
另外，用糖度计((株)シ一·アイ·エス公司制造的BRX-242)测定含有脂肪酶的水溶液中的固体成分浓度，作为Brix.％求出。
比较例1
作为比较例1，使用将得自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶固定在阴离子交换树脂上而成的ノボザイムズジヤパン(株)公司制造的Lipozym RM IM。
比较例2
除了进行冷冻干燥来代替喷雾干燥之外，与实施例1相同地操作得到脂肪酶粉末。冷冻干燥如下进行：将pH调节到6.8～6.9的含有脂肪酶的水溶液加入回收烧瓶中，用干冰甲醇冷冻，然后用东京理化器械(株)公司制造的冷冻干燥器(FDU-830)，在0.15托(Torr)下冷冻干燥1天。干燥后，用研钵轻轻粉碎，得到脂肪酶粉末。得到的脂肪酶粉末的形状为无定形，水分含量为11.3质量％。
采用下面的方法测定实施例1、比较例1和比较例2的脂肪酶粉末的1，3-选择性。将实施例1和比较例1的1，3-选择性的测定结果示于表1中。即，比较例2中得到的脂肪酶粉末完全没有酯交换活性。
1，3-选择性的测定方法
使用1摩尔的1，3-二棕榈酸-2-油酸-甘油酯(Gryceryl-1，3-Palmitate-2-Oleate(POP))和3摩尔的辛酸乙酯(C8Et)作为反应底物，添加脂肪酶粉末使其根据酶活性成为底物的0.5～5w％，在60℃下进行反应，随时间抽样，并用己烷稀释。对该样品进行GC分析，并按照下式求得1·3位(C16:0Et)和2位(C18:1Et)的反应速率。
C16:0Et(％)＝{C16:0Et峰面积/(C16Et+C18:1Et峰面积+C8Et峰面积)}×100
C18:1Et(％)＝{C18:1Et峰面积/(C16Et+C18:1Et峰面积+C8Et峰面积)}×100
根据各时间下的各反应速率，利用分析软件(origin ver.6.1)，求得反应速率常数K。此时，最终反应速率的值是可变的。求出以2位的反应性设为1时的1，3位的反应性。
<GC条件>
柱：DB-1ht 5m
注入量：1μl
载体气：氦气
汽化室温度：360℃
检测器温度：370℃
柱温：初期50℃，升温15℃/min，最终370℃
表-1
  条件   1，3-选择性   (提高率％)
 比较例1(固定化脂肪酶)实施例1(喷雾干燥)   11.120.8 (Δ87％)
由表-1的结果可知，根据本发明，1，3-特异性脂肪酶的1，3-选择性提高了87％。
实施例2
在实施例1中得到的脂肪酶粉末中加入5倍量的菜籽油，使脂肪酶粉末含浸·浸润于菜籽油中，通过过滤除去过量的油脂，制得脂肪酶粉末/菜籽油的重量是55/45的脂肪酶组合物。

Claims (12)

1.一种脂肪酶粉末，其特征在于，该脂肪酶粉末是得自米赫根毛霉的1，3-特异性脂肪酶，为球状，水分含量为10质量％或10质量％以下。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶粉末，是通过将pH调节到6～7.5的含有脂肪酶的水溶液进行喷雾干燥而制得的。
3.根据权利要求2所述的脂肪酶粉末，是通过将pH调节到6.5～7的含有脂肪酶的水溶液进行喷雾干燥而制得的。
4.根据权利要求2或3所述的脂肪酶粉末，所述含有脂肪酶的水溶液是除去了菌体的脂肪酶培养液或其精制培养液。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的脂肪酶粉末，所述含有脂肪酶的水溶液是经过超滤膜处理的。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的脂肪酶粉末，所述脂肪酶粉末的90质量％或90质量％以上，其粒径为1～100μm。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的脂肪酶粉末，所述脂肪酶粉末的水分含量为6.5～8.5质量％。
8.一种脂肪酶组合物，在油脂中浸渍或浸润有权利要求1～7中任一项所述的脂肪酶粉末而成。
9.根据权利要求8所述的脂肪酶组合物，前述脂肪酶组合物中的油脂的质量，相对于脂肪酶粉末是0.1～20倍。
10.一种权利要求1～7中任一项所述的脂肪酶粉末的制备方法，其特征在于，将pH调节到6～7.5的含有脂肪酶的水溶液进行喷雾干燥。
11.一种酯交换用脂肪酶，其含有权利要求1～7中任一项所述的脂肪酶粉末。
12.一种油脂的酯交换方法，其特征在于，使用权利要求11所述的酯交换用脂肪酶。
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