DK173025B1 - Ruthenium og osmium-komplekser til brug ved kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminiscerende analysering af multikompone - Google Patents

Ruthenium og osmium-komplekser til brug ved kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminiscerende analysering af multikompone Download PDF

Info

Publication number
DK173025B1
DK173025B1 DK199300162A DK16293A DK173025B1 DK 173025 B1 DK173025 B1 DK 173025B1 DK 199300162 A DK199300162 A DK 199300162A DK 16293 A DK16293 A DK 16293A DK 173025 B1 DK173025 B1 DK 173025B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
antibody
ruthenium
solution
labeled
electrochemiluminescence
Prior art date
Application number
DK199300162A
Other languages
English (en)
Other versions
DK16293D0 (da
DK16293A (da
Inventor
Richard J Massey
Michael J Powell
Paul A Mied
Peter Feng
Leopoldo Della Ciana
Walter J Dressick
Mohindar S Poonian
Original Assignee
Igen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Igen Inc filed Critical Igen Inc
Publication of DK16293D0 publication Critical patent/DK16293D0/da
Publication of DK16293A publication Critical patent/DK16293A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173025B1 publication Critical patent/DK173025B1/da

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/04—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms
    • C07D473/06—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms with radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached in position 1 or 3
    • C07D473/08—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms with radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached in position 1 or 3 with methyl radicals in positions 1 and 3, e.g. theophylline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System compounds of the platinum group
    • C07F15/002—Osmium compounds
    • C07F15/0026—Osmium compounds without a metal-carbon linkage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F15/00—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System
    • C07F15/0006—Compounds containing elements of Groups 8, 9, 10 or 18 of the Periodic System compounds of the platinum group
    • C07F15/0046—Ruthenium compounds
    • C07F15/0053—Ruthenium compounds without a metal-carbon linkage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/30—Electrochemically active labels

Description

i DK 173025 B1
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte ruthenium- og osmium-komplekser til brug ved kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminescerende analysering af multikomponentvæsker samt biologiske forbindelser indeholdende 5 disse komplekser.
Der et et stadigt stigende behov for hurtige og meget . specifikke metoder til påvisning og kvantitativ bestem melse af kemiske/ biokemiske og biologiske substanser. Af 10 særlig stor værdi er metoder til måling af små mængder af farmaceutiske midler/ metaboliter, mikroorgamismer og andre materialer af diagnostisk værdi. Som eksempler på sådanne materialer kan anføres narkotika og giftstoffer, lægemidler indgivet med terapeutiske formål for øje, hor-15 moner, patogene mikroorganismer og vira, antistoffer, metaboliter, enzymer og nucleinsyrer.
Tilstedeværelsen af disse materialer kan ofte bestemmes ved bindingsmetoder, hvor man udnytter den høje grad af 20 specificitet, som kendetegner mange biokemiske og biologiske systemer. De hyppigt anvendte metoder er eksempelvis baseret på antigen-antistof-systemer, nucleinsyre-hy-bridiseringsteknikker og protein-ligand-systemer. Ved disse metoder påvises eksistensen af et kompleks af diag-25 nostisk værdi typisk ved enten tilstedeværelse eller fravær af en observerbar "mærkning", som er knyttet til ét eller flere af de kompleksdannende materialer.
Den specifikke mærkningsmetode, som man vælger, vil ofte 30 diktere anvendeligheden og alsidigheden af et bestemt system til påvisning af et materiale af interesse. En foretrukken mærkning bør være billig, sikker og i stand til at knytte sig effektivt til en lang række forskellige kemiske, biokemiske og biologiske materialer uden at 35 ændre de vigtige bindingskarakteristika, som findes hos disse materialer. Mærkningen bør give et meget karakteri- 2 DK 173025 B1 stisk signal, og der bør være tale om en mærkning, som sjældent (og fortrinsvis aldrig) findes i naturen. Mærkningen bør være stabil og detekterbar i vandige systemer i tidsperioder, der strækker sig over måneder. Detekte-5 ringen af mærkningen bør være hurtig, sensitiv og reproducerbar, uden at der stilles krav om kostbare specialiserede faciliteter eller særligt personale. Den kvantitative bestemmelse af mærkningen skal være relativt uafhængig af sådanne variable som temperaturen og sammen-10 sætningen af den blanding, der skal analyseres. De mest fordelagtige mærkninger er sådanne, som kan anvendes i homogene systemer, d.v.s. systemer, hvori det ikke er nødvendigt at foretage en separation af det kompleksbund-ne og det ikke kompleksbundne mærkede materiale. Dette er 15 muligt, hvis mærkningens detekterbarhed moduleres, når det mærkede materiale indkorporeres i et specifikt kompleks .
Man har udviklet en lang række forskellige mærkninger, 20 som hver især indebærer bestemte fordele og ulemper. For eksempel er radioaktive mærkninger meget alsidige, og de kan påvises i meget lave koncentrationer. Imidlertid er de både kostbare og farlige at anvende, og deres anvendelse kræver avanceret udstyr og specialtrænet personale.
25 Desuden begrænses sensitiviteten af radioaktive mærkninger af det faktum, at den detekterbare hændelse i sin grundlæggende natur kun kan forekomme én gang for hvert af de radioaktive atomer i det mærkede materiale. Hertil kommer, at radioaktive mærkninger ikke kan anvendes i ho-30 mogene metoder.
Der er således en udstrakt interesse for ikke-radioaktive mærkninger. Sådanne ikke-radioaktive mærkninger omfatter molekyler, som kan opserveres spektrofotometrisk og ved 35 spinresonans- og luminescens- teknikker, såvel som enzymer, der producerer sådanne molekyler. Blandt de nyttige 3 DK 173025 B1 ikke-radioaktive mærkningsmaterialer kan nævnet organome-talliske forbindelser. På grund af den sjældenhed, hvor med visse metaller optræder i biologiske systemer, kan metoder, som specifikt analyserer metalkomponenten i de 5 organometalliske forbindelser, udnyttes med gode resultater. For eksempel beskriver US patentskrift nr. 4 204 952 (1980) anvendelsen af immunokemisk aktive materialer, som er mærket med bestemte organometalliske forbindelser, til brug ved kvantitativ bestemmelse af specifikke antigener.
10 Man kan anvende en hvilken som helst generel metode til påvisning af de udvalgte metaller sammen med disse mærkninger, herunder emission, absorptions- og fluoresens-spectroscopy, atomabsorption og neutronaktivering. Disse metoder lider imidlertid ofte under en mangel på sensi-15 vitet, og de kan sjældent tilpasses til et homogent system, ligesom de undertiden medfører en destruktion af prøven, hvilket således er tilfældet med atomabsorption.
Af særlig interesse er mærkninger, som kan gøres selvly-20 sende bed hjælp af fotokemike, kemiske og elektrokemiske midler. "Fotoluminescens" er betegnelsen for en proces, hvorved et materiale bliver selvlysende, når det absorberer elektromagnetisk stråling. Fluoresens og phosphore-sens er typer af fotoluminescens. "Kemiluminescens-pro-25 cesser" indebærer, at den selvlysende specie dannes ved en kemisk energioverføring. "Elektrokemiluminescens" indebærer, at den lysenende specie dannes ad elektrokemisk vej .
30 Disse luminescens-systemer er af stadig større betydning.
For eksempel beskriver US patentskrift nr. 4 372 745 (1983) en udnyttelse af kemiluminescens-mærkninger i forbindelse med immunokemiske anvendelser, l de beskrevne systemer anslås mærkningerne til en luminescerende til-35 stand ved hjælp af kemiske midler, eksempelvis ved at lade mærkningen reagere med H202 og et oxalat. I disse 4 DK 173025 B1 systemer vil H202 oxidativt omdanne oxalatet til et højenergi-derivat, som derefter anslår mærkningen. Dette system vil i princippet virke sammen med et hvilket som helst luminiserende materiale, som er stabilt under ana-5 lysens oxiderende betingelser, og som kan anslås af det højenergetiske oxalat-derivat. Uheldigvis giver selve denne alsidighed anledning til en væsentlig begrænsning af teknikken. Typiske biologiske væsker, som indeholder analysanden af interesse, indeholder nemlig også et stort 10 antal potentielt luminescerende substanser, som kan bevirke høje baggrundsniveauer af luminescens.
Et andet eksempel på den immunokemiske anvendelse af kemi lumeninescens, som lider under de samme ulemper, er be-15 skrevet i US patentskrift nr. 4 280 815 (1981), som beskriver den elektrokemiske dannelse in situ af et oxidationsmiddel (eksempelvis H202) i umiddelbar nærhed af en immunoreaktant mærket med en kemiluminescerende specie.
Det elektrogenererede oxidationsmiddel diffunderer hen 20 til den kemiluminescerende specie, som derved oxideres kemisk, hvilket resulterer i en nettooverføring af en eller flere elektroner til det elektrogenererede oxidationsmiddel. Efter oxidationen udsender den kemilumine-scerende specie en foton. I modsætning hertil kræver den 25 omhandlede opfindelse en direkte overføring af elektroner fra en kilde for elektrokemisk energi til en kemilumine-scerende specie, som er i stand til gentagne gange at udsende fotoner.
30 Egnede mærkninger omfatter elektrokemiluminescerende forbindelser, herunder organiske forbindelser og organometalliske forbindelser. Elektrokemiluminescerende metoder til bestemmelse af tilstedeværelsen af mærkede materialer foretrækkes frem for andre metoder af mange 35 årsager. Således er de særdeles diagnostiske med hensyn til tilstedeværelsen af en bestemt mærkning, og de er 5 DK 173025 B1 sensitive, ufarlige og billige, ligesom de kan anvendes til en række forskellige formål. Organiske forbindelser, som er egnede elektrokemiske mærkninger, omfatter eksempelvis rubren og 9,10-diphenylantracen. Mange organo-5 metalliske forbindelser er velegnede elektrokemiske mærkninger, men Ru-holdige og Os-holdige forbindelser er af særlig interesse. Opfindelsen angår således en anvendelse af Ru-holdige og Os-holdige mærkninger, som kan påvises ved en række forskellige metoder. Disse mærk-10 ninger er fordelagtige af mange årsager, som vil blive uddybet nærmere i det følgende.
Ru-holdige og Os-holdige organometalliske forbindelser er omtalt i litteraturen. Således fremgår det af US patent-15 skrift nr. 4 205 952, at et hvilket som helst metallisk grundstof eller en hvilken som helst kombination af sådanne metalliske grundstoffer, herunder ædelmetaller fra gruppe VIII så som Ru, vil egne sig som komponent eller komponenter i organometalliske mærkninger, som kan 20 påvises ved atomabsorptionsmetoder (se patentskriftets spalte 11, linie 20). I det nævnte US patentskrift er ruthenium imidlertid ikke et foretrukket metal, og osmium er ikke specifikt nævnt. Der er heller ikke angivet nogen data med hensyn til effektiviteten ved anvendelse af Ru 25 eller Os i nogen af de omtalte metoder, og den ifølge skriftet foretrukne detekteringsmetode, nemlig atomabsorption, medfører en destruktion af prøven.
I US patentskrift nr. 4 293 310 (1981) beskrives anvenr 30 delsen af Ru-holdige og Os-holdige komplekser som elektrokemiske mærkninger for analysander i immunoanalyser.
De omtalte komplekser er blindet til aminogrupper på ana-lysanderne via en thiourinstof-binding. Skriftet foreslår også muligheden af at danne carboxylatestere imellem 35 mærkningerne og hydroxygrupperne på andre analysander.
6 DK 173025 B1
Ifølge US patentskrift nr. 4 293 310 kan tilstedeværelsen af de mærkede materialer bestemmes ved en metode og et apparatur, som omfatter en udslukningsanordning og en elektrokemisk flowcelle med lysmåling. Den fotoelektro-5 kemisk aktive mærkning vil efter fotoexitation overføre en elektron til et udslukningsmolekyle. Det oxiderede molekyle bliver derefter reduceret med en elektron fra en af flowcellens elektroder, som holdes på et passende potential. Denne elektron måles som en fotostrøm. Mængden 10 af fri mærket analysand i systemet bestemmes ud fra fotostrømmens signal. Det bemærkes, at denne metode er det omvendte af elektrokemiluminescerende bestemmelse af selvlysende materialer.
15 I efterfølgende rapporter har opfinderne, Weber et al. diskuteret de problemer, der er forbundet med at anvende denne metode til at påvise Ru-holdige mærkninger (1) . I tabel 2 hos Weber et al. (1) er den extrapolerede detekteringsgrænse for tris(bipyridyl)ruthenium(II) af stør-20 relsesordenen 1,1 x 10-10 mol/1 under optimale betingelser. Idet man forudså, at den praktiske udnyttelse af disse mærkninger ville medføre målinger i nærværelse af kompleksblandinger, foretog Weber et al. en test for potentielle forstyrrelser i deres system. Tabel 3 hos Weber 25 et al. anfører dimethylalkylaminer, EDTA, N-methylmor-pholin, N,N'-dimethylpiperazin, hydroxid, oxalat, ascor-bat, urinsyre og serum som forstyrrende substanser, som sandsynligvil vil hæve den praktiske detekteringsgrænse væsentligt over værdien 1,1 x 10~10 mol/1. Disse under-30 søgelser blev foretaget med en simpel Ru-holdig forbindelse. Der blev ikke rapporteret nogen undersøgelser vedrørende detekteringsgrænserne for komplexe substanser mærket med Ru-holdige mærkninger, og det blev heller ikke angivet, hvorvidt thiourinstof-bindingen imellem det 35 mærkede materiale og mærkningen af stabil under de betingelser, hvorunder analysen gennemføres.
7 DK 173025 B1
De bestemte mærkninger/ som er elektrokemiluminescerende.
De kan ofte anslås til en selvlysende tilstand uden at blive oxideret eller reduceret, hvilket kan gøres ved at 5 exponere forbindelserne for elektromagnetisk stråling eller for en kemisk energikilde, såsom den, der frembringes af typiske oxalat-H202-systerner. Desuden kan disse forbindelsers luminescens induceres ved elektrokemiske metoder, som dog indebærer en oxidation og 10 reduktion af forbindelserne.
Der er rappoteret et omfattende arbejde med hensyn til metoder til påvisning af Ru(2,2’-bipyridin)32+ ved anvendelse af fotoluminescerende, kemiluminiserende og e-15 lektrokemiluminescerende midler (2,3). Dette arbejde viser, at en klar orange kemiluminescens kan baseres på den vandige reaktion imellem kemisk frembragt eller elektro-genereret Ru (bpy) 33* (hvor "bpy" representerer en pibpyri-dyl-ligand) og stærke reduktionsmidler, som er opstået 20 som mellemprodukter under oxidationen af oxalationer eller andre organiske syrer. Luminisensen kan også opnås i opløsninger i organiske opløsningsmidler og H20 ved reaktion imellem elektrogenereret eller kemisk genereret Ru(bpy)31+ og stærke oxidationsmidler, som er opstået 25 under reduktionen af peroxydisulfat. En tredie mekanisme til produktion af elektrokemiluminescens ud fra Ru(bpy)32+ involverer oscillation af et elektrodepotential imellem et potential, der er tilstrækkeligt negativt til at producere Ru)bpy) 31*, og et potential, der er tilstræk-30 keligt positive til at producere Ru (bpy) 33*. Disse tre metoder benævnes hhv. "oxidativ reduktion", "reduktiv oxidation” og "det Ru(bpy)33</* regenerative system".
Den oxidative reduktionsmetode kan gennemføres i vand, og 35 den frembringer en intens, effektiv og stabil luminescens, som er relativt ufølsom overfor tilstedeværende 8 DK 173025 B1 oxygen eller urenheder. Denne luminescens fra Ru (bpy) 32* afhænger af tilstedeværelsen af oxalat eller salte af andre organiske syrer, så som pyruvat, lactat, malonat, tartrat og citrat, samt af de anvendte midler til oxida-5 tiv frembringelse af Ru(bpy) 33+-specier. Denne oxidation kan gennemføres kemisk ved hjælp af stærke oxidationsmidler, såsom Pbo2 eller et Ce(IVj-salt. Processen kan gennemføres elektrokemisk ved hjælp af et tilstrækkeligt positivt potential, som enten påtrykkes kontinuerligt el-10 ler periodevist. Som egnede elektroder til den elektrokemiske oxidation af Ru(bpy)32* kan eksempelvis nævnes platin, pyrolytisk grafit og glasagtigt carbon. Selv om oxalatet eller et tilsvarende salt af en anden organisk syre forbruges under kemiluminescensen, kan man opnå en 15 kraftig konstant kemi luminescens, som varer i mange timer, ved at sikre tilstedeværelse af et overskud af det forbrugte materiale eller ved kontinuerligt at supplere det forbrugte materiale i reaktionskammeret.
20 Den reduktive oxidationsmetode kan foretages i delvist vandige opløsninger, som indeholder et supplerende organisk opløsningsmiddel, f.eks. acetonitril. Denne luminescens afhænger af tilstedeværelsen af peroxydisulfat og af et middel, som reduktivt kan producere RuibpyJ^'-spe-25 cier. Reduktionen kan gennemføres kemisk ved hjælp af stærke reduktionsmidler, så som magnesium eller andre metaller. Den kan også foretages elektrokemisk ved enten kontinuerligt eller periodevist at påtrykke et tilstrækkeligt negativt potential. En egnet elektrode til den e-30 lektrokemiske reduktion af Ru (bpy) 324 er eksempelvis en poleret elektrode af glasagtigt carbon. Ligesom ved den oxidative reduktionsmetode kan man opnå en kontinuerig ingens luminescens, som varer i mange timer, ved at indføre et overskud af reagenser eller ved kontinuerligt at 35 erstatte de forbrugte reagenser i reaktionsblandingen.
9 DK 173025 B1
Det Ru(bpy)334/+ regenerative system kan udøves i organiske opløsningsmidler, såsom acetonitril, eller i delvist vandige systemer ved hjælp af et pulserende elektrodepotential, som svinger imellem et potential, der er 5 tilstrækkeligt negativt til at reducere Ru(bpy)32*, og et potential, der er tilstrækkeligt positivt til at oxidere Ru(bpy)32*. En egnet elektrode til et sådant regenerativt system er eksempelvis en platinelektrode. Dette system forbruger ikke kemiske reagenser, og det kan i princippet 10 forløbe i ubegrænsende tidsperioder.
Disse tre metoder til at frembringe luminescerende Ru-holdige forbindelser har den gentagne oxidation/reduktion eller rektion/oxidation af den Ru-holdige forbindelse til 15 fælles. Luminescensen af opløsninger, der indeholder disse forbindelser, afhænger derfor i høj grad af det elektriske potential af den påtrykte energikilde, og luminescensen er derfor særdeles diagnostiserende med hensyn til tilstedeværelsen af den Ru-holdige forbindelse.
20 I US patentskrift nr. 4 372 745 citeres Curtis et al. (4) som en mulig mærkning til anvendelse i forbindelse med kemiluminescens. Curtis et al. rapporterer kun ikke-pub-liserede observationer gående ud på, at Ru-komplekser kan 25 induceres til at udesende lys, når de anslås kemisk af et oxalat/H202-system (Curtis et al., side 350).
Hverken i US patentskrift nr. 4 372 745 eller hos Curtis har man erkendt den exceptionelle anvendelighed af ruthe-30 nium- og osmium-komplekser til anvendelse i forbindelse med kemi luminescens, og man har heller ikke erkendt nytten af elektrokemiluminescerende systemer. Sprintschnik, G. et al. (5) har beskrevet komplexer af tris-(2,2'-bipy-ridin}ruthenium(II) esterificeret med octadecanol eller 35 dehydrocholesterol, og de har tilvejebragt film bestående af monolag af disse overfladeaktive komplekser. Komplek- 10 DK 173025 B1 serne viste sig at være fotoluminescerende. Men når filmene blev udsat for indvirkning af vand og derefter eksponeret for lys, udviste Ru-komplekserne ikke fotoluminescens. Dette fænomen blev tilskrevet en fotohydrolyse af 5 estergrupperne i nærværelse af lys.
Det har viåt sig, at en lang række analysander af interesse og kemiske grupper, som binder sig til analysander af interesse, bekvemt kan knyttes til Ru-10 holdige eller Os-holdige mærkninger via amid- eller amin-bindinger. De mærkede materialer kan derefter bestemmes ved hjælp af en lang række forskellige midler, men de mest effektive, pålidelige og sensitive midler er fotoluminescerende, kemiluminescerende og elektro-15 kemiluminescerende midler. Det fremgår af opfindelsen, at elektrokemiluminescerende mærkninger, herunder Ru-holdige og Os-holdige mærkninger og organiske molekyler, såsom rubren og 9,10-diphenylanthracen, i særlig høj grad er alsidige og fordelagtige. De store fordele ved at anvende 20 disse hidtil ukendte mærkede materialer, og de store fordele, der er knyttet til påvisningen af materialerne, er beskrevet i nærmere detaljer i det følgende.
I mange år har fødevare industrien været opmærksom på 25 tilstedeværelsen af biologiske og kemiske kontaminanter, såvel i råvarer som i forarbejdede levnedsmidler. Der har været gjort mange teknologiske fremskridt i retning af at reducere forekomsten af fødevarekontaminering og udbrud af sygdomme hidrørende fra kontaminerede fødevare, med 30 der har hidtil kun været berskrevet beskedne fremskridt med henyn til udvikling af hurtige og sensitive metoder til påvisning og identifikation af fødevarekontaminanter.
De eksisterende standardmetoder til påvisning af skadelige kontaminanter i fødevarer er generelt meget tidsfor-35 brugende, arbejdskrævende og teknisk vanskelige. De analytiske metoder i sig selv er for størstedelens vedkom- 11 DK 173025 B1 raende tilstrækkeligt sensitive, roen de langvarige prøvefremstillingsprocedurer, som går forud for udøvelsen af selve detekteringsmetoden, resulterer ofte i et lavt udbytte af den pågældende kontaminant, således at man 5 hyppigt møder falske negative måleresultater.
To eksempler, som tjener til at illustrere disse problemer, er de for øjeblikket anerkendte standardmetoder til påvisning af tilstedeværelsen af Salmonella- og sta-10 fylokok-enterotoxiner i fødevarer. Påvisningen af salmonella i fødevarer involverer flere berigelsestrin som følge af den kendsgerning, at disse bakterier, når de er tilstede i fødevarer, sædvanligvis findes i lave antal, ligesom de ofte er blevet subletalt skeadet. Påvisnings-15 metoderne med hensyn til salmonelle må derfor være sensitive og muliggøre genoplivning og vækst af de skadede celler.
Der findes to metoder til påvisning af salmonella, som 20 for øjeblikket anbefales af the U.S. Food and Drug Administration. Disse metoder er beskrevet i The Bacteriological Analytical Manual for Foods (1984), 6. udgave,
Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC. Den ene af disse metoder er en ren dyrkningsteknik, 25 som involverer en forudgående berigelse, en selektiv berigelse og en selektiv udsåning, hvilken procedure kræver 4 dage, for at man kan opnå foreløbige resultater, og 5-7 dage, for at man kan opnå endelige resultater. Den anden metode involverer immunofluoresens efter selektiv beri-30 gelse. Denne metode er den hurtigste, men den kan resultere i en høj forekomst af falske positive resultater som følge af problemer i retning af, at de polyvalente antisera, som anvendes i denne test, kan være tværreaktive (6, 7).
35 12 DK 173025 B1
Den procedure, som anbefales af The U.S. food and Drug Administration til påvisning af stafylokok-enterotoxiner i fødevarer, er også angivet i the Bacteriological Analytical Manual for Foods (1984), 6. udgave, Association 5 of Official Analytical Chemists, Washington, DC. Denne metode involverer en koncentrering af en ekstrakt af en stor fødevareprøve, eksempelvis omkring 100 g, til et lille volumen, eksempelvis omkring 0,2 ml, hvilket gøres ved hjælp af flere dialysekoncentrationstrin og en rens-10 ning af prøveekstrakten i en ionbytterkolonne med henblik på at fremstille en prøve til den såkadte dobbelte immu-nodiffusionstekmik med mikropræparatglas. Denne procedure kræver generelt mere end en uge at gennemføre.
15 Man har for nyligt udviklet testmetoder, som er hurtigere at gennemføre, til påvisning af en række kontaminanter, såsom bakterier toxiner, antibiotika og pesticidrester i føderester. I mange tilfælde viser det sig imidlertid, at prøvefremstillingen forud for gennemførelse af selve 20 analysen er så langvarig, at den er både arbejdskrævende og tidsrøvende. Radioimmunoanalyser (RIA) og enzym-bundne immunosorbent-analyser (ELISA) har bevirket en forkortelse af håndteringstiden med hensyn til selve den analytiske metode, men disse metoder er stadig arbejdskrævende 25 og langt fra simple at udøve. Endvidere er disse metoder sædvanligvis baseret på anvendelse af polyklonale antisera, som kan variere med hensyn til specificitet og sensitivitet, og som generelt kun er begrænset tilgængelige til brug ved analysering ved en given fødevarekontami-30 nant. Man har udviklet ELISA-metoder til analysering af fødevareprøver, hvilke metoder gør brug af monoklonale antistoffer i stedet for polyklonale antisera. Anvendelsen af monoklonale antistoffer i et analysesystem til analysering for en given fødevarekontaminant sikrer en 35 konstant tilførsel af et reagens, som bibringer selve testen uforandret specificitet og sensitivitet. Man har 13 DK 173025 B1 anvendt monoklonale antistoffer i ELISA-systemer med henblik på at teste for fødevarekontaminanter, såsom enterotoxiner fra salmonella (8) og stafylokokkus (9) . Kommercielt tilgængelige produkter til salmonella-påvis-5 ning, som anvender EIA-metodik (Bio-Enzabead Screen Kit,
Litton Bionetics) og DNA-probe-teknologi (Gene-Trak, Integrated Genetics), er tidsrøvende og arbejdskrævende. Kommercielt tilgængelige testsystemer til påvisning af stafylokok-enterotoxiner i fødevarer, der gør brug af 10 revers passiv latex-agglutination (SET-RPLA, Denka Seiken Co.) og EIA-metodik (SET-EIA, Dr. W. Bommeli Laboratories) lider under de samme begrænsninger.
I de sidste 100 år har bakterien escherichia coli og co-15 liform-gruppen været hyppigt anvendt som indikatorer til overvågning af vandkvalitet og forekomst af spildevands-kontaminering.
De for øjeblikket anvendte detekteringsmetoder til påvis-20 ning af E. coli og/eller bakterier hørende til coliform-gruppen er baseret på egenskaberne med hensyn til syreeller gasproduktion under fermenteringen af lactose. De mest udbredte metoder er en analyse baseret på det mest sandsynlige antal ("the Most Probable Number (MPN) 25 assay") og den såkaldte menbranfiltreringstest (MF). Begge teknikker er godkendt af the Environmental Protection Agency (EPA) og the American Public Health Association (APHA) til mikrobiologisk undersøgelse af vand og spildevand (10), ligesom de er godkendt af the Food and Drug 30 Administration (FDA) til bakteriologisk undersøgelse af mælk og fødevarer (11) .
MPN-metoden består i praksis af tre (12) separate analyser (10) . I den foreløbige test benyttes et ikke-selek-35 tivt medium, såsom laurylsulfat-tryptose (LST) væske eller lactosevæske til at overvåge gasproduktionen, der 14 DK 173025 B1 hidrører fra fermenteringen af lactose. Gas-positive rør underdyrkes derefter i et mere selektivt medium, nærmere bestemt "Brillant Green Lactose Bile" (BGLB) væske for coliform-arter og E. coli (EC) væske for fækale coliform-5 arter, og der kontrolleres påny for gasproduktion (bekræftet test). Prøver fra positive bekræftende testninger skal testes yderligere ved udsåning på et selektivt differentielt medium, såsom Eosin-methylenblåt (EMB) agar eller Endos agar, efterfulgt af Gram-farvning og 10 visse biokemiske testninger med henblik på korrekt at fastslå tilstedeværelsen af indikator-bakterierne (afsluttet test). Den samlede MPN-analyse kan kræve op til 5 dage til fuldstændig gennemførelse (5). Til rutinemæssige vandanalyser anvender de fleste laboratorier derfor kun 15 den foreløbige og den bekræftede del af MPN-analysen, som i øvrigt stadig kræver mellem 48 og 72 timer at gennemføre til ende. Ud over at være tidsrøvende og økonomisk belastende med hensyn til materialer, har MPN-ana-lyserne ofte udvist såvel forkerte positive som forkerte 20 negative reaktioner (15, 16, 20).
MF-teknikken til bakteriologisk undersøgelse af vand blev introduceret i de tidlige 1950'ere (12) . Til forskel fra MPN-analysen, som var langsommelig og tidsrøvende, kunne 25 MF-analysen fuldendes i løbet af 234 timer, uden at der var behov for yderligere bekræftelse eller kontrol. Den grundlæggende MF-procedure er følgende: Et volumen af vandprøven, sædvanligvis 100 ml, filtreres igennem et filter med en porediameter på 0,45 pm, hvorefter vand-30 prøven inkuberes på et sterilt underlag mættet med et selektivt medium. De to medier, som anvendes hyppigst, er Endo-væsken, som er selektiv over for coliform-arter ved 35 *C, og FC-væsken, som er selektiv for fækale coliform-arter ved 44,5 'C (10). Siden disse mediers introduktion 35 har adskillige forskere rapporteret, at både Endo- og FC-væsken har en tendens til at underistimere de faktiske 15 DK 173025 B1 antal af tilstedeværende indikatorbakterier, hvilket enten skyldes mediets selektivitet eller den høje temperatur (44,5 ’C), der anvendes ved inkubationen (21, 22).
Sådanne tilfælde af forkerte negative resultater har vist 5 sig med særlig stor hyppighed, når organismerne i prøven forinden er blevet subletalt skadet af miljømæssige faktorer og/eller kemikalier (17, 18) . I den senere tid har EPA foreslået modifikationer til opfølgning af MF-testen ved en bekræftende procedure, hvorved mindst 10 kolonier 10 på hver filter skal kontrolleres for gasproduktion ved anvendelse af LST-væske efterfulgt af BGLB-væske ligesom i MPN-analysen (14) . Sådanne modifikationer vil ganske vist reducere forekomsten af såvel forkerte negtive som forkerte positive reaktioner, men de vil også forøge ma-15 terialeomkostningerne, ligesom de vil tredoble MF-ana-lysetiden fra 24 timer til 72 timer.
I 1982 indtroducerede Feng og Hartman en fluorogenanalyse til bestemmelse af E. coli ved anvendelse af substratet 20 4-methylumbelliferon-glucuronid (MUG) (13). E. coli-cel-ler producerede enzymet β-blucoronidase, som ville spalte substratet under frigivelse af det fluorogene 4-methyluin-belliferon-radikal (19). Ved at indkorporere forbindelsen MUG i LST-mediet, der benyttes ved den foreløbige test, 25 gav et enkelt rør med LST-MUG-medium både de foreløbige data (gasproduktion) og de bekræftede data fluoresens) for fækale coliform-arter inden for 24 timer. Selv om MUG-analysen var hurtig og simpel, var det kun 85-95 % af E. coli-cellerne (afhængigt af oprindelse), der produce-30 rede dette enzym, eftersom testen ikke var 100 % pålidelig. Endvidere kunne systemet ikke anvendes på coliform-gruppen.
For øjeblikket eksisterer der ikke nogen egnet analyseme-35 tode til påvisning og optælling af coliform-arter og fækale coliform-arter i en prøve. Udviklingen af en sim- 16 DK 173025 B1 pel, hurtig og pålidelig detekteringsanalyse vil derfor ikke kun nedbringe omkostninger og arbejdstid, men også i høj grad forøge effektiviteten med hensyn til overvågning af vandets sundhedstilstand og med hensyn til fødeva-5 reforarbejdning og -håndtering.
Opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til tegningen, hvor 10 figur 1 er en afbildning af elektrokemiluminescensmålin-ger foretaget for en homogen immunoanalyse med henblik påbestemmelse af koncentrationen af et antigen i opløsning, 15 figur 2 er en grafisk afbildning af resultaterne af en homogen ECL-theophyllin-anayse, figur 3 er en grafisk afbildning af resultaterne af en homogen theophyllin-analyse i forskellige sera, idet der 20 på figuren er anvendt følgende angivelser: • = Normal sera = Hæmolyserede sera ♦ = Lipæmiske sera 25 □ = Icteriske sera.
Figur 4 er en grafisk afbildning af resultaterne af en ECL-theophylin-analyse sammenlignet med resultaterne af 30 en theophyllin-analyse ved fluoresens-polariseering, og figuren er opdelt som følger: A. Normalt sera: n = 4; hældning = 0,986; r = 1,00 35 B. Hæmolyserede sera: n = 3; hældning = 0,878; r = 1,00 17 DK 173025 B1 C. Lipæmiske sera: n = 5; hældning = 0,872; r = 0,99 D. Icteriske sera: n = 4; hældning = 2,14; r = 1,00.
5
Figur 5 er en grafisk afbildning af resultaterne af en ECL-theophylin-analyse sammenlignet med resultaterne af en højtryksvæskechromatografisk analyse.
10 n = 9; hældning = 1,197; r = 0,98.
Figur 6 er en grafisk afbildning af moduleringen af et ECL-signal frembragt i en ECL-digoxin-immunoanayse.
15 Figur 7 er en grafisk afbilding af resultaterne af en ECL-digoxin-immunoanalyse, idet der på figuren er anvendt følgende angivelser: = Blindprøve 20 · - Digoxin.
Figur 8 er en grafisk afbildning af det ECL-signal, der frembringes af forskellige koncentrationer MBI 38-for-bindelse I.
25 figur 9 viser resultaterne af en undersøgelse af hybridi-sering/sensitivitet udført på MBI 38-forbindelse I, idet TAG = forbindelse I.
30
Endelig viser figur 10 resultaterne af en specifik undersøgelse af MBI 38-forbindelse I. 1 nærværende bekrivelse betyder "molær" koncentrationen 35 af en analysand i opløsning udtrykt i mol pr. liter eller den mængde partikelformigt materiale, som er tilstede i 18 DK 173025 B1 en væskeprøve, udtrykt i partikler eller enheder pr. liter. For eksempel kan 1 x 1023 partikler pr. liter udtrykkes som 1 molær.
5 Den foreliggende opfindelse angår elektrokemi-luminescerende komplekser, som er ejendommelige ved at være valgt blandt de krav 1 nævnte forbindelser.
Eksempler på sådanne elektrokemiluminescerende kemiske grupper kan være bis[(4,41-carbomethoxy)-2,2'-bipyridin] 10 2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolan- ruthenium (II), bis (2,2'-bipyridin) [4-(butan-l-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin] ruthenium (II), ffbis (2,2'-bipyridin) [4-(4'-methyl-2, 2'-bipyridin-4-’yl) smørsyre] ruthenium (II), (2,2-bifpyridin)[cis-bis(1,2-diphenyl- 15 phosphino)ethylen]{2 —[3—(4-methyl-2,2’-bipyridin-41-yl)-propyl]-1,3-dioxolan}osmium (II), bis (2,2'-bipyridin) [4-(4'-methyl-2,21bipyridin)-butylamin] ruthenium (II), bis(2,2'-bipyridin)[l-brom-4(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan] ruthenium (II) eller bis (2,2'-bipyridin)-20 maleimidohexansyre-4-methyl-2, 2'-bipyridin-4'-butylamid-ruthenium (II).
Reagenset, som bringes i kontakt med prøven, kan bestå af en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe, konjugeret 25 til en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, en prion, et viroid, et lipid, en fedsyre, en nucleinsyre, et poysaccharid, et protein, et lipoprotein, et lipopoly-saccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær meta-bolit, et hormon, et farmakologisk middel, et beroligende 30 middel et barbiturat, et alkaloid, et steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organometallisk molekyle, et uorganisk molekyle, biotin, avidin eller streptavidin. I en udførelsesform fer opfindelsen er mid-35 let en elektrokemiluminescerende gruppe konjugeret til et antistof, et antigen, en nucleinsyre, et hapen, en ligand 19 DK 173025 B1 eller et enzym eller konjugeret til biotin, avidin eller streptavidin.
Prøven kan være udvundet fra et fast stof, en emulsion, 5 en suspension, væske eller gas. Endvidere kan prøven være afledt af vand, fødevarer, blod, serum, urin, afføring, væv, spyt, olier, organiske opløsningsmidler eller luft.
Endvidere kan prøven indeholde acetonitril, dimethylsulf-oxid, dimethylformamid, n-methylpyrrolidinon eller ter Ι-ΙΟ butanol. Prøven kan også omfatte et reducerende middel eller et oxiderende middel.
Komplekserne ifølge opfindelsen kan anvendes til i et på forhånd bestemt volumen af en multikomponentvæske at 15 påvise en analysand af interesse, som er tilstede i prøven i en koncentration på under ca. 10'3molær.
Reagenset til dette formål kan være selve analysanden af interesse, som er konjugeret til en elektrokemilumine-20 scerende kemisk gruppe, eller en analog til anlysanden af interesse, som er konjugeret til en elektrokemilumi-nescerende gruppe. Endvidere kan analysanden af interesse være theophylin, digoxin eller hCG. Den elektrokemi-luminescerende kemiske gruppe kan f.eks. være bis[(4,4'-25 carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyri-din-4-yl) propyl]-1,3-dioxolan-ruthenium (II), bis{2,2'- bipyridin)[butanl-lal)-4'-methyl-2,2'-bipyridin] ruthenium (II), bis (2,2'-bipyridin) [4-(4-methyl)-2,2'-bipyri-din-4'-yl)-smørsyre] ruthenium (II),(2,2'-bipyridin)[cis-30 bis(1,2-diphenylphosphino)ethylen](2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4’-yl)propyl]-l,3-dioxolan}osmimun (II), bis(2,2'-bipyridin) [4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin)-butyl-amin] ruthenium (II), bis(2,2T-bipyridin)[l-brom-4(4r-me-thyl-2,2'-bipyridin-4-yl) butan] ruthenium (II) eller 35 bis(2, 2'-bipyridin)maleimidohexansyre-4-methyl-2,2'-bipy-ridin-4’-butylamid-ruthenium (II).
20 DK 173025 B1
Det komplimentaere materiale kan være en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, en prion, et viroid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et polysaccarid, et 5 protein, et lipoprotein et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et hormon, et farmakologisk middel, et beroligende middel, et barbiturat, et steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk mo-10 lekyle, et organometallisk molekyle eller et uroganisk molekyle.
Det falder inden for opfindelsens rammer, at de omhandlede komplekser kan anvendes på en sådan måde, at man 15 kvantitativt bestemmer en analysand af interesse.
En sådan metode kan gennemføres som en heterogen analyse eller som en homogen analyse. I en af de foretrukne udførelsesformer bliver ethvert reagens, som ikke kombine-20 res med analysanden af interesse, separeret fra prøven, som har været i kontakt med en kendt mængde af reagenset, inden prøven udsættes for elektrokemisk energi fra en egnet energikilde, som på effektiv måde kan bringe reagenset til vedvarende at udsende stråling. Ifølge en an-25 den udførelsesform behandler man prøven, inden man bringer den i kontakt med reagenset, således at man immobili-serer analysanden af interesse.
Analysanden af interesse kan være en hel celle, en sub-30 cellulær partikel, et virus, en prion, et viroid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et polysccharid, et protein, et lipoprotein, et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et hormon, et farmakologisk middel, et beroligende middel, et barbitu-35 rat, et alkaloid, et steroid, et vitamin, en aminoyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk or- 21 DK 173025 B1 ganisk molekyle, et organmetallisk molekyle eller et uorganisk molekyle. I en udførelsesform for opfindelsen er analysanden af interesse theopyllin. Ifølge en anden udførelsesform er analysanden af interesse digoxin. Ana-5 lysanden af interesse kan også være hCG.
Reagenset, hvormed prøven bringes i kontakt, kan være en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe konjugeret til en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, en prion, 10 et viorid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et po-lysaccharid, et protein, et lipoprotein, et lopopolysac-charid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabo-lit, et hormon, et farmakologisk middel, et beroligende middel, et barbiturat, et alkaloid, et steroid, et vita-15 min, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organmetallisk molekyle eller et uorganisk molekyle.
Reagenset er en elektrokeminuminescerende kemisk gruppe 20 konjugeret til et antistof, et antigen, en nucleinsyre, en ligand eller et enzym eller hapten, biotin, avidin eller streptvidin.
Den elektrokemiluminescerende gruppe er en metalholdig 25 organisk forbindelse, hvori metallet er valgt blandt ruthenium og osmium. Eksempler på den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe kan også være bis [(4,4'-carbomethoxy)-2,2’-bipyridin] 2-[3-(4-methyl-2,2’-bipyridin-4-yl)propylJ-l,3-dioxolan-ruthenium (II), 30 bis (2,2'-bipyridin)[4-(butan-l-al)-4’-methyl-2,21-bipy-ridin]ruthenium (II), bis (2,2'-bipyridin) [4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4’-yl)-smørsyre] ruthenium (II), (2,2*— bipyridin)[cis-bis(1,2-diphenylphosphino) ethylen]{2-[3-(4-methyl-2,2*bipyridin-4'-yl)propyl]-l,3 dioxolanjosmium 35 (II), bis(2,2'-bipyridin) [4-(4’-methyl-2,2’-bipyridin)- butylamin]- ruthenium (II), bis(2,2’-bipyridin)[1-brom- 22 DK 173025 B1 4(4'-methyl-2,2'-fbipyridin-4-yl)butan] ruthenium (II) eller bis(2,2'-bipyridin)maleimidohexansyre, 4-methyll-2,2'-bipyridin-4'-butylamid-ruthenium (II).
5 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes også en fremgangsmåde til at påvise og identificere tilstedeværelsen af et større antalanalysander af interesse i flydende fødevarer eller fødevarehomogenater. Analysanderne af interesse kan i dette tilfælde være mikroorganismer.
10 Disse mikroorganismer kan være levedygtige eller ikke-levedygtige. Nærmere bestemt kan der være tale om bakterier. Som eksempler på bakterier, som kan påvises ved den omhandlede metode, kan nævnes salmonella, Campylobacter, escherichia, yersinia, bacillus, vibrio, legionella, clo 15 stridium, streptokok og stafylokok. Metoden er ikke begrænset til disse bakterier.
Analysanderne af interesse kan også være antigener, sådanne antigener omfatter (men er ikke begrænset til) en-20 terotoxiner og aflatoxiner.
De immobiliserede reagenser og påvisningsreagenserne kan være polyclonale antistoffer, monoklonale antistoffer, blandinger af monoklonale antistoffer eller blandinger af 25 polyclonale og monoklonale antistoffer.
Påvisningsreagenserne kan være mærket med en detekterbar markering. Ifølge en udførelsesform for opfindelsen er påvisningsreagenserne hver især mærket med den samme de-30 tekterbare markering. Sådanne markeringer er velkendte inden for fagområdet, og der kan være tale om et enzym, f.eks. alkalinsk phosphatase, pebberrodperoxidase, gluco-seoxidase, β-galactosidase eller urease, en fluoriserende gruppe, f.eks. fluorescein-isothiocyanat, tetramethyl-35 rhodamin-isothiocyanat, dichlortriazinylamino-fluorescein eller "Texas Red", eller en kemiluminescerende gruppe 23 DK 173025 B1 f.eks. luminol, isoluminol eller en acridiniumester. Desuden kan den detekterbare markering være en elektrokemi-luminescerende kemisk gruppe, som kan induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling, når den 5 eksponeres for elektrokemisk energi fra en egnet energikilde i mængder, som kan inducere strålingen. Denne elek-trokemiluminescerende kemiske gruppe kan være ruthenium eller osmium.
10 De immobiliserede reagenser kan vare immobiliseret til en nitrocellulosemembran, som er fastgjort til reagens-holderen. Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.
15 EKSEMPEL 1
Elektrokemiluminescens i forskellige organiske opløsningsmidler.
20 Elektrokemiluminescensen af tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) clorid, hexahydrat blev målt i en 15 ml trehalset, rundbundet kolbe, der indeholdt 10 ml af en opsøsning fremstillet som beskrevet nedenfor, en magnet-omrører med dimensionerne 1,5 x 10 mm, en kvasi-reference 25 elektrode fremstillet af sølvtråd med en diameter på 1,0 mm, en kombineret modeleektrode fremstillet af 0,35 mm platintråd og en driftselektrode bestående af en 0,7 mm platintråd fastloddet til et kvardratisk stykke (1 x 1 cm) 0,1 mm tyk høj glanspoleret platinfolie (drifselek- 30 troden af platinfolie var udformet som en halvcirkel med en diameter på 0,48 cm, som ækvidistant omgav modelektroden af 0,35 mm platintråd med en afstand på omkring 0, 24 cm).
35 Sølvtråden blev forbundet til EG&G Model 178 elektrome-tersonden hørende til en EG&G Model 173 potentiostat/ 24 DK 173025 B1 galvanostat. Modelektroden af platintråd og driftselektroden af platinfolie blev forbundet med hhv. anoden og katoden på den anvendte EG&G Model 173 potentiostat. Anordningen blev jordforbundet.
5
Cyklisk voltammetri blev udført med EG&G Model 173 poten-tiostaten, hvortil der var forbundet en EG&G Model 175 universal programmeringsenhed. Programmeringsenheden blev indstillet til udsving på 100 mV/sek. imellem et ano-10 depotential på +1,75 V og et katodepotential på -1,80 V. Elektrokemiluminescensen blev målt ved hjælp af et Hamamatsu R928 fotoforstærkerrør anbragt inden i et kabinet af mærket "Products for Research" Model PR1402RF til fotoforstærkerrør, som var forsynet med et Kodak nr.
15 23 A gelatine (rødt) filter. Fotoforstærkerrørets kabinet var forbundet til et Oriel Model 7070 fotoforstærkerde-tekteringssystem. Det cykliske voltamogram blev optaget på et Houston Instruments Model 200 X-Y registreringsapparat .
20
Der frembragtes cykliske voltamogrammer for 1 mM tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat (Aid-rich Chemical Company) og 0,1 M tetrabutylammonium-tetra-fluorborat TBABF«) (Aldrich Chemical Company) i opløs-25 ninger fremtillet med de følgende organiske opløsningsmidler: acetonitril, N, N-dimethylformamid, dime- thylsulfoxid og 1-methyl,-2-pyrrolidinon (Aldrich Chemical Company). Man benyttede også t-butanol og deioniseret destilleret vand (1:1 v/v) til at fremstille en opløsning 30 indeholdende 2 mM tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat og 0,10 M TBABF«. De resulterende voltamogrammer indicerede ikke nogen ændringer i redox-potentialet af tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat ved variation af det organiske opløsnings-35 middel.
25 DK 173025 B1
Med henblik på en visuel bestemmelse af elektrokemiluminescensen fremstillede man opløsninger som følger: til strækkelige mængder af tris (2,2’-bipyridyl) ruthenium {II) chlorid-hexahydrat og TBABF* blev opløst i de oven-5 for beskrevne organiske opløsningsmidler af spektrosko-pisk kvalitet (Aldrich Chemical Company) til opnåelse af slutkoncentrationer på hhv. 1 mM og 0,1 M. Derefter satte man 10 ml af den resulterende opløsning til den trehal-sede, rundbundede kolbe med volumen 15 ml. Elektroderne 10 blev neddyppet i opløsningen, og driftselektroden blev påtrykt et pulserende potential på mellem +1,75 og -1,45 V for at frembringe elektrokemiluminescens. I hver af de ovenfor beskrevne opløsninger blev elektrokemiluminisen-sen observeret visuelt.
15
Til kvantitative bestemmelser af den indvirkning, som en ændring af opløsningsmidlet havde på elektrokemiluminescensen, fremstillede man opløsninger som følger: tii stækkelige mængder tris (2,2’-bipyridyl) ruthenium (II) 20 chlorid-hexahydrat og TBABF« blev sat til de ovenfor beskrevne orgniske opsøsningsmidler til opnåelse af slutkoncentrationer på hhv. 2 mM og 0,2 M. til en prøve af denne opløsning sattes et tilsvarende volumen deionise-ret, destilleret vand, der indeholdt et stærkt oxiderende 25 ammoniumpersulfat, til en koncentration på 36 mM. Der fremstilledes også kontrolopløsninger, som ikke indeholdt tris (2,2’-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat.
Derefter anbragtes 10 ml af den resulterende opløsning i den trehalsede, rundbundede kolbe med volumen 15 ml.
30 Elektrokemiluminescensen blev frembragt ved at pulsere katodepotentialet i intervaller på 1 sek. imellem 0 og -2,0 V.
Elektrokemiluminescensmålingerne blev foretaget ved at 35 integrere det resulterende signal fra fotoforstaerkerrøret ved anvendelse af en integrator forbundet til et Micronta 26 DK 173025 B1
Model 22191 digital multimeter. Signalet blev integreret i 10 sek. under pulseringen, og resultatet blev registreret i mV. Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel I, og de antyder, at man ved at variere opløsningsmidlet S påvirker ruthenium (II) choridets kvanteeffektivitet.
TABEL I
10
Organisk Tris-RuBiPy
Opløsningsmiddel (10~6M) Kontrol Δ
Acetonitril 2540* 104 2436 15
Tert-butanol 1280 0 1280 N, N-dimethyl- formamid 2390 143 2247 20
Dimethylsulfoxid 2760 29 2731 1-methyl 1-2- pyrrolidinon 1630 0 1630 25 * alle målinger er i millivolt.
EKSEMPEL 2 30 Sensitivitet af detekteringen af elektrokemiluminescensen af ruthenium-mærket anti-museimmunoglobulin G (IgG) antistof fra kaniner.
Elektrokemiluminneensen af anti-muse-IgG-antistof fra ka-35 niner mærket med 4,4,-dichlormethyl-2,2,-bipyridyl-bis(2,21-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket ka- 27 DK 173025 B1 nin-anti-muse-IgG-antistof) blev målt i en 15 ml tre-halset, rundbundet kolbe indeholdende 10 ml af en opløsning fremstillet som beskrevet nedenfor, et magnetisk om-rørerlegeme med dimensionerne 1,5 x 10 mm, en kvasi-5 referenceelektrode fremstillet af 1,0 mm sølvtråd, en kombineret modelektrode fremstillet af 0,35 mm platintråd og en driftselektrode bestående af 0,7 mm platintråd fastloddet til et kvadratisk (1 x 1 cm) stykke høj-glanspoleret platinfolie med en tykkelse på 0,1 mm 10 (driftselektroden af platinfolie var formet som en halvcirkel med en diameter på omkring 0,48 cm, som ækvidistant omgav platintråden med diameter 0,35 mm i en afstand fra denne på ca. 0,24 cm).
15 Sølvtråden blev forbundet til EG&G Model 178 elektrome-tersonden hørende til en EG&G Model 173 potentiostat/ galvanostat. Modelektroden af platintråd og driftselektroden af platin blev forbundet med hhv. anoden og katoden i en EG&G Model 173 potentiostat. Anordningen blev 20 jordforbundet.
Elektrokemiluminescensen, som blev udsendt fra den rut-henium-mærkede opløsningen af kanin-anti-muse-IgG-anti-stof, blev målt ved hjælp af et Hamamatsu R928 fotofor-25 stærkerrør anbragt inden i et kabinet af mærket "Products for Research" Model PR1402RF til fotoforstærkerrør, som var forsynet med et Kodak nr. 23 A gelatine (rødt) filter. Kabinettet til fotoforstærkerrøret var forbundet til et Oriel Model 7070 fotoforstærkerdetekteringssystem.
30
Elektrokemiluminescensen blev induceret ved at pulsere et katodepotential mellem 0 og -2,0 V i intervaller på 1 sek. Målingerne af elektrokemiluminescensen blev foretaget ved at integrere det resulterende signal fra foto-35 forstærkerrøret ved hjælp af en integrator forbundet til et Micronta Model 22191 digital multimeter. Elektrokemi- 28 DK 173025 B1 luminescenssignalet blev integreret i 10 sek. under pulseringen, og resultatet blev registreret i millivolt.
Man fremstillede en stamopløsning af 1,25 x 10'7M ruthe-5 nium-mærket anti-muse-IgG-antistof fra kaniner ud fra en koncentreret opløsning (2 mg/ml, 7,5 Ru/antistof) af det mærkede antistof ved fortynding med fosfatpufferholdigt saltvand (PBS). En prøve af denne opløsning (80 mikroli-ter) blev sat til 10 ml af en blanding af dimethylsulfo 10 sid (DMSO) og demineraliseret, destilleret vand (1:1), der indeholdt 0,1 M tetrabutylammoniumtetrafluorborat (TBABF4) og 18 mM ammoniumpersulfat, i reaktionsbeholderen. Slutkoncentrtionen af ruthenium-mærket antistof var 1 x 10'^. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskre-15 vet ovenfor.
Der fremstilledes yderligere opløsninger, som repræsenterede forskellige fortyndinger af stamopløsningen af det ruthenium-mærkede anti-muse-IgG-anti-stof fra kaniner, og 20 prøver (80 mikroliter) af disse opløsninger blev sat til den samme opløsning af ruthenium-mærket antistof i reaktionsbeholderen i trinvise stigninger, som resulterede i de følgende koncentrationer af mærket antistof: 5 x 10" *M, 1 x 10“*M og 5 x 10'^. For hver opløsning foretog man 25 elektrokemiluminescensmlinger som tidligere beskrevet. Resultaterne af disse målinger er anført i tabel II medenfor. disse resultater visser sensitiviteten af elek-trokemiluminescensmålinger af mærket antistof (1 x 10' , ligsoro de viser, hvorledes intensiteten af elektro-30 kemiluminescensen afhænger af koncentrationen af det ruthenium-mærkede anti-muse-IgG-antistof.
Elektroluminescens (ECL) af ruthenium-mærket anti-museimmunoglobulin G (IgG) antistof fra kaniner 5
TABEL II
29 DK 173025 B1
Koncentration af ruthenium-mærket anti-muse-IqG-antistof_ ECL (mV) 5 x 10-¾ 1610 10 1 x 10-¾ 892 5 x 10-¾ 418 1 x 10-¾ 72 0 0 15 EKSEMPEL 3
Immunologisk reaktivitet af ruthenium-mærket bovint se-20 rumalbumin (BSA) i en enzym-bundet immunosorbent-analyse (ELISA) i fast fase.
Hulrummene i en mikrotiterplade af polystyren blev belagt med en mættende koncentration af enten bovint seruro-25 albumin mærket med 4,47-(dichorroethyl)-2,2'-bipyridyl-bis(2,2*-bipyridyl) ruthenium (II), d.v.s. rutheium-mærket bovint serumalbumin (6 RU/BSA, 20 mikrogram/ml i PBS-puffer, 50 mikroliter/hulrum eller ikke-mærket BSA (20 mikrogram/ml i PBS-puffer, 50 mikroliter/hulrum) og 30 inkuberet i en time ved stuetemperatur. Efter denne inkubationsperiode blev pladen vasket 3 gange med PBS, 5 minutter pr. udvaskning. En opløsning, der indeholdt 6 mg/ml kanin-anti-BSA-antistof, blev fortyndet hhv.
1:20.000, 1:30.000, 1:40.000, 1:50.000 og 1:60.000 i PBS, 35 og fortyndingerne blev in duplo sat til hulrummene, der var belagt med ruthenium-mærket BSA eller med ikke-mærket 30 DK 173025 B1 BSA, hvorefter pladen blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter 3 udvaskninger med PBS som beskrevet ovenfor blev tilstedeværelsen af bundet kanin-anti-BSA-antistof bestemt ved, at man til hvert hulrum satte gede-5 anti-kanin-IgG-peroxidase-konjugat (1:1000 fortynding af en 0,5 mg/ml opløsning i PBS, 50 mikroliter/hulrum) og inkuberede pladen i 1 time ved stuetemperatur. Efter at have vasket pladen to gange med PBS, 1 gang med 0,5 %
Tween-20 og 2 gange med PBS som ovenfor blandede man 10 hydrogenperoxid (30 %) og 2,2'-azino-di-[3-ethylbenze- thiazolinsulfonat] (KPL, Gaithersburg, MD i lige store volumener, hvorpå man satte 200 mikroliter af blandingen til hvert af pladens hulrum. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur blev pladen aflæst spektrofoto-15 metrisk ved 414 mn. Den gennemsnitlige baggrundsabsorbans af kontrolprøverne blev trukket fra middelværdien af de dobbelte aflæsninger for hver fortynding af kanin-anti-BSA-antistoffet, som var sat til de hulrum, der var belagt med ruthenium-mærket BSA eller ikke-mærket BSA.
20 Disse korrigerede absorbansværdier er anført i den efterfølgende tabel III.
Kurverne opnået for ikke-mærket BSA og ruthenium-mærket BSA var parallelle, og de korrigerede absorbansværdier i 25 hvert punkt på de to kurver havde et konstant indbyrdes forhold på omkring 0,6. Man opnåede identiske resultater for to andre portioner ruthenium-mærket BSA, som var fremstillet ved anvendelse af det samme aktiverede ruthenium- kompleks som tidligere beskrevet, og som havde 30 tilsvarende Ru/BSA-mærkningsforhold. disse resultater antyder, at det ruthenium-mærkede BSA er immunologisk reaktivt, og at det opretholder omkring 60 % af sin im-munoreaktivitet, når det mærkes med ruthenium, i sammenligning med ikke-mærket BSA.
35
TABEL III
31 DK 173025 B1
Absorbans ved 414 nm 5 Kanin-anti-BSA- Ikke- Ruthenium- Relative antistof- mærket mærket immunore- fortynding BSA BSA__ aktivitet
20.000 1,06 0,66 62 S
10 30.000 0,83 0,50 60 % 40.000 0,67 0,40 60 % 50.000 0,56 0,33 59 % 60.000 0,47 0,28 60 % 15 EKSEMPEL 4
Immunologisk reaktivitet af rutheniuro-mærket anti-muse-immunoglobulin (igG) antistof fra kaniner ved en konkur-20 rerende enzym-bundet immunosorbent-analyse (ELISA) i fast fase.
Anti-muse IgG-antistof fra kaniner, mærket med 4,4'-di-chlormethyl-2,2’-bipyridyl-bid (2,2'-bipyridyl) ruthenium 25 (II) (ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof), blev sammenlignet med ikke-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof med hensyn til sin evne tii at konkurrere med enzym-mærket anti-muse-IgG-antistof om at binde sig til muse-IgG. Hulrummene i en mikrotiterplade af polystyren 30 med 96 hulrum blev belagt med en opløsning af muse-IgG (5 mikrogram/ml i PBS-puffer), inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur og vasket 3 gange med PBS (5 minutter pr. vask). Der fremstilledes to opløsninger, hvoraf den ene indeholdet en blanding af konjugatet af kanin-anti-muse-35 IgG med alkalisk phosphortase og kanin-anti-muse-IgG (1 32 DK 173025 B1 mg/ml), mens den anden indeholdt en blanding af konjuga-tet af kanin-anti-muse-IgG med alkalisk phosphortase og ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG (1 mg/ml, 7,5 Ru/an-tistof). Disse to opløsninger samt en tredie, som inde-5 holdt konjugatet af kanin-anti-muse-IgG med alkalisk phosphortase, blev fortyndet 1:6000, 1:7000, 1:8000,
1:9000. 1:10.000, 1:12.000, 1:14.000. og 1:16.000 i PBS
indeholdende 0,5% Tween-20 og sat (50 mikroliter/hulrum) til separate rækker af hulrum i pladen, som indeholdt 10 bundet muse-IgG. Pladen blev inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur og vasket 2 gange med en blanding af PBS og Tween-20 og 2 gange med PBS, 5 minutter pr. vask. Enzymsubstratet p-nitrofenylfosfat (1,5 mg/ml i 10 % di-ethanolamin-puffer, pH 9,6) blev sat til hvert hulrum 15 (200 mikroliter/hulrum). Pladen blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og aflæst spektrofotometrisk ved 405 nm. Den gennemsnitlige baggrundsabsorbans af kontrolprøverne blev trukket fra middelværdien af de dobbelte aflæsninger for hver af de 3 opløsninger i hver af de 20 angivne fortyndinger. Disse absorbansværdier er vist i tabel VI.
Der opnåedes 3 parallelle kurver, hvoraf topkurven re-presenterede den ikke-inhiberede binding af enzyn-kon-25 jugatet, mens de to underliggende kurver angav inhibe-ringen som følge af hhv. ruthenium-mærket anti-muse-IgG og ikke-mærket anti-muse-IgG. Ved sammenligning punkt for punkt finder man, at kurven svarende til ruthenium-mærket anti-muse-IgG ligger på tilnærmelsesvis 81 % i forhold 30 til kurven svarende til ikke-mærket anti-muse IgG i forhold til enzym-konjugat kurven. Disse resultater angiver, at det ruthenium-mærkede anti-muse-IgG-antistof er immunologisk reaktivt over for sit antigen (muse-IgG), og at det har en effektivitet i forhold til ikke-mærket anti-35 muse-IgG-antistof på tilnærmelsesvis 81 % med hensyn til 33 DK 173025 B1 at konkurrere med enzym-mærket anti-muse-IgG-antistof om binding til muse-IgG.
TABEL IV
34 DK 173025 B1
Absorbans ved 405 nm
5 AB C
Anti-muse Enzym-
IgG,alka- konjugat+ Enzym- Sammen linsk phos- ruthenium- konjugat+ lignende 10 phortase mærket ikke-mær- grad af (enzym-kon- anti-muse- ket anti- inhibe-Fortynding jugat)_ IqG_ muse-IgG ring* 6000 1,48 0, 94 0,79 77 % 15 7000 1,33 0, 82 0,69 79 % 8000 1,21 0,72 0,62 82 % 9000 1,10 1.10 0,65 84 % 10000 1,01 0, 60 0,51 82 % 12000 0,87 0,51 0,43 80 % 20 14000 0,77 0,45 0,37 81 % 16000 0,68 0,40 0,33 80 %
*(A-B/A-C) x 100 S
25 EKSEMPEL 5
Elektrokemiluminescens af ruthenium-merket bovint serumalbumin (BSA).
30 En opløsning indeholdende 7,8 x ΙΟ"6 M bovint serumal-bomin (BSA) mærket med 4, 4'-dichlormethyl-2,2'-bipyridyl-bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-market bovint serumalbumin) fremstilledes ud fra en stamopløsning af ruthenium-mærket BSA (2,6 mg/ml, 6 Ru/BSA) ved fortyn-35 ding i phosphatpufferholdigt saltvand. Man satte 26 mi-kroliter af denne opløsning til 10 ml DMSO/deioniseret, 35 DK 173025 B1 destilleret vand (1:1) indeholdende 0,1 M TBABF^ og 18 mM ammoniumpersulfat i reaktionsbeholderen. Slutkoncentra-tionen af ruthenium-mærket BSA var 2 x 10*8 M. Elektrokemi luminescensen blev målt som beskrevet ovenfor.
5 På analog måde fremstilledes en opløsning, der indeholdt 7,8 x 10‘6 M ikke-mærket BSA, og denne opløsning blev anbragt i reaktionsbeholderen til opnåelse af en slutkon-centration af ikke-mærket BSA på 2 x ΙΟ'8 M. Elektro-10 kemiluminescensen af denne opløsning og af en tilsvarende opløsning uden BSA blev derefter målt. Resultaterne af disse elektrokemiluminescensmålinger er vist i den efterfølgende tabel V for kovalent koblet rutenium-mærket BSA og for ikke-mærket BSA.
15
TABEL V
Elektrokemiluminescens (ECL) af ruthenium-mærket BSA 20 Opløsning ECL (mV) 2 x 10-8M ruthenium- mærket BSA 730 25 2 x 10‘8 M BSA 100 DMSO: H20 (1:1) 0 30 EKSEMPEL 6
Elektrokemiluminescens af ruthenium-mærket anti-muse-immunoglobulin (IgG) antistof fra kaniner.
36 DK 173025 B1
En opløsning, der indeholdt 1,25 x 10'6 M kanin-anti-mu-se-IgG-antistof mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2,-bi-pyridyl-bis-(2,21-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof), blev fremstillet ud 5 fra en stamopløsning af ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof (2 mg/ml, 7,5 Ru/antistof) ved fortynding i forsfatpufferholdigt saltholdigt saltvand. Man satte 80 mikroliter af denne opløsning til 10 ml DMSO/deioniseret destilleret vand (1:1), der indeholdt 0,1 M TBABF« og 18 10 mM ammoniumpersulfat, i reaktionsbeholderen, slutkoncen-trationen af ruthenium-mærket antistof var 1 x 10'8 M. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskrevet i eksempel 2.
15 På analog måde fremstillede man en opløsning indeholdende 1,25 x 10 "s M ikke-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof, og man satte denne opløsning til reaktionsbeholderen til opnåelse af en slutkoncentration af ikke-mærket antistof på 1 x 10'8 M. Elektrokemiluminescensen af denne opløs-20 ning og af opløsningen uden tilsat antistof blev ligeledes målt som beskrevet ovenfor. Resultaterne af elektrokemiluminescensmålingerne er vist i den efterfølgende tabel VIII for kovalent koblet ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof og ikke-mærket kanin-anti-25 muse-IgG-antistof.
TABEL VI
37 DK 173025 B1
Elektrokemiluminescens (ECL) af ruthenium-market kanin-anti-museimmunoqlobulin (IqG) antistof 5
Opløsning ECL (mV) 1 x 10'8 M ruthenium- mærket kanin-anti-muse-
IgG-antistof 892 10 1 x ΙΟ"8 M kanin-anti- muse-IgG-antistof 0 DMSO: H;0 (1:1) 0 15 EKSEMPEL 7
Homogen elektrokemiluminiscens-immunoanalyse for anti stoffer til bovint serumalbumin.
20
En opløsning indeholdende 7/8 x 10‘s M bovint serumalbumin (BSA) mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2'-bipyridyl-bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket bovint serumalbumin) blev fremstillet ud fra en stamop- 25 løsning af ruthenium-mærket BSA (2,5 mg/ml, 6 RU/BSA) ved fortynding i phosphatpufferholdigt saltvand (PBS). Man satte 26 mikroliter af denne opløsning til 10 ml af en 1:1 blanding af DMSO og deioniseret destilleret vand, der indeholdt 0,1 M TBABFi og 18 mM ammoniumpersulfat, i 30 reaktionsbeholderen. Slutkoncentrationen af ruthenium- mærket BSA var 2 x 10'* M. Elektrokemi luminescensen blev målt som beskrevet i eksempel 2.
På analog måde blev en opløsning, der indeholdt 7,8 x 35 10’€ M ikke-mærket BSA, fremstillet og sat til reaktions beholderen til opnåelse af en slutkoncentration af ikke- 38 DK 173025 B1 mærket BSA på 5 x 10~B M. Man målte elektrokemiluminescensen af denne opløsning og af en tilsvarende opløsning uden BSA.
5 En opløsning, der indeholdt 3,75 x ΙΟ'5 M kanin-anti-BSA-antistof, blev fremstillet ud fra en stamopløsning af kanin-anti-BSA-antistof (6,0 mg/ml) ved fortynding i PBS, og der sattes en prøve (26 mikroliter) til opløsningen af ruthenium-mærket BSA i reaktionsbeholderen til opnåelse 10 af en slutkoncentration af kanin-anti-BSA-antistof på 1 x 10-7 M.
Elektrokemiluminescensen af den resulterende blanding af ruthenium-mærket BSA-antigen og antistof {kanin-anti-BSA) 15 blev målt. Resultaterne angivet i den efterfølgende tabel VII viser en reduktion i elektrokemiluminescensen af det ruthenium-mærkede BSA efter tilsætning af kanin-anti-BSA-antistof, og resultaterne viser også, at man kan opnå en homogen elektrokemiluminescerende bestemmelse af antistof 20 til BSA. På basis af disse resultater vil det være klart for fagmanden, at man kan udvikle en homogen elektrokemi-luminescens-immunoanalyse til påvisning af andre analy-sander af interesse.
25 TABEL VIII
Reduktion af elektrokemiluminescensen (ECL) af ruthenium-mærket bovint serumalbumin efter binding til antistof 30 Ruthenium- Kanin-
Ikke-mærket mærket (BSA) anti-BSA
BSA (kontrol) (antigen) (antistof) ECL(mV) 0 2 X 10*β M 0 727 35 0 2 x 10'® Μ 1 x 10'7 M 92 2 x 10‘e M 0 0 94 EKSEMPEL 8 39 DK 173025 B1
Homogen elektrokemiluninescerende immunoanalyse for 5 museimmunoglobulin G (IgG)„
En opløsning indeholdende 6,25 x 10~6 M kanin-anti-muse-IgG-antistof mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2’-bipyri-dyl-bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket 10 kanin-anti-muse-IgG-antistof) blev fremstillet ud fra en stamopløsning af ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof (2 rog/ml, 7,5 Ru/antistof) ved fortynding i phos-phatpufferholdigt saltvand (PBS). Man satte 80 roikroliter af denne opløsning til 10 ml af en blanding (1:1) af DMSO 15 og ioniseret destilleret vand, der indeholdt 0,1 M TBABF« og 18 mM ammoniumper sulf at, i reaktionskolben. Den endelige koncentration af ruthenium-mærket antistof var 5 x 10~8 M. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskrevet i eksempel 2.
20 På analog måde fremstillede man en opløsning indeholdende 6,25 x ΙΟ"6 M ikke-mærket anti-muse-IgG-antistof fra kaniner, og denne opløsning satte man til reaktionsbeholderen til opnåelse af en endelig koncentration af 25 ikke-mærket antistof på 5 x ΙΟ"8 M. Man bestemte elektrokemiluminescensen af denne opløsning og af en tilsvarende opløsning uden antistof.
En opløsning indeholdende 2,5 x 10"5 M muse-igG frem-30 stilledes ud fra en stamopløsning af muse-igG (4,0 mg/ml) ved fortynding i PBS, og man satte forskellige prøver (20 mikroliter og 40 mikroliter) af denne opløsning til opløsningen af ruthenium-mærket anti-muse-IgG-antistof i reaktionsbeholderen til opnåelse af slutkoncentrationer 35 af muse-igG på hhv. 5 x ΙΟ'8 M og 1 x 10'1 M.
40 DK 173025 B1
Derefter målte man elektrokemiluminescensen af den resulterende blanding af ruthenium-mærket anti-muse-IgG-anti-stof og antigenet (muse-IgG). resultaterne fremgår af den nedenstående tabel VIII. Elektrokemiluminescensmålinger-5 nes afhængighed af koncentrartionen af muse-IgG-antigen er vist på figur 1. Disse resultater viser, at der sker en reduktion i elektrokemiluminescensen af det ruthenium-mærkede antistof efter tilsætning af antigenet. På basis af disse resultater vil det være klart for fagmanden, at 10 det er muligt at udvikle en homogen elektrokemilumine-scens-immunoanayse til bestemmelse af koncentrationen af andre stoffer af interesse.
TABEL VIII 15
Reduktion af elektrokemiluminescensen (ECL) af ruthenium-mærket antistof efter binding til antigen ikke-mærket Ruthenium-
20 anti-muse- mærket-anti- muse-IgG
IgG (kontrol) IgG (antistof) (antigen) ECL (MV) 0 5 x 10‘® M 0 1610 0 5 x 10"® M 5 x 10"® M 1360 25 0 5 x 10’® Μ 1 x 10*7 M 1240 5 x 10*® M 0 0 0 EKSEMPEL 9 30 Heterogen elektrokimiluminescerende immunoanalyse for legionella under anvendelse af et muse-anti-legionella-immunoglobulin G (IgG) antistof og ruthenium-mærket kanin-anti-museimmunoglobulin G (IgG) antistof 35 En formalinholdig suspension af bakterien Legionella medadei blev indstillet til en optisk densitet (ved 425 41 DK 173025 B1 nm) på 1,00 ved fortynding med PBS puffer. Omkring 3 x 109 celler blev anbragt i et konisk mikrocentrifugeglas.
Cellerne blev centrifugeret (10 minutter ved 10.000 omdr./min., subernatanten blev hældt fra, og cellerne 5 blev resuspenderet i en 1:50 fortynding af et monoklonalt IgG-antistof fra mus (1,45 mg/ml), som var specifikt for Legionella midadei, i PBS (1 ml) . Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur blev cellerne centrifugeret, og supernatanten blev borthældt, hvorefter cellerne blev 10 resuspenderet i PBS-puffer og centrifugeret påny. Efter dekantering af supernatanten blev cellerne resuspenderet i en 1:50 fortynding (i PBS) af kanin-anti-muse-IgG-anti-stof mærket med 4,4,-dichlormethyl-2,2'-bipyridyl-bis (2,2’-bipyridyl) ruthenium (II), d.v.s. ruthenium-mær 15 ket kanin-anti-muse-IgG-antistof (2 mg/ml, 7,5 Ru/anti-stof). Efter inkubation ved stuetemperatur i 1 time blev cellerne centrifugeret, og subernatanten blev dekanteret fra, hvorefter cellerne blev resuspenderet i PBS og vasket 2 gange under centrifugering som beskrevet ovenfor.
20 Efter den sidste udvaskning blev cellerne resuspenderet i 200 mikroliter PBS. Man satte 100 mikroliter af cellesuspensionen til reaktionskolben, som i forvejen indeholdt 10 ml DMSO/deioniseret destilleret vand (1:1) indeholdende 0,1 M TBABF« og 18 Mm annomiumpersulfat. Man målte 25 elektrokemiluminescensen af cellesuspensionen. Derefter satte man yderligere 100 mikroliter af cellesuspensionen til reaktionskolben og målte elektrokemiluminescensen.
Desuden målet man elektrokemiluminescensen for en opløsning uden celler. Desuden målte man elektrokemiluraine-30 scensen for en opløsning uden celler, som tjente som kontrol, ifølge metoden beskrevet i eksempel 2. Resultaterne vist i tabel 9 nedenfor viser, at man med gode resultater har gennemført en heterogen elektrokemilumeniscerende immunoanalyse for legionella under anvendelse af rutheni-35 um-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof.
TABEL 9 42 DK 173025 B1
Heterogen elektrokemiluminescerende (ECL) imminoanalyse for legionella micdadei 5
Prøve ECL (mV)
Legionella micdadei cellesuspension, 1,9 x 109 celler 10 i DMSO/H20 (1:1) 160
Legionella micdadei cellesuspension, 9,3 x 10® celler i DMSO/H2 (1:1) 90 15 DMSO: H20 (1:1) 0 EKSEMPEL 10 20 Homogen elektrokemiluminescenerende immumoanalyse for legionella under anvendelse af et muse-anti-legionella-immuniglobulin G (IgG) antistof og rutheniura-mærket ka-nin-anti-muse-immunoglobulin G (IgG) antistof.
25 En suspension af bakterien Legionella micadei blev fremstillet og inkuberet med et muse-monoklonalt IgG-anti-stof, som er specifikt for legionella, som beskrevet i eksempel 9. Cellerne blev centrifugeret, vasket og resus-penderet i 0,2 ml PBS. En prøve (80 mokroliter) af anti-30 muse-IgG-antistof fra kaniner, mærket med 4,4'-di-chlormethyl-2,2' bipyridyl-bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium (II), d.v.s. ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-anti-stof (1,25 x 10‘6 M) blev sat til cellesuspensionen, og blandingen blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur.
35 Som en kontrol blev en identisk fortynding af ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof inkuberet på samme 43 DK 173025 B1 måde i fravær af cellesuspensionen. Efter inkubationsperioden blev opløsningen af mærket antistof sat til 10 ml DMSO/deioniseret destilleret vand (1:1), der indeholdt 0,1 M TABAF.J og 18 mM ammoniumpersulfat, i reaktionsblan-5 dingen, til opnåelse af en slutkoncentration af ru- thenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof på 1 x 10"9M. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskrevet i eksempel 2. Man fulgte den samme procedure for cellesuspensionen med tilsat ruthenium-mærket kanin-anti-muse-10 IgG-antistof. Resultaterne, som er vist i tabel X, viser en reduktion af den elektrokemiluminescerende stråling efter vekselvirkningen imellem det ruthenium-mærkede an-ti-muse-IgG-antistof og det muse-monoklonale antistof bundet til legionella, og resultaterne viser også, at man 15 med gode resultater har gennemført en elektrokemilu minescerende immunoanalyse for legionella micdadei.
TABEL X
20 Homogen elektrokemiluminescerende (ECL) immunoanalyse for Legionella mecdadei
Prøve ECL (mV) 25 1 x 10‘8 M ruthenium-merket anti-muse-IgG-antistof 976 1 x 10'8 M ruthenium-mærket anti-muse-IgG-antistof + monoklonalt antistof bundet til Legionella mecdadei 803 30 DMSO: H20 (1:1) 0 EKSEMPEL 11 35 Forøgelse af elektrokemiluminescensen efter frigivelse af et ruthenium-mærket antistof bundet til bakterier.
44 DK 173025 B1
En suspension af bakterien Legionella micdadei i formalin blev indstillet til en optisk densitet (ved 425 nm) pål,00 ved fortynding med PBS-puffer, og 2 ml af denne suspension blev overført til et konisk mikrocentrifuge-5 glas. Cellerne blev centrifugeret (10 minutter ved 10.000 omdr./min.), supernatanten blev dekanteret fra, og cellerne blev resuspenderet i en 1:10 fortynding i PBS (0,5 ml) af et muse-monoklonalt IgG-antistof (1,45 mg/ml) specefikt for Legionella micdadei. Efter inkubation ved 10 stuetemperatur i 1 time blev cellerne centrifugeret som før, og supernatanten blev dekanteret fra, hvorefter cellerne blev resuspenderet i PBS-puffer og centrifugeret påny. Efter dekantering af supernatanten blev cellerne resuspenderet i en 1:50 fortynding (i PBS) af ruthenium-15 mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof (1 ml, 7,5 Ru/anti-stof). Efter inkubation ved stuetemperatur i 1 time blev cellerne centrifugeret som tidligere, og supernatanten blev dekanteret fra, hvorefter cellerne blev resuspenderet i PBS og vasket 2 gange med mellemliggende centrifu-20 gering som tidligere beskrevet. Efter den sidste udvaskning blev cellerne resuspenderet i 100 mikroliter af enten PBS eller 1,0 M eddikesyre i 0,9 S NaCl-opløsning (normalt saltvand) og inkuberet ved stuetemperatur i 40 minutter. Efter centrifugering blev 100 mikroliter af 25 supernatantvæsken overført til reaktionskolben sammen med 10 ml af en blanding (1:1) af DMSO og deioniseret destilleret vand indeholdende 0,1 M TBABF4 og 18 mM am-moniorapersulfat. Elektrokemiuminescensen af cellesuper-natantvæsken (eddikesyre/normalt saltvand) og af super-30 natantvæsken fra de PBS-vaskede celler blev målt i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 2. Resultaterne af elektrokemiluminescensmålingerne er vist i den nedenstående tabel XI, og de viser, at den eluering af det ruthenium-mærkede kanin-anti-muse-IgG fra de med 35 monoklonalt antistof belagte legionella-bakterier, som opnås ved at behandle cellerne med 1,0 M eddikesyre/nor- 45 DK 173025 B1 malt saltvand (reference 23), resulterer i en forøgelse af den elektrokemiluminescens, som frembringes af det ik-ke-bundne rutheniura-mærkede antistof. Disse resultater viser også, at det ruthenium-mærkede antistof er bundet 5 til de med monoklonalt antistof belagte legionella-bakte-rier, og at udvaskningen med PBS ikke resulterede i en forøgelse i ECL sammenlignet med baggrundssignalet.
TABEL XI
10
Elektrokemi luminescens (ECL) af supernatantvæsker fra celler belagt med ruthenium-mærket anti-muse-immunoglobulin (IgG) 15 Opløsning ECL (mV)
Baggrundskontrol:
100 mikroliter 1,0 M
eddikesyre/normalt saltvand 134 20 100 mikroliter PBS-cellevaske- supernatantvæske 121 100 mikroliter 1,0 M 25 eddikesyre/normalt saltvand sammen med cellevaske- supernatantvæske 214 EKSEMPEL 12 30
Homogen konkurrerende immunoanalyse for pregnandiol-3-glucuronid (PD3G) i urin.
Pregnandiol-3-glucoronid (PD3G) kan påvises og bestemmes 35 kvantitativt i urin ved at bringe en urinprøve i kontakt med en kendt mængde PD3G mærket med en elektrokemilumine- 46 DK 173025 B1 scerende gruppe og en kendt mængde af en anti-PD3G-anti-stof under sådanne betingeler, at PD3G, som er tilstede i prøven, og den PD3G-elektrokemiluminescerende gruppe konkurrerer med hinanden om at besætte bindingsstederne på 5 antistoffet. Efter et passende tidsrum kan den resulterende prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde. Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, og herudfra kan man betemme den mængde 10 PD3G, som er tilstede i prøven.
EKSEMPEL 13 Mærkning af nucleinsyrer med en tris-ruthenium-bipyridyl-15 N-hydroxysuccinimidester.
Nucleinsyreprøver {5-25 mikrogram) i 10 mM tris-HCL (pH 8,0)/1 mM EDTA kan varmedenatureres, afkøles og modificeres ved bisulfit-katalyseret transaminering af cytosin-20 rester med ethylendiamin i 3 timer ved 42 "C. Efter
dialyse natten over imod 5 mM natriumfosfatpuffer, PH
8,5, kan prøverne koncentreres ti 100 mikroliter ved ultrafiltrering. Disse modificerede nucleinsyrer (1-10 mikrogram) kan fortyndes til 100 mikroliter med 0,1 M 25 natriumfosfatpuffer, pH 8,5.
Man kan fremstille et tris-ruthenium-bipyridyl-N-hydroxy-succinimidester-derivat som en 0,2 M stamopløsning i N,N-dimethylformamid (EMF) ved i sig selv kendte metoder. Man 30 kan sætte 5 mikroliter af denne esteropløsning til den modificerede nucleinsyreopløsning i 0,1 M natriumfosfatpuffer, pH 8,5, og inkubere blandingen ved stuetemperatur i 1 time. Mærkede nucleinsyreprober kan renses ved dialyse imod 150 mM natriumclorid/10 mM natriumfosfatpuffer 35 (pH 7,0), der udskiftes mindst 3 gange. De opbevares ved 4 ’C indtil anvendelsen.
EKSEMPEL 14 47 DK 173025 B1
Nucleinsyrehybridiseringsanalyse for humant T-celle-5 leukemi III virus (HTLV-III) i blod.
HTLV-III virus kan påvises i helt blod ved behandling af blodet til frigivelse af RNA fra viruspartikler. En prøve, der indeholder HTLV-III RNA, bringes i kontakt med en 10 enkeltstrenget oligonucleotid-probe, som er komplementær til HTLV-III RNA’et, og mærkes med en elektroke mi luminescerende gruppe. Efter en passende tid, kan den resulterende prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en 15 elektrokemisk energikilde, der er effektiv til dette formål. Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, og på grundlag heraf kan man bestemme den mængde HTLV-III RNA, der er tilstede i prøven.
20 EKSEMPEL 15
Homogen nucleinsyrehybridiseringsanalyse for legionella-bakterier i en klinisk prøve.
25 Legionella-bakterier kan påvises i en klinisk prøve, såsom spyt, ved at behandle spyttet til frigivelse af ri-bosomalt RNA fra bakterierne. Den resulterende prøve bringes i kontakt med en enkeltstrenget oligonucleotid-probe, som er komplementær til de sekvenser i det ribo-30 somale RNA, som er specifikke for legionella, og mærkes med en elektrokemiluminescerende gruppe. Efter en passende tid kan den resulterende prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er 35 effektiv til dette formål. Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, og mængden af legionella-bakte- 48 DK 173025 B1 rier, som er tilstede i prøven, kan bestemmes på dette grundlag.
EKSEMPEL 16 5
Hybridiseringsanalyse til bestemmelse af cytomegalovirus-DNA integreret i gemonisk DNA ved strengforskydningsmetoden .
10 Cytomegalovirus (CMV) DNA kan påvises i humant genomisk DNA ved behandling af en vævsprøve, for eksempel lymfocytter, til frigørelse af DNA'et efterfulgt af en spaltning af DNA med restriktionsenzymer. Den resulterende prøve, som indeholder dobbeltstrengede fragmenter af CMV, 15 bringes i kontakt med en enkeltstrenget oligonucleotid-probe, som er komplementær til CMV-DNA'et, mærket med en elektrokemiluminescerende gruppe og i stand til at forskyde en af strengene i DNA-duplex’et. Efter et passende tidsrum kan den resulterende prøve induceres til vedva-20 rende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde til dette formål. Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, og på grundlag heraf kan man bestemme den mængdecyto-megalovirus-DNA, som er tilstede i prøven.
25 EKSEMPEL 17
Hybridiseringsnalyse til påvisning af ras-oncogenet i humane blærecarcinomaceller ved anvendelse af en heterogen 30 metode.
Man kan bestemme ras-onkcogenet i humane blærecarcinomaceller ved at behandle en vævsprøve til frigørelse af DNA, som man spalter med restriktionsenzymer. Derefter 35 nedbryder man DNA'et til enkeltstrenge og binder disse til nitrocellulosepapir som tidligere beskrevet af Mania- 49 DK 173025 B1 tis, T. et al. (24). filterpapiret med bundet enkelt-strenget DNA bringes i kontakt med en oligonucleotid-pro-be, som er specifik for ras-oncogenet, og som er mærket med en elektrokemiluroinecerende gruppe. Efter en passende 5 reaktionstid kan den resulterende prøve induceres til vedvarende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er effektiv til dette formål. Den udsendte stråling kan påvises, og på grundlag heraf kan man bestemme tilstedeværelsen af 10 ras-oncogen-RNA i prøven.
EKSEMPEL 18
Elektrokemiluminescerende polymer-baseret enzymanalyse.
15
Et makromolekylært enzym-substrat, f.eks. stivelse, dex-tran eller en syntetisk fremstillet makroroolekylær polymer, kan mærkes med en elektrokemiluminescerende gruppe.
Det mærkede substrat kan benyttes til påvisning og kvan-20 titativ bestemmelse af tilstedeværelsen af et enzym, som forekommer i et multikomponentsystem, det mærkede substrat kan også benyttes til kvantitativt at bestemme en mængde enzym, som er bundet til et antistof, en DNA-pro-be, en RNA-probe, streptavidin, avidin eller biotin. Det 25 mærkede substrat kan spaltes selektivt til mindre fragmenter ved hjælp af et passende enzym. Man kan anvende en hvilken som helst kombination af enzym og substrat. Som eksempler på enzymer kan nævnes glycosidaser, glucosi-daser, amylaser, proteaser, endonucleaser, lyaser og dex-30 tranaser. Efter en passende reaktionstid kan den resulterende prøve induceres til vedværende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er effektiv til formålet.
Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, og her-35 ud fra kan man bestemme den mængde enzym, der er tilstede i prøven. Fordelen er, at man opnår en forstærkning af 50 DK 173025 B1 det elektrokemiluminescerende signal fra de spaltede fragmenter, som hver især er mærket med en elektrokemilu-minescerence gruppe.
5 EKSEMPEL 19
Afsløring af streptokokker af en elektrokemiluminescerende enzymforsøg.
10 En prøve indeholdende streptokokker kan bringes i kontakt med en reagensblanding indeholdende et syntetisk peptid mærket med en elektrokemiluminescerende gruppe. Det syntetiske peptid er et substrat specifikt for peptidase frembrakt af bakterien. Indvirkning af peptidasen på det 15 syntetiske peptid bevirker frembringelsen af fragmenter mærket med den elektrokemiluminescerende gruppe. Efter et passende tidsrum kan den fremstillede prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der 20 er i stand til at inducere den elektrokemiluminescerende gruppe til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling. Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af tilstedeværende streptokokker i prøven kan bestemmes herud fra.
25 EKSEMPEL 20
Enzymimmunoforsøg for hepaitis B overfladeantigen baseret på elektrokemiluminescens.
30
En blodprøve indeholdende hepatitis B overfladeantigen (HBsag) bringes i passende tidsrum i kontakt med et antistof specifikt for HBsag og mærkes med dextranase. Ikke-bundet antistof til HBsag fjernes, og antigen-antistof-35 komplekset bringes i kontakt med en dextratpolymer mærket med elektrokemiluminescerende gruppe. Indvirkning af 51 DK 173025 B1 dextranasen på de mærkede polymere vil bevirke frembringelse af fragmenter, der hver især er mærket med den elektrokemiliuminescerende gruppe. Efter passende tidsrum kan den fremstillede prøve induceres til vedvarende at 5 udsende elektromagnetisk stråling ved direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er i stand til at inducere den elektrokemiluminescerende gruppe til varigt at udsende elektromagnetisk stråling. Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af hepatitis B overflade-10 antigen tilstede i prøven bestemmes herudfra.
EKSEMPEL 21
Homogen undersøgelse for bradykininreceptorer under an-15 vendelse af er. elektrokemiluminescerende-mærket brady-kinin.
En vævsprøve indeholdende bradykininreceptorer præpareres på passende måde og bringes i kontakt med bradykinin mær-20 ket med en elektrokemiluminescerende gruppe. Efter et passende tidsrum kan den fremstillede prøve induceres til varigt at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte eksponering for en elektrokemins energikilde, der er i stand til at inducere den elektrokemiluminescerende grup-25 pe til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling.
Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af bra-dykininreceptor tilstede i prøven bestemmes herudfra.
Dette forsøg kan også anvendes til at måle andre ligand-receptorgensidig indvirkninger som f.eks. østrogen-østro-30 genreceptor. Herudover kan denne undersøgelse anvendes til at bestemme og kvantificere mængden af umærkede ligander ved nvendelse af en kompetitiv bindingsforsøgsmetode.
35 EKSEMPEL 22 52 DK 173025 B1
Anvendelse af en elektrokemiliminescerende gruppe til at afsløre nucleinsyrehybrider.
5
En prøve indeholdende nucleinsyre hybrider som f.eks. dobbeltstrenget DNA, DNA-RNA dubeltter eller dobbeltstrenget RNA bringes i kontakt med en elektrokemilumine-scerende gruppe, der specielt kiler sig ind i nucleinsy-10 rehybrider. Efter passende tisdrum kan den fremstillede prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte eksponering for en elektrokemisk energikilde, der er i stand til at inducere den e-lektrokemiluninescerende gruppe til varigt at udsende e-15 lektromagnetisk stråling. Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af nucleinsyrehybrider, der findes i prøven, bestemmes herudfra.
EKSEMPEL 23 20
Afsløring af humant T-celleleukemivirus III (HTLV-III) antigen kompleksbundet til antistof i spyt ved hjælp af et homogent immunoforsøg under anvendelse af elektrokemiluminescens.
25
En spytprøve indeholdende HTLV-III kompleksbundet til antistof bringes i kontakt med en opløsning indeholdende et kaotopisk middel for at itubryde antigen- antistofkomplekset. Denne opløsning bringes herefter i kontakt med 30 et antistof specifikt for HTLV-III og mærket med e-lektrokemiluminescerende gruppe. Det kaotopiske middel fjernes, hvilke muliggør at de mærkede og umærkede antistoffer kan rekombinere med antigen. Efter passende tidsrum kan den fremstillede prøve induceres til vedva-35 rende at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte eksponering for en elektrokemisk energikilde, der er i 53 DK 173025 B1 stand til at inducere den elektrokemiluminescerende gruppe til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling.
Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af human T-celleleukemivirus III (HTLV-III) antigen tilstede i 5 prøven kan bestemmes herudfra. Disse metoder kan ogsåanvendes til prøver indeholdende andre typer antigen-antistofkomplekser som f.eks. hepatitis antigen- antistofkomplekser, cytomegolavirus-antistofkomplekser og non-A, non-B hepatitis-antistofkomplekser i serum.
10 EKSEMPEL 24
Immunoforsøg til afsløring og identificering af en hel række stafylokok enterotoxiner.
15 '
Monoklonale antistoffer specifikke for hver af stafylo-kokenterotoxinerne A, B, C , D og E og monoklonale antistoffer, der er krydsreaktive med disse enterotoxiner, blev renset. Hver antistof rensedes fra askities væske 20 ved passage af askitesvæsken gennem en søjle af stafylo-kokprotien A koblet til en agarosegels understøttelses-matrix, der er udstyret med bindings-eluerings og regenerationspuffere som del af det monoklonale antistofrensningssystem (Bid-Rad Laboratories, Inc.). Ved rens-25 ningsmetoden forfiltreredes to ml askitesvæske typisk indeholdende 5-15 ml monoklonalt antistof pr. ml ved at anbringe et Metricell membranfilter (Gelman Sciences,
Inc.) mellem to F-13 analytiske papirer (Schleicher and Schuell, Inc.) i bunden af en 10 ml injektionssprøjte 30 (Becton Dickenson, Inc.) indføre askitesvæsken i injektionsnålen, indsætte stemplet og filtrere askitesvæsken over i en opsamlingsbeholder. Filtratet blandedes med lige rumfang af bindingspufferen og påførtes en 5 ml protein A agarosesøjle. Søjlereagensreservoiret fyldets 35 herefter med bindingspufferen for at påbegynde eluerin-gen. Elueringen kontrolleredes for absorbans ved 280 nm 54 DK 173025 B1 (Α-βο) i og der opsamledes 1 ml fraktioner. Når A,s0 var nået tilbage til en stabil basislinieværdi, vaskedes søjlen med 5 lejerumfang bindingspuffer, og elueringspuf-feren anvendtes herefter til at eluere det rensede immu-5 noglobulin fra søjlen. For at neutralisere immunoglobulin opsamledes elutatet i 0,3 ml 1 M Tris-HCL, pH 9,0. Når A28o atter var vendt tilbage til en stabil basislinieværdi vaskedes søjlen med 5 lejerumfang elueringspuffer, efterfulgt af 10 lejerumfang regenerationspuffer og 5 10 lejerumfang bindingspuffer, således at søjlen var parat til næste rensningscyklus.
Fraktionerne indeholdende det rensede immunoglobulin blev slået sammen og koncentreret under anvendelse af en 15 omrørt ultrafiltreringscelle (Amicon Corp.) Slutkoncen-trationen af renset monoglobulin var mere end 5 mg/ral bestemt ved hjælp af Lowry forsøgsmetoden for total protein. Det rensede antistof dialyseredes over for to udskiftninger af phosphat-pufferet saltvand (PBS) indehol-20 dende 0,1 % natriuraazid i 48 timer ved 4 *C.
De rensede monoklonale antistofferf titreredes i et 96-brønds mikrotiterplade ELISA system til opnåelse af et mål for deres immunologiske reaktivitet for specifik en-25 terotoxin. Slutpunkt titrene for de antistoffer, der blev opnået, blev sammenlignet med referencetiterværdier for tidligere undersøgte prøver af hver antistof. Antistoffer med tilstrækkeligt titer blev accepteret som immunologisk funktionelt beklædende antistoffer til immobilisering til 30 en dianogstisk reagensholder f.eks. en dyppestav eller til konjugation til et enzym til anvendelse som prober ved immunoforsøg.
Det diagnostiske reagensholdesystem (dyppestave) med ni-35 trocellulosemembraner fastgjort præpareredes til immobi lisering af antistoffer til membranoverfladen ved først 55 DK 173025 B1 at dybbe membranerne i phosphatpufferet saltvand i 1 time ved stuetemperatur for at forbedre membranens opfugte-lighed. Staven fjernes fra opløsningen, og man lod membranen lufttørre. Opløsninger af rensede monoklonale an-5 tistoffer, der hver var specifikke for en af stafylo- kokenterotoxinerne A, B, C, D, eller E og en ikke-spe-cifik kontrol muse-immuno-globulin {Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.) påførtes forskellige områder af membranen ved at anbringe 2 mikroliter antistofopløs-10 ning direkte på membranoverfladen. Koncentrationen af hver anvendt antistof var en sådan, der var kendt for at mætte bindingspladserne fra nitrocellucose: 250 roikro- gram/ml 3A antistof (specifikt for A toxin), 50 mikro gram/ml 2B antistof (specifikt for B toxin), 300 mikro-15 gram/ml 1C3 antistof (specifikt for Cl, C2, og C3 tox- iner), 200 mikrogram/ml 3D antistof (specifikt for D toxin), 250 mikrogram/ml 4E antistof (specifikt for E toxin) og 200 mikrogram/ml ikke-specifikt kontrol muse-immunoglobulin. Dyppestavene lufttørredes ved stuetem-20 peratur, og de tilbageblevne proteinbindingspladser påmembranen blokeredes ved neddypning af stavene i en opløsning af phosphatpufferet saltvand indeholdende 0,5 %
Tween 20 og 3 % bovint serum albumin. Efter inkubation natten over ved stuetemperatur i denne blokerende opløs-25 ning lufttørredes stavene.
Rensede monoklonale antistoffer 2A (specifik for A og E toxiner), 6B (specifik for B, Cl, og C3 toxiner), og ID (specifik for D toxin) lænkedes kovalent til enzymalka-30 lisk phosphortase til anvendelse som konjugerede prober for at bestemme tilstedeværelsen af A, B, Cl, C2, C3, D og E toxiner bundet til antistoffer immobiliseret på membranoverfladen af den diagnostiske reagensholdige dyppestav. Hvert konjugat fremstilledes ved hjælp af en 35 støkiometrisk kontorlieret totrinsmetode, der anvender glutaraldehyd som det bifunktionelle tværbindingsmiddel.
56 DK 173025 B1
Ved denne metode sattes 0,47 ml EIA grad alkalisk phosphatase (2500 enh./mg, Boehringer Mannheim Corp.) til 1,5 ml. 50 mM kalium phosphatpuffer pH 7,2 indeholdende 13,4 mikroliter vandig glutaradehydopløsning (25 %, Sigma 5 Chemical Co.). Blandingen omrørtes i 90 minutter ved stuetemperatur for at muliggøre fastgørelse af glutaral-dehyd til fri aminogrupper fra enzymmolekylet. Efter denne inkubation sattes en 2 ml prøve af renset monoklonalt antistof i en koncentration på 1 mg/ml til, blandingen 10 omrørtes yderligere 90 minutter og anbragtes på is for at afbryde konjugationsreaktionen. Konjugatet dialyseredes over for 2 udskiftninger phosphatpufferet saltvand indeholdende 0,1 % natriumazid i 48 timer ved 4 ’C. Bovint serumalbumin tilsattes dialysatet til slutkoncentrationen 15 på 3 % for at stabilisere under den langvarige lagring ved 4 ’C. antistof-enzymkonjugaterne titreredes i et 96-brønds mikrotiterplade ELISA system til opnåese af et mål for deres immunologiske reaktivitet for specifikt entero-toxin. De opnåede slutpunktstiterværditer for konjugater-20 ne sammelignedes med referencetiterværdier for forud undersøgte prøver af hver konjugat. Konjugater med tilstrækkeligt titer accepteredes til anvendelse som prober ved dyppestavforsøg for stafylokokinterotoxiner.
25 Faste fødevarer såsom skinke, pølse, nudler og ost, der er repræsentanter for fødevaretyper der sædvanligvis as-soieseres med udbrud af stafylokokfødevareforgiftning, omdannedes til en homogen væskesuspension for at udføre forsøget for undersøgelse for stafolykokenterotoxiner. I 30 et typisk ekstraktion tilsattes 20 ml vand til 20 g fødevarer, og blandingen homogeniseredes i 30 sekunder under anvendelse af en laboratorieblender (Tekmar Co.) Til mere viscose fødevarer anvendtes 2 gange dette rumfang vand.
35 Stafylokokenterotoxin sattes til fødevaren enten før eller efter homogenisering. Fødevarehomogenatet undersøgtes 57 DK 173025 B1 direkte under anvendese af den diagnostiske reagens-dyppestav beskrevet ovenfor. Positive resultater blev opnået med de fødevareprøver, hvortil lave niveauer af enterotoxin sattes. Yderligere extraktionstrin blev ud-5 ført på fødevarehomogenaterne for at forbedre følsomheden for stafylokokenterotoxinafsløring. Homogenatet justeres typisk til pH 4,5 med 6 N HC1 og centrifugeret i 20 minutter ved 20.000 x g, og den supernatante del indstilledes til pH 7,5 med 5 N NaOH, centrifugeredes atter 10 20 minutter ved 20.000 x g, og den supernatante del an vendtes direkte ved dyppestavsforsøget. Fødevareextrakter præpareret på denne måde, havde en følsomhed for ente-rotoxinafsløring på 1 nanogram pr. milliliter af extrak-ten for hver afprøvede toxin i fødevaren.
15
Flydende fødevarer såsom mælk undersøgtes direkte ved at neddyppe den diagnostiske dyppestav i den flydende fødevare og foretage forsøg på samme måde som for de faste fødevarehomogenater. Ved at undersøge disse fødevare be-20 stemtes det også, at følsomheden kan forbedres til 1 nanogram pr. milliliter ved at udføre de yderligere ovenfor beskrevne extraktionstrin.
Diagnostiske reagensholdere {dyppestave) udstyret med en 25 nitrocellulosemembran, der bærer monoklonale antistoffer specifikke for de enkelte stafylokokenterotoxiner neddyp-pedes i et reagensglas indeholdende 1 ml flydende fødevarer, fødevarehomogenat eller fødevareekstrakt fremstillet som beskrevet ovenfor, eller 1 ml PBS. hver af 30 disse opløsninger indeholdt 1 ng/ml af et tilsat stafylo-kokenterotoxift eller en blanding af enterotoxiner hver med en koncentration på 1 ng/ml. Dyppestaven forblev ned-dyppet i disse prøveopløsninger i 1 time ved stuetemperatur under omrystning på en roterende omryster. Stavene 35 fjernedes herefter fra prøverne og vaskedes under omrystning i 5 minutter i PBS med 0,5 % Tween 20, 58 DK 173025 B1 herefter 2 gange yderligere under omrystning i PBS alene, 5 minutter pr. afvaskning. En blanding af monoklonale antistof-alkaliske phophatasekonjugater præpareret som beskrevet fremstilledes på følgende måde: 1:1000 for- 5 tyndinger af 2A konjugat (specifikt for A og E toxiner), 6B konjugat (specifikt for D, Cl, C, 2 og C3 toxiner) og ID konjugat (specifikt for D toxin) fremstilledes i den samme opløsning (30 mikroliter af hver konjugat i 30 ml PBS indeholdende 0,5 % Tween 20 og 3 % BSA) . Stavene 10 neddyppedes i denne konjugatblanding, 2 ml pr. stav, og inkuberedes i 30 minutter ved stuemperatur under omrystning. Stavene vaskedes 2 gange i PBS-Tween, herefter 3 gange under omrystning i PBS, 5 minutter pr. vask, for at fjerne ubundet raonoklonalt antistof/alkalisk phosphatase-15 konjugat fra membranoverfladen.
Efter at have fjernet ubundet monoklonalt antistof-en-zymkonjugat fra den diagnostiske reagensdyppestav påviste tilstedeværelsen af bundet konjugat ved at neddyppe 20 staven i en opløsning af 5-brom-4-chlor indolyl phcsphat (BCIP, Sigma Chemical Co.) og nitroblå tetrazolium (NBT,
Sigma Chemical Co.). BCIP og NBT opløsningerne fremstilledes hver for sig på følgende måde: 3,2 ml BCIP opløses i 10 ml 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 5 nM MgCl: og 8,8 NBT 25 opløstes i 10 ml af samme opløsning. Disse opløsninger blandedes umiddelbart inden anvendelsen. Stavene neddyppedes i substratblandingen i 30 minutter ved stuetemperatur under omrystning, herefter rensedes i vand og lufttørredes, hvilket gav en permanent aflæsning af for-30 søgsresultatet. Hele forsøgsmetoden kræver få til ingen afpipetteringstrin, minimal håndteringstid og kan udføres i løbet af omtrent 2 timer. Substratet for enzymkon-jugatet BCIP hydrolyseredes med konjugatet bundet til to-xinet på membranen til opnåelse af et reaktionsprodukt, 35 der reducerer NBT til et uopløseligt blåt produkt, der binder til membranen på staven. Tilstedeværelsen af 4 * 59 DK 173025 B1 stafylokonenterotoxin i prøven, der var bundet med det immobiliserede første monoklonale antistof på membranen og afsløret ved binding af det andet monoklonale anti-stof-enzymkonjugat indiceredes ved tilstedeværelsen af en 5 blå plet på nitrocellulosemembranen. Når der ikke fandtes stasfylokokenterotoxin i prøven, forblev nitrocellulosemembranen hvid. Området af membranen, hvortil kontrol muse-immunoglobulin var immobiliseret, forblev i hvert tilfælde hvid. Identifikation af det specielle stafylo-10 kokenterotoxin, der forefandtes, d.v.s. A, B, C, D eller E indiceredes ved tilstedeværelsen af en blå plet på det afgrænsede og identificerbare område af membranen, hvortil det monoklonale antistof specifikt for dette toxin var immobiliseret. Denne metode, der anvender en diagnosis tisk reagensdyppestav, er i stand til at afsløre 1 nanogram pr. milliliter af en eller flere stafylokoken-terotoxiner i en flydende fødevare, i fødevarehomogenat eller et fødevareekstrakt.
20 EKSEMPEL 25
Enzymimmunoforsøg (EIA) for coliforme bakterier.
Forsøg blev udført for at sammenligen aflæsningseffekti-25 . viteten for fækale coliformeer for at smmenligne den omhandlede fremgangsmåde (CAP-EIA MPN) og EPA godkendt MPN konfirmeret metode under anvendelse af EC bullion ved 44,5 "c.
30 Forsøgene udførtes som et standard 5-reagensglas MPN forsøg med følgende modifikationer. I stedet for lauryl-sulfattryptose (LST; Difco Labs, Detroit, MI) bullion eller lactosebullion (Difco Labs, Detroit, MI) anvendtes phenolrødt lactosebullion (PRLB; Difco Labs, Detroit, MI) 35 indeholdende 80 roikrogram/ml 4-methylumbelliferon glu-curonid (MUG; sigma Chemical Co., St. Louis, MO ) som det i.
60 DK 173025 B1 sandsynlige substrat. PRLB anvendtes, fordi Phenolrødt-farven muliggør afsløring af syreproduktion ved forgæring af lactose. Gas, der udvikles ved lactoseforgæring, inde-sluttedes af de omvendet Durham glas, der var anbragt 5 inden i hver af reagensglassene. MUG var tilsat som en mulighed for at tilvejebringe en foreløbig bekræftelse for tilstedeværelsen af E. coli. E. coli, den vigtigste fækale coliforme er den eneste organisme, der findes i vand, der kan spalte MUG under frigørelse af en fluorogen 10 gruppe, der kan ses under UV lus (4, 10).
CAP-EIA MPN forsøgsmetoden gav 3 typer resultater: 1)
syre og gasproduktion ved forgæring af lactose (foreløbig coliformanalyse); 2) fluorescens fra spaltning af MUG
15 (foreløbig bekræftelse for E. coli eller fækale coliforme) og 3) CAP-enzym immunoforsøgsbekræftelse (bekræftende undersøgelse baseret på monoklonale antistoffer) . Disse resultater efter MUG og CAP-EIA reaktioner blev herefter sammenlignet med resultater opnået ved 20 hjælp af standardmetoder (1) baseret på lactoseforgæring ved forhøjet temperatur ved 44,5 'C i EC bullion (Difco Labs, Detroit, MI).
Forsøget udførtes på følgende måde: for at få tre 10-fold 25 fortyndingsrækker, som er nødvendige til et MPN forsøg, indsamledes følgende rumfang vand fra en nærliggende bæk, der anvendte til at inokulere prøveglassene indeholdende 10 ml PRLB-MUG og udstyret med en polystyren brønd inden i hætten.
30 Række A - 5 prøveglas, 1,00 ml inokulum Række B - 5 prøveglas, 1,10 ml inokulum Række C - 5 prøveglas, 0,01 ml inokulum 35 Alle prøveglassene inkuberedes natten over i omtrent 18-20 timer ved 35 "C.
61 DK 173025 B1
Den følgende dag undersøgtes alle glassene for syre- og gasproduktion såvel som for fluorescens under UV lys. Alle prøveglassene viste uklarhed {vækst) uafhængig af 5 syre- eller gasreaktionerne og vendtes om for at lade celle-substratsuspensionen fylde polystyrenbrønden inden i hætten. De omvendte prøveglas anbragtes 1 time ved 35 ’C for at muliggøre bakterier (antigen) i at klæbe til polystyren hætte-brøndene. De antigenbundne hætte-brønde 10 fjernedes herefter fra prøveglassene for at foretsætte med antistofbaserede bekræftende forsøg.
For at udføre EIA (enzymimmunoforsøg) delen af undersøgelsen behandledes brøndene i 30 minutter ved 35 *C med 15 en opløsning af 3 % bovint serumalbumin (BSA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i phosphatpufferet satvand (PBS; NaCl, 8,5 g: Na;HP04, 1,02 g: NaH;P0j.H;0, 0,386 g: destilleret vand, 1000 ml, pH 7,2) for at blokere eventuelle uvundne pladser på polystyrenen. Herefter af-20 dekanteredes BSA opløsningen, brøndene vaskedes 2 gange med PBS, herefter tilsattes 50 mikroliter af en hybri-domacellesubernatant, der indeholdt monoklonale antistoffer rettet mod E. coliceller til hver brønd, og der indkuberedes 1 time ved 35 *C for at muliggøre at anti-25 stoffet kunne reager med de specifikke antigener (E. coliceller) bundet til polystyrenen. Efter afdekantering af antistofsupernatantdelen fjernedes spor af eventuelt ubundet antistof ved at vaske brøndene 3 gange under anvendelse af en PBS-Tween 20 opløsning (PBS + 0,05 % Tween 30 20, J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ). Et affi nitets-renset alkalisk phosphortase-mærket gede-antistof over for muse-IgG (konjugat; KPL, Gaithersburg, MD) fortyndedes 1:1000 i PBS, og 50 mikroliterprøver blev sat til hver brønd. Efter 1 times inkubation ved 35 ‘C 35 fjernedes eventuelt ubundet konjugat i brøndene ved 4 gange afvask med PBS-Tween 20 opløsning. Det alkaliske 62 DK 173025 B1 phosphatasesubstrat anvendt til afsløring var natri-umpara-nitrophenylphosphat eller Sigma-104 substrat {Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), fremstillet i en slutkoncentration på 1 mg/ml i 10 % diethanol-aminpuffer 5 {diethanolamin, 97 ml;NaN3. 0,2 g; MgCl26H20, 100 mg og destilleret vand, 800 ml, pH 9,8). Substratet indsattes i 100 miokroliterprøver pr. brønd, hvorefter der inkuberedes 30 minutter ved 35 'C, hvorved reaktionen i brøndene kunne ses visuelt. For at kvantificere overførtes i 10 dette eksempel den omsatte substratopløsningtil en mikro-titerplade og bestemtes instrumentalt ved hjælp af Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Mcleans, VA) udstyret med et 405 nm filter.
15 For at udføre almindelige bekræftende forsøg for fækale coliforme under anvendele af EC bullion (Difco Labs, Detroit, MI) overførtes aseptisk en øsefuld af væksten fra hver af de over natten dyrkede PRLB dyrkninger til et reagensglas indeholdende 10 ml EC boullion og udstyredes 20 med et omvendt Durham glas. Herefter inkuberedes 24-48 timer ved 44,5 ‘C, således som specificeret i standardmetoder (1), hvorefter der undersøgtes for lactoseforgæ-ring (indesluttet gas i Durham-massen). Eventuelle spor af gasbobler inden i glassene blev betragtet som positiv 25 reaktion.
De opsummerede resultater for hvert forsøg er angivet i tabel XII og tabel XIII. Resultaterne af forsøg 1 viser, at baseret på gasproduktion ud fra lactose, fås en posi-30 tiv kombination af 551, der ifølge den statistiske MPN tabel er 35 coliforme/ml (foreløbig undersøgelse). Blandt de gaspositive (+) prøveglas, var kun 4 (A2-A5) positive ved MUG forsøget, og de indeholder derfor sandsynligvis E. coli (foreløbig bekræftelse for E. coli eller fækale 35 coliforme). Blandt de bekræftende resultater viste almindelig EC undersøgelse 5 rør (A1-A5) sig at være 63 DK 173025 B1 positive for fækale coliforme, medens kun 4 prøveglas viste positiv reaktivitet ved CAP-EIA metoden. De positive EIA aflæsninger lå fra 0,55 indtil 1,06 med den negative reaktion omkring 0,20. De positive EIA resul-5 tater er kraftigt understøttet af de positive MUG resultater, på den måde at begge disse forsøg indicerer tilstedeværelsen af fækalecoliforme i de samme prøveglas, A2-A5. Den kendsgerning, at prøveglas Al var negativ ved MUG og EIA, men positiv ved EC, var ikke overraskende, 10 fordi forekomsten af falske {+) og falske (-) reaktioner, der almindeligt ses ved de almindelige MPN metoder (15, 16, 20) . Selektiviteten af EC substratet sammen med de forhøjede inkubationstemperaturer er velkendt for at påvirke genfindeisen af fækale coliformer. Ca. 7 % af de 15 fækale coliforme (E. coli) vil yderligere ikke frembringe gas på EC (falske negativer), og 8 % af ikke-fækale co liformer har vist sig at være i stand til at vokse og frembringe gas i EC boullion (falske positive). EC reaktionen observeret i rør Al kan derfor være en falsk posi- 20 tiv reaktion, der vil være en forklaring for dens uover ensstemmelse med MUG og EIA resultaterne for rør Al. Med hensyn til de andre prøveglas (B1-B5, C1-C5) i samme forsøg observeredes glimrende korrealation mellem alle forsøgene. Ved andre ord, prøveglas der var MUG (-) var 25 også EC (-) og EIA (-), hvilket bekræfter fravær af fækale coliforme disse prøveglas.
I forsøg 2 var den anvendte vandprøve, der skulle bruges til inokulering af prøveglassene, kraftigere kontramine-30 ret, fordi alle sandlynlige rør var positive for glasproduktion. Baseret på den statistiske MPN tabel vil en positiv kombination af 5 5 5 indicere tilstedeværelsen af mere end 240 coliforme/ml. Ved sammenligning opnåedes ved det bekræftende forsøg glimrende korrealition mellem 35 MUGA, EC og antistofbaseret EIA. Hver prøveglas, der viste fluorescens (MUG +) var også positiv ved EC samt ved 64 DK 173025 B1 EIA. EIA reaktionerne lå fra ganske svagt positive aflæsninger på 0,46 (B2) til roeget kraftige reaktioner på 2,15 observeret på C4.
5 Resultaterne af disse to forsøg viser, at den omhandlede antistofbaserede CAP-EIA undersøgelsesmetode er så effektiv som det EPA anerkendte EC forsøg til at bekræfte tilstedeværelsen af fækale coliformer. Yderligere som vist i tilfælde med prøveglas Al i forsøg 1, viste CAP-EIA 10 forsøget en mindre tendens til at blive falske positive eller negtive reaktioner på grund af antistof-antigen-reaktionernes specifikke art. Yderligere frembryder CAP-EIA metoden adskillige klare fordele i forhold til den almindelige MPN undersøgelsesmetode, nemlig: 1) enkelhed, 15 både ved det foreløbige og det bekræftende forsøg, der kan foretages under anvendelse under det samme prøveglas uden behov for yderligere overførsler eller substrat; 2) hastigheden, CAP-EIA undersøgelsen kan udføres i en tredjedel til 1/2 af den tid, der er nødvendig for et 20 anmindeligt forsøg; og 3) specificiteten, antistofferne er højt specifikke for deres antigene targets.
Disse fordele plus det enestående hætte-brønd design af CAP-EIA, der kan give 4 adskilte resultater (syre, gas, 25 fluorescens og EIA) fra samme prøveglas gør metoden til et særdeles udmærket alternativ til den almindelige MPN undersøgelsesmetode til analysering af coliforme og fækale coliforme i vand og/eller fødevareprøver.
30 Metoden med at udføre EIA i et prøveglas eller reagensglashætte indeholdende et polystyrenindskud er ikke begrænset til coliforme elkker fækale coliforme undersøgelser, men kan lige så vil anvendes til afsløring af andre bakterier.
35 65 DK 173025 B1 EKSEMPEL 26
Fremstilling af 2-[3-(4-methyl-2, 2'-bipyridin-4'-yl)-propyl] -1,3-dioxolan.
5 I en inert atmofære af argon sattes 30 ml tørt tetrahy-drofuran (THF), og 7,65 ml tør diisopropylamin {54,6 mmol) til en trehalset, 600 ml kolbe ved hjælp af en en injektionssprøjte under omrøring. Opløsningen afkøledes 10 til -78 ’C ved at neddyppe kolben i en blanding af tør is-isopropanol i et lavt bæger. 21,6 ml 2,5 Mn-butylli-thium (54 mmol) sattes langsomt til kolben. Den fremstillede opløsning omrørtes 15 minutter, og en opløsning af 9,58 g 4,4,-dimethyl-2,2'-bipyridin (52 mmol) opløst i 15 300 ml tør THF tildryppedes ved hjælp af en kanyle under omrøring i løbet af en time.
Den fremstillede brune blanding opmrørtes yderligere ved -78 *C i 2 timer, 10 g 2- (2-bromethyl)-1,3-diosylan (55 20 mmol) tilsattes via en injektionssprøjte, og den fremstillede blanding omrørtes ved -78 *C i 5 minutter. Reaktionsbeholderen anbragtes herefter i et isbad (10 *C) og efter 30 minutters forløb begyndte farveforandring (efter 1 times forløb var farven mørk violet; efter 2 timer var 25 farven blå; efter 2,5 timers forløb var farven grøn; og efter 3,25 timer var farven citrongul).
Reaktionsblandingen frakøledes med 30 ml mættet NaNl efterfulgt af 10 ml vand og 50 ml ether. Den vandige fase 30 ekstrahederes 2 gange med 300 ml ether, og de kombinerede etherfaser blev ekstraheret igen med 100 ml vand og tørret over vandfrit natriumsulfat.
For at rense reaktionsproduktet adskiltes prøven på al-35 luminiumoxid (Merck) 90, aktivitet III, neutral. De anvendte elueringsmidler var petroleumsether/diethylether 66 DK 173025 B1 (2:1) efterfulgt af petroleumsether/diethylether (1:1) (udgangsmaterialer elueret fuldstændigt med petroleums-ether/diethylether (2:1) efterfulgt af slutproduktet).
Proton MNR analye bekræftede, at opbyning af det isole-5 rede reaktionsprodukt er y°'~\ (X) EKSEMPEL 27 15 Fremstilling og rensning af 4-(butan-l-al)-4'-methyl-2, 2’bipyridin.
2 g 2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-propyl)-1,3 di-oxolan opløses i 50 ml IN HCL og opvarmes 2 timer ved 50 20 *C. Opløsningen afkøledes, indstilledes til mellem pH 7 og 8 med natrium bicarbonat og ekstraheredes 2 gange med 100 ml chloroform.
De forenede chloroformfaser blev vasket med en ringe 25 mængde vand, der tørret over natriumsulfat, filtreredes og inddampedes på roterende inddamper til opnåelse af en gul olie.
Den gule olie rensedes på en silicagelsøjle under anven-30 delse af ethylacetat/toluen (1:1) som elueringsmiddel, i-det urenheden blev elueret med methanol.
Protonanalyse [51,96-2,11 (m,2H); 2,43 (s,3H);2,46-2,50) (t,2H); 2,53-2,80 (m,2H); 7,12-7,14 (m,2H); 8,17-8,21 35 (br. s,2H); 8,52-8,58 (m,2H); 9,89 (s,IH)] bekræftede, at opbygningen af reaktionsproduktet er 67 DK 173025 B1 CHj C«fc-crfx-ciix-cifo , 0-0 EKSEMPEL 28
Fremstilling af 4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)smørsy-10 re.
0,5 g 4-(butan-l-al)-4'methyl-2,2'bipyridin (2,0 mmol) opløstes i 10 ml absolut acetone. 225 mg fint pulveriseret kaliumpermanganat (KMnO^ 1,42 mmol) sattes por-15 tionsvis til opløsningen under omrøring. Omsætningen fulgtes ved hjælp af et tyndt lag chromatografi (siliciumoxid; ethylacetat/toluen 50:50) der viste, at medens aldehydet gradvist forsvandt, dannedes en bipyridin med lavt Rj.
20
Efter at omsætningen var afsluttet tilsattes vand, og Mn02 frafiltreredes og der vaskedes med en ringe mængde Na2C03(aq.). Acetonen fjernedes på en roterende inddamper og remanensen extraheredes med CH2Cl2 for at fjerne ikke-25 sure bipyridiner. Den vandige opløsning indstilledes til sur reaktion ved forsigtig tilsætning af 1,0 N HCl til pH
4,8. Opløsningen blev delvis uklar, når man nåede denne pH-værdi, og suspensionen opløstes atter ved lavere pH. Blandingen extraheredes 5 gange med lige rumfang CH2Cl2, 30 tørret over Na2S0« og inddampet på en roterende inddamper til en olie, der straks størknede i vakuum. Det urensede faste stof omkrystalliseredes med chloroform: petroleums-ether, hvorved der opnåedes hvide krysteller med smeltepunkt 103,5 *C - 105,5 *C; IR: 1704 cm-1, proton NMR ana-35 lyse var i overensstemmelse med følgende opbygning: 68 DK 173025 B1
crf3 CHt-CUL-cU. - CooH
Å0 5 EKSEMPEL 29
Fremstilling af bis(2,2’bipyridin)[4-(butan-l-al)-4'-me-thyl-2,2’-bipyridin] ruthenium (II) diperchlorat: Forbin-10 delse I.
250 mg ruthenium bipyridyldichloriddihydrat (0,48 mmol) (Strem) i 50 ml ethylen glycol opvarmedes hurtigt til kogning og anbragtes herefter i et siliconeoliebad (130 15 'C. Til den fremstillede purpur-orange opløsning sattes 150 mg 2-[3-(-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-di-oxolan (0,53 mmol) i 10 ml ethylenglycol. Den fremstillede orangefarvede opløsning omrørtes 30 minutter ved 130 'C, afkøledes til stuetemperatur og fortyndedes 1:1 med 20 destilleret vand.
En koncentreret opløsning af natrium perchlorat i vand sattes til opløsningen, hvorved der dannedes et meget finkornet orange bundfald. Blandingen afkøledes natten 25 over, filtreres og bundfaldet vaskedes med vand.
Bundfaldet opløstes i varmt vand, og der omkrystallisere des ved tilsætning af perchlorsyre til frembringelse af klar orange krysteller, der herefter filtreredes, vaske-30 des med koldt vand og tørredes. Opkrystallisationen blev gentaget, hvorved der opnåedes 150 mg klart orange krystaller.
NMR analyse angav følgende opbygning 35 -— 2* 69 DK 173025 B1 5 __ \ θ\ \y (cioa é^t\ όηϋ 10 rv_ I den foreliggende beskrivelse med krav omtales ovennævnte forbindelse som forbindelse I.
15 EKSEMPEL 30
Fremstilling af bis(2,2,-bipyridin)[4-(4-methyl-2,2’-bi-pyridin-4*-yl)-smørsyre] ruthenium (II) dihexafluor-20 phosphat: Forbindelse II.
134 mg 4-(4-methyl-2,2'-bibyridin-4'-yl)smørsyre (0,52 mml) opløstes i 50 ml vand. Opløsningen afgassedes med argon, og 250 mg ruthenium bipyridyodichloriddihydrat 25 (Strem) (0,48 mmol) tilsattes. Blandingen opvarmedes under argon med tilbagesvaling i 4 timer. Vandet fjernedes ved afdampning på roterende inddamper, og remene-sensen opløstes i mindst mulig mængde vand og anbragtes på en Sephadex SP-25- ionbyttersøjle. Efter eluering af 30 urenheder med vand elueredes forbindelsen som et rødt bånd med 0,2 M NaCl opløsning, og forbindelsen isoleredes som hexafluorphosphatet ved tilsætning af en mættet vandig opløsning af NH4PFe. Den urensede forbindelse gen-udfældedes 2 gange med varm acetone med diethylether.
35 Analyse: Beregnet; C, 43,80 %; H, 3,36 %; N, 8,76 %.
Fundet; c, 43,82 %; H, 3,54 %; N, 8.55 %.
70 DK 173025 B1
Proton NMR analyse var i overensstemmelse med følgende opbygning _ O + 5 - ^ kjl 10 /==\ \ ^ V (pfi)a Ο/' ) \ 15 (χΟ
II
20 EKSEMPEL 31
Fremstilling af N-[4-(4-methyl-2,2*-bipyridin-4 *-yl)-butyl ]-pthalimid.
25 I en inert atmosfære af argon sattes 30 ml tørt tetra-hydrofuran (THF) og 7,65 ml tør diisopropylamin {54,6 mmol) til en trehalset, 600 ml kolbe ved hjælp af en injektionssprøjte under omrøring. Opløsningen afkøledes til 30 -78 'C ved at neddyppe kolben i en blanding af tør is- isopropanol i et lavt bæger. 21,6 ml 2,5 N-butyllithium (54 mmol) sattes langsomt til kolben. Den fremstillede opløsning omrørtes 15 minutter, og en opløsning af 9, 58 g 4,4'-dimethyl-2,2'-dipyridin (52 mmol) opløst i 300 ml 35 tør THF tildryppedes via injektionssprøjte i løbet af 1 time under omrøring.
71 DK 173025 B1
Den fremstillede brune blanding omrørtes yderligere ved -78 ’C i 2 timer, der tilsttes hurtigt 100 g 1,3-dibrom-propan (0,495 mol), og den fremstillede blanding omrørtes 5 i 1 time ved -78 'C. Herefter omrørtes blandingen yderligere 2 timer ved stuetemperatur. Blandingens farve forandredes fra brun til blå til gul. Det meste af opløsningsmidlet fjernedes ved afdampning på roterende inddamper, og 200 ml vand tilsattes, hvorved der dannedes 10 2 faser. Koncentreret HC1 tilsattes for at sænke pH til 0. Det organiske lag bortkastedes. Det vandige lag vaskedes 2 gange med 100 ml ether. pH hævedes til mellem 1 og 2. Der udskilte en rød olie, og der extraheredes med CH2C12. Efter tørring og opløsning med vandfrit Na2CP03, 15 afdampedes det meste CH2C12 på roterende inddamper, og prøven anbragtes på en silicagelsøjle. Prøven elueredes med chloroform, hvorved der opnåedes en lysegul olie, der udkrystalliseredes efter afkøling natten over (12,37 g).
20 4 g af den urensede 4-(4-brombutyl)-4'-methyl-2,2'-bipy- ridin (13,3 mmol) fremstillet på denne måde sattes herefter til en suspension af 2,46 g caliumphthalimid (13,3 mmol) i 60 ml dimethyl formamid (DMF) . Herefter omrørtes blandingen ved omtrent 50 "C i to timer. 90 ml CHClj sat-25 tes til blandingen, hvorefter der tilsattes 125 ml vand.
CHCI3 laget fraskiltes, og det vandige lag extraheredes 2 gange med 50 ml chloroform. De forenede CHCI3 lag vaskedes med 50 ml H20, der tørredes over vandfrit Na2S0«og inddampedes på roterende inddamper, hvorved der 30 opnåedes en svagt orangefarvede olie, der størknede ved henstand natten over. Den urensede forbindelse omkrystalliseredes med acetone/ethanol, hvorved der opnåedes 2,21 g (44,5 %) hvide krystaller med (smeltepunkt 114,5-117,8 *C) .
35 Analyse: Beregnet; C, 74,38 %; H, 5,70 %; N, 11,31 %.
Fundet; C, 73,98 S; H, 6,14 %; N, 11,28 %.
72 DK 173025 B1
Ir: Phthalimidcarbonyl-strækning 1771 og 1704 cm'1.
Proton NMR analyse viste aromatisk resonans (δ 7,75-7,85, m, 4H) ud over de sædvanlige bipyridylderivatsignaler.
Disse resultater er i overensstemmelse med følgende op-5 bygning
Cfc CHX- cttx ' ” Οό · EKSEMPEL 32 15 Fremstilling af theopyllin-8-smørsyre-[4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-butyl]amid: Forbindelse III.
370 mg (1 mmol) N-[4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-butyl )_phthalimid opslemmedes i 100 ml ethanol, der be-20 handledes med hydrazinhydrat (720 mg, 1,4 mmol), omrørtes og opvarmedes 4 timer ved tilbagesvaling, i løbet af hvilket tidsrum alt det faste materiale opløstes. Mod afslutningen af reaktionen begyndte et hvidt bundfald at dannes.
25
Under afkøling indstilledes reaktionsblandingen til basisreaktion med 50 % NaOh, og herefter udhældes i 100 ml vand. Der opnåedes en opløsning, NazCOj tilsattes for at udsalte forbindelsen som en olie. Aminen extraherede un-30 der anvendelse af tre 40 ml portioner CH2C12. Extrakterne tørredes med CaSO*, filtreredes og inddampedes, hvorved aminobipyridinderivatet opnåedes som en farveløs olie (udbytte = 0,135 g; 56 %) .
35 1,34 g (5,6 mmol) 4-[4-(1-aminobutyl)]4'-methyl-2,2'- bipyridin og theopyllin-8-smørsyre (1,18 g; 4,4 mmol) 73 DK 173025 B1 opløstes ved stuetemperatur i 10 ml tør pyridin. Til opløsningen sattes 1,16 g (5,6 mmol) diclychlohexylcar-bodiimid. Der omrørtes natten over ved stuetemperatur.
Tyndtlagschromatografi på alluminiumoxid (mobil fase = 15 5 % methanol/chloroform) afslørede en enkel produktplet med en Rf på 0,68. Det udfældede dicyclohexylures fjernedes ved filtrering, og pyridinen afstrippedes til opnåelse af et fast stof, der findeltes i ether og filtreredes (udbytte * 2,13 g; 99 %).
10 EKSEMPEL 33
Fremstilling af bis-(2,2'-bipyridin)[theopyllin-8-smørsy-re-4-(4-methyl-2,2’-bipyridin-4'-yl)-butylamid] ruthenium 15 (II) dichlorid: Ru (II)-forbindelse III konjugat.
Til en blanding af 154 mg (0,296 mmol) bis-)2,2'-bipyridin) ruthenium (II) dichlorid dihydrat og 175 mg (0,357 mmol) af forbindelse (III) beskrevet ovenfor sattes 40 ml 20 ethanol/vand (1:1, rumfang/rumfang). Denne blanding blev argonafgasset i mørke i 15 minutter og opvarmet med tilbagesvaling i mørke under argon i 3 timer til fremstilling af en klar, kirsebærrød opløsning. Den fremstillede klare kirsebærrøde opløsning henstod for at af-25 køle til stuetemperatur, og opløsningsmidlet afstrippedes under anvendelse af en roterende inddamper, idet opløsningen forblev i mørke ved en temperatur på mindre end eller lig med 37 "C.
30 Den fremstillede remanens opløstes i ca. 1-3 ml methanol, påførtes en Sephadex LH-20 chromatografisk søjle, (75 cm x 3 cm) og elueredes med en gennemstrømningshastighed på ca. 0,4-0,7 ml/min. Et klart rødt bånd (forbindelsen) blev tæt fulgt af et brunt, ikke-luminiscerende bånd 35 (urenhed) og toluminiscerende bånd. Det røde produktbånd viste sig at være kontamineret med en ringe mængde af 74 DK 173025 B1 materiale fra det brune, ikke-luminiscerende bånd. Det kontaminerende materiale adskiltes fra slutproduktet ved at køre prøven på en anden Sehadex LH-20 søjle under ligende betingelser.
5
Det røde fremstillede produkt opnåedes ved at afstrippe opløsningsmidlet ved roterende inddampning. Det fremkomne faste materiale opløstes i ca. 1 ml methanol og genud-fældedes i ca. 75 ml diethylether til opnåelse af et 10 orangefarvet pulver, der frafiltreredes.
Analyse: Beregnet; C, 54,51 %; H, 5,72 %; N, 13,99 %; O, 10,47 %; cl, 6,44 %.
Fundet; C, 55,04 %; H, 6,35 %; N, 13,18 %; 0, 10,62 S; cl, 6,68 %.
15 EKSEMPEL 34
Modulering af elektrokemiluminescenssignal frembragt af Ru (II)-forbindelse (III) konjugat under anvendelse af 20 antistoffer specifikke for theophyllin.
Ru(II)-forbindelse (III) konjugatet beskrevet i eksempel 33 fortyndedes til en slutkoncentration på 150 nM under anvendelse af 0,1 M phosphatpuffer, pH 6,0 indeholdende 25 0,35 M natriumfluorid (PBF puffer). Monoklonalt antistof (klon nr. 9,49, ascitesprøve nr. WO 399, katalog nr. 046) specifikt for theophyllin indkøbtes fra Kallestad Laboratories, Inc. (Chaska, MN). Det monoklonale antistof fortyndedes til forskellige koncentrationer under anvendelse 30 af PBF puffer (mellem 21,9 mikrogram protein/ml til 700 mikrogram/ml) .
Et andet monoklonalt antistof (kontrol MAB) der ikke var reaktivt med theophyllin indkøbtes fra Sigma (St. Louis, 35 MO) og fortyndedes til forskellige koncentrationer mellem 21,9 mikrogram protein/ml til 700 mikrogram/ml under an- 75 DK 173025 B1 vendelse af PBF puffer. En standardoplysning af theophyl-lin fremstilledes under anvendesle af theophyllin leveret af Aldrich Chemical Co., (Milwaukee, WI, katalog nr. 26-140-8, molvægt 180,17). Theophyllin opløstes i PBF puffer 5 til en slutkoncentration på 75 mikromolær og fortyndedes med PBF puffer til 6 mikromolær til anvendelse ved analysen. Inden man målte elektrokemiluminescensen tilsattes en opløsning indeholdende 250 mM oxalsyre og 5 rum-fang/rumfang-% Triton-X 100 (ECL opløsning) til reak-10 tionsblandingen. Målingerne blev foretaget med et Berthold luminometer, mer var mdificeret for at muliggøre anbringelsen af to platingazeelektroder i forsøgsglasset indeholdende reaktionsopløsningen. Elektroderne var forbundet til en potentiostat, og elektrokemiluminescensmå-15 linger blev foretaget ved at føre et påtrykt potentiale over elektroderne fra 1,5-2,5 volt med en scanningshastighed på 50 mV/sek. Det anvendte Berthold luminometer til målingerne havde et høj forstærknings, rødtfølsomt fotoforstærkerrør. Luminumetereffekten til recorderen 20 justeredes til 105 tællinger/ volt. Målingerne registreredes på en X-Y-Y' recorder, og tophøjden anvendes som måling på elektrokemiluminescens. Elektroderne rensedes mellem målingerne ved at afrense med en puffer med pH 4,2 indeholdende 0,1 M phosphat, 0,1 M citrat, 0,025 oxals-25 syre, og 1 % Triton X- 100; pulsere elektroderne i denne opløsning mellem +2,2 til -2,2 volt i 60 sekunder, hvorefter man behandlede med +2,2 volt i 10 sekunder.
Herefter fjernedes elektroderne fra opløsningen, afrense-des i destilleret vand og blev tørret. Forsøget udførtes 30 som vist i tabel XIV.
En opløsning af kontrol roonoklonale antistoffer, antistoffer over for theophyllin eller PBF puffer sattes til et sæt forsøgsrør (trin 1). Til rørene sattes theophyllin 35 eller PBF puffer (trin 2). Opløsningerne blev kort blandet ved at ryste reagensglassene og lade reagere 25 76 DK 173025 B1 minutter ved stuetemperatur. Herefter sattes en opløsning af Ru(II)-forbindelse (III) konjugat til rørene (trin 3). Reagensglassene rystedes og henstod ved stuetemperatur i 15 minutter. Til sidst sattes 100 mikroliter ECL opløs-5 ning til hvert rør, og elektrokemiluminescensen måltes som beskrevet ovenfor. Resultaterne er angivet i tabel XV.
Tabel XIV
10 Eksperimentel opbygning til undersøgelse af virkningen af antistof-Ru(II)-forbindelse (III) konjugatindvirkninger på elektrokemiluminescens.
Trin 1 Trin 2 Trin 3 15 100 mikroliter 200 mikroliter 100 mikroliter af:_af:_af:_ A. Kontrol mono- Puffer Ru (II)-forbin-
klonalt anti- delse III
20 stof (2,19 mi- konjugat krogram til 70 mikrogram) eller 25 B. Anti-theopyllin Puffer eller Ru(II)-forbin-
antistof (2,19 theopyllin delse III
mikrogram til konjugat 70 mikrogram) 30 eller C. PBF puffer Puffer Ru(III)-forbin
delse III
35 konjugat eller puffer 77 DK 173025 B1
Tabel XV
Virkning af antistof og theophyllin på elektroluminescens af Ru(II)-forbindelse (III) konjugat 5
Antostof protein Kontrol koncen- MAB + Anti-theopyllin tration Ru(Il) Anti-theopyllin MAB + theopyl- 10 mikro- forbin- MAB + Ru(II)- lin Ru(II)-for-
qram/rør delse III forbindelse III bindelse III
Luminescensmåling 15 2,19 55.000 40.000 43.000 55.000 41.000 57.000 4,38 57.000 22.500 37.000 57.000 25.000 36.000 8,75 53.000 20.000 33.500 20 50.000 22.000 30.500 35.0 43.000 13.500 17.500 41.000 14.000 16.000 70.0 42.000 11.000 11.000 37.500 12.000 12.500 25
Elektrokemiluminescensen af dobbelte prøver måltes som beskrevet ovenfor. Elektrokemiluminescensen af Ru(II)-forbindelse III konjugat anvendt i ovennævnte undersøgelse var 57.200, når der måltes i puffer uden tilsætning 30 af antistof. Baggrunden for pufferblandingen var 5750.
Resultaterne viser, at et monoklonalt antistof, der specifikt genkender theophyllin, dersom det bringes i kontakt med en analog af theophyllin, hvortil en rutheni-35 umforbindelse er knyttet f.eks. Ru(II)-forbindelse III vil bevirke nedgang i elektrokemiluminescensen. Nedgangen 78 DK 173025 B1 i elektrokemiluminescens er proportional med antistofkoncentrationen, dersom Ru{II)-forbindelse III kon-jugatkoncentrationen holdes konstant. Dersom et antistof anvendes, der ikke reagerer med theophyllin, ses kun en 5 ringe nedgang i elektrokemiluminescensen ved den højeste koncentration af antistof.
Resultaterne viser også, at dersom theophyllin bringes i kontakt med anti-theophyllin-antistof og herefter Ru (II)-10 forbindelse III konjugatet sættes til denne blanding, er størrelsen af elektrokemiluminescens større. Dette viser, at theophyllin konkurrere med binding af antistof til Ru(II)-forbindelse III konjugat hvilket bevirker en større mængde Ru(II)-forbindelse III konjugat, der kan 15 frembringe elektrokemiluminescens.
EKSEMPEL 35
Analyse af theopyllin i serum baseret på et homogent 20 elektrokemiluminescens immunoforsøg.
Baseret på resultaterne beskrevet i eksempel 34 udvikledes et homogent immunoforsøg for theophyllin under anvendelse af antistof over for theophyllin og Ru(II)-for-25 bindelse III konjugatet beskrevet i eksempel 33 i et kom-petitivt bindingsforsøg. De anvendte materialer var som beskrevet i eksempel 34, bortset fra at PBF puffere var 0,1 M phospha tpuf fer, pH 6,0 indeholdende 0,1 M na-triumchlorid. Til denne analyse udvalgtes en særlig kon-30 centration af monoklonalt antistof overfor theophyllin. Antistofkoncentrationen var 55 mikrogram/ml. Ru(II)-forbindelser III konjugatkoncentrationen indstilledes til 175 nM. Theophylin sattes til humant serum til opnåelse af slutkoncentrationer på 2,5, 5, 10, 20 og 40 mikrogram 35 theophyllin/ml serum. Analysen udførtes ved at sætte 10 mikroliter serum til 290 mikroliter anti/theophyllin mo- 79 DK 173025 B1 noklonalt antistof og holde opløsningen ved stuetemeratur i 25 minutter. Herefter sattes 100 mikroliter Ru(II)-forbindelse III konjugat til hvert rør til opnåelse af en slutkoncentration på 35 nM, og herefter holdt man denne 5 opløsning ved stuetemperatur 1 15 minutter. Dernæst tilsattes 100 mikroliter ECL opløsning beskrevet i eksempel 34 til hvert rør, og opløsningernes elektrokemilumine-scensegenskaber måltes som beskrevet tidligere under anvendelse af en trimmebølge på 1,5 volt til 2,5 volt ved 10 50 mV/sek. Resultaterne er angivet i figur 2 og viser, at der er en korrelation mellem koncentrationen af theophyl-lin i en serumprøve og mængden af elektrokemi luminescens udsendt af reaktionsblandingen. Denne observation viser, at det er muligt at udvikle en analysemetode for theo-15 phyllin.
Baseret på disse resultater kan fagmanden udvikle et homogent elektrokemiluminescens immunoforsøg til afsløring og kvantificering af en særlig analyt i et biologisk ma-20 teriale.
EKSEMPEL 36
Analyse af theophyllin i hæmolyseret, lipeide, ikteriske 25 og normale serumprøver baseret på en homogen elektrokemi-luminiscens immunoanalyse og sammenligning med en fluorescenspolariseringsanalyse.
Koncentrationen af theophyllin i forskellige serumprøver 30 bestemtes under anvendelse af en homonogen elektrokemiluminescens immunoanalysemetode. Opbygningen af forsøget var et kompetitivt bindingsforsøg under anvendelse af et monoklonalt antistof specifikt for theophyllin og Ru (II)-forbindelse III konjugatet beskrevet i eksempel 33. Rea-35 genser og metoder til frembringelse af elektrokemiluminescens er som beskrevet i det tidligere eksempel.
80 DK 173025 B1
Fluorescenspolariseringsanalysen anvendt til at måle koncentration af theophyllin i forskellige serumprøver udførtes under anvendelse af et automatisk TDX instrument 5 fra Abbott Laboratories (North Chicago, IL) . Hæmolysere-de, lipæmiske, ikteriske og normale sera undersøgtes ved analyserne, og resultaterfne for anormale sera er angivet i tabel XVI nedenfor.
10 Tabel XVI
Homogent theophylinanalysemetode, egenskaber ved potentielt problematiske sera.
15 Faktorkon-
Serum koncentration Normalt område Hæmolyseret 12,4 mg/dl hæmo- 0-3,2 mg/dl globin 20 Lipasmisk 405 mg/dl trigly- 10-190 mg/dl cerider 196 mg/dl chole- 120-200 mg/dl sterol
Ikterisk 10 mg/dl bilirubin 0-1,5 mg/dl 25
Forskellige mængder theophyllin sattes til serumprøverne til slutkoncentrationer på mellem 2,5 mikrogram theophyl-lin/ml og 40 mikrogram theophyllin/ml. Resultaterne af det homogene elektrokemiluminescens immunoforsøg er angi-30 vet i figur 3. Hver serumprøve analyseres også for koncentration af theophylin ved hjælp af en fluorescenspola-riseringsanalysemetode. Koncentrationen af theophyllin målt ved hjælp af det homogene elektrokemiluminescens immunoforsøg og ved fluorescenspolariseringsanalysemetoden 35 sammenlignedes. Resultaterne blev afsat som en spredning og er vist i figurerne 4A-D. Punkterne for resultaterne 81 DK 173025 B1 analyseredes ved hjælp af lineær regression og korrelationskoefficienterne beregnedes. Analysen viser en glimrende korrealation mellem de to analysemetoder. Kotrela-tionskoefficienterne (r) var mellem 0,98 og 1,00. Hæld-5 ningerne på kurverne får normale, hæmolyserede og lipæ-miske serumprøver var mellem 0,8 og 1,2 , hvilket viste glimrende genfindelse af theophyllin fra disse serumprøver.
10 Skønt elektrokemiluminescensen udsendt af de ikteriske (gulsotholdige) serumprøver indeholdende theophylin var større end for de andre serumprøver, var den proportional højere ved hver theophyllinkoncentration. Dette fremgår af figur 4D. Korrealationskoefficienten er 1,00 for punk- 15 terne når man sammenligner elektrokemiluminescens og fluorescenspolarisering; imedlertid er hældningen 2,14, hviket viser højere genfindelse for theophyllin i den ikteriske serumprøve.
20 Baseret på disse resultater kan koncentrationen af theophyllin i en ekterisk prøve bestemmes ved at optegne en standardkurve for prøven ved at tilsætte kendte mængder Ru (II)-forbindelsekonjugat til prøver af den ikteriske serum. Disse resultater viser, at et homogent elektroke- 25 miluminescens immunoundersøgelsesmetode kan anvendes til at måle koncentrationen af theophyllin tilstede i serumprøver indeholdende unormale niveauer af hæmoglobin, li-pider og bilirubin.
30 En homogen elektrokemiluminescens imrounoundersøgelses-metode frembyder fordelse i forhold til en fluorescenspolariseringsmetode på grund af alsidigheden ved ECL de-tektion, f.eks. mere følsom detektion ved højere koncentrationer af biologike molekyler.
35 82 DK 173025 B1
Et homogent elektrokemiluminescens imunoforsøg frembyder yderligere fordele i forhold til en fluorescenspolariseringsmetode fordi ingen indfaldende lyskilde er nødvendig; Elektrisk stimulering er det eneste krav til ef-5 fektiv lysfrembringelse. Som en følge heraf er der ikke behov for speciel optik. Da målingsprincippet er rent specifikt photonemmision induceret ved elektrokemisk stimulering, er systemets følsomhed potentiel betydeligt større end fluorescenspolarisering og større dynamisk 10 område er opnåeligt. Måling af en betydelig større mængde forskellige analyter er også mulig med en homogen elektrokemiluminescens immunoforsøgsmetode end hvad der opnås ved fluorescenspolariseringsmetoden på grund af den selektive modulering af elektrisk stimuleret kemilu-15 minescens af biobolekylære genkendelsestildragelser som f.eks. den gensidige indvirkning mellem antistof-antigen.
Baseret på disse resultater vil fagmanden vide, at homogene elektrokemiluminescens immunoanalysemetoder til at 20 afsløre andre analyter i anormale serumprøver er mulige at udvikle.
EKSEMPEL 37 25 Undersøgeslse for theophyllin i serumbaseret på en homogen elektrokemiluminescens immunoalalysemetode og sammenligning med en højtryksvæskechromatografisk (HPLC) metode.
30 Forskellige mængder theophyllin sattes til humane serumprøver til opnåelse af slutkoncentrationer mellem 2,5 mikrogram theophyllin/ml og 40 mikrogram theophyllin/ml.
Hver prøve opdeltes herefter i 2 prøver, og koncentrationen af theopyllin i prøven bestemtes ved hjælp af en 35 homogen elektrokemiluminescens immunoanalysemetode og sammenlignedes med de opnåede resultater for samme serum- 83 DK 173025 B1 prøver under anvendelse af en HPLC metode. Af det homogene elektrokemiluminescens immunoforsøg var et kompe-titivt bindings forsøg under anvendelse af et monoklonalt antistof specifikt for theophyllin og Ru(II)-forbindelse 5 III konjugatet. Reagenserne og metoderne ved denne analysemetode er som beskrevet i det tidligere eksempel.
Den anvendte HPLC metode til at måle koncentrationen af theophyllin i forskellige serumprøver er beskrevet nedenfor.
10
Theophyllin (1,3-dimethylxanthin) hældes fra serumproteiner ved udfældning af sidstnævnte med acetonitril. Den supernatante væske indeholdende theophyllin blev kørt pået HPLC system udstyret med en Waters Associates Micro 15 Bondapak C18 søjle, (3,9 mm x 30 cm). Chromatogrammet var fuldstændig opløst i mindre tid end 10 minutter.
Følgende reagenser anvendtes: Natriumacetat (reagens
grad) , afioniseret vand (renset ved hjælp af Millipore 20 Milli Q' system), acetonitril (HPLC grad) og theyphyllin standard (Sigma). Opløsningmidlet anvendt til udfældning af serumproteinerne var en 20 mM natriumacetatpuffer, pH
4,0 indeholdende 14 rumfang/rumfang-% acetonitril. Den HPLC mobile fasepuffer var 10 mM natriumacetatpuffer, pH 25 4,0 indeholdende 7 rumfang/rumfang-% acetinitril. Strøm ningshastigheden var 1,5 ml/min., og eluanten kontrolle-redes ved hjælp af et UV spektrometer ved 270 nm. Følsomheden af UVf absorbantdetektoren var sat til 0,02 ab-sorbansenhed fuld udslag (AUFS). Stuetemperaturen lå ty-30 pisk mellem 22 og 24 'C.
Resultaterne af den homogene elektrokemiluminescerende immunoanalyse og HPLC anaysen til bestemmelse af koncentrationen af theophyllin i serum er angivet i figur 5.
35 Resultaterne blev anbragt som punkter, og disse punkter analyseredes ved hjælp af lineær regression. Korrela- 84 DK 173025 B1 tionskoefficienten beregnedes. Korrelationskoefficienten (r) var 0,98, hvilket viser glimrende korrelation mellem de to undersøgelsesmetoder.
5 Hældningen på kurven var 1,197, hvilket viser glimrende genfindelse af theophyllinet fra serumprøven ved den homogene elektrokemiluminescerende immunoanaysemetode i forhold til standardmetoden baseret på HPLC. Den homogene elektrokemilumimescensanalysemetode frembyder fordele i 10 forhold til HPLC metoden, fordi den er hurtig, følsom, og man let kan håndtere flere prøver. Baseret på disse resultater vil fagmanden erkende, at homogene elektrokemiluminescens immunoanalysemetoder til afsløring af særlige analyter, der kan afsløres ved hjælp af HPLC og 15 lignende metoder kan udvikles.
EKSEMPEL 38
Fremstilling af theophyllin-bovint serumalbumin konju-20 gater.
Theophyllin bovint serumalbumin (BSA) konjugater fremstilledes ud fra theophyllin-3-methyl-smørsyre, theo-phyllin-8-smørsyre og theophyllin-7-eddikesyre på føl-25 gende måde. 50 mg BSA opløstes i 1,5 ml 0,15 M NaHC03, pH
9,0. For sig tilsattes 16 mg ethyl-3'3-dimethylamino-propylcarbodiimidhydrochlorid (EDC1), 11 mgf N-hydroxy- succinimid (NHS) og enten 17, 8 mg theophyllin-7-eddi- kesyre, 20 mg theophyllin-8-smørsyre eller 20.9 mg theo-30 phyllin-3-methylsmørsyre oplyst i dimethylsulfoxid, og opløsningen opvarmedes 1-2 timer ved 45 ’C. Opløsningen sattes dråbevist til BSA opløsningen og reagerede 1 time. Theophyllin konjugater af BSA rensedes ved gelfil-treringschromatografi på en Sephades G-25 søje (1,6 cm x 35 38 cm) under anvendelse af 0,15 M PBS/0,1 % azid, pH 7,4 85 DK 173025 B1 som den mobile fase og en strømningshastighed på 30 ml/time.
EKSEMPEL 39 5
Fremstilling af theophyllin-BSA biomag· partikler.
4 ml rumfang af Biomag'-aminpartikler (Advanced Magnetis,
Inc., Cambridge, MA) vaskedes 2-3 gange i separate T-10 kolber med phosphatpufferet saltvand (Sigma) (PBS), pH
7,4 indeholdende 0,008 S Nonidet P-40 (NP-40).j Til den våde Biomag· kage sattes 10 ml 5 % glutaraldehyd (Sigma) i PBS, og aktiveringen skred fremad i løbet af 3 timer under anvendelse af en roterende blander. De aktiverede 15 Biomag· partikler vaskedes som beskrevet ovenfor til et totalantal på 4 afvaskninger og overførdtes til en T-kol-be.
6,8 mg theopyllin-BSA fremstillet som beskrevet i eksem-20 pel 38 i 10 ml PBS/NP-40 sattes til den aktiverede våde kage af Biomag'. Der omsattes natten over ved 4 *c under blading.
Den våde kage af aktiveret Biomag* vaskedes 3 gange med 25 20 ml 1 S BSA/0,15 M PBS/0,1 % azid (pH 7,4) idet den første afvaskning varede omtrent 30 minutter under anvendelse af en roterende blander.
EKSEMPEL 40 30
Fremstilling af forbindelse I-anti-theophyllin konjugat.
1,1 ml af et muse-anti-theophylin monoklonalt antistof (Kallestad, fremstillings nr. W0399; 4,6 mg/ml) centri-35 fugeredes ved 10.000 g i 8 minutter. Pufferen ombyttedes med 0,2 NaHCC>3, 0,15 M NaCl, med azid pH 9,0 under anven- 86 DK 173025 B1 delse af en Amicon Centricon' 30 koncentrator (centrifugeret ved 3000 x g ) . Antistofopløsningen fortyndedes til 2 ml, og 3,2 mg forbindelse I tilsattes. Der omsattes i 2 timer ved stuetemperatur under omrøring og 5 79 mikroliter vandig NaBH^ i en mængde på 1 mg/ml til sattes, og opløsningen omrørtes 30 minutter.
Den fremstillede opløsning anbragtes på en Sephadex G-2S søjle (1,0 cm x 18,0 cm) forudbragt i ligevægt med tris 10 puffer, og der elueredes med en hastighed på 15 ml/time. Fraktionerne indeholdende forbindelse I-anti-theophyllin konjugatet bev slået sammen, overført til dialyserør og dialyseret mod 0,15 M phosphat/0,15 M NaF (PBS) pH 6,9 (4 1) .
15 EKSEMPEL 41
Analyse af theophylin i serum baseret på en heterogen elektrokemiluminescensanalysemetode.
20
Under anvendelse af en immunometrisk forsøgsopbygning udvikledes en heterogen analysemetode for theophytyllin under anvendelse af et I-mærket anti-theophyllin antistof og theophyllin BSA immobiliseret på Biomag' magnetiske 25 partikler. Antistofkoncentrationen var 20 mikrogram/ml.
Den magnetiske partikelkoncentration var en vægt/rumfang-% faste partikler, theopyllin tilsattes til en slutkon-centration op 10 og 40 mikrogram/ml serum. Theopyllin serumstandarderne fortyndedes 1000 gange i PBF puffer (na-30 triumphosphat puffer, pH 7,0, 0,1 M natriumfluorid) indeholdende 0,1% BSA.
Analysen udførtes ved tilsætning af 75 mikroliter af de fortyndede serumstandarder til 75 mikroliter antistof 35 konjugeret til forbindelse I og indubere opløsningen 20 minutter ved stuetemperatur. Herefter tilsattes 50 mikro- 87 DK 173025 B1 liter theophyllin-BSA-Biomag' partikler, og suspensionen henstod i 5 minutter. Partiklerne fraskiltes magnetisk, og 100 mikroliter af den supernatante del måltes for elektrokemiluminescens som beskrevet i eksempel 48.
5
Theopyllinkoncentration ECL* SD % CV
mikrogram/ml++ 0 8,758 81 0.9 % 10 11,078 368 3,0 % 10 40 14, 106 674 4,8 % *ECL tællinger pr. 10 sekunder ++ korrigeret ved fortynding.
15
Baseret på disse resultater kan fagmanden udvikle en heterogen elektrokemiluminescens immunoundersøgelsesmetode for andre analyter af interesse i et biologisk materiale.
20 EKSEMPEL 42
Fremstilling af et forbindelse II-digoxigenin konjugat.
100,2 mg (0,104 mmol) forbindelse II, 41 mg (0,105 mmol) 25 digoxigenin (Sigma) og 28 mg (0,136 mmol) 1,3-dicychlo-hexylcarbodiiraid (DCC) sattes til en 50 ml rundbundet kolbe udstyret med en omrører. Til den fremstilede blanding satte 8-10 ml vandfrit pyridin (Aldrich Sure-Seal) under anvendelse af en injektionssprøjte med en 18 gauge 30 nål. Kolben tilproppedes, forsegledes med Teflon tape, og indholdet omrørtes forsigtigt til opnåelse af en rød opløsning. Kolben henstod i mørke under omrøring i indelukke i 24 timer, på hvilket tidspunkt 6 mg (0,015 mmol) digoxigenin og 20 mg (0,097 mmol) DCC tilsattes. Opløs-35 ningen tilpropedes, to der omrørtes i mørke ved stuetemperatur. Den næste dag sås ingen dicyclohexylurinstof- 88 DK 173025 B1 udfældning. Yderligere 18 mg (0,05 mmol) digoxigenin og 103 mg (0,50 mmol) DCC tilsattes. Kolben forsegledes atter og omrøringen fortsatte i mørke. Efter 72 timers forløb tilsattes yderligere 103 mg DCC, og opløsningen 5 omrørtes 3 timer i mørke.
5-10 dråber vand sattes til opløsningen, der herefter strippedes til tørhed på en roterende inddamper i mørke til frembringelse af et rødt fast stof.
10
Det fremkomne røde faste stof blev dækket med aluminiumfolie og tørret natten over i vacuum over CaSOj i en es-sikator. Det tørrede faste materiale opløstes herefter i 3-5 ml methanol, og omtrent 0,25 g vandfrit fast Lido« 15 tilsattes blandingen. Når LiCIO« var opløst anbragtes opløsningen på en Sephadex LH-20 søjle (75 cm x 19 mm), og der elueredes med methanol med en strømningshastighed påmellem 7-10 sekunder/dråbe.
20 Der sås 3 bånd efterhånden som chromatograf ien skred frem; et svagt orange (rødtluminiscerende) første bånd (fraktion 1); et mørkerødt andet bånd, der repræsenterer hoveddelen af reaktionsproduktet (fraktion 2), og et tredje bånd, der fulgte efter de to første bånd (sand-25 synligvis uomsat udgangsmaterialed), der bortkastedes.
Fordi bånd 1 og 2 knapt var adskilte på søjlen isoleredes eventuelt orange produkt i bånd 2 ved at dyppe en me-thanolopløsning af fraktion 2 (15 ml) i omtrent 300 ml 30 tør diethylether (omrørt). Det fremkomne bundfald frasu-gedes på et 15 ml medium glasfilter og vaskedes 5 gange med 15 ml diethylether. Den tilbageblevne ether fjernedes ved at tørre komplekset natten over over CaSO* i en vacuum esikator. Det faste materiale bestemtes til at væ-35 re 09 DK 173025 B1 \ /ΎΤ 5 Ui — - \ n / \ ° „ M> oo
C*S XlXjoH
io O mw-·7 ob 15 EKSEMPEL 43
Elektorkemiluminescens (ECL) af forbindelse II-digoxige-nin konjugat: Modulering af ECL signal ved hjælp af anti-20 digoxin antistof.
Monoklonalt antistof overfor digoxin fortyndedes til følgende koncentrationer i immunoførsøgspuffer: 1/ 10, 50, 200 og 400 mikrogram/ml.
25
Forbindelse II-digoxigenin konjugat (50 mikromolær) fortyndedes til 150 nM i immunoforsøgspuffer (0,1 M phos-phatpuffer, pH 6,0, indeholdende 0,1 M natrium fluorid).
30 Til 200 mikroliter immunoforsøgspuffer i polypropylenrør (12 mm x 75 mm) sattes 100 mikroliter af forskellige koncentrationer af digoxin antistof og 100 mikroliter forbindelse II-digoxigenin konjugat (150 nM) . Rørerne blandedes på en hvirvelblander og inkuberedes 15 minutter ved 35 stuetemperatur. Efter inkubation tilsattes 100 mikroliter 90 DK 173025 B1 EC1 opløsning (beskrevet ovenfor) og elektrokemiluminescensen måltes. Resultater:
Specifik antistof koncentration x 5 mikrogram/rør ECL signal 0,1 108000 1 114000 5 82500 10 10 64000 20 52000 40 36000
Totale ECL tællinger for 30 nM forbindeler II-digoxigenin 15 konjugat = 113666 (tophøjde).
Ved en koncentration på 40 mikrogram/rør var ikke specifik antistofmodulering af signalet 67000 tællinger i forhold til 36000 tællinger i nærværelse af et specifikt 20 antistof overfor digoxin.
Som det fremgår af figur 6 viste en stigende koncentration af anti-digoxin antistof, når der omsattes med en fast koncentration af forbindelse II-digoxigenin konju-25 gat, stigende modulation af det elektrokemiluminescerende signal. Denne egenskab kan anvendes med fordel til at udvikle en homogen elektrokemiluninescensbaseret analysemetode til måling af digoxin i serum eller plasma.
30 EKSEMPEL 44
Homogen digoxinanalyse.
Baseret på resultaterne beskrevet i eksempel 43 kan en 35 homogen elektrokemiluminescens immunoanalyse for digoxin udvikles under anvendele af antistof overfor digoxin og 91 DK 173025 B1 forbindelse II-digoxigenin konjugat under anvendele af en kompetitiv bindingsforsøgsmetode. Reagenserne, der kan anvendes er beskrevet i eksempel 43. Til denne analyse udvælges en særlig koncentration af monokonalt antistof 5 overfor digoxin. Antistofkoncentrationen kan være mellem 75-100 mikrogram pr. ml. Forbindelse II-digoxigenin konjugatkoncentrationerne kan være mellem 5-15 nM (slut-koncentration).
10 Digoxinstandard sættes til humant serum til opnåelse af en slutkoncentration på 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 8 og 16 nano-gram digoxin pr. ml serum.
Analysen udføres ved at sætte 10-30 mikroliter serum til 15 300 mikroliter anti-digoxin monoklonalt antistof og hen sætte opløsningen 30 minutter ved stuetemperatur. Herefter kan 100 mikroliter af forbindele II-digoxigenin kon-jugatet sættes til hvert rør til opnåelse af en slutkoncentration inden for området 5-15 nM, og opløsningen in-20 kuberes 20 minutter ved stuetemperatur. 100 mikroliter af ECL opløsningen beskrevet ovenfor kan tilsættes hvert rør, og ECL kan måes som beskrevet tidligere.
EKSEMPEL 45 25
Fremstilling af Oubain-bovint serumalbunin konjugat.
50 mg ouain octahydrat (Aldrich) opløstes i 5 ml afioniseret H20. 81 mg NalO« sattes til det opløste oubain, og 30 blandingen inkuberedes 2 timer ved stuetemperatur. Reaktionen blev afbrudt ved at lede blandingen over en Dowex 1X-8 ionbytter harpikssøjle (5 ml), der var ækvilibreret med afioniseret vand intil pH var mellem 5 og 6. Den oxiderede oubainfraktion opsamledes, når dråber, der kom ind 35 i affaldsbeholderen viste tegn på blanding.
92 DK 173025 B1 100 mg krystallinsk lyophiliseret bovint serumalbumin (Sigma) (BSA) opløstes i 5 ml 0,1 M kaliumphosphatpufferet saltvand, pH 7,4 indeholdende 0,05 % azid. Den oxiderede oubainopløsning dryppedes til BSA opløsningen un-5 der omrøring. Den fremstillede.opløsning omsattes 1 time ved stuetemperatur, inden der tilsattes 30 mg NaCNBHj (Aldrich) . Opløsningen omrørtes herefter natten over ved stuetemperatur.
10 opløsningen koncentreredes (11 ml til 4 ml) under anvendelse af polyethylenglycol-8000, og fri oubain og overskud af borhydrid fjernedes fra opløsningen ved gelfiltrering på Sephadex G-25 (søjle = 0,6 cm x 37 cm; elu-eringsmiddel = 0,1 M KzPOj/0,15 M MaCl, pH 7,5 0,05 % 15 NaN3) . Fraktionerne 11-17 blev slået sammen, og proteinkoncentrationen bestemtes ved at måle absorbans ved 280 mn (efter fortynding).
EKSEMPEL 46 20
Fremstilling af oubain-BSA-Sepharose.
2 g cyanbromid aktiveret Sepharose 4A (Pfharmacia) vaskedes med 400 ml 1 mM HC1 i 50 ml protioner på en glasbrink 25 med sinteret skive. Harpiksen vaskedes herefter med 20 ml 0, 1 M naHC03, 0,5 M NaCl puffer, pH 9,0 (koblingspuffer).
Efter overførsel af harpiksen til en polypropylenbeholder tilsattes 30 mg oubain-BSA opløst” i 15 ml koblingspuffer.
Den aktiverede harpiks henstod for at reagere med oubain-30 BSA i 2 timer under roterende blanding. De tilbageblevne aktive pladser omsattes med 7 ml 0,5 M ethanolamin (pH 8,0) i 2 timer ved stuetemperatur. Under anendelse af en tragt med sintret skive underkastedes harpiksen vask med 100 ml af hvert af følgende opløsninger: Koblingspuffer;
35 0,15 M PBS; 1 mM HC1; koblingspuffer; 0,2 % NP-40 i PBS
og PBS. Harpiksen genopslemmedes til 11 mm, og en til- 93 DK 173025 B1 strækkelig mængde af denne suspension sattes til en 1,0 cm indvendig diameter søjle (Pharmacia) til opnåelse af et totalt lejerumfang på 3,5 ml.
5 EKSEMPEL 47
Fremstilling og affinitetsrensning af et anti-digoxin-forbindelse I konjugat.
10 450 mikroliter af en 1 mg/ml stamopløsning af et muse- anti-digoxin monoklonalt antistof (Cambridge Medical
Diagnostics, katalog nr. 200M-014, omstillings nr. MA 2507F) koncentreredes til 100 mikroliter under anvendelse af in amicon Centricon 30' koncentrerende enhed. Til 15 dette koncentrat sattes 900 mikroliter 0,2 M natrium bi-carbonatpuffer, pH 9,6 og 0,6 mg forbindelse I. Reaktionen (amidering) skred frem ved stuetemperatur i 2 timer inden 30 mikroliter 1,0 NaBH« (vandig) (Sigma) tilsattes.
Den fremstillede opløsning henstod 1 time.
20
Overskud af forbindelse I og andre produkter adskiltes fra antistof konjugatet ved Sephadex G-25 chromatografi (søjle = 1,0 cm id x 13 cm; elueringsmiddel = 0,1 M phos-25 phatpufferet saltvand). Pøven fraktioneredes i 1 ml portioner med en strømningshastighed på 20 ml/time, og absorbansen ved 280 nm kontrolleredes ved 2,0 AUFS og 0,5 AUFS.
30 Fraktionerne 5, 6, 7 og 8 blev slået sammen, anbragt for en forudvasket oubain-BSA-Sepharoseaffinitetssøjle (3,5 ml søjle med 1 cm diameter) og elueret med en strømningshastighed på 15 ml/time. Efter at ikke tilbageholdt materiale var elueret hævedes strømningshastigheden til 35 30 ml/time, indtil der var opsamlet 20 ml eluat. Salt- 94 DK 173025 B1 vandskoncentrationen af den mobile fase forøgedes til 0,5 M og yderligere 20 ml elueredes gennem søjlen.
Oubainspecifikt anti-digoxin-forbindelse I konjugat fjer-5 nedes ved tilsætning af 4 M og 6 M KSCN. Fraktioner svarende til anti-digoxin-forbindelse I konjugat blev slået sammen og dialyseret mod 10 mM phosphatpufferet saltvand (4 1; pH 7,4) efterfulgt af 0,1 H phosphatpuffer ( 4 1; pH 7,0) 10 EKSEMPEL 48
Heterogent elektrokimiluninescens immunoanalyse for digoxin.
15 10 mg fast digoxin opløstes i 10 ml DMS0:H;0 (8:2) til opnåelse af en digoxinkoncentration på 1 mg/ml (herefter stam standard).
20 Arbejdsstandarder blev fremstillet ud fra stamstandarden til følgende koncentrationer i 0,5 M phosphatpuffer, pH
7,0 indeholdende 0,12 % BSA og 0,15 M NaF (i det efterfølgende betegnet ECL puffer): 80 ng/ml, 40 ng/ml, 20 ng/ml, 10 mg/ml. 5 ng/ml, og 0 ng/ml.
25 75 mikroliter anti-digoxin-forbindelse I konjugat (fortyndet 1:90) og 75 mikroliter af hver af standarderne pipetteredes i et glasrør, blandedes på et hvirvelapparat og inkuberedes 20 minutter ved stuetemperatur.
30 50 ml forudvasket oubain-BSA-biomag' partikler sattes til hvert rør, blandedes på nævnte apparater oginkuberedes 5 minutter ved stuetemperatur. Biomag- partiklerne fraskiltes, og den supernatante del overførtes til et se-35 parat rør.
95 DK 173025 B1 100 mikroliter af den supernatante del blandedes med 400 mikroliter 0,125 M kaluimphosphat, 0,125 M citronsyre; 32 mM oxalsyre og 1,25 % Triton X-100 i et reagensglas.
5 Prøven anbragtes i et Berthold instrument, og elektrokemiluminescensen måltes som tidligere beskrevet, bortset fra at proceduren blev modificeret ved at trin-dele det påtrykte potentiale fra den åbne strømkreds til 2,2 V og integrere photontællingerne i 10 sekunder.
10
Elektroden rensedes mellem målingerne under anvendelse af phosphat-citrat puffer som følger; (a) Elektroden pulseres under anvendelse af 3 sekunders 15 intervaller svingende mellem -2,2 V og +2,2 Vil minut.
(b) Hvil elektroden ved +2,2 V i 10 sekunder.
20 (c) Skyl elektroden med afioniseret vand og tryk tør.
Resultaterne er angivet i figur 7.
EKSEMPEL 49 25 Mærkning af DNA med en elektrokemiluminescerende gruppe.
Følgende 2 metoder er blevet anvendt til at mærke DNA med en elektrokemiluminescerende gruppe.
30
Syntese A.
1,0 A26o af leverandørsyntetiseret 38 mer (MBI 38) 3 5 TCACCAATAAACCGCAAACACCATCCCGTCCTGCCAGT * 96 DK 173025 B1
Hvor T* er thymidinmodificeret carbon 5 med -CH=CH-C0-NH- (CH2) 7-NH2 5 opløstes i 100 mikroliter 0,01 M phosphatpuffer, pH 8,7.
100 mikroliter af en opløsning af bis(2,2'-bipyridin) [4-butan-l-al)-41-methyl-2, 2'-bipyridin]ruthenium (II) di-perchlorat (forbindelse I) (2,3 mg i 300 mikroliter af 0,01 M kaliumphosphatpuffer, pH 8,7) tilsattes. Indholdet 10 omrørtes og henstod natten over ved stuetemperatur.
100 mikroliter af en mættet vandig opløsning af natrium-borhydrid sattes til blandingen for at omdanne den reversible imin Schiffske basebinding til ikke-reversibel 15 aminbinding. Omsætningen fik lov at foregå ved stuetemperatur i 2 timer. Opløsningen behandledes forsigtigt med nogle få dråber fortyndet eddikesyre for at bratkøle o-verskud af natriumborhydrid. Reaktionsopløsningen anbragtes på en P-2gelfiltreringssøjle (18 inch x 1/2 20 inch), der forud var bragt i ligevægt med 0,1 M triethyl-ammoniumacetat, pH 6,77. Søjlen elueredes med denne puffer, og 2 ml fraktioner opsamledes med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time. DNA eluerede i fraktioner 9 og 10 og var udmærket adskilt fra uomsat ruthe-25 niumbipyridylkompleks. Den opsamlede DNA prøve udviste typisk UV absorbtion og viste yderligere et fluorescens-emmissionsspektrum ved 620 nm, når der magnitiseredes ved 450 nm. Fluorescensemmissionen viste tilstedeværelsen af rutheniumbipyridylgruppen i DNA prøven. Produktet går som 30 et enkelt orangefluorescerende bånd ved polyacrylamid gelelektroforese. Den elektroforetiske mobilitet af det mærkede DNA (MBI 38-forbindelse I konjugat) er omtrent den samme som det umærkede DNA.
35 Syntese B.
97 DK 173025 B1
Rutheniumkomplekset omdannedes først til et N-hydroxysuc-cinimid derivat ved at opløse 3 mg i 60 mikroliter vandfrit dimethylformamid og behandle med en opløsning af N-hydroxysuccinimid (52 mg) i 200 mikroliter vandfrit DMF 5 i nærværelse af 94 mg dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Man lod reaktionen skride fremad ved 0 *C i 4 timer. Udfældet dicyclohexylurinsto fracentrifugeredes, og den su-pernatante del (200 mikroliter) sattes til oplsningen af amino-bundet DNA (beskrevet under syntese A) i 0,01 M 10 phosphatpuffer pH 8,77 (2A 26o i 100 mikroliter puffer).
Der omsattes natten over ved sturtemperatur. En betydelig mængde fast materiale kom til syne under omsætningen, der fjernedes ved filtrering gennem glasuld. Filtratet koncentreredes og opløstes i 0,5 ml 1 M triethyl-15 ammoniumacetat (pH 6,8). Herefter chromatograferedes reaktionsblandingen som beskreved under syntese A. Det mærkede DNA viste alle spektrale og elektroforetiske egenskaber som omtalt for materialet fremstillet under syntese A.
20 EKSEMPEL 50
Elektrofrembragt kemiluminescensegenskåber ved mærket DNA.
25
Den mærkede DNA prøve f.eks. 49, syntese A (MBI 38 forbindelse I) anvendtes til at undersøge forbindelsens e-lektrokemiluminiscerende egenskaber. Forskellige koncentrationer af mærket DNA opløstes i 0,5 ml 01 M phosphat-30 puffer, pH 4,2 indeholdende 0,1 M citrat, 25 mM oxalat og 1,0 % Triton X-100, og der måltes på et modificeret
Berthold luroinometer. Figur 8 viser responsen af det e-lektrokemiluminescerende signal på forskellige DNA koncentrationer.
35 98 DK 173025 B1 EKSEMPEL 51
Hybridiseringsundersøgelser af forbindelse I-mærket oli-gonucleotid.
5
Den komplementære strand til den 38 mer-forbindelse beskrevet i eksempel 50 syntetiseredes under anvendelse af ABI model 380B DNA syntisatoren og betegnedes MGEN-38.
10 For at bestemme om den kovalente fastgørelse af forbindelse I til oligonucleotidet påvirkede hybridiseringseg-enskaberne af MBI 38 oligonucleotidet udførtes følgende forsøg. Forskellige koncentrationer af targetfragmentet (MGEN-38) blev anbrag som pletter på et lag Gelman RP ny-15 lonmembran, fixseret og afsøgt med probe med enten MBI 38 eller MBI 38-forbindelse I. Begge fragmenter behandledes med T4 poynucleotidkinase og gamma 32P[ATP] og mærket med 32P ved 5' enden. Hybridiseringsfølsomhederne af DNA og forbindelse I-mærket DNA sammenlignedes herefter.
20
Konsentrationen af MGEN-38 DNA, der lå fra 50 ng ned til 0,05 ng blev anbragt som pletter på en nylonmembran og lufttørret. Dobbelte membraner blev fremsillet. Pletterne blev behandlet i 2 minutter hver i: 1,5 M NaCl-0,5 M NaOH 25 for fuldstændigt at denaturere DNA; 1,5 M, NaCl-0,5 M TRIS for at neutraliserer blotten og endelige i 2X SSC.
Blotten blev bagt i vacuumovn ved 80 0 C i 2 timer.
30 Hybridiseringsproben blev fremstillet på følgende måde: 3 mikrogram MBI 38 og MBI 38-forbindelse I blev kinasebe-handlet med 10 enheder T4 kinase og 125 mikrokurie af gamma 32P-ATP. Procent isotopindarbejdelse i DNA blev bestemt og vist nedenfor.
MBI 38 totaltælling 4,1 x 10s cpm/mikroliter 35 99 DK 173025 B1
Indarbejdede tællinger 3/1 x 105 cpm/mikroliter % indarbejdelse = 75,6 % 5
MBI 38-forbindelse I
totaltælling 3,2 x 106 cpm/mikroliter
Indarbejdet tælling 2,6 c 105 cpm/mikroliter 10 % indarbejdelse 81,2 %
Præhybridiserings- og hybridiseringsopløsninger fremstilledes som beskrevet af Maniatis (24) . Blots blev præhy-15 driseret i 4 timer ved 53 *C med 50 mikrogram/ml kalve-thymus DNA. Blottene blev herefter anbragt i hybridi-seringsopløsning indeholdende de respektive prober ved 10.000.000 cpm. og henstod for at hybridisere natten over (12 timer) ved 53 0 C. Den følgende dag blev blottene 20 vasket på følgende måde:
To gange med 2X SSC + 0,1 % SDS ved 53 'C i 15 minutter for hver afvaskning 25 to gange med 0,2 x SSC + 0,1 % SDS (som ovenfor) to gange med 0,16 x SSC + 0,1 % SDS (som ovenfor).
Blottene lufttørredes herefter og exponeredes for Kodak 30 X-omat' film ved -70 *C.
Analyse af røngtenbillede (se fig. 9) viste, at meget ens hybridiseringsmønster observeredes mellem MBI 38 og MBI 38-forbindelse I proben. I begge tilfælde observeredes 35 hybridisering af proben til 0,5 ng af target, og svage spor af hybridisering observeredes ned til 0,05 ng af 100 DK 173025 B1 target DNA. Der afsløredes ingen hybridiseringsaktivitet af proben for den negative kontrol DNA (fag lamba DNA anbragt i en koncentration på 50 ng).
5 EKSEMPEL 52
Forbindelse I-mærket DNA probe hybridiseringsspecifici-tetundersøgelse.
10 Genom DNA fra adskillige E. coli cg ikke-E. colistammer isoleredes som beskrevet af Maniatis (24). De anvendte organismer var: E. coli stamme EC8 - naturligt isolat 15 E. coli stamme PclA - enteropatogenstamme E. coli stamme 10HO7 - enterotoxigenstamme E. coli stamme EC50 - anturligt isolat E. coli stamme B - laboratoriestamme E. coli stamme K12 - laboratoriestamme 20
Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Salmonella paratyphi B Salmonella potsdam.
25 DNA fra ovennævnte stammer blev pletanbragt dobbelt i 3 mikrogramprøver på en Gelman RP nylonmembran og på en S & S nitrocellulosemembran. Som negativ kontrol pletanbragtes 50 ng fag lamda DNA. Positiv kontrol bestod af 30 forskellige koncentrationer af den komplementære streng, MGEN-38, fra 50 ng ned til 0,5 ng. Blottene blev fremstillet og behandlet som beskrevet som i eksempel 51.
Probet DNA bestod af 3,0 mikrogram MBI 38-forbindelse I 35 fragment, der var T4 kinasebehandlet ved 120 mikrokurie 101 DK 173025 B1 gamma 32P-ATP for at indarbejde radioaktivitet. Følgende mængde aktivitet indarbejdedes.
MBI 38-forbindelse totale tællinger - 3,35 x 106 cpm/mikroliter 5 indarbejdede tællinger - 1,50 x 10e cpm/mikroliter % indarbejdelse - 44,7 %.
1 dette forsøg anvendtes 2.600.000 cpm aktivitet som pro-beafsøgelse for hvert filter. Hybridiseringsopløsninger- 10 ne, betingelserne, vaskeopløsningerne og forsøgsmetoderne var som beskrevet i eksempel 51.
Røntgenfilmen af blotten (fig. 10) viser, at både de positive og negative kontroller reagerede i overensstem-15 melse hermed. Der afsløredes ingen hybridiseringsaktivi-tet med lambda DNA (50 ng) og stærk hybridisering observer ve redes ved den komplementære sekvens, MGEN-38, med til 0,5 ng koncentration. Disse fund er i fuldstændig overensstemmelse med resultaterne af sensitivitetsunder-20 søgelsen.
EKSEMPEL 53
Forbindelse I mærkning af humant IgG.
25 2 ml humant IgG (2,5 mg/ml) dialyseredes mod 2 1 0,2 M natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6, natten over ved 4 *C under sagte omrøring. Forbindelse I fremstilledes i et 100 mol overskud i forhold til tilstedeværende protein (2,7 30 mg/100 mikroliter dimethylformamid) og henstå for at oplyses. Det dialyserede protein tildryppedes tag-aldehydet under forsigtig omrøring ved stuetemperatur i 2 timer. 100 mol overskud (i forhold til protein) af na-triumborhydrid (100 mikroliter af en 1,24 mg/ml opløsning 35 i afioniseret vand) sattes til opløsningen om omrørtes forsigtigt yderligere 30 minutter ved stuetemperatur.
102 DK 173025 B1
Konjugatet anbragtes på en Sephadex G-25 søjle (1,0 cm x 18,0 cm) bragt i ligevæget ved stuetemperatur med 0,2 M jTris, pH 8,0, og eluanten kontrolleredes ved 280 nm. Den tomme rumfangstop opsamledes, blev slået sammen og dialy-5 seret mod 2 1 trispuffer. Konjugatet afprøvedes for immunologisk aktivitet bed standard ELISA forsøg og lagret ved 4 *C indtil brug.
EKSEMPEL 54 10
Biomag/gede-anti-human igG partikel præparation.
En 2,5 ml prøve af 5 % Biomag'-amin afsluttede partikler (Advanced Magnetics, Cambridge, MA) overførtes til en ren 15 stor T-kolbe og vaskedes 5 gange med phosphatpufferet saltvand (PBS). Den våde kage genopslemmedes i 12,5 ml 5 S frisk glutaraldehyd (Sigma) og roteredes over top og bund ved stuetemperatur i 3 timer. Den våde kage overførtes til en anden T-kolbe og vaskedes 3 gange med PBS.
20 De aktiverede partikler genopslemmedes til 12,5 ml med PBS og overførtes til et 15 ml centrifugerør. Til denne suspension sattes 12,5 mg gede-anti-humant IgG (H+L) (Jackson Labs) i 2 ml PBS. røret roteredes top over bund i 3 timer ved stuetemperatur og herefter natten over ved 25 4 *C. Den næste dag vaskedes partiklerne 2 gange med PBS indeholdende 1 vægt/rumfang-% bovint serum albumin (BSA) efterfulgt af lagring i 12,5 ml PBS indeholdende 0,1 % BSA ved 4 'C indtil brugen.
30 EKSEMPEL 55
Pseudo-homogent humant IgG elektrokemiluminescensanalyse under anvendelse af Biomag' magnetisk baserede partikelanalyse.
35 103 DK 173025 B1
Forbindelse I-humant IgG konjugat fortyndedes 1:50 i 0,15 M phosphatpuffer indeholdende 0,1 % BSA og ombragtes i portioner i 250 mikroliter/rør. 150 mikroliter af dilu-enten (PB w/BSA som ovenfor) sattes til hvert rør, 5 hvorefter der sattes enten forskellige fortyndinger af analyten (humant IgG) eller diluenten (negative kontroller) . Yderligere anvendtes en ikke-specifik analyt (gede-anti-kanin IgG) i visse rør, for at checke analysespecificiteten. 50 mikroliter 1 % Biomag· koblet med gede-10 anti-humant IgG (H&L) tilsattes hvert rør. Rørene blandedes på en hvirvelblander og inkuberedes ved stuetemperatur i 15 minutter under forsigtig omrystning. Partiklerne fjernedes magnetisk fra opløsningen, og 100 mikroliter af den fremkomne supernatant overførtes til et Berthold rør, 15 hvortil 400 mikroliter af en citrat-oxalat-Triton X-l-opløsning var sat. Rørene blandedes på en hvirvelblander og aflæstes i et modificeret Berthold luminumeter udstyret med et R-268 fotoforstærkerrør og en 0,29 inch diameter cirkulær 54 gauge dobbelt platinmesh elektrode 20 understøtet med en ledende malings-beklædt polycarbonat-understøttelse og forbundet til spændingskilden gennem en 0,01 inch diameter platintråds/sølvmalingskontakt. Det tilførte potentiale gik trinvis fra +1,4 til +2,15 V, medens en 10 sekunders integration blev foretaget. Mellem 25 aflæsningerne rensedes elektroden elektrokemisk ved afioniseret vand, neddyppedes herefter i 0,1 M phosphatci-tratpuffer indeholdende oxalsyre og Triton X-100 og trinvis optrapning af den tilførte spænding fra -2,2 V til +2,2 V (med 3 sekunder ved hver spænding) i 2 minutter og 30 20 sekunder, efterfulgt af en hvilepause ved spændingen på +2,2 V i 10 sekunder. Elektroden fjernedes, fra rense-opløsningen, afrensedes med afioniseret vand og blev trukket tør med et absorberende stykke materiale. I denne forsøgsopstilling var elektrokemiluminescenssignalet di-35 rekte proportional med analytkoncentrationen.
104 DK 173025 B1 EKSEMPEL 56
Fremstilling af bis(2,2,-bipyridin)maleimidohexansyre, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamid ruthenium (II) di-5 perchorat: forbindelse IV.
4- [4- (1-aminobutyl)]-4'-methyl-2,2'-bipyidin, fremstillet som beskrevet i eksempel 32 ud fra 500 mg (1,35 x 10“ 3mol) phthalimid opløstes i 5 ml tør pyridin med 0,313 g 10 (1,48 x 10"3 mol) maleimid hexansyre og 0,306 g (1,48 x 10'3 mol) DCC. Efter lagring natten over frafiltreredes dicyclohexylurinstof, og pyridinen afstrippedes under vacuum. Remanensen rensedes ved søjlechromatografi (aktivitets II aluminium oxid, 5 % MeOH/CH^Cl2) til opnåelse af 15 den rensede forbindelse. Udbytte 0,56 g (95 %) 100 mg (2,3 x ΙΟ-4 mol) maleimido-hexansyre, 4- methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamid og 100 mg (2,06 x 10“ 4mol) bis-(2,2'-bipyridin) rutheniumdichloriddihydrat op-20 løstes i 50 ml ethanol/vand (1:1), afgassedes med argon og opvarmedes 4 timer med tilbagesvaling. Den fremstillede klart orange opløsning fortyndedes med 25 ml fast NaC104 2 5 ml ethanol og 25 ml acetone og afdampedes langsomt i vacuum. Da materialet var tørt tilsattes yder-25 ligere 25 ml vand og 25 ml acetone, og opløsningen inddampedes på roterende inddamper til ca. 15-20 ml. Det faste udfældede materiale opsamledes, vaskedes med vand og tørredes. Prøven rensedes ved præparativtivt TLC påaluminiumoxid underanvendelse af 1:9 methanol/chloro-30 form. Det hurtigt løbende bånd isolierdes ved afskrabning fra pladen, og forbindelsen elueredes ved omrøring i methanol/chloroform (1:1). Efter filtrering for at fjerne aluminiumoxidet inddampedes den orangefarvede opløsning til tørhed til opnåelse af 86,7 mg renset forbindelse (72 35 %) .
105 DK 173025 B1 EKSEMPEL 57 Mærkning af hCG peptid med foribindelse IV.
5 2 mg humant chorion gonadotropin (hCG) peptid {#109-145, JP141, Vernon Stevens, Ohio State University) opslemmedes i 1 ml 0,15 M citratpuffer, pH 6,0, og 1,13 mg forbindelse IV opløset i 300 mikroliter dimethylformamid. Peptidopløsningen dryppedes til forbindelse IV opløsnin-10 gen i løbet af 1 minut. Opløsningen omrørtes forsigtigt 1 time ved stuetemperatur. Prøven anbragtes derefter på en Bio-gel P-2 søjle {Bio-Rad; 1 cm x 45 cm) der var bragt i ligevægt ved stuetemperatur ved 0,2 M Tris-base, pH 8,5 med en strømningshastighed på 15 ml/time, og eluanten 15 kontrolleredes ved 280 nm. Hulrumsrumfanget af gen-nemløbningen opsamledes, blev slået sammen og påført en QAE-Sephadex A-25 søjle (Pharmacia; 1 cm x 10 cm), der var bragt i ligevægt ved stuetemperatur med 50 mM Tris-HC1, pH 7,0. Dette blev foretaget for at fjerne e-20 ventuelle umærkede peptider (der vil adsorbere til den positivt ladede harpiks; den positive ladning af det mærkede peptid muliggør, at det kan passere gennem søjlen uden yderligere behandling). Eluanten undersøgtes ved 280 nm, og den første hovedtop opsamledes, blev slået sammen 25 og koncentreret ved lyophilisering. Den tørrede forbindelse påslemmedes i mindst muligt rumfang PBF. hCG peptid-forbindelse IV konjugatet lagredes ved 4 *C indtil anvendelsen.
30 EKSEMPEL 58
Rensning af kanin-anti-hCG peptid ved hjælp af DEAE
AFFI-gel blåt chromatografi.
35 106 DK 173025 B1 4 ml DEAE-AFFI-gel blåt (Bio-Rad) hældtes på en chromato-grafisøjle (1 cm x 10 søjlestørrelse) og ækvilibreredes ved stuetemperatur med 0,2 M Tris-HCl indeholdende 0,028 M NaCl, pH 8,0 i 1 time med en 40 ml/time gennem-5 strømningshastighed. Gennemstrømningshastigheden sænkedes til 20 ml/time og 1 ml kanin-anti-hCG peptid (anti 109-145, Vernon Stevens, Ohio State University), der var prædialyseret overfor søjlepuffer, påførtes søjlen. 1 ml fraktioner opsamledes, og eluanten kontrolleredes ved 280 10 nm. Hulrumstoppen opsamledes, blev slået sammen fra flere gennemløb og koncentreredes ved at anbringe eluanten i en 12K MMWCO dialysesæk, der var omgivet af polyethylen-glycol 6000 (Sigma). Antistoffet undersøgtes for immuno-reaktivitet under anvendelse af standard ELISA metoder og 15 for renhed ved hjælp af HPLC, hvilket bevirkede forekomsten af 1 hovedtop, der tydede på et rent aktivt præparat.
EKSEMPEL 59 20
Titrering af hCf peptid-forbindelse IV konjugat mod renset kanin-anti-hCG peptid: Elektrokemiluminescens signalmodulering.
25 hCG peptid-forbindelse IV konjugat fortyndedes i 0,1 M phosphatpuffer indeholdende 0,1 M citrat, pH 6,2. Prøver af denne blanding anbragtes i mikrofugerør. Det forud rensede anti-peptidantistof fortyndedes til forskellige koncentrationer og sattes til rørene, der blandedes i en 30 hvirvelblander og inkuberedes 1 time ved stuetemperatur.
Lige inden aflæsning af elektrokemi luminescens overførtes en prøve til et Berthold rør, hvortil oxalsyre og Triton X-100 (Sigma) var sat. Rørene blandedes på en hvirvelblander og aflæsningen under anvendelse af en trim-35 mebølge ( + 1/5 til +2,5 V ved 50 mV/sek., ved hvilke 3 scanninger blev foretaget, idet man tog tophøjden af den 107 DK 173025 B1 anden scanning som værdien) på et Berthold luminometer under anvendelse af et R-268 fotoforstærkerrør med dobbelt platin mesh blev foretaget. Mellem aflæsningerne rensedes elektroden elektrokemisk ved først at rense den 5 med afioniseret vand og herefter neddyppe den i 0,1 M Phosphat-citratpuffer, pH 6,1 indeholdende 25 nM oxalat og 1 % Triton X-100. Den tilførte spænding blev tilsluttet med 3 sekunder ved hver spænding mellem +2,2 og -2,2 Vil minut og 50 sekunder og bragt i ligevægt ved +2,2 V 10 i 10 sekunder. Herefter blev strømmen afbrudt, og elektroden fjernet fra renseopløsningen og renset med afioniseret vand og trykket tør med et absorberende klæde.
Resultaterne viser en generel tendens, hvor elektrokemi-15 luminescenssignalet var direkte proportional med koncentrationen af antistof til peptidet. Dette er i modsætning til andre eksperimenter, ved hvilken elektrokemilu-minescenssignalet falder efterhånden som den elektrokemi-luminescensmærkede analyt bringes i kontakt med antistof.
20 EKSEMPEL 60
Elektrokemiluminescenssignalydelse: Stabilitetsdata for
Ru (II)-forbindelse III konjugat.
25
Ru (II)-forbindelse III konjugat fortyndedes til 300 nM i 0,1 M phosphat-ciratpuffer, pH 6,1 enten med eller uden 1 % normalt humant serum (NHS). Hver af puffertyperne inkuberedes ved 4 0, 20 0, 37 0 og 55 *C og undersøgtes ved 30 prøveudtagning på inkubationsdagene 3, 4 og 5. Prøverne bragtes i ligevægt ved stuetemperatur og bedømtes for deres elektrokemiske signal. 400 mikroliter prøve blandedes med 100 mikroliter 125 mM oxalsyre-5 % Triton X-100 i et rør, anbragtes i et modificeret Berthold lu-35 minometer med et Hamamatsu R-268 fotoforstærkerfør og en dobbelt mesh platingaze elektrode. Aflæsningen blev fore- 108 DK 173025 B1 taget ved at variere den påførte spænding konstant mellem + 1,5 til +2,5 V med 50 mV/sek. i 3 behandlinger, og højden af den anden behandlingstop registreredes og omdannedes til elektrokemiluminescenttællinger. Mellem 5 tællingerne rensedes elektroden elektrokemisk ved at rense med afioniseret vand, neddyppe elektroden i 0,1 M phosphat-citratpuffer indeholdende 25 mM oxalat og 1 %
Triton X-100 og pulsere spændingen fra -2,2 til +2,2 V med en 3 sekunders pause ved hver spænding i 1 minut og 10 50 sekunder. Spændingen forblev ved +2,2 V i 10 sekunder og blev herefter afbrudt. Elektroden fjernedes fra rense-opløsningen, der vaskedes med afioniseret vand og blev trukket tør med et absorberende klæde. Resultaterne viser, at der var overensstemmende signal i hver puffertype 15 under forsøgets varighed. Dette viser reagensets evne og stabilitet til at fremkalde et elektrokimiluminescerende signal.
EKSEMPEL 61 20
Immunoreaktivitetsundersøgelse af Ru(II)-forbindelse III konjugat: Stabilitetsundersøgelser.
Ru(II)-forbindelse III konjugat fortyndedes og inkubere-25 des under de betingelser der er beskrevet i eksempel 60.
Prøver blev udtaget på dag 3, 4 og 5, afkølet til stuetemperatur og undersøgt for immunoreaktivitet ved hjælp af partikelkoncentratonsfluorescensimmunoforsøget (PCFIA) under anvendelse af en Pandex Screen Machine indkøbt fra 30 Pandex, Inc., Mundelein, IL. PCFIA blev foretaget som et kompetitivt forsøg. Latexpartiklerne (Pandex) konjugeredes med theophyllin-BSA. En konstant mængde af disse partikler blandedes med Ru(II)-forbindelse III konjugat-forsøgsopløsningen til slutkoncentrationer af anti-35 theopyllin monikonalt antistof (ascites, Hyclone katalog nr. E-3120M, forsøgsfremstilling nr. RD200) og en kon- 109 DK 173025 B1 stant mængde gede-anti-muse IgG-FITC konjugat (Pandex, katalog nr. 33-020-1 forsøgsnr. COL). Efter inkubation oparbejdedes prøverne og aflæstes på Pandex Screen Machine. Resultaterne viser, at der ikke var nogen betyden-5 de tab af aktivitet, selv efter 5 dages inkubation ved 55 *C.
EKSEMPEL 62 10 Elektrokemiluminescens af forskellige ruthenium- og osmiumforbindelser.
Elektrokemien ved forskellige osmium- og rutheniumforbin-delser måltes som 1 mM opløsninger i 10 ml nitrogen-15 gennemskyllet acettonitril med 0,1 M tetrabutylammonium tetrafluorborat som en elektrolyt. Arbejdselektroden var en platinskiveelektrode indkøbt hos Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, IN. En platintråds modelelektrode og en 1,0 mm sølvtråd anvendtes som en referen-20 ceelektrode. Målingerne blev foretaget ved at scanne fra -2,2 til +2,2 V (vs SCE) med en scanningshastighed på 100 mV/sekund. Efter hver elektrokemisk måling bestemtes spændingsforskellingen mellem en mættet Calomel referenceelektrode (SCE) og sølvtråden. Således er de an-25 givne værdier korrigeret til spænding over for SCE.
Elektrokemiluminescens (ECL) målinger blev foretaget i 0,5 ml vandige opløsninger indeholdende 0,1 M phosphate-citratpuffer (pH 4,2), 25 mM oxalsyre og 1 % Triton X-30 100. Det anvendte elektrodesystem bestod af 2 platingaze (52 gauge) elektroder forbundet til en "Radio Shack" transistorsokkel (nr. 276-548) ved en 0,1 mm platintråd. Elektroderne blev anbragt på ydersiden af et 60 mm tykt stykke celluloseacetatplast. Plasten var udformet såle-35 des, at et ca. 0,5 cm diameter hul muliggjorde, at opløs-ningerne let kunne flyde mellem arbejds og modrefe- 110 DK 173025 B1 renceelektroder. Elektroderne blev forbundet til poten-tiostaten, således at en elektrode fungerede som en ar-bejdselektrode (der var nærmere fotoforstærkerrøret) og den anden elektrode fungerede som mod- og referenceelek-5 trode. Målingerne blev foretaget ved at variere konstant fra 1,5 til 2,5 V (dobbeltspænding) med en scanningshastighed på 50 mV/sek. ECL målingerne er angivet som signal til støjforhold d.v.s. eller signal til baggrundsforhold og en given koncentration af forbindelsen. Bag-10 grunden er defineret som luminescenstællinger observeret med puffer og ingen tilsatte ECL forbindelser. Luminescensmålingerne var maximum lysafgivelsen observeret under den første eller anden lineære afsøgning.
15 Både elektrokemiluminescens (ECL) og cykliske spændingsmålinger af hver opløsning blev foretaget med enten en EG&Gf Model 273 potentiostat eller en bipotentiostat fra Ursar Scientific Instruments, Oxford, England. Photon-fluxen for hver ECL måling blev kontrolleret med et Bert-20 hold Biolumat LB95000 luminometer fra Wilebad, Vesttyskland, modificeret således, at enten et to- eller tre-elektrodesystem kunne anbringes i 0,5 ml måleopløsning.
Både elektrokemiske og elektrokemiluminescensmålingerne blev registreret på en Kipp & Zonen Model BD 91 X, Y, Y' 25 recorder fra Delft, Holland.
Fluorescensmålingerne blev foretaget med 50 mikromolær opøsninger af den ønskede forbindelse i 3,0 ml ECL opløsning, eller dersom uopløselig i ECL, opløsning i ace-30 tonitril. Målinger blev foretaget på et Perkin-Elmer LS-5 fluorescens spectrofotometer. Prescanninger af opløsningernes excitations- og emissionsspektre blev udført inden excitations- og emissionsspektrene registreredes, såeldes at emissionsspektret kunne måles, medens der be-35 stråledes ved maximum excitationsbølgelængde og omvendt, 111 DK 173025 B1 idet excitationsspektret kunne registreres, medens man kontrollerede maximumemissionsbølgelængden.
5 Forbindelse Eox Erea Fluorescens ECUS/N)1 vs. SCE emission max. & Conc.
a) Ru(biby)3 1,07 V -1,52 625 nm 1 x 10_?M
10 (2,5) b) Ru(4,4'
-COi-bipy) 3 1,19 V N.D. 628 nm 2 x lO'^M
(4,5) c) Ru (4,4 'C02
15 et-bipy) 3 1,54 V -0,89 V 636 nm 1 x 10'10H
(2,01) d) Ru(bipy)2 (C-8-theo-pyllin
20 C-4-bipy) 1,17 V N.D. 624 nm 1 x 10_!*M
(0,97) e) OS (bipy) 2 (CO) (PY) 1,82 V -0,99 V 585 nm 1 x 10-¾ 25 f) OS(DPPene) (BPY)
(bpyoxal) 1,60 V N.D. 630 nm 6 x 10'eM
(10,B) 30 1 (S/N) er signal til støjforhold, hvor signalet er defi neret som ECL output (luminescenstællinger) af en forbindelse ved en given koncentration, og støjen er luminescenstællinger af pufferen, hvori forbindelsen var opløst.
35 112 DK 173025 B1 I modsætning til ECL af de andre forbindelser, der måltes ved pH 4,2, viste forbindelsen C også signifikant ECL ved den physiologiske værdi oH 7,0.
5 a) Tris (2,21-bipyridin)-ruthenium 24 b) Tris (4,4’-carboxylat-2,2’-bipyridin-ruthenium 24 c) Tris (4,4T-carboethoxy-2,2’-bipyridin)-ruthenium 24 10 d) bis (2,2'-bipyridin) [theophyllin-8-smørsyre-4-(4-me-thyl-2,2'-bipyridin)-4’-yl)butyl)amid]ruthenium(II) dichlorid 15 e) (bis-(2,2'-bipyridin)(monocarbonyljpyridyl]osmium(II) dihexafluorphsphat f) {2,2'-bipyridin(cis-bis(1,2-diphenyphosphin)ethylen] (2 - (3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-di- 20 oxolan}2-osmium{II) dichlorid.

Claims (19)

113 DK 173025 B1
1. Elektrokemiluminescerende kompleks kendeteg-5 net ved, at komplekset er valgt blandt _ _ Z* 10 p Q^]/ (A T Cr/\ IC I' tt Crt) 20 - - 2 + «»*> / Jiti-(C"xX-CooH
25 S'>i/: (A % åp\ CrO 30 114 DK 173025 B1 - z4 5 \~0 JJL Q^V os* O^I\ CT0 io —- · - i— —2* «·*> ! i e,,^HzVBr cS/ ^ & é^/\
20 L && _ ” /~~\ ,CHj -j 2
25 V '' y. 115 DK 173025 B1 _ z* °o C S 1¾1-£W(-4‘“ i“' (R), - S i w *>-«**. c*-\ 'oCHj 10 15 Ιλ >of - *όΊ\ ^
20 L <&} 25 hvor det for formlerne I til VI gælder, at R er en anion og n er et heltal, og hvor det for formel VII gælder, at R er en anion, og m og n begge er heltal, som kan være ens eller forskellige. 30
2. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at n er 2 i hver af formlerne I, II, V og VI.
3. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 35 n er 3 i hver af formlerne III og IV. 116 DK 173025 B1
4. Kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at m er 5 og n er 3 i formel VII.
5 CH3 (CH2),-C- (CH2)n-C0-NH- (CH2)r ch3 10 hvori m, n og r hver for sig er et helt tal på 1 eller derover.
5. Biologisk forbindelse, kendetegnet ved, at den har strukturen X-Y-Z 10 hvori X betegner et eller flere nucleotider, som kan være ens eller forskellige, en eller flere aminosyrer, som kan være ens eller forskellige, et antistof, en analyt af interesse eller en analog til en analyt af interesse; 15. betegner en bindende gruppe, som indeholder mindst et carbonatom, og som er knyttet til X og Z, og Z betegner et kompleks ifølge krav 1.
6. Biologisk forbindelse, kendetegnet ved, at den har strukturen X-CH=CH-CO-NH- (CH2) n-NH-CO- (CH2)„,-Z 25 hvori X betegner et eller flere nucleutider, som kan være ens eller forskellige; Z betegner en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe, n er et helt tal på 1 eller derover, og 30. er et helt tal på 1 eller derover.
7. Biologisk forbindelse, kendetegnet ved, at den har strukturen 35 [T-Y-Z]2*(R)2 117 DK 173025 B1 hvori T er theophyllin; Y er en bindende gruppe, der knytter T til Z; Z er en bis-(2,2'-bipyridin)[4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl]ruthenium (II), og 5 R er en anion.
8. Biologisk forbindelse ifølge krav 7, kendetegnet ved, at Y er knyttet til carbonatornet i Τ’-gruppens 8-stilling. 10
9. Biologisk forbindelse ifølge krav 8, kendetegnet ved, at Y har strukturen (CH2)m-CO-NH-(CH2)n 15 hvori m og n hver for sig er et helt tal på 1 eller derover.
10. Biologisk forbindelse ifølge krav 9, kende-20 tegnet ved, at m er 3 og n er 4.
11. Biologisk forbindelse ifølge krav 9, k ende-tegnet ved, at m og n begge er 3.
12. Biologisk forbindelse ifølge krav 8, kende tegnet ved, at Y har strukturen CH3 30 (CH2) m-CH- (CH2) „-CO-NH- {CH2) r hvori m, n og r hver for sig er et helt tal på 1 eller derover.
13. Biologisk forbindelse ifølge krav 12, kende tegnet ved, at i er 1, n er 1 og r er 4. 118 DK 173025 B1
14. Biologisk forbindelse ifølge krav 8, kendetegnet ved, at Y har strukturen
15. Biologisk forbindelse ifølge krav 14, kende-15 tegnet ved, at m er 1, n er 1 og r er 4.
16. Biologisk forbindelse ifølge krav 7, kendetegnet ved, at Y er knyttet til nitrogenatomet i T-gruppens 7-stilling. 20
17. Biologisk forbindelse ifølge krav 16, kendetegnet ved, at Y har strukturen (CH2)„ 25 hvori n er et helt tal på 1 eller derover.
18. Biologisk forbindelse ifølge krav 17, kendetegnet ved, at n er 4. 30
19. Biologisk forbindelse, kendetegnet ved, at den har strukturen X-Z 35 119 DK 173025 B1 hvori X repræsenterer en eller flere aminosyrer, som kan være ens eller forskellige, idet der indgår mindst én aminosyre, som er cystein eller methionin, og 5. er bis(2,2'-bipyridin)maleimidohexonsyre-4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamid-ruthenium(II), som gennem carbon-atomet i maleimidets 3- eller 4-stilling er knyttet til en svovl-substituent i cystein eller methionin. DK 173025 B1 120 litteratruliste
DK199300162A 1986-04-30 1993-02-12 Ruthenium og osmium-komplekser til brug ved kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminiscerende analysering af multikompone DK173025B1 (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85835486A 1986-04-30 1986-04-30
US85835486 1986-04-30
US8700987 1987-04-30
PCT/US1987/000987 WO1987006706A1 (en) 1986-04-30 1987-04-30 Electrochemiluminescent assays

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK16293D0 DK16293D0 (da) 1993-02-12
DK16293A DK16293A (da) 1993-02-12
DK173025B1 true DK173025B1 (da) 1999-11-15

Family

ID=25328109

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK199300162A DK173025B1 (da) 1986-04-30 1993-02-12 Ruthenium og osmium-komplekser til brug ved kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminiscerende analysering af multikompone

Country Status (13)

Country Link
EP (3) EP0647849A3 (da)
JP (6) JPH0737464B2 (da)
KR (1) KR960016340B1 (da)
AT (2) ATE127923T1 (da)
AU (2) AU644150B2 (da)
CA (1) CA1339465C (da)
DE (2) DE3752345T2 (da)
DK (1) DK173025B1 (da)
FI (1) FI102017B1 (da)
HK (2) HK1007442A1 (da)
IL (1) IL82411A0 (da)
NO (1) NO176071C (da)
WO (1) WO1987006706A1 (da)

Families Citing this family (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6165729A (en) * 1986-04-30 2000-12-26 Hyperion Catalysis International, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
US5770459A (en) * 1986-04-30 1998-06-23 Igen International, Inc. Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence detection
US6881536B1 (en) * 1986-04-30 2005-04-19 Bioveris Corporation Particle based electrochemiluminescent assays
US6451225B1 (en) 1986-04-30 2002-09-17 Igen International, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
US5635347A (en) * 1986-04-30 1997-06-03 Igen, Inc. Rapid assays for amplification products
US6271041B1 (en) * 1986-04-30 2001-08-07 Igen International, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
US6881589B1 (en) 1987-04-30 2005-04-19 Bioveris Corporation Electrochemiluminescent localizable complexes for assay compositions
US5935779A (en) * 1988-11-03 1999-08-10 Igen International Inc. Methods for improved particle electrochemiluminescence assay
US6702986B1 (en) 1988-04-29 2004-03-09 Igen International, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
US5705402A (en) * 1988-11-03 1998-01-06 Igen International, Inc. Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets
ZA898290B (en) * 1988-11-03 1991-06-26 Igen Inc Electrochemiluminescent assays
WO1990005296A1 (en) * 1988-11-03 1990-05-17 Igen, Inc. Electrochemiluminescent reaction utilizing amine-derived reductant
US5746974A (en) * 1988-11-03 1998-05-05 Igen International, Inc. Apparatus for improved luminescence assays using particle concentration, electrochemical generation of chemiluminescence and chemiluminescence detection
US5962218A (en) * 1988-11-03 1999-10-05 Igen International Inc. Methods and apparatus for improved luminescence assays
JPH0363571A (ja) * 1989-08-02 1991-03-19 Chisso Corp 大腸菌群の検査キット
IL100866A (en) * 1991-02-06 1995-10-31 Igen Inc Luminescence test method and device based on magnetic tiny particles, containing many magnets
IL100867A (en) * 1991-02-06 1995-12-08 Igen Inc Method and device for improved luminescence testing
ZA92804B (en) 1991-02-06 1992-12-30 Igen Inc Methods and apparatus for improved luminescence assays
CA2112675C (en) * 1991-07-10 2007-03-20 Richard J. Massey Methods and apparatus for improved luminescence assays using particle concentration and chemiluminescence detection
CA2100159C (en) * 1991-11-15 2003-01-21 John R. Link Rapid assays for amplification products
ZA929351B (en) * 1991-12-11 1993-06-04 Igen Inc Electrochemiluminescent label for DNA assays.
FR2699170B1 (fr) * 1992-12-15 1995-07-28 Asulab Sa Complexes d'un métal de transition à ligands 2,2'-bipyridine substitués par au moins un radical ammonium alkyle, leur procédé de fabrication et leur application comme médiateur redox.
US5541113A (en) * 1993-09-22 1996-07-30 Beckman Instruments, Inc. Method for detecting an analyte using an electrochemical luminescent transition metal label
ATE187732T1 (de) * 1994-07-25 2000-01-15 Roche Diagnostics Gmbh Hydrophile metallkomplexe
US6066448A (en) * 1995-03-10 2000-05-23 Meso Sclae Technologies, Llc. Multi-array, multi-specific electrochemiluminescence testing
US6319670B1 (en) 1995-05-09 2001-11-20 Meso Scale Technology Llp Methods and apparatus for improved luminescence assays using microparticles
DE69637001T2 (de) 1995-06-07 2007-12-06 Bioveris Corp. Elektrochemilumineszenz-enzymimmunoassay
JP3574457B2 (ja) * 1995-09-12 2004-10-06 エーザイ株式会社 電気化学発光検出方法と装置
US8527026B2 (en) 1997-03-04 2013-09-03 Dexcom, Inc. Device and method for determining analyte levels
US6001067A (en) 1997-03-04 1999-12-14 Shults; Mark C. Device and method for determining analyte levels
US7192450B2 (en) 2003-05-21 2007-03-20 Dexcom, Inc. Porous membranes for use with implantable devices
US6862465B2 (en) 1997-03-04 2005-03-01 Dexcom, Inc. Device and method for determining analyte levels
US6613583B1 (en) 1997-06-27 2003-09-02 Igen International, Inc. Electrochemiluminescent label based on multimetallic assemblies
DE19803528A1 (de) 1998-01-30 1999-08-05 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Analyse einer Probe mittels eines Elektrochemolumineszenz-Bindungsreaktion-Tests
DE19811582A1 (de) * 1998-03-17 1999-09-23 Roche Diagnostics Gmbh Stabilisierung und Verstärkung von Elektrochemilumineszenz-Signalen
DE19828441A1 (de) * 1998-06-25 1999-12-30 Roche Diagnostics Gmbh Verwendung derivatisierter Reagenzien in Chemilumineszenz- und Elektrochemilumineszenz-Nachweisverfahren
US6312896B1 (en) 1998-09-17 2001-11-06 Igen Inaternational, Inc. Assays for measuring nucleic acid binding proteins and enzyme activities
US6214552B1 (en) 1998-09-17 2001-04-10 Igen International, Inc. Assays for measuring nucleic acid damaging activities
US7041807B1 (en) 1999-06-23 2006-05-09 Caprion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to a YYX epitope of a mammalian prion protein
CA2764307C (en) 2001-06-29 2015-03-03 Meso Scale Technologies, Llc. Assay plates, reader systems and methods for luminescence test measurements
US20030032874A1 (en) 2001-07-27 2003-02-13 Dexcom, Inc. Sensor head for use with implantable devices
ATE471369T1 (de) 2001-07-30 2010-07-15 Meso Scale Technologies Llc Assay-elektroden mit schichten aus immobilisiertem lipid/protein sowie verfahren zu deren herstellung und verwendung
EP1436598B1 (en) 2001-09-10 2013-11-27 Meso Scale Technologies LLC Assay buffer, compositions containing the same, and methods of using the same
US8260393B2 (en) 2003-07-25 2012-09-04 Dexcom, Inc. Systems and methods for replacing signal data artifacts in a glucose sensor data stream
US8010174B2 (en) 2003-08-22 2011-08-30 Dexcom, Inc. Systems and methods for replacing signal artifacts in a glucose sensor data stream
US9282925B2 (en) 2002-02-12 2016-03-15 Dexcom, Inc. Systems and methods for replacing signal artifacts in a glucose sensor data stream
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
US20040072236A1 (en) 2002-09-27 2004-04-15 Neil Cashman PrPSc -interacting molecules and uses thereof
US8423113B2 (en) 2003-07-25 2013-04-16 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US8282549B2 (en) 2003-12-09 2012-10-09 Dexcom, Inc. Signal processing for continuous analyte sensor
US8676287B2 (en) 2003-08-01 2014-03-18 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US8160669B2 (en) 2003-08-01 2012-04-17 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US20190357827A1 (en) 2003-08-01 2019-11-28 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7774145B2 (en) 2003-08-01 2010-08-10 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US8369919B2 (en) 2003-08-01 2013-02-05 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US8275437B2 (en) 2003-08-01 2012-09-25 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US7591801B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Dexcom, Inc. Integrated delivery device for continuous glucose sensor
US8761856B2 (en) 2003-08-01 2014-06-24 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US8060173B2 (en) 2003-08-01 2011-11-15 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US7925321B2 (en) 2003-08-01 2011-04-12 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
US8233959B2 (en) 2003-08-22 2012-07-31 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing analyte sensor data
US20140121989A1 (en) 2003-08-22 2014-05-01 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing analyte sensor data
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
WO2005051170A2 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Dexcom, Inc. Integrated receiver for continuous analyte sensor
US8423114B2 (en) 2006-10-04 2013-04-16 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
DE602004029092D1 (de) 2003-12-05 2010-10-21 Dexcom Inc Kalibrationsmethoden für einen kontinuierlich arbeitenden analytsensor
US8532730B2 (en) 2006-10-04 2013-09-10 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US11633133B2 (en) 2003-12-05 2023-04-25 Dexcom, Inc. Dual electrode system for a continuous analyte sensor
US8364231B2 (en) 2006-10-04 2013-01-29 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8808228B2 (en) 2004-02-26 2014-08-19 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
ITTO20040372A1 (it) * 2004-06-01 2004-09-01 Giuseppe Caputo Composti luminescenti aventi un braccio di legame funzionalizzato.
KR101076578B1 (ko) 2004-06-23 2011-10-24 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 2입자 착물을 이용한 생물학적 분자의 검출을 위한 방법 및조성물
US8452368B2 (en) 2004-07-13 2013-05-28 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
WO2006127694A2 (en) 2004-07-13 2006-11-30 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8886272B2 (en) 2004-07-13 2014-11-11 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US7946984B2 (en) 2004-07-13 2011-05-24 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
JPWO2006038686A1 (ja) * 2004-10-07 2008-05-15 松下電器産業株式会社 遺伝子検出方法、及び遺伝子検出装置
EP1893990B1 (en) 2005-06-03 2018-05-02 Board of Regents of the University of Texas System Electrochemistry and electrogenerated chemiluminescence with a single faradaic electrode
JPWO2007055302A1 (ja) * 2005-11-10 2009-04-30 国立大学法人富山大学 生体物質と生体物質結合性物質との結合性評価方法
WO2008154312A1 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Dexcom, Inc. Integrated medicament delivery device for use with continuous analyte sensor
US9452258B2 (en) 2007-10-09 2016-09-27 Dexcom, Inc. Integrated insulin delivery system with continuous glucose sensor
CA2705848C (en) * 2007-11-21 2016-02-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Photoluminescent metal complexes for protein staining
WO2009105709A1 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing, transmitting and displaying sensor data
ES2457541T3 (es) 2008-04-11 2014-04-28 Board Of Regents Of The University Of Texas System Método y aparato para la amplificación de la quimioluminiscencia electrogenerada por nanopartículas
AU2014203680B2 (en) * 2008-05-08 2015-03-05 Board Of Regents Of The University Of Texas System Luminescent nanostructured materials for use in electrogenerated chemiluminescence
ES2644997T3 (es) 2008-05-08 2017-12-01 Board Of Regents Of The University Of Texas System Materiales nanoestructurados luminiscentes para su uso en quimioluminiscencia electrogenerada
US8264347B2 (en) 2008-06-24 2012-09-11 Trelleborg Sealing Solutions Us, Inc. Seal system in situ lifetime measurement
FR2939895B1 (fr) * 2008-12-15 2011-01-14 Commissariat Energie Atomique Procede de detection non intrusive d'element chimique
EP3925533B1 (en) 2009-04-30 2024-04-10 DexCom, Inc. Performance reports associated with continuous sensor data from multiple analysis time periods
WO2012005588A2 (en) 2010-07-07 2012-01-12 Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patiëntenzorg Novel biomarkers for detecting neuronal loss
CA2822902C (en) * 2011-02-09 2019-04-30 F. Hoffmann-La Roche Ag New iridium-based complexes for ecl
DK3575796T3 (da) 2011-04-15 2021-01-18 Dexcom Inc Avanceret analytsensorkalibrering og fejldetektion
AU2012273121B2 (en) 2011-06-19 2016-08-25 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
BR112014000219B8 (pt) * 2011-07-07 2022-12-06 Dupont Nutrition Biosci Aps Dispositivo de ensaio para detecção de enzima ativa, método de determinação da presença de enzima ativa e kit
US9213043B2 (en) 2012-05-15 2015-12-15 Wellstat Diagnostics, Llc Clinical diagnostic system including instrument and cartridge
US9625465B2 (en) 2012-05-15 2017-04-18 Defined Diagnostics, Llc Clinical diagnostic systems
US9075042B2 (en) 2012-05-15 2015-07-07 Wellstat Diagnostics, Llc Diagnostic systems and cartridges
ES2602206T3 (es) 2012-08-02 2017-02-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Nuevos complejos de bis-iridio para la elaboración de marcajes EQL
DK2968424T3 (da) 2013-03-13 2020-03-30 Geneweave Biosciences Inc Ikke-replikative transduktionspartikler og transduktionspartikelbaserede reportersystemer
US9481903B2 (en) 2013-03-13 2016-11-01 Roche Molecular Systems, Inc. Systems and methods for detection of cells using engineered transduction particles
US9540675B2 (en) 2013-10-29 2017-01-10 GeneWeave Biosciences, Inc. Reagent cartridge and methods for detection of cells
EP3129482B1 (en) * 2014-04-10 2021-12-15 DNA Genotek Inc. Method and system for microbial lysis using periodates
WO2016091755A1 (en) 2014-12-08 2016-06-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for measurement of vitamin d
BR112018001956A2 (pt) 2015-08-20 2018-09-11 Hoffmann La Roche ?método de medição de analitos e kit?
US10351893B2 (en) 2015-10-05 2019-07-16 GeneWeave Biosciences, Inc. Reagent cartridge for detection of cells
CN108780092A (zh) 2016-03-07 2018-11-09 豪夫迈·罗氏有限公司 抗p53抗体的检测
CN108698047B (zh) 2016-03-11 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 电化学发光检测中的支链胺
EP3577460B1 (en) 2017-02-02 2021-01-20 Roche Diagnostics GmbH Immunoassay using at least two pegylated analyte-specific binding agents
US11077444B2 (en) 2017-05-23 2021-08-03 Roche Molecular Systems, Inc. Packaging for a molecular diagnostic cartridge
US20190120785A1 (en) 2017-10-24 2019-04-25 Dexcom, Inc. Pre-connected analyte sensors
US11331022B2 (en) 2017-10-24 2022-05-17 Dexcom, Inc. Pre-connected analyte sensors
WO2019201901A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel anti-thymidine kinase antibodies
WO2019223691A1 (zh) * 2018-05-21 2019-11-28 博阳生物科技（上海）有限公司 一种化学发光分析测定方法及使用该方法的系统、试剂盒
EP3844503A1 (en) 2018-08-31 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Thymidine kinase (tk-1) in prognostic indices for dlbcl
CN114144673A (zh) 2019-07-22 2022-03-04 豪夫迈·罗氏有限公司 S100a8作为血液生物标志物用于子宫内膜异位症的非侵入性诊断
BR112022001140A2 (pt) 2019-07-22 2022-03-15 Hoffmann La Roche Métodos para avaliar se um paciente tem endometriose ou está em risco de desenvolver endometriose, selecionar um paciente para terapia e monitorar um paciente que sofre de endometriose ou que está sendo tratado para endometriose
BR112022000172A2 (pt) 2019-07-22 2022-02-22 Hoffmann La Roche Métodos para avaliar se uma paciente tem endometriose, para selecionar uma paciente para terapia e para monitorar uma paciente
WO2021013781A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Substance p as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
WO2021013786A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag S100a6 as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
CN114728984A (zh) 2019-11-15 2022-07-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于患者样品中质谱测量的β-内酰胺类抗生素的衍生化
US20220057362A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Meso Scale Technologies, Llc Auxiliary Electrodes and Methods for Using and Manufacturing the Same
CN116829951A (zh) 2020-11-02 2023-09-29 豪夫迈·罗氏有限公司 SARS-CoV-2核衣壳抗体
WO2022207628A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Scf as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of endometriosis
CN117099001A (zh) 2021-04-01 2023-11-21 豪夫迈·罗氏有限公司 Psp94作为血液生物标志物用于子宫内膜异位症的非侵入性诊断
EP4341700A1 (en) 2021-05-17 2024-03-27 F. Hoffmann-La Roche AG Sfrp4 as blood biomarker for the non-invasive diagnosis of adenomyosis
TW202340716A (zh) 2021-08-13 2023-10-16 美商梅梭刻度技術公司 電化學電池裝置及製造方法
WO2023072904A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Monoclonal antibodies specific for sars-cov-2 rbd
US20230213476A1 (en) 2022-01-04 2023-07-06 Meso Scale Technologies, Llc. Electrochemical cell devices and methods of manufacturing
WO2023131594A1 (en) 2022-01-05 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivatization of compounds in patient samples for therapeutic drug monitoring (tdm)
WO2023247752A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for diagnosing endometriosis and for classifying the stage of endometriosis
WO2024017982A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Leukotriene a4 hydrolase (lta4h) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
WO2024017985A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Fibroblast growth factor binding protein 1 (fgfbp1) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome
WO2024017983A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Meteorin-like protein (metrnl) as (blood) biomarker for the diagnosis of polycystic ovarian syndrome

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL49685A (en) * 1976-05-31 1978-10-31 Technion Res & Dev Foundation Specific binding assay method for determining the concentration of materials and reagent means therefor
US4233144A (en) * 1979-04-16 1980-11-11 Technicon Instruments Corporation Electrode for voltammetric immunoassay
US4280815A (en) * 1979-06-18 1981-07-28 Technicon Instruments Corporation Electrochemiluminescent immunoassay and apparatus therefor
WO1981001883A1 (en) * 1979-12-19 1981-07-09 Electro Nucleonics Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry
US4293310A (en) * 1980-03-14 1981-10-06 University Of Pittsburgh Photoelectrochemical immunoassay
FI76888C (fi) * 1981-04-29 1988-12-12 Ciba Geigy Ag Nya medel och foerpackningar foer immunologiska analyser.
US4514508A (en) * 1982-07-06 1985-04-30 Biond Inc. Assaying for a multiplicity of antigens or antibodies with a detection compound
GB2135773B (en) * 1983-01-31 1985-12-04 Boots Celltech Diagnostics Enzyme inhibitor labelled immunoassay
EP0139373A1 (en) * 1983-08-26 1985-05-02 The Regents Of The University Of California Multiple immunoassay system
IL75464A (en) * 1984-06-12 1990-08-31 Orgenics Ltd Method and apparatus for multi-analyte assay
CA1340372C (en) * 1984-07-09 1999-02-02 John D. Clements Production of e. coli lt-b enterotoxin subunit
DK365785A (da) * 1984-09-17 1986-03-18 Hoffmann La Roche Metalcomplexer
US4617265A (en) * 1984-09-19 1986-10-14 Board Of Regents, University Of Texas System Colony blot assay for enterotoxigenic bacteria
US5238808A (en) * 1984-10-31 1993-08-24 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5120662A (en) * 1989-05-09 1992-06-09 Abbott Laboratories Multilayer solid phase immunoassay support and method of use

Also Published As

Publication number Publication date
NO176071C (no) 1995-01-25
EP0658564A1 (en) 1995-06-21
JPH07309836A (ja) 1995-11-28
ATE212030T1 (de) 2002-02-15
AU5754094A (en) 1994-05-12
FI102017B (fi) 1998-09-30
DK16293D0 (da) 1993-02-12
IL82411A0 (en) 1987-11-30
JPH0737464B2 (ja) 1995-04-26
JP2648474B2 (ja) 1997-08-27
JP3476679B2 (ja) 2003-12-10
JPH09118688A (ja) 1997-05-06
FI875732A (fi) 1987-12-28
AU7433891A (en) 1991-08-08
KR960016340B1 (ko) 1996-12-09
AU644150B2 (en) 1993-12-02
JP3349279B2 (ja) 2002-11-20
EP0647849A3 (en) 1996-05-15
DE3751516T2 (de) 1996-02-15
CA1339465C (en) 1997-09-16
HK1013653A1 (en) 1999-09-03
NO875476D0 (no) 1987-12-29
NO875476L (no) 1988-02-23
HK1007442A1 (en) 1999-04-09
JPH07267972A (ja) 1995-10-17
DK16293A (da) 1993-02-12
KR880701379A (ko) 1988-07-26
EP0265519A4 (en) 1990-05-14
EP0647849A2 (en) 1995-04-12
JPH11101800A (ja) 1999-04-13
AU7581687A (en) 1987-11-24
DE3752345D1 (de) 2002-02-21
EP0658564B1 (en) 2002-01-16
AU685071B2 (en) 1998-01-15
DE3751516D1 (de) 1995-10-19
NO176071B (no) 1994-10-17
JP3509812B2 (ja) 2004-03-22
AU605158B2 (en) 1991-01-10
EP0265519A1 (en) 1988-05-04
DE3752345T2 (de) 2002-08-22
JPH01500146A (ja) 1989-01-19
JP2674957B2 (ja) 1997-11-12
WO1987006706A1 (en) 1987-11-05
JP2003128689A (ja) 2003-05-08
FI875732A0 (fi) 1987-12-28
FI102017B1 (fi) 1998-09-30
ATE127923T1 (de) 1995-09-15
EP0265519B1 (en) 1995-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK173025B1 (da) Ruthenium og osmium-komplekser til brug ved kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminiscerende analysering af multikompone
US6316607B1 (en) Electrochemiluminescent assays
US6468741B1 (en) Electrochemiluminescent rhenium moieties
JP2702075B2 (ja) 発光性金属キレート標識及び検出手段
US5731147A (en) Luminescent metal chelate labels and means for detection
JP2718618B2 (ja) 電気化学的ルミネッセンス性レニウムモイエティ及びそれらの使用方法
US6916606B2 (en) Electrochemiluminescent assays
DK172940B1 (da) Fremgangsmåde til kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminescerende analysering af multikomponentvæsker
AU605158C (en) Electrochemiluminescent assays
IL110557A (en) Method for detecting the presence of analytes of interest in food samples and a kit for the detection thereof
WO1997032886A1 (en) Ecl labels having improved nsb properties

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PUP Patent expired