JP2686766B2 - ファクター▲ｖｉｉｉ▼：ｃを精製する方法 - Google Patents

ファクター▲ｖｉｉｉ▼：ｃを精製する方法

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、複合水性混合物からポリペプチドを分離し
そして精製する方法に関する。さらに詳しくは、本発明
はポリペプチド含有混合物が、抗体精製ステップとそし
てアフィニティー帯域精製ステップよりなる２ステップ
クロマトグラフィー吸着操作を受けるそのような方法に
関する。
本発明の背景 近年科学界および医学界は、治療剤として有用な種々
のポリペプチドとそしてそれらが存在する複合ソース材
料からそのようなポリペプチドを単離する方法に増大し
た注目を与えている。そのようなポリペプチドの一例は
抗血友病因子として知られる血漿から得られる血液因子
である。この血液因子はファクターVIII凝血促進剤活性
タンパク（ファクターVIII:C）としても同定される。こ
のタンパクは血友病Ａを持っている個人の凝血欠陥を修
正するように作用する。それは血漿中にファクターVIII
関連タンパクもしくはファクターVIII:RPとして知られ
る他のタンパクと複合化して存在する。ファクターVII
I:RPの他の名称はファクターVIII:R:Agおよびフオンウ
イルブランドファクターである。ファクターVIII:Cの凝
血剤としての治療的価値のため、ファクターVIIIを精製
し、そしてファクターVIII:CをファクターVIII:RPから
単離することが好ましいと考えられていた。種々の操作
がファクターVIII:Cおよび治療価値のある他のポリペプ
チドの単離を示唆した。これらの方法は一般に免疫アフ
ィニティ、アフィニティまたはイオン交換クロマトグラ
フィーの技術に基いていた。例えば、ファクターVIII:C
の超精製のための最近の特許、ZimmermanおよびFulcher
の米国再発行特許32,011の方法は、アフィニティおよび
イオン交換クロマトグラフィーの２ステップ操作を採用
する。本質的に、ファクターVIII製剤はファクターVII
I:RPに向けられたマウスモノクロナール抗体と結合した
アガロースビーズを含んでいるカラムを通される。フオ
ンウイルブランドファクターへ複合化されたファクター
VIII:Cはマトリックスへ吸着されるが、複合化されてい
ないファクターVIII:C部分および夾雑物は未結合物質と
してカラムを通過する。ファクターVIII:Cは、結合した
フオンウイルブランド抗体複合体からカルシウムを含む
高濃度塩溶液で除去される。ファクターVIII:C溶液は脱
塩され、そして最後にイオン交換カラム、詳しくは正に
帯電したアミノヘキシル基と結合したアガロースビーズ
へ吸着される。ファクターVIII:Cはカラムから高濃度塩
溶液で脱着される。
この方法はポリペプチドの超精製に使用するのに適し
ているが、それは製品の治療安全性を改良しそして大規
模生産を容易化するいくつかの重要な特徴を欠いてい
る。Zimmerman et al再発行特許の一つの目立つた特徴
は、モノクロナール抗体が通常は過剰でそして関心ある
ポリペプチド（ファクターVIII:C）と会合していると考
えられる他のポリペプチド（フオンウイルブランドファ
クター）に向けられていることである。ソース材料に応
じ、ファクターVIII:Cの50％もの多くがフオンウイルブ
ランドファクターと会合していない形であることがあ
る。Amphletの米国特許第4,508,709号を見よ。会合して
いないファクターVIII:Cは上記の免疫アフィニティステ
ップに使用されたモノクローナル抗体によって結合され
ず、従って精製プロセスにおいて失われるであろう。今
日まで、複合化されない形単独での製品としてファクタ
ーVIII:Cを持つ証明された利益は存在しなかった。証拠
はファクターVIII:Cはこのポリペプチドを複合ソース材
料から単離する時の重要な特徴である、そのフオンウイ
ルブランドファクターとの会合によってタンパク分解か
らより長く保護されることを示す。Weiss et al,J.Cli
n.Invest.60,390−404を見よ。そのため不利益ではなく
て、ファクターVIII:Cとのフオンウイルブランドファク
ターの会合は、精製ステップ中ファクターVIII:Cへ安定
性を付与し、そして治療的投与の間該ポリペプチドの半
減期を延長する点において有利であり得る。
第２に、任意のマトリックスへ共有結合したモノクロ
ーナル抗体はそれらのマトリックスから浸出もしくは分
離し、最終のポリペプチド含有製品を汚染する傾向を有
する。前述の特許方法および先行技術は非ヒト細胞誘導
浸出モノクローナル抗体が免疫アフィニティステップか
ら随伴し、そして第２のイオン交換ステップの間ファク
ターVIII:Cと再会合する確率に対して防禦しない。ファ
クターVIII:Cを溶出するため免疫アフィニティ操作にお
いて使用される高イオン強度緩衝液は低イオン強度へ減
じられ、これは免疫アフィニティカラムから除去された
モノクロナール抗体がファクターVIII:Cへ再結合する
か、それともファクターVIII:Cと共にイオン交換マトリ
ックスへ結合しそして脱着されることを許容し得る。
第３に、イオン交換カラムへ負荷する前に、ポリペプ
チド含有溶液にとって必要な脱塩プロセスは通常大容積
希釈、透析または限外ロ過分子洗浄によって得られる。
これら方法は大規模生産容積に対しては厄介であるばか
りでなく、不可避的に製品の損失へ導く。
最後に、関心あるポリペプチドがけ発見される水性ソ
ース原料はしばしば一種以上のビールスで汚染されてい
る。ポリペプチド中のビールスを不活性化する技術があ
るが、そのような技術を既知のポリペプチド精製プロセ
スと組合わせる試みは、大容量生産には適さない多数ス
テップを有する方法を産む。この方法はポリペプチドの
精製にはしばしば部分的に成功しただけである。例え
ば、先行技術において多数のビールス不活性剤がビール
スの不活性化のために有効であることを示した。しかし
ながらそのような剤は変性するか、また関心あるポリペ
プチドから分離するのが困難であり、特別の処理または
分離ステップを必要とした。加熱または照射のような、
潜在的ビールス汚染のためポリペプチド含有製剤を処理
するための他の慣用方法は、関心あるポリペプチドの有
意な変性か、またはビールスの不十分な不活性をもたら
した。
ここに記載したビールス不活性剤の使用は、関心ある
ポリペプチドの生物学的活性に悪影響することなくビー
ルスを不活性化することができる。本発明の他の操作を
伴う、水性ソース材料のビールス不活性化剤による処理
は、ビールスおよびビールス不活性剤を実質上含まない
最終製品を生産する。
本発明の主要目的は、特にポリペプチド変性の低いレ
ベルをもってポリペプチドの大スケール精製に適した、
ポリペプチドのための精製方法を提供するこである。本
発明の他の目的は、精製した製品の抗体およびビールス
汚染の減少に有効なポリペプチド精製プロセスを提供す
ることである。本発明の付加的目的は、他のタンパク、
ビールスおよび精製ステップにおいて使用した処理剤の
ような汚染物質を含まない、ポリペプチドの精製方法の
開発である。
本発明の概要 本発明によれば、ポリペプチドを複合水性混合物から
単離し、精製する方法が開示される。この方法の結果、
ポリペプチドは実質上他の汚染タンパクを含まず、そし
て出発水性混合物のその純度に比較して一層高度に精製
される。この方法の好ましい一具体例は、ビールスのよ
うな病原性物質のレベルを減少する技術をプロセスへ含
めることである。諸方法は、ポリペプチドと他の成分の
混合物中のポリペプチドを、 （ａ）精製すべき特異性ポリペプチドへ結合する抗体を
前記ポリペプチドが前記抗体へ加えられる前または後に
気質へ固定化し、それにより前記ポリペプチドを免疫ア
フィニティマトリックス中に固定化し、 （ｂ）ポリペプチド：免疫アフィニティマトリックスを
前記マトリックスからポリペプチドを脱着する脱着物質
で処理することによって固定化した抗体からポリペプチ
ドを溶出し、 （ｃ）精製すべきポリペプチドをポリペプチドへ結合す
ることができるアフィニティ帯域を通過させ、それによ
り夾雑物がアフィニティ帯域を通過するのを許容しなが
ら該ポリペプチドをアフィニティ材料へ結合し、 （ｄ）精製したポリペプチドをアフィニティ帯域から溶
出する 多段階精製プロセスへかけることよりなるポリペプチ
ドと他の成分との混合物中のポリペプチドを精製するこ
とよりなる。
好ましい具体例は、前記プロセスへ、有機溶媒と洗剤
を含むビールス不活性化剤を加え、そして前記溶媒およ
び洗剤を除去することを含む。これは脂質で包まれたビ
ールスで汚染された複合水性混合物中のポリペプチド
を、 （ａ）前記複合水性混合物を有機脂質溶解もしくは破壊
溶媒とそして洗剤を含有するビールス不活性化剤とプロ
セスの任意の段階で混合し、 （ｂ）前記ポリペプチド混合物を該ポリペプチドに対し
特異性の活性固定化モノクローナル抗体を含んでいる免
疫アフィニティマトリックスを通過させ、それにより該
ポリペプチドを免疫アフィニティーマトリックスへ吸着
させ、 （ｂ）前記免疫アフィニティマトリックスへ吸着された
ポリペプチドを残しながら複合水性混合物から夾雑物の
少なくとも一部を除去するため前記免疫アフィニティマ
トリックスを水性緩衝液で洗浄し、 （ｄ）前記ポリペプチドを脱着するため前記免疫アフィ
ニティマトリックスを低極性緩衝液で溶出し、それによ
って低極性ポリペプチド溶液を形成し、 （ｅ）前記低極性ポリペプチド溶液をアフィニティマト
リックスを通過させ、それにより浸出されたモノクロナ
ール抗体、洗剤および他の夾雑物がアフィニティマトリ
ックスを通過することを許容する一方で前記ポリペプチ
ドをそれへ結合し、 （ｆ）前記ポリペプチドを脱着し、実質上夾雑物を含ま
ない溶液を形成するように前記アフィニティマトリック
スを溶出液で溶出する ことによって精製することにより有利に実施される。
本発明の詳細な説明 本発明は、ポリペプチドを複合水性混合物から単離
し、精製する方法に関する。関心あるポリペプチドは主
としてヒト治療投与、研究目的および診断用途のもので
ある。血漿タンパクは特に関心ある。血液フィブリン溶
解および凝血促進因子が本発明に使用するポリペプチド
の一つの好ましい群を構成する。代表例は、プラスミノ
ーゲン活性化剤として有用な、ウロキナーゼ、ストレプ
トキナーゼおよびフィブロラーゼのような酵素、および
他の治療剤として有用なファクターII、ファクターV,フ
ァクターVII,ファクターVIII,ファクターIX,ファクター
X,ファクターXI,ファクターXII,タンパクＣおよびタン
パクＳのような血液ファクターを含む。特に関心あるポ
リペプチドは、血液ファクターであるファクターVIII,
さらに詳しくはファクターVIII:Cと、そしてファクター
VIII凝血ファクター抗原である。本発明のプロセスによ
り、そのようなポリペプチドは、血漿、血漿分画、市販
濃縮物、および合成的に製造されたポリペプチドおよび
天然に存在するポリペプチドを含有する培地を含む組織
培養培地のような複合混合物から単離することができ
る。
本発明のプロセスは、処理前に混合物中に存在した、
また以下に開示する処理ステップの間に混合物へ添加し
た夾雑物を実質上含まないポリペプチドを製造する。夾
雑の例は、脂質包囲ビールスおよび非包囲ビールスを含
む病原性ビールス、パイロージェン、浸出抗体、有機培
養、洗剤、脱着剤、そしてそれから関心あるポリペプチ
ドが単離される複合混合物中に存在する他のタンパクを
含む。
本発明の一具体例によれば、関心あるポリペプチドを
含有する複合水性混合物は、精製すべき特異性ポリペプ
チドへ結合する抗体へ添加される。抗体がポリペプチド
へ結合する時、抗体はどのような他のマトリックスへ結
合していないことができ、またはそれにポリペプチドへ
の結合前に、抗体を固定化しそしてそれをあらかじめ決
められた帯域内に固定するマトリックスへ結合すること
ができる。抗体をその中に固定できる帯域の好ましい帯
域は、クロマトグラフィーカラム中のまたは放射流カー
トリッジ中のビーズ化した樹脂である。抗体のポリペプ
チドへの結合前にそれが帯域内に固定されるかされない
かにかかわらず、抗体はポリペプチドへの結合後ある点
で固定化状態にあることが重要である。
抗体は固定化マトリックスへ固定でき、そして精製す
べきポリペプチドへ結合することができる任意の抗体と
することができる。ポリクロナールおよびモノクロナー
ル抗体の両方と、そして多数の固定化基質またはポリペ
プチドまたは両者と結合するように仕組まれた両方のタ
イプの混合物が使用できる。それらの特異性と、そして
大量に容易に入手し得るため、モノクロール抗体が好ま
しい。抗体の選定は選んだポリペプチドおよび固定化基
質に依存するからであろう。他の好ましい操作条件と共
にここで有用な抗体の好ましいクラスは、もし免疫アフ
ィニティステップが第２のイオン交換クロマトグラフィ
ーステップと組み合わされるならば、疎水性相互作用に
よってポリペプチドと相互作用するそれらである。親水
性相互作用によってポリペプチドと相互作用する抗体
は、もし免疫アフィニティステップが第２の疎水性相互
作用クロマトグラフィーステップと組み合わされるなら
ば、等しく好ましくそして有用である。
本発明の好ましい方法は、ポリペプチドを関心あるポ
リペプチドに対し特異性のモノクロナール抗体へ、該抗
体自身が免疫アフィニティクロマトグラフィーカラム中
に固定化された後に結合することよりなる。ポリペプチ
ドの混合物は、関心あるポリペプチドに対し特異性のモ
ノクロナール抗体がその上に固定されている免疫クロマ
トグラフィーカラムを通される。該混合物がカラムまた
はカートリッジを通過する時、該ポリペプチドは固定化
モノクロナール抗体へ吸着される。カラムまたはカート
リッジは水性緩衝液で洗浄される。緩衝液はビールス不
活性化剤の大部分と、そして他の夾雑物を複合水性混合
物から除去するが、しかしカラムまたはカートリッジ上
に吸着された関心あるポリペプチドを残す。
カラム中のポリペプチドは脱着剤で脱着および溶出さ
れる。脱着剤の選択は当業者の伎倆の範囲内である。ポ
リペプチドへの疎水性引力を持った抗体のための好まし
い脱着剤は、低イオン強度、低極性緩衝液である。低イ
オン強度は、普通0.2より低いイオン強度μを有する溶
液を意味する。低イオン強度を持つ塩溶液の例は、0.15
M塩化ナトリウム、1.0mM塩化カルシウム、および40mM塩
化カルシウムである。低極性溶液を提供する非極性剤の
例は、エチレングリコール、ジオキサン、プロピレング
リコールおよびポリエチレングリコールを含む。緩衝液
はポリペプチドを脱着し、それにより低イオン強度低極
性ポリペプチド溶液を形成する。ポリペプチドへの親水
性引力を持った抗体に対しては、好ましい脱着剤は0.8M
塩化ナトリウムおよび0.25塩化カルシウムのような高イ
オン強度水性緩衝溶液である。高イオン強度は、0.2以
上のイオン強度値μを有する溶液を意味する。
関心あるポリペプチドのソースを提供する複合水性混
合物は、しばしば病原性ビールス、特に肝炎Ｂビール
ス、非Ａ非Ｂ肝炎ビールス、およびHIV（HTLV−III）ビ
ールスのような脂質包囲ビールスによって汚染されてい
る。
本発明の最も広い適用、すなわちアフィニティ精製と
組み合わせた免疫アフィニティ精製において、ビールス
の実質量が除去される。ポリペプチド有機溶媒および洗
剤で処理することにより好ましい具体例の一つが採用さ
れる時、脂質で包まれたビールスのレベルは通常検出可
能レベル以下に減らされる。この処理の実施可能な成分
は有機溶媒と洗剤である。有機溶媒は、多数のビールス
を囲んでいる脂質含包被層を溶解または破壊するのに活
性であり、そして精製すべきポリペプチドを変性しない
有機溶媒である。実例はジ−（ｎ−プロピル）フオスフ
ェートおよびトリ−（ｎ−ブチル）フオスフェートのよ
うなジ−およびトリアルキルフオスフェート、エチルエ
ーテルおよびプロピルエーテルのようなエーテル、酢酸
アミルのようなエステル、およびブチル化ヒドロキシア
ニソール（BHA）およびブチル化ヒドロキシトルエン（B
HT）のようなアルキル化およびヒドロキシアルキル化物
質を含む。上記の混合物または他の有機溶媒も有用であ
る、エチルアルコールおよびエチルエーテルがアルキル
フオスフェートと同様に特に許容できることが判明し
た。
ここで有用な洗剤はアニオン性、カチオン性および非
イオン性洗剤の任意の認可されたグループから選ぶこと
ができる。実例は、硫酸化オキシエチル化アルキルフェ
ノール（トリトンＷ−30およびトリトンＸ−100），ド
デシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ナツコノールN
R）,2−スルホオレイン酸ナトリウム（イゲポンＡ），
コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ド
デシルスルホン酸ナトリウム、ドデシルジメチルベンジ
ルアンモニウムクロライド（トリトンＫ−60），オキシ
エチル化アミン（エソミーン）,N−ドデシルアミノエタ
ンスルホン酸、エチレンオキシド−プロピレンオキシド
縮合物（プルロニック共重合体）、エステルのポリオキ
シエチル化誘導体（トウィーン80およびポリソルベート
80），ポリオキシエチル脂肪アルコールエーテル（ブリ
ジ35），ノニデットＰ−40およびリュブロックスPXのよ
うな多数の硫酸アルコールおよびナトリウム酸塩を含
む。
本発明の好ましい具体例の実施に使用される有機溶媒
および洗剤の量は、処理すべき水性混合物に応じ、そし
て選択した溶媒および洗剤に応じ変化し得る。もしエー
テルまたはアルコールまたはそ混合物を使用するなら
ば、その、量は混合物が血漿または血液成分であるなら
ば水性混合物の１ないし50重量％、好ましくは約５ない
し25重量％である。アルキルフォスフェートは処理され
る混合物の約0.1mg/ml、好ましくは約0.1mg/mlないし10
mg/mlの濃度において使用される。使用される洗剤もし
くは湿潤剤の量は重要ではない。その機能は有機溶媒と
ビールスとの接触を改善することである。ここで有用な
多数の非イオン剤について、洗剤の量は処理される水性
混合物中の脂肪物質量に応じ、水性混合物の0.001％な
いし10％、好ましくは0.01乃至２％よりなることができ
る。溶媒および洗剤の量は、相互に応じて、処理される
水性混合物および精製されるポリペプチドルに応じても
変化するであろう。
先行技術は、ポリペプチドの濃厚溶液へ有機溶媒およ
び洗剤の添加は脂質で包まれたビールスを破壊および不
活性化するが、しかし所望のポリペプチドのタンパク構
造を保存することを教えている。米国特許第4,540,573
号を見よ。Tween−80またはトリトンＸ−100を含有する
有機溶媒が、タンパクの生物活性に悪影響することなく
ある種のタンパクの濃厚溶液中に発見されるビールスを
殺滅するための有効な指導であることが示された。しか
しながらそのような溶媒／洗剤混合物の使用は、濃縮タ
ンパクからのそのような混合物の後からの除去が非常に
困難なため、回避されていた。例えば、Prince、A.M.et
al、P.706,1981年３月29日を見よ。その結果コール酸
ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウムのような
他の洗剤がもっと普通に使用される。これら洗剤は関心
あるポリペプチドから、たてえばセファデックスＧ−25
上のゲル排除クロマトグラフィーによって除去すること
ができる。しかしながらこれら洗剤の使用の欠点は、そ
れらはポリペプチドの生物活性に悪影響し得る強いタン
パク変性剤であることである。そのような洗剤は他の洗
剤またはタンパク安定剤またはその両者と併用して、精
製すべきポリペプチドを変性しない量においてここで使
用することができる。
先行技術方法の欠点は本発明の好ましい具体例によっ
て克服される。本発明は、関心あるポリペプチドからビ
ールス不活性化試薬の硬化的除去のための手段を提供
し、そのためTween880およびトリトンＸ−100のような
洗剤と有機溶媒の使用の障害を克服する。本発明方法に
おいては、ビールス不活性化剤は、関心あるポリペプチ
ドを含んでいる複合水性原料へ添加される。後で詳しく
記載するように、混合物は次にポリペプチドに対する活
性固定化モノクロナール抗体を含むマトリックスへ直接
適用することができる。ポリペプチドはマトリックスへ
吸着され、ビールス殺滅試薬はマトリックスの洗浄によ
って除去することができる。
マトリックスは、関心あるポリペプチドを特異的に吸
着することができる活性モノクロナール抗体が結合され
る固体支持マトリックスを収容する免疫アフィニティク
ロマドグラフィーカラムとすることができる。該モノク
ロナール抗体は、しばしば臭化シアンのような活性化剤
によって活性化されている樹脂支持体へ加えることがで
きる。支持体は慣用の操作に従ってつくられ、そして例
えばビーズ化したアガロール、セルロール、ナイロンま
たはポリビニル膜よりなることができる。前述したよう
に、免疫アフィニティマトリックスは通常クロマトグラ
フィーカラムまたはカートリッジの形である。そのよう
なカラムまたはカートリッジの調製は当業者の熟練の範
囲内である。適当な支持体を含んでいるそのようなカラ
ムまたはカートリッジは水で洗浄し、次に精製すべきポ
リペプチドを含有する精製混合物と同じ緩衝役で平衡化
することができる。
カラムは次に、カラムへ吸着されたポリペプチドを溶
出することなく、ビールス不活性化剤およびモノクロナ
ール抗体マトリックスまたはポリペプチドへ非特異的に
結合し得る他の夾雑物の大部分を除去するため水性緩衝
液で洗浄される。
先行技術、Livingston、D.M.,Methods in Enzymlogy
34,723−731 （1974）は、イオン性相互作用による関心
あるポリペプチドまたは固体支持体への夾雑物の非特異
的結合は、高イオン強度溶液または洗剤の使用によって
最小化し得ることを示した。これは高イオン強度溶液お
よび／または洗剤の慣用マトリックスへの添加は、しば
しばマトリックスへ結合したポリペプチドを不安定にす
るか、またはマトリックスのポリペプチドの低い吸着率
をもたらすので、実用的示唆であるとは証明されなかっ
た。
しかしながら本発明方法においては、洗剤を含有する
イオン強度ポリペプチド溶液は、ポリペプチドに対して
疎水性引力を有するモノクロナール抗体を使用する時、
免疫吸着ステップの間悪影響を全く生じないことを示し
た。例えば高イオン強度、例えば0.5ないし1.5M NaClを
持ったいくつかのソース物質溶液からのファクターVII
I:Cポリペプチドは、低イオン強度、例えば0.15M NaCl
を持ったポリペプチド溶液よりも速い速度で免疫アフィ
ニティマトリックスへ吸着することが見られた。ファク
ターVIII:Cは有機溶媒および洗剤を含んでいるそのよう
なソース溶液中においても同様に安定である。関心ある
ポリペプチドおよびビールス不活性化剤を含んでいる複
合水性混合物をカラムへ添加する時、ポリペプチドはカ
ラムとその成分によって吸着される。混合物の他の成分
はカラムを通過する。
免疫アフィニティクロマトグラフィーカラムを、ビー
ルス不活性化剤および他の夾雑物の大部分がカラムへ結
合したポリペプチドから除去されるように、緩衝液で十
分に洗った後、カラムは結合したポリペプチドを遊離す
る剤で処理される。この剤は望ましくは、モノクロナー
ル抗体がポリペプチドに対し疎水性引力を持っている時
は、低イオン強度の極性減少緩衝液である。低極性低イ
オン強度緩衝液を免疫アフィニティカラムからポリペプ
チドを溶出するために使用することは、生成するポリペ
プチド溶液を修飾することなくイオン交換または他のア
フィニティマトリックスへ加えることができるので有利
であることが判明した。
慣用の免疫アフィニティ精製における主な関心は、溶
出ステップ中非ヒトモノクロナール抗体のポリペプチド
溶出液中への浸出である。先行技術においては、第２の
アフィニティマトリックスへのポリペプチドの適切な吸
着が生起し得るように、溶出したポリペプチド溶液のp
H、極性、またはイオン強度を変えるのが普通である。
通常この変更は、浸出したポリペプチドがポリペプチド
と再会合するか、またはポリペプチドと共に第２のアフ
ィニティマトリックスへ結合し、それにより最終製品を
汚染するのに十分である。しかしながら本方法において
は、免疫アフィニティカラムからポリペプチドを脱着す
る溶液の組成は、イオン交換カラムへ負荷する前に変え
る必要はない。それ故溶液中に存在するどんなモノクロ
ナール抗体にとっても、関心あるポリペプチドイまたは
第２のアフィニティマトリックスへ再結合することは一
層困難である。
低極性緩衝液をアフィニティマトリックスを通す時、
ポリペプチドはアフィニティマトリックスへ結合する
が、どんな浸出されたモノクロナール抗体も、洗剤また
は他の夾雑物のカラムを通過する。好ましくはアフィニ
ティマトリックスは、低イオン強度において荷電した生
物学的分子と結合し、そしてそれらをpHもしくはイオン
強度を変える時遊離することができる。荷電した化学基
を共有結合したマトリックスよりなるイオン交換カラム
である。しかしながらもし疎水性相互作用物質が使用さ
れるならば、アフィニティマトリックスは高イオン強度
においてポリペプチド分子の非帯電区域を吸着すること
ができる非極性化学基を含有する。適当なアフィニティ
材料は抗体に対し実質親和性を持たないそのような化学
的官能基を含む。イオン性化学種の例は、特にアルキル
基が６個までの炭素原子を持っているアミノアルキルア
ニオン交換体およびカチオン交換体を含む。第４級アミ
ノエチル、アミノエチルおよびジエチルアミノエチル化
合物はアニオン交換基の好ましいクラスを構成する。ス
ルホプロピルおよびカルボキシメチルは許容でき、そし
て好ましいカチオン交換基である。疎水性相互作用化学
種はフェニルおよびｎ−オクチル官能基である。アフィ
ニティ吸着剤支持体は、架橋したセルロースの材料の繊
維、ビーズ、ディスクもしくは小板、ビーズ化したアガ
ロースおよび類似物のような普通に使用される支持体の
どれでもよい。
マトリックスは次にポリペプチド上の汚染残渣の微量
を除去するため洗浄される。洗浄液は夾雑物をヒトに対
して非毒性レベルへ、そしてまた精製されるポリペプチ
ドの有効性に影響しないレベルへ減らすのに十分でなけ
ればならない。洗浄液は好ましくは溶出液と同じ成分を
含有するが、しかしもし正に荷電した基を有するアニオ
ン交換マトリックスが使用されるならばもっと高いpHお
よび／または低いイオン強度にある。一般的指針とし
て、溶出液はポリペプチドをアニオン交換マトリックス
から脱着するのに十分に高いイオン強度および／または
低いpHを与える組成で緩衝化されなければならない。該
溶液はポリペプチドと併立性で、非毒性で、そしてポリ
ペプチドアフィニティマトリックス結合を破壊できなけ
ればならない。
溶出されたポリペプチドを含有する溶液は、治療用途
に適した精製した製品を製造するため緩衝液中に直接希
釈することができる。該溶液は典型的には生理濃度の塩
およびヒトアルブミンと、そして約pH7の緩衝化能力を
提供するアミノ酸、酢酸塩、リン酸、クエン酸、イミダ
ゾール、トリメタミン等のような非毒性試薬を含有す
る。
精製すべきポリペプチドのためのソース原料は、精製
すべきポリペプチドを含有する血漿または血漿から得た
分画、例えば可溶化した寒性沈澱を含む。ヒト血漿また
は他の動物からの血漿も本発明において使用することが
できる。本発明において有用な他のソース原料は、組換
えDNA技術によって製造されたポリペプチドを含んでい
るヒトまたは動物組織培養培地を含む。
本発明において寒性沈澱を使用するため、寒性沈澱
は、ポリペプチド活性に対して合理的に安定な環境を提
供するのに必要な成分を含有する水溶中に懸濁すること
によって溶解することができる。そのような溶液成分
は、適当なイオン強度を保つための塩を含む。水溶液中
に寒性沈澱を懸濁およびよく混合した後、遠心または濾
過のような物理的技術によって不溶物を除去することが
しばしば望ましい。寒性沈澱の例えばpH、塩の調節およ
びPEG添加も不溶物の除去を容易にするために行うこと
ができる。結果は安定なポリペプチド活性を持った粒子
不含溶液となる。他のソース材料は調節を必要としない
であろう。
第２のステップは、脂質で包まれたビールスの不活性
化のため、ソース原料溶液へ有機溶媒および洗剤を添加
することを含むことができる。ソース原料と有機溶媒／
洗剤混合物を混合した後、混合物およびソース原料は脂
質で包まれたビールスを不活性するのに十分な時間静置
しなければならない。この時間はソース原料溶液の温度
に依存する。ソース原料が0.3％トリ−ｎ−ブチルフオ
スフェートおよび1.0％トリトンＸ−100を含有する寒性
沈澱溶液であり、18℃以上の温度のとき最低３分間が使
用される。
免疫アフィニティ精製ステップを実施する前に、免疫
アフィニティマトリックスによるポリペプチドの吸着を
補強するため、溶液条件を最適化するのが望ましい。そ
のような条件は、もし存在すれば他のタンパクとポリペ
プチドの会合を破壊するのに十分な濃度に塩（例えば塩
化ナトリウム、塩化カルシウム）の添加を含む。そのよ
うな条件はまた、ポリペプチドの他のタンパクとの会合
を破壊するpH調節を含むことができる。一般に広範囲の
物理的および化学的技術が免疫アフィニティマトリック
スによるポリペプチド吸着を最適化するために使用でき
る。選択すべき技術は、一旦抗体製品および免疫アフィ
ニティマトリックスが確立されたならばこの分野に経験
ある者にとっては自明であろう。
プロセスの免疫アフィニティ精製ステップは種々の方
法で実施することができる。このステップの目的は
（１）抗体がそれへ最初に共有結合されたマトリックス
上へポリペプチドを吸着すること、（２）免疫アフィニ
ティマトリックスから非特異的に結合した物質を洗い、
それにより精製すべきポリペプチドから夾雑物を分離す
ること、（３）免疫アフィニティマトリックスを実質的
に精製された形でポリペプチドを溶出するこである。抗
体分子上のポリペプチド認識部位は、好ましくはソース
材料溶液からのポリペプチドの定量的吸着が可能なよう
に、ポリペプチド濃度と常に等しいかまたは過剰であ
る。免疫アフィニティマトリックスがカラム中に収容さ
れている時は、ソース材料が加えられる速度はポリペプ
チド吸着が起こる十分な時間を許容するように調節され
る。免疫アフィニティマトリックスがカラム中に収容さ
れず、その代わりポリペプチドソース原料へバッチ反応
のように加えられる時は、マトリックスはポリペプチド
吸着が起こるのを許容するのに十分な時間かきまぜられ
る。どちらの反応モードを使用する時でも、吸着が起こ
るのに必要な時間は実験的に決定するのが普通である。
ポリペプチドは免疫アフィニティマトリックスへ吸着
され、そして免疫アフィニティマトリックスはマトリッ
クスから非特異的に結合または保持された物質を除去す
るため水溶液で洗浄される。洗浄水溶液の組成は、前述
の非特異的に結合もしくは保持された物質を免疫アイニ
ティマトリックスから除去するが、ポリペプチドを免疫
マトリックス上に保持し、そしてポイペプチド活性を維
持するようなものである。この基準を満たす洗浄水溶液
の組成は、免疫アフィニティマトリックスから非特異的
に結合もしくは保持された物質の実質的除去を行うのに
必要な洗浄水溶液の量とともに、この分野に経験ある者
によって実験的に普通に決定される。ポリペプチドがフ
ァクターVIII:Cである時、洗浄液のイオン強度は達成さ
れる精製程度に大きな影響を持ち得る。これは高イオン
強度洗浄は免疫吸着したファクターVIII:Cからファクタ
ーVIII:RP（フオンウィルブランドファクター）を除去
するからである。溶出を続ける時、この解離は高い非活
性のファクターVIII:Cを与えるであろう。
免疫アフィニティマトリックスの洗浄後、ポリペプチ
ドは抗体からポリペプチドの解離を起こす成分を含有す
る水溶液によって溶出される。水溶液中の成分は、さも
なければ抗体へ結合したポリペプチドを維持する非共有
結合を破壊する極性物質を含む。該水溶液はポリペプチ
ド活性を維持するのに役立つ他の成分、例えば塩化カル
シウムおよびアルブミンを含むことができる。水溶液の
成分およびそれらのそれそれの濃度は、ポリペプチドタ
イプおよび複合水性混合物タイプの他のパラメーターが
選択されれば決定することができる。
本発明方法の第２部は、アフィニティマトリックス精
製の使用である。前に説明したように、本発明の広い面
においては免疫アフィニティ精製ステップかまたはアフ
ィニティ精製ステップのどちらが先行してもよい。しか
しこのプロセスの最も顕著な利益のいくつかは、免疫ア
フィニティ精製がアフィニティ精製に先行する２ステッ
ププロセスによって実現される。ポリペプチド混合物が
アフィニティマトリックス添加された後、アニオン交換
アフィニティ帯域が低イオン強度緩衝液で洗浄される。
この帯域は次に、好ましくは高イオン強度および／また
は低pHと、そしてポリペプチド安定性を維持する成分、
例えばカルシウムイオン、ポリエチレングリコールおよ
びアルブミンを有する緩衝塩溶液で溶出される。関心あ
るポリペプチドを含んでいる溶出液は、溶出液を排除し
た以外溶出の均等物である溶液中に集めることができ
る。
本発明のプロセスは、例証目的のみで提供され、をし
て限定と考えるべきでない以下の実施例によってさらに
例証される。
以下は実施例１ないし４において使用される溶液の処
方のリストである。
溶液Ｉ（免疫アフィニティ平衡化溶液）:0.05Mイミダゾ
ール、0.8M塩化ナトリウム、0.05M塩化カルシウム、0.3
％（V/V）トリ−（ｎ−ブチル）フオスフェート、1.0％
トリトンＸ−100:6N塩化水素でpH7.4±0.1へ調節。
溶液II（免疫アフィニティ洗浄液）:0.05Mイミダゾー
ル、0.04M塩化カルシウム、5.0％（V/V）エチレングリ
コール;6N HClでpH6.4±0.1へ調節。
溶液III（免疫アフィニティ溶出液）:0.05Mイミダゾー
ル、0.04M塩化カルシウム、40％（V/V）エチレングリコ
ール、0.1％（1.0mg/ml）ヒトアルブミン;6N HClでpH
6.4へ調節。
溶液IV（QAE−Zeta洗浄液）:0.05Mヒスチジン、0.15M塩
化ナトリウム、1.0mM塩化カルシウム、1.0Mグリシン、
0.1％（W/V）ポリエチレングリコール4000、0.1％ヒト
アルブミン（U.S.P.）;6N HClでpH6.4へ調節 溶液Ｖ（QAE−Zeta溶出液）:0.05Mヒスチジン、0.6±0.
1M塩化ナトリウム、4.0mM塩化カルシウム、0.1％（W/
V）ポリエチレングリコール4000、１％ヒトアルブミン
（U.S.P）;6N HClでpH5.5〜6.4へ調節。
溶液VI（バルク希釈液）:0.05Mヒスチジン、4.0mM塩化
カルシウム、0.1％（W/V）ポリエチレングリコール400
0、1.0％ヒトアルブミン（U.S.P.）;6N HClでpH8.2へ
調節。
溶液VII:0.05Mヒスチジン、0.15M塩化ナトリウム、4.0m
M塩化カルシウム、0.1％（W/V）ポリエチレングリコー
ル4000、1.0％ヒトアルブミン（U.S.P.）;6NHClでpH7.1
±0.1へ調節。
実施例１ A.抗ファクターVIII:Cモノクロナール抗体溶液の製造 ここに使用するモノクロナール抗体は、ミルスタイン
およびコーラーの方法に一般的に従って製造したハイブ
リドーマから得られる。Balb/c雌マウスをヒトファクタ
ーVIII:Cで免疫化した後、免疫マウスの脾臓細胞をマウ
スミエローマからのミエローマ細胞Ｐ−3Ag8653と融合
し、せしせいするハイブリドーマをヒトファクターVII
I:Cに対して特異的結合を与える抗体を含んでいる上清
についてスクリーニングした。所望のハイブリドーマを
その後クローン化し、特徴化した。その結果、マサチュ
ーセッツ州ケンブリッジのジェネチィックス、インスチ
ィチュートから、同定番号GI−F8/1,5,6を有し、ヒトフ
ァクターVIII/C上のエピトープに対する抗体を産生する
ハイブリドーマを得た。この抗体は血漿から得たヒトフ
ァクターVIII:Cと反応するばかりでなく、ヒトファクタ
ーVIII:Cをコードする組換えDNAで形質転換した細胞に
よって生産されたヒトファクターVIII:Cとも反応するこ
とが判明した。ここに使用したモノクロナール抗体の製
造は以下のように実施した。
免疫化 雌マウスBalb/Cマウス（ジャクソン、ラボラトリーズ
から入手）を０日において実施例１に述べたようにして
得た、そして完全フロインドアジュバント0.4ml中に乳
化したファクターVIIIの25〜50単位で腹腔内で免疫化し
た。21日にマウスを完全フロインドアジュバント中に乳
化したファクターVIIIで再免疫化した。その後のブース
ター免疫化は３週間隔で投与した。
免疫化した動物の血清を各ブースターの３日後、正常
プール血漿と血清の希釈液を37℃で２時間インキュベー
トすることにより、ファクターVIII凝血活性の阻害につ
いてテストする。残存ファクター活性をクロモゲンファ
クターVIII定量によって測定する。
融合３日前に、マウスをリン酸塩緩衝食塩水のファク
ターVIII25〜50単位最終注射（静脈内または腹腔内）で
チャレンジする。
細胞融合 融合は、コーラーおよびミルスタインによって開発さ
れた操作に従って血清の不存在に実施される。
２匹の免疫化マウスの脾臓を切開によって取り出し、
縦に切断し、細胞をプレート上に氷冷したRPMI−1640/
グルタミン2ml中へかき出し、プレートを一回同じ緩衝
液2mlで洗い、残りの細胞を取り、10ml試験管へ入れ
る。細片を氷上で約５分間沈降させ、細胞を４℃におい
てPPMI−1640/グルタミン50mlで洗い、その後氷冷したR
PMI−1640/グルタミン10ml中に再懸濁する。細胞のカウ
ントは２×10に達した。
207FCS/RPMI（グルタミン、スーメルカプトエタノー
ル、ゲンタマイシン）中に保存したミエローマ細胞株P3
Ag8553を10℃でRPMI−1640/グルタミン50ml中で洗い、
その後室温の10mlRPMI−1640中に再懸濁する。
脾臓およびミエローマ細胞をミエローマ細胞１個あた
り脾臓細胞約４個の比で混合し、そしてPRMI−1640/グ
ルタミンで50mlとし、10℃で洗浄する。上清を吸引し、
ペレットを試験管をはじくことによって再懸濁する。試
験管を次に37℃の水を入れたビーカに置く。ペレットを
1mりっとるピペット先端でかきまぜながら1mlの50％W/W
PEG5000をゆっくりと1/2に渡って管へ加える。混合物を
時々かきまぜながら37℃で1/2分間静置する。37℃のRPM
I−1640/グルタミン5mlをかきまぜながら３分間で徐々
に加える。RPMI−1640/グルタミンの追加の14mlを１分
間で加え、20％FCS RP−1640/グルタミン30mlを加え
る。細胞懸濁液を20℃で８分間遠心し、ペレットを20％
FCS RPMI−1640＋HAT中1.5×10/ml（1.5×10脾臓細胞
／プレート/20ml）入力脾臓細胞/mlへ懸濁する、脾臓細
胞ドナーとして同じ株からの正常マウス腹膜細胞フィー
ダー（2.5×10/ml）を加える。
0.2ml分量をコスター96ウェル中へ滴下した（20ml/プ
レートに計量）。７日後培地の1/2ないし2/3をHAT＋RPM
I−1640＋20％FCSで置換する。12〜28日の間に培地を定
期的にHTおよびRPMI−1640および20％FCSで置換する
（培地は細胞が黄色になり始めた時〜２日い置換す
る）。30日以後、培地をPRMI−1640＋20％FCSで置換す
る。
1.HT200X:ヒポキサンチン、136mg ４チミジン、38.8mg D.D.W.,100ml 70℃で溶解し、滅菌濾過し、そして役６月間−29℃で
冷凍保存する。
2.アミノプテリン1,000×：アミノプテリン3.5mg 0.10N NaOH、1ml D.D.W.、19ml 滅菌濾過し、暗所に２日まで−20℃で貯蔵する。
3.HAT1X:HT10X、5ml;アミノプテリン1,000X、 0.5ml:RPMI＋20％FCS,500ml 4.HT1X:HT100X、0.5ml;RPMI＋20％FCS、500ml 5.アザグアニン100X:8−アザグアニン2.5mg 0.01N NaOH 10ml 滅菌濾過し、1ml分量で20℃で貯蔵する。
ファクターVIII:Cに対する抗体についてハイブリッド細
胞培養物のスクリーニング ハイブリッド細胞培養物を二つの方法によって抗ファ
クターVIII:C抗体についてスクリーニングする。
1.結合アッセイ マイクロタイタープレート（96ウェル）をウサギ抗マ
ウスIgGにより、0.2M炭酸塩緩衝液pH9.5中で役37℃で２
時間インキュベートすることによって被覆する。プレー
トを0.05％Tween20を含有するリン酸塩緩衝食塩水（PBS
/Tween20）で３回洗浄する。非特異性部位はプレートを
３％ゼラチンを含有するPBSとインキュベートすること
によって被覆された。ハイブリッド細胞上清の部分標本
をウェルへ加え、37℃で２時間インキュベートし、その
後PBS/Tween20で３回洗浄する。血漿からえあたヒトフ
ァクターVIII:Cをくわえ、室温で一夜インキュベート
し、その後PBS/Tween20で３回洗浄する。抗ファクターV
III Ｉ−FAB′（高力価ファクターVIII阻害因子を有す
る患者の血漿から単離しあたIgGから製造）を加え、37
℃で４時間インキュベートし、その後PBSで３回洗浄す
る。ウェルを熱ワイヤカッターで切断し、放射能をカウ
ントする。このアッセイにおいて上清はファクターVII
I:Cに対する抗体を指示した。
2.阻害アッセイ ハイブリッド細胞上清の部分標本を正常プール血漿の
等容積と混合し、37℃で２時間インキュベートする。サ
ンプルをファクターVIII:C生物活性の適当なアッセイ
（クロモゲンまたは凝血アッセイ）を得るように希釈す
る。正常プール血漿のファクターVIII:C活性の低下はフ
ァクターVIII:Cに対する阻害抗体の存在を指示する。こ
のアッセイはファクターVIII:Cに対する非阻害抗体の存
在を検出しない。
上の二つアッセイのどちらかによって陽性である細胞
を以下に記載する技術によってソフトアガー中において
クローン化およびサブクローン化する。サブクローン化
した細胞はマウス中で抗体リッチ腹水の生産のため腹水
腫瘍として生育する。
ソフトアガークローニング技術 1.0.5％寒天培地の製造： 500mlに対し： 10Xアール氏バランス化塩溶液5.5ml、混合しそして45℃
へ暖めよ。
RPMI−1640:434ml ５％寒天溶液50mlを100℃へ加熱し、加熱溶液をRPMI
−1640溶液へ加えよ。
45℃水浴中でインキュベートせよ。
18ml0.5％寒天／プレートを許容せよ。
2.ハイブリッド細胞希釈液：各ラインについてライン名
称をラベルしそして1,8-1,8-2,8-3とマークした４本の
試験間を使用する。希釈は例えば8-1,8-2,8-3,8-4のよ
うに変えてもよい。試験間１へ0ml、他へ0.7mlのRPMI−
1640を加えよ。ハイブリッド細胞は健康でそして成育の
対数フェーズになければならない。細胞を懸濁し、そし
て0.7mlを試験管１へ移し、0.1mlを試験管8-1へ移し、
混合し、そして８倍系列希釈は、試験管8-1からの0.1ml
を試験管8-2,8-3中へ希釈し、そして8-3から0.1mlを捨
て、すべてが0.7mlを含有するように実施される。37度
Ｃ浴中に入れよ。これら希釈液のすべてを最初のクロー
ニングに使用するのが好ましい。“1"希釈液は通常サブ
クローニングのためオミットすることができる。3.100
×15mmペトリ皿をラベルし、そして25ml使い捨てピペッ
トで0.5％バクト観点培地15mlを皿へピペットし、そし
て0.33％寒天培地中に細胞を含むソフトアガーオーバー
レイを加える前に20分間固まるのを許容する。この間プ
レートを傾けないことが重要である。0.5％バクト寒天
培地の残りは45℃に保つ。
4.ソフトアガーオーバーレイ:0.5％寒天の部分標本を50
mlプラスチックチューブへ注ぎ、フード中の45℃水浴中
に入れる。細胞を含んでいる試験管を個々に37℃浴から
取り出す。1.4ml寒天を５または10ml使い捨てピペット
で添加し、混合するために上下にピペットし、そして混
合物の大部分（泡立ちを避けて）0.5％寒天ベース上に
オーバーレイする。このステップの間寒天も細胞も冷え
ないことが肝要であり、さもなければ均一な0.33％寒天
混合物は得られないであろう。
5.プレートを動かすことなく（フード内でスライドさせ
ることを除いて）30分間固化させ、37℃５％CO2におい
て７〜14日間インキュベートする。
6.分離したコロニーが出現した時、クローンを無菌パス
ツールピペットですくい上げ（すなわち先端をコロニー
の上に置き、各コロニーのためきれいなピペットを用い
て吸引する）、そして細胞を96ウェルコスタープレート
中の20％FCS/RPMI−1640の150μ中へ入れる。
7.プレートを37℃５％のCO2において７〜14日間インキ
ュベートする。培養物上清が黄変する時、クローンを規
定した方法によってスクリーニングする。
腹水からのモノクロナールIgGの精製 A.実施例IVからの腹水を粒状物を除去するためのガラス
ウールプラグを通して濾過する。
B.（Ａ）からの腹水を0.45ミクロンフィルターを通過さ
せ、等容積の0.02Mトリス、pH8.5で希釈し、そして以下
の精製直前に0.22ミクロンフィルターを通過させる。
C.濾過したサンプルを、24℃で0.02Mトリス、pH8.5中で
平衡化したTSK DEAE−SPW HPLCイオン交換カラム上へ
注入する。流量を1.0ml/分に調節し、1mlまでの分画を
集める。結合したIgGは０％Ｂから30％Ｂまでの直線交
配を用いて溶出する（緩衝液Ａは0.02Mトリス、pH8.5で
あり、緩衝Ｂは1.0M NaClを含有する0.02Mトリス、pH
7.0である）。
分画をファクターVIII:Cバイオアッセイ（上に記載し
た）における分析の前に、各分画の部分標本を適当に希
釈した正常プール血漿と混合することにより、ファクタ
ーVIII:C生物活性の阻害についてアッセイする。
E.抗VIII:C抗体を含有する分画をめいえき吸着剤として
使用するためプールする。
上記のように調整したハイブリドーマは、マサチュー
セッツ州ケンブリッジのジェネチィックス、インスティ
テュートから得た。
ヒトファクターVIII:Cに対するモノクロナール抗体
（mAb）を0.1M重炭酸ナトリウム、0.5M NaCl、pH8.5
（カツプリング溶液）の10容積に対し、２〜８℃で４時
間透析する。透析は一夜くり返す。280nmの吸収で測定
される抗体タンパク濃度をカツプリング溶液で1.1g/
に調節する。
B.免疫アフィニティ樹脂の調整 モノクロナール抗体は、March et al、Anal.Bioche
m、60、149−152（1974）によって記載されたように、
臭化シアン活性化セファロースCL−2Bへ結合する。この
方法は以下のとおりである。あらかじめ膨潤したセファ
ロースCL−2Bを10樹脂容積の脱イオン水で洗い、１樹脂
容積の冷（２〜８℃）脱イオン水中に懸濁する。2.0M炭
酸ナトリウムの２樹脂容積を樹脂へ加え、かきまぜる。
樹脂１当たり、臭化シアン60gをアセトニトリル120ml
中に溶解し、激しくかきまぜながら樹脂へ加える。必要
とする活性化の速度および程度に応じ、10ないし30分間
インキュベートした後、樹脂懸濁液を吸引濾過し、樹脂
容積の５倍のカップリング溶液で洗浄する。樹脂を直ち
にビーカーに移し、透析したモノクロナール抗体溶液へ
加える。樹脂懸濁液を21℃で２時間かきまぜると、樹脂
１当たりモノクロナール抗体約1gが結合する90％以上
の結合効果が得られる。樹脂懸濁液は冷所に一夜貯蔵
し、吸引濾過し、そして樹脂ようせき４倍の冷カップリ
ング溶液で洗う。樹脂を３樹脂容積の0.2Mグリシン、pH
8.0を収容するビーカーへ移し、樹脂上の残っている反
応部位をブロックするため21℃で２時間かきまぜ、吸引
濾過し、２樹脂容積の0.1M酢酸ナトリウム、0.5M NaC
l、pH3.5溶液で５回洗う。抗体−樹脂混合物は最後に２
樹脂容積の10mM酢酸、pH3.5で４回洗い、同じ溶液の１
樹脂容積中に２〜８℃で必要となるまで貯蔵する。抗体
−樹脂混合物はこの酢酸溶液中に長期間貯蔵した時機能
的に活性であることが判明した。
C.ファクターVIII:Cソース原料溶液の調整 新鮮なヒト血漿約3000を抗凝固剤と混合し、−25℃
で貯蔵する。凍結ヒト血漿を、Shanbrom et al、米国特
許第3,631,018号（1971）によって記載されたように、
寒天沈澱（クライオ）と呼ばれる不溶性物質30kgを生成
する条件で解凍する。クライオを可溶性血漿成分から分
離する遠心によって集める。クライオは、それが−70℃
凍結貯蔵されたものであるか、それとも５℃で新鮮なも
のとして受け入れたものかにかかわらず、50μMCaClを
含有する蒸留水の２容積中に20〜30℃で溶解する。クラ
イオ懸濁液は1M酢酸の添加によって徐々にpH6.7±0.2へ
調節する。温度を９℃へ下げ、不溶性物質が形成される
までその温度に保ちそして遠心により可溶性物質から分
離する。冷たい上清（約75）の温度を21℃へ上げ、pH
を1N NaOHをもって7.4±0.2へ調節する。塩化ナトリウ
ム（固体）および塩化カルシウム（5Mストック）を最終
濃度それぞれ0.8M NaClおよび0.05M CaClが得られる
ように冷たい上清溶液へ加える。最後にトリトンＸ−10
0とトリ（ｎ−ブチル）フォスフェート（TNBP）の3.33
対１混合物を1.3％（V/V）の最終濃度になるようにビー
ルス不活性化剤として溶液へ加える。このようにして得
られた溶液を寒天沈澱−洗剤（クライオ−洗剤）溶液と
呼ぶ。
D.免疫アフィニティクロマトグラフィステップ 抗体−樹脂混合物の約2.5を10mM酢酸、pH3.5、21℃
の存在下カラムに充填する。カラムを21℃で３〜４樹脂
容積の蒸溜水で洗い、３〜４樹脂容積の溶液Ｉで平衡化
する。クライオ−洗剤溶液約75をカラムの頂部から底
部へ２〜５／分の流量でカラムへ適用する。カラムを
18樹脂容積の溶液IIで10／分の流量で洗浄する。ファ
クターVIII:Cポリペプチドは約４樹脂容積の溶液IIIを
適用することによって逆の流れ方向でカラムから溶出さ
れる。流速は２〜５／時の範囲である。
E.イオン交換クロマトグラフィーステップ 第４級アミノエチル官能基を含む圧縮したセルロース
ディスクカートリッジ（QAE ZetaPrep250）であるイオ
ン交換マトリックスは、カートリッジを、500mlの0.15M
NaCl、１の1.0M酢酸、１の0.1Mイミダゾール、0.
1/M NaCl、pH8.2、８の0.15M NaCl、そして最後に
２の溶液IIIで洗うことにより、使用のために調整さ
れる。調整後、ファクターVIII:Cを含有するmAb溶出液
を0.4〜1.0／時の流量でQAE ZetaPrep250へ負荷するQ
AE ZetaPrepカートリッジ溶液IV2で洗い、そしてファ
クターVIII:Cを溶液Ｖ約２で溶出する。溶出液を生理
的に許容し得る溶液VIの３容積へ加え、さらにファクタ
ーVIII:Cの最終力価へ調節するため溶液にVIIで希釈す
る。超精製したファクターVIII:C物質を0.2ミクロンフ
ィルターを通して滅菌濾過い、ガラスバイアルに入れ、
熱処理することなく凍結乾燥する。
実施例２ A.ファクターVIII:Cソース原料溶液の調整 実施例に記載したように血漿から得た寒性沈澱約86kg
をヒトファクターVIII:Cリッチ血漿分画として−70℃で
貯蔵し、その重量の水に溶解し、塩化カリウムを50μＭ
の最終濃度に加える。クライオ懸濁液（250）のpHを1
M酢酸でゆっくりと6.7に調節する。ファクターVIII:C溶
液の温度を徐々に9.5℃へ冷し、連続的混合の約20分間
に沈澱を生成させる。主として総タンパクの約50％を占
めるフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンである沈
澱を9.5℃において3000×ｇにおいて15分間遠心するこ
とによって除去する。生成する冷たい上清（225）のp
Hを1N NaOHで7.4で調節し、ファクターVIII:Cの少しの
損失で粒状物を除去するため0.5ないし0.8ミクロン公称
ポアサイズ膜を通して濾過する。濾過した上清へNaClを
0.8Mへ、CaClを0.05Mへ、そしてトリトンＸ−100/トリ
−（ｎ−ブチル）フォスフェート混合物（3.3:1比率）
を1.3％（V/V）へファクターVIII:Cの少しの損失（17.9
単位/ml）をもって加える。これはクライオー洗剤溶液
と命名される。
免疫アフィニティクロマトグラフィーステップ クライオ−洗剤溶液230を、免疫吸着剤（キャパシ
ティは1g mAb/樹脂）５を収容する垂直カラムを通
って8.5／時の流量において頂部から底部へ室温にお
いて適用する。mAb−樹脂を夾雑タンパク、ビールスお
よびビールス不活性化剤を除去するため溶液II40容積に
より20／時の流量で洗浄する。
樹脂結合ファクターVIII:Cは、樹脂から溶液III19.4
により６／時の流量で脱着される。
イオン交換クロマトグラフィーステップ ファクターVIII:C溶出液プール（19.4）をQAE−Zet
aPrep800カートリッジ（LKB、ブロマ、スウェーデン）
上に１〜５／時の流量で中心から外周マトリックスへ
向かって通過させる。QAE−ZetaPrepマトリックスを４
／時の流量において溶液IV8〜10で洗浄する。ファ
クターVIII:Cは、QAEマトリックスから3.2／時の流速
でV3で逆の流れ方向で溶出され、溶液VI9へ加えら
れる。最後に、ファクターVIII:Cバルク溶液の力価を溶
液VII6.5をもって調節し、治療用途に適した高度に精
製したVIII:Cを製造する。
実施例３ この実施例は、ファクターVIII製剤のイオン強度の増
大は、疎水性相互作用によってファクターVIII:Cへ結合
する抗ファクターVIII:Cモノクロナール抗体と結合した
樹脂に対するファクターVIII:Cの吸着率を増加させうこ
とを示す。結果は表１に示してある。
第１の実験においては、寒天沈澱を、0.03Mクエン酸
ナトリウム、0.12M NaCl、0.1Mグリシン、および１単
位/mlヘパリンの溶液中ファクターVIII:C9.5単位/mlを
含むように溶液へ溶解した。それぞれNaCl0.12、0.52お
よび1.0Mの存在下ファクターVIII:Cを含有する寒性沈澱
溶液の1ml部分標本をモノクロナール抗体−樹脂0.1mlお
よび正常マウスIgGと結合した対照樹脂0.1mlへ加えた。
連続的に混合しながら、樹脂スラリーの0.1ml部分標本
を遠心し、時間ｔ＝ｏ、0.5、2.5および５時間において
ファクターVIII:C活性についてアッセイした。
第２の実験においては、ヘモフィルＣ（抗血友病因
子、バクスター社ハイランド部門）を0.02Mクエン酸ナ
トリウム、0.15M NaCl、0.10Mグリシン、50μＭ CaC
l、１％（W/V）ポリエチレングリコール、１％ヒトアル
ブミン、pH7.0を含むように水で復元した。それぞれNaC
lを0.15Mおよび1.0Mを含んでいるファクターVIII:C溶液
の14ml部分標本を1mlのmAb−樹脂および1mlの未結合対
照樹脂へ加えた。連続的に混合しながら、樹脂スラリー
0.3ml部分標本を遠心し、時間ｔ＝o,0.0,0.25,0.5,1.5
および2.0時間においてファクターVIII:C活性について
アッセイした。
第３の実験においては、凍結乾燥したmAb−精製ファ
クターVIII:Cを溶液III中ファクターVIII:C14単位/mlを
含むように水で復元した。mAb−樹脂へのファクターVII
I:Cの吸着率はこの実施例の第２の実験に記載したよう
に測定した。
実施例４ この実施例は、抗体樹脂複合体からの溶出したファク
ターVIII:C物質は、それへ会合したファクターVIII:RP
の大部分を保持しているけれども、高度に精製されてい
ることを示す。
寒性沈澱の1.15kgを50μＭ CaClの存在下その重量の
２倍の水に溶解した。pHを酢酸で6.7へ調節し、そして
9.5℃へ徐々に冷却した。10分間によって形成された沈
澱を4,500×ｇにおいて20分間遠心することによって除
去した。冷たい上清のpHを1M NaOHによって7.4へ調節
し、NaClを0.8Mへ、CaClを0.05Mへ、そして3.3:1割合い
のトリトンＸ−100:トリ−（ｎ−ブチル）フォスフェー
ト混合物を1.3％（V/V）へ加えた。この溶液を以下クラ
イオー洗剤溶液と呼ぶ。
このクライオー洗剤溶液約３を3ml/分の流量でmAb
−樹脂（キャパシティ:1mg mAb/ml樹脂）100mlを通し
て上から下へ室温で適用した。カラムを溶液II1800ml/
分の流量で洗った。ファクターVIII:C物質はmAb樹脂か
らヒトアルブミン不含溶液III450mlにより5ml/分の流量
で溶出された。次に精製したファクターVIII:Cの比活性
を、１段階凝血アッセイと、そして280nmにおける吸収
および染料結合技術から決定した。以下の表２は指示し
た出発物質から回収されたファクターVIII:Cの活性を示
す。
フロントページの続き (72)発明者 シュ・レン・リュー アメリカ合衆国カリフォルニア州 90701、セリトス、リアルアベニュー 17149 (56)参考文献 特開 昭59−184130（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−185723（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−51116（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−19534（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−242593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−60614（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−57310（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−137824（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−12627（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−131918（ＪＰ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．59，Ｎｏ．３ （1982），Ｐ．594−600 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ. 24，Ｎｏ．16（1985），Ｐ．4294−4300

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】脂質で包囲された病原性ビールスで汚染さ
    れた複合水性混合物からファクターVIII:Cを生成する方
    法であって、 （ａ） 前記複合水性混合物をプロセスの任意のステッ
    プにおいて有機脂質溶解または破壊溶媒と洗剤とを含ん
    でいるビールス不活性化剤と混合し、 （ｂ） 前記複合水性混合物を該ファクターVIII:Cに対
    して特異性の活性化モノクローナル抗体を含んでいる免
    疫アフィニティーマトリックスに通し、該ファクターVI
    II:Cに対する疎水性引力によってファクターVIII:Cを免
    疫アフィニティーマトリックスへ吸着させて疎水性結合
    を形成させ、 （ｃ） 前記複合水性混合物から夾雑物の少なくとも一
    部を除去するが前記免疫アフィニティーマトリックスに
    吸着されたファクターVIII:Cは残すように前記免疫アフ
    ィニティーマトリックスを水性緩衝剤で洗浄し、 （ｄ） イオン強度μが0.2未満の緩衝化塩溶液中に含
    まれた非極性剤である脱着物質であって前記ステップ
    （ｂ）で形成された疎水性結合を破壊する脱着物質によ
    って、前記免疫アフィニティーマトリックスから前記フ
    ァクターVIII:Cを溶出させ、それによってファクターVI
    II:C:脱着物質混合物を形成し、 （ｅ） 精製すべき前記ファクターVIII:Cをアフィニテ
    ィー帯域に通し、それにより、浸出されたモノクローナ
    ル抗体、洗剤および残存夾雑物の何れもがアフィニティ
    ー帯域を通過することを許容しつつ、親水性引力でファ
    クターVIII:Cを該アフィニティー帯域へ結合させ、 （ｆ） ファクターVIII:Cを前記アフィニティー帯域に
    吸着させたまま残しつつ、残存夾雑物をファクターVII
    I:C:脱着物質混合物から取り除くよう、水性緩衝剤で前
    記アフィニティー帯域を洗浄し、 （ｇ） アフィニティー帯域とファクターVIII:Cとの間
    の前記親水性結合を壊す溶出液で前記アフィニティー帯
    域からファクターVIII:Cを溶出させて、実質的に夾雑物
    を含まない前記ファクターVIII:Cを溶出させることを含
    み、そしてここに （ｈ） 精製すべきファクターVIII:C:脱着物質混合物
    を更に変化させることなくステップ（ｄ）の免疫アフィ
    ニティーマトリックスからステップ（ｅ）のアフィニテ
    ィー帯域へと通すものである方法。
  2. 【請求項２】前記ステップ（ａ）の有機溶媒がトリ−
    （ｎ−ブチル）フオスフェートであり、前記洗剤がトリ
    トンＸ−100である、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】前記ステップ（ｂ）の前記複合水性混合物
    が0.5ないし1.5モル濃度範囲の塩化ナトリウムまたは0.
    07ないし0.5モル濃度範囲の塩化カルシウムを含む、0.2
    以上のイオン強度μを有するものである、請求項１の方
    法。
  4. 【請求項４】前記ステップ（ｃ）の水性緩衝液がイオン
    強度μが0.2未満の緩衝化塩溶液である、請求項１の方
    法。
  5. 【請求項５】前記ステップ（ｄ）の脱着物質がエチレン
    グリコールまたはプロピレングリコールを含み、そして
    前記緩衝化塩溶液が6.3ないし7.2の範囲のpHを有するも
    のである、請求項１の方法。
  6. 【請求項６】前記ステップ（ｅ）のアフィニティー帯域
    がカートリッジ中のセルロースマトリックス上に沈着し
    たアミノジエチルアミノエチルまたは第４級アミノエチ
    ル官能基を含んでいるものである、請求項１の方法。
  7. 【請求項７】前記ステップ（ｇ）の前記溶出液が0.6な
    いし0.8モル濃度範囲の塩化ナトリウムと0.1ないし１％
    のヒトアルブミンとを含有するイオン強度μが0.2以上
    の緩衝化塩溶液であり、そして5.5ないし6.4のpHを持っ
    ているものである、請求項１の方法。
  8. 【請求項８】ポリペプチドと夾雑物との混合物からファ
    クターVIII:Cを精製する方法であって、 （ａ） 精製すべきファクターVIII:Cに疎水性引力によ
    って結合する抗体を、第１の精製帯域において免疫アフ
    ィニティーマトリックスに固定化して疎水性結合を形成
    させ、これに際して前記抗体が該マトリックスに結合す
    る前又は後に前記抗体に前記混合物を加え、それによっ
    て前記免疫アフィニティーマトリックスにファクターVI
    II:Cを吸着させ、 （ｂ） 前記ファクターVIII:C:免疫アフィニティーマ
    トリックスをイオン強度μが0.2未満の緩衝化塩溶液中
    に含まれた非極性の脱着物質で処理することにより固定
    化抗体からファクターVIII:Cを溶出し、それによってフ
    ァクターVIII:C:脱着物質混合物を形成し、 （ｃ） 精製すべきファクターVIII:Cをイオン交換帯域
    であるアフィニティー帯域たる第２の精製帯域に通し、
    それにより、夾雑物が該アフィニティー帯域を通過する
    ことを許容しつつ、該アフィニティー帯域にファクター
    VIII:Cを結合させ、 （ｄ） 精製されたファクターVIII:Cを前記アフィニテ
    ィー帯域からファクターVIII:Cを分離するのに十分なイ
    オン強度を有する脱着物質によって前記アフィニティー
    帯域から溶出させ、ファクターVIII:C:脱着物質混合物
    を更に変化させることなく前記精製すべきファクターVI
    II:Cをステップ（ｂ）の精製帯域からステップ（ｃ）の
    精製帯域へ通すことを含む、方法。
  9. 【請求項９】ビールス不活性化ステップが、前記ファク
    ターVIII:Cが前記免疫アフィニティーマトリックスに加
    えられる前に採用されるものである、請求項８の方法。
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