KR101174532B1 - 리파아제 분말 조성물 및 그것을 사용한 에스테르화물의제조방법 - Google Patents

리파아제 분말 조성물 및 그것을 사용한 에스테르화물의제조방법 Download PDF

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Abstract

(a)리조무코르속(Rhizomucor sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제 또는 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제와 (b)알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제, 리조푸스속(Rhizopus sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제 및 써모마이세스속(Thermomyces sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제로 이루어지는 군(群)에서 선택되는 분말형상의 리파아제를 함유하는 리파아제 조성물을 제공한다. 이 리파아제 조성물을 사용하면, 알코올성 수산기를 분자 내에 적어도 1개 갖는 화합물을, 카르복실산으로 효율적으로 에스테르화할 수 있다.
리파아제 분말 조성물, 에스테르화, 알코올성 수산기

Description

리파아제 분말 조성물 및 그것을 사용한 에스테르화물의 제조방법{POWDERY LIPASE COMPOSITION AND METHOD OF PRODUCING ESTERIFIED PRODUCT BY USING THE SAME}
본 발명은 글리세린 등의 알코올성 수산기를 갖는 화합물과 각종 지방산 등과의 에스테르화에 매우 적합하게 사용할 수 있는 분말형상 리파아제 조성물, 및 이것을 사용하는 트리글리세리드 등의 에스테르화물의 제조방법에 관한 것이다.
리파아제는 지방산 등의 각종 카르복실산과 모노 알코올이나 다가 알코올 등의 알코올류와의 에스테르화 반응, 복수의 카르복실산 에스테르간의 에스테르 교환반응 등에 폭 넓게 사용되고 있다. 이 중, 탈수를 수반하는 에스테르화 반응에서는, 리파아제 분말을 그대로 사용하더라도 활성이 충분히 발현하지 않을 뿐만 아니라, 반응계에 균일하게 분산시키는 것은 곤란하며, 그 회수도 곤란하다. 이 때문에, 리파아제를 어떠한 담체, 예를 들면 음이온 교환 수지(특허문헌 1), 페놀 흡착 수지(특허문헌 2), 소수성 담체(특허문헌 3), 양이온 교환 수지(특허문헌 4), 킬레이트 수지(특허문헌 5) 등에 고정화해서 에스테르화 반응에 사용하는 것이 일반적이다.
이와 같이, 종래는 리파아제를 고정화해서 에스테르화 반응에 사용하고 있었 으나, 이러한 고정화 리파아제는 고정화 처리에 의한 본래의 리파아제 활성의 손실을 수반할 뿐만 아니라, 다공성 담체를 사용한 경우는 세공(細孔;fine pores)에 원료나 생성물이 가득 차서, 결과로서 에스테르화율의 저하를 초래하고 있었다.
이러한 상황을 감안하여, 리파아제 분말을 사용하는 각종 기술이 개발되어 있다. 예를 들면, 불활성 유기용매의 존재하 또는 비존재하, 에스테르 교환 반응시에 분산 리파아제 분말 입자의 90% 이상을 1～100㎛의 범위의 입경(粒徑)으로 유지하도록, 에스테르를 함유하는 원료에 리파아제 분말을 분산시켜서 에스테르 교환 반응을 행하는 방법이 제안되어 있다(특허문헌 6). 또한, 인지질 및 지용성 비타민을 포함하는 효소용액을 건조해서 얻은 효소분말을 사용하는 것이 제안되어 있다(특허문헌 7).
특허문헌 1: 일본국 특허공개 소60-98984호 공보
특허문헌 2: 일본국 특허공개 소61-202688호 공보
특허문헌 3: 일본국 특허공개 평2-138986호 공보
특허문헌 4: 일본국 특허공개 평3-61485호 공보
특허문헌 5: 일본국 특허공개 평1-262795호 공보
특허문헌 6: 일본국 특허 제2668187호 공보
특허문헌 7: 일본국 특허공개 2000-106873호 공보
본 발명은 에스테르화 반응을 효율적으로 행할 수 있는 분말 리파아제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 또한, 상기 리파아제 조성물을 사용하는 에스테르화물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 이들 목적 및 다른 목적은 이하의 기재로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 고정화 리파아제가 아니라, 특정의 2종의 분말 리파아제를 조합시켜서 사용하면, 극히 높은 에스테르화율을 달성할 수 있으며, 이것에 의해 상기 과제를 해결할 수 있다고 하는 지견(知見)에 기초해서 이루어진 것이다.
즉, 본 발명은, (a)리조무코르속(Rhizomucor sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제 또는 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제와, (b)알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제, 리조푸스속(Rhizopus sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제 및 써모마이세스속(Thermomyces sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제로 이루어지는 군(群)에서 선택되는 분말형상의 리파아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물을 제공한다.
본 발명은, 또한, 알코올성 수산기를 분자 내에 적어도 1개 갖는 화합물을, 상기 리파아제 조성물의 존재하, 카르복실산으로 에스테르화하는 것을 특징으로 하는 에스테르화물의 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 2종의 분말 리파아제를 병용한 리파아제 조성물(RM(1%)＋QL(0.1%), 및 G(0.7%)＋QL(0.3%))을 사용한 경우의 에스테르화 반응에 있어서의 트리글리세리드의 생성상황을 나타낸다.
본 발명의 성분 (a)로서 사용하는 리조무코르속(Rhizomucor sp.) 유래의 리파아제로서는, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 유래의 리파아제, 다시 말하면 1,3 특이성 리파아제를 사용하는 것이 바람직하고, 노보자임즈 재팬 가부시키가이샤(Novozymes Japan Co., Ltd.) 제조의 리파아제 함유 수용액, 파라타아제(Palatase)(20000L)를 분말화해서 분말 리파아제로 사용할 수 있다. 이 분말 리파아제로서는, 형상이 구상(球狀)이며, 수분함량이 10질량% 이하인 분말을 사용하는 것이 바람직하다. 수분함량은 6.5～8.5질량%인 것이 더욱 바람직하다. 한편, 종래, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei)는 무코르속(Mucor sp.)으로서 취급되고 있던 경우도 있다.
이러한 분말 리파아제는, 예를 들면, 리파아제 함유 수용액을 분무건조(스프레이 드라이)함으로써 용이하게 조제할 수 있다.
여기에서, 리파아제 함유 수용액으로서는, 균체를 제거한 리파아제 배양액, 정제 배양액, 이들로부터 얻은 리파아제 분말을 다시 물에 용해?분산시킨 것, 시판의 리파아제 분말을 다시 물에 용해?분산시킨 것, 시판의 액상 리파아제 등을 들 수 있다. 또한, 리파아제 활성을 보다 높이기 위해서 염류 등의 저분자 성분을 제거한 것이 보다 바람직하며, 또한, 분말 성상을 보다 높이기 위해서 당 등의 저분자 성분을 제거한 것이 보다 바람직하다.
리파아제 배양액으로서는, 예를 들면, 대두분, 펩톤, 옥수수 침지액(corn steep liquor), K2HPO4, (NH4)2SO4, MgSO4?7H2O 등을 함유하는 수용액을 들 수 있다. 이들의 농도로서는, 대두분 0.1～20질량%, 바람직하게는 1.0～10질량%, 펩톤 0.1～30질량%, 바람직하게는 0.5～10질량%, 옥수수 침지액 0.1～30질량%, 바람직하게는 0.5～10질량%, K2HPO4 0.01～20질량%, 바람직하게는 0.1～5질량%이다. 또한, (NH4)2SO4는 0.01～20질량%, 바람직하게는 0.05～5질량%, MgSO4?7H2O는 0.01～20질량%, 바람직하게는 0.05～5질량%이다. 배양 조건은, 배양 온도는 10～40℃, 바람직하게는 20～35℃, 통기량은 0.1～2.0VVM, 바람직하게는 0.1～1.5VVM, 교반 회전수는 100～800rpm, 바람직하게는 200～400rpm, pH는 3.0～10.0, 바람직하게는 4.0～9.5로 제어하는 것이 좋다.
균체의 분리는 원심분리, 막 여과 등으로 행하는 것이 바람직하다. 또한, 염류나 당 등의 저분자 성분의 제거는 UF막처리에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, UF막처리를 행하고, 리파아제를 함유하는 수용액을 1/2 양의 체적으로 농축 후, 농축액과 동량의 인산 버퍼를 첨가한다고 하는 조작을 1～5회 반복함으로써, 저분자 성분을 제거한 리파아제 함유 수용액을 얻을 수 있다.
원심분리는 200～20,000×g, 막 여과는 MF막, 필터 프레스 등으로 압력을 3.0㎏/㎡ 이하로 컨트롤하는 것이 바람직하다. 균체 내 효소의 경우는 호모지나이저(homogenizer), 와링 블렌더(Waring blender), 초음파 파쇄, 프렌치 프레스(French press), 볼 밀 등으로 세포 파쇄하고, 원심분리, 막 여과 등으로 세포 잔사를 제거하는 것이 바람직하다. 호모지나이저의 교반 회전수는 500～30,000rpm, 바람직하게는 1,000～15,000rpm, 와링 블렌더의 회전수는 500～10,000rpm, 바람직하게는 1,000～5,000rpm이다. 교반시간은 0.5～10분, 바람직하게는 1～5분이 좋다. 초음파 파쇄는 1～50KHz, 바람직하게는 10～20KHz의 조건으로 행하는 것이 좋다. 볼 밀은 직경 0.1～0.5mm 정도의 유리제 소구(小球; pellet)를 사용하는 것이 좋다.
리파아제 함유 수용액으로서는, 고형분으로서 5～30질량% 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
여기에서, 리파아제 함유 수용액 중의 고형분 농도는, 예를 들면, 당도계((주)씨아이에스사제 BRX-242)를 사용해서 Brix.%로서 구할 수 있다.
분무건조(스프레이 드라이) 등의 건조공정 직전에, 리파아제 함유 수용액의 pH를 6～7.5로 조정하는 것이 바람직하다. 특히 pH를 7.0 이하로, 또한 pH를 6.5～7.0의 범위가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. pH조정은, 분무건조(스프레이 드라이) 등의 건조공정 전의 어느 공정에 있어서 행해도 좋으며, 건조공정 직전의 pH가 상기 범위 내가 되도록, 미리 리파아제 함유 수용액의 pH를 조정해 두어도 좋다. pH조정에는, 각종 알칼리제나 산을 사용할 수 있으나, 수산화나트륨 등의 알칼리 금속 수산화물을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 건조공정 전의 도중의 공정에 있어서, 리파아제 함유 수용액을 농축해도 좋다. 농축방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 증발기(evaporator), 플래시 증발기(flash evaporator), UF막 농축, MF막 농축, 무기염류에 의한 염석, 용제에 의한 침전법, 이온 교환 셀룰로오스 등에 의한 흡착법, 흡수성 겔에 의한 흡수 법 등을 들 수 있다. 바람직하게는 UF막 농축, 증발기가 좋다. UF막 농축용 모듈로서는, 분획 분자량 3,000～100,000, 바람직하게는 6,000～50,000의 평막 또는 중공사막, 재질은 폴리아크릴니트릴계, 폴리술폰계 등이 바람직하다.
분무건조(스프레이 드라이)는, 예를 들면, 노즐 향류식, 디스크 향류식, 노즐 병류식, 디스크 병류식 등의 분무건조기를 사용해서 행하는 것이 좋다. 바람직하게는 디스크 병류식이 좋고, 분무기(atomizer) 회전수는 4,000～20,000rpm, 가열은 입구 온도 100～200℃, 출구 온도 40～100℃로 제어해서 분무건조(스프레이 드라이)하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용하는 성분 (a)의 다른 리파아제는, 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제이며, 페니실리움 카멤베르티(Penicillium camemberti) 유래의 리파아제, 다시 말하면 1,3 특이성 리파아제를 사용하는 것이 바람직하다. 이 분말 리파아제로서는, 아마노 엔자임 가부시키가이샤(Amano Enzyme Co., Ltd.)에서 판매되고 있는 리파아제 G "아마노" 50 등을 사용할 수 있다. 이 리파아제의 최적 pH는 5.0이며, 특히 pH4.5～6.0에서 유효하게 작용하고, 최적온도는 40℃이다. 이 분말 리파아제는 담체를 갖지 않는 백색～담황갈색의 미분말이다.
한편, 이것 이외에 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제를, 상기 리조무코르속(Rhizomucor sp.) 유래의 리파아제에 대해서 설명한 것과 동일한 방법에 의해 분말형상물로서 얻고, 이것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 성분 (b)의 리파아제는, 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 리파아제이다. 이 리파아제의 분말형상물로서는, 메이토 산교 가부시 키가이샤(Meito Sangyo Co., Ltd.) 제품의 리파아제 QL이나 리파아제 PL 등을 사용할 수 있다.
리파아제 QL은 겔 여과법에 의해 구한 분자량이 18～19만, 등전점(等電点; isoelectric point) 4.1, 최적 pH 7～8.5, 최적온도 60℃, pH 안정성 6～10, 온도 안정성 40℃ 이하의 특성을 가지며, 리파아제 PL은 겔 여과법에 의해 구한 분자량이 35～37만, 등전점 4.5, 최적 pH 7～8.5, 최적온도 37～40℃, pH 안정성 7～10, 온도 안정성 40℃ 이하의 특성을 갖는다. 양자는 모두 담체를 갖지 않는 담황색의 미분말이다. 본 발명에서는, 리파아제 QL을 사용하는 것이 바람직하다.
한편, 이것 이외에 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 리파아제를, 상기 리조무코르속(Rhizomucor sp.) 유래의 리파아제에 대해서 설명한 것과 동일한 방법에 의해 분말형상물로서 얻고, 이것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 성분 (b)의 다른 리파아제는, 리조푸스속(Rhizopus sp.) 유래의 리파아제 및 써모마이세스속(Thermomyces sp.) 유래의 리파아제이다. 리조푸스속(Rhizopus sp.) 유래의 리파아제로서는, 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae) 유래의 리파아제가 바람직하며, 이 리파아제의 분말물로서는, 아마노 엔자임 가부시키가이샤 제품의 분말 리파아제 F-AP15를 사용할 수 있다.
또한, 써모마이세스속(Thermomyces sp.) 유래의 리파아제로서는, 써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 리파아제가 바람직하며, 이 리파아제의 분말물로서는, 노보자임즈 재팬 가부시키가이샤 제품의 리포자임(lipozyme) TL(100L)을 막처리하고, 이어서 스프레이 드라이에 의해 분말화한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 성분 (a) 및 (b)의 분말 리파아제의 입경은 임의로 할 수 있으나, 분말 리파아제의 90질량% 이상이 입경 1～100㎛인 것이 바람직하다.
분말 리파아제의 입경은, 예를 들면, HORIBA사의 입도 분포 측정장치(LA-500)를 사용해서 측정할 수 있다.
본 발명에서는, 성분 (a) 및 (b)의 분말 리파아제의 병용비율로서는, 성분 (a):성분(b)의 질량비가 1:99～99:1인 것이 바람직하다. 특히, (a)리조무코르속(Rhizomucor sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제:(b)알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제의 질량비가 60:40～98:2인 것이 보다 바람직하고, 또한, 70:30～95:5인 것이 가장 바람직하다. 또한, (a)페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제:(b)알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제의 질량비가 10:90～90:10인 것이 보다 바람직하고, 또한, 70:30～30:70인 것이 가장 바람직하다. 특히, 이 리파아제의 조합의 경우, 효과를 보다 발휘하는 2종의 분말 리파아제의 병용비율의 폭이 극히 넓은 것이 특징이다.
(a)의 분말형상의 리파아제:(b)리조푸스속(Rhizopus sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제의 질량비가 10:90～70:30인 것이 보다 바람직하고, 또한, 20:80～40:60인 것이 가장 바람직하다. 또한, (a)의 분말형상의 리파아제:(b)써모마이세스속(Thermomyces sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제의 질량비가 10:90～90:10인 것이 보다 바람직하고, 또한, 30:70～80:20인 것이 가장 바람직 하다.
다음으로, 본 발명의 분말 리파아제 조성물을 사용하는 에스테르화 방법에 대해서 설명한다.
에스테르화에서 대상으로 하는 알코올성 수산기를 분자 내에 적어도 1개 갖는 화합물로서는, 각종 모노 알코올, 다가 알코올, 아미노 알코올 등 여러 가지 화합물을 들 수 있다. 구체적으로는, 단쇄(短鎖), 중쇄(中鎖), 장쇄(長鎖)의 포화, 불포화, 직쇄, 분기 알코올, 글리콜류, 글리세린, 에리스리톨류와 같은 다가 알코올을 들 수 있다. 이들 중, 글리세린이 바람직하다.
한편, 카르복실산으로서는, 단쇄, 중쇄, 장쇄의 포화, 불포화, 직쇄, 분기 카르복실산을 들 수 있다. 이들 중, 탄소수 6～30의 지방산, 예를 들면, 옥탄산(octanoic acid), 데칸산(decanoic acid), 라우린산(lauric acid), 미리스틴산(myristic acid), 팔미틴산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 리놀산(linoleic acid), 리놀레인산(linolenic acid) 등을 들 수 있다. 이들은 1종 또는 2종 이상을 병용해서 사용할 수 있다. 이들 중, 불포화 지방산이 바람직하며, 특히 공역 리놀산을 사용하는 것이 바람직하다.
에스테르화의 조건은, 예를 들면, 일본국 특허공개 평13-169795호 공보나 일본국 특허공개 평15-113396호 공보 등에 기재된 조건에 준하여 행할 수 있다. 일례를 들면, 기질의 합계 질량, 즉 알코올성 수산기를 갖는 화합물과 카르복실산의 합계 질량에 대하여, 본 발명의 분말 리파아제 조성물을 0.1～2질량% 첨가하고, 30～60℃에서 24～72시간 반응시키는 것이 좋다. 이때, 반응계를 감압으로 해서 에스테 르화에 의해 발생하는 물을 제거(탈수)하면서 반응을 행하는 것이 좋다. 감압도는 1～100hPa인 것이 바람직하고, 1～50hPa인 것이 보다 바람직하며, 1～25hPa인 것이 가장 바람직하고, 이 범위 내에 있어서, 단계적으로 감압도를 높이면서 탈수해 가는 것이 보다 바람직하다. 또한, 탈수처리시, 질소를 불어넣으면서 행하면, 보다 탈수를 효율 좋게 행할 수 있다.
한편, (a)의 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제를 사용하는 경우에는, 기질의 합계 질량에 대하여 0.1～5질량%의 물을 미리 첨가해서 반응을 개시시키고, 그 후, 에스테르화에 의해 발생하는 물을 제거하면서 반응을 행하는 것이 좋다.
본 발명에 따르면, 극히 높은 에스테르화율을 달성할 수 있으며, 특히, 글리세린과 카르복실산에서 직접, 고수율로 트리글리세리드를 제조할 수 있다.
다음으로 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
<실시예>
제조예 1
수용액에 리파아제가 용해?분산한 형태에 있는 노보자임즈 재팬 가부시키가이샤 제품의 Rhizomucor miehei 유래의 리파아제, 상품명 파라타아제(Palatase)(20000L)를, UF모듈(아사히 가세이 고교(주)사 제품 SIP-0013)을 사용해서 저분자 성분을 제거하여 리파아제 함유 수용액(고형분 농도 10.6질량%)을 얻었다. 상세하게는, 액상 리파아제(파라타아제)를 빙냉(氷冷)하에서 UF막처리를 행하고, 1/2 양의 체적으로 농축 후, 농축액과 동량의 pH7의 0.01M 인산 버퍼를 첨가 하였다. 얻어진 용액에 대해서, 마찬가지로 UF막처리 후 인산 버퍼를 첨가하는 조작을 3회 반복하여, 리파아제 함유 수용액(리파아제 농축액:버퍼의 체적비는 1:1)을 얻었다.
이 리파아제 함유 수용액의 pH를, 수산화나트륨 수용액을 사용해서 pH6.8～6.9로 조정하였다.
이 액을, 스프레이 드라이어(SD-1000형:도쿄 리카 기카이(주)사 제품)를 사용해서, 입구 온도 130℃, 건조 공기량 0.7～1.1㎥/min, 분무 압력 11～12kpa의 조건하에 분무하여, 리파아제 분말을 얻었다. 리파아제 분말 입자의 형상은 구상(球狀)이며, 리파아제 분말의 90질량% 이상이 입경 1～100㎛의 범위 내에 있고, 평균 입경은 8.2㎛였다. 입경은 HORIBA사의 입도 분포 측정장치(LA-500)를 사용해서 측정하였다. 105℃, 1시간의 건열건조(乾熱乾燥)의 방법에 의해 측정한 수분함량은 7.9질량%였다.
한편, 리파아제 함유 수용액 중의 고형분 농도는 당도계((주)씨아이에스사 제품 BRX-242)를 사용해서 Brix.%로서 구하였다.
실시예 1〔각종 리파아제 또는 리파아제 조성물을 사용한 질소 취입(吹入) 조건하에서의 에스테르화 반응〕
교반기를 갖는 반응용기에, 글리세린 10g 및 공역 리놀산 90g을 첨가하고, 이것에, 교반하, 하기의 리파아제 분말 효소를 첨가하였다. 수욕(水浴)에서 45℃ 정도로 온도를 유지하면서 30분 방치 후, 즉시 감압 펌프로 감압하였다. 그때, 질소를 불어넣어 물을 나오기 쉽게 해 두었다.
최초는, 40hPa 정도로 유지하였다. 2～3시간 후에 50℃ 정도까지 서서히 가온(加溫)하고, 또한 2～3시간 후에 60℃ 정도까지 가온하며, 그 후는 이 온도를 유지하였다. 한편, 감압을 서서히 세게 해 가서, 최종적으로는 10hPa 정도까지로 하였다.
한편, G, 또는 G＋QL을 효소로서 사용한 경우에는, 반응 전에, 글리세린 및 공역 리놀산의 합계 질량에 대하여, 물을 2질량% 첨가하였다.
에스테르화 반응의 진행은, 수시 샘플링을 행하여, GLC분석에 의해 확인하였다. 이때는 미반응 글리세린, MG, DG, TG의 백분율을 내고, 그 중의 TG의 생성률을 하기 표 1에 나타내며, 또한 도 1에 그래프로서 나타내었다.
사용 리파아제
RM (1%): 제조예 1에서 제조한 리조무코르속(Rhizomucor sp.)에 속하는 Rhizomucor miehei 유래의 분말 리파아제의 단독 사용. 괄호 안의 수치는 리파아제의 사용량을 나타내고, 이러한 수치가 1%인 경우, 리파아제의 사용량이 글리세린과 공역 리놀산과의 합계량의 1질량%인 것을 나타낸다(이하 동일).
RM (1%)＋ QL (0.1%)(본 발명): 제조예 1에서 제조한 리조무코르속(Rhizomucor sp.)에 속하는 Rhizomucor miehei 유래의 분말 리파아제 및 메이토 산교 가부시키가이샤 제품의 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 QL의 병용. 사용량은 괄호 안에 기재(이하 동일).
G(1%): 아마노 엔자임 가부시키가이샤 제품의 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 분말 리파아제 G "아마노" 50의 단독 사용.
G(0.7%)＋QL(0.3%)(본 발명): 아마노 엔자임 가부시키가이샤 제품의 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 분말 리파아제 G "아마노" 50과 메이토 산교 가부시키가이샤 제품의 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 QL의 병용.
QL (1%): 메이토 산교 가부시키가이샤 제품의 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 QL의 단독 사용.
반응시간(h) RM(1%) RM(1%)＋QL(0.1%) G(1%) G(0.7%)＋QL(0.3%) QL(1%)
0 0 0 0 0 0
4 14 2
5.5 25
8 26 0 28
16 53
20 56 81 64 3
22 2 69
24 64 85
28 69 87 3
44 75 91 4 87 3
표 1의 결과로부터, 리조무코르속(Rhizomucor sp.)에 속하는 Rhizomucor miehei 유래의 분말 리파아제의 단독 사용(RM(1%))에 비하여, 리조무코르속(Rhizomucor sp.)에 속하는 Rhizomucor miehei 유래의 분말 리파아제에, 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 QL을 병용하면 (RM(1%)＋QL(0.1%)), 44시간 후의 트리글리세리드의 수율이 75%에서 91%로 크게 상승하는 것을 알 수 있다. 또한, 트리글리세리드의 생성량에 착안하면, 트리글리세리드의 생성량이 75%에 달하는 시간은, RM(1%)의 경우에는 40시간 조금 더 되는 데 비해서, RM(1%)＋QL(0.1%)의 경우에는, 그 반인 20시간이다.
또한, 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 QL 단독으로 1% 사용하더라도, 트리글리세리드를 거의 제조할 수 없는 점에서 보아 당업자에게 있어서 놀랄만한 것이다.
한편, 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 분말 리파아제 G "아마노" 50(G(1%)) 및 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 QL(QL(1%))의 단독 사용에서는, 트리글리세리드를 거의 제조할 수 없는 데도 불구하고, 양자를 병용하면 (G(0.7%)＋QL(0.3%)), 44시간 후의 트리글리세리드의 수율이 87%로 높아지는 것은, 당업자에게 있어서 놀랄만한 것이다.
실시예 2〔RM 또는 각종 리파아제 조성물을 사용한 에스테르화 반응〕
질소가스의 취입을 행하지 않고, 물의 첨가 또는 무첨가로 하면서, 최종 감압을 표 2에 나타낸 상태로 한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 해서 에스테르화 반응을 행하였다. 반응 개시로부터 47시간 후에, 샘플링을 행하고, TG의 생성률을 GLC분석에 의해 확인하였다. 이때, 미반응 글리세린, MG, DG, TG의 백분율을 내었다. TG의 생성률을 하기 표 2에 나타낸다. 표 중, 물의 첨가에 대해서 기재가 없는 것은 물 무첨가이다. 또한, 표 중의 효소의 항목 중의 %로 나타낸 수치는 리파아제의 사용량을 나타내며, 이러한 수치가 1%인 경우, 리파아제의 사용량이 글리세린과 공역 리놀산과의 합계량의 1질량%인 것을 나타낸다. 또한, 표 중의 효소의 항목의 괄호 안에 기재한 수치비는 각종 리파아제의 조합의 질량비를 나타낸다.
사용 리파아제
RM: 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 리조무코르속(Rhizomucor sp.)에 속하는 Rhizomucor miehei 유래의 분말 리파아제.
QL: 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 메이토 산교 가부시키가이샤 제품의 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 QL.
G: 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 아마노 엔자임 가부시키가이샤 제품의 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 분말 리파아제 G "아마노" 50.
PL: 메이토 산교 가부시키가이샤 제품의 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말 리파아제 PL.
TL: 노보자임즈 재팬 가부시키가이샤 제품의 써모마이세스 라누기노수스(Thermomyces lanuginosus) 유래의 리포자임(lipozyme) TL(100L)을 막처리하고, 이어서 스프레이 드라이에 의해 분말화한 것.
F-AP: 아마노 엔자임 가부시키가이샤 제품의 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae) 유래의 분말 리파아제 F-AP15.
효소 TG% 감압 hPa
RM 단독 1% 69 20
RM＋QL(1%, 8:2) 82 19
G＋QL(1%, 5:5) 물 첨가 2% 80 19
RM＋PL(1%, 8:2) 83 17
G＋TL(1%, 5:5) 물 첨가 1% 89 5
G＋F-AP(1%, 3:7) 물 첨가 2% 83 3
RM＋TL(0.6%, 8:2) 72 16
표 2의 결과로부터 명백하듯이, (a)와 (b)의 특정의 분말 리파아제를 병용하면 에스테르화율이 향상하는 것을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. (a)리조무코르속(Rhizomucor sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제 또는 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제와 (b)알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제, 리조푸스속(Rhizopus sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제 및 써모마이세스속(Thermomyces sp.) 유래의 리파아제이며 분말형상의 리파아제로 이루어지는 군(群)에서 선택되는 분말형상의 리파아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  2. 제1항에 있어서, (b)의 분말형상의 리파아제가 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.) 유래의 분말형상의 리파아제인 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, (a)의 분말형상의 리파아제가 Rhizomucor miehei 유래의 리파아제인 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 페니실리움속(Penicillium sp.) 유래의 리파아제가 Penicillium camemberti 유래의 리파아제인 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 성분 (a)와 (b)의 분말 리파아제가 담체에 담지되어 있지 않은 것임을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 성분 (a)와 (b)의 분말 리파아제의 수분량이 10질량% 이하인 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 분말 리파아제의 90질량% 이상이 입경 1～100㎛인 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 에스테르화용인 것을 특징으로 하는 리파아제 조성물.
  9. 알코올성 수산기를 분자 내에 적어도 1개 갖는 화합물을, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 리파아제 조성물의 존재하, 카르복실산으로 에스테르화하는 것을 특징으로 하는 에스테르화물의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 알코올성 수산기를 분자 내에 적어도 1개 갖는 화합물이 글리세린인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 카르복실산이 불포화 지방산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 에스테르화를, 감압하에서 행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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