JP2648474B2 - エレクトロ化学ルミネセンスアッセイ - Google Patents

エレクトロ化学ルミネセンスアッセイ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本出願に関する刊行物はカッコ内
にアラビア数字で示す。これらの参考文献の引用一覧は
請求の範囲のすぐ前の発明明細書の最後に挙げてある。
これらの刊行物に関する完全な説明を記載するのは、そ
れによって本発明に関連する技術状況をより完全に説明
できるよう本出願に参考文献を引用しているためであ
る。化学的、生化学的、生物学的物質を検出し定量する
ための速やかかつ高度に特異的な方法が常に必要とされ
需要が拡大している。特に少量の医薬品、代謝産物、微
生物やその他の診断上価値のある材料を測定するための
方法は重要である。このような材料の例としては麻薬及
び毒薬、治療上の目的で投与される薬物、ホルモン、病
原性をもつ微生物及びウイルス、抗体、代謝産物、酵素
や核酸等が挙げられる。
【０００２】
【従来の技術】このような材料の存在は高度な特異性を
もつ結合法を用いて検出されることが多く、これによっ
て多くの生化学及び生物学的系の特徴が明らかになって
いる。頻繁に使用されている方法の例としては、抗原−
抗体系、核酸ハイブリッド形成法、たん白質−リガンド
系等がある。このような方法においては通常複雑な材料
の１つあるいはそれ以上に目印としてつけた検出可能な
「標識」の有無によって診断上有用な複合体の存在が明
らかになっている。選択した特異的標識方法によって当
該材料の検出のための特別な系の有用性及び融通性が決
まることが多い。好ましい標識物の条件としては安価で
あり安全であって、多岐にわたる化学的、生化学的、生
物学的材料の重要な結合特性を変化させることなしに効
率よくそれらの材料に標識できることが必要である。標
識物は高度に特徴的な目印をもっていなければならず、
さらに天然にはほとんど、あるいはより好ましくは全く
存在していないことが必要である。標識物は安定であり
何か月にもわたる期間を経て水溶液系中で検出可能であ
ることが要求される。検出の際には高価な特別の設備や
技術者を必要とせず、速やかに、かつ高い感度、及び再
現性をもって標識物が検出されなければならない。標識
物の定量に当たっては、温度や供試混合物の組成といっ
た変化要素に比較的影響されにくいことが必要である。
均一系、すなわち標識材料の複合体及び非複合体を分離
する必要のない系において使用できる標識物が最も有用
である。標識された材料が特定の複合体中に取り込まれ
た時に標識物の検出度を調節するようにすればこれが可
能である。
【０００３】非常に多くの種類の標識物が開発されてお
り、それぞれ長所、短所をもっている。例えば放射性標
識物はきわめて多用途に使用でき、非常に低い濃度にお
いても検出可能である。しかし高価で危険性もあり、そ
の使用のためには精巧な装置と訓練を受けた技術者とが
必要である。さらに放射性標識物の感度は、標識された
材料において検出し得る事象というのがその本質上放射
性原子当たり１回しか起こらないという事実によって限
定されてしまう。また放射性標識物は均質法においては
使用できない。
【０００４】このため非放射性の標識物に高い関心が集
まっている。例えば分光測光、スピン共鳴、ルミネセン
ス法によって検出可能な分子や、そのような分子を産生
し得る酵素等がそれに含まれる。有用な非放射性標識材
料の中に有機金属化合物がある。ある種の金属は生物学
的系においてまれにしか存在しないため、有機金属化合
物中の金属成分を特異的に試験する方法が有効となる。
例えばＣａｉｓ、アメリカ特許番号４，２０５，９５２
（１９８０年）は、特異的抗原を定量するのにある種の
有機金属化合物によって標識された免疫化学的活性材料
を使用している。このような標識物に対しては選択した
金属を検出するのに発光、吸収、蛍光分光法、原子吸
光、中性子活性化等を含む一般的手法がどれでも使用で
きる。これらの方法は感度が低いという欠点をもつこと
が多く、均質系にはほとんど適用できない。また原子吸
光に関しては時として試料の破壊を伴う。光化学的、化
学的、電気化学的手段を通じて発光するように作られた
標識物は特に興味深い。「光化学ルミネセンス」とは材
料が電磁放射線を吸収した時に発光するように作られた
過程である。蛍光及びりん光は光化学ルミネセンスの一
種である。「化学ルミネセンス」過程にはエネルギーの
化学的変換による発光物の産生が伴っている。「エレク
トロ化学ルミネセンス」には電気化学的に産生される発
光物が伴う。
【０００５】このような発光系の重要性は増加してい
る。例えばＮａｎｄｌｅ、アメリカ特許番号４，３７
２，７４５（１９８３年）は免疫化学的応用分野におい
て化学ルミネセンス標識物を使用している。この系では
標識物がＨ2 Ｏ2 とシュウ酸塩と反応することによる化
学的手段によって標識物を発光状態に励起させている。
この系ではＨ2 Ｏ2 がシュウ酸塩を酸化して高エネルギ
ー誘導体に転換しその結果標識物を励起させるのであ
る。この系は原理的には、試験における酸化条件下で安
定であり高エネルギーシュウ酸塩誘導体によって励起さ
れ得る発光物質であればどんな材料でも使用できる。残
念なことにこのようにきわめて融通性の高いことが技術
の限界の主な要因となってしまう。当該分析物を含む生
物学的溶液は一般に発光の可能性をもつ物質も大量に含
んでおり、ルミネセンスのバックグラウンド値を高くす
る原因となる。
【０００６】化学ルミネセンスの免疫化学的利用法でや
はり同様の欠点をもつもう１つの例は、Ｏｂｅｒｈａｒ
ｄｔら、アメリカ特許番号４，２８０，８１５（１９８
１年）によるもので、化学ルミネセンスによって標識さ
れた免疫反応物質と非常によく類似しているｉｎ ｓｉ
ｔｕにおける酸化剤（例えばＨ2 Ｏ2 ）の電気化学的産
生に関して述べている。電気的に産生されたオキシダン
トが化学ルミネセンス物質中に拡散しそれを化学的に酸
化することによって１つ以上の電子を電気的に産生され
たオキシダントに転移させる。化学ルミネセンス物質は
酸化される際に光子を放つ。これに対し本発明の対象物
では、電気化学的エネルギー源から化学ルミネセンス物
質への直接の電子転移が必要であり、このため光子の連
続放出が可能となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明はエレクトロ化
学ルミネセンス標識物に関するものである。適切な標識
物としては有機化合物及び有機金属化合物を含むエレク
トロ化学ルミネセンス化合物から成るものを用いる。多
くの理由から、標識された材料の存在を検出する方法と
しては他の方法よりもエレクトロ化学ルミネセンス法の
方が適している。特定の標識物の存在を高度に判定で
き、感度が高く、危険性が少なく、安価であり、さらに
応用範囲も広い。電気化学的標識物として適切な有機化
合物には例えばルブレンや９，１０−ジフェニルアント
ラセン等がある。有機金属化合物の多くが電気化学的標
識物として適しているが、特にルテニウム及びオスミウ
ム含有化合物は有用である。
【０００８】このため１つの具体例として本発明では多
岐にわたる方法を用いて検出可能なルテニウム及びオス
ミウム含有標識物の使用について述べている。これらの
標識物は以下の文中で論ずるように数多くの点で有益な
ものである。ルテニウム及びオスミウム含有有機金属化
合物については文献中でも論じられている。Ｃａｉｓは
ルテニウムのような第８群の貴金属を含む金属元素ある
いはそのような金属元素の組み合わせであればどれでも
原子吸光法によって検出可能な有機金属標識物の成分と
して適切であると述べている（Ｃａｉｓ、１１列２０
行）。しかしＣａｉｓの文献においてはルテニウムは適
切な金属とされておらずオスミウムに関しては特に言及
されておらず、記載されたどの方法にもルテニウムまた
はオスミウムを使用した場合の有効性に関するデータは
含まれていないし、適切な方法とされている原子吸光法
には試料の破壊が伴っている。
【０００９】Ｗｅｂｅｒ、アメリカ特許番号４，２９
３，３１０（１９８１年）はイムノアッセイにおける分
析物の電気化学的標識物としてルテニウム及びオスミウ
ム含有複合体を使用することに関する報告をしている。
この複合体は分析物のチオ尿素結合を通じてアミノ基に
結合している。Ｗｅｂｅｒはまた他の分析物の水酸基と
標識物との間にカルボキシルエステルを形成し得る可能
性もあると述べている。Ｗｅｂｅｒによると標識された
材料の存在は、消光物質と光学手段を用いた電気化学的
フローセルから成る器具、方法で検出できるとのことで
ある。光電気化学的に活性な標識物が励起すると、電子
を消光物質分子に転移させる。酸化された分子は続いて
適当な電位に保ったフローセルの電極からの電子によっ
て還元される。この電子を光電子流として測定するので
ある。系中の遊離標識分析物は光電子流信号によって測
定する。この方法は発光材料のエレクトロ化学ルミネセ
ンス検出の逆であることに留意すべきである。
【００１０】Ｗｅｂｅｒらはその後の報告で、ルテニウ
ム含有標識物を検出するためにこの方法を用いる際の問
題点について論じている（１）。Ｗｅｂｅｒら（１）の
表２によると、トリス（ビピリジル）ルテニウム（Ｉ
Ｉ）の外挿検出限界は最適条件下で１．１×１０-10 モ
ル／ｌとなっている。これらの標識物を実際に使用する
際には複合体混合物の存在下で測定することになるであ
ろうと予想し、Ｗｅｂｅｒらはその系において考えられ
る妨害物について調査した。Ｗｅｂｅｒらの表３ではジ
メチルアルキルアミン類、ＥＤＴＡ、Ｎ−メチルモルホ
リン、Ｎ，Ｎ′−ジメチルピペラジン、水酸化物、シュ
ウ酸塩、アスコルビン酸塩、尿酸、血清等が、実際の検
出限界を１．１×１０-10 モル／ｌ以上に引き上げると
考えられる妨害物として挙げられている。これらの研究
は単純なルテニウム含有化合物を用いて行なわれてい
る。ルテニウム含有標識物によって標識した複合体の検
出限界に関して、またこの試験条件下において標識され
た材料と標識物との間のチオ尿素結合が安定であるかど
うかに関しての記述はＷｅｂｅｒ、あるいはＷｅｂｅｒ
らの報告中にはされていなかった。
【００１１】本発明における標識物はエレクトロ化学ル
ミネセンスに関するものである。この標識物は電磁放射
線や、シュウ酸塩−Ｈ2 Ｏ2 のような代表的系により産
生される化学エネルギー源に接触することで酸化あるい
は還元されなくても、発光状態にまで励起し得ることが
多い。さらに酸化、還元を伴う電気化学的方法によって
もこれらの化合物の発光を起こすことができる。光化学
ルミネセンス、化学ルミネセンス、エレクトロ化学ルミ
ネセンスの手段を用いてルテニウム（２，２−ビピリジ
ン）3 ２+ を検出する方法に関しての詳細な研究が報告
されている（２，３）。この研究ではシュウ酸イオンま
たは他の有機酸の酸化の中間体として産生された強い還
元剤と共に化学的あるいは電気的に生成されるルテニウ
ム（ｂｐｙ）3 3+ （「ｂｐｙ」はビピリジルリガンドの
こと）の水性反応によって明るいオレンジ色の化学ルミ
ネセンスが得られると述べている。また過酸化二硫酸の
還元に伴い産生された強い還元剤と共に電気的あるいは
化学的に生成されるルテニウム（ｂｐｙ）3 1+ の反応に
よって、有機溶剤−水溶液中でルミネセンスを得ること
も可能である。ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ からエレクト
ロ化学ルミネセンスを得るための３番目の機構として
は、電極の電位をルテニウム（ｂｐｙ）3 1+ を産生する
のに十分なマイナス電位とルテニウム（ｂｐｙ）3 3+ を
産生するのに十分なプラス電位との間で振動させるとい
う方法がある。以上の３種類の方法はそれぞれ「酸化還
元」、「還元酸化」、「ルテニウム（ｂｐｙ）3 3+/+ 再
生系」と呼ばれている。
【００１２】酸化還元法は水中で行うことができ、強
く、有効で、安定なルミネセンスが得られ、酸素や不純
物の存在に対しては比較的感受性が低い。このルテニウ
ム（ｂｐｙ）3 2+ からのルミネセンスは、シュウ酸塩や
その他ピルビン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、
クエン酸塩等の有機酸、そしてルテニウム（ｂｐｙ）3 3
+ を酸化的に生成し得る手段が存在する場合に得られ
る。この酸化はＰｂｏ2 やセリウム（ＩＶ）塩のような
強い酸化剤によって化学的に起こすことができる。また
連続的あるいは間欠的に十分にプラスである電位をかけ
ることによって電気化学的に起こすこともできる。ルテ
ニウム（ｂｐｙ）3 2+ を電気化学的に酸化させるのに適
当な電極としては、例えばプラチナ、熱分解性グラファ
イト、ガラスカーボン等がある。シュウ酸塩やその他の
有機酸は化学ルミネセンスを出す過程で消費されてゆく
が、このように消費されてしまう材料を過剰に添加して
おくか、反応チャンバー中に連続的に供給するかによっ
て強く一定した化学ルミネセンスを何時間にもわたって
得ることができる。
【００１３】還元酸化法は例えばアセトニトリルのよう
な有機共溶剤を含む部分水性溶液中で行うことができ
る。このルミネセンスは、過酸化二硫酸と、ルテニウム
（ｂｐｙ）3 1+ を還元的に生成し得る手段とが存在する
場合に得られる。この還元は例えばマグネシウムや他の
金属のような強い還元剤によって化学的に起こすことが
できる。また連続的あるいは間欠的に十分にマイナスで
ある電位をかけることによって電気化学的に起こすこと
もできる。ルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ を電気化学的に還
元させるのに適当な電極としては、例えば光沢ガラスカ
ーボンがある。酸化還元法の場合と同様、試薬を過剰に
添加しておくか、反応液中に消費された試薬を連続的に
供給するかによって連続的な強いルミネセンスを何時間
にもわたって得ることができる。
【００１４】ルテニウム（ｂｐｙ）3 3+/+ 再生系はアセ
トニトリルのような有機溶剤中、または部分水性溶液中
で、電極の電位をルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ を還元する
のに十分なマイナス電位とルテニウム（ｂｐｙ）3 2+ を
酸化するのに十分なプラス電位の間で振動させることに
よって行うことができる。このような再生系に適当な電
極としては、例えばプラチナ電極がある。この系では化
学試薬が消費されず、原理的には無限に続行することが
可能である。以上の３種類のルテニウム含有化合物のル
ミネセンスを産生させる方法では、ルテニウム含有化合
物の反復酸化還元あるいは還元酸化というのが共通点で
ある。このためこれらの化合物を含む溶液のルミネセン
スは、与えられたエネルギー源の電気的ポテンシャルに
強く依存しており、そのためにルテニウム含有化合物の
存在を高感度で検出できることになる。
【００１５】ＭａｎｄｌｅはＣｕｒｔｉｓらの報告
（４）を、化学ルミネセンスの応用として使用可能な標
識物として引用している。Ｃｕｒｔｉｓらは未発表デー
タとしてではあるがルテニウム複合体はシュウ酸塩／Ｈ
2 Ｏ2 系によって化学的に励起されると発光するように
なると報告している（Ｃｕｒｔｉｓらｐ．３５０）Ｍａ
ｎｄｌｅもＣｕｒｔｉｓもルテニウム及びオスミウム複
合体が化学ルミネセンスの応用分野として有用であるこ
とは、エレクトロ化学ルミネセンス系で有用であること
は認識していない。Ｓｐｒｉｎｔｓｃｈｎｉｋ，Ｇら
（５）はオクタデカノールまたはデヒドロコレステロー
ルを用いてエステル化したトリス（２，２′−ビピリジ
ン）ルテニウム（ＩＩ）について報告し、これらの界面
活性剤複合体の単層フィルムを産生した。この複合体は
光学ルミネセンスを発する。しかしフィルムを水につけ
その後光に当てると、ルテニウム複合体は光学ルミネセ
ンスを発しなくなる。これは光の存在下でエステル基の
光学的加水分解が起きるためである。アミド結合または
アミン結合を通して多岐にわたる分析当該物及び分析当
該物に結合する化学種に対しルテニウム含有あるいはオ
スミウム含有標識物を容易に標識し得る方法を開発した
ので以下に報告する。このようにして標識された材料は
非常に多くの手段を用いて分析できるが、その中でも最
も効率的で信頼性があり感度も高い方法は光学ルミネセ
ンス、化学ルミネセンス、エレクトロ化学ルミネセンス
を用いる方法である。またルテニウム含有及びオスミウ
ム含有標識物のようなエレクトロ化学ルミネセンス標識
物、ルブレン及び９，１０−ジフェニルアントラセンの
ような有機分子が特に多用途に使用でき有効であること
についても以下に述べる。このような新規標識材料を使
用すること、そしてそれらを検出する方法についての大
きな利点に関しても以下でさらに詳しく論じる。
【００１６】食品会社は長年にわたり生の食品成分及び
加工食品中の生物学的、化学的汚染物質の存在について
関心をもってきている。技術進歩によって食品中の汚染
物質混入及びその結果起こる食品起因の病気の発生は減
少しつつあるが、その一方食品汚染物質の検出及び同定
のための迅速で感度の高い方法の開発における進歩はほ
とんど見られていない。食品中の有害な汚染物質を検出
するための既存の標準的方法は一般に非常に時間がかか
り、労力も必要で、技術的にも困難である。分析方法自
体は適度の感受性をもつものが大部分であっても、検出
を行う前の試料調製過程が長くかかるために当該汚染物
質の回収率が低くなってしまうことも多く、陰性である
との誤判断が下されることもしばしばある。このような
問題点の例となるのは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシンが食品中
に存在するかどうかを検出するのに現在用いられている
標準的方法の２例である。食品中のＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａを検出する際には、これらの細菌が食品中に存在する
としても通常少数しか生息しておらず致死寸前の損傷を
受けていることも多いため、いくつかの濃縮段階が含ま
れている。このためＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出方法は
感度が高く、損傷を受けた細胞を蘇生させ増殖させるよ
うなものでなくてはならない。
【００１７】現在Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの検出方法とし
てはアメリカ食品医薬品局によって２種類が推奨されて
いる。これらの方法はＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｆｏ
ｏｄｓ（１９８４年）第６版、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈ
ｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．に記載さ
れている。このうち一法は前濃縮、選択的濃縮、選択的
プレーティングを含む純粋培養技法であり、推定結果を
得るのに４日間、完全な結果を得るのに５〜７日間を要
する。もう一法は選択的濃縮の後、免疫蛍光検査法を用
いるものである。この方法はより迅速であるが、試験に
使用する多価の抗血清が交差反応性をもつという問題点
があるため、陽性であるとの誤判断が下されることが高
率で起こり得る（６，７）。食品中のＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンを検出する方法としてア
メリカ食品医薬品局が推奨している方法もＢａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａ
ｌ ｆｏｒ Ｆｏｏｄｓ（１９８４年）第６版、Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌ
ｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，ＤＣ．に記載されている。この方法では大量の食品
試料、例えば約１００ｇのものの抽出物を透析濃縮の数
段階を経て約０．２ｍｌ程度の少量に濃縮し、マイクロ
スライド二重免疫拡散法の試料として調製するために試
料抽出物をイオン交換カラムによって精製する。この方
法を行うためには通常一週間以上を要する。
【００１８】食品中の細菌、毒素、抗生物質、農薬のよ
うな各種の汚染物質を検出するより迅速な試験方法が最
近開発されている。しかし多くの場合試験を実施する前
の試料調製に依然として労力と時間を要する。ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素標識イムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって分析方法自体の実施時
間は短縮されたが、それでもこのような方法はやはり労
力を要するもので、簡単に実施できるとは言い難い。さ
らにこれらの方法は通常特異性も感受性も様々な多価の
抗血清を使用することに基づいており、当該食品汚染物
質の試験のためには量的に不足していることが多い。Ｅ
ＬＩＳＡ法は多価の抗血清ではなくモノクローナル抗体
を用いて食品試料を分析するために開発された方法であ
る。食品汚染物質の試験系にモノクローナル抗体を使用
することによって試薬の一定した供給が得られるように
なり、試験自体の不変の特異性、感度が保証される。Ｅ
ＬＩＳＡ系ではＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（８）やＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシン（９）のよう
な食品汚染物質を試験するのにモノクローナル抗体が用
いられている。ＥＩＡ法（Ｂｉｏ−Ｅｎｚａｂｅａｄ
Ｓｃｒｅｅｎ Ｋｉｔ，Ｌｉｔｔｏｎ Ｂｉｏｎｅｔｉ
ｃｓ）及びＤＮＡプローブ技法（Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｋ，
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いる市
販のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ検出用製品は、時間がかかる
し労力も要する。逆受身ラテックス凝集反応（ＳＥＴ−
ＲＰＬＡ，Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．）及びＥ
ＩＡ法（ＳＥＴ−ＥＩＡ，Ｄｒ．Ｗ．Ｂｏｍｍｅｌｉ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いる市販の食品中Ｓｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシン検出用製品
も同様の欠点をもっている。水質及び汚水汚染の発生を
管理するための指標として過去１００年の間細菌Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及び大腸菌型群が広く使用
されてきた。
【００１９】現在Ｅ．ｃｏｌｉ及び／または大腸菌型群
の検出に使用されている方法は、乳糖の発酵による酸ま
たは気体産生の特性に基づいている。最も広く使われて
いる方法は、最大可能菌数（ＭＰＮ）試験と膜ろ過（Ｍ
Ｆ）試験である。両方法共上水及び下水の微生物学的検
査法として環境保護庁（ＥＰＡ）及びアメリカ公衆衛生
協会（ＡＰＨＡ）により承認されており（１０）、牛乳
及び食品の微生物学的検査法として食品医薬品局（ＦＤ
Ａ）によっても承認されている。（１１）。ＭＰＮ法は
実際には３種の（１２）別個の試験から成っている（１
０）。推定試験においてはラウリル硫酸トリプトース
（ＬＳＴ）ブロスや乳糖ブロスのような非選択的培地を
用いて、乳糖発酵による気体産生を調べる。次に気体発
生陽性であった試験管についてより選択的な培地中で継
代培養を行う。大腸菌型群の培養にはブリリアントグリ
ーン乳糖胆汁酸（ＢＧＬＢ）ブロスを、糞便大腸菌型群
の培養にはＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）ブロスを使用し、気体
産生について再び調査する（確認試験）。確認試験で陽
性を呈した試料はさらにエオシンメチレンブルー（ＥＭ
Ｂ）寒天培地や遠藤寒天培地のような選択的鑑別培地上
にプレーティングし、指標細菌の存在を明確に証明する
ためにグラム染色やその他の生化学的試験を行う（完全
試験）。ＭＰＮ試験を完全に終結するには最大５日間
（５）必要なので、ほとんどの研究所では日常的水分析
としてはＭＰＮ試験のうちの推定試験と確認試験のみを
採用しているが、それでも終了までに４８〜７２時間を
要する。ＭＰＮ試験は時間がかかり材料の面からも費用
がかかるばかりでなく、陽性及び陰性であるとの誤判断
が発生することが多い（１５，１６，２０）。
【００２０】水の微生物学的検査法としてＭＦ法が導入
されたのは１９５０年代の初期である（１２）。冗長で
時間のかかるＭＰＮ試験とは異なり、ＭＦ分析は２４時
間で完結しさらに確認する必要もない。ＭＦ法の基本手
順は次の通りである。水試料の一定量、通常１００ｍｌ
を０．４５μｍ孔径のろ紙を通じてろ過し、選択的培地
で満たした滅菌パッド上で培養する。最もよく使用され
る培地は３５℃で大腸菌型に選択的なｍ遠藤ブロスと４
４．５℃で糞便大腸菌型に選択的なｍＦＣブロスの２種
類である（１０）。これらの培地が使用されるようにな
って以来、多くの著者らがｍ遠藤及びｍＦＣブロスは共
に実際に存在する指標細菌数よりも少なく算定する傾向
にあると報告してきた。これは培地の選択性、あるいは
培養に使用した高温度（４４．５℃）のどちらかによる
ものであろう（２１，２２）。試料中の菌体が環境因子
及び／または化学物質によって致死寸前の損傷を受けて
いる場合には、このような陰性誤判断が特に起こりやす
い（１７，１８）。最近ＥＰＡによってＭＦ試験を確認
的手順を用いて補うための改良法が提案されており、そ
れによるとＭＰＮ試験におけるＢＧＬＢブロスと同様Ｌ
ＳＴブロスを用いて気体産生を調べるのに各ろ紙上に最
低１０個のコロニーがなければならない（１４）。この
改良法を用いれば陰性及び陽性の両誤判断は減るであろ
うけれども、材料費が高くなりＭＦ試験に要する時間は
２４時間から７２時間へと３倍になる。
【００２１】１９８２年にＦｅｎｇとＨａｒｔｍａｎは
４−メチルウンベリフェロングルクロニド（ＭＵＧ）を
基質として使用したＥ．ｃｏｌｉ検出のための蛍光発生
試験を導入した（１３）。Ｅ．ｃｏｌｉの細胞がβ−グ
ルクロニダーゼという酵素を産生し、それによって基質
を切断して蛍光を発する４−メチルウンベリフェロンラ
ジカルを放出するのである（１９）。ＭＵＧ化合物を推
定試験のＬＳＴ培地に加えることによって、ＬＳＴ−Ｍ
ＵＧ培地の試験管１本で糞便大腸菌型に関する推定デー
タ（気体産生）及び確認データ（蛍光）の両方が２４時
間以内に得られるようになった。ＭＵＧ試験は迅速で簡
単であるが、Ｅ．ｃｏｌｉの８５〜９５％しかこの酵素
を産生しないため（出所による）、試験は１００％信頼
性をもつわけではない。またこの系は大腸菌型群には適
用できない。現在１つの試料中の大腸菌型及び糞便大腸
菌型を検出し計数するのに適切な試験はない。簡単で迅
速、信頼性のある検出試験が開発されれば、経費及び時
間の節約になるばかりでなく、水道設備や食品加工、取
扱いの管理がずっと効率よく行われることになろう。
【００２２】
【課題を解決するための手段】本発明は予め測定された
量の多成分液体試料において、その試料中に約１０-3モ
ル以下の濃度で存在する目的分析物を検出するための方
法に関するもので、以下の部分から構成されている。
ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得るよ
うな適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け
た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び
（ｉｉ）目的分析物と結合することができる、ような試
薬と接触させる。ただし分析物と試薬が結合するのに最
適な条件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試料
に、試薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な源
からの電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし試
薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下
で与える。ｃ）このようにして放出された電磁放射線を
検出し、それによって試料中の分析物の存在も検出す
る。
【００２３】また本発明は予め測定された量の多成分液
体試料において、その試料中に約１０-3モル以下の濃度
で存在する目的分析物を検出するための競合的方法に関
するものでもあり、以下の部分から構成されている。
ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得るよ
うな適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け
た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び
（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的材料の結合部
位について目的分析物、及び相補的材料と競合し得る、
ような試薬と接触させる。ただし目的分析物と試薬が相
補的材料と競合的に結合するのに最適な条件下で接触さ
せる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬がくり返し
放射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エ
ネルギー一定量を与える。ただし試薬がくり返し電磁放
射線を放出し得るような最適条件下で与える。ｃ）この
ようにして放出された電磁放射線を検出し、それによっ
て試料中の分析物の存在も検出する。また予め測定され
た量の多成分液体試料において、その試料中に存在する
目的分析物の量を定量的に測定するための方法に関する
ものも含み、以下の部分から構成されている。ａ）試料
を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得るよ
うな適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を受け
た時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、及び
（ｉｉ）目的分析物と結合することができる、ような試
薬と接触させる。ただし分析物と試薬が結合するのに最
適な条件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試料
に、試薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な源
からの電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし試
薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下
で与える。ｃ）このようにして放出された放射線の量を
定量的に測定し、それによって試料中に存在する目的分
析物の量も定量的に測定する。
【００２４】本発明はさらに予め測定された量の多成分
液体試料において、その試料中に存在する目的分析物の
量を定量的に測定するための競合的方法に関するものも
含む。この方法は以下の部分から構成されている。ａ）
試料を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出し得
るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量を
受けた時に電磁放射線をくり返し放出するようになる、
及び（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的材料の結
合部位について目的分析物、及び既知量の相補的材料と
競合し得る、ような試薬と接触させる。ただし目的分析
物と試薬が相補的材料と競合的に結合するのに最適な条
件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試料に、試
薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な源からの
電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし試薬がく
り返し電磁放射線を放出し得るような最適条件下で与え
る。ｃ）このようにして放出された放射線の量を定量的
に測定し、それによって試料中に存在する目的分析物の
量も定量的に測定する。
【００２５】また液体食品、食品ホモジネート中に多数
存在する目的分析物を検出し同定するための方法に関す
るものも含む。この方法は以下の部分から構成されてい
る。ａ）液体または固体懸濁液に浸すのに適切で多数の
試薬に対して固定された診断試薬ホルダーを液体食品あ
るいは食品ホモジネート中に浸す。ただし各試薬は診断
試薬ホルダーの明確に区別できる位置に固定し、固定さ
れた試薬−目的分析物複合体が形成されるよう目的分析
物１種類ずつと複合体を形成し得るようにする。ｂ）液
体食品あるいは食品ホモジネート中から診断試薬ホルダ
ーを取り除く。ｃ）適当な洗浄溶液を用いて診断試薬ホ
ルダーを洗浄する。ｄ）固定された試薬−目的分析物複
合体を含む判断試薬ホルダーを、固定された試薬−目的
分析物複合体と複合体を形成することができ、固定され
た試薬−目的分析物検出試薬複合体を形成し得るような
最低１種類の検出試薬を含む検出溶液中に浸す。ｅ）試
薬が、固定された試薬−目的分析物−検出試薬複合体と
して固定されている診断試薬ホルダーの同定可能な部分
を検出し、それによって液体食品あるいは食品ホモジネ
ート中に多数存在する目的分析物を検出し同定する。
【００２６】本発明はまた試料中に多数存在するエンテ
ロトキシン類を検出し同定するのに有用なキットも含
む。このキットは以下の部分から構成されている。ａ）
液体または固体懸濁液に浸すのに適切なように表面部分
に連結された取っ手のついた診断試薬ホルダー；ただし
上記の表面部分には最低１枚のニトロセルロース膜がつ
いており、このニトロセルロース膜上には区別し得る位
置に別々に明確に固定された各種モノクローナル抗体が
つけてあり、固定されたモノクローナル抗体はそれぞれ
１種類のエンテロトキシンの抗原決定基に対し特異的な
ものとなっている；ｂ）界面活性剤入り水性緩衝溶液か
ら成る第一洗浄溶液；ｃ）最低一種類のモノクローナル
抗体酵素結合から成る検出部；モノクローナル抗体は各
エンテロトキシンに対する異なる抗原決定基に特異的な
もので、診断試薬ホルダーにつけられたニトロセルロー
ス膜上に固定されている；ｄ）バッファー水溶液からな
る第２洗浄液；ｅ）検出溶液中のモノクローナル抗体に
結合された酵素と反応し得る酵素基質；及びｆ）無色染
液。
【００２７】本発明には１つの試料中の細菌最低１種の
存在を検出するための方法も含まれる。この方法は以下
の部分から構成されている。ａ）試料を開放式で細菌種
の増殖に適する培地を含む容器中に接種する。ｂ）キャ
ップを容器の端に連結する。このキャップの面は容器に
連結した時に容器の内部と接触するようになっており表
面が最低１つの細菌成分を固定するのに適切な構造とな
っている。ｃ）培地中に接種された細菌が増殖し得るよ
うな条件下で、接種された培地を培養する。ｄ）容器の
上下を適当な時間の間反転させ、培地中に存在する細菌
成分が容器の内部に面したキャップの表面上に固定され
るようにする。ｅ）容器の上下を反転させ正しい方向に
戻す。ｆ）容器からキャップを取りはずす。ｇ）細菌成
分が固定されているキャップの表面を、固定された細菌
成分−試薬複合体が形成されるのに適切な条件下で、固
定された細菌成分と複合体を形成し得る試薬に接触させ
る。ｈ）固定された細菌成分−試薬複合体を検出し、そ
れによって試料中の細菌種の存在をも検出する。
【００２８】さらに本発明には試料中の大腸菌型細菌の
存在を検出するための方法も含まれる。この方法は以下
の部分から構成されている。ａ）試料を開放式で非選択
的乳糖培地及び倒立Ｄｕｒｈａｍを入れた容器中に接種
する。ｂ）ポリスチレン挿入物をつけたキャップを各容
器の開放側の端に連結する。ｃ）接種された培地を３７
℃で最低２時間培養する。ｄ）各容器中に倒立させたＤ
ｕｒｈａｍバイアル内に採取されている細菌発酵により
産生された気体があるかどうか検出する。ｅ）倒立させ
たＤｕｒｈａｍバイアル内に気体が採取されている容器
の上下を適当な時間の間反転させ、培地中に存在する大
腸菌型細菌が大腸菌型−ポリスチレン複合体を形成し得
るようにする。ｆ）容器の上下を反転させ正しい方向に
戻す。ｇ）容器からキャップを取りはずす。ｈ）取りは
ずしたキャップのポリスチレン挿入物を、未結合部位を
ふさぐのに適切な物質を用いて処理する。ｉ）未結合部
位をふさぐのに適切な物質を用いて処理されたキャップ
のポリスチレン挿入物を、抗体−大腸菌型−ポリスチレ
ン複合体が形成し得るような条件下で大腸菌型細菌に結
合でき検出可能となる標識物によって標識した抗大腸菌
型細菌抗体最低１種類を用いて処理する。ｊ）ポリスチ
レン挿入物上の抗体−大腸菌型−ポリスチレン複合体の
存在を検出し、それによって試料中の大腸菌型細菌の存
在をも検出する。
【００２９】図の説明要約 第１図は溶液中の一種の抗原の濃度を測定するための均
質系イムノアッセイ用に用いられるエレクトロ化学ルミ
ネセンス測定法について表わしたものである。第２図は
均質系ＥＣＬテオフィリン試験の結果をグラフに表わし
たものである。第３図は各種血清における均質系テオフ
ィリン試験の結果をグラフに表わしたものである。 ●＝正常血清 ■＝溶血血清 ◆＝脂肪血症血清 □＝黄疸血清 第４図はＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テオ
フィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたものであ
る。 Ａ．正常血清：ｎ＝４；傾き＝０．９８６；ｒ＝１．００ Ｂ．溶血血清：ｎ＝３；傾き＝０．８７８；ｒ＝１．００ Ｃ．脂肪血症血清：ｎ＝５；傾き＝０．８７２；ｒ＝０．９９ Ｄ．黄疸血清：ｎ＝４；傾き＝２．１４；ｒ＝１．００ 第５図はＥＣＬテオフィリン試験の結果を高速液体クロ
マトグラフィ−試験の結果と比較しグラフに表わしたも
のである。
【００３０】ｎ＝９；傾き＝１．１９７；ｒ＝０．９８ 第６図はＥＣＬジゴキシンイムノアッセイにおいて産生
されたＥＣＬ信号の調整をグラフに表わしたものであ
る。第７図はＥＣＬジゴキシンイムノアッセイの結果を
グラフに表わしたものである。 ■：対照 ●：ジゴキシン 第８図はＭＢＩ３８−化合物Ｉの各濃度において産生さ
れたＥＣＬ信号をグラフに表わしたものである。第９図
はＭＢＩ３８−化合物Ｉのハイブリッド形成／感受性試
験の結果を示したものである。 ＴＡＧ＝化合物Ｉ 第１０図はＭＢＩ３８−化合物Ｉの特異性試験の結果を
示したものである。
【００３１】本発明の詳細 本発明は予め測定された量の多成分液体試料において、
その試料中に約１０-3モル以下の濃度で存在する目的分
析物を検出するための方法に関するもので、以下の部分
から構成されている。ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し
放射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エ
ネルギー一定量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出
するようになる、及び（ｉｉ）目的分析物と結合するこ
とができる、ような試薬と接触させる。ただし分析物と
試薬が結合するのに最適な条件下で接触させる。ｂ）こ
のようにして得た試料に、試薬がくり返し放射線を放出
し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定
量を与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線を放出し
得るような最適条件下で与える。ｃ）このようにして放
出された電磁放射線を検出し、それによって試料中の目
的分析物の存在をも検出する。本出願において「モル」
とは、溶液中に１リットル当たり存在する分析物の濃度
をモルで表わしたもの、あるいは液体試料中に１リット
ル当たり存在する粒子またはユニットで粒子状物質の量
を表わしたものを意味する。例えば１リットル中１×１
０23個の粒子のことを１モルと表わす。
【００３２】本発明における方法は、不均一試験すなわ
ち結合した標識試薬に電気化学的エネルギーを与える前
に結合した標識試薬から未結合標識試薬を分離する試験
と、均質系試験すなわち未結合標識試薬と結合した標識
試薬の両方に同時に電気化学的エネルギーを与える試験
として実施されるものである。本発明の均質系試験にお
いては、結合した標識試薬から放出された電磁放射線
は、未結合標識試薬と比較して結合した標識試薬から放
出された電磁放射線の量が増加したか減少したか、ある
いは波長の異なる電磁放射線によって未結合標識試薬か
ら放出された電磁放射線と区別し得る。従って本発明の
１つの具体例として、目的分析物と結合していない試薬
はすべて、試料に電気化学的エネルギーを与える前に試
薬と接触した試料から分離されることになる。本発明の
もう１つの具体例では、試料を試薬と接触させる前に、
目的分析物を固定するために試料を処理する。目的分析
物の固定方法はその技術分野ではよく知られているもの
であり、試料をポリスチレン、ニトロセルロース、ナイ
ロンの表面に接触させるか、または全細胞、準細胞粒
子、ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、
核酸、多糖、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖、
糖タンパク質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬
理学的試薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロ
イド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学
的ポリマー、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機
分子でコーティングした表面に接触させるのである。ま
た目的分析物が以上の物質の中のどれかであってもよ
い。本発明の１つの具体例では、目的分析物がテオフィ
リンである。また別の具体例では目的分析物がジゴキシ
ンである。さらに別の具体例では目的分析物がヒト繊毛
性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）である。また目的分析物が
全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイ
ド、核酸、タンパク質、リポタン白質、リポ多糖、糖タ
ン白質、ペプチド、ホルモン、薬理学的試薬、非生物学
的ポリマー、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機
分子であることも可能で、試料中に約１０-12 モル以下
の濃度で存在するこれらの物質を分析できる。さらに目
的分析物が試料中に約１０-15 モル以下の濃度で存在す
る全細胞、準細胞粒子、ビールス、プリオン、ビイロイ
ド、核酸であることも可能である。
【００３３】試料と接触させる試薬は、全細胞、準細胞
粒子、ビイルス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪
酸、核酸、多糖、たん白質、リポタン白質、リポ多糖、
糖タン白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理
学的試薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロイ
ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的
高分子、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分
子、ビオチン、アビジン、ストレプタビジンに結合した
エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種を含むもの
である。本発明の１つの具体例では試薬は抗体、抗原、
核酸、ハプテン、リガンドまたは酵素、ビオチン、アビ
ジン、ストレプタビジンに結合したエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種である。
【００３４】エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学
種としてはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジ
ウム、ロジウム、プラチナ、パラジウム、モリブデン、
テクネチウムから成る群から選択した金属を含む有機化
合物が用いられる。本発明の１つの具体例では金属はル
テニウムあるいはオスミウムを使用している。また別の
具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種
としてルブレンまたは９，１０−ジフェニルアントラセ
ンを使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種としてビス〔（４，４′
−カルボメトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３
−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）プ
ロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）を
使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種としてビス（２，２′ビピリジ
ン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）−４′−メチル−２，
２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用してい
る。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンス
を発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−
ｙｌ）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を使用している。ま
た別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する
化学種として（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２ジフェニルホスフイノ）エチレン〕｛２−〔３
−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙｌ）
プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム（Ｉ
Ｉ）を使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ
化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′
−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピ
リジン）−ブチラミン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンス
を発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピリジ
ン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセン
スを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリ
ジン−４′ブチラミドルテニウム（ＩＩ）を使用してい
る。
【００３５】試料は固体、乳濁液、懸濁液、液体、気体
から得たものが使用できる。さらに水、食品、血液、血
清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶剤、空気から得た
試料も使用できる。また試料中にアセトニトリル、ジメ
チルスルフオキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチ
ル−ピロリジノン、第三級ブチルアルコールが含まれて
いても使用できる。試料中に還元剤あるいは酸化剤が含
まれていても使用できる。また本発明は予め測定された
量の多成分液体試料において、その試料中に約１０-3モ
ル以下の濃度で存在する目的分析物を検出するための競
合的方法に関するものであり、以下の部分から構成され
ている。ａ）試料を（ｉ）試薬がくり返し放射線を放出
し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定
量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出するようにな
る、及び（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的材料
の結合部位について目的分析物、及び相補的材料と競合
し得る、ような試薬と接触させる。ただし目的分析物と
試薬が相補的材料と競合的に結合するのに最適な条件下
で接触させる。ｂ）このようにして得た試料に、試薬が
くり返し放射線を放出し得るような適切な源からの電気
化学的エネルギー一定量を与える。ただし試薬がくり返
し電磁放射線を放出し得るような最適条件下で与える。
ｃ）このようにして放出された電磁放射線を検出し、そ
れによって試料中の目的分析物の存在をも検出する。
【００３６】試薬はエレクトロ化学ルミネセンスを発す
る化学種に結合した目的分析物、あるいはエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的分析物の
類似体を用いる。また目的分析物としてテオフィリン、
ジゴキシン、ｈＣＧが使用できる。エレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種としてはビス｛（４，４′−カ
ルボメトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３−
（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）プロ
ピル−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）が使用
できる。また本発明の別の具体例ではエレクトロ化学ル
ミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピ
リジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）−４′−メチル−
２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセン
スを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を使用している。また
別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化
学種として（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕｛２−
〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例ではエレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−２，２′−
ビピリジン）−ブチラミン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセ
ンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピ
リジン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネ
センスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ブチラミドルテニウム（ＩＩ）を使用
している。
【００３７】相補的材料としては全細胞、準細胞粒子、
ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核
酸、多糖、タン白質、リポタン白質、リポ多糖、糖タン
白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試
薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、ステロイド、ビタ
ミン、アミノ酸、糖、非生物学的高分子、合成有機分
子、有機金属化合物分子、無機分子を使用することがで
きる。
【００３８】本出願の範囲内ではここに述べる方法は目
的分析物を定量するために用いるものである。従って本
発明は予め測定された量の多成分液体試料において、そ
の試料中に存在する目的分析物の量を定量的に測定する
ための方法に関するものも含み、以下の部分から構成さ
れている。ａ）試料を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放
射線を放出し得るような適切な源からの電気化学的エネ
ルギー一定量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出す
るようになる、及び（ｉｉ）目的分析物と結合すること
ができる、ような試薬と接触させる。ただし分析物と試
薬が結合するのに最適な条件下で接触させる。ｂ）この
ようにして得た試料に、試薬がくり返し放射線を放出し
得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量
を与える。ただし試薬がくり返し電磁放射線を放出し得
るような最適条件下で与える。ｃ）このようにして放出
された放射線の量を定量的に測定し、それによって試料
中に存在する目的分析物の量をも定量的に測定する。本
方法は不均一試験としても均一系試験としても使用でき
る。本発明の１つの具体例では目的分析物と結合してい
ない試薬はすべて、試料に試薬がくり返し放射線を放出
し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定
量を与える前に、既知量の試薬と接触した試料から分離
される。また本発明の別の具体例では、試料を試薬と接
触させる前に、目的分析物を固定するために試料を処理
する。
【００３９】目的分析物としては全細胞、準細胞粒子、
ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核
酸、多糖、タン白質、リポタン白質、リポ多糖、糖タン
白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試
薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロイド、ス
テロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的高分
子、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分子であ
ることが可能である。本発明の１つの具体例では目的分
析物がテオフィリンである。また本発明の別の具体例で
は目的分析物がジゴキシンである。さらに本発明の別の
具体例では目的分析物がｈＣＧである。試料と接触させ
る試薬は、全細胞、準細胞粒子、ウイルス、プリオン、
ビイロイド、脂質、脂肪酸、核酸、多糖、タン白質、リ
ポタン白質、リポ多糖、糖タン白質、ペプチド、細胞代
謝産物、ホルモン、薬理学的試薬、精神安定薬、バルビ
ツール酸塩、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、ア
ミノ酸、糖、非生物学的ポリマー、合成有機分子、有機
金属化合物分子、無機分子に結合したエレクトロ化学ル
ミネセンスを発する化学種である。本発明の１つの具体
例では試薬は抗体、抗原、核酸、ハプテン、リガンドま
たは酵素、ビオチン、アビジン、ストレプタビジンに結
合したエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種であ
る。
【００４０】エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学
種としてはルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジ
ウム、ロジウム、プラチナ、パラジウム、モリブデン、
テクネチウムから成る群から選択した金属を含む有機化
合物が用いられる。本発明の１つの具体例では金属はル
テニウムあるいはオスミウムを使用している。また別の
具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種
としてルブレンまたは９，１０−ジフェニルアントラセ
ンを使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種としてビス〔（４，４′
−カルボメトキシ）−２，２′−ビピリジン〕２−〔３
−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）プ
ロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウム（ＩＩ）を
使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリ
ジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）−４′−メチル−
２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用して
いる。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセン
スを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジン）
〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙ
ｌ）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を使用している。また
別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化
学種として（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕｛２−
〔３−（４ーメチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙ
ｌ）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例ではエレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−２，２′−
ビピリジン）−ブチラミン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミネセ
ンスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，２′−ビピ
リジン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（ＩＩ）を使用
している。さらに別の具体例ではエレクトロ化学ルミネ
センスを発する化学種としてビス（２，２′−ビピリジ
ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ブチラミドルテニウム（ＩＩ）を使用
している。
【００４１】試料は固体、乳濁液、懸濁液、液体、気体
から得たものが使用できる。さらに水、食品、血液、血
清、尿、便、組織、唾液、油、有機溶剤、空気から得た
試料も使用できる。また試料中にアセトニトリル、ジメ
チルスルフオキシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチ
ルピロリジノン、第三級ブチルアルコールが含まれてい
ても使用できる。試料中に還元剤あるいは酸化剤が含ま
れていても使用できる。本発明はまた予め測定された量
の多成分液体試料において、その試料中に存在する目的
分析物の量を定量的に測定するための競合的方法に関す
るものも含む。この方法は以下の部分から構成されてい
る。ａ）試料を既知量の（ｉ）試薬がくり返し放射線を
放出し得るような適切な源からの電気化学的エネルギー
一定量を受けた時に電磁放射線をくり返し放出するよう
になる、及び（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的
材料の結合部位について目的分析物、及び既知量の相補
的材料と競合し得る、ような試薬と接触させる。ただし
目的分析物と試薬が相補的材料と競合的に結合するのに
最適な条件下で接触させる。ｂ）このようにして得た試
料に、試薬がくり返し放射線を放出し得るような適切な
源からの電気化学的エネルギー一定量を与える。ただし
試薬がくり返し電磁放射線を放出し得るような最適条件
下で与える。ｃ）このようにして放出された放射線の量
を定量的に測定し、それによって試料中に存在する目的
分析物の量をも定量的に測定する。目的分析物としてテ
オフィリン、ジゴキシン、ｈＣＧが使用できる。
【００４２】本発明の１つの具体例では試薬はエレクト
ロ化学ルミネセンスを発する化学種に結合した目的分析
物、あるいはエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学
種に結合した目的分析物の類似体を用いている。エレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてはビス
〔（４，４′−カルボメトキシ）−２，２′−ビピリジ
ン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−
４−ｙｌ）プロピル〕−１，３−ジオキソランルテニウ
ム（ＩＩ）が使用できる。また本発明の別の具体例では
エレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス
（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）
−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム
（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例ではエレク
トロ化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ｙｌ）−酪酸〕ルテニウム（ＩＩ）を
使用している。また別の具体例ではエレクトロ化学ルミ
ネセンスを発する化学種として（２，２′−ビピリジ
ン）〔シス−ビス（１，２−ジフェニルホスフィノ）エ
チレン｛２−〔３−（４ーメチル−２，２′−ビピリジ
ン−４′−ｙｌ）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝
オスミウム（ＩＩ）を使用している。さらに別の具体例
ではエレクトロ化学ルミネセンスを発する化学種として
ビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（４′−メチル−
２，２′−ビピリジン）ブチラミン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）を使用している。また別の具体例ではエレクトロ化
学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′−
ビピリジン）〔１−ブロモ−４（４′−メチル−２，
２′−ビピリジン−４−イル）ブタン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）を使用している。さらに別の具体例ではエレクトロ
化学ルミネセンスを発する化学種としてビス（２，２′
−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４′−ブチラミドルテニウム
（ＩＩ）を使用している。
【００４３】相補的材料としては全細胞、準細胞粒子、
ビールス、プリオン、ビイロイド、脂質、脂肪酸、核
酸、多糖、タン白質、リポタン白質、リポ多糖、糖タン
白質、ペプチド、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的試
薬、精神安定薬、バルビツール酸塩、アルカロイド、ス
テロイド、ビタミン、アミノ酸、糖、非生物学的ポリマ
ー、合成有機分子、有機金属化合物分子、無機分子を使
用することができる。本発明はまた液体食品、食品ホモ
ジネート中に多数存在する目的分析物を検出し同定する
ための方法に関するものも含む。この方法は以下の部分
から構成されている。ａ）液体または固体懸濁液に浸す
のに適切で多数の試薬に対して固定された診断試薬ホル
ダーを液体食品あるいは食品ホモジネート中に浸す。た
だし各試薬は診断試薬ホルダーの明確に区別できる位置
に固定し、固定された試薬−目的分析物複合体が形成さ
れるよう目的分析物１種類ずつと複合体を形成し得るよ
うにする。ｂ）液体食品あるいは食品ホモジネート中か
ら判断試薬ホルダーを取り除く。ｃ）適当な洗浄溶液を
用いて判断試薬ホルダーを洗浄する。ｄ）固定された試
薬−目的分析物複合体を含む判断試薬ホルダーを、固定
された試薬−目的分析物複合体と複合体を形成すること
ができ、固定された試薬−目的分析物−検出試薬複合体
を形成し得るような最低１種類の検出試薬を含む検出溶
液に浸す。ｅ）試薬が、固定された試薬−目的分析物−
検出試薬複合体として固定されている判断試薬ホルダー
の同定可能な部分を検出し、それによって液体食品ある
いは食品ホモジネート中に多数存在する目的分析物を検
出し同定する。
【００４４】目的分析物としては微生物を用いることが
できる。微生物の生死は問わない。また微生物は細菌で
もよい。本方法によって検出し得る細菌の例としてはサ
ルモネラ属、カンピロバクター属、エシエリキア属、エ
ルジニア属、バチルス属、ビブリオ酸、レジュネラ属、
クロストリジウム属、連鎖球菌属、ブドウ球菌属が挙げ
られるが、これらの細菌のみに限定されるわけではな
い。また目的分析物として抗原を用いることができる。
このような抗原としてはエンテロトキシン類及びアフラ
トキシン類が挙げられるが、これに限定されるわけでは
ない。
【００４５】固定される試薬及び検出試薬としてはポリ
クローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル
抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗
体の混合物が使用できる。検出試薬は検出可能な標識物
を用いて標識することができる。本発明の１つの具体例
では検出試薬がそれぞれ同じ検出可能標識物によって標
識されている。このような標識物はその技術分野でよく
知られているものであり、例えばアルカリ性ホスファタ
ーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼのような酵
素、例えばフルオレセインイソチオシアネート、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリア
ジニラミノフルオレセイン、テキサスレッドのような蛍
光種、例えばルミノール、イソルミノール、アクリジニ
ウムエステルのような化学ルミネセンス種が含まれてい
る。また検出可能標識物として化学種が放射線を放出し
得るような適切な源からの電気化学的エネルギー一定量
を受けた時に電磁放射線をくり返し放出するようになる
エレクトロ化学ルミネセンス化学種も使用できる。この
エレクトロ化学ルミネセンス化学種にはルテニウム、オ
スミウムが含まれる。固定試薬は、診断試薬ホルダーに
取りつけたニトロセルロース膜に固定する。
【００４６】本発明はまた試料中に多数存在するエンテ
ロトキシン類を検出し同定するのに有用なキットも含
む。このキットは以下の部分から構成されている。ａ）
液体または固体懸濁液に浸すのに適切なように表面部分
に連結された取っ手のついた診断試薬ホルダー。ただし
上記の表面部分には最低１枚のニトロセルロース膜がつ
いており、このニトロセルロース膜上には区別し得る位
置に別々に明確に固定された各種モノクローナル抗体が
つけてあり、固定されたモノクローナル抗体はそれぞれ
１種類のエンテロトキシンの抗原決定基に対し特異的な
ものとなっている。ｂ）界面活性剤入り水性緩衝溶液か
ら成る第一洗浄溶液。ｃ）最低一種類のモノクローナル
抗体酵素結合から成る検出部。モノクローナル抗体は各
エンテロトキシンに対する異なる抗原に決定基に特異的
なもので、診断試薬ホルダーにつけられたニトロセルロ
ース膜上に固定されている。ｅ）検出溶液中のモノクロ
ーナル抗体に結合された酵素と反応し得る酵素基質。
ｆ）無色染液。
【００４７】本発明の１つの具体例ではニトロセルロー
ス膜に別々に明確に固定され、各種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓエンテロトキシン類の抗原決定基に特異的で
あるモノクローナル抗体をつけたニトロセルロース膜を
使用している。また本発明の別の具体例ではニトロセル
ロース膜に別々に明確に固定され、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓのエンテロトキシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅに対して
特異的である４種のモノクローナル抗体をつけたニトロ
セルロース膜を使用している。またこのニトロセルロー
ス膜には、膜に別々に明確に固定され、１種以上のＳｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンの１つの抗
原決定基に特異的であるモノクローナル抗体がつけてあ
ることもある。このエンテロトキシンはＳｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシン類Ｃ1 ，Ｃ2 ，Ｃ3
の抗原決定基に特異的なものである。各Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンの抗原決定基に特異的
で、ニトロセルロース膜に固定されたモノクローナル抗
体が特異性をもつＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテ
ロトキシンに向けられたモノクローナル抗体に結合され
るこのキットの酵素はアルカリ性ホスファターゼ等があ
り、この酵素と反応し得る酵素基質は５−ブロモ、４−
クロロインドリルホスフェート、無色染液はニトロブル
ーテトラゾリウムである。
【００４８】本発明はまた液体あるいは固体懸濁液中に
多数存在するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロ
トキシン類を検出し同定するための方法も含む。この方
法は以下の部分から構成されている。ａ）Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓのエンテロトキシン類に特異的で、診
断試薬ホルダーに別々に明確に固定された多数のモノク
ローナル抗体のついている診断試薬ホルダーを適当な時
間液体あるいは固体懸濁液中に浸し、固定されたモノク
ローナル抗体−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロ
トキシン複合体を形成させる。ｂ）試料から判断試薬ホ
ルダーを取り除く。ｃ）界面活性剤入り水性緩衝溶液中
に判断試薬ホルダーを浸す。ｄ）界面活性剤入り水性緩
衝溶液から判断試薬ホルダーを取り除く。ｅ）モノクロ
ーナル抗体−アルカリ性ホスファターゼコンジュゲート
を含む検出溶液中に診断試薬ホルダーを適当な時間浸
し、固定されたモノクローナル抗体−Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓエンテロトキシン−モノクローナル抗体−
アルカリ性ホスファターゼ複合体を形成させる。ｆ）検
出溶液から診断試薬ホルダーを取り除く。ｇ）水性緩衝
溶液中に診断試薬ホルダーを浸す。ｈ）水性緩衝溶液か
ら診断試薬ホルダーを取り除く。ｉ）５−ブロモ、４−
クロロインドリルホスフェート及びニトロブルーテトラ
ゾリウムを含む溶液中に診断試薬ホルダーを浸す。ｊ）
青色沈澱が蓄積したニトロセルロース膜上の同定可能な
部分を肉眼で検出する。ｋ）青色沈澱が蓄積したニトロ
セルロース膜上の同定可能な部分と、その部分に固定し
たモノクローナル抗体が特異性を示すＳｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンとを対応させ、それによ
って試料中の各種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテ
ロトキシンの存在を検出し同定する。
【００４９】さらに本発明には１つの試料中の細菌最低
１種の存在を検出するための方法も含まれる。この方法
は以下の部分から構成されている。ａ）試料を開放式で
細菌種の増殖に適する培地を含む容器の最低１つに接種
する。ｂ）キャップを容器の端に連結する。このキャッ
プの面は容器に連結した時に容器の内部と接触するよう
になっており表面が最低１つの細菌成分を固定するのに
適切な構造となっている。ｃ）培地中に接種された細菌
が増殖し得るような条件下で、接種された培地を培養す
る。ｄ）容器の上下を適当な時間の間反転させ、培地中
に存在する細菌成分が容器の内部に面したキャップの表
面上に固定されるようにする。ｅ）容器の上下を反転さ
せ正しい方向に戻す。ｆ）容器からキャップを取りはず
す。ｇ）細菌成分が固定されているキャップの表面を、
固定された細菌成分−試薬複合体が形成されるのに適切
な条件下で、固定された細菌成分と複合体を形成し得る
試薬に接触させる。ｈ）固定された細菌成分−試薬複合
体を検出し、それによって試料中の細菌種の存在をも検
出する。本出願の範囲内では「細菌成分」とは全細胞、
細胞壁成分、細胞膜成分、べん毛成分を含むがこれらの
みに限定されるわけではない。
【００５０】最低１つの細菌成分を固定するのに適切な
キャップ表面としては、ポリスチレン挿入物、ニトロセ
ルロース膜、ナイロン膜を用いることができる。また表
面をポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノク
ローナル抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクロ
ーナル抗体の混合物でコ−ティングしたものも用いられ
る。固定された細菌成分と複合体を形成し得る試薬には
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、モノクロー
ナル抗体の混合物、ポリクローナル抗体とモノクローナ
ル抗体の混合物がある。また試薬は例えば検出可能な酵
素、蛍光を発する種、化学ルミネセンスを発する種のよ
うな検出可能な標識物で標識するこもできる。さらに検
出可能な標識物としてエレクトロ化学ルミネセンスを発
する種を用いることもできる。本発明の１つの具体例で
はルテニウムまたはオスミウムを含むエレクトロ化学ル
ミネセンス種を使用している。また本発明の別の具体例
では固定された細菌成分−試薬複合体を検出するのに、
固定された細菌成分−試薬複合体と複合体を形成し得る
検出可能標識をした第２試薬を使用することもできる。
さらに本発明の別の具体例では試薬としてポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の混
合物、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の混合
物を使用し、第２試薬としてその試薬に対する抗−抗体
を検出可能なように標識したものを使用している。
【００５１】細菌を検出できる試料には水及び食品も含
まれる。本発明の１つの具体例では細菌種の増殖に適す
る培地として非選択的乳糖培地を使用している。また１
つの具体例では培地として非選択的乳糖培地を使用し、
検出できる細菌は最低１種類の大腸菌型である。本発明
には試料中の大腸菌型細菌の存在を検出するための方法
も含まれる。この方法は以下の部分から構成されてい
る。ａ）試料を開放式で非選択的乳糖培地及び倒立Ｄｕ
ｒｈａｍを入れた容器の最低１つに接種する。ｂ）ポリ
スチレン挿入物をつけたキャップを各容器の開放側の端
に連結する。ｃ）接種された培地を３７℃で最低２時間
培養する。ｄ）各容器中に倒立させたＤｕｒｈａｍバイ
アル内に採取されている細菌発酵により産生された気体
があるかどうか検出する。ｅ）倒立させたＤｕｒｈａｍ
バイアル内に気体が採取されている容器の上下を適当な
時間の間反転させ、培地中に存在する大腸菌型細菌が大
腸菌型−ポリスチレン複合体を形成し得るようにする。
ｆ）容器の上下を反転させ正しい方向に戻す。ｇ）容器
からキャップを取りはずす。ｈ）取りはずしたキャップ
のポリスチレン挿入物を、未結合部位をふさぐのに適切
な物質を用いて処理する。（ｉ）未結合部位をふさぐの
に適切な物質を用いて処理されたキャップのポリスチレ
ン挿入物を、抗体−大腸菌型−ポリスチレン複合体が形
成し得るような条件下で大腸菌型細菌に結合でき検出可
能となる標識物によって標識した抗大腸菌型細菌抗体最
低１種類を用いて処理する。ｊ）ポリスチレン挿入物上
の抗体−大腸菌型−ポリスチレン複合体の存在を検出
し、それによって試料中の大腸菌型細菌の存在をも検出
する。
【００５２】本発明の１つの具体例では非選択的乳糖培
地はフェノールレッドブロスである。ポリスチレン挿入
物上の未結合部位をふさぐのに適切な物質としてはウシ
血清アルブミンが使用できる。検出可能な標識物で標識
された抗大腸菌型細菌抗体としては検出可能な標識物で
標識されたモノクローナル抗体が使用できる。検出可能
な標識物としてはモノクローナル抗体に結合した酵素が
使用できる。本発明の１つの具体例ではこの酵素として
子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼを使用している。ま
た本発明の別の具体例では検出可能な標識物としてモノ
クローナル抗体に結合した蛍光を発する種を使用してい
る。さらに別の具体例では検出可能な標識物としてモノ
クローナル抗体に結合したエレクトロ化学ルミネセンス
を発する種を使用している。エレクトロ化学ルミネセン
スを発する種にはルテニウムやオスミウムが含まれる。
本発明の１つの具体例では試料は水である。また本発明
の別の具体例では試料は食品である。
【００５３】開放式の容器としてはバイアルが使用でき
る。また水試料中の大腸菌型細菌を検出するためのキッ
トも含まれる。このキットは以下の部分から構成されて
いる。ａ）非選択的乳糖培地の入ったバイアル最低１
本、ｂ）Ｄｕｒｈａｍバイアル最低１本、ｃ）ポリスチ
レン挿入物をつけたバイアルキャップ最低１個、ｄ）ウ
シ血清アルブミン溶液、ｅ）抗大腸菌型細菌モノクロー
ナル抗体−酵素結合体、ｆ）洗浄用水性緩衝溶液、ｇ）
酵素基質溶液。本発明の１つの具体例では抗大腸菌型細
菌モノクローナル抗体に結合した酵素は子ウシ腸アルカ
リ性ホスファターゼであり、酵素基質はｐ−ニトロフェ
ニルリン酸二ナトリウムである。本発明は次の構造をも
つ化合物も含み、
【化１４】 ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２であ
る。さらに本発明は次の構造をもつ化合物も含み、
【化１５】 ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２であ
る。また本発明は次の構造をもつ化合物も含み、
【化１６】 ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは２であ
る。
【００５４】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ、
【化１７】 Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの具体
例ではｎは２である。この化合物は次の構造をもつ構成
物を含み、
【化１８】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。
【００５５】また本発明は次の構造をもつ化合物も含
み、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの
具体例ではｎは２である。
【化１９】 この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、
【化２０】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。
【００５６】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１
つの具体例ではｎは３である。
【化２１】 この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、
【化２２】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。
【００５７】また本発明は次の構造をもつ化合物も含
み、Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの
具体例ではｎは３である。
【化２３】 この化合物は次の構造をもつ構成物を含み、
【化２４】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。
【００５８】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ、
【化２５】 ｎは整数である。本発明の１つの具体例ではｎは３であ
る。また本発明は次の構造をもつ化合物を含み、
【化２６】 ｍとｎはそれぞれ同じまたは異なる整数である。本発明
の１つの具体例ではｍとｎは両方とも３である。
【００５９】さらに本発明には次の構造をもつ化合物も
含まれ
【化２７】 Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの具体
例ではｎは２である。
【００６０】この化合物は次の構造をもつ構成物を含
み、
【化２８】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。また本発明は次の構造をもつ
化合物を含む。
【化２９】 さらに次の構造をもつ化合物も含み、
【化３０】 Ｒは陰イオンで、ｎは整数である。本発明の１つの具体
例ではｎは２である。
【００６１】この化合物は次の構造をもつ構成物を含
み、
【化３１】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。また本発明は次の構造をもつ
化合物を含み、
【化３２】 Ｒは陰イオンで、ｍとｎは整数である。本発明の１つの
具体例ではｍは５、ｎは３である。
【００６２】この化合物は次の構造をもつ構成物を含
み、
【化３３】Ｘ−（Ｙ）n −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、同種また
は異種のアミノ酸１つ以上、抗体、目的分析物、目的分
析物の類似体を表わし、ｎは整数、Ｚは本発明に含まれ
る化合物を表わしている。本発明の１つの具体例ではＸ
はテオフィリンである。また本発明の別の具体例ではＸ
はジゴキシゲニンである。さらに本発明の別の具体例で
はＸはｈＣＧ由来のペプチドである。さらに本発明には
次の構造をもつ化合物が含まれ、
【化３４】Ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n
−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2 ）m −Ｚ Ｘは同種または異種のヌクレオチド１つ以上、Ｚはエレ
クトロ化学ルミネセンスを発する化学種、ｎは１以上の
整数、ｍは１以上の整数、をそれぞれ表わしている。本
発明の１つの具体例ではＸが５番目の炭素の位置のＣＨ
につけたチミジン、ｎが７でｍが３である。
【００６３】また本発明の別の具体例ではＺがビス
（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−ａｌ）
−４′メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）である。さらに本発明の別の具体例ではチミジンヌ
クレオチドが次のヌクレオチド配列につけた３′末端ヌ
クレオチドとなっている。
【化３５】ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡ
ＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧ 本発明はまた次の構造をもつ化合物を含み、
【化３６】〔Ｔ−Ｙ−Ｚ〕2+（Ｒ）2 Ｔはテオフィリン、ＹはＴからＺにつくリンカー基、Ｚ
はビス−（２，２′−ビピリジン）〔４−メチル−２，
２′−ビピリジン−４′−ｙｌ〕ルテニウム（ＩＩ）、
Ｒは陰イオンを表わしている。本発明の１つの具体例で
はＹは８番目のＴの位置の炭素についている。また本発
明の別の具体例ではＹは次の構造をもち、
【化３７】（ＣＨ2 ）m −ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）n ｍとｎは同じまたは異なる１つ以上の整数を表わしてい
る。また別の具体例ではｍは３、ｎは４である。さらに
別の具体例ではｍとｎは両方とも３である。
【００６４】また本発明の別の具体例ではＹは次の構造
をもち、
【化３８】 ｍ、ｎ、ｒは同じまたは異なる１つ以上の整数を表わし
ている。１つの具体例ではｍは１、ｎは１、ｒは４であ
る。さらに本発明の別の具体例ではＹは次の構造をも
ち、
【化３９】 ｍ、ｎ、ｒは同じまたは異なる１以上の整数を表わして
いる。１つの具体例ではｍは１、ｎは１、ｒは４であ
る。また本発明の別の具体例ではＹは７番目のＴの位置
の窒素についている。１つの具体例ではＹは次の構造を
もち、
【化４０】（ＣＨ2 ）n ｎは１以上の整数である。別の具体例ではｎは４であ
る。
【００６５】本発明はまた次の構造をもつ化合物を含
み、
【化４１】 Ｙはリンカーアームである。本発明の１つの具体例では
Ｙは次の構造をもち
【化４２】（ＣＨ2 ）m −ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2 ）n ｍとｎは同じまたは異なる１以上の整数である。１つの
具体例ではｍは３、ｎは２である。
【００６６】本発明はさらに次の構造をもつ化合物を含
み、
【化４３】 ｍとｎは同じまたは異なる整数である。１つの具体例で
はｍとｎは両方とも１である。また次の構造をもつ構成
物を含み、
【化４４】Ｘ−Ｚ Ｘはシステインまたはメチオニンの最低１つのアミノ酸
から成る同種あるいは異種のアミノ酸１つ以上を表わ
し、Ｚは３番目または４番目のマレイミドの位置の炭素
によってシステインまたはメチオニンのイオウ置換基に
つけたビス（２，２′−ビピリジン）マレイミドヘキサ
ン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチ
ラミドルテニウム（ＩＩ）を表わしている。以下に挙げ
る例は本発明の具体的説明であるが、これに限られるわ
けではなく、発明明細書に続く承認請求によってその範
囲を定めている。
【００６７】実施例１−各種有機溶剤中のエレクトロ化
学ルミネセンス トリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）ク
ロリドヘキサヒドレートのエレクトロ化学ルミネセンス
を、以下のようにして調製した溶液１０ｍｌを含む１５
ｍｌ ３口丸底フラスコ中で測定した：１．５ｍｍ×１
０ｍｍマグネチックスターラーバー、直径１．０ｍｍの
銀線準基準電極、配合２８ゲージプラチナ線対電極、厚
さ０．１ｍｍの高度に研磨したプラチナ箔１ｃｍ×１ｃ
ｍ正方形片に溶接した２２ゲージプラチナ線から成る作
動電極（プラチナ箔作動電極は直径３／１６インチの半
円形とし、２８ゲージプラチナ線対電極を３／３２イン
チの等距離をおいて囲むようにした）。銀線をＥＧ＆Ｇ
１７３型電位調節器／電流調節器のＥＧ＆Ｇ１７８型電
位計プローブに接続した。プラチナ線対電極とプラチナ
作動電極はＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器の陽極及び陰極
にそれぞれ接続した。装置はアースした。
【００６８】ＥＧ＆Ｇ１７５型ユニバーサルプログラマ
ーをつけたＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器を用いて循環電
圧電流を測定した。プログラマーは陽極電位＋１．７５
ボルトと陰極電位−１．８０ボルトの間を１００ｍＶ／
秒で掃引するように設定した。Ｈａｍａ−ｍａｔｓｕ
Ｒ９２８光電増倍管チューブをＫｏｄａｋ＃２３Ａゼラ
チン（赤色）フィルターをつけたＰｒｏｄｕｃｔｓ ｆ
ｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＲ１４０２ＲＦ型光電増倍
管チューブハウジングの中に入れ、エレクトロ化学ルミ
ネセンスを検出した。光電増倍管チューブハウジングは
Ｏｒｉｅｌ ７０７０型光電増倍管検出システムに接続
した。循環電圧電流はＨｏｕｓｔｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ２００Ｘ−Ｙ型記録計に記録した。循環電圧電流
は次の有機溶剤と１ｍＭトリス（２，２′−ビピリジ
ル）ルテニウム（ＩＩ）クロリドヘキサヒドレート（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）及び
０．１Ｍテトラブチルアンモニウムテトラフルオロボレ
ート（ＴＢＡＢＦ4 ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）とによって産生された。：アセ
トニトリル、ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、１−メチル、２−ピロリジノン（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）。また１ｍ
Ｍトリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
クロリドヘキサヒドレート及び０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ4
を含む溶液を調製する時には第三級ブチルアルコールと
脱イオン蒸留水の溶液（１：１、ｖ／ｖ）を使用した。
このようにして産生された電圧電流によると、各有機溶
剤中でのトリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム
（ＩＩ）クロリドヘキサヒドレートの酸化還元電位に変
化は見られなかった。
【００６９】エレクトロ化学ルミネセンスを肉眼で検出
するため、次のようにして溶液を調製した：十分量のト
リス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）クロ
リドヘキサヒドレート及びＴＢＡＢＦ4 を上記の有機溶
剤分光器用等級（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ）に溶解し、最終濃度をそれぞれ１ｍ
Ｍ、０．１Ｍとした。この溶液１０ｍｌを１５ｍｌ ３
口丸底フラスコに入れた。電極をこの溶液中に浸し、作
動電極は＋１．７５から−１．４５ボルトの電位間を振
動させエレクトロ化学ルミネセンスが産生されるように
した。エレクトロ化学ルミネセンスは前述の各溶液中で
肉眼的に観察した。各種溶剤によるエレクトロ化学ルミ
ネセンスへの影響を定量的に測定するため、次のように
して溶液を調製した：十分量のトリス（２，２′−ビピ
リジル）ルテニウム（ＩＩ）クロリドヘキサヒドレート
及びＴＢＡＢＦ4 を前述の有機溶剤中に溶解し、最終濃
度をそれぞれ２ｍＭ、０．２ｍＭとした。この溶液一定
量に、強酸化剤過硫酸アンモニウムを３６ｍＭの濃度で
含有する脱イオン蒸留水を等量加えた。トリス（２，
２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）クロリドヘキサ
ヒドレートの入っていない対照溶液も調製した。このよ
うにして得た溶液１０ｍｌを１５ｍｌ ３口丸底フラス
コに入れた。陰極電位を０から−２．０ボルトまで１／
２秒間隔で振動させ、エレクトロ化学ルミネセンスが産
生されるようにした。
【００７０】Ｍｉｃｒｏｎｔａ２２１９１型デジタルマ
ルチメーターに接続したインテグレーターを用い、この
ようにして得たエレクトロ化学ルミネセンスの光電増倍
管チューブ信号の総和を計算することによってエレクト
ロ化学ルミネセンスを測定した。エレクトロ化学ルミネ
センス信号は振動期間の１０秒間の和を求め、ｍＶで記
録した。結果は表Ｉに示す通りで、各種溶剤によってル
テニウム（ＩＩ）クロリドの効率が量的に異なることが
わかる。
【表１】 表 Ｉ 有機 トリスＲｕＢｉＰｙ 溶剤 （１０-6Ｍ） 対 照 Δ アセトニトリル ２, ５４０ １０４ ２，４３６ 第三級ブチルアルコール １，２８０ ０ １，２８０ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ２，３９０ １４３ ２，２４７ ジメチルスルホキシド ２，７６０ ２９ ２，７３１ １−メチル−２−ピロリジノン １，６３０ ０ １，６３０ ＊ 測定値の単位はすべてｍＶ。
【００７１】実施例２−ルテニウム標識ウサギ抗マウス
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のエレクトロ化学ルミ
ネセンス検出感度 ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）のエレクトロ化学ルミネセ
ンスを、以下のようにして調製した溶液１０ｍｌを含む
１５ｍｌ ３口丸底フラスコ中で測定した：１．５ｍｍ
×１０ｍｍマグネチックスターラーバー、直径１．０ｍ
ｍの銀線準基準電極、配合２８ゲージプラチナ線対電
極、厚さ０．１ｍｍの高度に研磨したプラチナ箔１ｃｍ
×１ｃｍ正方形片に溶接した２２ゲージプラチナ線から
成る作動電極（プラチナ箔作動電極は直径３／１６イン
チの半円形とし、２８ゲージプラチナ線対電極を３／３
２インチの等距離をおいて囲むようにした）。銀線をＥ
Ｇ＆Ｇ１７３型電位調節器／電流調節器のＥＧ＆Ｇ１７
８型電位計プローブに接続した。プラチナ線対電極とプ
ラチナ作動電極はＥＧ＆Ｇ１７３型電位調節器の陽極及
び陰極にそれぞれ接続した。装置はアースした。
【００７２】ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体
溶液から放出されたエレクトロ化学ルミネセンスは、Ｋ
ｏｄａｋ ＃２３Ａゼラチン（赤色）フィルターをつけ
たＰｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＲ
１４０２ＲＦ型光電増倍管チューブハウジングの中に入
れたＨａｍａｍａｔｓｕ Ｒ９２８光電増倍管チューブ
を用いて検出した。光電増倍管チューブハウジングはＯ
ｒｉｅｌ ７０７０型光電増倍管検出システムに接続し
た。陰極電位を０から−２．０ボルトまで１／２秒間隔
で振動させ、エレクトロ化学ルミネセンスが産生される
ようにした。Ｍｉｃｒｏｎｔａ２２１９１型デジタルマ
ルチメーターに接続したインテグレーターを用い、この
ようにして得たエレクトロ化学ルミネセンスの光電増倍
管チューブ信号の総和を計算することによってエレクト
ロ化学ルミネセンスを測定した。エレクトロ化学ルミネ
センス信号は振動期間の１０秒間の和を求め、ｍＶで記
録した。ルテニウニム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の
１．２５×１０-7Ｍの保存用溶液は、標識抗体の濃縮液
（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）をリン酸緩衝溶液
（ＰＢＳ）で希釈することにより調製した。この溶液一
定量（８０μｌ）を反応容器中の０．１Ｍテトラブチル
アンモニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＡＢＦ4 ）
及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むジメチルスルホ
キシド（ＤＭＳＯ）／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍ
ｌに加えた。ルテニウム標識抗体の最終濃度は１×１０
-9Ｍとした。前述のようにしてエレクトロ化学ルミネセ
ンスを測定した。
【００７３】ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体
保存用溶液の各種希釈溶液をも調製し、これらの溶液一
定量（８０μｌ）を反応容器中のルテニウム標識抗体同
溶液に加え、標識抗体の濃度が次のようになるようにし
た：５×１０-9Ｍ、１×１０ -8Ｍ、５×１０-8Ｍ。各溶
液のエレクトロ化学ルミネセンスを前述のようにして測
定した。この測定値を以下の表ＩＩに挙げる。これらの
結果から標識抗体（１×１０-9Ｍ）のエレクトロ化学ル
ミネセンス検出感度が示され、エレクトロ化学ルミネセ
ンスの強度はルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体の濃度
に依存することがわかる。
【表２】 表 ＩＩ ルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ） 抗体のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ） ルテニウム標識抗マウス ＩｇＧ抗体の濃度 ＥＣＬ（ｍＶ） ５×１０-8Ｍ １６１０ １×１０-8Ｍ ８９２ ５×１０-9Ｍ ４１８ １×１０-9Ｍ ７２ ０ ０
【００７４】実施例３−固相酵素標識イムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）におけるルテニウム標識ウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）の免疫学的反応性 ポリスチレン製マイクロタイター板の各穴を、４，４′
−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジル、ビス
（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）で標識し
たウシ血清アルブミン、すなわちルテニウム標識ウシ血
清アルブミン（６Ｒｕ／ＢＳＡ、２０μｇ／ｍｌ ＰＢ
Ｓ、５０μｌ／穴）あるいは未標識ＢＳＡ（２０μｇ／
ｍｌ ＰＢＳ、５０μｌ／穴）の十分な濃度の溶液でコ
ーティングし、室温で１時間インキュベートした。この
インキュベート期間終了後、タイター板をＰＢＳで１回
当たり５分間、３回洗浄した。６ｍｇ／ｍｌのウサギ抗
ＢＳＡ抗体を含む溶液をＰＢＳで１：２０，０００、
１：３０，０００、１：４０，０００、１：５０，００
０、１：６０，０００に希釈し、ルテニウム標識ＢＳＡ
あるいは未標識ＢＳＡでコーティングした各穴２つずつ
にこの希釈液を加え、タイター板を室温で１時間インキ
ュベートした。前回と同様ＰＢＳを用いて３回洗浄した
後、各穴にヤギ抗ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合
体（０．５ｍｇ／ｍｌ溶液をＰＢＳで１：１０００に希
釈）を加えタイター板を室温で１時間インキュベートす
ることにより、結合したウサギ抗ＢＳＡ抗体が存在する
かどうかを検出した。タイター板を前回と同様にして
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで２回、ＰＢＳで
２回洗浄した後、過酸化水素（３０％）と２，２′−ア
ジノ−ジ−〔３−エチル−ベンツチアゾリンスルホネー
ト〕（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）とを
等量ずつ混合し、そのうち２００μｌをタイター板の各
穴に加えた。室温で３０分間インキュベートした後、４
１４ｎｍでタイター板の吸光度測定を行った。ルテニウ
ム標識ＢＳＡあるいは未標識ＢＳＡでコーティングした
穴に加えたウサギ抗ＢＳＡ抗体の各希釈液の２穴の平均
測定値から対照穴のバックグラウンド吸光度の平均値を
引いた。これらの補正吸光度を表Ｖに示す。
【００７５】未標識ＢＳＡとルテニウム標識ＢＳＡから
得られた曲線は平行で、２つの曲線の各点の補正吸光度
の比は約０．６と一定であった。前述の活性化ルテニウ
ム複合体と同じものを用いて調製し同様のＲｕ／ＢＳＡ
標識比をもつ他のルテニウム標識ＢＳＡ２ロットによる
実験でも同一の結果が得られた。以上の結果から、ルテ
ニウム標識ＢＳＡは免疫学的反応性を有し、ルテニウム
で標識した時の免疫反応性は未標識ＢＳＡと比較して約
６０％に達することが示される。
【表３】 表 ＩＩＩ ４１４ｎｍにおける吸光度 ウサギ抗ＢＳＡ 未標識 ルテニウム 相対免疫 抗体希釈 ＢＳＡ 標識ＢＳＡ 反応性 ２0,０００ 1.０６ 0.６６ ６２％ ３0,０００ 0.８３ 0.５０ ６０％ ４0,０００ 0.６７ 0.４０ ６０％ ５0,０００ 0.５６ 0.３３ ５９％ ６0,０００ 0.４７ 0.２８ ６０％
【００７６】実施例４−競合固相酵素標識イムノソルベ
ントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）におけるルテニウム標識ウ
サギ抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）抗体の免疫学的
反応性 ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）について、マウスＩｇＧへ
の結合を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体と競合する能力に
関して未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体と比較した。９
６穴ポリスチレン製マイクロタイター板の各穴をマウス
ＩｇＧ溶液（５μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）でコーティング
し、室温で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳで１
回当たり５分間、３回洗浄した。ウサギ抗マウスＩｇＧ
−アルカリ性ホスファターゼ結合体とウサギ抗マウスＩ
ｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ）との混合物を含む溶液及びウサギ
抗マウスＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼ結合体とル
テニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（１ｍｇ／ｍｌ、
７．５Ｒｕ／抗体）との混合物を含む溶液の２種類を調
製した。これら２種類の溶液と、ウサギ抗マウスＩｇＧ
−アルカリ性ホスファターゼ結合体を含む第３の溶液と
を、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで１：６０
００、１：７０００、１：８０００、１：９０００、
１：１０，０００、１：１２，０００、１：１４，００
０、１：１６，０００に希釈し、マウスＩｇＧを結合さ
せたタイター板の各列に加えた（５０μｌ／穴）。タイ
ター板を室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔ
ｗｅｅｎ−２０で２回、ＰＢＳで２回、１回当たり５分
間洗浄した。各穴に酵素基質ｐ−ニトロフェニルホスフ
ェート（１．５ｍｇ／ｍｌ １０％ジエタノールアミン
緩衝液、ｐＨ９．６）を加え（２００μｌ／穴）、タイ
ター板を室温で３０分間インキュベートした後、４０５
ｎｍで吸光度測定を行った。３種類の溶液の各希釈液の
２穴の平均測定値から対照穴のバックグラウンド吸光度
の平均値を引いた。これらの吸光度の値を表ＶＩに示
す。
【００７７】得られた３本の曲線は平行で、一番上が酵
素結合体の結合を阻害しなかった場合、二番目と三番目
がルテニウム標識抗マウスＩｇＧ及び未標識抗マウスＩ
ｇＧによって阻害した場合である。ルテニウム標識抗マ
ウスＩｇＧの曲線は、酵素結合体の曲線と比較して各点
共未標識抗マウスＩｇＧの曲線の値の約８１％である。
以上の結果から、ルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体は
その抗原（マウスＩｇＧ）に対する免疫学的反応性を有
し、マウスＩｇＧへの結合を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗
体と競合する能力は未標識抗マウスＩｇＧ抗体の約８０
％であることが示される。
【表４】 表 ＩＶ ４０５ｎｍにおける吸光度 Ａ Ｂ Ｃ 抗マウスIgG 酵素結合体＋ アルカリ性ホ ルテニウム 酵素結合体＋ スファターゼ 標識抗マウス 未標識抗マウ 相対 希 釈 (酵素結合体） ＩｇＧ スＩｇＧ 阻害度* 6,０００ １．４８ ０．９４ ０．７９ ７７％ 7,０００ １．３３ ０．８２ ０．６９ ７９％ 8,０００ １．２１ ０．７２ ０．６２ ８２％ 9,０００ １．１０ ０．６５ ０．５６ ８４％ １0,０００ １．０１ ０．６０ ０．５１ ８２％ １2,０００ ０．８７ ０．５１ ０．４３ ８０％ １4,０００ ０．７７ ０．４５ ０．３７ ８１％ １6,０００ ０．６８ ０．４０ ０．３３ ８０％ ──────────────────────────────────── ＊（Ａ−Ｂ／Ａ−Ｃ）×１００％
【００７８】実施例５−ルテニウム標識ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）のエレクトロ化学ルミネセンス ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ルテニウム
標識ウシ血清アルブミン）の７．８×１０-6Ｍ溶液を、
ルテニウム標識ＢＳＡの保存用溶液（２．６ｍｇ／ｍ
ｌ、６Ｒｕ／ＢＳＡ）のリン酸緩衝溶液を用いた希釈に
よって調製した。この溶液２６μｌを反応容器中の０．
１Ｍ ＴＢＡＢＦ4 及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを
含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍｌに加
えた。ルテニウム標識ＢＳＡの最終濃度は２×１０-8Ｍ
とした。実施例Ｖと同様にしてエレクトロ化学ルミネセ
ンスを測定した。同じ方法を用いて未標識ＢＳＡの７．
８×１０-6Ｍ溶液を調製し、未標識ＢＳＡの最終濃度が
２×１０-8Ｍとなるよう反応容器中に加えた。この溶液
とＢＳＡを含まない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネ
センスを測定した。共有結合したルテニウム標識ＢＳ
Ａ、未標識ＢＳＡのエレクトロ化学ルミネセンス測定値
を表Ｖに示す。
【表５】 表 Ｖ ルテニウム標識ＢＳＡのエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ） 溶 液 ＥＣＬ（ｍＶ） ２×１０-8Ｍルテニウム標識ＢＳＡ ７３０ ２×１０-8Ｍ ＢＳＡ １００ ＤＭＳＯ：Ｈ2 Ｏ（１：１） ０
【００７９】実施例６−ルテニウム標識ウサギ抗マウス
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体のエレクトロ化学ルミ
ネセンス ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）の１．２５×１０-6Ｍ溶液
を、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の保存用
溶液（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のリン酸緩衝
溶液を用いた希釈によって調製した。この溶液８０μｌ
を反応容器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ4 及び１８ｍＭ過
硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水
（１：１）１０ｍｌに加えた。ルテニウム標識抗体の最
終濃度は１×１０-8Ｍとした。実施例２と同様にしてエ
レクトロ化学ルミネセンスを測定した。同じ方法を用い
て未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の１．２５×１０-6
Ｍ溶液を調製し、未標識抗体の最終濃度が１×１０-8Ｍ
となるよう反応容器中に加えた。この溶液と抗体を含ま
ない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネセンスも前述の
ようにして測定した。共有結合したルテニウム標識ウサ
ギ抗マウスＩｇＧ抗体、未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗
体のエレクトロ化学ルミネセンス測定値を表ＶＩＩＩに
示す。
【表６】 表 ＶＩ ルテニウム標識ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ） 抗体のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ） 溶液 ＥＣＬ（ｍＶ） １×１０-8ルテニウム標識ウサギ ８９２ 抗マウスＩｇＧ抗体 １×１０-8ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体 ０ ＤＭＳＯ：Ｈ2 Ｏ（１：１） ０
【００８０】実施例７−ウシ血清アルブミンに対する抗
体の均質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノアッセイ ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ルテニウム
標識ウシ血清アルブミン）の７．８×１０-6Ｍ溶液を、
ルテニウム標識ＢＳＡの保存用溶液（２．５ｍｇ／ｍ
ｌ、６Ｒｕ／ＢＳＡ）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）を用
いた希釈によって調製した。この溶液２６μｌを反応容
器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ4 及び１８ｍＭ過硫酸アン
モニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）１
０ｍｌに加えた。ルテニウム標識ＢＳＡの最終濃度は２
×１０ -8Ｍとした。実施例２と同様にしてエレクトロ化
学ルミネセンスを測定した。同じ方法を用いて未標識Ｂ
ＳＡの７．８×１０-6Ｍ溶液を調製し、未標識ＢＳＡの
最終濃度が５×１０-8Ｍとなるよう反応容器中に加え
た。この溶液とＢＳＡを含まない同様の溶液のエレクト
ロ化学ルミネセンスを測定した。ウサギ抗ＢＳＡ抗体の
３．７５×１０-5Ｍ溶液を、ウサギ抗ＢＳＡ抗体の保存
用溶液（６．０ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳを用いた希釈によ
って調製し、この溶液一定量（２６μｌ）を反応容器中
のルテニウム標識ＢＳＡ溶液に加えてウサギ抗ＢＳＡ抗
体の最終濃度が１×１０-7Ｍとなるようにした。
【００８１】このようにして得たルテニウム標識ＢＳＡ
抗原と抗体（ウサギ抗ＢＳＡ）との混合物のエレクトロ
化学ルミネセンスを測定した。表ＶＩＩに示した結果か
ら、ルテニウム標識ＢＳＡのエレクトロ化学ルミネセン
スはウサギ抗ＢＳＡ抗体を加えると減少することが示さ
れ、ＢＳＡに対する抗体の均質系エレクトロ化学ルミネ
センス検出が可能であることがわかる。以上の結果に基
づき、本技術分野の専門家によって他の目的分析物を検
出するための均質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノ
アッセイも開発され得るであろう。
【表７】 表 ＶＩＩ ルテニウム標識ウシ血清アルブミンの抗体結合時における エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）の減少 未標識 ルテニウム標識 ウサギ ＢＳＡ ＢＳＡ 抗ＢＳＡ （対照） （抗原） （抗体） ＥＣＬ（ｍＶ） ０ ２×１０-8Ｍ ０ ７２７ ０ ２×１０-8Ｍ １×１０-7Ｍ ９２ ２×１０-8Ｍ ０ ０ ９４
【００８２】実施例８−マウス免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）の均質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノアッセ
イ ４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリジ
ル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）
で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ルテニウム標識
ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体）の６．２５×１０-6Ｍ溶液
を、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の保存用
溶液（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のリン酸緩衝
溶液（ＰＢＳ）を用いた希釈によって調製した。この溶
液８０μｌを反応容器中の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ4 及び
１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン
蒸留水（１：１）１０ｍｌに加えた。ルテニウム標識抗
体の最終濃度は５×１０-8Ｍとした。実施例２と同様に
してエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。同じ方法
を用いて未標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の６．２５×
１０-6Ｍ溶液を調製し、未標識抗体の最終濃度が５×１
０-8Ｍとなるよう反応容器中に加えた。この溶液と抗体
を含まない同様の溶液のエレクトロ化学ルミネセンスを
測定した。
【００８３】マウスＩｇＧの２．５×１０-5Ｍ溶液を、
マウスＩｇＧの保存用溶液（４．０ｍｇ／ｍｌ）のＰＢ
Ｓを用いた希釈によって調製し、この溶液の２容量（２
０μｌ及び４０μｌ）を反応容器中のルテニウム標識抗
マウスＩｇＧ溶液に加えてマウスＩｇＧの最終濃度がそ
れぞれ５×１０-8Ｍ、１×１０-7Ｍとなるようにした。
このようにして得たルテニウム標識抗マウスＩｇＧ抗体
と抗原（マウスＩｇＧ）との混合物のエレクトロ化学ル
ミネセンスを測定した。結果は表ＶＩＩＩに示す。エレ
クトロ化学ルミネセンス測定値がマウスＩｇＧ抗原の濃
度に依存する様子を図１に示してある。以上の結果か
ら、ルテニウム標識抗体のエレクトロ化学ルミネセンス
は抗原を加えると減少することがわかる。これらの結果
に基づき、本技術分野の専門家によって他の目的分析物
の濃度を測定するための均質系エレクトロ化学ルミネセ
ンスイムノアッセイも開発され得るであろう。
【表８】 表 ＶＩＩＩ ルテニウム標識抗体の抗原結合時における エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）の減少 未標識抗 ルテニウム標識 マウスＩｇＧ 抗マウスＩｇＧ マウスＩｇＧ （対照） （抗体） （抗原） ＥＣＬ（ｍＶ） ０ ５×１０-8Ｍ ０ １６１０ ０ ５×１０-8Ｍ ５×１０-8Ｍ １３６０ ０ ５×１０-8Ｍ １×１０-7Ｍ １２４０ ５×１０-8Ｍ ０ ０ ０
【００８４】実施例９−マウス抗Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体及びルテニウム標識ウ
サギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用いた
Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａの異質系エレクトロ化学ルミネセ
ンスイムノアッセイ ─────────────────────────
───────────細菌Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍ
ｉｃｄａｄｅｉのホルマリン化懸濁液を、光学密度１．
００（４２５ｎｍで）となるようにＰＢＳで希釈した。
約３×１０9 細胞を円錐形ミクロ遠心チューブに入れ
た。細胞を遠心し（１０分間、１０，０００ＲＰＭ）、
上清を捨て、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍｉｃｄａｄｅｉ
に特異的なマウスモノクローナルＩｇＧ抗体（１．４５
ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ中１：５０希釈液（１ｍｌ）に細
胞を再懸濁した。室温で１時間インキュベートした後、
細胞を遠心し、上清を捨て、ＰＢＳ中に細胞を再懸濁し
て再び遠心した。上清を捨てた後、４，４′−（ジクロ
ロメチル）−２，２′−ビピリジル、ビス（２，２′−
ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）で標識したウサギ抗マ
ウスＩｇＧ抗体、すなわちルテニウム標識ウサギ抗マウ
スＩｇＧ抗体（２ｍｇ／ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のＰ
ＢＳ中１：５０希釈液に細胞を再懸濁した。室温で１時
間インキュベートした後、細胞を遠心し、上清を捨て、
ＰＢＳ中に細胞を再懸濁して前述のように遠心により２
回洗浄した。最後の洗浄の後ＰＢＳ２００μｌ中に細胞
を再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌを反応容器中
の０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ4 及び１８ｍＭ過硫酸アンモニ
ウムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍ
ｌに加え、反応容器に移した。この細胞懸濁液のエレク
トロ化学ルミネセンスを測定した。細胞懸濁液の残り１
００μｌを反応容器に加え、エレクトロ化学ルミネセン
スを測定した。実施例２で述べた方法に従い、細胞を含
まない溶液のエレクトロ化学ルミネセンスを対照として
測定した。表ＩＸに示した結果から、ルテニウム標識ウ
サギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ
の異質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノアッセイが
成功していることがわかる。
【表９】 表 ＩＸ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍｉｃｄａｄｅｉの異質系エレクトロ 化学ルミネセンス（ＥＣＬ）イムノアッセイ 試 料 ＥＣＬ（ｍＶ） Legionella micdadei細胞懸濁液 １６０ DMSO／H2O （１：１）中１．９×１０9 細胞 Legionella micdadei細胞懸濁液 ９０ DMSO／H2O （１：１）中９．３×１０8 細胞 DMSO：H2O （１：１） ０
【００８５】実施例１０−マウス抗Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌ
ａ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体及びルテニウム標識
ウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体を用い
たＬｅｇｉｏｎｅｌｌａの均質系エレクトロ化学ルミネ
センスイムノアッセイ ─────────────────────────
───────────実施例９で述べたのと同様にし
て細菌Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍｉｃｄａｄｅｉの懸濁
液を調製し、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａに特異的なマウスモ
ノクローナルＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。細
胞を遠心し、洗浄し、ＰＢＳ０．２ｍｌ中に再懸濁し
た。４，４′−（ジクロロメチル）−２，２′−ビピリ
ジル、ビス（２，２′−ビピリジル）ルテニウム（Ｉ
Ｉ）で標識したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体、すなわちル
テニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（１．２５×１
０-6Ｍ）の一定量（８０μｌ）を細胞懸濁液に加え、混
合物を室温で２時間インキュベートした。対照として細
胞懸濁液を含まないルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体の同一希釈液を同様にインキュベートした。イン
キュベーション終了後、標識抗体溶液を反応容器中の
０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ4 及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウ
ムを含むＤＭＳＯ／脱イオン蒸留水（１：１）１０ｍｌ
に加え、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の最
終濃度が１×１０-8Ｍとなるようにした。実施例２と同
様にしてエレクトロ化学ルミネセンスを測定した。ルテ
ニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を加えた細胞懸濁
液についても同様に測定を行った。表Ｘに示した結果か
ら、エレクトロ化学ルミネセンスの放出がルテニウム標
識抗マウスＩｇＧ抗体とＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに結合し
たマウスモノクローナル抗体との間の相互作用によって
減少することがわかり、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍｉｃ
ｄａｄｅｉの均質系エレクトロ化学ルミネセンスイムノ
アッセイが成功していることが示されている。
【表１０】 表 Ｘ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍｉｃｄａｄｅｉの均質系エレクトロ 化学ルミネセンス（ＥＣＬ）イムノアッセイ 試 料 ＥＣＬ（ｍＶ） １×１０-8Ｍルテニウム標識 ９７６ 抗マウスＩｇＧ抗体 １×１０-8Ｍルテニウム標識 ８０３ 抗マウスＩｇＧ抗体＋ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍｉｃｄａｄｅｉに結合した モノクローナル抗体 ＤＭＳＯ：Ｈ2 Ｏ（１：１） ０
【００８６】実施例１１−細菌に結合したルテニウム標
識抗体放出時のエレクトロ化学ルミネセンス増加 細菌Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｍｉｃｄａｄｅｉのホルマ
リン化懸濁液を、光学密度１．００（４２５ｎｍで）と
なるようにＰＢＳで希釈し、この懸濁液２ｍｌを円錐形
ミクロ遠心チューブに入れた。細胞を遠心し（１０分、
１０，０００ＲＰＭ）、上清を捨て、Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ ｍｉｃｄａｄｅｉに特異的なマウスモノクローナ
ルＩｇＧ抗体（１．４５ｍｇ／ｍｌ）のＰＢＳ中１：１
０希釈液（１ｍｌ）に細胞を再懸濁した。室温で１時間
インキュベートした後、前述のように細胞を遠心し、上
清を捨て、ＰＢＳ中に細胞を再懸濁して再び遠心した。
上清を捨てた後、ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧ
抗体（１ｍｌ、７．５Ｒｕ／抗体）のＰＢＳ中１：５０
希釈液に細胞を再懸濁した。室温で１時間インキュベー
トした後、前述のように細胞を遠心し、上清を捨て、Ｐ
ＢＳ中に細胞を再懸濁して前述のように遠心により２回
洗浄した。最後の洗浄の後ＰＢＳまたは１．０Ｍ酢酸−
０．９％ＮａＣｌ（生理食塩水）溶液１００μｌ中に細
胞を再懸濁し、室温で４０分間インキュベートした。遠
心後、細胞上清液１００μｌを０．１Ｍ ＴＢＡＢＦ4
及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含むＤＭＳＯ／脱イ
オン蒸留水（１：１）１０ｍｌと共に反応容器に移し
た。実施例２で述べた方法に従い、酢酸／生理食塩水細
胞上清液とＰＢＳ洗浄細胞からの上清液のエレクトロ化
学ルミネセンスを測定した。エレクトロ化学ルミネセン
スの測定値は表ＸＩに示す通りで、モノクローナル抗体
でコーティングしたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌を１．０
Ｍ酢酸−生理食塩水で処理することによって（Ｒｅｆ．
２３）ルテニウム標識ウサギ抗マウスＩｇＧをそこから
溶離させると、未結合のルテニウム標識抗体により産生
されるエレクトロ化学ルミネセンスが増加することがわ
かる。以上の結果から、ルテニウム標識抗体はモノクロ
ーナル抗体でコーティングしたＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに
結合しておりＰＢＳによる洗浄ではバックグラウンドと
比較してＥＣＬが増加しないことも示される。
【表１１】 表 ＸＩ ルテニウム標識抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でコーティ ングした細胞の上清液のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ） 溶 液 ＥＣＬ（ｍＶ） バックグラウンド対照： １．０Ｍ酢酸−生理食塩水１００μｌ １３４ ＰＢＳ洗浄細胞上清液１００μｌ １２１ １．０Ｍ酢酸−生理食塩水洗浄 ２１４ 細胞上清液１００μｌ
【００８７】実施例１２−尿中プレグナン−ジオール−
３グルクロニド（ＰＤ３Ｇ）の均質系競合イムノアッセ
イ 尿試料を既知量のエレクトロ化学ルミネセンス種で標識
したＰＤ３Ｇ及び既知量の抗ＰＤ３Ｇ抗体と、試料中に
存在するＰＤ３ＧとＰＤ３Ｇ−エレクトロ化学種とが抗
体の結合部位に対して競合するような条件下で接触させ
ることによって、プレグナン−ジオール−３−グルクロ
ニド（ＰＤ３Ｇ）を検出し定量し得る。適当な時間後、
得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス種がくり返
し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネルギー
源を直接与えることによって、電磁放射線をくり返し放
出するようになる。放出された放射線を定量し、それに
よって試料中に存在するＰＤ３Ｇの量を測定することが
できる。
【００８８】実施例１３−トリス−ルテニウムビピリジ
ル−ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステルを用いた核酸
標識 １０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
中の核酸試料（５〜２５μｇ）を熱変性させ、冷却し、
シトシン残基のエチレンジアミンによる亜硫酸水素塩触
媒アミノ基転移を４２℃で３時間行って修飾する。５ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中で１晩、外液を
３回交換して透析を行った後、試料を限外ろ過によって
１００μｌまで濃縮する。このようにして修飾した核酸
（１〜１０μｇ）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ８．５ １００μｌで希釈する。トリス−ルテニウム
ビピリジル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル誘導
体を、当該技術分野における既知の方法によってＮ，
Ｎ′ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の０．２Ｍ保存
用溶液として調製する。このエステル溶液５μｌを０．
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．５中の修飾核酸溶
液に加え、室温で１時間インキュベートする。標識した
核酸プローブを１５０ｍＭ塩化ナトリウム−１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で外液を最低３
回交換しながら透析して精製し、使用時まで４℃で保存
する。
【００８９】実施例１４−血中ヒトＴ細胞白血病ＩＩＩ
ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）の核酸ハイブリッド形成
アッセイ ウイルス粒子からＲＮＡが遊離されるよう血液を処理す
ることによって、全血中のＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスを
検出し得る。ＨＴＬＶ−ＩＩＩのＲＮＡを含む試料をＨ
ＴＬＶ−ＩＩＩのＲＮＡに相補的でエレクトロ化学ルミ
ネセンス種で標識してある一本鎖オリゴヌクレオチドプ
ローブと接触させる。適当な時間後、得られた試料にエ
レクトロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放
出し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えるこ
とによって、電磁放射線をくり返し放出されるようにな
る。放出された放射線を定量し、それによって試料中に
存在するＨＴＬＶ−ＩＩＩのＲＮＡ量を測定することが
できる。
【００９０】実施例１５−臨床試料中Ｌｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ細菌の均質系核酸ハイブリッド形成アッセイ 痰のような臨床試料中のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ細菌を、
細菌からリボソームＲＮＡが遊離されるよう痰を処理す
ることによって検出し得る。このようにして得た試料を
リボソームＲＮＡ中のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａに特異的な
配列と相補的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識し
た一本鎖オリゴヌクレオチドプローブと接触させる。適
当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセン
ス種がくり返し電磁放射線を放出し得るような電気化学
的エネルギー源を直接与えることによって、電磁放射線
をくり返し放出するようにする。放出された放射線を定
量し、それによって試料中に存在するＬｅｇｉｏｎｅｌ
ｌａ細菌の量を測定することができる。
【００９１】実施例１６−鎖置換法によってゲノムＤＮ
Ａ中に挿入したサイトメガロウイルスＤＮＡを検出する
ためのハイブリッド形成アッセイ 例えばリンパ球のような組織試料からＤＮＡが遊離さ
れ、制限酵素によってＤＮＡが切断されるよう処理する
ことで、ヒトゲノムＤＮＡ中のサイトメガロウイルス
（ＣＭＶ）ＤＮＡを検出し得る。このようにして得たＣ
ＭＶの二本鎖断片を含む試料を、ＣＭＶのＤＮＡに相補
的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識してありＤＮ
Ａ二本鎖のうちの１方を置換し得る一本鎖オリゴヌクレ
オチドプローブと接触させる。適当な時間後、得られた
試料にエレクトロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放
射線を放出し得るような電気化学的エネルギー源を直接
与えることによって、電磁放射線をくり返し放出するよ
うにする。放出された放射線を定量し、それによって試
料中に存在するサイトメガロウイルスＲＮＡの量を測定
することができる。
【００９２】実施例１７−異質法によってヒト膀胱ガン
細胞中のｒａｓ腫瘍遺伝子を検出するためのハイブリッ
ド形成アッセイ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔら（２４）によって以前に報告さ
れている方法を用いて、組織試料からＤＮＡが遊離さ
れ、制限酵素によりＤＮＡが切断され、ＤＮＡが一本鎖
となりニトロセルロース紙に結合するよう処理すること
で、ヒト膀胱ガン細胞中のｒａｓ腫瘍遺伝子を検出し得
る。一本鎖ＤＮＡが結合したろ紙をｒａｓ腫瘍遺伝子に
特異的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識したオリ
ゴヌクレオチドプローブと接触させる。適当な反応時間
後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス種がく
り返し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネル
ギー源を直接与えることによって、電磁放射線をくり返
し放出するようにする。放出された放射線を検出し、そ
れによって試料中に存在するｒａｓ腫瘍遺伝子を測定す
ることができる。
【００９３】実施例１８−エレクトロ化学ルミネセンス
ポリマーを基質とする酵素アッセイ 例えばデンブン、デキストラン、合成高分子ポリマーの
ような高分子酵素基質をエレクトロ化学ルミネセンス種
で標識し得る。標識した基質は多成分系中に存在する酵
素を検出し定量するのに使われる。また標識した基質は
抗体、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、ストレプタビ
ジン、ビオチン等と結合した酵素の量を定量するのにも
使われる。標識した基質は適当な酵素を用いて選択的に
より小さい断片へと切断し得る。どのような酵素−基質
の組み合わせでも使用できる。酵素の例としてはグルコ
シダーゼ、リアーゼ、デキストラナーゼ等が挙げられ
る。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミ
ネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し得るような電
気化学的エネルギー源を直接与えることによって、電磁
放射線をくり返し放出するようにする。放出された放射
線を定量し、それによって試料中に存在する酵素の量を
測定することができる。それぞれエレクトロ化学ルミネ
センス種で標識されている切断断片から増幅されたエレ
クトロ化学ルミネセンス信号が得られることが利点であ
る。
【００９４】実施例１９−エレクトロ化学ルミネセンス
酵素アッセイによる連鎖球菌属の検出 連鎖球菌属を含む試料を、エレクトロ化学ルミネセンス
種で標識した合成ぺプチドを含む反応液と接触させる。
合成ぺプチドはこの細菌のぺプチダーゼに特異的な基質
を用いる。ぺプチダーゼが合成ぺプチドに作用すること
によってエレクトロ化学ルミネセンス種で標識された断
片が産生される。適当な時間後、得られた試料にエレク
トロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し
得るような電気化学的エネルギー源を直接与えることに
よって、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放
出された放射線を定量し、それによって試料中に存在す
る連鎖球菌属の量を測定することができる。
【００９５】実施例２０−エレクトロ化学ルミネセンス
を利用したＢ型肝炎表面抗原の酵素イムノアッセイ Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓａｇ）を含む血液試料を、Ｈ
Ｂｓａｇに特異的でデキストラナーゼで標識した抗体と
適当な時間接触させる。ＨＢｓａｇと結合していない抗
体を除去し、抗原−抗体複合物をエレクトロ化学ルミネ
センス種で標識したデキストランと接触させる。デキス
トラナーゼが標識したポリマーに作用することによって
エレクトロ化学ルミネセンス種で標識された各断片が産
生される。適当な時間後、得られた試料にエレクトロ化
学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し得るよ
うな電気化学的エネルギー源を直接与えることによっ
て、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放出さ
れた放射線を定量し、それによって試料中に存在するＢ
型肝炎表面抗原の量を測定することができる。
【００９６】実施例２１−エレクトロ化学ルミネセンス
標識ブラジキニンを用いたブラジキニンリセプターの均
質系アッセイ ブラジキニンリセプターを含む適当な組織試料を調製
し、エレクトロ化学ルミネセンス種で標識したブラジキ
ニンと接触させる。適当な時間後、得られた試料にエレ
クトロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出
し得るような電気化学的エネルギー源を直接与えること
によって、電磁放射線をくり返し放出するようにする。
放出された放射線を定量し、それによって試料中に存在
するブラジキニンリセプターの量を測定することができ
る。このアッセイはエストロジエン−エストロジエンリ
セプターのような他のリガンド−リセプター相互作用を
測定するのにも使用できる。さらにこのアッセイは、競
合結合アッセイの形式を用いれば未標識リガンドの量を
測定、定量するのにも使用できる。
【００９７】実施例２２−核酸ハイブリッドの検出にお
けるエレクトロ化学ルミネセンス種の利用 二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖、二本鎖ＲＮＡの
ような核酸ハイブリッドを含む試料を、特に核酸ハイブ
リッドの間に挿入し得るエレクトロ化学ルミネセンス種
と接触させる。適当な時間後、得られた試料にエレクト
ロ化学ルミネセンス種がくり返し電磁放射線を放出し得
るような電気化学的エネルギー源を直接与えることによ
って、電磁放射線をくり返し放出するようにする。放出
された放射線を定量し、それによって試料中に存在する
核酸ハイブリッドの量を測定することができる。
【００９８】実施例２３−エレクトロ化学ルミネセンス
を用いた均質系イムノアッセイによる唾液中の抗体と複
合体を形成するヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ（ＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩ）抗原の検出 抗体と複合体を形成するＨＴＬＶ−ＩＩＩを含む唾液試
料を、抗原−抗体複合物を分離させるカオトロピック剤
を含む溶液と接触させる。次にこの溶液を、ＨＴＬＶ−
ＩＩＩに特異的でエレクトロ化学ルミネセンス種で標識
した抗体と接触させる。カオトロピック剤を除去し、標
識抗体、未標識抗体を再び抗原と結合させる。適当な時
間後、得られた試料にエレクトロ化学ルミネセンス種が
くり返し電磁放射線を放出し得るような電気化学的エネ
ルギー源を直接与えることによって、電磁放射線をくり
返し放出するようにする。放出された放射線を定量し、
それによって試料中に存在するヒトＴ細胞白血病ウイル
スＩＩＩ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）抗原の量を測定すること
ができる。以上の方法は肝炎抗原−抗体複合物、サイト
メガロウイルス−抗体複合物、非Ａ非Ｂ肝炎−抗体複合
物のような血清中の他の型の抗原−抗体複合物を含む試
料にも応用できる。
【００９９】実施例２４−各種Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシン類の検出、同定のためのイムノ
アッセイ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの各Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
エンテロトキシンに特異的なモノクローナル抗体とこれ
らのエンテロトキシンに対して交差反応性をもつモノク
ローナル抗体とを精製した。各抗体は、腹水をアガロー
スゲル支持担体に結合させたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓのＡたん白質カラムにかけ、モノクローナル抗体精
製法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．）の一部に基づき結合、溶出、再生緩衝液を流す
ことによって精製した。精製過程では、通常１ｍｌ当た
り５〜１５ｍｇのモノクローナル抗体を含む腹水２ｍｌ
を、２枚のＦ−１３分析紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａ
ｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）の間にＭｅｔｒｉｃ
ｅｌｌメンブランフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を入れ底においた１０ｍｌ注射器
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．）の中
に入れ、ピストンを挿入し、腹水を収集容器中にろ過す
るという予備ろ過を行った。ろ液に等量の結合緩衝液を
加え、５ｍｌのＡたん白質−アガロースカラムに重層し
た。次にカラムの試薬容器に結合緩衝液を入れ溶出を開
始した。流出画分の２８０ｎｍにおける吸光度
（Ａ280 ）をチェックし、１ｍｌずつの画分を採取し
た。Ａ280 が安定した基準値に戻ったら、カラムを結合
緩衝液５ベッド容量で洗浄し、次に溶出緩衝液を流して
精製された免疫グロブリンをカラムから溶離させた。免
疫グロブリンを中和するため、溶離画分を１Ｍトリス塩
酸ｐＨ９．０ ０．３ｍｌ中に採取した。Ａ280 が再び
安定した基準値に戻ったら、カラムを溶出緩衝液５ベッ
ド容量で洗浄し、続いて再生緩衝液１０ベッド容量、結
合緩衝液５ベッド容量で洗浄してカラムを次の精製過程
が行えるよう調整しておいた。精製された免疫グロブリ
ンを含む画分を集め、かくはん式限外ろ過器（Ａｍｉｃ
ｏｎ Ｃｏｒｐ．）を用いて濃縮した。精製された免疫
グロブリンの総たん白質をＬｏｗｒｙ法により測定した
ところ、最終濃度は５ｍｇ／ｍｌ以上であった。精製さ
れた抗体は０．１％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝
液（ＰＢＳ）中で外液を２回交換しながら４℃で４８時
間透析した。
【０１００】精製されたモノクローナル抗体の特異的エ
ンテロトキシンに対する免疫学的反応性を測定するた
め、９６穴マイクロタイター板ＥＬＩＳＡ系に分注し
た。抗体の力価として得られた値を、各抗体の以前に認
定されているロットの対照力価値と比較した。十分な力
価をもつ抗体を、判断試薬ホルダーすなわちデイップス
ティックに固定するため、あるいはイムノアッセイにお
いてプローブとして使用する酵素と結合させるための免
疫学的に機能をもつコーティング用抗体として認定し
た。抗体をニトロセルロース膜の表面に固定して膜を付
けた診断試薬ホルダー（デイップスティック）を調製す
るため、まず膜をリン酸緩衝溶液中に室温で１時間浸し
て膜の湿潤性を上げた。スティックを溶液から取り出し
膜を空気乾燥させた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの
各エンテロトキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの１つに特異的
な精製モノクローナル抗体または非特異的な対照マウス
免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
の溶液を２μｌずつ膜表面上の異なる位置に直接スポッ
トした。使用した各抗体の濃度はニトロセルロースの結
合部位を飽和し得ることが知られている濃度であった：
３Ａ抗体（Ａトキシンに特異的）２５０μｇ／ｍｌ、２
Ｂ抗体（Ｂトキシンに特異的）５０μｇ／ｍｌ、１Ｃ３
抗体（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３トキシンに特異的）３００μｇ
／ｍｌ、３Ｄ抗体（Ｄトキシンに特異的）２００μｇ／
ｍｌ、４Ｅ抗体（Ｅトキシンに特異的）２５０μｇ／ｍ
ｌ、非特異的対照マウス免疫グロブリン２００μｇ／ｍ
ｌである。デイップスティックを室温で空気乾燥させ、
膜上に残っているたん白質結合部位をブロックするため
デイップスティックを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び３％
ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝溶液中に浸した。
このブロック溶液中で一晩室温にてインキュベートした
後、スティックを空気乾燥させた。
【０１０１】精製されたモノクローナル抗体２Ａ（Ａ及
びＥトキシンに特異的）、６Ｂ（Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３
トキシンに特異的）、１Ｄ（Ｄトキシンに特異的）を酵
素アルカリ性ホスファターゼに共有結合させ、診断試薬
ホルダーのデイップスティックの膜表面に固定した抗体
に結合しているＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｄ、Ｅトキ
シンの存在を検出するための結合プローブとして使用し
た。各結合体はグルタルアルデヒドを２種類の機能をも
つ架橋試薬として用いる２段階の化学量論的に制御され
た段階によって調製した。この段階では、ＥＩＡ等級ア
ルカリ性ホスファターゼ（２５００Ｕ／ｍｇ、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．）０．４
７ｍｌを、１３．４μｌの水性グルタルアルデヒド溶液
（２５％、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）を含
む５０ｍＭリン酸カルシウム緩衝溶液ｐＨ７．２の１．
２ｍｌ中に加えた。混合物を室温で９０分間かくはん
し、酵素分子の未結合アミノ基にグルタルアルデヒドを
結合させた。インキュベーション終了後、精製されたモ
ノクローナル抗体１ｍｇ／ｍｌの濃度のものを２ｍｌ加
え、混合物をさらに９０分間かくはんし、氷冷すること
により結合反応を終結させた。結合体を０．１％アジ化
ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液中で外液を２回交換し
ながら４℃で４８時間透析した。透析後の溶液にウシ血
清アルブミンを最終濃度３％となるように加え、４℃で
の保存中に安定であるようにした。抗体−酵素結合体の
特異的エンテロトキシンに対する免疫学的反応性を測定
するため、９６穴マイクロタイター板ＥＬＩＳＡ系に分
注した。結合体の力価として得られた値を、各結合体の
以前に認定されているロットの対照力価値と比較した。
十分な力価をもつ結合体を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓエンテロトキシン類のデイップスティックアッセイ
に使用するものとして認定した。
【０１０２】ハム、ソーセージ、ヌードル、チーズ等の
ようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる食品汚染が
最も発生しやすい形の食品を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシン類のアッセイを実施するため均
質系液体懸濁液とした。典型的な抽出方法としては、食
品２０ｇに水２０ｍｌを加え、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒｌａ
ｂｂｌｅｎｄｅｒ（Ｔｅｋｍａｒ Ｃｏ）を用いて混合
物を３０秒間ホモジナイズした。より粘性の高い食品の
場合には水の容量を２倍にした。ホモジナイズの前また
は後にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシン
を食品に加えた。食品ホモジネートについて上述の診断
試薬ホルダーデイップスティックを直接使用して試験を
行った。エンドトキシンを少量加えた食品試料において
も陽性の結果が得られた。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓエンテロトキシンの検出感度を上げるため、さらに抽
出の段階を加えた。ホモジネートのｐＨを６Ｎ ＨＣｌ
を用いて通常４．５に調整し、２０，０００ｇで２０分
間遠心し、上清のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨを用いて７．５
に調整し、再び２０，０００ｇで２０分遠心し、上清を
デイップスティックアッセイに直接使用した。このよう
にして調製した食品抽出物のエンテロトキシン検出感度
は、試験した各食品中の各トキシンにつき１ｎｇ／ｍｌ
抽出物であった。牛乳のような液体食品については診断
試薬ホルダーデイップスティックを液体食品中に浸し固
体食品ホモジネートの場合と同じ方法で直接試験を実施
した。これらの食品を試験する際にも、上述のような追
加抽出段階を加えることにより感度が１ｎｇ／ｍｌにま
で上がるようにした。
【０１０３】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの個々のエ
ンテロトキシンに特異的なモノクローナル抗体を固定し
たニトロセルロース膜のついた診断試薬ホルダー（デイ
ップスティック）を、液体食品、食品ホモジネート、ま
たは上述のようにして調製した食品抽出物１ｍｌ、ある
いはＰＢＳ １ｍｌの入った試験管中に浸した。以上の
溶液にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシ
ン１ｎｇ／ｍｌまたはそれぞれ１ｎｇ／ｍｌの濃度のエ
ンテロトキシン類の混合物を加えておいた。デイップス
ティックをこれらの試料溶液中に室温で１時間、ロータ
リーシェーカーで振とうしながら浸した。その後デイッ
プスティックを試料から取り出し、０．５％Ｔｗｅｅｎ
−２０を含むＰＢＳ中で５分間、ＰＢＳ単独中で５分間
ずつさらに２回振とうした。前述のモノクローナル抗体
−アルカリ性ホスファターゼ結合体の混合物を次のよう
にして調製した：２Ａ結合体（Ａ及びＥトキシンに特異
的）、６Ｂ結合体（Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３トキシンに特
異的）、１Ｄ結合体（Ｄトキシンに特異的）の１：１０
００希釈液を同一溶液中（０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０及
び３％ＢＳＡを含むＰＢＳ３０ｍｌ中各結合体３０μ
ｌ）に調製した。この結合体混合物中にデイップスティ
ックを浸し（ステイック１本当たり２ｍｌ）、室温で振
とうしながら３０分間インキュベートした。デイップス
ティックをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で２回、ＰＢＳ中で３
回、１回当たり５分間ずつ振とうしながら洗浄し、膜表
面から未結合のモノクローナル抗体−アルカリ性ホスフ
ァターゼ結合体を除去した。
【０１０４】未結合のモノクローナル抗体−酵素結合体
を診断試薬ホルダーデイップスティックから除去した
後、デイップスティックを５−ブロモ−４−クロロイン
ドリルホスフェート（ＢＣＩＰ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．）及びニトロブル−テトラゾリウム
（ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を
含む溶液中に浸し、結合した結合体の存在を検出した。
ＢＣＩＰ及びＮＢＴ溶液はそれぞれ次のようにして調製
した：３．２ｍｇのＢＣＩＰを０．１Ｍトリス塩酸、
０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 溶液１０ｍｌ
に、８．８ｍｇのＮＢＴを同溶液１０ｍｌに溶解した。
これらの溶液は使用直前に混合した。デイップスティッ
クを基質混合物中に室温で３０分間振とうしながら浸
し、その後水で洗浄して空気乾燥させ、アッセイの結果
が永久に記録されるようにした。本アッセイの全過程を
通じてピペット操作はほとんどあるいは全く必要なく、
処理時間も最小限ですみ、約２時間で終了することがで
きる。酵素結合体の基質であるＢＣＩＰは膜上のトキシ
ンに結合した結合体によって加水分解され、ＮＢＴを還
元してデイップスティック上の膜に結合する不溶性の青
色物質とし得る反応産物を産生する。試料中にＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンが存在し膜上に
固定された第１モノクローナル抗体に結合して第２モノ
クローナル抗体−酵素結合体と結合することによって検
出されていれば、ニトロセルロース膜上に青色スポット
が出現し指示される。試料中にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシンが存在しない場合は、ニトロセ
ルロース膜は白色のままである。対照のマウス免疫グロ
ブリンを固定した位置の膜も各場合共白色のままであっ
た。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの各Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓエンテロトキシンに特異的なモノクローナル抗体を
固定した膜上の明確に区別し得る位置に青色スポットが
出現することによって、特定のエンテロトキシンが同定
される。診断試薬ホルダーデイップスティックを使用す
る本方法により、液体食品、食品ホモジネート、食品抽
出物中の１種類あるいは複数のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓエンテロトキシン類を１ｎｇ／ｍｌの量まで検出
することが可能である。
【０１０５】実施例２５−大腸菌型細菌の酵素イムノア
ッセイ（ＥＩＡ） 本発明の方法（ＣＡＰ−ＥＩＡ ＭＰＮ）と４４．５℃
においてＥＣブロスを使用するＥＰＡによって承認され
ているＭＰＮ確認試験の方法との便中大腸菌型の検出効
率を比較するための実験を行った。実験は標準５−バイ
アルＭＰＮアッセイに以下の変更を加えて実施した。硫
酸ラウリルトリプトースブロス（ＬＳＴ、Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）の代わりに、４−メ
チルウンベリフェロングルクロニド（ＭＵＧ，Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）８０μｇ／ｍｌを含むフェノールレッド乳糖ブロス
（ＰＲＬＢ，Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，
ＭＩ）を推定用培地として使用した。
【０１０６】フェノールレッド染色剤によって乳糖の発
酵により産生される酸を検出し得るため、ＰＲＬＢを選
択した。乳糖発酵により得られた気体は、各バイアル中
に挿入した倒立Ｄｕｒｈａｍバイアルに集気した。Ｅ．
ｃｏｌｉの存在を予備的に確認するための選択薬剤とし
てＭＵＧを用いた。便中の主要大腸菌型であるＥ．ｃｏ
ｌｉは、ＭＵＧを切断しＵＶ光線下で見える蛍光性ラジ
カルを遊離させることのできる水中に存在する唯一の細
菌である（４、１０）。ＣＡＰ−ＥＩＡ ＭＰＮアッセ
イ方法によって次の３種類のデータが得られる：１）乳
糖の発酵による酸及び気体の産生（推定大腸菌型アッセ
イ）、２）ＭＵＧの切断による蛍光（Ｅ．ｃｏｌｉまた
は便中大腸菌型の推定確認）、３）ＣＡＰ−酵素イムノ
アッセイ確認（モノクローナル抗体を利用した確認試
験）。次にＭＵＧ及びＣＡＰ−ＥＩＡ反応の結果を、Ｅ
Ｃブロス（Ｄｉｆｃｏ．Ｌａｂｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）を用いた４４．５℃の高温下での乳糖発酵に基づく
標準方法（１）による結果と比較した。実験は次のよう
にして行った：ＭＰＮアッセイに必要な３種類の１０倍
希釈系列を作るため、付近の河川から採取した水試料を
以下に示す容量で、ＰＲＬＢ−ＭＵＧ １０ｍｌを含み
バイアルキャップの内側にポリスチレン製穴のついたバ
イアルに接種した。
【０１０７】系列Ａ−５バイアル、１．００ｍｌ接種 系列Ｂ−５バイアル、０．１０ｍｌ接種 系列Ｃ−５バイアル、０．０１ｍｌ接種 その後バイアルをすべて３５℃で約１８〜２０時間イン
キュベートした。次の日すべてのバイアルについて酸及
び気体の産生、ＵＶ光線下での蛍光を試験した。酸また
は気体の反応の有無にかかわらず、濁度（増殖）の見ら
れたバイアルはすべて倒立させ、細胞−培地懸濁液がキ
ャップ内側のポリスチレン製穴を満たすようにした。倒
立させたバイアルを３５℃で１時間インキュベートし、
細菌（抗原）をポリスチレン製キャップ穴に付着させ
た。次にキャップ穴に結合した抗原をバイアルから除去
し、抗体を用いる確認試験を続けた。
【０１０８】アッセイのＥＩＡ（酵素イムノアッセイ）
の部分を行うため、穴をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、Ｎａ
Ｃｌ ８．５ｇ、Ｎａ2 ＨＰＯ4 １．０２ｇ、ＮａＨ
2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ ０．３８６ｇ、蒸留水で１０００ｍ
ｌとする、ｐＨ７．２）中のウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）３％溶液で３５℃、３５分間処理し、
ポリスチレン上の未結合部位をすべてブロックした。Ｂ
ＳＡ溶液を捨てた後すぐにＰＢＳで穴を２回洗浄し、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に対するモノクローナル抗体を含むハ
イブリドーマ細胞上清を各穴に５０μｌずつ加え、３５
℃で１時間インキュベートして抗体をポリスチレンに結
合した特異的抗原（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）と相互作用させ
た。抗体上清を捨てた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液
（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋ
ｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂ
ｕｒｇ，ＮＪ）を用いて穴を３回洗浄し、未結合抗体を
完全に除去した。親和性カラムで精製したアルカリ性ホ
スファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（結合体、Ｋ
ＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）をＰＢＳで
１：１０００に希釈し、各穴に５０μｌずつ加えた。３
５℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ２０溶液を用いて穴を４回洗浄し未結合の結合体をす
べて除去した。検出に使用するアルカリ性ホスファター
ゼの基質は、パラニトロフェニルリン酸ナトリウムまた
はＳｉｇｍａ−１０４基質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１０％ジエ
タノール−アミン緩衝溶液（ジエタノールアミン９７ｍ
ｌ、ＮａＮ3 ０．２ｇ、ＭｇＣｌ2 ６Ｈ2 Ｏ １００
ｍｇ、蒸留水８００ｍｌ、ｐＨ９．８）中に最終濃度１
ｍｇ／ｍｌとなるよう溶解したものを用いた。基質を各
穴に１００μｌずつ加え、３５℃で３０分間インキュベ
ートした後各穴中の反応を肉眼で観察した。本実施例に
おける定量の目的のためには、反応した基質溶液をマイ
クロタイター板に移し、４０５ｎｍフィルターをつけた
Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ（Ｆｌｏｗ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｃｌｅａｎｓ，ＶＡ）を用
いて機器測定を行った。
【０１０９】ＥＣブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｓ，Ｄｅ
ｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を使用した便中大腸菌型の従来型確
認試験を行うため、ＰＲＬＢ中での各一晩培養液からの
増殖菌を一白金耳ずつ、１０ｍｌのＥＣブロスを含み倒
立Ｄｕｒｈａｍバイアルを入れた試験管中に無菌的に移
した。試験管を標準方法（１）に従い４４．５℃で２４
〜４８時間インキュベートした後、乳糖発酵の有無を検
出した（Ｄｕｒｈａｍバイアル中に採取された気体によ
って）。バイアル内に少しでも気泡の見られたものは陽
性反応と認めた。各実験のデータの概要は表ＸＩＩ及び
ＸＩＩＩに示す通りである。
【０１１０】実験１の結果から、乳糖からの気体産生に
基づく陽性の組み合わせは５５１であり、ＭＰＮ統計表
によると３５大腸菌型／ｍｌである（推定試験）。気体
産生陽性（＋）バイアルのうちＭＵＧアッセイで陽性だ
ったのはわずか４本（Ａ２〜Ａ５）でありＥ．ｃｏｌｉ
の含まれていた可能性が高い（Ｅ．ｃｏｌｉまたは便中
大腸菌型の推定確認）。確認試験データのうち従来型Ｅ
Ｃ試験では５本の試験管（Ａ１〜Ａ５）が便中大腸菌型
陽性であったのに対し、ＣＡＰ−ＥＩＡ法では陽性反応
を示したのは４バイアル（Ａ２〜Ａ５）のみであった。
ＥＩＡの陽性測定値は０．５５から１．０６までの範囲
であり、陰性測定値は０．２０付近であった。ＥＩＡ試
験とＭＵＧ試験のデータでは共に同じバイアルＡ２〜Ａ
５で便中大腸菌型の存在が示されているため、ＥＩＡの
陽性データはＭＵＧの陽性データによって強く裏付けら
れている。従来型ＭＰＮ法（１５、１６、２０）では
（＋）の誤判断及び（−）の誤判断の発生率が高いた
め、バイアルＡ１がＭＵＧ及びＥＩＡでは陰性でＥＣで
は陽性であったという事実も驚くべきことではない。Ｅ
Ｃ培地では高温度でのインキュベーションによって選択
性が変わり便中大腸菌型の回収率に影響することが知ら
れている。また便中大腸菌型（Ｅ．ｃｏｌｉ）のうち約
７％はＥＣにおいて気体を産生せず（陰性の誤判断）、
非便中大腸菌型のうち８％はＥＣブロス中でも増殖し気
体を産生し得る（陽性の誤判断）ことが知られている。
すなわち試験管Ａ１中で身られたＥＣ反応は誤判断の陽
性反応である可能性があり、ＭＵＧ及びＥＩＡのＡ１に
関する結果との不一致の原因となっていると思われる。
同実験中の他のバイアル（Ｂ１〜Ｂ５、Ｃ１〜Ｃ５）に
ついては、すべての試験においてよい相関関係が見られ
た。言い換えれば、ＭＵＧで（−）であったバイアルは
ＥＣでもＥＩＡでも（−）であり、これらのバイアル中
には便中大腸菌型が存在しないことが確認できた。
【０１１１】実験２においてはバイアルに接種した水試
料は、推定試験における全試験管で気体産生が陽性であ
ったため、さらに強く汚染されていたといえる。ＭＰＮ
統計表による陽性の組み合わせは５５５であり２４０大
腸菌型／ｍｌ以上が存在することが示された。確認試験
を比較すると、ＭＵＧ、ＥＣ、抗体利用ＥＩＡの間には
よい相関関係が見られた。蛍光を示した（ＭＵＧ＋）バ
イアルはすべてＥＣ及びＥＩＡでも陽性であった。ＥＩ
Ａ反応の測定値はやや弱い陽性０．４６（Ｂ２）からＣ
４で見られた非常に強い反応２．１５までの範囲であっ
た。
【０１１２】以上の２つの実験結果から、本発明におけ
る抗体利用ＣＡＰ−ＥＩＡ試験は便中大腸菌型の存在を
確認するＥＰＡの承認したＥＣ試験と同様に有効である
ことが示されている。さらにバイアルＡ１の例で見られ
るように、ＣＡＰ−ＥＩＡ試験は抗体−抗原反応の特異
的性質を利用しているため陽性または陰性の誤判断がよ
り少ない。またＣＡＰ−ＥＩＡ試験は従来型ＭＰＮ試験
に比べていくつかの顕著な利点をもっている。すなわ
ち：１）簡便さ−推定試験及び確認試験共同一のバイア
ルを用いて行うことができ、液を移したり他の培地を使
用する必要がない。２）迅速さ−ＣＡＰ−ＥＩＡ試験は
従来型試験に要する時間の１／３から１／２の時間で完
了できる。３）特異性−抗体はその抗原標的に対して高
度に特異的である。以上の利点に加えてＣＡＰ−ＥＩＡ
のキャップ穴は同一バイアルから４種類の独立したデー
タ（酸、気体、蛍光、ＥＩＡ）が得られるような独自の
デザインとなっており、水及び／または食品試料中の大
腸菌型及び便中大腸菌型を分析するための従来型ＭＰＮ
試験よりもはるかに優れた代替法である。バイアルまた
はポリスチレン挿入物を含む試験管キャップを用いてＥ
ＩＡを実施するという構想は大腸菌型または便中大腸菌
のアッセイに限定されるものではなく、他の細菌の検出
にも同様に応用し得るものである。
【０１１３】実施例２６ ２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−プロピル〕−１，３−ジオキソランの合成 不活性なアルゴンで気体を置換した６００ｍｌの三頸フ
ラスコに、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３０ｍｌ
と乾燥ジイソプロピルアミン７．６５ｍｌ（５４．６ｍ
ｍｏｌ）を、注射器を用いて攪拌しながら添加した。
低位型ビーカー中、ドライアイス−イソプロパノールの
混合物にフラスコを浸して、溶液を−７８℃に冷却し
た。フラスコに２．５Ｍｎ−ブチルリチウム２１．６ｍ
ｌ（５４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。この溶液を
１５分間攪拌し、ＴＨＦ３００ｍｌに溶解した４，４′
−ジメチル−２，２′−ビピリジン９．５８ｇ（５２ｍ
ｍｏｌ）の溶液を、カニューレを用いて攪拌しながら、
１時かけて滴下して加えた。生じた褐色の混合物をさら
に−７８℃で２時間攪拌し、２−（２−ブロモメチル）
−１，３−ジオキソラン１０ｇ（５５ｍ ｍｏｌ）を、
注射器を用いて添加し、生じた混合物を、−７８℃で５
時間攪拌した。その後反応容器を氷浴中（１０℃）に置
き、３０分経過すると色が変化し始めた（１時間後に
は、濃紫色となり；２時間後には、青色となり；２．５
時間後には、緑色となり；３．２５時間後には、レモン
イエローとなった）。
【０１１４】反応混合物に、飽和ＮａＣｌ ３０ｍｌを
添加し、その後、水１０ｍｌとエーテル５０ｍｌを添加
して反応を止めた。水相をエーテル３００ｍｌで２度抽
出し、エーテル層を合併して水１００ｍｌで逆抽出し、
無水硫酸ナトリウムで乾燥した。反応生成物を精製する
ために、活性度ＩＩＩで、中性のアルミナ（メルク）９
０を用いてサンプルを分離した。溶出溶媒としては、石
油エーテル／ジエチルエーテル（２：１）を用い、その
後石油エーテル／ジエチルエーテル（１：１）を用いた
（原料は、石油エーテル／ジエチルエーテル（２：１）
で完全に溶出され、生成物は、その後溶出された）。プ
ロトンＮＭＲ解析により、単離した反応生成物の構造
は、以下に示すものであることを確認した。
【０１１５】
【化４５】 実施例２７ ４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−
ビピリジンの合成及び精製 ２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−プロピル〕−１，３−ジオキソラン２ｇを、
１Ｎ ＨＣｌ ５０ｍｌに溶解し、５０℃で２時間加熱
した。この溶液を冷却し、炭酸水素ナトリウムでｐＨ７
〜８に調節し、クロロホルム１００ｍｌで２度抽出し
た。クロロホルム層を合併して少量の水で洗浄し、硫酸
ナトリウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレータ
ーで蒸発すると黄色のオイル状物質を与えた。この黄色
のオイル状物質を、酢酸エチル／トルエン（１：１）を
溶出溶媒として用いるシリカゲルカラムで精製し、不純
物はメタノールで溶出した。プロトンＮＭＲ解析〔δ
１．９６−２．１１（ｍ，２Ｈ）；２．４３（ｓ，３
Ｈ）；２．４６−２．５０（ｔ，２Ｈ）；２．５３−
２．８０（ｍ，２Ｈ）；７．１２−７．１４（ｍ，２
Ｈ）；８．１７−８．１２（ｂｒ．ｓ，２Ｈ）；８．５
２−８．５８（ｍ，２Ｈ）；９．８９（ｓ，１Ｈ）〕に
より、反応生成物の構造は、以下の通りであることを確
認した。
【化４６】
【０１１６】実施例２８ ４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）酪酸の合成 ４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−
ビピリジン０．５ｇ（２．０ｍ ｍｏｌ）を無水アセト
ン１０ｍｌに溶解した。この溶液に、微粉にした過マン
ガン酸カリウム２２５ｍｇ（ＫＭｎＯ4 ；１．４２ｍ
ｍｏｌ）を少量ずつ攪拌しながら添加した。この反応を
薄層クロマトグラフィー（シリカ；酢酸エチル／トルエ
ン５０：５０）により追跡すると、アルデヒドが徐々に
消失していき、Ｒf 値の低いビピリジンが生成すること
が指摘された。
【０１１７】反応が完了した後に水を添加し、ＭｎＯ2
を濾過し、Ｎａ2 ＣＯ3 （水溶液）少量ずつを用いて洗
浄した。アセトンを回転式エバポレーターで蒸発し、残
留物をＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出して非酸性ビピリジンを除去
した。０．１ＮのＨＣｌを注意深く添加することにより
水溶液を酸性としてｐＨ４．８とした。このｐＨに達す
ると溶液は部分的に懸濁し、これよりも低いｐＨでは懸
濁液は再び溶解した。この混合物を等量のＣＨ2 Ｃｌ2
で５回抽出し、Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥し、回転式エバポレ
ーターで蒸発するとオイル状物質を与えるが、この物質
は、減圧下では急速に固化した。この粗製の固体をクロ
ロホルム：石油エーテルから再結晶して、白色の結晶を
得た。融点：１０３．５℃−１０５．５℃；ＩＲ：１７
０４ｃｍ-1。プロトンＮＭＲ解析は、以下の構造と一致
した。
【化４７】
【０１１８】実施例２９ ビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−１−ア
ル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウ
ム（ＩＩ）２過塩素酸塩：化合物Ｉの合成 エチレングリコール５０ｍｌ中のルテニウムビピリジル
ジクロリド２水塩２５０ｍｇ（０．４８ｍ ｍｏｌ）
（Ｓｔｒｅｍ）を急速に加熱して沸騰させ、その後シリ
コン油浴（１３０℃）に浸した。生じた赤紫色〜オレン
ジ色の溶液に、２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソ
ラン１５０ｍｇ（０．５３ｍ ｍｏｌ）のエチレングリ
コール１０ｍｌ溶液を添加した。得られたオレンジ色溶
液を１３０℃で３０分間攪拌し、冷却して室温とし、蒸
留水で１：１に希釈した。この溶液に、過塩素酸ナトリ
ウムの濃水溶液を添加すると、非常に微細なオレンジ色
の沈殿を生じた。この混合物を一夜冷蔵し、濾過し、沈
殿を水で洗浄した。この沈殿を湯に溶解し、過塩素酸を
添加して再結晶を行うと、鮮明なオレンジ色をした結晶
を生成した。その後、結晶を濾過し、冷水で洗浄し、乾
燥した。この再結晶操作をくり返すと、総量１５０ｍｇ
の鮮明なオレンジ色の結晶を与えた。ＮＭＲ解析は、以
下の構造を示した。本実施例においては、上で同定した
化合物は、化合物Ｉであると見なされる。
【化４８】
【０１１９】実施例３０ ビス（２，２′−ビピリジン）〔４−（４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４′−イル）酪酸〕ルテニウム
（ＩＩ）ジヘキサフルオロフォスフェート：化合物ＩＩ
の合成 ４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）酪酸１３４ｍｇ（０．５２ｍ ｍｏｌ）を、水１５
０ｍｌに溶解した。この溶液をアルゴンで脱気し、ルテ
ニウムビピリジルジクロリド２水塩（Ｓｔｒｅｍ）２５
０ｍｇ（０．４８ｍ ｍｏｌ）を添加した。この混合物
をアルゴン気流下で４時間還流した。水を回転式エバポ
レーターで蒸発し、残留物を最少量の水に再溶解し、Ｓ
Ｐ−２５−セファデックスイオン交換カラムにかけた。
水で不純物を溶出した後に、０．２ＭＮａＣｌ溶液を用
いて化合物を赤色帯として溶出し、ＮＨ4 ＰＦ6 の飽和
水溶液を添加することにより、ヘキサフルオロホスフェ
イトとして単離した。粗生成物を、熱アセトン−ジエチ
ルエーテルから２度再沈殿させた。元素分析：計算値；
Ｃ，４３．８０％；Ｈ，３．３６％；Ｎ，８．７６％。
測定値；Ｃ，４３．８２％；Ｈ，３．５４％；Ｎ，８．
５５％。プロトンＮＭＲの解析は、以下の構造と一致し
た。
【化４９】
【０１２０】実施例３１ Ｎ−〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−ブチル〕−フタルイミドの合成 不活性なアルゴンの気流下に、乾燥テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）３０ｍｌ及び乾燥ジイソプロピルアミン７．
６５ｍｌ（５４．６ｍｌ）を、６００ｍｌの三頸フラス
コに、注射器を用いて攪拌しながら添加した。低位型ビ
ーカーに入れたドライアイス−イソプロパノール混合物
にフラスコを浸すことにより、この溶液を、−７８℃に
冷却した。２．５Ｍｎ−ブチルリチウム２１．６ｍｌ
（５４ｍｍｏｌ）をゆっくりとフラスコに添加した。得
られた溶液を１５分間攪拌し、４，４′−ジエチル−
２，２′−ビピリジン９．５８ｇ（５２ｍ ｍｏｌ）の
乾燥ＴＨＦ３００ｍｌ溶液を、カニューレを介して、攪
拌しながら１時間かけて滴下した。
【０１２１】生じた褐色の混合物をさらに−７８℃で２
時間攪拌し、１，３−ジブロモプロパン１００ｇ（０．
４９５ｍｏｌ）を急速に添加し、得られた混合物を−７
８℃で１時間攪拌した。その後、この混合物を室温で２
時間攪拌した。混合物の色調は、褐色から青、さらに黄
色へと変化した。殆んどの溶媒を回転式エバポレーター
で蒸発し、水２００ｍｌを添加すると二層となった。濃
塩酸を添加してｐＨを０に下げた。有機溶媒層を廃棄し
た。水層を１００ｍｌのエーテルで２度洗浄した。ｐＨ
を１〜２に上げた。赤色のオイル状物質を分離し、ＣＨ
2 Ｃｌ2 に抽出した。この溶液を無水Ｎａ2 ＣＯ3 で乾
燥した後に、殆んどのＣＨ2 Ｃｌ2 を回転式エバポレー
ターで蒸発し、サンプルをシリカゲルカラムにかけた。
クロロホルムでサンプルを溶出すると、淡黄色のオイル
状物質を与えた。この物質は、一夜冷却すると結晶化し
た（１２．３７ｇ）。
【０１２２】この様にして合成した４−（４−ブロモブ
チル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジンの粗結晶
４ｇ（１３．３ｍ ｍｏｌ）を、その後フタルイミドカ
リ２．４６ｇ（１３．３ｍ ｍｏｌ）のジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）６０ｍｌ懸濁液に添加した。その後、
この混合物を約５０℃で２時間攪拌した。この混合物に
ＣＨＣｌ3 ９０ｍｌを添加し、さらに水１２５ｍｌを添
加した、ＣＨＣｌ3 層を分離し、水層をクロロホルム５
０ｍｌで２度抽出した。ＣＨＣｌ3 層を合併して水５０
ｍｌで洗浄し、無水Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥し、回転式エバ
ポレーターで蒸発すると、淡橙色のオイル状物質を与
え、この物質は一夜の間に固化した。この粗生成物をア
セトン／エタノールから再結晶すると、白色結晶（融
点、１１４．５−１１７．８℃）２．２１ｇ（４４．５
％）を与えた。元素分析：計算値；Ｃ，７４．３８％；
Ｈ，５．７０％；Ｎ，１１．３１％。測定値；Ｃ，７
３．９８％；Ｈ，６．１４％；Ｎ，１１．２８％。Ｉ
Ｒ：フタルイミドカルボニル伸縮１７７１及び１７０４
ｃｍ-1。プロトンＮＭＲの解析では、アロマティック共
鳴（δ７．５７−７．８５，ｍ，４Ｈ）と通常のビピリ
ジル誘導体のシグナルを示した。これらのデータは、以
下の構造と一致する。
【化５０】
【０１２３】実施例３２ テオフィリン−８−ブチリック−〔４−（４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４−イル）−ブチル〕アミド：
化合物ＩＩＩの合成 Ｎ−〔４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−イル）−ブチル〕−フタルイミド３７０ｍｇ（１ｍ
ｍｏｌ）をエタノール１０ｍｌ中で泥状にし、包水ヒド
ラジン（７２０ｍｇ、１．４ｍ ｍｏｌ）で処理し、攪
拌し、４時間還流すると、この間に固体はすべて溶解し
た。この反応の終末に向って、白色の沈殿が生成し始め
た。冷却した後に、この反応混合物を５０％ＮａＯＨで
塩基性とし、水１００ｍｌに注加した。溶液を得た後に
Ｎａ2 ＣＯ3 を添加し、生成物をオイル状物質として塩
析した。ＣＨ2 Ｃｌ2 ４０ｍｌずつを４回用いてアミン
を抽出した。抽出物をＣａＳＯ4 で乾燥し、濾過し、蒸
発するとアミノビピリジン誘導体を無色のオイル状物質
として与えた（収量＝０．１３５ｇｍ；５６％）。４−
〔４−（１−アミノブチル）〕−４′−メチル−２，
２′−ビピリジン１．３４ｇ（５．６ｍ ｍｏｌ）及び
テオフィリン−８−酪酸（１．１８ｇ；４．４ｍ ｍｏ
ｌ）を室温で乾燥ピリジン１０ｍｌ中に溶解した。この
溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．１６ｇ
（５．６ｍ ｍｏｌ）を添加した。室温で一夜攪拌をし
続けた。アルミナの薄層クロマトグラフィー（移動相＝
１５％メタノール／クロロホルム）を行ったところ、Ｒ
f ０．６８の単一生成スポットを示した。沈殿したジシ
クロヘキシル尿素を濾過して除去し、ピリジンを留去す
ると固体を与えるが、これをエーテル中でトリチュレー
トし、濾過した（収量＝２．１３ｇ；９９％）。
【０１２４】実施例３３ ビス（２，２′−ビピリジン）〔テオフィリン−８−ブ
チリック−４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−
４′−イル）−ブチルアミド〕ルテニウム（ＩＩ）ジク
ロリド：Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体の合成 上述の化合物ＩＩＩ１７５ｍｇ（０．３５７ｍ ｍｏｌ
ｅｓ）及びビス−（２，２′−ビピリジン）ルテニウム
（ＩＩ）ジクロリド２水塩１５４ｍｇ（０．２９６ｍ
ｍｏｌｅｓ）の混合物に、エタノール／Ｈ2 Ｏ（１：
１，ｖ／ｖ）４０ｍｌを添加した。この混合物を暗所で
１５分間アルゴンで脱気し、アルゴン気流下暗所で３時
間還流すると、澄明なチェリーレッドの溶液を与えた。
生じた澄明なチェリーレッドの溶液を室温に冷却し、回
転式エバポレーターを用いて、３７℃以下の暗所で溶液
を維持しつつ溶媒を除去した。得られた残留物を約３ｍ
ｌのメタノールに溶解し、セファデックスＬＨ−２０ク
ロマトグラフィーカラム（７５ｃｍ×３ｃｍ）にかけ、
約０．４−０．７ｍｌ／ｍｌの流速で溶出した。鮮明な
赤色のバンド（生成物）には、褐色の非蛍光バンド（不
純物）と、２個の蛍光バンドが接近して続いていた。赤
色の生成物バンドには、褐色の非蛍光バンドからの少量
の不純物が混入していることが判明した。この混入物
は、同様の条件下の２度目のセファデックスＬＨ−２０
カラムにサンプルをかけることにより、生成物から分離
した。回転式エバポレーターで溶媒を蒸発することによ
り赤色の生成物を得た。得られた固体物質を約１ｍｌの
メタノールに溶解し、約７５ｍｌのジエチルエーテル中
で再沈殿させるとオレンジ色の粉末を与え、これを濾取
した。元素分析：計算値；Ｃ，５４．５１％；Ｈ，５．
７２％；Ｎ，１３．９９％；Ｏ，１０．４７％；Ｃｌ，
６．４４％。測定値；Ｃ，５５．０４％；Ｈ，６．３５
％；Ｎ，１３．１８％；Ｏ，１０．６２％；Ｃｌ，６．
６８％。
【０１２５】実施例３４−テオフィリンに対して特異的
な抗体を用いたＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体によ
り生ずるエレクトロルミネセントシグナルの変調 実施例３３で述べたこのＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結
合体を０．３５Ｍフッ化ナトリウムを含むｐＨ６．０の
０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＦ緩衝液）で最終濃度が１
５０ｎＭになるまで希釈した。テオフィリンに対し特異
的なモノクローナル抗体（クローン番号９−４９、腹水
ロット番号ＷＯ３９９、ｃａｔ ｎｏ．０４６）をＫａ
ｌｌｅｓｔａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．
（Ｃｈａｓｋａ，ＭＮ）より入手した。このモノクロー
ナル抗体をＰＢＦ緩衝液を用いて様々な濃度に希釈した
（１ｍｌ中のタンパク質が２１．９μｇから７００μｇ
の範囲）。テオフィリンに反応しないもうひとつのモノ
クローナル抗体（対照ＭＡＢ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌ
ｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手し、ＰＢＦ緩衝液を用いて１
ｍｌ中のタンパク質が２１．９μｇから７００μｇまで
の様々な濃度に希釈した。テオフィリンの標準溶液をＡ
ｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．より入手した
テオフィリン（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ネコ番号２
６−１４０−８、Ｍ．Ｗ．１８０．１７）を用いて調製
した。テオフィリンはＰＢＦ緩衝液中に最終濃度が７５
μＭとなる様に溶かし、アッセイに使用する為にＰＢＦ
緩衝液で６μＭにまで希釈した。エレクトロ化学ルミネ
セントの測定を実施するに先立ち２５０ｍＭのシュウ酸
と５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む溶液
（ＥＣＩ溶液）を反応混合物に添加した。測定は反応溶
液を含む試験管に２つの白金ガーゼ電極を取り付けられ
る様に改良されたＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターを用
いて行なった。この電極をポテンショスタットに接続
し、エレクトロ化学ルミネセンスの測定は走査速度５０
ｍＶ／ｓｅｃで１．５から２．０ボルトまでこの電極間
の印加電圧を変化させる事により実施した。この測定に
使われたＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターには高利得の
赤感性光電子倍増管が付いていた。このルミノメーター
の記録計への出力は１０5 ｃｏｕｎｔｓ／ｖｏｌｔに合
わせた。この測定値はＸ−Ｙ−Ｙ′記録計に記録され、
このピーク高をエレクトロ化学ルミネセンスの測定値と
して用いた。この電極は測定と測定の間に０．１Ｍリン
酸、００．１Ｍクエン酸、０．０２５Ｍシュウ酸、及び
１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むｐＨ４．２の緩衝液
ですすぎ、この溶液中でこの電極に＋２．２から−２．
２ボルトの間の電流を６０秒間パルスとして流し、続い
て＋２．２ボルトを１０秒間流す事によりきれいにす
る。次にこの電極をこの溶液から取り出し、蒸留水中で
すすぎ、水気を拭きとって乾かす。この実験は表ＸＩＶ
に概略を示したとおりに実施した。
【０１２６】対照のモノクローナル抗体の溶液、テオフ
ィリンに対する抗体の溶液、又はＰＢＦ緩衝液を一組の
試験管に注いだ（ステップ１）。この試験管にテオフィ
リン溶液又はＰＢＦ緩衝液を加えた（ステップ２）。こ
の溶液を試験管を簡単に振る事で混合し、室温で２５分
間反応させた。その後Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合
体の溶液をこの試験管に加えた（ステップ３）。この試
験管を振り、室温で１５分間放置した。最後にこのＥＣ
Ｌ溶液１００μｌを各々の試験に添加し、上述の様にエ
レクトロ化学ルミネセンスを測定した。この結果は表Ｘ
Ｖに示した。
【表１２】 或いは 或いは
【表１３】 表 ＸＶ Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役物のエレクトロ化学ルミネ センスに対する抗体とテオフィリンの影響 抗テオフィリン 抗体タンパク質 対照ＭＡＢ＋ 抗テオフィリン MAB ＋テオフィ 濃度 Ｒｕ（ＩＩ）− MAB + Ru(II)− リンRu(II)−化 （μｇ／試験管） 化合物ＩＩＩ 化合物ＩＩＩ 合物ＩＩＩ ルミネッセンスの測定値 ２．１９ ５５，０００ ４０，０００ ４３，０００ ５５，０００ ４１，０００ ５７，０００ ４．３８ ５７，０００ ２２，５００ ３７，０００ ５７，０００ ２５，０００ ３６，０００ ８．７５ ５３，０００ ２０，０００ ３３，５００ ５０，０００ ２２，０００ ３０，５００ ３５．０ ４３，０００ １３，５００ １７，５００ ４１，０００ １４，０００ １６，０００ ７０．０ ４２，０００ １１，０００ １１，０００ ３７，５００ １２，０００ １２，５００
【０１２７】重複試料のエレクトロ化学ルミネセンスを
上述した様に測定した。上の実験で用いたＲｕ（ＩＩ）
−化合物ＩＩＩ結合体のエレクトロ化学ルミネセンスは
抗体を添加しない緩衝液中で測定した際５７，２００で
あった。緩衝混合液に対するバックグラウンドは５７５
０であった。このデータはルテニウム化合物が付着した
テオフィリン類似体、即ちＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ
と接触した際、特異的にテオフィリンを認識するモノク
ローナル抗体はそのエレクトロ化学ルミネセンスを減じ
るであろう事を示している。エレクトロ化学ルミネセン
スの減少量はＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体の濃度
を一定に保った場合、抗体の濃度に比例する。テオフィ
リンと反応しない抗体を使用する場合は抗体が高い濃度
でもエレクトロ化学ルミネセンスはわずかに減少するだ
けである。このデータはまた、テオフィリンを抗テオフ
ィリン抗体に接触させた後、Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩ
Ｉ共役物を混合物に加えた場合、エレクトロ化学ルミネ
センスの量はより大きくなる事も示している。この事は
テオフィリンは抗体の結合に関してＲｕ（ＩＩ）−化合
物ＩＩＩ共役物と競合しその結果としてエレクトロ化学
ルミネセンスを生じるＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合
体が大量に得られる。
【０１２８】実施例３５−ホモジニアス エレクトロ化
学ルミネセント イムノアッセイに基づいた血清中のテ
オフィリンのアッセイ 実施例３４で述べた結果に基づいてテオフィリンに対す
るホモジニアスイムノアッセイ法を競合結合の型につい
ての実施例３３で述べたテオフィリンとこのＲｕ（Ｉ
Ｉ）−化合物ＩＩＩ結合体に対する抗体を用いて開発し
た。材料は０．１Ｍフッ化ナトリウムを含むｐＨ６．０
の０．１Ｍリン酸緩衝液を除き実施例３４で述べた物と
同じであった。このアッセイに対してはテオフィリンに
対するモノクローナル抗体の濃度を特別に選択した。こ
の抗体濃度は５５μｇ／ｍｌであった。このＲｕ（Ｉ
Ｉ）−化合物ＩＩＩ結合体の濃度は１７５ｎＭに調整し
た。テオフィリンをヒト血清に最終濃度が１ｍｌの血清
当り２．５、５、１０、２０、及び４０マイクログラム
となる様に加えた。アッセイは１０μｌの血清を２９０
μｌの抗テオフィリンモノクローナル抗体に加え、室温
で２５分間放置する事により行なった。次に１００μｌ
のＲｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役物を各々の試験管に
最終濃度が３５ｎＭになる様に加え、この溶液を室温で
１５分間放置した。実施例３４で述べたＥＣＬ溶液を１
００μｌずつ各々の試験管に注ぎ、この溶液のエレクト
ロ化学ルミネセンス特性を１．５〜２．５ボルトの範囲
を５０ｍＶ／ｓｅｃで走査して先に述べた方法で測定し
た。このデータを第２図に示す。このデータは血清試料
中のテオフィリン濃度とこの反応混合物より生ずるエレ
クトロ化学ルミネセンスの量との間に相関がある事を示
している。この結果はテオフィリンのアッセイ開発の可
能性を示している。これらの結果に基づけば、この技術
に習熟した人は生物基質中の興味ある目的の分析物質を
検知したり定量する為にホモジニアス エレクトロ化学
ルミネセンス イムノアッセイを開発する事ができるで
あろう。
【０１２９】実施例３６−ホモジニアス エレクトロ化
学ルミネセント イムノアッセイに基づく溶血した血
清、脂血症の血清、黄疸の血清、及び正常血清試料中の
テオフィリンのアッセイと蛍光偏光法との比較 様々なタイプの血清試料中のテオフィリン濃度をホモジ
ニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノアッセイ
を用いて測定した。このアッセイの型は実施例３３で述
べたテオフィリンに特異的なモノクローナル抗体とＲｕ
（ＩＩ）−化合物ＩＩ結合体を用いた競合結合アッセイ
である。エレクトロ化学ルミネセンスの為の試薬と方法
は先の実施例で述べられている。様々な血清試料中のテ
オフィリン濃度の測定に使われている蛍光偏光法をＡｂ
ｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｖｉｅｓ（Ｎｏｒｔｈ Ｃ
ｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）より購入した自動ＴＤＸ器機を用
いて実施した。このアッセイには溶血した血清、脂血症
の血清、黄疸の血清及び正常の血清を用い、この異常血
清に対するデータは以下の表ＸＶＩに示す。
【表１４】 表 ＸＶＩ ホモジニアス テオフィリン アッセイ潜在的に問題のある血清の特徴 血清 ファクターの濃度 正常値の範囲 溶血 １２．４ｍｇ／ｄｌヘモグロビン ０−３．２ｍｇ／ｄｌ 脂肪血症 ４０５ｍｇ／ｄｌトリグリセリド １０−１９０ｍｇ／ｄｌ １９６ｍｇ／ｄｌコレステロール １２０−２００ｍｇ／ｄｌ 黄疸 １０ｍｇ／ｄｌビリルビン ０−１．５ｍｇ／ｄｌ 様々な量のテオフィリンを最終濃度が２．５μｇテオフ
ィリン／ｍｌから４０μｇテオフィリン／ｍｌの間にな
る様にこの血清試料に加えた。このホモジニアス エレ
クトロ化学ルミネセント イムノアッセイの結果を第３
図に示す。各々の血清試料はテオフィリン濃度に関して
蛍光偏光法でも分析した。このホモジニアス エレクト
ロ化学ルミネセント イムノアッセイと蛍光偏光法とで
測定したテオフィリンの濃度を比較した。このデータは
散布図としてプロットし、第４Ａ〜Ｄ図に示す。このデ
ータの点を線型回帰により分析し、相関係数を計算し
た。この分析によりこの２つのアッセイの間には特に強
い相関がある事が示されている。この相関係数（ｒ）は
０．９８から１．００であった。正常血清、溶血した血
清、脂血症の血清試料に対する曲線の勾配は０．８から
１．２の間であり、この事はこれらの血清試料からのテ
オフィリンの回収率が非常に高い事を示している。
【０１３０】テオフィリンを含め黄疸の血清試料から生
じるエレクトロ化学ルミネセンスは他の血清試料に対す
るものより高いが、これは各々のテオフィリン濃度に於
いて比例して高くなった。この事は第４Ｄ中に見る事が
出来る。この相関係数はエレクトロ化学ルミネセンスと
蛍光偏光を比較したデータ点に対して１．００である；
しかし勾配は２．１４である。この事は黄疸の血清試料
中のテオフィリンの高い回収率を示している。これらの
結果に基づいて、黄疸の試料中のテオフィリン濃度を既
知の量のＲｕ（ＩＩ）−化合物結合体を黄疸の血清の一
部に加える事により試料に対する標準曲線を描き、これ
を用いて測定することができるであろう。これらのデー
タはホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント イム
ノアッセイは、異常な量のヘモグロビン、脂肪、及びビ
リルビンを含む血清試料中のテオフィリン濃度を測定す
る為に使用できる事を示している。ホモジニアス エレ
クトロ化学ルミネセント イムノアッセイはＥＣＬ検出
に於ける多能性、即ち生物分子のより高い濃度でより敏
感な検出が出来るという理由から蛍光偏光法よりも優れ
ている。
【０１３１】さらにホモジニアス エレクトロ化学ルミ
ネセント イムノアッセイは入射光源が不必要で、電気
的励起のみが効率的な光の発生に必要であるという理由
からも蛍光偏光法よりも有利である。従ってエレクトロ
化学ルミネセント イムノアッセイには精巧な光学は必
要でない。この測定原理は電気化学的刺激によって誘発
される純粋に特異的な光子の放出であるので、このシス
テムの感度は本質的に蛍光偏光法より十分に高く、より
幅広いダイナミックレンジが達成できるであろう。ま
た、非常に多様な目的の分析物質の測定が蛍光偏光法よ
りもホモジニアスエレクトロ化学ルミネセント イムノ
アッセイで可能である。これは生物分子の認識作用、即
ち抗体−抗原相互作用により電気的に刺激された化学ル
ミネセンスが敏感な変調を起こす事に因る。これらの結
果に基づけば、この技術に習熟した者には異常な血清試
料中の興味あるその他の目的の分析物質を検知する為の
ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノア
ッセイを開発できる事がわかるであろう。
【０１３２】実施例３７−ホモジニアス エレクトロ化
学ルミネセンス イムノアッセイに基づく血清中のテオ
フィリンのアッセイ及び高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）法との比較 様々な量のテオフィリンを最終濃度が２．５μｇテオフ
ィリン／ｍｌから４０μｇテオフィリン／ｍｌになる様
にヒトの血清試料に加えた。各々の試料を次に２つの部
分に分け、この試料のテオフィリン濃度をホモジニアス
エレクトロ化学ルミネセンス イムノアッセイで測定
し、同じ血清試料に対してＨＰＬＣ法で得られた結果と
比較した。ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセンス
イムノアッセイに於けるアッセイの型はテオフィリン
に特異的なモノクローナル抗体とＲｕ（ＩＩ）−化合物
ＩＩＩ結合体を用いた競合結合アッセイである。このア
ッセイの為の試薬と方法は先の実施例で述べられてい
る。様々な血清試料中のテオフィリン濃度の測定に使わ
れたＨＰＬＣ法は以下に述べる。
【０１３３】テオフィリン（１，３−ジメチルキサンチ
ン）をアセトニトリルで血清タンパク質を沈殿させる事
により血清タンパク質から分離する。テオフィリンを含
む上澄み液をＷａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｍ
ｉｃｒｏ ＢｏｎｄａｐａｋＣ１８カラム（３．９ｍｍ
×３０ｃｍ）を装備したＨＰＬＣシステムに流した。こ
のクロマトグラムは１０分以内に完全に分かれた。以下
の試薬を使用した：酢酸ナトリウム（試薬用）、脱イオ
ン水（Ｍｉｌｌｉｐｏｖｅ Ｍｉｌｌｉ Ｑシステムに
より精製）、アセトニトリル（ＨＰＬＣ用）、テオフィ
リン標準試薬、（Ｓｉｇｍａ）。血清タンパク質を沈殿
させる為に用いた溶媒は１４％（ｖ／ｖ）のアセトニト
リルを含むｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
とした。このＨＰＬＣの移動相の緩衝液は７％（ｖ／
ｖ）のアセトニトリルを含むｐＨ４．０の１０ｍＭ酢酸
ナトリウム緩衝液とした。流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎと
し、流出液は２７０ｎｍにセットされているＵＶ分光光
度計でモニターした。このＵＶ吸収検出器の感度は０．
０２吸光度単位フルスケール（ＡＵＦＳ）にセットし
た。気温は２２℃から２４℃の間であった。
【０１３４】血清中のテオフィリン濃度測定に関するホ
モジニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノアッ
セイとＨＰＬＣアッセイの結果を図５に示す。データは
散布図としてプロットされデータの点は線型回帰により
分析された。その相関係数を計算した。相関係数（ｒ）
は０．９８であり、これは２つのアッセイの間に強い相
関がある事を示している。曲線の勾配は１．１９７であ
り、ＨＰＬＣに基づいた標準的方法に比べてホモジニア
ス エレクトロ化学ルミネセント イムノアッセイの方
がこの血清試料からのテオフィリンの回収率が優れてい
る事を表わしている。このホモジニアスエレクトロ化学
ルミネセント アッセイはＨＰＬＣ法よりもスピード、
感度、及び多数の試料を簡単に扱えるという点でより有
利である。これらの結果に基づけば、この技術に習熟し
た者にはＨＰＬＣやその他同類の方法で検出できる分析
対象物をホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント
イムノアッセイで検出する方法を開発できる事がわかる
であろう。
【０１３５】実施例３８−テオフィリン−ウシ血清アル
ブミン結合体の製法 テオフィリン−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）共役物を
テオフィリン−３−メチル−酪酸、テオフィリン−８−
酪酸、及びテオフィリン−７−酢酸から以下の方法によ
り調製した。５０ｍｇのＢＳＡを１ｍｌの０．１５Ｍ
ＮａＨＣＯ3 、ｐＨ９．０に溶解した。１６ｍｇのエチ
ル３′，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩
酸塩（ＥＤＣＩ）と１１ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸
塩（ＮＨＳ）、及びジメチルスルホキシドに溶かした１
７．８ｍｇのテオフィリン−７−酢酸、又は２０ｍｇの
テオフィリン−８−酪酸、又は２０．９ｍｇのテオフィ
リン−３−メチル−酪酸を別々に加えこの溶液を４５℃
で１〜２時間加熱した。この溶液をＢＳＡ溶液に一滴ず
つ加え１時間反応させた。ＢＳＡのテオフィリン結合体
はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５のカラムを用いたゲル濾
過クロマトグラフィーでｐＨ７．４の０．１５Ｍ ＰＢ
Ｓ／０．１％アジ化物を移動相とし、流速３０ｍｌ／ｈ
ｒで分離精製した。
【０１３６】実施例３９−テオフィリン−ＢＳＡ Ｂｉ
ｏｍａｇ粒子の製法 ４ｍｌのＢｉｏｍａｇ−アミン粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｍａｇｎｅｔｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，
ＭＡ）を０．００８％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ
−４０）を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇ
ｍａ）（ＰＢＳ）２０ｍｌで２〜３回ｓｅｐａｒａｔｅ
Ｔ−ｆｌａｓｋ中で洗った。このＢｉｏｍａｇ ｗｅ
ｔ ｃａｋｅに５％のグルタルアルデヒドを含むＰＢＳ
を１０ｍｌ加えロータリーミキサーで３時間活性化させ
た。活性化されたＢｉｏｍａｇ粒子を上述の様に合計４
回洗い、Ｔ−ｆｌａｓｋに移し換えた。１０ｍｌのＰＢ
Ｓ／ＮＰ−４０中の実施例３８に述べた方法で調製され
たテオフィリン−ＢＳＡを６．８ｍｇこの活性化された
Ｂｉｏｍａｇ ｗｅｔ ｃａｋｅに加えた。４℃で一晩
反応させた。この活性化されたＢｉｏｍａｇ ｗｅｔ
ｃａｋｅを２０ｍｌの１％ＢＳＡ／０．１５Ｍ ＰＢＳ
／０．１％アジ化物（ｐＨ７．４）で３回洗った。この
際最初の洗浄はロータリーミキサーを用いて約３０分間
続けた。
【０１３７】実施例４０−化合物Ｉ−抗テオフィリン結
合体の製法 １．１ｍｌのマウス抗−テオフィリン モノクローナル
抗体（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ、ロット番号ＷＯ３９９；
４．６ｍｇ／ｍｌ）を１０，０００ｇで８分間遠心し
た。緩衝液は０．２Ｍ ＮａＨＣＯ3 、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、でアジ化物を含んだｐＨ９．０のものにＡｍｉ
ｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ
ｏｒを用いて取り換えられた（３０００ｇで遠心され
た）。この抗体溶液は２ｍｌに希釈され、３．２ｍｇの
化合物Ｉが加えられた。室温で２時間攪拌しながら反応
させ、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＢＨ水溶液を７９μｌ
加え、この溶液を３０分間攪拌した。こうして得られた
溶液を前もってトリス緩衝液で平衡化されたＳｅｐｈａ
ｄｅｘ Ｇ−２５のカラム（１．０ｃｍ×１８．０ｃ
ｍ）にかけ、流速１５ｍｌ／ｈｒで流出させた。化合物
Ｉ−抗テオフィリン結合体を含むフラクションを集め、
透析チューブに移し、０．１５Ｍリン酸塩／０．１５Ｍ
ＮａＦ（ＰＢＳ）、ｐＨ６．９（４リットル）に対し
透析した。
【０１３８】実施例４１−不均質エレクトロ化学ルミネ
セント アッセイに基づいた血清中のテオフィリンのア
ッセイ 免疫学的測定法のひとつの型を用いて、テオフィリンに
対する不均質アッセイを化合物Ｉで標識された抗テオフ
ィリン抗体とＢｉｏｍａｇ磁気粒子上に固定されたテオ
フィリンＢＳＡを用いて開発した。この抗体濃度は２０
μｇ／ｍｌであった。磁気粒子の濃度は１％固体（ｗｔ
／ｖｏｌ）であった。テオフィリンは１ｍｌの血清に対
し最終濃度が１０及び４０μｇとなる様に加えた。この
テオフィリン血清標準物は１％のＢＳＡを含むＰＢＦ緩
衝液（リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．１Ｍ
フッ化ナトリウム）で１０００倍に希釈した。アッセイ
は、７５μｌの希釈された血清標準物を７５μｌの抗体
が結合した化合物Ｉに加え、この溶液を室温で２０分間
反応させる事により実施した。次に５０μｌのテオフィ
リン−ＢＳＡ−Ｂｉｏｍａｇ粒子を加え、この懸濁液を
５分間放置した。この粒子を磁気的に分離し、上澄み液
の１００μｌについて実施例４８で述べる方法に従って
エレクトロ化学ルミネセンスを測定した。
【表１５】 これらの結果に基づけば、この技術に習熟した者は生物
基質中のその他の興味ある分析対象についても不均質エ
レクトロ化学ルミネセンスイムノアッセイを開発する事
が出来るであろう。
【０１３９】実施例４２−化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン
結合体の製法 攪拌バーが付いた５０ｍｌの丸底フラスコに１００．２
ｍｇ（０．１０４ｍｍｏｌ）の化合物ＩＩ、４１ｍｇ
（０．１０５ｍ ｍｏｌ）のジゴキシゲニン（Ｓｉｇｍ
ａ）及び２８ｍｇ（０．１３６ｍ ｍｏｌ）の１，３−
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加えた。
この混合物に８−１０ｍｌの無水ピリジン（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ Ｓｕｒｅ−Ｓｅａｌ）を１８ゲージの針を付けた
シリンジで加えた。このフラスコに栓をし、テフロンの
テープで封をして溶液が赤くなるまで穏やかに攪拌し
た。このフラスコはフードの中で攪拌しながら暗い状態
で２４時間放置し、この時６ｍｇ（０．０１５ｍ ｍｏ
ｌ）のジゴキシゲニンと２０ｍｇ（０．０９７ｍ ｍｏ
ｌ）のＤＣＣを加えた。この溶液には栓をし、暗い状態
で室温に於いて攪拌した。翌日、ジシクロヘキシル尿素
の沈殿は観察されなかった。さらに１８ｍｇ（０．０５
ｍ ｍｏｌ）のジゴキシゲニンと１０３ｍｇ（０．５０
ｍ ｍｏｌ）のＤＣＣを加えた。フラスコに再び封をし
暗い状態でさらに攪拌を続けた。７２時間後さらに１０
３ｍｇのＤＣＣを加え暗い状態で３時間攪拌した。
【０１４０】この溶液に５〜１０滴のＨ2 Ｏを加え、次
にこれをロータリーエバポレーターに移して赤い固体を
生じるまで暗い状態で乾燥させた。得られた赤い固体は
アルミニウムホイルで覆い、デシケーター中でＣａＳＯ
4を用いて一晩乾燥させた。この乾燥させた固体を次に
３〜５ｍｌのメタノールに溶かし、この混合物に約０．
２５ｇの無水で固体状態のＬｉＣｌＯ4 を加えた。Ｌｉ
ＣｌＯ4 が溶けたら、この溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｌ
Ｈ−２０のカラム（７５ｃｍ×１９ｍｍ）にかけ、流速
７〜１０ｓｅｃ／ｄｒｏｐの範囲でメタノールにより流
出させた。クロマトグラフィーが展開した際３つのバン
ドが確認された；第１の淡橙色（赤色ルミネセント）の
バンド（フラクション１）；第２番目の暗赤色のバンド
でこれはこの反応の主生成物を示している（フラクショ
ン２）；及び第３番目の最初の２つのバンドの後ろに続
いたバンドで（おそらく未反応の原材料から成り）これ
は捨てた。
【０１４１】バンド１と２はこのカラムでかろうじて分
離されたものなのでバンド２の中の橙色生成物をフラク
ション２（１５ｍｌ）のメタノール溶液を約３００ｍｌ
の無水ジエチルエーテルに滴下し攪拌した。得られた沈
殿は１５ｍｌメデウムフリット上で吸引濾過により集
め、１５ｍｌのジエチルエーテルで５回洗った。残こっ
たエーテルを真空デシケーター中でＣａＳＯ4 を用いて
一晩この化合物を乾燥させる事により取り除いた。この
固体物質は以下の様に同定された：
【化５１】
【０１４２】実施例４３−化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン
結合体のエレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）：抗ジ
ゴキシン抗体によるＥＣＬシグナルの変調 ジゴキシンに対するモノクロナル抗体をイムノアッセイ
緩衝液で以下の濃度に希釈した：１，１０，５０，２０
０，４００μｇ／ｍｌ 化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体（５０マイクロモ
ル）をイムノアッセイ緩衝液（０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ６．０、０．１Ｍフッ化ナトリウムを含む）で１５
０ｎＭに希釈した。ポリプロプレン製の試験管（１２ｍ
ｍ×７５ｍｍ）に入った２００μｌのイムノアッセイ緩
衝液に様々な濃度のジゴキシン抗体を１００μｌと化合
物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体を１００μｌ（１５０ｎ
Ｍ）加えた。試験管をボルテックス上で攪拌し、室温で
１５分間反応させた。反応の後、１００μｌのＥＣＬ溶
液（先述）を加えエレクトロ化学ルミネセンスを測定し
た。 結果：
【表１６】 ３０ｎＭ化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体に対するＥ
ＣＬカウントの総計＝１１３６６６（ピーク高）
【０１４３】試験管１本当り４０μｇの濃度でシグナル
の非特異的抗体による変調は６７，０００カウントであ
りジゴキシンに対する特異的抗体が存在する時は３６，
０００であった。第６図からわかる様に、化合物ＩＩ−
ジゴキシゲニン結合体の固定された濃度に反応する際、
抗ジゴキシン抗体の濃度が上昇するとエレクトロ化学ル
ミネセントシグナルの変調が上昇する事が示された。こ
の特徴は血清や血漿中のジゴキシゲニンの測定に対して
ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセンスを基礎とし
たアッセイを開発に当り有益となるであろう。
【０１４４】実施例４４−ホモジニアス ジゴキシン
アッセイ 実施例４３で述べた結果に基づいてジゴキシンに対する
ホモジニアス エレクトロ化学ルミネセント イムノア
ッセイをジゴキシンに対する抗体と本化合物ＩＩ−ジゴ
キシゲニン結合体を用い競合結合型のアッセイ法を使っ
て開発する事ができるであろう。使用されるであろう試
薬は実施例４３に記載されている。このアッセイに対し
てはジゴキシンに対するモノクローナル抗体の特異的な
濃度が選択されるであろう。この抗体濃度は１ｍｌ当り
７５〜１００μｇである。本化合物ＩＩ−ジゴキシゲニ
ン結合体の濃度は５〜１５ｎＭ（最終濃度）となるであ
ろう。ジゴキシン標準物がヒト血清に最終濃度が血清１
ｍｌ当りジゴキシン０．１、０．５、１、２、４、８、
及び１６ｎｇとなる様に加えられるであろう。このアッ
セイは１０〜３０μｌの血清を３００μｌの抗−ジゴキ
シンモノクローナル抗体に加え、室温で３０分間この溶
液を放置する事により実施されるであろう。次に１００
μｌの本化合物ＩＩ−ジゴキシゲニン結合体を最終濃度
が５〜１５ｎＭの範囲になる様に各々の試験管に加え、
この溶液を室温で２０分間放置する。先に述べたＥＣＬ
溶液を１００μｌ各々の試験に入れ先に述べた様にして
ＥＣＬが測定されるであろう。
【０１４５】実施例４５−ウアバイン−ウシ血清アルブ
ミン結合体の製法 ５０ｍｇのウアバイン８水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ）を５
ｍｌの脱イオン水に溶かした。８１ｍｇのＮａＩＯ4 を
この溶かしたウアバインに加え、この混合物を室温で２
時間反応させた。この反応はｐＨが５と６の間になるま
で脱イオン水で平衡化したＤｏｗｅｘ ＩＸ−８イオン
交換樹脂のカラム（５ｍｌ）にこの混合物を通す事によ
り止めた。廃液入れに入ってくる流出液が混合のサイン
を示したら酸化されて得られたフラクションを集めた。
１００ｍｇの凍結乾燥されたウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）の結晶（Ｓｉｇｍａ）を０．０５％のアジ化物を含
むｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液５ｍｌに
溶かした。この酸化されて得られた溶液にこのＢＳＡ溶
液を一滴ずつ攪拌しながら加えた。こうして得られた溶
液は室温で１時間反応させた後ＮａＣＮＢＨ4 （Ａｌｄ
ｒｉｃｈ）を３０ｍｇ加えた。次にこの溶液を室温で一
晩攪拌した。この溶液をポリエチレングリコール−８０
００で濃縮し（１１ｍｌから４ｍｌまで）、遊離状態の
ウアバインと過剰の水素化ホウ素をこの溶液からＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ−２５（カラム＝０．６ｃｍ×３７ｃ
ｍ；溶離剤＝０．１Ｍ Ｋ2 ＰＯ4 ／０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、０．０５％ＮａＮ3 ）を用いて取り
除いた。フラクション１１−１７を集め、そのタンパク
質濃度を２８０ｎｍに於ける吸収を（希釈後に）測定す
る事により決定した。
【０１４６】実施例４６−ウアバイン−ＢＳＡ−セファ
ロースの製法 セファロース４Ｂで活性化された臭化ジシアンを２ｇ
ｓｉｎｔｅｒｅｄ ｄｉｓｋ ｆｕｎｎｅｌ上で４００
ｍｌの１ｍＭ ＨＣｌを１回に５０ｍｌずつ使って洗っ
た。この樹脂を次に２０ｍｌの０．１Ｍ ＮａＨＣ
Ｏ3 、０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０（カップ
リングバッファー）で洗った。この樹脂をポリプロプレ
ン製の容器に移し換えた後、１５ｍｌのカップリングバ
ッファーに溶かした３０ｍｇのウアバイン−ＢＳＡを加
えた。この活性化された樹脂をロータリー混合しながら
２時間このウアバイン−ＢＳＡと共に反応させた。残こ
った活性化部位は室温で２時間７ｍｌの０．５Ｍエタノ
ールアミン（ｐＨ８．０）と反応させた。ｓｉｎｔｅｒ
ｅｄ ｄｉｓｋ ｆｕｎｎｅｌを用いてこの樹脂を以下
の溶液それぞれ１００ｍｌずつで洗った：カップリング
バッファー；０．１５ＭＰＢＳ；１ｍＭ ＨＣｌ；カッ
プリングバッファー；０．２％ＮＰ−４０を含むＰＢ
Ｓ；及びＰＢＳ。この樹脂を再び１１ｍｌに懸濁し、十
分な量のこの懸濁液を内径１．０ｃｍのカラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）に入れ総ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅが３．５
ｍｌになる様にした。
【０１４７】実施例４７−抗−ジゴキシン−化合物Ｉ結
合物の製法とアフィニティー精製法 マウス抗ジゴキシンモノクローナル抗体（Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ｃ
ａｔ ｎｏ．２００Ｍ−０１４、ロット番号ＭＡ２５０
７Ｆ）の１ｍｇ／ｍｌ貯蔵用溶液を４５０μｌ Ａｍｉ
ｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０濃縮ユニットを用いて
１００μｌにまで濃縮した。この濃縮物に０．２Ｍ炭酸
水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６を９００μｌと化合
物Ｉを０．６ｍｇ加えた。反応（アミノ化）を室温で２
時間行ない、その後３０μｌの０．１Ｍ ＮａＢＨ
4 （ａｑ）（Ｓｉｇｍａ）を加えた。得られた溶液を１
時間放置した。過剰の化合物Ｉ及びその他の生成物をこ
の抗体結合体からセファデクスＧ−２５クロマトグラフ
ィー（カラム＝１．０ｃｍID×１８ｃｍ；溶出剤＝０．
１Ｍリン酸塩緩衝食塩水）により分離した。試料は２０
ｍｌ／ｈｒの流速で１ｍｌずつのフラクションにして採
り、２８０ｎｍに於ける吸収を２．０ＡＵＦＳ及び０．
５ＡＵＦＳでモニターした。フラクション５、６、７、
及び８を集め、予め洗ってあるウアバイン−ＢＳＡ−セ
ファロースアフィニティーカラム（３．５ｍｌのカラム
で内径１ｃｍ）にかけた。そして１５ｍｌ／ｈｒの流速
で溶離させた。保持されていない物質が溶出した後、流
速を２０ｍｌの溶出液が集まるまで３０ｍｌ／ｈｒに上
げた。移動相のこの食塩水濃度は０．５Ｍに上昇し、さ
らに２０ｍｌをカラムから溶出させた。ウアバインに特
異的な抗ジゴキシン−化合物Ｉ結合体は４Ｍと６ＭのＫ
ＳＣＮを加える事により取り除かれた。抗ジゴキシン−
化合物Ｉ結合体に当るフラクションを集め１０ｍＭリン
酸塩緩衝食塩水（４リットル；ｐＨ７．４）、続いて
０．１Ｍリン酸塩緩衝液に対して透析した。
【０１４８】実施例４８−ジゴキシンに対する不均質エ
レクトロ化学ルミネセントイムノアッセイ １０ｍｇの固体ジゴキシンを１０ｍｌのＤＭＳＯ：Ｈ2
Ｏ（８：２）に溶かし、ジゴキシン濃度を１ｍｇ／ｍｌ
とした（今後これを貯蔵用標準液と呼ぶ）。この貯蔵用
標準液から０．１％ＢＳＡ及び０．１５Ｍ ＮａＦを含
むｐＨ７．０の０．１５Ｍリン酸緩衝液（今後ＥＣＬ緩
衝液と呼ぶ）を用いて以下の濃度の作業用標準液を調製
した；８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍ
ｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌ。
７５μｌの抗ジゴキシン−化合物Ｉ結合体（１：９０に
希釈されている）及び７５μｌのそれぞれの標準液をガ
ラス試験管にピペットで注ぎ、ｖｏｒｔｅｘ上で混合し
室温で２０分間反応させた。５０μｌの予め洗浄された
ウアバイン−ＢＳＡ−Ｂｉｏｍａｇ粒子を各々の試験管
に加え、ｖｏｒｔｅｘで混合した後室温で５分間反応さ
せた。Ｂｉｏｍａｇ粒子を分離し、上澄み液をそれぞれ
別の試験管に移した。１００μｌの上澄み液を４００μ
ｌの０．１２５Ｍリン酸カリウム０．１２５Ｍクエン
酸；３２ｍＭシュウ酸；１．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００と試験管中で混合した。この試料をＢｅｒｔｈｏ
ｌｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに入れ、先に述べた様にエ
レクトロ化学ルミネセンスを測定した。但しその方法は
開回路からの加電圧を２．２Ｖに切り換え、光子の計数
を１０秒間で積算する様に改変された。電極はリン酸−
クエン酸緩衝液を用いて以下の方法で測定の間に洗浄し
た： （ａ） 電極に３秒おきに交互に−２．２Ｖと＋２．２
Ｖのパルスを１分間送る。 （ｂ） 電極を＋２．２Ｖに１０秒間保つ。 （ｃ） 電極を脱イオン水ですすぎ、水気をとって乾か
す。 この結果を第７図に示す。
【０１４９】実施例４９−エレクトロ化学ルミネセンス
を有する化学種によるＤＮＡの標識づけ エレクトロ化学ルミネセントを有する化学種によるＤＮ
Ａの標識づけを以下の２つの方法を用いて行なった。 合成Ａ １．０Ａ260 の標準的に合成された３８量体（ＭＢＩ
３８）
【化５２】ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＣＡ
ＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴ* でＴ* が５位
の炭素が
【化５３】 −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2 ）7 −ＮＨ2 で修飾されたチミジンであるものを０．０１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ８．７に溶かした。１００μｌのビス（２，
２′−ビピリジン）〔４−（ブタン−ｌ−ａｌ）−４′
−メチル−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）
二過塩素酸塩（化合物Ｉ）（０．０１Ｍリン酸カリウム
緩衝液、ｐＨ８．７ ３００μｌ中に２．３ｍｇ）の溶
液。内容物を攪拌し室温で一晩放置した。１００μｌの
水素化ホウ素ナトリウム飽和水溶液をこの混合物に加
え、この可逆的なイミンのシッフ塩基結合を非可逆的な
アミン結合に変換させた。この反応は室温で２時間行な
った。次にこの溶液を注意深く希酢酸で処理し、過剰の
水素化ホウ素ナトリウムを失活させた。この反応溶液を
Ｐ−２ゲル濾過のカラム（１８インチ×１／２インチ）
で予め０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ６．
７７で平衡化されているものにかけた。このカラムはこ
の同じ緩衝液で溶出させ、２ｍｌのフラクションを流速
２０ｍｌ／ｈｒで集めた。フラクション９及び１０に溶
出したＤＮＡは未反応のルテニウムビピリジル化合物と
十分に分離された。この集められたＤＮＡ試料は典型的
なＵＶ吸収を示し、さらに４５０ｎｍで励起すると６２
０ｎｍで蛍光の発光スペクトルを示した。この蛍光の発
光はこのＤＮＡ試料中にルテニウムビピリジルの化学種
が存在する事を示している。この生成物は単一の橙色の
蛍光を発するバンドとしてポリアクリルアミドゲル電気
泳動で移動する。この標識されたＤＮＡ（ＭＢＩ３８−
化合物Ｉ結合体）の電気泳動による移動度はおよそ未標
識のＤＮＡと同じである。
【０１５０】合成Ｂ 本ルテニウム化合物をまず３ｍｇ、６０μｌの無水ジテ
チルホルムアミドに溶かし、これを９４ｍｇのジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で２００μ
ｌの無水ＤＭＦ中の５２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシン
イミドで処理する事によりＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド誘導体に変換した。この反応は０℃で４時間行なっ
た。沈殿したジシクロヘキシル尿素を遠心により取り除
き、この上澄み液（２００μｌ）を０．０１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ８．７７中にアミノ結合したＤＮＡ（合成Ａで
述べた）を含む溶液（１００μｌの緩衝液中２Ａ260 ）
に加えた。この反応は一晩室温で行なった。かなりの量
の固体が反応液中に現われたがガラスウールで濾過して
取り除いた。この濾液を濃縮し、０．５ｍｌの１Ｍ酢酸
トリエチルアンモニウム（ｐＨ６．８）に溶かした。こ
の反応混合液を次に合成Ａで述べた様にクロマトにかけ
た。この標識されたＤＮＡは合成Ａで調製された材料に
ついて述べた様な全てのスペクトル上及び電気泳動上の
特徴を示した。
【０１５１】実施例５０−標識されたＤＮＡの電気的に
発生させた化学ルミネセンスの特性 実施例４９、合成Ａで得られた標識されたＤＮＡ試料
（ＭＢＩ−化合物Ｉ）を用いてそのエレクトロ化学ルミ
ネセンスの特性を研究した。様々な濃度の標識されたＤ
ＮＡを０．１Ｍクエン酸、２５ｍＭシュウ酸及び１．０
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ４．２、０．５ｍｌに溶かし、改良されたＢｅ
ｒｔｈｏｌｄ Ｉｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで測定した。第
８図に様々なＤＮＡ濃度に対するエレクトロ化学ルミネ
セントシグナルの反応を示す。
【０１５２】実施例５１−化合物Ｉで標識されたオリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーション実験 実施例５０で述べた３８量体に対する相補ストランドを
ＡＢＩ ｍｏｄｅｌ３８０ Ｂ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒを用いて合成し、これをＭＧＥＮ−３８と命
名した。このオリゴヌクレオチドへの化合物Ｉの共有結
合的付着がＭＢＩ３８オリゴヌクレオチドのハイブリダ
イゼーション特性に影響を与えているかどうかを調べる
為に、以下の実験を考案した。様々な濃度の標的フラグ
メント（ＭＧＥＮ−３８）をＧｅｌｍａｎ ＲＰナイロ
ンメンブランのシート上にスポットし、ＭＢＩ３８又は
ＭＢＩ３８−化合物Ｉを固定し、エーテルでプローブし
た。両方のフラグメントをＴ4 ポリヌクレオチドキナー
ゼ及びガンマ32Ｐ〔ＡＴＰ〕で処理し、５′末端を32Ｐ
で標識した。ＤＮＡと化合物Ｉで標識されたＤＮＡのハ
イブリダイゼーション感度を比較した。
【０１５３】５０ｎｇから０．０５ｎｇまでの範囲の濃
度のＭＧＥＮ−３８ＤＮＡをナイロンメンブランにスポ
ットし、空気乾燥した。メンブランは１スポットに対し
２枚ずつ用意した。このブロットをそれぞれ以下の溶液
で２分間ずつ処理した：ＤＮＡを十分変性させる為に
１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ ＮａＯＨ；ブロットを
中和する為に１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ ＴＲＩ
Ｓ；最後に２Ｘ ＳＳＣ。このブロットを８０℃の真空
オーブン中で２時間焼いた。ハイブリダイゼーションプ
ローブは以下の要領で調製した：３μｇのＭＢＩ３８及
びＭＢＩ３８−化合物Ｉを１０単位のＴ4 キナーゼと１
２５μ Ｃｉのガンマ32Ｐ−ＡＴＰでキナーゼ処理し
た。ＤＮＡへの同位体の取り込み率を測定し以下に示し
た。 ＭＢＩ３８総カウント数 ４．１×１０6 ｃｐｍ／μｌ 取り込まれたカウント数 ３．１×１０5 ｃｐｍ／μｌ 取り込み率＝７５．６％ ＭＢＩ３８−化合物Ｉの総カウント数 ３．２×１０6 ｃｐｍ／μｌ 取り込まれたカウント数 ２．６×１０5 ｃｐｍ／μｌ 取り込み率＝８１．２％
【０１５４】プレハイブリダイゼーション及びハイブリ
ダイゼーションの溶液をＭａｎｉａｔｉｓ（２４）に従
って調製した。ブロットは５０μｇ／ｍｌの仔ウシ胸腺
ＤＮＡと供に５３℃で４時間ハイブリダイゼーションし
た。次にこのブロットを１０，０００，０００ｃｐｍの
各々のプローブを含むハイブリダイゼーション溶液に入
れた。そして５３℃で一晩（１２時間）ハイブリダイゼ
ーションさせた。翌日このブロットを以下の様に洗浄し
た： −５３℃の２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１５分間ずつ
２回 −０．２×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回（上と同様
に） −０．１６×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回（上と同様
に） このブロットを次に空気乾燥し−７０℃でＫｏｄａｋ
Ｘ−ｏｍａｔフィルムにさらした。このＸ線分析（第９
図参照）からＭＢＩ３８とＭＢＩ３８−化合物Ｉのプロ
ーブの間には非常に似たハイブリダイゼーションのパタ
ーンが見られる事がわかった。両方の場合に於いて５ｎ
ｇの標的に対するプローブのハイブリダイゼーションが
観察され、最低０．０５ｎｇの標的ＤＮＡに至るまでわ
ずかなハイブリダイゼーションの痕跡が認められた。陰
性対照のＤＮＡ（５０ｎｇスポットしたファージラムダ
ＤＮＡ）に対してはこのプローブによるハイブリダイゼ
ーション活性は検出されなかった。
【０１５５】実施例５２−化合物Ｉで標識されたＤＮＡ
プローブのハイブリダイゼーションの特異性に関する実
験 幾つかのＥ．ｃｏｌｉ及び非Ｅ．ｃｏｌｉ株からゲノム
のＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓ（２４）の方法に従って分
離した。使用した生物は： Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣ８株−天然分離株 Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＣＩＡ株−腸管病原性株 Ｅ．ｃｏｌｉ １０Ｈ０７株−毒素原性株 Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣ５０株−天然分離株 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株−実験用株 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株−実験用株 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ エンテロバクター・エロゲ ネス Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ シトロバクター・フロイン ディイ Ｓａｌｍｏｒｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｂ サルモネラ・パラチフィＢ Ｓａｌｍｏｒｅｌｌａ ｐｏｔｓｄａｍ サルモネラ・ポツダム 上述の株から得られたＤＮＡを３μｇずつ重複してＧｅ
ｌｍａｎ ＲＰナイロンメンブラン及びＳ＆Ｓニトロセ
ルロースメンブラン上にスポットした。陰性対照として
５０ｎｇのファージラムダＤＮＡをスポットした。陽性
対照は５０ｎｇから０．５ｎｇの範囲の様々な濃度の相
補ストランド、ＭＧＥＮ−３８とした。このブロットは
実施例５１で述べた方法により調製し処理した。このプ
ローブ用ＤＮＡは放射性を取り込ませる為に１２５μＣ
ｉのガンマ32Ｐ−ＡＴＰと共にＴ4 キナーゼ処理された
３．８μｇのＭＢＩ３８−化合物Ｉフラグメントから構
成された。
【０１５６】 ＭＢＩ３８−化合物総カウント数 −３．３５×１０6 ｃｐｍ／μｌ 取り込まれたカウント数 −１．５０×１０6 ｃｐｍ／μｌ 取り込み率 −４４．７％ このアッセイの為に２，６００，０００ｃｐｍの活性を
各々のフィルターをプローブする為に用いた。このハイ
ブリダイゼーション溶液、条件、洗浄溶液及びプロトコ
ルは実施例５１で述べたものと同様のものを用いた。こ
のブロットのＸ線フィルム（第１０図）はそれぞれ適宜
反応させた陽性及び陰性対照を示している。ラムダＤＮ
Ａ（５０ｎｇ）ではハイブリダイゼーション活性は検出
されず、最低０．５ｎｇの濃度までＭＧＥＮ−３８の相
補配列に対し強いハイブリダイゼーションが観察され
た。これらの結果は感度に関する実験の結果と総合的に
一致するものである。
【０１５７】実施例５３−２，２′−ビピリジニウムヘ
キサクロロオスミウム酸塩（ＩＶ）の製法 １．０１ｇのヘキサクロロオスミウム酸（ＩＶ）アンモ
ニウム、（ＮＨ4 ）2ＯｓＣｌ6 、（Ａｌｆａ）（１．
００等量）を５０ｍｌの３Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）に７０℃
で溶かした。この熱せられ、攪拌された溶液に３Ｎ Ｈ
Ｃｌ（ａｑ）に溶かした２，２′−ビピリジンを一滴ず
つ加えた。赤い塩、
【化５４】 （今後（ｂｐｙＨ2 2+）ＯｓＣｌ6 2-と呼ぶ）で分子量
５６２．２ｇ／ｍｏｌｅがこの溶液から沈殿した。沈殿
はこの溶液を０℃の氷浴で２時間冷却する事により完了
した。生成物をｇｌａｓｓ ｆｒｉｔｔｅｄ ｆｉｌｔ
ｅｒ上で吸引濾過により集めた。この沈殿物を連続的に
５〜１０ｍｌの氷冷した３Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）と水で洗
った。最後に２０ｍｌの無水ジエチルエーテルで洗った
後、この生成物を真空下７０℃で４８時間乾燥させた。
収量＝１．０１ｇ橙色粉末（（ＮＨ4 ）2 ＯｓＣｌ6 に
基づいた収率７８％）。この生成物はさらに精製する事
なく使用した。
【０１５８】実施例５４−２，２′−ビピリジンテトラ
クロロオスミウム酸塩（ＩＶ）の製法 実施例５３で調製した（ｂｐｙＨ2 2+）（ＯｓＣ
ｌ6 2-）塩０．９ｇ（１．６０ｍ ｍｏｌ）をパイレッ
クスの試験管に量り取る。この試験管をアルゴンの出入
口と温度計（最大目盛４００℃）の付いたパイレックス
の煙管に入れた。この装置全体を煙管に入れアルゴンを
流し込んだ。この炉を加熱し、温度を２７０−３００℃
に上げた。反応の間を通してアルゴンを穏やかに管に流
した。このアルゴンの出口を反応の間に生成したＨＣｌ
を実験室外へ排気する為にｆｕｍｅフード下に向けた。
温度が２７０℃に近づくにつれ、反応物の熱分解が開始
した。この固体からＨＣｌガスが発生するのが観察され
た。３０分間にわたり激しくＨＣｌが発生するのが観察
され、その後しだいに鎮静化し始めた。６時間後、オー
ブンを止め、試料を室温まで冷却した。この生成物、
（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ4、細かく分かれた茶褐色の固体を
１２時間、攪拌された３Ｎ ＨＣｌ（ａｑ）溶液中に懸
濁し、続いて６時間攪拌された無水ジエチルエーテル中
に懸濁する事により精製した。ｇｌａｓｓ ｆｒｉｔｔ
ｅｄ ｆｉｌｔｅｒ上で吸収濾過する事によりこの生成
物を分離した結果、２，２′−ビピリジンテトラクロロ
オスミウム酸塩（ＶＩ）が０．７５ｇ（９５％）収穫さ
れた。これを今後（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ4 と呼ぶ。（ＭＷ
＝４８９．３ｇ／ｍｏｌｅ）。
【化５５】 この生成物はさらに精製する事なく使用した。
【０１５９】実施例５５ シス−（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス（１，２
−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕−ジクロロオスミ
ウムの合成 攪拌子と還流冷却器を付けた５０ｍｌの丸底フラスコ
に、実施例５４に於いて合成した（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ4
２３０ｍｇ（０．４７ｍ ｍｏｌ）とシス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン（ＤＰＰ−
ｅｎｅ）４６５ｍｇ（１．１７ｍ ｍｏｌ）を添加し
た。ジグライム２５ｍｌを添加し、内容物をアルゴン気
流下で５時間還流した。濃緑−黒色の溶液をアルゴン気
流下で室温に冷却し、２００ｍｌのビーカーに移し入れ
た。無水ジエチルエーテル８０ｍｌを加えると濃緑色の
沈殿を与えた。この沈殿をガラスフィルター（中程度の
孔）上に吸引濾過により収集し、２０ｍｌずつの無水ジ
エチルエーテルで５回洗浄した。この沈殿をその後ＣＨ
2 Ｃｌ2 １５ｍｌに溶解すると濃緑色の溶液を与え
た。この溶液をガラスフィルター（中程度の孔）を通し
て自然濾過して約３００ｍｌの攪拌している無水ジエチ
ルエーテル中に注入した。灰色−緑色のシス−（２，
２′−ビピリジン）〔シス−ビス（１，２−ジフェニル
フォスフィノ）エチレン〕−ジクロロオスミウムＩＩ錯
体、これ以後は、シス−（ｂｐｙ）（ＤＰＰ−ｅｎｅ）
ＯｓＣｌ2 と記述する、の沈殿が生じた。この錯体をガ
ラスフィルター（中程度の孔）上に吸引濾過して収集し
た。生成物を速かに２０ｍｌの冷１：２ｖ／ｖエタノー
ル／水で洗浄し、その後３０ｍｌずつのジエチルエーテ
ルで７回洗浄した。スレート灰色の粉末を、真空デシケ
ーター中ＣａＳＯ4 を用いて一夜乾燥した。
【化５６】 収量：２４０ｍｇ（（ｂｐｙ）ＯｓＣｌ4 ；分子量＝８
１４．４ｇ／ｍｏｌｅに基づいて６３％）。この生成物
は、これ以上精製しないで使用した。
【０１６０】実施例５６ （２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス（１，２−ジフ
ェニルホスフィノ）エチレン｛２−〔３−（４−メチル
−２，２′−ビピリジン−４′−イル）プロピル〕−
１，３−ジオキソラン｝オスミウム（ＩＩ）ジクロリド
の合成 攪拌子と還流冷却器を装備した１００ｍｌの丸底フラス
コに、実施例５５で合成したシス−（ｂｐｙ）（ＤＰＰ
ｅｎｅ）ＯｓＣｌ2 １２９ｍｇ（０．１５８ｍ ｍｏ
ｌ）と２−〔３−（４−メチル−２，２−ビピリジン−
４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン、即ちｂ
ｐｙｏｘａｌ、０．３ｇ（１．０ｍ ｍｏｌ）を添加し
た。これにエチレングリコール１５ｍｌを添加した。こ
の懸濁液をアルゴン気流下に３時間還流した。室温に冷
却した後に、水１０ｍｌをフラスコの内容物に添加し
た。水に入れたＳＰ−セファデックスＣ−２５イオン交
換樹脂のカラム（３０ｃｍの高さ×１９ｍｍ内径）を調
製した。反応フラスコの内容物をカラムにかけた。カラ
ムをＨ2 Ｏ（約５００ｍｌ）で溶出してエチレングリコ
ールと過剰のｂｐｙｏｘａｌ配位子を除去した。０．２
５Ｍ ＮａＣｌ（水）溶液で溶出して淡黄色の小バンド
（長波長のＵＶ光下ではオレンジ色の蛍光）を分離し、
その後非蛍光のオリーブグリーンのバンドを分離した。
これらのバンドは、反応の副生成物であることを示し
た。それらの同定は行わず、廃棄した。これらのバンド
をカラムから除去すると同時に、０．５Ｍ ＮａＣｌ
（水溶液）による溶出を始めた。最初のオレンジ色蛍光
を有するオレンジ色のバンドは、必要とする生成物の塩
化物塩である（２，２′−ビピリジン）〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィノ）エチレン〕｛２−
〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）、これ以後は（ｂｐｙ）（ＤＰＰｅｎｅ）（ｂ
ｐｙｏｘａｌ）Ｏｓ（ＩＩ）2+と記述、であると同定し
た。この物質は、テイリングした黄色バンド（緑色蛍
光）と褐色バンド（非蛍光）から純粋に分離した。
【０１６１】（ｂｐｙ）（ＤＰＰｅｎｅ）（ｂｐｙｏｘ
ａｌ）Ｏｓ（ＩＩ）2+を含む分画中の溶液量を、回転式
エバポレーターで蒸発して５０ｍｌとした。その後濃Ｎ
ａＣｌ水溶液を５０ｍｌずつのＣＨ2 Ｃｌ2 で３回抽出
した。ＣＨ2 Ｃｌ2 抽出液を合併し、無水Ｎａ2 ＳＯ4
で乾燥し、ヒダ折りの濾紙で自然濾過した。赤色のＣＨ
2 Ｃｌ2 溶液を回転式エバポレーターで蒸発して濃縮し
１０ｍｌの容量とした。ＣＨ2 Ｃｌ2 溶液を、良く攪拌
した２００ｍｌの石油エーテルにゆっくりと滴下するこ
とにより、オレンジ色の固体として錯体を単離した。沈
殿した錯体をガラスフィルター（中程度の孔）上に吸引
濾過して収集した。生成物を、１５ｍｌずつのジエチル
エーテルで３回洗浄した。生成物を真空デシケーター中
ＣａＳＯ 4 により一夜乾燥した。収量：（ｂｐｙ）（Ｄ
ＰＰｅｎｅ）（ｂｐｙｏｘａｌ）Ｏｓ（ＩＩ）2+（Ｃｌ
- ）2 ・２Ｈ2 Ｏを１１０ｍｇ（シス−（ｂｐｙ）（Ｄ
ＰＰｅｎｅ）ＯｓＣｌ2に基づき６３％）。生成物は２
水塩であり、分析的に純粋である：Ｃ57Ｈ54Ｎ4 Ｏ4 Ｐ
2 Ｃｌ2 Ｏｓ・２Ｈ2 Ｏ（分子量＝１１０９．５９ｇ／
ｍｏｌｅ）。理論値：Ｃ，５５．２０％；Ｈ，４．８７
％；Ｎ，５．０５％；Ｏ，５．７７％；Ｃｌ，６．３９
％。測定値：Ｃ，５６．０３％；Ｈ，５．１８％；Ｎ，
４．８８％；Ｏ，６．８７％；Ｃｌ，７．０７％
【化５７】
【０１６２】実施例５７ シス−ジクロロ−ビス−〔４，４′−カルボエトキシ）
−２，２′−ビピリジン〕ルテニウム（ＩＩ）の合成 攪拌子と還流冷却器を装備した２５０ｍｌの丸底フラス
コに、シス−テトラ−（ジメチルスルホキシド）ジクロ
ロルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕ（ＤＭＳＯ）4 Ｃｌ2 ）７
５０ｍｇ（１．５５ｍ ｍｏｌ）とエチレングリコール
１００ｍｌを添加した。フラスコの内容物をアルゴン気
流下に軽く沸騰させ、（４，４′−カルボメトキシ）−
２，２′−ビピリジン７５６ｍｇ（３．０９ｍ ｍｏ
ｌ）を添加した。アルゴン気流下の加熱を５分間継続し
た。オレンジ色の溶液は、褐色／黒色となり、リチウム
クロリド０．７５ｇとエチレングリコール５０ｍｌを添
加した。この溶液をさらに１０分間加熱した。室温に冷
却した後に、混合物に約１００ｍｌのＨ2 Ｏを添加し
た。この混合物を、２００ｍｌずつのＣＨ2 Ｃｌ2 で５
回抽出した。ＣＨ2 Ｃｌ2 抽出液を２００ｍｌずつの水
で６回洗浄した。洗浄する毎に水層を（赤色の）蛍光に
ついてテストし、水層に蛍光が検出されなくなる迄は、
必要があれば洗浄を続けた。ＣＨ2 Ｃｌ2 抽出液を無水
Ｎａ2 ＳＯ4 で乾燥した。生成物のＣＨ2 Ｃｌ2 溶液を
蒸発し、攪拌している１０倍量の無水ジエチルエーテル
に滴下することにより単離した。沈殿した生成物を吸引
により濾取し、３０ｍｌのジエチルエーテルで１度洗浄
し、真空デシケーター中でＣａＳＯ4 により一夜乾燥し
た。収率＝２５％濃いメタリックグリーン結晶。この生
成物は、分析的に純粋である。理論値：Ｃ，４４．５
７；Ｈ，４．０１；Ｎ，７．４３；Ｃｌ，９．４０；
Ｏ，２１．２１。測定値：Ｃ，４４．１６；Ｈ，３．７
２；Ｎ，７．１１；Ｃｌ，９．５３；Ｏ，２０．１５。
分子量＝７５４．５ｇ／ｍｏｌｅ。
【化５８】
【０１６３】実施例５８ ビス〔（４，４′−カルボメトキシ）−２，２′−ビピ
リジン〕２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジ
ン−４−イル）プロピル〕−１，３−ジオキソランルテ
ニウム（ＩＩ）２過塩素酸塩の合成 ビス（４，４′−ジカルボメトキシ−２，２′−ビピリ
ジン）ルテニウム（ＩＩ）ジクロリド２５０ｍｇ（０．
３３ｍ ｍｏｌ）のメタノール／水（１：１）５０ｍｌ
溶液に、２−〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジ
ン−４′−イル）−プロピル〕−１，３−ジオキソラン
（ｂｐｏｘａｌ）１０５ｍｇ（０．３７ｍ ｍｏｌ）を
添加し、この混合物をアルゴン気流下に１２時間還流し
た。この溶液を冷却し、７０％ＨＣｌＯ4 ０．５ｍｌを
添加した。メタノールをゆっくりと蒸発した。沈殿した
赤色結晶を濾取し、少量の冷却した水で洗浄し、ついで
エタノール及びエーテルで洗浄し、真空で乾燥した。ビ
ス（４，４′−ジカルボメトキシ−２，２′−ビピリジ
ン）ルテニウム（ＩＩ）ジクロリドと４−（４−メチル
−２，２′−ジピリジン−４′−イル）−酪酸又は４，
４′−メチル−２，２′−ビピリジンから錯体を合成す
るために、同様の方法を使用した。
【化５９】
【０１６４】実施例５９−ヒトＩｇＧの化合物Ｉによる
標識づけ ２ｍｌのヒトＩｇＧ（２．５ｍｇ／ｍｌ）を２リットル
の０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６に対
し４℃で一晩、穏やかに攪拌しながら透析した。化合物
Ｉを存在するタンパク質（２．７ｍｇ／１００μｌジメ
チルホルムアミド）に対して１００ｍｏｌａｒ過剰に調
製し、溶かした。この透析されたタンパク質を一滴ずつ
ｔａｇ−ａｌｄｅｈｙｄｅに加えた。この間２時間、溶
液を室温で穏やかに攪拌した。タンパク質に対し１００
ｍｏｌａｒ過剰の水素化ホウ素ナトリウム（脱イオン水
に溶かした１．２４ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌ）をこの
溶液に加え、室温でさらに３０分間穏やかに攪拌を続け
る。この結合体を室温で０．２Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．
０で平衡化したセファデクスＧ−２５カラム（１．０ｃ
ｍ×１８．０ｃｍ）にかけ、溶出液を２８０ｎｍでモニ
ターした。ボイドボリュームのピークを集め、合わせて
２リットルのＴｒｉｓ緩衝液に対し透析した。この結合
体に対し標準的なＥＬＩＳＡ法で免疫学的活性をテスト
し、使用時まで４℃で貯蔵した。
【０１６５】実施例６０−Ｂｉｏｍａｇ／ヤギ−抗ヒト
ＩｇＧ粒子の製法 ５％Ｂｉｏｍａｇ−ａｍｉｎｅ ｔｅｒｍｉｎａｌｅｄ
粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｒｅｔｉｃｓ，Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を２．５ｍｌ清浄なＴ−フラスコ
に入れ、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗った。
このｗｅｔ ｃａｋｅを１２．５ｍｌの５％新しいグル
タルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、外界温度で
３時間十分に回転させた。このｗｅｔ ｃａｋｅを別の
Ｔ−フラスコに移しＰＢＳで３回洗浄した。この活性化
された粒子を１２．５ｍｌのＰＢＳに再び懸濁し、１５
ｍｌの遠沈管に移した。この懸濁液に２ｍｌのＰＢＳに
溶かした１２．５ｍｇのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）
（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を加えた。この管を室温
で３時間十分に回転し、次に４℃で一晩回転させる。翌
日この粒子を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含むＰＢＳで２回洗浄し、次に０．１％ＢＳＡを
含む１２．５ｍｌのＰＢＳ中で４℃で使用時まで貯蔵す
る。
【０１６６】実施例６１−Ｂｉｏｍａｇの磁気に基づく
粒子アッセイを用いた偽ホモジニアスヒトＩｇＧエレク
トロ化学ルミネセンスアッセイ 化合物Ｉ−ヒトＩｇＧ結合体を０．１％ＢＳＡを含む
０．１５Ｍリン酸緩衝液で１：５０に希釈し、１本の試
験につき２５０μｌずつ入れた。希釈剤（上述と同様Ｐ
Ｂ ｗ／ＢＳＡ）を１５０μｌずつ試験管に注ぎ、次に
様々な希釈率の目的の分析物質（ヒトＩｇＧ）又は希釈
剤（陰性対照）を加えた。さらに非特異的目的の分析物
質（ヤギ−抗ウサギＩｇＧ）を特異性のアッセイをチェ
ックする為に試験管数本に入れた。ヤギ抗ヒトＩｇＧ
（Ｈ＆Ｌ）と結合した１％Ｂｉｏｍａｇを５０μｌ各々
の試験管に加えた。この試験管はｖｏｒｔｅｘ上で混合
され、室温で穏やかに振盪しながら１５分間反応させ
た。この粒子を溶液から磁気的に除去し、得られた上澄
み液１００μｌをＢｅｒｔｈｏｌｄ管に移し、ここに４
００μｌのクエン酸塩−シュウ酸塩−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００溶液を加えた。この管をｖｏｒｔｅｘ上で混合
し、Ｒ−２６８光電子増倍管及び直径０．２９インチの
輪状の５２ゲージ二重白金メッシュ電極が付いた改良型
Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターで測定した。この電極
は、ポリカーボネートの支持体で覆われ、直径０．０１
インチの白金線／銀ペイント・コンタクトを介して電圧
源に接続されている伝導性ペイントによって支持されて
いる。加電圧は＋１．４から＋２．１５Ｖまでステップ
して、この間１０秒間の積算をした。測定と測定の間に
はこの電極を脱イオン水ですすぐ事により電気化学的に
清浄にし、次にシュウ酸とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を
含む０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液に浸漬し、加
電を−２．２Ｖから＋２．２Ｖまで（各々の電圧で３秒
間）２分間及び２０秒間ステップし、＋２．２Ｖのｐｏ
ｔｅｎｔｉａｌで１０秒間保持した。この電極を洗浄液
から取り出し、脱イオン水ですすぎ、水気を吸い取って
乾かした。この方式に於いてはエレクトロ化学ルミネセ
ントシグナルは目的の分析物質の濃度に直接比例した。
【０１６７】実施例６２−ビス（２，２′−ビピリジ
ン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビ
ピリジン−４′−ブチルアミドルテニウム（ＩＩ）二過
塩素酸塩：化合物ＩＶの製法 実施例３２に記載されている方法で５００ｍｇ（１．３
５×１０-3ｍｏｌ）のフタルイミドから調製した４−
〔４−（１−アミノブチル）〕−４′−メチル−２，
２′−ビピリジンを無水ピリジンに０．３１３ｇ（１．
４８×１０-3ｍｏｌ）のマレイミドヘキサン酸と０．３
０６ｇ（１．４８×１０-3ｍｏｌ）のＤＤＣと共に溶解
した。一晩攪拌した後、ジシクロヘキシル尿素を濾過に
より除去し、ピリジンを真空下で蒸発させた。この残留
物をカラムクロマトグラフィー（活性ＩＩアルミナ、５
％ＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 ）で精製し、精製された生成
物を得た。収量：０．５６ｇ（９５％）。１００ｍｇ
（２．３×１０-4ｍｏｌ）のマレイミド−ヘキサン酸、
４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチルアミ
ド及び１００ｍｇ（２．０６×１０ -4ｍｏｌ）のビス−
（２，２′−ビピリジン）ルテニウム二塩化物二水和物
を５０ｍｌのエタノール／水（１：１）に溶かし、アル
ゴンで脱気して４時間還流した。得られた透明の橙色溶
液を２５ｍｌの固体過塩素酸ナトリウム、２５ｍｌのエ
タノール、及び２５ｍｌのアセトンで希釈し、真空状態
でゆっくりと蒸発乾固させた。乾固したら、さらに２５
ｍｌの水と２５ｍｌのアセトンを加え、この溶液を約１
５〜２０ｍｌになるまでロータリーエバポレーターで濃
縮した。沈殿した固体を集め水で洗い乾燥させた。この
試料は１：９メタノール／クロロホルムの溶媒系でアル
ミナの調製用ＴＬＣで精製した。ここで速く展開してき
たバンドをプレートをかき取り、本化合物をメタノール
／クロロホルム（１：１）中で攪拌する事により溶離さ
せて分離した。アルミナを取り除く為に濾過した後、橙
色の溶液を蒸発乾固させ８６．７ｍｇの精製された化合
物を得た（７２％）。この構造はＮＭＲにより確認され
た。
【０１６８】実施例６３−化合物ＩＶによるｈＣＧペプ
チドの標識づけ ２ｍｇのヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）ペプチド
（＃１０９−１４５、ＪＰ１４１、Ｖｅｒｎｏｎ Ｓｔ
ｅｖｅｎｓ，Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ）を１ｍｌの０．１５Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ６．
０に懸濁し、１．１３ｍｇの化合物ＩＶは３００μｌの
ジメチルホルムアミドに溶かした。このペプチド溶液を
一滴ずつ１分間以上かけて化合物ＩＶ溶液に加えた。こ
の溶液を室温で１時間穏やかに攪拌した。次にこの試料
を、室温で０．２Ｍ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ８．５で流速
１５ｍｌ／ｈｒで平衡化されたＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−２
カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；１ｃｍ×４５ｃｍ）にかけ、
溶出液を２８０ｎｍでモニターした。このボイドボリュ
ームを集め、合わせて、室温で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．０で平衡化されたＱＡＥ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ａ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；１ｃｍ×
１０ｃｍ）にかけた。これは未標識の全てのペプチドを
取り除く為に行なった。（この未標識のペプチドは陽性
にチャージした樹脂に吸着され、プラス電荷の標識され
たペプチドはそのままカラムを通過する。この溶出液は
２８０ｎｍでモニターされ、最初の主なピークを集め凍
結乾燥により濃縮した。乾燥させた固体を再び最少量の
ＰＢＦに懸濁した。このｈＣＧペプチド−化合物ＩＶ結
合体は使用時まで４℃で貯蔵された。
【０１６９】実施例６４−ＤＥＡＥ ＡＦＦＩ−Ｇｅｌ
Ｂｌｕｅクロマトグラフィーによるウサギ抗ｈＣＧペ
プチドの精製法 ４ｍｌのＤＥＡＥ ＡＦＦＩ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）をクロマトグラフィー用のカラム（１ｃｍ
×１０カラムサイズ）に注ぎ、室温で０．０２８Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用い流速４
０ｍｌ／ｈｒで１時間かけて平衡化した。この流速を２
０ｍｌ／ｈｒに下げ、予めこのカラム緩衝液に対し透析
されたウサギ抗−ｈＣＧペプチド（ａｎｔｉ １０９−
１４５、Ｖｅｒｎｏｎ Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｏｈｉｏ Ｓ
ｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を１ｍｌこのカラム
にかけた。１ｍｌずつのフラクションを集め、溶出液は
２８０ｎｍでモニターした。ボイドボリュームのピーク
を集め、数回の実験分を合わせ、ポリエチレングリコー
ル６，０００（Ｓｉｇｍａ）で囲まれた１２Ｋ ＭＷＣ
Ｏ透析サックにこの溶出液を入れる事により濃縮した。
この抗体について標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて免疫学
的活性をテスト、ＨＰＬＣにより純度をテストした。Ｈ
ＰＬＣの結果、ひとつの大きなピークを得、これは純粋
で活性のある製剤である事を示している。
【０１７０】実施例６５−精製されたウサギ抗ｈＣＧペ
プチドに対するｈＣＧペプチド−化合物ＩＶ結合体の滴
定：エレクトロ化学ルミネセンスシグナルの変調 ｈＣＧペプチド−化合物ＩＶ結合体を０．１Ｍクエン酸
ｐＨ６．２を含む０．１Ｍリン酸緩衝液で希釈した。こ
の混合物の一部をｍｉｃｒｏｆｕｇｅ管に入れた。予め
精製された抗ペプチド抗体を様々な濃度に希釈し、この
管に加え、Ｖｏｒｔｅｘで混合した後室温で１時間反応
させた。エレクトロ化学ルミネセントを測る直前に、こ
の一部をシュウ酸とＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇ
ｍａ）の入ったＢｅｒｔｈｏｌｄ管に移した。この管を
Ｖｏｒｔｅｘで混合し、Ｒ−２６８光電子増倍管を用
い、二重白金メッシュの電極を持つＢｅｒｔｈｏｌｄ
ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒでＳｗｅｅｐモード（＋１．５
から＋２．５Ｖまで５０ｍＶ／ｓｅｃで３回走査し、２
回目の走査のピーク高を測定値とする）を使って測定し
た。測定の間にこの電極を電気化学的に清浄にした。最
初にこれを脱イオン水で洗い、次にこれを２５ｍＭのシ
ュウ酸塩と１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むｐＨ
６．１の０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液に浸漬し
た。加電圧は各電圧に於いて３秒間、＋２．２Ｖと−
２．２Ｖの間を１分間及び５０秒間スイッチを入れ、＋
２．２Ｖで１０秒間保持した。次に電気を切り、洗浄液
から電極を取り出し脱イオン水ですすぎ、水気を吸い取
って乾かした。この結果はエレクトロ化学ルミネセント
シグナルはこのペプチドに対する抗体の濃度に直接比例
するという一般的傾向を示した。この事はエレクトロ化
学ルミネセンスで標識された分析対象物が抗体と接触す
るとエレクトロ化学ルミネセンスシグナルが落ちるその
他の実験とは対照的である。
【０１７１】実施例６６−エレクトロ化学ルミネセンス
シグナルの出力：Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ結合体の
安定性に関するデータ Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ共役物を１％の正常なヒト
血清（ＮＨＳ）を含むか或いは含まない０．１Ｍリン酸
塩−クエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．１で３００ｎＭまで希
釈した。各々の緩衝液の種類のうちひとつを４°、２０
°、３０°、及び５０℃でインキュベートし、３、４、
及び５日目に試料を採取した。この試料は室温と平衡状
態にし、そのエレクトロ化学ルミネセンスシグナル出力
を測定した。４００μｌの試料を試験管内で１００μｌ
の１２５ｍＭシュウ酸−５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
と混合し、浜松Ｒ−２６８光電子増倍管と二重メッシュ
白金ガーゼ電極の付いた改良型Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノ
メーターに入れた。測定は加電圧を＋１．５Ｖから＋
２．５Ｖまで５０ｍＶ／ｓｅｃで３回スイープし、２回
目のピーク高を記録し、エレクトロ化学ルミネセンスの
カウントに変換する事により測定した。測定の間、電極
を電気化学的に清浄にした。脱イオン水ですすぎ、電極
を２５ｍＭシュウ酸塩と１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液に浸漬し、
−２．２Ｖから＋２．２Ｖまで３秒間の休止をして、各
電圧１分間及び５０秒間、電圧を脈送した。電圧を＋
２．２Ｖで１０秒間止め、次に取り除いた。電極を洗浄
液から取り除き、脱イオン水で洗い、水気を吸い取って
乾かした。この結果は実験の全過程を通じて各々の緩衝
液の種類で一貫したシグナルが存在する事を示してい
る。この事は本試薬の安定性とこれがエレクトロ化学ル
ミネセンスシグナルを発生する能力がある事を示してい
る。
【０１７２】実施例６７−Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩＩ
結合体の免疫学的反応性試験：安定性に関する実験 本Ｒｕ（ＩＩ）−化合物ＩＩ結合体を実施例６６で述べ
た条件で希釈し、インキュベートした。試料を３、４、
及び５日目に採取し、室温にまで冷却し、Ｐａｎｄｅ
ｘ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｄｅｌｅｉｎ，ＩＬより入手した
Ｐａｎｄｅｘ Ｓｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅを用いて
Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＰＣＦ
ＩＡ）により免疫学的反応性をテストした。このＰＣＦ
ＩＡは競合的アッセイ方式で行なった。このラテックス
粒子（Ｐａｎｄｅｘ）をテオフィリン−ＢＳＡと結合さ
せた。これらの粒子の一定量をＲｕ（ＩＩ）−化合物Ｉ
ＩＩ結合体テスト溶液と抗テオフィリンモノクローナル
抗体（腹水、Ｈｙｃｌｏｎｅ ｃａｔ ＃Ｅ−３１２０
Ｍ、ｌｏｔ ＃ ＲＤ２００）の最終濃度まで、及び一
定量のヤギ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ結合体（Ｐａｎｄｅ
ｘ、ｃａｔ ＃３３−０２−１、ｌｏｔ ＃Ｃ０１）と
混合した。インキュベーションの後、この試料を加工
し、ＰａｎｄｅｘＳｃｒｅｅｎ Ｍａｃｈｉｎｅで測定
した。この結果は５５℃で５日間のインキュベーション
の後に於いてさえ目に見えるほど活性は失われなかった
事を示している。
【０１７３】実施例６８−様々なルテニウム及びオスミ
ウム化合物のエレクトロ化学ルミネセンス 様々なオスミウム及びルテニウム化合物を１０ｍｌの窒
素でパージしたアセトニトリルに１０ｍＭの濃度で溶か
した溶液として、電解質には１Ｍテトラブチルアンモニ
ウムテトラフルオロホウ酸塩を用いて電気化学的に測定
した。電解用電極はＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌａｆａｙｅｔｔ
ｅ，ＩＮより入手した白金ディスク電極である。白金線
対向電極と１．０ｍｍの銀線を参照電極として使用し
た。測定は走査速度１００ｍＶ／ｓｅｃで−２．２Ｖか
ら＋２．２Ｖまで（ｖｓ ＳＣＥ）走査する事により実
施した。各々の電気化学的測定の後、飽和カロメル参照
電極（ＳＣＥ）と銀線との間の電圧差を測定した。従っ
て報告される値はＳＣＥに対する電圧に補正されてい
る。エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）の測定を
０．１Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４．２）、
２５ｍＭシュウ酸、及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む０．５ｍｌの水溶液中で行なった。使用した電極
システムは０．１ｍｍの白金線でＲａｄｉｏ Ｓｈａｃ
ｋ トランジスタソケット（＃２７６−５４８）に接続
された２つの白金ガーゼ（５２ゲージ）電極から構成さ
れていた。この電極は６０ｍｌのセルロースアセテート
プラスチックの薄片の外側に取り付けられた。このプラ
スチックには直径１／４インチの穴があけられており、
電解用と対向−参照電極の間を容易に溶液が流れる事の
出来るようになっている。ひとつの電極が電解用（これ
は光電子増倍管に近い）として機能し、もうひとつの電
極が対向及び参照電極として機能するためにこれらの電
極をポテンショスタットに接続した。測定は走査速度５
０ｍＶ／ｓｅｃで１．５Ｖから２．５Ｖまで（バイアス
電圧）走査して行なった。Ｅｃｌの測定は化合物の与え
られた濃度に於けるシグナル対ノイズの割合、即ち、又
はシグナル対バックグランドの割合として報告する。
【０１７４】バックグランドはＥｃｌ化合物の添加され
ていない緩衝液に対し観測されるルミネセンスカウント
数と定義される。ルミネセンスの測定値は第１回目又は
第２回目の線型走査の間に観測されるピーク光出力とし
た。エレクトロ化学ルミネセンス（ＥＣＬ）及びサイク
リックボルタンメトリーの測定の双方を各々の溶液につ
いて、Ｕｒｓａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄより入手
したＥＧ ＆ ＧＭｏｄｅｌ ２７３ポテンショスタッ
ト又はビポテンショスタットを用いて実施した。各々の
ＥＣＬの測定に於ける光子流はＷｉｌｅｂａｄ，Ｗｅｓ
ｔ Ｇｅｒｍａｎｙより入手したＢｅｒｔｈｏｌｄ Ｂ
ｉｏｌｕｍａｔ ＬＢ ９５００ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅ
ｒでモニターした。この装置は０．５ｍｌの測定溶液中
に２〜３個の電極システムが設置できる様に改変されて
いる。電気化学的及びエレクトロ化学ルミネセントの測
定はともにＤｅｌｆｔ，Ｈｏｌｌａｎｄより入手したＫ
ｉｐｐ ＆ Ｚｏｎｅｎ Ｍｏｄｅｌ ＢＤ９１Ｘ、
Ｙ、Ｙ′レコーダーにより記録した。目的の化合物を
３．０ｍｌのＥＣＬ溶液に溶かすか、或いはＥＣＬ溶液
に溶けない場合はアセトニトリルに溶かして、これを５
０ｍｌ用い、蛍光の測定を行なった。測定はＰｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５型蛍光分光光度計で行なっ
た。最大励起波長を照射中に発光スペクトルが測定で
き、逆に、最大発光波長をモニターする間に励起スペク
トルを記録できるようにする為に、励起及び発光スペク
トルを記録する前にこの溶液の励起及び発光スペクトル
の予備走査を実施した。
【表１７】 Eox Ered 蛍光発光 ECL(S/N)1 化合物 VS.SCE 最大値の波長 及び濃度 a) Ru(bipy)3 1.07V-1.52V 625 nm 1×10-9M (2.5) b) Ru(4,4'- 1.19V N.D. 628 nm 2×10-9M CO2-bipy)3 (4.05) c) Ru(4,4' CO2 1.54V-0.89V 636 nm 1×10-10M -Et-bipy)3 (2.01) d) Ru(bipy)2 1.17V N.D. 624 nm 1×10-9M (C-8-theo- (.97) phylline C-4-bipy) e) Os(bipy)2 1.82V-0.99V 585 nm 1×10-8M (CO)(Py) f) Os(DPPene) 1.60V N.D. 630 nm 6×10-8M (bpy)(bpyoxal) (10.8)
【０１７５】1（Ｎ／Ｓ）はシグナルを与えられた濃度
に於ける化合物のＥＣＬ出力（ルミネセンスのカウント
数）として定義し、ノイズを化合物が溶解している緩衝
液自体のルミネセンスのカウントと定義した際のシグナ
ル対ノイズの割合である。ｐＨ４．２で測定したその他
の化合物のＥＣＬと異なり、化合物ｃ）は生理学的なｐ
Ｈ７に於いてもかなりのＥＣＬを示す。 ａ） トリス（２，２′−ビピリジン）ルテニウム2+ ｂ） トリス（４，４′−カルボン酸−２，２′−ビピ
リジン）ルテニウム2+ ｃ） トリス（４，４′−カルボエトキシ−２，２′−
ビピリジン）ルテニウム2+ ｄ） 二塩化ビス（２，２′−ビピリジン）〔テオフィ
リン−８−酪酸−４−（４−メチル−２，２′−ビピリ
ジン）−４′−ｙｌ）−ブチル）アミド〕ルテニウム
（ＩＩ） ｅ） ジヘキサフルオロリン酸〔ビス−（２，２′−ビ
ピリジン）｛モノカルボニル｝ピリジル〕オスミウム
（ＩＩ） ｆ） 二塩化（２，２′−ビピリジン〔シス−ビス
（１，２−ジフェニルホスフィン）エテレン〕｛２−
〔３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イ
ル）プロピル〕−１，３−ジオキソラン｝オスミウム
（ＩＩ）
【０１７６】実施例６９−ビス（２，２′−ビピリジ
ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブ
チルアミン〕ルテニウム（ＩＩ）二過塩素酸 １．２９ｇ（２．４８ｍ ｍｏｌ）の二塩化ビス−
（２，２′−ピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二水和物
（Ｓｔｒｅｍ）及び０．７１９ｇ（２．９８ｍ ｍｏ
ｌ）の４−〔４−（１−アミノブチル）〕４′−メチル
−２，２′−ビピリジン（実施例３２で記載されてい
る）を５０ｍｌの５０／５０エタノール／Ｈ2 Ｏに懸濁
し、アルゴン存在下で３時間還流した。この反応溶液を
濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５のクロマトグラフ
ィーによる分離を行ない、最初に蒸留水で、続いて０．
２５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。最後に０．４Ｍ ＮａＣ
ｌで溶出させた。本生成物を含むフラクションを約１０
０ｍｌまで濃縮し、この溶液が濁るまで過塩素酸を加え
た。一晩冷蔵し、本生成物の赤橙色結晶（１．２１５
ｇ）を得た。元素分析の結果構造は以下の様に確認され
た：
【化６０】
【０１７７】実施例７０−テオフィリン−８−（３，３
−ジメチル）酪酸の製法 ５，６−ジアミノ，Ｎ1 ，Ｎ3 −ジメチルウラシル水和
物（１０ｇ、０．０５９ｍｏｌ）及び３，３−ジメチル
グルタミン酸無水物（１２．６ｇ、８．８５×１０-2ｍ
ｏｌ）を１００ｍｌ Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンに溶か
し、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを使って還流した。
この反応の内容物は加熱後可溶化し、橙赤色に変化し
た。４時間の還流後、１ｍｌの水がこのトラップ中に集
まった。これはこの反応の完了を示している。この反応
物を室温まで冷却した。この時、全体が固まっていた。
この固体をｆｒｉｔｔｅｄ ｆｕｎｎｅｌ上で濾過し、
色が淡黄色になるまで洗った。ＤＭＦから２回再結晶さ
せた後、中間生成物であるラクタムの純粋な白色結晶
（融点２８３．１−２８４．９℃）を得た。このラクタ
ムを水の中で８時間煮沸した。冷却するとこの溶液から
純粋な白色の結晶（融点２１８−２２０℃）が生じた。
プロトンＮＭＲと元素分析から以下の構造が確認され
た：
【化６１】
【０１７８】実施例７１−ビス−（２，２′−ビピリジ
ン）〔テオフィリン−８−（３，３−ジメチル酪酸−
｛４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ｙ
ｌ）−ブチル｝アミドルテニウム（ＩＩ）二過塩素酸 １００ｍｇ（０．３４ｍ ｍｏｌ）のテオフィリン−８
−（３，３−ジメチル）酪酸及び０．３２５ｇ（０．３
４ｍ ｍｏｌ）の二過塩素酸ビス（２，２′−ピリジ
ン）〔４−（４′−メチル−２，２′−ビピリジン）ブ
チルアミンルテニウム（ＩＩ）を０．３５１ｇ（１．７
ｍ ｍｏｌ）のジシクロヘキシルカルボジイミドと共に
１０ｍｌの無水ピリジンに溶かした。２日間攪拌して反
応させた。多量のジシクロヘキシル尿素の沈殿を濾過に
より除去し、真空状態でこのピリジン溶液を濃縮した。
この残留物をメタノールに溶かし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
ＬＨ−２０のクロマトグラフにかけた。目的とするフラ
クションを濃縮し、生成物をエーテルで沈殿させ、橙色
の沈殿物を得た。元素分析とプロトンＮＭＲの結果、構
造は以下のとおりである：
【化６２】
【０１７９】実施例７２−テオフィリン−８−プロピル
（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル）
カルボン酸アミドの製法 ６１．８ｍｇ（１．５５×１０-4ｍｏｌ）の８−（ガン
マ−アミノプロピル）テオフィリンフタル酸ヒドラジド
塩を１ｍｌの水に溶かし、ＨＣｌで酸性にした。沈殿さ
せたフタル酸のヒドラジドを濾過により除去し、水溶性
の濾液を蒸発乾固し、真空中で乾燥させて３４．５ｍｇ
（１．３１×１０-4ｍｏｌ）のテオフィリン−８−プロ
ピルアミン塩酸塩を得た。この物質を５ｍｌの無水ピリ
ジンに溶かし、３６．９ｍｇ（１．４４×１０-4ｍｏ
ｌ）の４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′
−ｙｌ）酪酸と２６．４ｍｇ（２．６２×１０-4ｍｏ
ｌ）のトリエチルアミンをこれに加えた。最後に２９．
７ｍｇ（１．４４×１０-4ｍｏｌ）のジシクロヘキシル
カルボジイミドをこの溶液に加えた。得られた濁った溶
液を一晩攪拌した。沈殿した塩とジシクロヘキシル尿素
を濾過により除去し、この溶液を蒸発乾固させて白色固
体を得、これを溶出剤として５％のメタノールを含むジ
クロロメタンを用いたアルミナのクロマトグラフにかけ
た。生成物は白色粉末（融点２１５°−２１６．５℃）
として４４．２ｍｇ（７１％）得られた。プロトンＮＭ
Ｒ及び元素分析により以下の構造が確かめられた：
【化６３】
【０１８０】実施例７３−二塩化ビス−（２，２′−ビ
ピリジン）〔テオフィリン−８−プロピル（４−メチル
−２，２′−ビピリジン−４′−ブチル）カルボンアミ
ド〕ルテニウム（ＩＩ）の製法 １００ｍｇ（２．０６×１０-4ｍｏｌ）の二塩化ビス
（２，２′−ビピリジン）ルテニウム（Ｓｔｒｅｍ）及
び１０８ｍｇ（２．２７×１０-4ｍｏｌ）のテオフィリ
ン−８−プロピル（４−メチル−２，２′−ビピリジン
−４′−ブチル）カルボンイミドをアルゴンで脱気した
５０％エタノールに加えた。この溶液を加熱還流した。
得られたチェリーレッドの溶液を室温で高真空で濃縮し
た。この残留物を溶出剤にメタノールを用いてＳｅｐｈ
ａｄｅｘ ＬＨ−２０（７５ｃｍ×１９ｍｍ Ｉ．
Ｄ．）でクロマトグラフした。生成物のバンドを分離
し、溶媒をとばして、無水エーテル中に入れ沈殿させ
た。本生成物の収量は１５６ｍｇ（７５％）であった。
元素分析の結果、本生成物中には４モルのメタノールが
存在している事が示された。分析結果：計算上；Ｃ，５
４．０９；Ｈ，５．６５；Ｎ，１４．１６；Ｏ，１０．
２９；Ｃｌ，６．５２：実測；Ｃ，５３．３０；Ｈ，
５．２２；Ｎ，１４．５６；Ｏ，１０．６３及びＣｌ，
６．９５。
【化６４】
【０１８１】実施例７４−二過塩素酸ビス（２，２′−
ビピリジン）〔１−ブロモ−４−（４′−メチル−２，
２′−ビピリジン−４−ｙｌ）ブタン〕ルテニウム（Ｉ
Ｉ）の製法 実施例３１で調製された配位子１−ブロモ−４−（４′
−メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）ブタンを
０．２９ｇ及び二塩化ビス（２，２′−ビピリジン）ル
テニウム（ＩＩ）を０．３２ｇ、６０ｍｌの１：１ｖ／
ｖエタノール／水の入ったフラスコに入れた。この溶液
を窒素で１５分間脱気した。反応は窒素中で３．５時間
加熱還流して行なった。ＮａＣｌＯ4 の飽和水溶液を冷
却したこの赤色溶液に加えた。真空下で溶媒を除き、深
赤色の残留物を溶離剤としてアセトニトリル／トルエン
１：１ｖ／ｖを用いたアルミナのカラムクロマト（２０
ｃｍ×２．５ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ、天然活性３）にかけ
た。本生成物はカラムより暗赤色のバンド（バンド＃
２）として溶出した。目的とするフラクションを集め、
約１０ｍｌのジクロロメタンに再び溶かし、無水エチル
エーテルより沈殿させ、最後に真空下で乾燥させて３２
０ｍｇ（５３％）の収量の本生成物を得た。本生成物の
構造は元素分析とスペクトル特性により確認され、以下
に示す。
【化６５】
【０１８２】実施例７５−二過塩素酸ビス（２，２′−
ビピリジン〔テオフィリン−９−〔４−（４−メチル−
２，２′−ビピリジン−４′−ｙｌ）ブタン〕ルテニウ
ム（ＩＩ）の製法 テオフィリンの銀塩はテオフィリンのアンモニア溶液
（２５ｍｌ ｃｏｎｃ．ＮＨ4 ＯＨ及び７５ｍｌの水中
に２．１６８ｇ）と硝酸銀のアンモニア溶液（１０ｍｌ
ｃｏｎｃ． ＮＨ4 ＯＨ及び３０ｍｌ Ｈ2 Ｏ中に
２．００６ｇ）を共に混合し、暗い状態で反応させる事
により調製した。この２つの溶液を混合させた直後、白
色の生成物が出現した。生成物の沈殿が完了したら、こ
の沈殿物を６０ｍｌ ｍｅｄｉｕｍ ｇｌａｓｓ ｆｒ
ｉｔ上で濾過する事により集めた。この沈殿物を希アン
モニア水で洗浄し、真空下で乾燥させた。テオフィリン
の銀塩の構造は元素分析により確認した。４１ｍｇのテ
オフィリンの銀塩及び１２２ｍｇの二過塩素酸ビス
（２，２′−ビピリジン）〔１−ブロモ−４−（４′−
メチル−２，２′−ビピリジン−４−ｙｌ）ブタン〕ル
テニウム（ＩＩ）を１５ｍｌの無水ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）に溶かし、反応は暗条件で行なった。得ら
れた赤色溶液はアルゴンで脱気し、２４時間加熱還流
し、次に室温までアルゴン存在下で冷却した。この溶液
の冷却は氷点まで続け、次にこの黒色の銀金属懸濁液を
濾過し、５ｍｌのアセトンで洗浄した。赤色の濾液を
０．２ｇの過塩素酸ルテニウムで処理し、ＬｉＣｌＯ 4
を溶解した後この溶液を真空下で蒸発乾固させ、赤色の
残留物を暗条件で一晩真空中に置き乾燥させた。この試
料を３−５ｍｌのメタノールに溶かし、０．２５ｇの無
水ＬｉＣｌＯ4 を加え、溶かした。得られた溶液は溶出
剤にメタノールを使用したＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２
０のカラム（７５ｃｍ×１９ｃｍ ｉ．ｄ．）にかけ
た。主生成物はフラクション＃２（暗赤色バンド）とし
て溶出した。フラクション＃２を濃縮し、メタノールに
再び溶かし、エチルエーテルに注いで沈殿させた。この
生成物を真空下で乾燥させ、８０ｍｇ（５０％収率）の
物質を得た。この構造は元素分析と赤外線及び発光スペ
クトルで確認した。
【化６６】
【０１８３】 引用文献 １． Ｗｅｂｅｒ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏａｎａ ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｉｎｔｅｒｆ ｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔ ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｓ（２，２′−ｂｙｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｒｕ ｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｔ ｅｒｆｅｒｅｎｔｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｙ，２９，１６ ６５−１６７２（１９８３）。 ２． Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉ． ａｎｄ Ｂａｒｄ，Ａ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔ ｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．３７． Ａｑｕｅｏｕｓ ＥＣＬ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｒｕ（２ ，２′−ｂｙｐｙｒｉｄｉｎｅ）3 2+ ａｎｄ Ｏｘａｌａｔｅ ｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３， ５１２−５１６（１９８１）。 ３． Ｗｈｉｔｅ，Ｈ．Ｓ． ａｎｄ Ｂａｒｄ，Ａ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｇ ｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．４１．Ｅｌｅ ｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａ ｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｕ（２， ２′−ｂｐｙ）3 2+−Ｓ2 Ｏ8 -2 Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ａｃｅｔｏｎｉ ｔｒｉｌｅ Ｗａｔｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ ｏｃ．，１０４，６８９１（１９８２）。 ４． Ｃｕｒｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ；Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｔ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｉ ｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ ｇｒａｐｈｙ，１３４，３４３−３５０（１９７７）。 ５． Ｓｐｒｉｎｔｓｃｈｎｉｋ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ ｎ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）Ｃｏｍｐｌｅｘｅ ｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ａｎｄ ａｔ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，Ｊ．Ａｍ Ｃｈｅｍ．Ｓ ｏｃ．，９９，４９４７−４９５４（１９７７）。 ６． Ｍｉｎｎｉｃｈ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ，Ａｐｐｌ． ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃ ｒｏ．，４３，１１２４−１１２７（１９８２）。
【０１８４】 ７． Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｉ ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．，４４，３８１−３ ８４（１９８１）。 ８． Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓ ｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌ Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍ ｙｅｌｏｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎ ｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，７３，１４７−１５６ （１９８４）。 ９． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ ｂｙ ｅｎ ｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ ａｎｄ ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｄ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔ ｉｂｏｄｙ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌ． ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ． １０． Ａｍｅｒｉｃａｎ ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ ｏｎ，Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘａｍｉ ｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ． １ ５ｔｈ ｅｄ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓ ｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）。 １１． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉ ｏｎ，Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏ ｏｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉ ａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７６）。 １２． Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．，Ｇｅｌｄｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｅ．，Ｌｅｓｔｅｒ ，Ｈ．Ｌ．， ａｎｄ Ｋａｂｌｅｒ，Ｐ．Ｗ．，Ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａ ｎｅ ｆｉｌｔｅｒ ｉｎ ｓａｎｉｔａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｐ．６６：９５１−９５７（１９ ５１）。
【０１８５】 １３． Ｆｅｎｇ，Ｐ．， ａｎｄ Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐ．Ａ．，Ｆｌｕｏｒｏ ｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｎｆｉｒ ｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．，Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１３２０−１３２９（１９ ８２）。 １４． Ｇｅｌｄｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｅ．，Ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ Ｒ ｅｖｉｓｉｏｎｓ（１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）ｆｏｒ Ｃｏｎｖｅｎｔ ｉｏｎａｌ ｃｏｌｉｆｏｒｍ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｉｎ：Ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｗｏｒｋｓｈｏｐ，８５ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍ ｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏ ｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５）。 １５． Ｈｕｓｓｏｎｇ，Ｄ．，Ｃｏｌｗｅｌｌ，Ｒ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗｅｉｎ ｅｒ Ｒ．Ｍ．，Ｒａｔｅ ｏｆ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｆａｌ ｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｏｔａｌ ｃｏ ｌｉｆｏｒｍｓ ｍｏｓｔ−ｐｒｏｂａｂｌｅ−ｎｕｍｂｅｒ ａｎａｌ ｙｓｉｓ ｏｆ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ ａｎｄ ｅｓｔｕａｒｉｅｓ．Ａ ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：９８１−９８３（ １９８０）。 １６． Ｈｕｓｓｏｎｇ，Ｄ．，Ｄｅｍａｒｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｒ． Ｍ．，ａｎｄ Ｃｏｌｗｅｌｌ，Ｒ．Ｒ．，Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｓｓｏ ｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｓｔ−ｐ ｒｏｂａｂｌｅ−ｎｕｍｂｅｒ ｃｏｌｉｆｏｒｍ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕ ｌｔｓ ｆｏｒ ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ ａｎｄ ｅｓｔｕａｒｉｅｓ，Ａ ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：３５−４５（１９ ８１）。 １７． Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｉｆｏｒｍ ｔｅ ｓｔｓ ｆｏｒ ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｆｆ ｌｕｅｎｔｓ，Ｊ．Ｗａｔｅｒ Ｐｏｌｌｕｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆｅｄ ．４５：４９８−５０６（１９７３）。
【０１８６】 １８． Ｍｃｋｅｅ，Ｊ．Ｅ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｒ．Ｔ． ａｎｄ Ｌ ｅｓｇｏｕｒｇｕｅｓ，Ｐ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ ｆｉｌｔｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂａ ｃｔｅｒｉａｌ ａｓｓａｙ ｏｆ ｓｅｗａｇｅ ＩＩＩ． Ｅｆｆｅ ｃｔｓ ｏｆ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｓｉ ｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｅｗａｇｅ Ｉｎｄ． Ｗａｓｔｅ ３０：２４５ −２５２（１９５８）。 １９． Ｍｅａｄ，Ｊ．Ａ．Ｒ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｎ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉ ａｍｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｓ ｏｆ ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ ａｎｄ ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕ ｓｅ ｉｎ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６ １：５６９−５７４（１９５４）。 ２０． Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｈ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ ｃｏｌｉｆｏｒｍ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｓｅａｗａｔｅｒ ｂｙ ｍ ｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ−ｐｒｏｂａｂｌｅ− ｎｕｍｂｅｒ ｍｅｔｈｏｄ．Ａｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ，３６：４３８−４４４（１９７８）。 ２１． Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，Ｍ．Ｗ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂ ｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｎｕｍｅｒａｔｉ ｎｇ ｃｏｌｉｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｆｅｃａｌ ｃｏｌｉｆｏｒｍｓ ｉｎ ｅｓｔｕａｒｉｎｅ ｗａｔｅｒｓ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉｏｎａ ｌ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｓａｎｉｔａｔｉｏｎ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．１ ９７４：１２７−１３１（１９７４）。
【０１８７】 ２２． Ｐｒｅｓｓｗｏｏｄ，Ｗ．Ｇ．，ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｋ．，Ｍ ｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＦＣ ｍｅｄｉｕｍ ｂｙ ｅｌｉｍ ｉｎａｔｉｎｇ ｒｏｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ，Ａｐｐｌ． Ｅｕｖｉｒｏ ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：９０−９４（１９７８）。 ２３． Ｗａｒｒ，Ｇ．Ｗ．，ａｎｄ Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｐ ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉ ｂｏｄｙ ａｓ ａ Ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎ Ｙ，ＰＰ．５９−９６（１９８２）。 ２４． Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｐ．１５０−１６０，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ，ＮＹ（１９８２）。
【図面の簡単な説明】
【図１】溶液中の一種の抗原の濃度を測定するための均
質系イムノアッセイ用に用いられるエレクトロ化学ルミ
ネセンス測定法について表わしたものである。
【図２】均質系ＥＣＬテオフィリン試験の結果をグラフ
に表わしたものである。
【図３】各種血清における均質系テオフィリン試験の結
果をグラフに表わしたものである。
【図４Ａ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。
【図４Ｂ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。
【図４Ｃ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。
【図４Ｄ】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を蛍光偏光テ
オフィリン試験の結果と比較しグラフに表わしたもので
ある。
【図５】ＥＣＬテオフィリン試験の結果を高速液体クロ
マトグラフィー試験の結果と比較しグラフに表わしたも
のである。
【図６】ＥＣＬジゴキシンイムノアッセイにおいて産生
されたＥＣＬ信号の調整をグラフに表わしたものであ
る。
【図７】ＥＣＬジゴキシンイムノアッセイの結果をグラ
フに表わしたものである。
【図８】ＭＢＩ３８−化合物Ｉの各濃度において産生さ
れたＥＣＬ信号をグラフに表わしたものである。
【図９】電気泳動の結果を示す写真であり、更に具体的
には、ＭＢ１３８−化合物Ｉのハイブリッド形成／感受
性試験の結果を示したものである。
【図１０】電気泳動の結果を示す写真であり、更に具体
的には、ＭＢ１３８−化合物Ｉの特異性試験の結果を示
したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｆ 15/00 Ｃ０７Ｆ 15/00 Ａ Ｃ０７Ｈ 19/073 Ｃ０７Ｈ 19/073 21/04 21/04 Ｚ Ｃ０９Ｋ 11/07 Ｃ０９Ｋ 11/07 // Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ (72)発明者 ミード，ポール エイ. アメリカ合衆国 21776 メリーランド 州ニューウインザー，バッファロウ ロ ード 3713 (72)発明者 フェング，ピーター アメリカ合衆国 20852 メリーランド 州ロックビル，ロリンズ アベニュー 245 (72)発明者 デラ シアナ レオポルド アメリカ合衆国 20851 メリーランド 州ロックビル，ハルピン プレース 5511 (72)発明者 ドレシック，ウオルター ジェイ. アメリカ合衆国 20851 メリーランド 州ロックビル，クルックストン レーン 12905 (72)発明者 プーニアン，モヒンダー エス. アメリカ合衆国 20879 メリーランド 州ゲイサーズバーグ，ハイ ティンバー コート 224

Claims (25)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｍおよびｎがそれぞれ同一または異る整
    数である下の式の構造の化合物。 【化１】
  2. 【請求項２】 ｍとｎの両者が３である、請求項１の化
    合物。
  3. 【請求項３】 下の式の構造の化合物。 【化２】
  4. 【請求項４】 Ｘが同一または異った１ケまたはそれ以
    上のスクレオタイドを示しＺがエレクトロ化学ルミネセ
    ンスを発する化学種を示しｎが１または１より大きい整
    数を示し、およびｍが１または１より大きい整数を示し
    ている下の式の構造の合成物。 【化３】Ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2)n −Ｎ
    Ｈ−ＣＯ−（ＣＨ2)m −Ｚ
  5. 【請求項５】 Ｘが第５位の炭素原子のＣＨに結合して
    いるチミジンで、ｎが７でｍが３である、請求項４の合
    成物。
  6. 【請求項６】 Ｚがビス（２，２′−ビピリジン）〔４
    −（ブタン−１−アル）−４′メチル−２，２′ビピリ
    ジン〕ルテニウム（ＩＩ）である、請求項４の合成物。
  7. 【請求項７】 チミジンヌクレオタイドが下の式のヌク
    レオタイドシーケンスに結合した３′末端ヌクレオタイ
    ドである、請求項６の合成物。 【化４】ＴＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＣＯＧＣＡＡＡＣＡＣ
    ＣＡＴＣＣＯＧＴＣＣＴＧＣＣＡＧ
  8. 【請求項８】 Ｔがテオフィリンを示し、 ＹがＴとＺに結合したリンカーグループを示し、 ｎが１または１より大きい整数を示し、および、 ｍが１または１より大きい整数を示している、下の式の
    構造の合成物。 【化５】〔Ｔ−Ｙ−Ｚ〕2+（Ｒ）2
  9. 【請求項９】 ＹがＴの第８位の炭素に結合している、
    請求項８の合成物。
  10. 【請求項１０】 Ｙが下の式の構造で、ｍおよびｎが同
    一または異なる、１または１より大きい整数でを示す請
    求項９の合成物。 【化６】（ＣＨ2 ）m −ＣＯ−ＮＨ（ＣＨ2 ）n
  11. 【請求項１１】 ｍが３で、ｎが４である請求項１０の
    合成物。
  12. 【請求項１２】 ｍおよびｎが両者３である、請求項１
    ０の合成物。
  13. 【請求項１３】 Ｙが下の式の構造をもち、ｍ、ｎおよ
    びｒが同一または異なる、１または１より大きい整数を
    示す、請求項９の合成物。 【化７】
  14. 【請求項１４】 ｍが１、ｎが１であり、ｒが４である
    請求項１３の合成物。
  15. 【請求項１５】 Ｙが下の式の構造をもち、ｍ、ｎおよ
    びｒが同一または異なる、１または１より大きい整数で
    ある、請求項９の合成物。 【化８】
  16. 【請求項１６】 ｍが１、ｎが１であり、ｒが４であ
    る、請求項１５の合成物。
  17. 【請求項１７】 ＹがＴの７位のちっ素に結合してい
    る、請求項８の合成物。
  18. 【請求項１８】 Ｙが下の式の構造をもち、ｎが１また
    は１より大きい整数である、請求項１７の合成物。 【化９】（ＣＨ2 ）n
  19. 【請求項１９】 ｎが４である請求項１８の合成物。
  20. 【請求項２０】 Ｙがリンカーアームである下の式の構
    造である化合物。 【化１０】
  21. 【請求項２１】 Ｙが下の式の構造をもち、ｍおよびｎ
    が同一または異なり、１または１より大きい整数であ
    る、請求項２０の化合物。 【化１１】（ＣＨ2 ）m −ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2 ）n
  22. 【請求項２２】 ｍが３で、ｎが２である、請求項２１
    の化合物。
  23. 【請求項２３】 下の式の構造をもち、ｍおよびｎが同
    一または異なる整数である化合物。 【化１２】
  24. 【請求項２４】 ｍおよびｎが共に１である、請求項２
    ３の化合物。
  25. 【請求項２５】 下の式の構造をもち、Ｘが同一または 【化１３】Ｚ−Ｘ 異なる１ケまたはそれ以上のアミノ酸を示し少くとも１
    ケのシステインまたはメチオニンを含有し、 ＺがシステインまたはメチオニンのＳ置換基にマレイミ
    ドの第３または第４位の炭素原子で結合しているビス
    （２，２′−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−
    メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチルアミドル
    テニウム（ＩＩ）である合成物。
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