DK172940B1 - Fremgangsmåde til kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminescerende analysering af multikomponentvæsker - Google Patents

Description

i DK 172940 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kvalitativ og kvantitativ elektrokemiluminescerende analysering af multikomponentvæsker.

5 Der er et stadigt stigende behov for hurtige og meget _ specifikke metoder til påvisning og kvantitativ bestem melse af kemiske, biokemiske og biologiske substanser. Af , særlig stor værdi er metoder til måling af små mængder af farmaceutiske midler, metaboliter, mikroorgamisrner og 10 andre materialer af diagnostisk værdi. Som eksempler på sådanne materialer kan anføres narkotika og giftstoffer, lægemidler indgivet med terapeutiske formål for øje, hormoner, patogene mikroorganismer og vira, antistoffer, metaboliter, enzymer og nucleinsyrer.

15

Tilstedeværelsen af disse materialer kan ofte bestemmes ved bindingsmetoder, hvor man udnytter den høje grad af specificitet, som kendetegner mange biokemiske og biologiske systemer. De hyppigt anvendte metoder er eksempel-20 vis baseret på antigen-antistof-systemer, nucleinsyre-hy-bridiseringsteknikker og protein-ligand-systemer. Ved disse metoder påvises eksistensen af et kompleks af diagnostisk værdi typisk ved enten tilstedeværelse eller fravær af et observerbart "mærke", som er knyttet til ét 25 eller flere af de kompleksdannende materialer.

Den specifikke mærkningsmetode, som man vælger, vil ofte diktere anvendeligheden og alsidigheden af et bestemt system til påvisning af et materiale af interesse. Et * 30 foretrukket mærke bør være billig, sikker og i stand til at knytte sig effektivt til en lang række forskellige kemiske, biokemiske og biologiske materialer uden at ændre de vigtige bindingskarakteristika, som findes hos disse materialer. Mærket bør give et meget karakteristisk 35 signal, og der bør være tale om et mærke, som sjældent 2 DK 172940 B1 (og fortrinsvis aldrig) findes i naturen. Mærket bør være stabilt og detekterbart i vandige systemer i tidsperioder, der strækker sig over måneder. Detekteringen af mærket bør være hurtig, sensitiv og repro-5 ducerbar, uden at der stilles krav om kostbare speciali-, serede faciliteter eller særligt personale. Den kvantita tive bestemmelse af mærket skal være relativt uafhængig af sådanne variable som temperaturen og sammensætningen af den blanding, der skal analyseres. De mest 10 fordelagtige mærker er sådanne, som kan anvendes i homogene systemer, d.v.s. systemer, hvori det ikke er nødvendigt at foretage en separation af det kompleksbund-\ ne og det ikke kompleksbundne mærkede materiale. Dette er muligt, hvis mærkets detekterbarhed moduleres, når det , 15 mærkede materiale inkorporeres i et specifikt kompleks.

Man har udviklet en lang række forskellige mærker, som hver især indebærer bestemte fordele og ulemper. For . eksempel er radioaktive mærker meget alsidige, og de kan 20 påvises i meget lave koncentrationer. Imidlertid er de både kostbare og farlige at anvende, og deres anvendelse 1 kræver avanceret udstyr og specialtrænet personale.

Desuden begrænses sensitiviteten af radioaktive mærker af det faktum, at den detekterbare hændelse i sin 25 grundlæggende natur kun kan forekomme én gang for hvert af de radioaktive atomer i det mærkede materiale. Hertil kommer, at radioaktive mærker ikke kan anvendes i homogene metoder.

30 Der er således en udstrakt interesse for ikke-radioaktive mærker. Sådanne ikke-radioaktive mærker omfatter molekyler, som kan observeres spektrofotometrisk og ved spinresonans- og luminescens-teknikker, såvel som enzymer, der producerer sådanne molekyler. Blandt de 35 nyttige ikke-radioaktive mærkningsmaterialer kan nævnes t-l 3 DK 172940 B1 organometalliske forbindelser. På grund af den sjældenhed, hvormed visse metaller optræder i biologiske systemer, kan metoder, som specifikt analyserer metal-komponenten i de organometalliske forbindelser, udnyttes 5 med gode resultater. For eksempel beskriver US patentskrift nr. 4 204 952 (1980) anvendelsen af immuno- kemisk aktive materialer, som er mærket med bestemte or-^ ganometalliske forbindelser, til brug ved kvantitativ be stemmelse af specifikke antigener. Man kan anvende en 10 hvilken som helst generel metode til påvisning af de udvalgte metaller sammen med disse mærker, herunder e- mission, absorptions- og fluoresensspectroscopy, atomabsorption og neutronaktivering. Disse metoder lider i-midlertid ofte under en mangel på sensitivitet, og de kan 15 sjældent tilpasses til et homogent system, ligesom de undertiden medfører en destruktion af prøven, hvilket således er tilfældet med atomabsorption.

Af særlig interesse er mærker, som kan gøres selvlysende 20 ved hjælp af fotokemike, kemiske og elektrokemiske midler. "Fotoluminescens" er betegnelsen for en proces, hvorved et materiale bliver selvlysende, når det absorberer elektromagnetisk stråling. Fluoresens og phosphor-esens er typer af fotoluminescens. "Kemiluminescens-pro-25 cesser" indebærer, at den selvlysende specie dannes ved en kemisk energioverføring. "Elektrokemiluminescens" indebærer, at den lysenende specie dannes ad elektrokemisk vej .

^ 30 Disse luminescens-systemer er af stadig større betydning.

For eksempel beskriver US patentskrift nr. 4 372 745 (1983) en udnyttelse af kemiluminescens-mærker i forbindelse med immunokemiske anvendelser. I de beskrevne systemer anslås mærkerne til en luminescerende tilstand 35 ved hjælp af kemiske midler, eksempelvis ved at lade 4 DK 172940 B1 mærket reagere med H202 og et oxalat. I disse systemer vil H202 oxidativt omdanne oxalatet til et højenergiderivat, som derefter anslår mærket. Dette system vil i princippet virke sammen med et hvilket som helst 5 luminiserende materiale, som er stabilt under analysens . oxiderende betingelser, og som kan anslås af det højenergetiske oxalat-derivat. Uheldigvis giver selve denne alsidighed anledning til en væsentlig begrænsning af teknikken. Typiske biologiske væsker, som indeholder r 10 analysanden af interesse, indeholder nemlig også et stort * antal potentielt luminescerende substanser, som kan bevirke høje baggrundsniveauer af luminescens.

Et andet eksempel på den immunokemiske anvendelse af ke-15 miluminescens, som lider under de samme ulemper, er be- i * skrevet i US patentskrift nr. 4 280 815 (1981), som beskriver den elektrokemiske dannelse in situ af et oxidationsmiddel (eksempelvis H202) i umiddelbar nærhed af en immunoreaktant mærket med en kemiluminescerende specie.

20 Det elektrogenererede oxidationsmiddel diffunderer hen til den kemiluminescerende specie, som derved oxideres s kemisk, hvilket resulterer i en nettooverføring af en eller flere elektroner til det elektrogenererede oxidationsmiddel. Efter oxidationen udsender den kemilumine-25 scerende specie en foton. I modsætning hertil kræver den omhandlede opfindelse en direkte overføring af elektroner fra en kilde for elektrokemisk energi til en kemiluminescerende specie, som er i stand til gentagne gange at udsende fotoner.

30

Den foreliggende opfindelse angår elektrokemiluminesce-rende mærker. Egnede mærker omfatter elektroke-miluminescerende forbindelser, herunder organiske forbindelser og organometalliske forbindelser. Elektrokemilu-35 minescerende metoder til bestemmelse af tilstedeværelsen

iH

5 DK 172940 B1 af mærkede materialer foretrækkes frem for andre metoder af mange årsager. Således er de særdeles diagnostiske med hensyn til tilstedeværelsen af et bestemt mærke, og de er sensitive, ufarlige og billige, ligesom de kan anvendes 5 til en række forskellige formål. Organiske forbindelser, t. som er egnede elektrokemiske mærker, omfatter eksempelvis rubren og 9,10-diphenylantracen. Mange organometalliske i forbindelser er velegnede elektrokemiske mærker, men Ru- holdige og Os-holdige forbindelser er af særlig 10 interesse. Opfindelsen angår således en anvendelse af Ru- holdige og Os-holdige mærker, som kan påvises ved en række forskellige metoder. Disse mærker er fordelagtige af mange årsager, som vil blive uddybet nærmere i det følgende.

15

Ru-holdige og Os-holdige organometalliske forbindelser er omtalt i litteraturen. Således fremgår det af US patentskrift nr. 4 205 952, at et hvilket som helst metallisk grundstof eller en hvilken som helst kombination af 20 sådanne metalliske grundstoffer, herunder ædelmetaller fra gruppe VIII såsom Ru, vil egne sig som komponent eller komponenter i organometalliske mærker, som kan påvises ved atomabsorptionsmetoder (se patentskriftets spalte 11, linie 20). I det nævnte US patentskrift er ru-25 thenium imidlertid ikke et foretrukket metal, og osmium er ikke specifikt nævnt. Der er heller ikke angivet nogen data med hensyn til effektiviteten ved anvendelse af Ru eller Os i nogen af de omtalte metoder, og den ifølge skriftet foretrukne detekteringsmetode, nemlig a-* 30 tomabsorption, medfører en destruktion af prøven.

I US patentskrift nr. 4 293 310 (1981) beskrives anvendelsen af Ru-holdige og Os-holdige komplekser som elektrokemiske mærker for analysander i immunoanalyser. De 35 omtalte komplekser er bundet til aminogrupper på analy 6 DK 172940 B1 sanderne via en thiourinstof-binding. Skriftet foreslår også muligheden af at danne carboxylatestere imellem mærkerne og hydroxygrupperne på andre analysander.

5 Ifølge US patentskrift nr. 4 293 310 kan tilstedeværelsen af de mærkede materialer bestemmes ved en metode og et apparatur, som omfatter en udslukningsanordning og en elektrokemisk flowcelle med lysmåling. Det fotoelektro-kemisk aktive mærke vil efter fotoexitation overføre en 10 elektron til et udslukningsmolekyle. Det oxiderede mo lekyle bliver derefter reduceret med en elektron fra en af flowcellens elektroder, som holdes på et passende ] potential. Denne elektron måles som en fotostrøm. Mængden af fri mærket analysand i systemet bestemmes ud fra 15 fotostrømmens signal. Det bemærkes, at denne metode er det omvendte af elektrokemiluminescerende bestemmelse af = selvlysende materialer.

1 efterfølgende rapporter har opfinderne, Weber et al.

* 20 diskuteret de problemer, der er forbundet med at anvende denne metode til at påvise Ru-holdige mærker (1). I tabel 2 hos Weber et al. (1) er den extrapolerede detekte- : ringsgrænse for tris(bipyridyl)ruthenium(II) af størrel sesordenen 1,1 x 10'10 mol/1 under optimale betingelser.

25 Idet man forudså, at den praktiske udnyttelse af disse mærker ville medføre målinger i nærværelse af I kompleksblandinger, foretog Weber et al. en test for potentielle forstyrrelser i deres system. Tabel 3 hos Weber et al. anfører dimethylalkylaminer, EDTA, N-methyl-30 morpholin, N, Ν’-dimethylpiperazin, hydroxid, oxalat, ascorbat, urinsyre og serum som forstyrrende substanser, som sandsynligvis vil hæve den praktiske detekteringsgrænse væsentligt over værdien 1,1 x 10'10 mol/1. Disse undersøgelser blev foretaget med en simpel Ru-holdig for-35 bindelse. Der blev ikke rapporteret nogen undersøgelser DK 172940 Bl 7 vedrørende detekteringsgrænserne for komplexe substanser mærket med Ru-holdige mærker, og det blev heller ikke angivet, hvorvidt thiourinstof-bindingen imellem det mærkede materiale og mærket er stabil under de 5 betingelser, hvorunder analysen gennemføres.

De bestemte mærker, som anvendes ved fremgangsmåden ^ ifølge opfindelsen, er elektrokemiluminescerende. De kan ofte anslås til en selvlysende tilstand uden at blive o-10 xideret eller reduceret, hvilket kan gøres ved at expo-nere forbindelserne for elektromagnetisk stråling eller for en kemisk energikilde, såsom den, der frembringes af typiske oxalat-H202-systemer. Desuden kan disse forbindelsers luminescens induceres ved elektrokemiske metoder, 15 som dog indebærer en oxidation og reduktion af forbindelserne .

Der er rapporteret et omfattende arbejde med hensyn til metoder til påvisning af Ru(2,2'-bipyridin) 32* ved an-20 vendelse af fotoluminescerende, kemiluminescerende og e-lektrokemiluminescerende midler (2,3). Dette arbejde viser, at en klar orange kemiluminescens kan baseres på den vandige reaktion imellem kemisk frembragt eller elektro-genereret Ru(bpy)33t (hvor "bpy" repræsenterer en pibpyri-25 dyl-ligand) og stærke reduktionsmidler, som er opstået som mellemprodukter under oxidationen af oxalationer eller andre organiske syrer. Luminescensen kan også opnås i opløsninger i organiske opløsningsmidler og H20 ved reaktion imellem elektrogenereret eller kemisk genereret 30 Ru(bpy)^ og stærke oxidationsmidler, som er opstået under reduktionen af peroxydisulfat. En tredie mekanisme til produktion af elektrokemi luminescens ud fra Ru (bpy) 32* involverer oscillation af et elektrodepotential imellem et potential, der er tilstrækkeligt negativt til at 35 producere Ru)bpy)3*\ og et potential, der er 8 DK 172940 B1 tilstrækkeligt positivt til at producere Ru (bpy) 334 . Disse tre metoder benævnes hhv. "oxidativ reduktion", "reduktiv oxidation" og "det Ru (bpy) 334/4 regenerative system".

5 Den oxidative reduktionsmetode kan gennemføres i vand, og den frembringer en intens, effektiv og stabil luminescens, som er relativt ufølsom over for tilstedeværende oxygen eller urenheder. Denne luminescens fra Ru (bpy) 324 afhænger af tilstedeværelsen af oxalat eller salte af 10 andre organiske syrer, såsom pyruvat, lactat, malonat, tartrat og citrat, samt af de anvendte midler til oxidativ frembringelse af Ru (bpy) 334 -specier. Denne oxidation l kan gennemføres kemisk ved hjælp af stærke oxidations midler, såsom Pb02 eller et Ce(IV)-salt. Processen kan , 15 gennemføres elektrokemisk ved hjælp af et tilstrækkeligt positivt potential, som enten påtrykkes kontinuerligt eller periodevist. Som egnede elektroder til den elektrokemiske oxidation af Ru(bpy)324 kan eksempelvis nævnes ; platin, pyrolytisk grafit og glasagtigt carbon. Selv om 20 oxalatet eller et tilsvarende salt af en anden organisk ; syre forbruges under kemiluminescensen, kan man opnå en kraftig konstant kemiluminescens, som varer i mange timer, ved at sikre tilstedeværelse af et overskud af det forbrugte materiale eller ved kontinuerligt at supplere s 25 det forbrugte materiale i reaktionskammeret.

Den reduktive oxidationsmetode kan foretages i delvist vandige opløsninger, som indeholder et supplerende orga-" nisk opløsningsmiddel, f.eks. acetonitril. Denne lumine- i 30 scens afhænger af tilstedeværelsen af peroxydisulfat og af et middel, som reduktivt kan producere Ru (bpy) 3l4-spe- I cier. Reduktionen kan gennemføres kemisk ved hjælp af stærke reduktionsmidler, såsom magnesium eller andre me-! taller. Den kan også foretages elektrokemisk ved enten 35 kontinuerligt eller periodevist at påtrykke et tilstræk- 9 DK 172940 B1 keligt negativt potential. En egnet elektrode til den e-lektrokemiske reduktion af Ru(bpy)3Z* er eksempelvis en poleret elektrode af glasagtigt carbon. Ligesom ved den oxidative reduktionsmetode kan man opnå en kontinuerlig 5 intens luminescens, som varer i mange timer, ved at ind-v føre et overskud af reagenser eller ved kontinuerligt at erstatte de forbrugte reagenser i reaktionsblandingen.

Det Ru(bpy)j3‘/* regenerative system kan udøves i orga-10 niske opløsningsmidler, såsom acetonitril, eller i delvist vandige systemer ved hjælp af et pulserende elektrodepotential, som svinger imellem et potential, der er tilstrækkeligt negativt til at reducere Ru(bpy)3z*, og et potential, der er tilstrækkeligt positivt til at oxidere 15 Ru(bpy)3Zt. En egnet elektrode til et sådant regenerativt system er eksempelvis en platinelektrode. Dette system forbruger ikke kemiske reagenser, og det kan i princippet forløbe i ubegrænsende tidsperioder.

20 Disse tre metoder til at frembringe luminescerende Ru-holdige forbindelser har den gentagne oxidation/reduktion eller reduktion/oxidation af den Ru-holdige forbindelse til fælles. Luminescensen af opløsninger, der indeholder disse forbindelser, afhænger derfor i høj grad af det 25 elektriske potential af den påtrykte energikilde, og luminescensen er derfor særdeles diagnostiserende med hensyn til tilstedeværelsen af den Ru-holdige forbindelse .

30 I US patentskrift nr. 4 372 745 citeres Curtis et al. (4) som et muligt mærke til anvendelse i forbindelse med kemi luminescens. Curtis et al. rapporterer kun ikke-publicerede observationer gående ud på, at Ru-komplekser kan induceres til at udsende lys, når de anslås kemisk af 35 et oxalat/H202-system (Curtis et al., side 350).

10 DK 172940 B1

Hverken i US patentskrift nr. 4 372 745 eller hos Curtis har man erkendt den exceptionelle anvendelighed af ruthenium- og osmium-komplekser til anvendelse i forbindelse med kemiluminescens, og man har heller ikke erkendt 5 nytten af elektrokemiluminescerende systemer. Sprintsch-nik, G. et al. (5) har beskrevet komplexer af tris-(2,2'-bipyridin)ruthenium(II) esterificeret med octadecanol eller dehydrocholesterol, og de har tilvejebragt film bestående af monolag af disse overfladeaktive komplekser.

10 Komplekserne viste sig at være fotoluminescerende. Men når filmene blev udsat for indvirkning af vand og - derefter eksponeret for lys, udviste Ru-komplekserne ikke fotoluminescens. Dette fænomen blev tilskrevet en fo-i tohydrolyse af estergrupperne i nærværelse af lys.

15

Ifølge den foreliggende opfindelse har det vist sig, at en lang række analysander af interesse og kemiske grupper, som binder sig til analysander af interesse, bekvemt kan knyttes til Ru-holdige eller Os-holdige mærker via s 20 amid- eller amin-bindinger. De mærkede materialer kan derefter bestemmes ved hjælp af en lang række forskellige midler, men de mest effektive, pålidelige og sensitive midler er fotoluminescerende, kemiluminescerende og elektrokemiluminescerende midler. Det fremgår også af 25 opfindelsen, at elektrokemiluminescerende mærker, her under Ru-holdige og Os-holdige mærker og organiske , molekyler, såsom rubren og 9,10-diphenylanthracen, i særlig høj grad er alsidige og fordelagtige. De store fordele ved at anvende disse hidtil ukendte mærkede ma-30 terialer, og de store fordele, der er knyttet til påvis- ningen af materialerne, er beskrevet i nærmere detaljer i det følgende.

I mange år har fødevareindustrien været opmærksom på 35 tilstedeværelsen af biologiske og kemiske kontaminanter, 11 DK 172940 B1 såvel i råvarer som i forarbejdede levnedsmidler. Der har været gjort mange teknologiske fremskridt i retning af at reducere forekomsten af fødevarekontaminering og udbrud af sygdomme hidrørende fra kontaminerede fødevare, men 5 der har hidtil kun været beskrevet beskedne fremskridt med henyn til udvikling af hurtige og sensitive metoder til påvisning og identifikation af fødevarekontaminanter.

* De eksisterende standardmetoder til påvisning af skadelige kontaminanter i fødevarer er generelt meget 10 tidsforbrugende, arbejdskrævende og teknisk vanskelige.

De analytiske metoder i sig selv er for størstedelens vedkommende tilstrækkeligt sensitive, men de langvarige prøvefremstillingsprocedurer, som går forud for udøvelsen af selve detekteringsmetoden, resulterer ofte i et lavt 15 udbytte af den pågældende kontaminant, således at man hyppigt møder falske negative måleresultater.

To eksempler, som tjener til at illustrere disse problemer, er de for øjeblikket anerkendte standardmetoder 20 til påvisning af tilstedeværelsen af Salmonella- og sta-fylokok-enterotoxiner i fødevarer. Påvisningen af salmonella i fødevarer involverer flere berigelsestrin som følge af den kendsgerning, at disse bakterier, når de er tilstede i fødevarer, sædvanligvis findes i lave antal, 25 ligesom de ofte er blevet subletalt skadet. Påvisningsmetoderne med hensyn til salmonelle må derfor være sensitive og muliggøre genoplivning og vækst af de skadede celler.

30 Der findes to metoder til påvisning af salmonella, som for øjeblikket anbefales af the U.S. Food and Drug Administration. Disse metoder er beskrevet i The Bacteriological Analytical Manual for Foods (1984), 6. udgave,

Association of Official Analytical Chemists, Washington, 35 DC. Den ene af disse metoder er en ren dyrkningsteknik, 12 DK 172940 B1 som involverer en forudgående berigelse, en selektiv berigelse og en selektiv udsåning, hvilken procedure kræver 4 dage, for at man kan opnå foreløbige resultater, og 5-7 dage, for at man kan opnå endelige resultater. Den anden 5 metode involverer immunofluoresens efter selektiv berigelse. Denne metode er den hurtigste, men den kan resultere i en høj forekomst af falske positive resultater som følge af problemer i retning af, at de poly-valente antisera, som anvendes i denne test, kan være 10 tværreaktive (6, 7).

Den procedure, som anbefales af The U.S. food and Drug Administration til påvisning af stafylokok-enterotoxiner i fødevarer, er også angivet i the Bacteriological Ana-15 lytical Manual for Foods (1984), 6. udgave, Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC. Denne metode involverer en koncentrering af en ekstrakt af en stor fødevareprøve, eksempelvis omkring 100 g, til et lille volumen, eksempelvis omkring 0,2 ml, hvilket gøres 20 ved hjælp af flere dialysekoncentrationstrin og en rensning af prøveekstrakten i en ionbytterkolonne med henblik på at fremstille en prøve til den såkaldte dobbelte immunodiffusionsteknik med mikropræparatglas. Denne procedure kræver generelt mere end en uge at gennemføre.

25

Man har for nyligt udviklet testmetoder, som er hurtigere at gennemføre, til påvisning af en række kontaminanter, såsom bakterier toxiner, antibiotika og pesticidrester i føderester. I mange tilfælde viser det sig imidlertid, at s 30 prøvefremstillingen forud for gennemførelse af selve t analysen er så langvarig, at den er både arbejdskrævende og tidsrøvende. Radioimmunoanalyser (RIA) og enzym-bundne ~ immunosorbent-analyser (ELISA) har bevirket en forkortelse af håndteringstiden med hensyn til selve den 35 analytiske metode, men disse metoder er stadig 13 DK 172940 B1 arbejdskrævende og langt fra simple at udøve. Endvidere er disse metoder sædvanligvis baseret på anvendelse af polyklonale antisera, som kan variere med hensyn til specificitet og sensitivitet, og som generelt kun er 5 begrænset tilgængelige til brug ved analysering ved en ^ given fødevarekontaminant. Man har udviklet ELISA-metoder til analysering af fødevareprøver, hvilke metoder gør . brug af monoklonale antistoffer i stedet for polyklonale antisera. Anvendelsen af monoklonale antistoffer i et 10 analysesystem til analysering for en given fødevarekontaminant sikrer en konstant tilførsel af et reagens, som bibringer selve testen uforandret specificitet og sensitivitet. Man har anvendt monoklonale antistoffer i ELISA-systemer med henblik på at teste for fø-15 devarekontaminanter, såsom enterotoxiner fra salmonella (8) og stafylokokkus (9) . Kommercielt tilgængelige produkter til salmonella-påvisning, som anvender EIA-metodik (Bio-Enzabead Screen Kit, Litton Bionetics) og DNA-probe-teknologi (Gene-Trak, Integrated Genetics), er tids-20 røvende og arbejdskrævende. Kommercielt tilgængelige testsystemer til påvisning af stafylokok-enterotoxiner i fødevarer, der gør brug af revers passiv latex-agglutina-tion (SET-RPLA, Denka Seiken Co.) og EIA-metodik (SET-EIA, Dr. W. Bommeli Laboratoires) lider under de samme 25 begrænsninger.

I de sidste 100 år har bakterien escherichia coli og co-liform-gruppen været hyppigt anvendt som indikatorer til overvågning af vandkvalitet og forekomst af spildevands-30 kontaminering.

De for øjeblikket anvendte detekteringsmetoder til påvisning af e. coli og/eller bakterier hørende til coliform-gruppen er baseret på egenskaberne med hensyn til syre-35 eller gasproduktion under fermenteringen af lactose. De 14 DK 172940 B1 mest udbredte metoder er en analyse baseret på det mest sandsynlige antal ("the Most Probable Number (MPN) assay") og den såkaldte menbranfiltreringstest (MF) .

Begge teknikker er godkendt af the Environmental 5 Protection Agency (EPA) og the American Public Health Association (APHA) til mikrobiologisk undersøgelse af vand og spildevand (10), ligesom de er godkendt af the ' Food and Drug Administration (FDA) til bakteriologisk undersøgelse af mælk og fødevarer (11).

I 10 MPN-metoden består i praksis af tre (12) separate analyser (10) . I den foreløbige test benyttes et ikke-selek-tivt medium, såsom laurylsulfat-tryptose (LST) væske el-. ler lactosevæske til at overvåge gasproduktionen, der 15 hidrører fra fermenteringen af lactose. Gas-positive rør underdyrkes derefter i et mere selektivt medium, nærmere bestemt "Brillant Green Lactose Bile" (BGLB) væske for coliform-arter og E. coli (EC) væske for fækale coliform-g arter, og der kontrolleres påny for gasproduktion 20 (bekræftet test). Prøver fra positive bekræftende test ninger skal testes yderligere ved udsåning på et selektivt differentielt medium, såsom Eosin-methylenblåt (EMB) agar eller Endos agar, efterfulgt af Gram-farvning og visse biokemiske testninger med henblik på korrekt at _ 25 fastslå tilstedeværelsen af indikator-bakterierne (af- ^ sluttet test). Den samlede MPN-analyse kan kræve op til 5 i dage til fuldstændig gennemførelse (5). Til rutinemæssige vandanalyser anvender de fleste laboratorier derfor kun den foreløbige og den bekræftede del af MPN-analysen, som 1 30 i øvrigt stadig kræver mellem 48 og 72 timer at gennemføre til ende. Ud over at være tidsrøvende og øko-! nomisk belastende med hensyn til materialer, har MPN-ana- lyserne ofte udvist såvel forkerte positive som forkerte negative reaktioner (15, 16, 20).

35 m 15 DK 172940 B1 HF-teknikken til bakteriologisk undersøgelse af vand blev introduceret i de tidlige 1950'ere (12). Til forskel fra MPN-analysen, som var langsommelig og tidsrøvende, kunne MF-analysen fuldendes i løbet af 234 timer, uden at der 5 var behov for yderligere bekræftelse eller kontrol. Den grundlæggende MF-procedure er følgende: Et volumen af v vandprøven, sædvanligvis 100 ml, filtreres igennem et filter med en porediameter på 0,45 pm, hvorefter vandprøven inkuberes på et sterilt underlag mættet med et 10 selektivt medium. De to medier, som anvendes hyppigst, er Endo-væsken, som er selektiv over for coliform-arter ved 35 ’C, og FC-væsken, som er selektiv for fækale coliform-arter ved 44,5 'C (10). Siden disse mediers introduktion har adskillige forskere rapporteret, at både Endo- og FC-15 væsken har en tendens til at underestimere de faktiske antal af tilstedeværende indikatorbakterier, hvilket enten skyldes mediets selektivitet eller den høje temperatur (44,5 ’C), der anvendes ved inkubationen (21, 22). Sådanne tilfælde af forkerte negative resultater har 20 vist sig med særlig stor hyppighed, når organismerne i prøven forinden er blevet subletalt skadet af miljømæssige faktorer og/eller kemikalier (17, 18). I den senere tid har EPA foreslået modifikationer til opfølgning af MF-testen ved en bekræftende procedure, 25 hvorved mindst 10 kolonier på hver filter skal kontrolleres for gasproduktion ved anvendelse af LST-væske efterfulgt af BGLB-væske ligesom i MPN-analysen (14) . Sådanne modifikationer vil ganske vist reducere forekomsten af såvel forkerte negative som forkerte 30 positive reaktioner, men de vil også forøge materialeomkostningerne, ligesom de vil tredoble MF-analysetiden fra 24 timer til 72 timer.

I 1982 indtroducerede Feng og Hartman en fluorogenanalyse 35 til bestemmelse af E. coli ved anvendelse af substratet 16 DK 172940 B1 4-methylumbelliferon-glucuronid (MUG) (13) . E. coli-celler producerede enzymet β-blucoronidase, som ville spalte substratet under frigivelse af det fluorogene 4-methylumbelliferon-radikal (19). Ved at indkorporere for-5 bindeisen MUG i LST-mediet, der benyttes ved den foreløbige test, gav et enkelt rør med LST-MUG-medium både de foreløbige data (gasproduktion) og de bekræftede data fluoresens) for fækale coliform-arter inden for 24 timer.

Selv om MUG-analysen var hurtig og simpel, var det kun 10 85-95 % af E. coli-cellerne (afhængigt af oprindelse), der producerede dette enzym, eftersom testen ikke var 100 % pålidelig. Endvidere kunne systemet ikke anvendes på coli form-gruppen.

15 For øjeblikket eksisterer der ikke nogen egnet analysemetode til påvisning og optælling af coliform-arter og fækale coliform-arter i en prøve. Udviklingen af en simpel, hurtig og pålidelig detekteringsanalyse vil derfor ikke kun nedbringe omkostninger og arbejdstid, men også i 20 høj grad forøge effektiviteten med hensyn til overvågning af vandets sundhedstilstand og med hensyn til fødevareforarbejdning og -håndtering.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til i en 25 multikomponentvæskeprøve med afmålt volumen at detektere en partikel, et molekyle eller en ion, der er tilstede i prøven i en koncentration på under ca. 10_3M svarende til en mængde på under ca. 1020 partikler, molekyler eller ioner pr. liter, hvorved man: a) bringer prøven i kontakt 30 med et reagens omfattende en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe konjugeret til en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, et prion, et viroid, et lipid, en i fedtsyre, en nucleinsyre, et polysaccharid bortset fra sukker, et protein, et lipoprotein, et lipopolysaccharid, 35 et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et 17 DK 172940 B1 hormon, et farmakologisk præparat, en tranquilizer, et bariturat, et alkaloid, et steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organometallisk molekyle 5 eller et uorganisk molekyle, der (i) kan påvirkes til at udsende elektromagnetisk stråling ved eksponering for en vis mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling, og som (ii) er i stand til at forbinde sig med 10 den pågældende analyt, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, at analyt og reagens forenes; b) eksponerer den resulterende prøve for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til gentagne gange at udsende 15 stråling, idet eksponeringen udføres under betingelser, der påvirker reagenset til at udsende elektromagnetisk stråling; og c) detekterer den således udsendte elektromagnetiske stråling, hvorved komplekset mellem analyt og reagens bestemmes, idet reagenset er mærket med 20 et detekterbart mærke, karakteriseret ved, at det detekterbare mærke er elektrokemiluminescerende.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til i en multikomponent-væskeprøve med afmålt volumen at detektere 25 en analyt, der er til stede i prøven i en koncentration på under ca. 10'3 M, hvorved man; a) bringer prøven i kontakt med et reagens, der kan påvirkes til at udsende elektromagnetisk stråling ved eksponering for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i 30 stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling; b) eksponerer den resulterende prøve for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til gentagne gange at udsende stråling, idet eksponeringen udføres under betingelser, 35 der påvirker reagenset til at udsende elektromagnetisk 18 DK 172940 B1 stråling; og c) detekterer den således udsendte elektromagnetisk stråling og derved afslører tilstedeværelsen af den pågældende analyt i prøven, 5 karakteriseret ved, at reagenset er i stand til at konkurrere med den pågældende analyt om bindingspladserne på et komplementært materiale, der normalt ikke forefindes i prøven, og med det komplementære materiale, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, 10 at den pågældende analyt og reagenset kompetitivt binder sig til det komplementære materiale.

i j Videre angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde ! til i en multikomponent-væskeprøve med afmålt volumen at 15 detektere en analyt, der er til stede i prøven, hvorved man; a) bringer prøven i kontakt med et reagens, der (i) kan bringes til at udsende elektromagnetisk stråling ved eksponering for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der kan påvirke reagenset til gentagne 20 gange at udsende stråling, og som (ii) er i stand til at forbinde sig med den pågældende analyt, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, at analyt og reagens forenes med hinanden; og b) eksponerer den resulterende prøve for en mængde elektrokemisk energi fra 25 en passende kilde, der er i stand til at bevirke at påvirke reagenset til at udsende stråling, idet eksponeringen udføres under betingelser, der påvirker reagenset til at udsende elektromagnetisk stråling; karakteriseret ved, at man c) kvantitativt bestemmer 30 mængden af den således udsendte stråling og derved kvantitativt bestemmer mængden af den pågældende analyt, der forefindes i prøven, idet reagenset (i) anvendes i en på forhånd fastlagt mængde.

35 Endelig angår den foreliggende opfindelse en =1 19 DK 172940 B1 fremgangsmåde til i en multikomponent-væskeprøve med afmålt rumfang kvantitativt at bestemme mængden af en ana-lyt, der er til stede i prøven, karakteriseret ved, at 5 man a) bringer prøven i kontakt med et reagens, der kan påvirkes til at udsende elektromagnetisk stråling ved v eksponering for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling; b) eksponerer den resulterende 10 prøve for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til gentagne gange at udsende stråling, idet eksponeringen udføres under betingelser, der bringer reagenset til at udsende elektromagnetisk stråling; og c) kvantitativt 15 bestemmer mængden af stråling udsendt på denne måde og herved kvantitativt bestemmer den pågældende analyt i prøven, karakteriseret ved, at reagenset er i stand til at konkurrere med den pågældende analyt om bindingspladserne på et komplementært materiale, der 20 normalt ikke er til stede i prøven, og med en kendt mængde af det komplementære materiale, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, at den pågældende analyt og reagenset kompetitivt binder sig til det komplementære materiale.

25

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til at påvise og identificere tilstedeværelsen af et større antal analysander af interesse i en flydende fødevare eller et flydende fødevarehomogenat. Denne fremgangsmåde 30 er karakteriseret ved, at man (a) i den flydende fødevare eller det flydende fødevarehomogenat nedsænker en del af en diagnostisk reagens-holder, som egner sig til nedsænkning i en væske eller en suspension af faste stoffer, og hvortil der er immobiliseret et antal 35 reagenser, idet hvert enkelt reagens er immobiliseret til 20 DK 172940 B1 den diagnostiske reagens-holder i adskilte, identificerbare områder og i stand til at danne et kompleks med en enkel analysand af interesse, således at det bliver muligt at danne komplekser imellem det 5 immobiliserede reagens og analyanden af interesse, (b) fjerner den diagnostiske reagens-holder fra den flydende fødevare eller det flydende fødevarehomogenat, (c) renser den diagnostiske reagens-holder med en passende renseopløsning, (d) nedsænker den del af holderen, som 10 indeholder komplekset imellem immobiliseret reagens og analysanden af interesse, i en detekteringsopløsning, som ! indeholder mindst ét detekteringsreagens, der kan danne komplekser med komplekset imellem immobiliseret reagens og analysanden af interesse, således at det bliver muligt 15 at danne komplekser imellem det immobiliserede reagens, analysanden af interesse og detekteringsreagenset, og (e) påviser tilstedeværelsen af komplekser imellem det immobiliserede reagens, analysanden af interesse og detekteringsreagenset på de identificerbare områder af 20 reagens-holderen, hvortil reagenserne er immobiliseret, hvorved man påviser og identificerer tilstedeværelsen af et større antal analysander af interesse.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere 25 et system, som er nyttigt til påvisning og identifikation af tilstedeværende enterotoxiner i en prøve. Dette system består af (a) en reagens-holder, som er forsynet med et håndtag forbundet med et overfladeareal, der er egnet til neddypning i en væske eller en suspension af faste 30 partikler, hvilket overfladeareal omfatter mindst én Z nitrocellulosemembran, hvilken membran omfatter et antal

S

I monoklonale antistoffer, som separat og adskilt fra hinanden er immobiliseret til identificerbare områder, idet hvert af de immobiliserede monoklonale antistoffer 35 er specifikt for en antigen-determinant på et af 21 DK 172940 B1 enterotoxinerne, (bl en første renseopløsning, som består af en pufferholdig vandig opløsning indeholdende et overfladeaktivt middel, (c) en detektering, som omfatter mindst ét monoklonalt antistof-enzym-konjugat, hvis mo-5 noklonale antistof er specifikt for antigen-determinanter, der er forskellige fra (men lokaliseret på) hvert enterotoxin, for hvilket de monoklonale antistoffer, som - er immobiliseret til nitrocellulosemembranen knyttet til reagens-holderen, er specifikke, (d) en anden renseopløs-10 ning, som er en pufferholdig vandig opløsning, (e) et enzym-substrat, der kan reagere med enzymet konjugeret til detekteringsopløsningens monoklonale antistof og (f) et farveløst farvereagens.

15 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ligeledes velegnet til at påvise tilstedeværelsen af mindst én bakterieart i en prøve. Denne metode består i, at man (a) indpoder prøven i mindst én beholder, som er forsynet med en åben ende, og som indeholder et egnet medium, der kan 20 understøtte væksten af bakteriearten, (b) forsyner beholderens åbning med et dæksel, idet den overflade af dækslet, som ved anbringelse på beholderen kommer i kontakt med beholderens indre, er forsynet med en overflade, som er egnet til at immobilisere i det mindste 25 en komponent af bakterien, (c) inkubere det podede medium under sådanne betingelser, at de bakterier, der er indpodet i mediet, får mulighed for at reproducere, (d) vender hver beholder på hovedet i et tilstrækkeligt langt tidsrum, således at de bakteriekomponenter, som er til 30 stede i mediet, får lejlighed til at immobilisere sig til dækslets overflade, som er i kontakt med det indre af beholderen, (e) vender beholderen med den rigtige side opad igen, (f) løsner dækslet fra beholderen, (g) bringer den overflade af dækslet, hvortil der er immobiliseret 35 bakteriekomponenter, i kontakt med et reagens, der er i 22 DK 172940 B1 stand til at danne et kompleks med de immobi liserede bakteriekomponenter under sådanne betingelser, at der opstår mulighed for dannelse af komplekser imellem immobil iserede bakteriekomponenter og reagenet, og (h) 5 detektere disse komplekser imellem reagens og immobiliserede bakteriekomponenter, hvorved man påviser tilstedeværelsen af en bakterieart i prøven.

Endelig er fremgangsmåden velegnet til at påvise til-10 stedeværelsen af coliforme bakterier i en prøve. Denne metode består i, at man (a) indpoder prøven i mindst én beholder, som har en åben ende, og som indeholder et ik-ke-selektivt lactose-medium og en omvendt Durham-flaske, {b) anbringer et dæksel, som er forsynet med en polysty-15 ren-gennemføring på den åbne ende af hver beholder (c) inkubere det podede medium i mindst 2 timer ved 37 'C, (d) bestemmer, hvorvidt der i hver enkelt beholder findes gas, som er produceret ved bakteriefermentering, indesluttet i den omvendte Durham-flaske, (e) vender de be-20 holdere, som indeholder gas i den omvendte Durham-flaske, på hovedet i et passende tidsrum, således at de coliform-bakterier, der er tilstede i mediet, kan danne coliform-polystyren-komplekser, (f) vender de omvendte beholdere opad igen, (g) løsner dækslet fra hver beholder, (h) 25 behandler polystyren-gennemføringen i hvert af de ikke-koblede dæksler med en substans, der er egnet til blokering af ikke-bundne steder, (i) behandler po-lysteren-gennemføringen i de dæksler, som er blevet behandlet med en substans, der er egnet til blokering af 30 ikke-bundne steder, med mindst ét anti-coliform-bakterie-antistof, som er mærket med en detekterbar markering og i stand til at binde sig til coliform-bakterier under sådanne betingelser, at der er mulighed for dannelse af antistof-coliform-polystyren-komplekser, og (j) påviser 35 tilstedeværelsen af antistof-coliform-polystyren-komplek- 23 DK 172940 B1 ser på polystyren-gennemføringen, hvorved man påviser tilstedeværelsen af coliform-bakterier i prøven.

Opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til 5 tegningen, hvor figur 1 er en afbildning af elektrokemi luminescensmålinger foretaget for en homogen immunoanalyse med henblik påbestemmelse af koncentrationen af et antigen i opløs-10 ning, figur 2 er en grafisk afbildning af resultaterne af en homogen ECL-theophyllin-anayse, 15 figur 3 er en grafisk afbildning af resultaterne af en homogen theophyllin-analyse i forskellige sera, idet der på figuren er anvendt følgende angivelser: 20 · = Normal sera B = Hæmolyserede sera ♦ = Lipæmiske sera □ = Icteriske sera.

25

Figur 4 er en grafisk afbildning af resultaterne af en ECL-theophylin-analyse sammenlignet med resultaterne af en theophyllin-analyse ved fluoresens-polariseering, og figuren er opdelt som følger: 30 A. Normalt sera: n = 4; hældning = 0,986; r = 1,00 B. Hæmolyserede sera: n = 3; hældning = 0,878; r = 1,00 35 C. Lipæmiske sera: n = 5; hældning = 0,872; r - 0,99 24 DK 172940 B1 D. Icteriske sera: n = 4; hældning = 2,14; r - 1,00.

Figur 5 er en grafisk afbildning af resultaterne af en 5 ECL-theophylin-analyse sammenlignet med resultaterne af en højtryksvæskechromatografisk analyse.

n = 9; hældning = 1,197; r = 0,98.

10 Figur 6 er en grafisk afbildning af moduleringen af et ECL-signal frembragt i en ECL-digoxin-iiranunoanayse.

Figur 7 er en grafisk afbilding af resultaterne af en : ECL-digoxin-immunoanalyse, idet der på figuren er anvendt 15 følgende angivelser: B = Blindprøve i · = Digoxin.

i ! 20 Figur 8 er en grafisk afbildning af det ECL-signal, der s frembringes af forskellige koncentrationer MBI 38-for- bindelse I.

figur 9 viser resultaterne af en undersøgelse af hybridi-; 25 sering/sensitivitet udført på MBI 38-forbindelse I, idet TAG = forbindelse I.

Endelig viser figur 10 resultaterne af en specifik 30 undersøgelse af MBI 38-forbindelse I.

i I nærværende bekrivelse betyder "molær" koncentrationen j af en analysand i opløsning udtrykt i mol pr. liter eller den mængde partikelformigt materiale, som er til stede i - 35 en væskeprøve, udtrykt i partikler eller enheder pr.

25 DK 172940 B1 liter. For eksempel kan 1 x 10” partikler pr. liter udtrykkes som 1 molær.

De omhandlede metoder kan gennemføres som heterogene 5 analyser, d.v.s. analyser, hvori ikke-bundet mærket reagens separeres fra bundet mærket reagens, inden det bundne mærkede reagens udsættes for elektrokemisk energi, t og som homogene analyser, d.v.s analyser, hvori ikke- bundet mærket reagens og bundet mærket reagens sammen 10 udsættes for elektrokemisk energi. I de homogene analyser ifølge opfindelsen kan den elektromagnetiske stråling, som udsendes af det bundne mærkede reagens, skelnes fra den elektromagnetiske stråling, som udsendes af det ikke-bundne mærkede reagens, enten i form af en stigning eller 15 i form af et fald i den mængde elektromagnetisk stråling, som udsendes af det bundne mærkede reagens, i sammenligning med det ikke-bundne mærkede reagens, eller som elektromagnetisk stråling med en anden bølgelængde. I en udførelsesform for den foreliggende opfindelse bliver 20 et hvilket som helst reagens, som ikke er kombineret med analysanden af interesse, således separeret fra prøven, som har været bragt i kontakt med reagenset, inden prøven udsættes for elektrokemisk energi. Ifølge en anden udførelsesform for opfindelsen bliver prøven, inden den 25 bringes i kontakt med reagenset, behandlet på en sådan måde, at man immobiliserer analysanden af interesse.

Midler til immobilisering af analysander af interesse er velkendte inden for fagområdet, og man kan f.eks. bringe prøven i kontakt med en polystyren-, nitrocellulose-30 eller nylonoverflade eller en overflade belagt med hele celler, subcellulære partikler, virustyper, prioner, viroider, lipider, fedtsyrer, nucleinsyrer, polysaccharider, glycoproteiner, · peptider, cellulære metaboliter, hormoner, farmakologiske midler, berolinge 35 midler, barbiturater, alkaloider, steroider, vitaminer, 26 DK 172940 B1 aminosyrer, sukkerarter, ikke-biologiske polymer, syntetiske organiske molekyler, organometalliske molekyler eller uorganiske molekyler. Endvidere kan analysanden af interesse være en hviken som helst af 5 disse substanser. I en af udførelsesformerne for

, opfindelsen er theophyllin den interessante analysand. I

en anden udførelsesform for opfindelsen er digoxin den interessante analysand. Ifølge endnu en udførelsesform for opfindelsen er analysanden af interesse humant 10 chorionisk gonadotropin (hCG). Desuden kan analysanden af : interesse være en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, en prion, et viroid, en nucleinsyre, et protein, et lipoprotein, et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, et hormon, et farmakologisk middel, en ikke-15 biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organometallisk molekyle eller et uorganisk molekyle, der = er til stede i prøven i en koncentration på under ca. 10' 12 molær. Endvidere kan analysanden af interesse være en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, en prion, 20 et viroid eller en nucleinsyre, der er tilstede i prøven i en koncentration på under ca. 10-15 molær.

I en udførelsesform for opfindelsen er reagenset en elektrokemiluminescerende gruppe konjugeret til et 25 antistof, et antigen, en nucleinsyre, et hapen, en ligand ^ eller et enzym.

Den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe kan være en metalholdig organisk forbindelse, hvori metallet er valgt 30 blandt ruthenium, osmium, thenium, iridium, rhodium, platin, palladium, molybden og technetium. Ifølge en udførelsesform for opfindelsen er metallet ruthenium eller osmium. Ifølge en anden udførelsesforro for opfindelsen er den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe 35 rubren eller 9,10-diphenylanthracen. Den elektrokemilu minescerende kemiske gruppe kan også være bis[(4,4'-car- 27 DK 172940 B1 bomethoxy)-2,2'-bipyridin] 2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin- 4-yl)propyl]-1,3-dioxolanruthenium (IT), bis (2,2'-bipyridin) [4-(butan-l-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin] ruthenium (II), ffbis (2,21-bipyridin) [4-(4’-methyl- 5 2,2'-bipyridin-4-'yl) smørsyre] ruthenium (II), (2,2- bifpyridin)[cis-bis(1,2-diphenylphosphino)ethylen](2-[3-(4-me thyl-2,2’-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-dioxolan}-^ osmium (II), bis (2,2'-bipyridin) [4-(4'-methyl- 2, 2'bipyridin) -butylamin] ruthenium (II), bis(2,2'-10 bipyridin)[l-brom-4(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan] ruthenium (II) eller bis(2,2'-bipyridin)maleimido-hexansyre-4-methyl-2,2'-bipyridin-4' -butylamid-ruthenium (II) .

15 Prøven kan være udvundet fra et fast stof, en emulsion, en suspension, væske eller gas. Endvidere kan prøven være afledt af vand, fødevarer, blod, serum, urin, afføring, væv, spyt, olier, organiske opløsningsmidler eller luft. Endvidere kan prøven indeholde acetonitril, 20 dimethylsulfoxid, dimethylformamid, n-methylpyrrolidinon eller tert-butanol. Prøven kan også omfatte et reducerende middel eller et oxiderende middel.

Som nævnt angår opfindelsen også en fremgangsmåde, 25 hvormed man i et på forhånd bestemt volumen af en multikomponentvæske kan påvise en analysand af interesse, som er til stede i prøven i en koncentration på under ca.

10'3 molær.

30 Reagenset til dette formål kan være selve analysanden af interesse, som er konjugeret til en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe, eller en analog til analysanden af interesse, som er konjugeret til en elektrokemiluminescerende gruppe. Endvidere kan 35 analysanden af interesse være theophylin, digoxin eller hCG. Den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe kan 28 DK 172940 B1 også være bist(4,4'-carbomethoxy)2,2'-bipyridin]2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolan-ruthenium (II), bis(2,2'-bipyridin)[butan-1-al)-4'-methyl-2,2'- bipyidin)ruthenium (II), bis (2,2'-bipyridin) [4-(4-5 methyl]-2,2' -bipyridin-4'-yl)-smørsyre] ruthenium (II), (2,2'-bipyridin)[cis-bis(1,2-diphenylphosphino)ethy-len](2-[3-4-methyl-2/2,-bipyridin-4'-yl)propyl]-l,3-dioxolan)osmium (II), bis(2,2'-bipyridin) [4-(4'-methyl-2, 2'-bipyridin)-butylamin] ruthenium (II), bis (2,2'-10 bipyridin)[l-brom-4(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butan] ruthenium (II) eller bis (2,2'-bipyridin)maleimido-hexansyre-4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-butylamid-ruthenium (II).

15 Det komplimentaere materiale kan være en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, en prion, et viroid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et polysaccharid, et protein, et lipoprotein et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et 20 hormon, et farmakologisk middel, et beroligende middel, et barbiturat, et steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organometallisk molekyle eller et ; uorganisk molekyle.

! 25

Det falder inden for opfindelsens rammer, at de omhandlede fremgangsmåder kan gennemføres på en sådan måde, at man kvantitativt bestemmer en analysand af interesse.

30 I Denne metode kan gennemføres som en heterogen analyse eller som en homogen analyse. I en af de foretrukne udførelsesformer bliver ethvert reagens, som ikke kombineres med analysanden af interesse, separeret fra 1 35 prøven, som har været i kontakt med en kendt mængde af reagenset, inden prøven udsættes for elektrokemisk energi 29 DK 172940 B1 fra en egnet energikilde, som på effektiv måde kan bringe reagenset til vedvarende at udsende stråling. Ifølge en anden udførelsesform behandler man prøven, inden man bringer den i kontakt med reagenset, således at man 5 immobiliserer analysanden af interesse.

Analysanden af interesse kan være en hel celle, en . subcellulær partikel, et virus, en prion, et viroid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et polysaccharid, et 10 protein, et lipoprotein, et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et hormon, et farmakologisk middel, et beroligende middel, et barbiturat, et alkalodi, et steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et 15 syntetisk organisk molekyle, et organometallisk molekyle eller et uorganisk molekyle. I en udførelsesform for opfindelsen er analysanden af interesse theophyllin.

Ifølge en anden udførelsesform er analysanden af interesse digoxin. Analysanden af interesse kan også være 20 hCG.

Reagenset, hvormed prøven bringes i kontakt, kan være en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe konjugeret til en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, en prion, 25 et viroid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et polysaccharid, et protein, et lipoprotein, et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et hormon, et farmakologisk middel, et beroligende middel, et barbiturat, et alkaloid, et 30 steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organometallisk molekyle eller et uorganisk molekyle.

Ifølge en foretrukken udførelsesform for opfindelsen er 35 reagenset en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe konjugeet til et antistof, et antigen, en nucleinsyre, en 30 DK 172940 B1 ligand eller et enzym eller hapten, biotin, avidin eller streptvidin.

Den eletrokemiluminescerende gruppe kan være en 5 metalholdig organisk forbindelse, hvori metallet er valgt blandt ruthenium, osmium, rhenium, iridium, rhodium, platin, palladium, molybdæn og technetium. Det foretrækkes, at metallet er ruthenium eller osmium.

Ifølge en anden foretrukken udførelsesform er den 10 elektrokemiluminescerende kemiske gruppe rubren eller 9, 10-diphenylanthracen. Den elektrokemiluminescerende I kemiske gruppe kan også være bis[(4,4'-carbomethoxy)- 2,2'bipyridin] 2-[3-(4-methyl-2, 2' -bipyridin-4-yl)propyl ]-1,3-dioxolanruthenium (II), bis(2,2' -bipyridin)[4-15 (butan-l-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium (II), bis (2,2'-bipyridin) [4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)smørsyre] ruthenium (II), (2,2'-bipyridin)[cis-bis(1,2- diphenylphosphino) ethylen](2-[3-(4-methyl-2,2'bipyridin- 4'-yl)propyl]-1,3 dioxolan)osmium (II), bis(2,2- 3 20 bipyridin) (4-(4' -methyl- " 2,2’-bipyridin)-butylamin]- ruthenium (II), bis(2,2'-bi- pyridin)[l-brom-4(4’-methyl-2,2’-fbipyrldin-4-yl)butan] ruthenium (II) eller bis(2,2’-bipyridin)maleimidohexan-! syre, 4-methyll-2,2’-bipyridin-41-butylamid-ruthenium j 25 (II).

H

] Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes også en fremgangsmåde til at påvise og Identificere tilstedeværelsen af et større antalanalysander af interesse i fly-20 dende fødevarer eller fødevarehomogenater. Analysanderne af interesse kan I dette tilfælde være mikroorganismer.

Disse mikroorganismer kan være levedygtige eller ikke-levedygtige. Nærmere bestemt kan der være tale om bakterier. Som eksempler på bakterier, som kan påvises ved den omhandlede metode, kan nævnes salmonella, Campylobacter, 35 escherichia, yersinia, bacillus, vibrio, legionella, clo- 31 DK 172940 B1 stridium, streptokok og stafylokok. Metoden er ikke begrænset til disse bakterier.

Analysandeme af interesse kan også være antigener, så-5 danne antigener omfatter (men er ikke begrænset til) en-terotoxiner og aflatoxiner.

De immobiliserede reagenser og påvisningsreagenserne kan være polyclonale antistoffer, monoklonale antistoffer, 10 blandinger af monoklonale antistoffer eller blandinger af polyclonale og monoklonale antistoffer.

Påvisningsreagenserne kan være mærket med en detekterbar markering. Ifølge en udførelsesform for opfindelsen er 15 påvisningsreagenserne hver især mærket med den samme de-tekterbare markering. Sådanne markeringer er velkendte inden for fagområdet, og der kan være tale om et enzym, f.eks. alkalinsk phosphatase, pebberrodperoxidase, gluco-seoxidase, Æ-galactosidase eller urease, en fluoriserende 20 gruppe, f.eks. fluorescein-isothiocyanat, tetramethyl-rhodamin-isothiocyanat, dichlortriazinylamino-fluorescein eller "Texas Red", eller en kemiluminescerende gruppe f.eks. luminol, isoluminol eller en acridiniumester. Desuden kan den detekterbare markering være en elektrokemi-25 lumineseerende kemisk gruppe, som kan induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling, når den eksponeres for elektrokemisk energi fra en egnet energikilde i mængder, som kan inducere strålingen. Denne elektrokemi lumine see rende kemiske gruppe kan være ruthenium 30 eller osmium.

De immobiliserede reagenser kan være immobiliseret til en nitrocellulosemembran, som er fastgjort til reagens-holderen. Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende 35 eksempler.

5 EKSEMPEL 1 32 DK 172940 B1

Elektrokemiluminescens i forskellige organiske opløsningsmidler.

Elektrokemiliminescensen af tris (2/2,-bipyridyl) ruthenium (II) clorid, hexahydrat blev målt i en 15 ml trehalset, rundbundet kolbe, der Indeholdt 10 ml af en opsøsning fremstillet som beskrevet nedenfor, en magnet-10 omrører med dimensionerne 1,5 x 10 mm, en kvasi-reference elektrode fremstillet af sølvtråd med en diameter på 1,0 mm, en kombineret modeleektrode fremstillet af 0,35 mm platintråd og en driftselektrode bestående af en 0,7 mm ' platintråd fastloddet til et kvardratisk stykke (lxl 15 cm) 0,1 mm tyk højglanspoleret platinfolie (drifselek-troden af platinfolie var udformet som en halvcirkel med en diameter på 0,48 cm, som ækvidistant omgav modelek-i troden af 0,35 mm platintråd med en afstand på omkring 0,24 cm).

20 Sølvtråden blev forbundet til EG&G Model 178 elektrome-tersonden hørende til en EG&G Model 173 potentiostat/ galvanostat. Modelektroden af platintråd og driftselektroden af platinfolie blev forbundet med hhv. anoden og I 25 katoden på den anvendte EG&G Model 173 potentiostat. An- j ordningen blev jordforbundet.

Cyklisk voltammetri blev udført med EG&G Model 173 poten-tiostaten, hvortil der var forbundet en EG&G Model 175 30 universal programmeringsenhed. Programmeringsenheden blev Indstillet til udsving på 100 mV/sek. Imellem et ano-j depotential på +1,75 V og et katodepotential på -1,80 V.

Elektrokemiluminescensen blev målt ved hjælp af et Hamamatsu R928 fotoforstærkerrør anbragt Inden i et ka-35 binet af mærket "Products for Research" Model PR1402RF til fotoforstærkerrør, som var forsynet med et Kodak nr.

23 A gelatine (rødt) filter. Fotoforstærkerrørets kabinet 33 DK 172940 B1 var forbundet til et Oriel Model 7070 fotoforstærkerde-tekteringssystem. Det cykliske voltamogram blev optaget på et Houston Instruments Model 200 X-Y registrerings-apparat .

5

Der frembragtes cykliske voltamogrammer for 1 mM tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat (Aid-rich Chemical Company) og 0,1 M tetrabutylammonium-tetra-fluorborat TBABF^) (Aldrich Chemical Company) i opløs-10 ninger fremtillet med de følgende organiske opløsningsmidler: acetonitril, N, N-dimethylformamid, dime- thylsulfoxid og 1-raethyl,-2-pyrrolidinon (Aldrich Chemical Company). Man benyttede også t-butanol og deioniseret destilleret vand (1:1 v/v) til at fremstille en opløsning 15 indeholdende 2 mM tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat og 0,10 M TBABF^. De resulterende voltamogrammer indicerede ikke nogen ændringer I redox-potentialet af tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat ved variation af det organiske opløsnings-20 middel.

Med henblik på en visuel bestemmelse af elektrokemiluminescensen fremstillede man opløsninger som følger: tilstrækkelige mængder af tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium 25 (II) chlorid-hexahydrat og TBABF4 blev opløst i de ovenfor beskrevne organiske opløsningsmidler af spektrosko-pisk kvalitet (Aldrich Chemical Company) til opnåelse af slutkoncentrationer på hhv. 1 mM og 0,1 M. Derefter satte man 10 ml af den resulterende opløsning til den trehal-30 sede, rundbundede kolbe med vulumen 15 ml. Elektroderne blev neddyppet i opløsningen, og driftselektroden blev påtrykt et pulserende potential på mellem +1,75 og -1,45 V for at frembringe elektrokemiluminescens. I hver af de ovenfor beskrevne opløsninger blev elektrokemiluminisen-35 sen observeret visuelt.

Til kvantitative bestemmelser af den Indvirkning, som en 34 DK 172940 B1 ændring af opløsningsmidlet havde på elektrokemiluminescensen, fremstillede man opløsninger som følger: tii stækkelige mængder tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat og TBABF^ blev sat til de ovenfor be-5 skrevne orgniske opsøsningsmldler til opnåelse af slut-; koncentrationer på hhv. 2 mM og 0,2 M. til en prøve af denne opløsning sattes et tilsvarende vulumen deionise-ret, destilleret vand, der indeholdt et stærkt oxiderende ammoniumpersulfat, til en koncentration på 36 mM. Der 10 fremstilledes også kontrolopløsninger, som ikke indeholdt tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) chlorid-hexahydrat.

Derefter anbragtes 10 ml af den resulterende opløsning i den trehalsede, rundbundede kolbe med vulumen 15 ml. Elektrokemiluminescensen blev frembragt ved at pulsere 15 katodepotentialet i intervaller på 1 sek. imellem O og -2,0 V.

Elektrokemiluminescensmålingerne blev foretaget ved at integrere det resulterende signal fra fotoforstærkerrøret 20 ved anvendelse af en integrator forbundet til et Micronta - Model 22191 digital multimeter. Signalet blev Integreret i 10 sek. under pulseringen, og resultatet blev registreret i mV. Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel I, og de antyder, at man ved at variere opløsningsmidlet a 25 påvirker ruthenium (II) choridets kvanteeffektivitet.

4 i 30 35 *

S

TABEL I

35 DK 172940 B1

Organisk Tris-RuBiPy 5 Opløsningsmiddel (1Q~^M) Kontrol Δ

Acetonitril 2540* 104 2436

Tert-butanol 1280 0 1280 10 N, N-dimethyl- formamid 2390 143 2247

Dimethylsulfoxid 2760 29 2731 15 1-methyl 1-2- pyrrolidinon 1630 0 1630 * alle målinger er i millivolt.

20 EKSEMPEL 2

Sensitivitet af detekteringen af elektrokemiluminescensen af ruthenium-mærket anti-museimmunoglobulin G (IgG) anti-25 stof fra kaniner.

Elektrokemiluminneensen af anti-muse-IgG-antistof fra kaniner mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,21-bipyridyl-bis(2,21-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket ka-30 nin-anti-muse-IgG-antistof) blev målt i en 15 ml tre-halset, rundbundet kolbe indeholdende 10 ml af en opløsning fremstillet som beskrevet nedenfor, et magnetisk omrører legeme med dimensionerne 1,5 x 10 mm, en kvasi-referenceelektrode fremstillet af 1,0 mm sølvtråd, en 35 kombineret modelektrode fremstillet af 0,35 mm platintråd og en driftselektrode bestående af 0,7 mm platintråd fastloddet til et kvardratisk (lxl cm) stykke højglans- 36 DK 172940 B1 poleret platinfolie med en tykkelse på 0,1 nun (driftselektroden af platinfolie var formet som en halvcirkel med en diameter på omkring 0,48 cm, som ækvidistant omgav platintråden med diameter 0,35 mm i en afstand fra denne 5 på ca. 0,24 cm).

Sølvtråden blev forbundet til EG&G Model 178 elektrome-tersonden hørende til en EG&G Model 173 potentiostat/ galvanostat. Modelektroden af platintråd og driftselek-10 troden af platin blev forbundet med hhv. anoden og katoden i en EG&G Model 173 potentiostat. Anordningen blev jordforbundet.

Elektrokemiluminescensen, som blev udsendt fra den rut-15 henium-mærkede opløsningen af kanin-anti-muse-IgG-anti- stof, blev målt ved hjælp af et Hamamatsu R928 fotofor-stærkerrør anbragt inden i et kabinet af mærket "Products for Research" Model PR1402RF til fotoforstærkerrør, som var forsynet med et Kodak nr. 23 A gelatine (rødt) fil-20 ter. Kabinettet til fotoforstærkerrøret var forbundet til et Oriel Model 7070 fotoforstærkerdetekteringssystem.

Elektrokemiluminescensen blev induceret ved at pulsere et katodepotential mellem 0 og -2,0 V i intervaller på 1 25 sek. Målingerne af elektrokemiluminescensen blev foretaget ved at integrere det resulterende signal fra foto-forstærkerrøret ved hjælp af en integrator forbundet til et Micronta Model 22191 digital multimeter. Elektrokemi-lumlnescenssignalet blev integreret i 10 sek. under pul-30 seringen, og resultatet blev registreret i millivolt.

-7 j Man fremstillede en stamopløsning af 1,25 x 10 M ruthe- nium-mærket anti-muse-IgG-antistof fra kaniner ud fra en koncentreret opløsning (2 mg/ml, 7,5 Ru/antistof) af det i -i 35 mærkede antistof ved fortynding med fosfatpufferholdigt saltvand (PBS). En prøve af denne opløsning (80 mikroli-ter) blev sat til 10 ml af en blanding af dimethylsulfo- 37 DK 172940 B1 sid (DMSO) og demineraliseret, destilleret vand (1:1), der indeholdt 0,1 M tetrabutylammoniumtetrafluorborat (TBABF^) og 18 mM ammoniumpersulfat, i reaktionsbeholderen. Slutkoncentrtionen af ruthenium-mærket antistof var _q 5 1 x 10 M. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskre vet ovenfor.

Der fremstilledes yderligere opløsninger, som repræsenterede forskellige fortyndinger af stamopløsnlngen af det 10 ruthenium-mærkede anti-muse-IgG-anti-stof fra kaniner, og prøver (Θ0 mikroliter) af disse opløsninger blev sat til den samme opløsning af ruthenium-mærket antistof i reaktionsbeholderen i trinvise stigninger, som resulterede i de følgende koncentrationer af mærket antistof; 5 x 10” g _o _ o 15 Μ, 1 x 10 M og 5 x 10 M. For hver opløsning foretog man elektrokemiluminescensmlinger som tidligere beskrevet. Resultaterne af disse målinger er anført i tabel II medenfor. disse resultater visser sensitiviteten af elek- trokemiluminescensmålinger af mærket antistof (1 x 10” g 20 M), ligsom de viser, hvorledes intensiteten af elektro kemiluminescensen afhænger af koncentrationen af det ruthenium-mærkede anti-muse-igG-antistof.

TABEL II 25

Elektroluminescens (ECL) af ruthenium-mærket anti-museimmunoglobulin G (IgG) antistof fra kaniner

Koncentration af ruthenium-mærket 30 anti-muse-IgG-antistof__ECL (mV) 5 x 10”8M 1610 1 x 10”8M 892 5 x 10”9M 418 35 1 x 10”9M 72 0 0 38 DK 172940 B1 EKSEMPEL 3

Immunologisk reaktivitet af ruthenium-mærket bovint se-5 rumalbumin (BSA) i en enzym-bundet immunosorbent-analyse (ELISA) i fast fase.

Hulrummene i en mikrotiterplade af polystyren blev belagt med en msttende koncentration af enten bovint serum-10 albumin mærket med 4,47-(dichormethyl)-2,2'-bipyridyl-bis(2,2f-bipyridyl) ruthenium (II), d.v.s. rutheium-mærket bovint serumalbumin (6 RU/BSA, 20 mlkrogram/ml i j PBS-puffer, 50 mikroliter/hulrum eller ikke-mærket BSA

(20 mikrogram/ml i PBS-puffer, 50 mikroliter/hulrum) og 15 inkuberet i en time ved stuetemperatur. Efter denne inkubationsperiode blev pladen vasket 3 gange med PBS, 5 minutter pr. udvaskning. En opløsning, der indeholdt 6 mg/ml kanin-anti-BSA-antistof, blev fortyndet hhv.

1:20.000, 1:30.000, 1:40.000, 1:50.000 og 1:60.000 i PBS, 20 og fortyndingerne blev in duplo sat til hulrummene, der var belagt med ruthenium-mærket BSA eller med ikke-mærket BSA, hvorefter pladen blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter 3 udvaskninger med PBS som beskrevet ovenfor blev tilstedeværelsen af bundet kanin-anti-BSA-5 25 antistof bestemt ved, at man til hvert hulrum satte gede- i anti-kanin-IgG-peroxidase-konjugat (1:1000 fortynding af Ϊ en 0,5 mg/ml opløsning i PBS, 50 mikroliter/hulrum) og 3 inkuberede pladen i 1 time ved stuetemperatur. Efter at 3 j have vasket pladen to gange med PBS, 1 gang med 0,5 % j 30 Tween-20 og 2 gange med PBS som ovenfor blandede man hydrogenperoxid (30 %) og 2,2'-azino-di-[3-ethylbenze- thiazolinsulfonat] (KPL, Gaithersburg, MD i lige store vulumener, hvorpå man satte 200 mikroliter af blandingen til hvert af pladens hulrum. Efter 30 minutters inkuba-35 tion ved stuetemperatur blev pladen aflæst spektrofoto-j metrisk ved 414 mn. Den gennemsnitlige baggrundsabsorbans af kontrolprøverne blev trukket fra middelværdien af de 39 DK 172940 B1 dobbelte aflæsninger for hver fortynding af kanin-anti-BSA-antistoffet, som var sat til de hulrum, der var belagt med ruthenium-mærket BSA eller ikke-mærket BSA.

Disse korrigerede absorbansværdier er anført i den efter-5 følgende tabel III.

Kurverne opnået for ikke-mærket BSA og ruthenium-mærket BSA var parallelle, og de korrigerede absorbansværdier i hvert punkt på de to kurver havde et konstant indbyrdes 10 forhold på omkring 0,6. Man opnåede identiske resultater for to andre portioner ruthenium-mærket BSA, som var fremstillet ved anvendelse af det samme aktiverede ruthe-nium-kompleks som tidligere beskrevet, og som havde tilsvarende Ru/BSA-mærkningsforhold. disse resultater 15 antyder, at det ruthenium-mærkede BSA er immunologisk reaktivt, og at det opretholder omkring 60 % af sin im-munoreaktivitet, når det mærkes med ruthenium, I sammenligning med Ikke-mærket BSA.

20 25 30 35

TABEL III

40 DK 172940 B1

Absorbans ved 414 nm 5 Kanln-anti-BSA- Ikke- Ruthenium- Relative antistof- mærket mærket immunore- fortynding BSA BSA_ aktivitet 20.000 1,06 0,66 62 % 30.000 0,83 0,50 60 % 10 40.000 0,67 0,40 60 % 50.000 0,56 0,33 59 % 60.000 0,47 0,28 60 % 15 EKSEMPEL 4

Immunologisk reaktivitet af ruthenium-mærket anti-muse-immunoglobulin (IgG) antistof fra kaniner ved en konkurrerende enzym-bundet immunosorbent-analyse (ELISA) i fast 20 fase.

Anti-muse IgG-antistof fra kaniner, mærket med 4,4'-di-chlormethyl-2,2'-bipyridyl-bid (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket kanin-anti-muse-lgG-antistof), 25 blev sammenlignet med ikke-mærket kanin-anti-muse-IgG-an- : tlstof med hensyn til sin evne til at konkurrere med enzym-mærket anti-muse-IgG-antistof om at binde sig til muse-IgG. Hulrummene i en mikrotiterplade af polystyren med 96 hulrum blev belagt med en opløsning af muse-IgG (5 30 mikrogram/ml i PBS-puffer), inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur og vasket 3 gange med PBS (5 minutter pr. vask). Der fremstilledes to opløsninger, hvoraf den ene Indeholdet en blanding af konjugatet af kanin-anti-muse-IgG med alkalisk phosphortase og kanin-anti-muse-IgG (1 mg/ml), mens den anden indeholdt en blanding af konjugatet af kanin-anti-muse-IgG med alkalisk phosphortase og i i 41 DK 172940 B1 ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG (1 mg/ml, 7,5 Ru/an-tlstof). Disse to opløsninger samt en tredie, som Indeholdt konjugatet af kanin-anti-muse-IgG med alkalisk phosphortase, blev fortyndet 1:6000, 1:7000, 1:8000,

5 1:9000. 1:10.000, 1:12.000, 1:14.000. og 1:16.000 i PBS

indeholdende 0,5% Tween-20 og sat (50 mikroliter/hulrum) til separate rækker af hulrum i pladen, som indeholdt bundet muse-IgG. Pladen blev inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur og vasket 2 gange med en blanding af PBS 10 og Tween-20 og 2 gange med PBS, 5 minutter pr. vask. Enzymsubstratet p-nitrofenylfosfat (1,5 mg/ml I 10 % di-ethanolamin-puffer, pH 9,6) blev sat til hvert hulrum (200 mikroliter/hulrum). Pladen blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og aflæst spektrofotometrisk 15 ved 405 nro. Den gennemsnitlige baggrundsabsorbans af kontrolprøverne blev trukket fra middelværdien af de dobbelte aflæsninger for hver af de 3 opløsninger i hver af de angivne fortyndinger. Disse absorbansværdier er vist I tabel VI.

20

Der opnåedes 3 parallelle kurver, hvoraf topkurven re-presenterede den ikke-inhiberede binding af enzyn-kon-jugatet, mens de to underliggende kurver angav inhibe-rlngen som følge af hhv. ruthenium-mærket anti-muse-IgG 25 og ikke-mærket anti-muse-IgG. Ved sammenligning punkt for punkt finder man, at kurven svarende til ruthenium-mærket anti-muse-IgG ligger på tilnærmelsesvis 81 % i forhold til kurven svarende til ikke-mærket anti-muse IgG i forhold til enzym-konjugat kurven. Disse resultater angiver, 30 at det ruthenium-mærkede anti-muse-IgG-antistof er immu nologisk reaktivt over for sit antigen (muse-IgG), og at det har en effektivitet I forhold til Ikke-mærket anti-muse-IgG-antistof på tilnærmelsesvis 81 % med hensyn til at konkurrere med enzym-mærket anti-muse-IgG-antistof om 35 binding til muse-IgG.

TABEL IV

42 DK 172940 B1

Absorbans ved 405 nm

5 AB C

Anti-muse Enzym-

IgG,alka- konjugat+ Enzym- Sammen linsk phos- ruthenium- konjugat+ lignende phortase mærket ikke-mær- grad af (enzym-kon- anti-muse- ket anti- inhibe- 10 Fortynding .1 ugat) IgG_ muse-IgG ring* 6000 1,48 0,94 0,79 77 % 7000 1,33 0,82 0,69 79 % 8000 1,21 0,72 0,62 82 % 15 9000 1,10 1.10 0.65 84 % 10000 1,01 0,60 0,51 82 % 12000 0,87 0,51 0,43 80 % 14000 0,77 0,45 0,37 81 * 16000 0,68 0,40 0,33 80 % 20 *(A-B/A-C) x 100 % EKSEMPEL 5 25 ! Elektrokemiluminescens af ruthenium-merket bovint serum albumin (BSA).

En opløsning indeholdende 7,8 x 10-6 M bovint serumal-bomin (BSA) mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2,-bipyridyl-bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket bovint serumalbumin) fremstilledes ud fra en stamopløsning af ruthenium-mærket BSA (2,6 mg/ml, 6 Ru/BSA) ved fortynding i phosphatpufferholdigt saltvand. Man satte 26 mi-kroliter af denne opløsning til 10 ml DMSO/deioniseret, 43 DK 172940 B1 destilleret vand (1:1) indeholdende 0,1 M TBABF4 og 18 mM ammonlumpersulfat i reaktionsbeholderen. Slutkoncentra-tionen af ruthenium-mærket BSA var 2 x 10 M. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskrevet ovenfor.

5 På analog måde fremstilledes en opløsning, der indeholdt 7,8 x 10"6 M ikke-mærket BSA, og denne opløsning blev anbragt i reaktionsbeholderen til opnåelse af en slutkon- — 8 centration af ikke-mærket BSA på 2 x 10 M. Elektro-10 kemiluminescensen af denne opløsning og af en tilsvarende opløsning uden BSA blev derefter målt. Resultaterne af disse elektrokemiluminescensmålinger er vist i den efterfølgende tabel V for kovalent koblet rutenium-mærket BSA og for ikke-mærket BSA.

15

TABEL V

Elektrokemiluminescens (ECL) af ruthenium-mærket BSA

20 Opløsning ECL (mV)

— R

2 x 10 M ruthenium- mærket BSA 730 25 2 x 10“8 M BSA 100 DMSO: H20 (1:1) 0 30 EKSEMPEL 6

Elektrokemiluminescens af ruthenium-mærket anti-muse-lmmunoglobulin (IgG) antistof fra kaniner.

35 En opløsning, der indeholdt 1,25 x 10 8 M kanin-anti-mu-se-IgG-antistof mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2'-bi-pyridyl-bis-(2,2*-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium- 44 DK 172940 B1 mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof), blev fremstillet ud fra en stamopløsning af ruthenium-mærket kanin-anti-muse-

IgG-antistof (2 mg/ml, 7,5 Ru/antistof) ved fortynding i forsfatpufferholdigt saltholdigt saltvand. Man satte 80 5 mikroliter af denne opløsning til 10 ml DMSO/deioniseret destilleret vand (1:1), der indeholdt 0,1 M TBABF^ og 18 mM ammoniumpersulfat, i reaktionsbeholderen, slutkoncen- —8 trationen af ruthenium-mærket antistof var 1 x 10 M. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskrevet i ek-10 sempel 2.

På analog måde fremstillede man en opløsning indeholdende 1,25 x 10 M ikke-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof, og man satte denne opløsning til reaktionsbeholderen til 15 opnåelse af en slutkoncentration af ikke-mærket antistof -8 på 1 x 10 M. Elektrokemiluminescensen af denne opløsning og af opløsningen uden tilsat antistof blev ligeledes målt som beskrevet ovenfor. Resultaterne af elektrokemiluminescensmålingerne er vist i den efter-20 følgende tabel VIII for kovalent koblet ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof og ikke-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof.

m

TABEL VI

= 25 5 ® Elektrokemlluminescens (ECL) af ruthenium-mærket kanin- m anti-museimmunoglobulin (IqG) antistof ] Opløsning ECL (mV) 30 1 x 10 M ruthenium- mærket kanin-anti-muse-

IgG-antistof 892 1 x 10~8 M kanin-anti- 35 muse-IgG-antistof 0 DMSO: H20 (1:1) 0 5 EKSEMPEL 7 45 DK 172940 B1

Homogen elektrokemiluminiscens-immunoanalyse for antistoffer til bovint serumalbumin.

En opløsning indeholdende 7,8 x 10 ® M bovint serumalbumin (BSA) mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2'-bipyridyl-bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket bovint serumalburain) blev fremstillet ud fra en stamop-10 løsning af ruthenium-mærket BSA (2,5 mg/ml, 6 RU/BSA) ved fortynding i phosphatpufferholdigt saltvand (PBS). Man satte 26 mikroliter af denne opløsning til 10 ml af en 1:1 blanding af DMSO og deioniseret destilleret vand, der Indeholdt 0,1 M TBABF^ og 18 mM ammoniumpersulfat, I

15 reaktionsbeholderen. Slutkoncentrationen af ruthenium- —8 mærket BSA var 2 x 10 M. Elektrokemi luminescensen blev målt som beskrevet I eksempel 2.

På analog måde blev en opløsning, der indeholdt 7,8 x 10" 20 ^ M Ikke-mærket BSA, fremstillet og sat til reaktions beholderen til opnåelse af en slutkoncentration af ikke- —8 mærket BSA på 5 x 10 M. Man målte elektrokemi luminescensen af denne opløsning og af en tilsvarende opløsning uden BSA.

25 -5

En opløsning, der indeholdt 3,75 x 10 M kanin-anti-BSA-antistof, blev fremstillet ud fra en stamopløsning af kanin-anti-BSA-antistof (6,0 mg/ml) ved fortynding i PBS, og der sattes en prøve (26 mikroliter) til opløsningen af 30 ruthenium-mærket BSA I reaktionsbeholderen til opnåelse af en slutkoncentration af kanin-anti-BSA-antistof på 1 x ΙΟ"7 M.

Elektrokemiluminescensen af den resulterende blanding af 35 ruthenium-mærket BSA-antigen og antistof (kanin-anti-BSA) blev målt. Resultaterne angivet i den efterfølgende tabel VII viser en reduktion I elektrokemiluminescensen af det 46 DK 172940 B1 ruthenium-mærkede BSA efter tilsætning af kanin-anti-BSA-antistof, og resultaterne viser også, at man kan opnå en homogen elektrokemiluminescerende bestemmelse af antistof til BSA. På basis af disse resultater vil det være klart 5 for fagmanden, at man kan udvikle en homogen elektrokemi-luminescens- immunoanalyse til påvisning af andre analy-sander af interesse.

TABEL VIII

10

Reduktion af elektrokemilurainescensen (ECL) af ruthenlum-mærket bovint serumalbumin efter binding til antistof

Ruthenium- Kanin-

15 Ikke-maerket mærket (BSA) anti-BSA

BSA (kontrol) (antigen) (antistof) ECL(mV) 0 2 x 10"8 M 0 727 j 0 2 x ΙΟ"8 Μ 1 x ΙΟ'7 M 92 20 2 x 10~8 M 0 0 94 EKSEMPEL 8

Homogen elektrokemiluninescerende immunoanalyse for 3 25 museimmunoglobulin G (IgG).

i

En oplosning indeholdende 6,25 x 10~8 M kanin-anti-muse-IgG-antistof mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2,-bipyri-» dyl-bis(2,2'1-bipyridyl) ruthenium (II) (ruthenium-mærket 30 kanin-anti-muse-IgG-antistof) blev fremstillet ud fra en ^ stamoplysning af ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-an- ™ tistof (2 mg/ml, 7,5 Ru/antistof) ved fortynding i phos- j phatpufferholdigt saltvand (PBS). Man satte 80 mikroliter af denne oplysning til 10 ml af en blanding (1:1) af DMSO 35 og Ioniseret destilleret vand, der indeholdt 0,1 M TBABF4 og 18 mM ammoniumpersulfat, i reaktionskolben. Den endelige koncentration af ruthenium-mærket antistof var 5 x 47 DK 172940 B1

O

10 M. Elektrokemiluralnescensen blev målt som beskrevet 1 eksempel 2.

På analog måde fremstillede man en opløsning Indeholdende 5 6,25 x 10~® M ikke-mærket anti-muse-IgG-antistof fra kaniner, og denne opløsning satte man til reaktionsbeholderen til opnåelse af en endelig koncentration af -8 ikke-mærket antistof på 5 x 10 M. Man bestemte elektrokemiluminescensen af denne opløsning og af en tilsva-10 rende opløsning uden antistof.

_5

En opløsning indeholdende 2,5 x 10 M muse-igG fremstilledes ud fra en stamopløsning af muse-igG (4,0 mg/ml) ved fortynding i PBS, og man satte forskellige prøver (20 15 mikroliter og 40 mikroliter) af denne opløsning til opløsningen af ruthenium-mærket anti-muse-IgG-antistof i reaktionsbeholderen til opnåelse af slutkoncentrationer

-8 -V

af muse-igG på hhv. 5 x 10 M og 1 x 10 M.

20 Derefter målte man elektrokemiluminescensen af den resulterende blanding af ruthenium-mærket anti-muse-IgG-antistof og antigenet (muse-igG). resultaterne fremgår af den nedenstående tabel VIII. Elektrokemiluminescensmålinger-nes afhængighed af koncentrartionen af muse-IgG-antigen 25 er vist på figur 1. Disse resultater viser, at der sker en reduktion i elektrokemiluminescensen af det ruthenium-mærkede antistof efter tilsætning af antigenet. På basis af disse resultater vil det være klart for fagmanden, at det er muligt at udvikle en homogen elektrokemilumine-30 scens-immunoanayse til bestemmelse af koncentrationen af andre stoffer af interesse.

35 % 5 %

TABEL VIII

48 DK 172940 B1

Reduktion af elektrokemiluminescensen (ECL) af ruthenium-mærket antistof efter binding til antigen 5 ikke-mærket Ruthenium-

anti-muse- mærket-anti- muse-IgG

IgG (kontrol) IgG (antistof) (antigen) ECL (MV) 10 O 5 x 10~8 M O 1610 0 5 x ΙΟ"8 M 5 x 10"8 M 1360 0 5 x ΙΟ-8 Μ 1 x ΙΟ"7 M 1240 5 x ΙΟ-8 M 0 00 ^ 15 EKSEMPEL 9

Heterogen elektrokimiluminescerende immunoanalyse for legionella under anvendelse af et muse-anti-legionella-1 immunoglobulin G (IgG) antistof og ruthenium-mærket 20 kanin-anti-museimmunoglobulin G (IgG) antistof

En formalinholdig suspension af bakterien Legionella medadei blev indstillet til en optisk densitet (ved 425 nm) på 1,00 ved fortynding med PBS puffer. Omkring 3 x 9 25 10 celler blev anbragt i et konisk mikrocentrifugeglas.

Cellerne blev centrifugeret (10 minutter ved 10.000 - omdr./min., subernatanten blev hældt fra, og céllerne blev resuspenderet I en 1:50 fortynding af et monoklonalt IgG-antistof fra mus (1,45 mg/ml), som var specifikt for 30 Legionella midadei, I PBS (1 ml). Efter 1 times inkuba- ^ tion ved stuetemperatur blev cellerne centrifugeret, og supernatanten blev borthældt, hvorefter cellerne blev j resuspenderet i PBS-puffer og centrifugeret påny. Efter ^ dekantering af supernatanten blev cellerne resuspenderet 35 I en 1:50 fortynding (i PBS) af kanin-anti-muse-IgG-anti- j stof mærket med 4,4'-dichlormethyl-2,2'-bipyridyl- bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium (II), d.v.s. ruthenium-mær- 49 DK 172940 B1 ket kanin-anti-muse-IgG-antistof (2 mg/ml, 7,5 Ru/anti-stof). Efter inkubation ved stuetemperatur i 1 time blev cellerne centrifugeret, og subernatanten blev dekanteret fra, hvorefter cellerne blev resuspenderet i PBS og vas-5 ket 2 gange under centrifugering som beskrevet ovenfor.

Efter den sidste udvaskning blev cellerne resuspenderet i 200 mikrollter PBS. Man satte 100 mikroliter af cellesuspensionen til reaktionskolben, som i forvejen indeholdt 10 ml DMSO/deionlseret destilleret vand (1:1) indeholden-10 de 0,1 M TBABF^ og 18 Mm annomiumpersulfat. Man målte elektrokemiluminescensen af cellesuspensionen. Derefter satte man yderligere 100 mikroliter af cellesuspensionen til reaktionskolben og målte elektrokemiluminescensen.

Desuden målet man elektrokemiluminescensen for en opløs-15 ning uden celler. Desuden målte man elektrokemiluminescensen for en opløsning uden celler, som tjente som kontrol, ifølge metoden beskrevet i eksempel 2. Resultaterne vist i tabel 9 nedenfor viser, at man med gode resultater har gennemført en heterogen elektrokemilumeniscerende 20 immunoanalyse for legionella under anvendelse af rutheni-um-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof.

25 30 35 TABEL 9 50 DK 172940 B1

Heterogen elektrokemiluminescerende (ECL) imminoanalyse for leglonella micdadei 5

Prøve ECL (mV)

Legionella micdadei g cellesuspension, 1,9 x 10 celler 10 i DMS0/H20 (1:1) 160

Legionella micdadei 8 cellesuspension, 9,3 x 10 celler ? i DMSO/H2 (1:1) 90 “ 15 ^ DMSO: H20 (1:1) 0 EKSEMPEL 10 3 20 Homogen elektrokemiluminescenerende immumoanalyse for le- gionella under anvendelse af et muse-anti-legionella-immuniglobulin G (IgG) antistof og ruthenium-mærket ka-nin-anti-muse-iinmunoglobulin G (IgG) antistof.

25 En suspension af bakterien Legionella micadei blev fremstillet og inkuberet med et muse-monoklonalt IgG-anti-stof, som er specifikt for legionella, som beskrevet i eksempel 9. Cellerne blev centrifugeret, vasket og resus-penderet i 0,2 ml PBS. En prøve (80 mokroliter) af anti-30 muse-lgG-antistof fra kaniner, mærket med 4,4'-di-3 chlormethyl-2,2' bipyridyl-bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium i (II), d.v.s. ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-anti-^ stof (1,25 x 10- M) blev sat til cellesuspensionen, og blandingen blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur.

35 Som en kontrol blev en identisk fortynding af ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof inkuberet på samme måde i fravær af cellesuspensionen. Efter inkubationspe- m DK 172940 Bl 51 rioden blev opløsningen af mærket antistof sat til 10 ml DMSO/deioniseret destilleret vand (1:1), der indeholdt 0,1 M TABAF^ og 18 mM ammoniumpersulfat, i reaktionsblandingen, til opnåelse af en slutkoncentration af ru- _o 5 thenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof på 1 x 10 M. Elektrokemiluminescensen blev målt som beskrevet i eksempel 2. Man fulgte den samme procedure for cellesuspensionen med tilsat ruthenium-mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof. Resultaterne, som er vist i tabel X, viser 10 en reduktion af den elektrokemiluminescerende stråling efter vekselvirkningen Imellem det ruthenium-mærkede an-ti-muse-IgG-antistof og det muse-monoklonale antistof bundet til legionella, og resultaterne viser også, at man med gode resultater har gennemført en elektrokemilu-15 minescerende immunoanalyse for legionella micdadei.

TABEL X

Homogen elektrokemiluminescerende (ECL) immunoanalyse for 20 Legionella mecdadei

Prøve ECL (mV) -8 1 x 10 M ruthenium-mærket 25 anti-muse-IgG-antistof 976 •8 1 x 10 M ruthenium-mærket anti-muse-IgG-antistof + monoklonalt antistof bundet 30 til Legionella mecdadei 803 DMSO: H20 (1:1) 0 EKSEMPEL 11 35

Forøgelse af elektrokemiluminescensen efter frigivelse af et ruthenium-mærket antistof bundet til bakterier.

52 DK 172940 B1

En suspension af bakterien Legionella micdadei i formalin blev indstillet til en optisk densitet (ved 425 nm) på 1,00 ved fortynding med PBS-puffer, og 2 ml af denne suspension blev overført til et konisk mikrocentrifuge-5 glas. Cellerne blev centrifugeret (10 minutter ved 10.000 omdr./min.), supematanten blev dekanteret fra, og cellerne blev resuspenderet i en 1:10 fortynding i PBS (0,5 ml) af et muse-monoklonalt IgG-antistof (1,45 mg/ml) specefikt for Legionella micdadei. Efter inkubation ved 10 stuetemperatur i 1 time blev cellerne centrifugeret som før, og supematanten blev dekanteret fra, hvorefter cellerne blev resuspenderet i PBS-puffer og centrifugeret påny. Efter dekantering af supematanten blev cellerne resuspenderet i en 1:50 fortynding (i PBS) af ruthenium-15 mærket kanin-anti-muse-IgG-antistof (1 ml, 7,5 Ru/anti-stof). Efter inkubation ved stuetemperatur i 1 time blev cellerne centrifugeret som tidligere, og supematanten blev dekanteret fra, hvorefter cellerne blev resuspenderet i PBS og vasket 2 gange med mellemliggende centrifu-20 gering som tidligere beskrevet. Efter den sidste udvaskning blev cellerne resuspenderet i 100 mikroliter af enten PBS eller 1,0 M eddikesyre i 0,9 % NaCl-opløsning (normalt saltvand) og inkuberet ved stuetemperatur i 40 minutter. Efter centrifugering blev 100 mikroliter af 25 supernatantvæsken overført til reaktionskolben sammen med 10 ml af en blanding (1:1) af DMS0 og deioniseret de-- stilleret vand indeholdende 0,1 M TBABF^ og 18 mM am- moniompersulfat. Elektrokemiuminescensen af cellesuper-natantvæsken (eddikesyre/normalt saltvand) og af super-30 natantvæsken fra de PBS-vaskede celler blev målt i overensstemmelse med metoden beskrevet i eksempel 2. Resultaterne af elektrokemiluminescensmålingerne er vist i den nedenstående tabel XI, og de viser, at den eluering af det ruthenium-mærkede kanin-anti-muse-IgG fra de med 35 monoklonalt antistof belagte legionella-bakterier, som opnås ved at behandle cellerne med 1,0 M eddikesyre/normalt saltvand (reference 23), resulterer i en forøgelse

inS

53 DK 172940 B1 af den elektrokemiluminescens, som frembringes af det ik-ke-bundne ruthenium-mærkede antistof. Disse resultater viser også, at det ruthenium-mærkede antistof er bundet til de med monoklonalt antistof belagte legionella-bakte-5 rier, og at udvaskningen med PBS ikke resulterede i en forøgelse i ECL sammenlignet med baggrundssignalet.

TABEL XI

10 Elektrokemiluminescens (ECL) af supernatantvæsker fra celler belagt med ruthenium-mærket anti-muse-immunoglobu-lin (IgG)

Opløsning ECL (mV) 15

Baggrundskontrol:

100 mikroliter 1,0 M

eddikesyre/normalt saltvand 134 20 100 mikroliter PBS-cellevaske- supematantvæske 121 100 mikroliter 1,0 M eddikesyre/normalt saltvand 25 sammen med cellevaske- supernatantvæske 214 EKSEMPEL 12 30 Homogen konkurrerende immunoanalyse for pregnandiol-3- glucuronld (PD3G) i urin.

Pregnandiol-3-glucoronid (PD3G) kan påvises og bestemmes kvantitativt i urin ved at bringe en urinprøve i kontakt 35 med en kendt mængde PD3G mærket med en elektrokemilumlne-scerende gruppe og en kendt mængde af en anti-PD3G-anti-stof under sådanne betingeler, at PD3G, som er tilstede i 54 DK 172940 B1 prøven, og den PD3G-elektrokemiluminescerende gruppe konkurrerer med hinanden om at besætte bindingsstederne på antistoffet. Efter et passende tidsrum kan den resulterende prøve induceres til vedvarende at udsende elektro-5 magnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde. Den udsendte stråling kan bestem-- mes kvantitativt, og herudfra kan man betemme den mængde PD3G, som er tilstede i prøven.

10 EKSEMPEL 13 Mærkning af nucleinsyrer med en tris-ruthenium-bipyridyl-N-hydroxysuccinimidester.

15 Nucleinsyreprøver (5-25 mikrogram) i 10 mM tris-HCL (pH 8,0)/1 mM EDTA kan varmedenatureres, afkøles og modificeres ved bisulfit-katalyseret transaminering af cytosin-rester med ethylendiamin i 3 timer ved 42 °C. Efter dialyse natten over imod 5 mM natriumfosfatpuffer, PH T 20 8,5, kan prøverne koncentreres ti 100 mikroliter ved 5 ultrafiltrering. Disse modificerede nucleinsyrer (1-10 mikrogram) kan fortyndes til 100 mikroliter med 0,1 M natriumfosfatpuffer, pH 8,5.

25 Man kan fremstille et tris-ruthenium-bipyridyl-N-hydroxy- succinimidester-derivat som en 0,2 M stamopløsning i N,N-dimethylformamid (DMF) ved i sig selv kendte metoder. Man kan sætte 5 mikroliter af denne esteropløsning til den modificerede nucleinsyreopløsning i 0,1 M natriumfosfat- 30 puffer, pH 8,5, og inkubere blandingen ved stuetemperatur i 1 time. Mærkede nucleinsyreprober kan renses ved dialyse imod 150 mM natriumclorid/10 mM natriumfosfatpuffer (pH 7,0), der udskiftes mindst 3 gange. De opbevares ved 4 eC indtil anvendelsen.

35 M' - 1 1:::::5 i Ί 5 EKSEMPEL 14 55 DK 172940 B1

Nucleinsyrehybridiseringsanalyse for humant T-celle-leukemi III virus (HTLV-III) i blod.

HTLV-III virus kan påvises i helt blod ved behandling af blodet til frigivelse af RNA fra viruspartikler. En prøve, der indeholder HTLV-III RNA, bringes I kontakt med en enkeltstrenget oligonucleotid-probe, som er komplementær 10 til HTLV-III RNA'et, og mærkes med en elektroke-miluminescerende gruppe. Efter en passende tid, kan den resulterende prøve Induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er effektiv til dette 15 formål. Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, og på grundlag heraf kan man bestemme den mængde HTLV-III RNA, der er tilstede i prøven.

EKSEMPEL 15 20

Homogen nucleinsyrehybridiseringsanalyse for legionella-bakterier i en klinisk prøve.

Legionella-bakterier kan påvises i en klinisk prøve, så 25 som spyt, ved at behandle spyttet til frigivelse af ribo-somalt RNA fra bakterierne. Den resulterende prøve bringes i kontakt med en enkeltstrenget oligonucleotid-probe, som er komplementær til de sekvenser I det ribosomale RNA, som er specifikke for legionel la, og mærkes med en 30 elektrokemiluminescerende gruppe. Efter en passende tid kan den resulterende prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er effektiv til dette formål. Den udsendte stråling kan bestemmes 35 kvantitativt, og mængden af legionella-bakterier, som er tilstede i prøven, kan bestemmes på dette grundlag.

i EKSEMPEL 16 56 DK 172940 B1

Hybridlseringsanalyse til bestemmelse af cytomegalovirus- DNA integreret i gemonisk DNA ved strengforskydningsmeto- i 5 den.

! Cytomegalovirus (CMV) DNA kan påvises i humant genomisk DNA ved behandling af en vævsprøve, for eksempel lymfo-ϊ cytter, til frigørelse af DNA'et efterfulgt af en spalt- 10 ning af DNA med restriktionsenzymer. Den resulterende prøve, som indeholder dobbeltstrengede fragmenter af CMV, bringes i kontakt med en enkeltstrenget oligonucleotid-probe, som er komplementær til CMV-DNA'et, mærket med en elektrokemiluminescerende gruppe og i stand til at for-15 skyde en af strengene i DNA-duplex'et. Efter et passende tidsrum kan den resulterende prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde til dette i; formål. Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, ~ 20 og på grundlag heraf kan man bestemme den mængdecyto- = megalovirus-DNA, som er tilstede i prøven.

EKSEMPEL 17 " 25 Hybridiseringsnalyse til påvisning af ras-oncogenet i hu- — mane blærecarcinomaceller ved anvendelse af en heterogen — metode.

Man kan bestemme ras-onkcogenet i humane blærecarcino-30 maceller ved at behandle en vævsprøve til frigørelse af DNA, som man spalter med restriktionsenzymer. Derefter nedbryder man DNA'et til enkeltstrenge og binder disse in til nitrocellulosepapir som tidligere beskrevet af Mania- tis, T. et al. (24). filterpapiret med bundet enkelt-; I 35 strenget DNA bringes i kontakt med en oligonucleotid-pro- be, som er specifik for ras-oncogenet, og som er mærket med en elektrokemiluminecerende gruppe. Efter en passende 57 DK 172940 B1 reaktionstid kan den resulterende prøve induceres til vedvarende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er effektiv til dette formål. Den udsendte stråling kan påvises, og 5 på grundlag heraf kan man bestemme tilstedeværelsen af ras-oncogen-RNA i prøven.

EKSEMPEL 18 10 Elektrokemiluminescerende polymer-baseret enzymanalyse.

Et makromolekylært enzym-substrat, f.eks. stivelse, dex-tran eller en syntetisk fremstillet makromolekylær polymer, kan mærkes med en elektrokemiluminescerende gruppe.

15 Det mærkede substrat kan benyttes til påvisning og kvantitativ bestemmelse af tilstedeværelsen af et enzym, som forekommer i et multikomponentsystem, det mærkede substrat kan også benyttes til kvantitativt at bestemme en mængde enzym, som er bundet til et antistof, en DNA-pro-20 be, en RNA-probe, streptavidin, avidin eller biotin. Det mærkede substrat kan spaltes selektivt til mindre fragmenter ved hjælp af et passende enzym. Man kan anvende en hvilken som helst kombination af enzym og substrat. Som eksempler på enzymer kan nævnes glycosidaser, glucosi-25 daser, amylaser, proteaser, endonucleaser, lyaser og dex- tranaser. Efter en passende reaktionstid kan den resulterende prøve induceres til vedværende at udsende elektromagnetisk stråling efter direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er effektiv til formålet.

30 Den udsendte stråling kan bestemmes kvantitativt, og herud fra kan man bestemme den mængde enzym, der er tilstede i prøven. Fordelen er, at man opnår en forstærkning af det elektrokemiluminescerende signal fra de spaltede fragmenter, som hver især er mærket med en elektrokemilu-35 minescerence gruppe.

i EKSEMPEL 19 58 DK 172940 B1 j Afsløring af streptokokker af en elektrokemiluminesceren- de enzymforsøg.

! 5 § En prøve indeholdende streptokokker kan bringes i kontakt med en reagensblanding indeholdende et syntetisk peptid mærket med en elektrokemiluminescerende gruppe. Det syntetiske peptid er et substrat specifikt for peptidase 10 frembrakt af bakterien. Indvirkning af peptidasen på det syntetiske peptid bevirker frembringelsen af fragmenter mærket med den elektrokemiluminescerende gruppe. Efter et passende tidsrum kan den fremstillede prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling ved 15 direkte udsættelse for en elektrokemisk energikilde, der er i stand til at inducere den elektrokemiluminescerende gruppe til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling. Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af tilstedeværende streptokokker I prøven kan bestemmes her-20 ud fra.

EKSEMPEL 20

Enzymlmmunoforsøg for hepaitis B overfladeantigen baseret — 25 på elektrokemiluminescens.

—; En blodprøve indeholdende hepatitis B overfladeantigen (HBsag) bringes i passende tidsrum i kontakt med et antistof specifikt for HBsag og mærkes med dextranase. Ikke-30 bundet antistof til HBsag fjernes, og antigen-antistof-komplekset bringes i kontakt med en dextratpolymer mærket med elektrokemiluminescerende gruppe. Indvirkning af dextranasen på de mærkede polymere vil bevirke frembringelse af fragmenter, der hver især er mærket med den Γ "η 35 elektrokemiliuminescerende gruppe. Efter passende tidsrum j kan den fremstillede prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte udsættelse il 59 DK 172940 B1 for en elektrokemisk energikilde, der er i stand til at inducere den elektrokemiluminescerende gruppe til varigt at udsende elektromagnetisk stråling. Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af hepatitis B overflade-5 antigen tilstede i prøven bestemmes herudfra.

EKSEMPEL 21

Homogen undersøgelse for bradykininreceptorer under an-10 vendelse af en elektrokemiluminescerende-mærket brady-kinin.

En vævsprøve indeholdende bradykininreceptorer præpareres på passende måde og bringes i kontakt med bradykinin mær-15 ket med en elektrokemiluminescerende gruppe. Efter et passende tidsrum kan den fremstillede prøve induceres til varigt at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte eksponering for en elektrokemins energikilde, der er i stand til at inducere den elektrokemiluminescerende grup-20 pe til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling.

Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af bra-dykininreceptor tilstede i prøven bestemmes herudfra.

Dette forsøg kan også anvendes til at måle andre ligand-receptorgensidig indvirkninger som f.eks. østrogen-østro-25 genreceptor. Herudover kan denne undersøgelse anvendes til at bestemme og kvantificere mængden af umærkede ligander ved nvendelse af en kompetitiv bindingsforsøgsmetode.

30 EKSEMPEL 22

Anvendelse af en elektrokemiliminescerende gruppe til at afsløre nucleinsyrehybrider.

35 En prøve indeholdende nucleinsyre hybrider som f.eks.

dobbeltstrenget DNA, DNA-RNA dubeltter eller dobbeltstrenget RNA bringes i kontakt med en elektrokemilumine- 60 DK 172940 B1 scerende gruppe, der specielt kiler sig ind i nucleinsy-rehybrider. Efter passende tisdrum kan den fremstillede prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte eksponering for en elektroke-5 misk energikilde, der er i stand til at inducere den e-i lektrokemiluninescerende gruppe til varigt at udsende e- lektromagnetisk stråling. Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af nucleinsyrehybrider, der findes i prøven, bestemmes herudfra.

- 10 - EKSEMPEL 23

Afsløring af humant T-celleleukemivirus III (HTLV-III) antigen kompleksbundet til antistof i spyt ved hjælp af 15 et homogent immunoforsøg under anvendelse af elektrokemi-luminescens.

En spytprøve indeholdende HTLV-III kompleksbundet til antistof bringes i kontakt med en opløsning indeholdende et 20 kaotopisk middel for at itubryde antigen- antistofkom- — plekset. Denne opløsning bringes herefter i kontakt med et antistof specifikt for HTLV-III og mærket med e-lektrokemiluminescerende gruppe. Det kaotopiske middel fjernes, hvilke muliggør at de mærkede og umærkede an- 25 tistoffer kan rekombinere med antigen. Efter passende — tidsrum kan den fremstillede prøve induceres til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling ved direkte eksponering for en elektrokemisk energikilde, der er I stand til at inducere den elektrokemiluminescerende grup- 30 pe til vedvarende at udsende elektromagnetisk stråling.

Udsendt stråling kan kvantificeres, og mængden af human T-celleleukemivirus III (HTLV-III) antigen tilstede I prøven kan bestemmes herudfra. Disse metoder kan også anvendes til prøver indeholdende andre typer antigen-35 antistofkomplekser som f.eks. hepatitis antigen- anti stof komplekser, cytomegolavirus-antistofkomplekser og non-A, non-B hepatitis-antistofkomplekser i serum.

EKSEMPEL 24 5 61 DK 172940 B1

Immunoforsøg til afsløring og identificering af en hel række stafylokok enterotoxiner.

Monoklonale antistoffer specifikke for hver af stafylo-kokenterotoxinerne A, B, C , D og E og monoklonale antistoffer, der er krydsreaktive med disse enterotoxiner, blev renset. Hver antistof rensedes fra askities væske 10 ved passage af askitesvæsken gennem en søjle af stafylo-kokprotien A koblet til en agarosegels understøttelses-matrix, der er udstyret med bindings-eluerings og regenerationspuffere som del af det monoklonale antistof-rensningssystem (Bid-Rad Laboratories, Inc.)· Ved rens-15 ningsmetoden forfiltreredes to ml askitesvæske typisk indeholdende 5-15 ml monoklonalt antistof pr. ml ved at anbringe et Metricell membranfilter (Gelman Sciences,

Inc.) mellem to F-13 analytiske papirer (Schleicher and Schuell, Inc.) i bunden af en 10 ml injektionssprøjte 20 (Becton Dickenson, Inc.) indføre askitesvæsken i injektionsnålen, indsætte stemplet og filtrere askitesvæsken over i en opsamlingsbeholder. Filtratet blandedes med lige rumfang af bindingspufferen og påførtes en 5 ml protein A agarosesøjle. Søjlereagensreservoiret fyldets 25 herefter med bindingspufferen for at påbegynde eluerin-gen. Elueringen kontrolleredes for absorbans ved 2Θ0 nra ^A280^' °9 ^er opsamledes 1 ml fraktioner. Når A2qq var nået tilbage til en stabil baslslinieværdi, vaskedes søjlen med 5 lejerumfang bindingspuffer, og elueringspuf-30 feren anvendtes herefter til at eluere det rensede immunoglobulin fra søjlen. For at neutralisere immunoglobulin opsamledes elutatet i 0,3 ml 1 M Tris-HCL, pH 9,0. Når A280 at^er var vendt tilbage til en stabil basislinle-værdi vaskedes søjlen med 5 lejerumfang elueringspuffer, 35 efterfulgt af 10 lejerumfang regenerationspuffer og 5 lejerumfang bindingspuffer, således at søjlen var parat til næste rensningscyklus.

62 DK 172940 B1

Fraktionerne indeholdende det rensede immunoglobulin blev slået sammen og koncentreret under anvendelse af en omrørt ultrafiltreringscelle (Amicon Corp.) Slutkoncen-trationen af renset monoglobulin var mere end 5 mg/ml be-5 stemt ved hjælp af Lowry forsøgsmetoden for total pro-, tein. Det rensede antistof dialyseredes over for to ud skiftninger af phosphat-pufferet saltvand (PBS) indeholdende 0,1 % natriumazid i 4Θ timer ved 4 eC.

10 De rensede monoklonale antistofferf titreredes i et 96-brønds mikrotiterplade ELISA system til opnåelse af et mål for deres immunologiske reaktivitet for specifik en-terotoxin. Slutpunkt titrene for de antistoffer, der blev opnået, blev sammenlignet med referencetiterværdier for 15 tidligere undersøgte prøver af hver antistof. Antistoffer med tilstrækkeligt titer blev accepteret som immunologisk funktionelt beklædende antistoffer til immobilisering til en dianogstisk reagensholder f.eks. en dyppestav eller til konjugation til et enzym til anvendelse som probér ^ 20 ved immunoforsøg.

Det diagnostiske reagensholdesystem (dyppestave) med nitrocellulosemembraner fastgjort præpareredes til immobi-lisering af antistoffer til membranoverfladen ved først 25 at dybbe membranerne i phosphatpufferet saltvand i 1 time ved stuetemperatur for at forbedre membranens opfugte-— lighed. Staven fjernes fra opløsningen, og man lod mem branen lufttørre. Opløsninger af rensede monoklonale an-?= tistoffer, der hver var specifikke for en af stafylo- 30 kokenterotoxinerne A, B, C, D, eller E og en ikke-spe-cifik kontrol muse-immuno-globulin (Jackson Immuno Re-1 search Laboratories, Inc.) påførtes forskellige områder af membranen ved at anbringe 2 mikroliter antistofopløsning direkte på membranoverfladen. Koncentrationen af 35 hver anvendt antistof var en sådan, der var kendt for at mætte bindingspladserne fra nitrocellucose: 250 mikro- gram/ml 3A antistof (specifikt for A toxin), 50 mikro- 63 DK 172940 B1 gram/ml 2B antistof (specifikt for B toxin), 300 mikro-gram/ml 1C3 antistof (specifikt for Cl, C2, og C3 tox-iner), 200 mikrogram/ml 3d antistof (specifikt for D toxin), 250 mikrogram/ml 4E antistof (specifikt for E 5 toxin) og 200 mikrogram/ml ikke-specifikt kontrol muse-immunoglobulin. Dyppestavene lufttørredes ved stuetemperatur, og de tilbageblevne proteinbindingspladser på membranen blokeredes ved neddypning af stavene i en opløsning af phosphatpufferet saltvand indeholdende 0,5 % 10 Tween 20 og 3 % bovint serum albumin. Efter inkubation natten over ved stuetemperatur i denne blokerende opløsning lufttørredes stavene.

Rensede monoklonale antistoffer 2A (specifik for A og E 15 toxiner), 6B (specifik for B, Cl, og C3 toxiner), og ID (specifik for D toxin) lænkedes kovalent til enzymalkalisk phosphortase til anvendelse som konjugerede prober for at bestemme tilstedeværelsen af A, B, Cl, C2, C3, D og E toxiner bundet til antistoffer immobiliseret på mem-20 branoverfladen af den diagnostiske reagensholdige dyppestav. Hvert konjugat fremstilledes ved hjælp af en støkiometrisk kontorlieret totrinsmetode, der anvender glutaraldehyd som det bifunktionelle tværbindingsmiddel.

Ved denne metode sattes 0,47 ml EIA grad alkalisk phos-25 phatase (2500 enh./mg, Boehringer Mannheim Corp.) til 1,5 ml. 50 mM kalium phosphatpuffer pH 7,2 Indeholdende 13,4 mikroliter vandig glutaradehydopløsning (25 %, Sigma

Chemical Co.). Blandingen omrørtes i 90 minutter ved stuetemperatur for at muliggøre fastgørelse af glutaral-30 dehyd til fri aminogrupper fra enzymmolekylet. Efter denne inkubation sattes en 2 ml prøve af renset monoklonalt antistof i en koncentration på 1 mg/ml til, blandingen omrørtes yderligere 90 minutter og anbragtes på is for at afbryde konjugationsreaktionen. Konjugatet dialyseredes 35 over for 2 udskiftninger phosphatpufferet saltvand indeholdende 0,1 % natriumazid i 48 timer ved 4 “C. Bovint serumalbumin tilsattes dialysatet til slutkoncentrationen 64 DK 172940 B1 på 3 % for at stabilisere under den langvarige lagring ved 4 “C. antistof-enzymkonjugaterne titreredes i et 96-? brands mikrotiterplade ELISA system til opnåese af et mål ' for deres immunologiske reaktivitet for specifikt entero- 5 toxin. De opnåede slutpunktstiterværditer for konjugater- ne sammelignedes med referencetiterværdier for forud un dersøgte prøver af hver konjugat. Konjugater med tilstrækkeligt titer accepteredes til anvendelse som prober ved dyppestavforsøg for stafylokokinterotoxiner.

10

Faste fødevarer såsom skinke, pølse, nudler og ost, der er repræsentanter for fødevaretyper der sædvanligvis as-soieseres med udbrud af stafylokokfødevareforgiftning, omdannedes til en homogen væskesuspension for at udføre 15 forsøget for undersøgelse for stafolykokenterotoxiner. I et typisk ekstraktion tilsattes 20 ml vand til 20 g fødevarer, og blandingen homogeniseredes i 30 sekunder under anvendelse af en laboratorieblender (Tekmar Co.) Til mere viscose fødevarer anvendtes 2 gange dette rumfang vand.

“ 20

Stafylokokenterotoxin sattes til fødevaren enten før eller efter homogenisering. Fødevarehomogenatet undersøgtes direkte under anvendese af den diagnostiske reagensdyppes tav beskrevet ovenfor. Positive resultater blev op-25 nået med de fødevareprøver, hvortil lave niveauer af enterotoxin sattes. Yderligere extraktionstrin blev udført på fødevarehomogenaterne for at forbedre følsomheden for stafylokokenterotoxinafsløring. Homogenetet justeres Π typisk til pH 4,5 med 6 N HC1 og centrifugeret i 20 η 30 minutter ved 20.000 x g, og den supernatante del ind- r’j stilledes til pH 7,5 med 5 N NaOH, centrifugeredes atter I 20 minutter ved 20.000 κ g, og den supernatante del an vendtes direkte ved dyppestavsforsøget. Fødevareextrakter præpareret på denne måde, havde en følsomhed for ente-35 rotoxinafsløring på 1 nanogram pr. milliliter af extrak-ten for hver afprøvede toxin i fødevaren.

65 DK 172940 B1

Flydende fødevarer såsom mælk undersøgtes direkte ved at neddyppe den diagnostiske dyppestav i den flydende fødevare og foretage forsøg på samme måde som for de faste fødevarehomogenater. Ved at undersøge disse fødevare be-5 stemtes det også, at følsomheden kan forbedres til 1 na-nogram pr. milliliter ved at udføre de yderligere ovenfor beskrevne extraktionstrin.

Diagnostiske reagenholdere (dyppestave) udstyret med en 10 nitrocellulosemembran, der bærer monoklonale antistoffer specifikke for de enkelte stafylokokenterotoxiner neddyp-pedes i et reagensglas indeholdende 1 ml flydende fødevarer, fødevarehomogenat eller fødevareekstrakt fremstillet som beskrevet ovenfor, eller 1 ml PBS. hver af 15 disse opløsninger indeholdt 1 ng/ml af et tilsat stafylo-kokenterotoxin eller en blanding af enterotoxiner hver med en koncentration på 1 ng/ml. Dyppestaven forblev ned-dyppet i disse prøveopløsninger i 1 time ved stuetemperatur under omrystning på en roterende omryster. Stavene 20 fjernedes herefter fra prøverne og vaskedes under omrystning i 5 minutter i PBS med 0,5 % Tween 20, herefter 2 gange yderligere under omrystning i PBS alene, 5 minutter pr. afvaskning. En blanding af monoklonale antistof-alkaliske phophatasekonjugater præpareret som 25 beskrevet fremstilledes på følgende måde: 1:1000 for tyndinger af 2A konjugat (specifikt for A og E toxiner), 6b konjugat (specifikt for D, Cl, C,2 og C3 toxiner) og ID konjugat (specifikt for D toxin) fremstilledes i den samme opløsning (30 mikroliter af hver konjugat i 30 ml 30 PBS indeholdende 0,5 % Tween 20 og 3 % BSA). Stavene neddyppedes i denne konjugatblanding, 2 ml pr. stav, og inkuberedes i 30 minutter ved stuemperatur under omrystning. Stavene vaskedes 2 gange i PBS-Tween, herefter 3 gange under omrystning i PBS, 5 minutter pr. vask, for at 35 fjerne ubundet monoklonalt antistof/alkalisk phosphatase-konjugat fra membranoverfladen.

66 DK 172940 B1

Efter at have fjernet ubundet monoklonalt antistof-en-zyrokonjugat fra den diagnostiske reagensdyppestav påviste tilstedeværelsen af bundet konjugat ved at neddyppe staven i en opløsning af 5-brom-4-chlor indolyl phosphat 5 (BCIP, Sigma Chemical Co.) og nitroblå tetrazolium (NBT,

Sigma Chemical Co.). BCIP og NBT opløsningerne fremstil-ledes hver for sig på følgende måde: 3,2 ml BCIP opløses i 10 ml 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 5 nM MgCl2 og 8,8 NBT opløstes I 10 ml af samme opløsning. Disse opløsninger 10 blandedes umiddelbart inden anvendelsen. Stavene ned' = dyppedes i substratblandingen i 30 minutter ved stue- temperatur under omrystning, herefter rensedes i vand og lufttørredes, hvilket gav en permanent aflæsning af for- — søgsresultatet. Hele forsøgsmetoden kræver få til ingen 15 afpipetteringstrin, minimal håndteringstid og kan udføres i løbet af omtrent 2 timer. Substratet for enzymkon-jugatet BCIP hydrolyseredes med konjugatet bundet til to-xlnet på membranen til opnåelse af et reaktionsprodukt, der reducerer NBT til et uopløseligt blåt produkt, der — 20 binder til membranen på staven. Tilstedeværelsen af ~ stafylokonenterotoxin i prøven, der var bundet med det “ Immobiliserede første monoklonale antistof på membranen ~ og afsløret ved binding af det andet monoklonale anti- stof-enzymkonjugat indiceredes ved tilstedeværelsen af en 25 blå plet på nitrocellulosemembranen. Når der ikke fandtes — stasfylokokenterotoxin i prøven, forblev nitrocellulosemembranen hvid. Området af membranen, hvortil kontrol ” muse-immunoglobulin var immobiliseret, forblev i hvert tilfælde hvid. Identifikation af det specielle stafylo- s 30 kokenterotoxin, der forefandtes, d.v.s. A, B, C, D eller E indiceredes ved tilstedeværelsen af en blå plet på det 71 afgrænsede og identificerbare område af membranen, hvor til det monoklonale antistof specifikt for dette toxin -t var immobiliseret. Denne metode, der anvender en diagnos- 35 tisk reagensdyppestav, er I stand til at afsløre 1 nanogram pr. milliliter af en eller flere stafylokoken-terotoxiner i en flydende fødevare, i fødevarehomogenat t.m wim 67 DK 172940 B1 eller et fødevareekstrakt.

EKSEMPEL 25 5 Enzymimmunoforsøg (EIA) for coliforme bakterier.

Forsøg blev udført for at sammenligen aflæsningseffektiviteten for fækale coliformeer for at sinmenligne den omhandlede fremgangsmåde (CAP-EIA MPN) og EPA godkendt MPN 10 konfirmeret metode under anvendelse af EC bullion ved 44,5 °C.

Forsøgene udførtes som et standard 5-reagensglas MPN forsøg med følgende modifikationer. I stedet for lauryl-15 sulfattryptose (LST; Difco Labs, Detroit, MI) bullion eller lactosebullion (Difco Labs, Detroit, MI) anvendtes phenolrødt lactosebullion (PRLB; Difco Labs, Detroit, MI) indeholdende 80 mikrogram/ml 4-methylumbelliferon glu-curonld (MUG; sigma Chemical Co., St. Louis, MO ) som det 20 sandsynlige substrat. PRLB anvendtes, fordi Phenolrødt-farven muliggør afsløring af syreproduktion ved forgæring af lactose. Gas, der udvikles ved lactoseforgæring, inde-sluttedes af de omvendet Durham glas, der var anbragt inden i hver af reagensglassene. MUG var tilsat som en 25 mulighed for at tilvejebringe en foreløbig bekræftelse for tilstedeværelsen af E. coli. E. coli, den vigtigste fækale coliforme er den eneste organisme, der findes i vand, der kan spalte MUG under frigørelse af en fluorogen gruppe, der kan ses under UV lus (4, 10).

30 CAP-EIA MPN forsøgsmetoden gav 3 typer resultater: 1)

syre og gasproduktion ved forgæring af lactose (foreløbig coliformanalyse); 2) fluorescens fra spaltning af MUG

(foreløbig bekræftelse for E. coli eller fækale coli-35 forme) og 3) CAP-enzym immunoforsøgsbekræftelse (bekræftende undersøgelse baseret på monoklonale antistoffer). Disse resultater efter MUG og CAP-EIA reaktioner 68 DK 172940 B1 blev herefter sammenlignet med resultater opnået ved j hjælp af standardmetoder (t) baseret på lactoseforgæring | ved forhøjet temperatur ved 44,5 °C i EC bullion (Difco

Labs, Detroit, MI).

i 5

Forsøget udførtes på følgende måde: for at få tre 10-fold fortyndingsrækker, som er nødvendige til et MPN forsøg, indsamledes følgende rumfang vand fra en nærliggende bæk, der anvendte til at inokulere prøveglassene indeholdende 10 10 ml PRLB-MUG og udstyret med en polystyren brønd inden I hætten.

Række A - 5 prøveglas, 1,00 ml inokulum Række B - 5 prøveglas, 1,10 ml inokulum 15 Række C - 5 prøveglas, 0,01 ml inokulum

Alle prøveglassene inkuberedes natten over i omtrent 18-20 timer ved 35 "C.

20 Den følgende dag undersøgtes alle glassene for syre- og gasproduktion såvel som for fluorescens under UV lys. Alle prøveglassene viste uklarhed (vækst) uafhængig af syre- eller gasreaktionerne og vendtes om for at lade celle-substratsuspensionen fylde polystyrenbrønden inden fl 25 i hætten. De omvendte prøveglas anbragtes 1 time ved 35 "C for at muliggøre bakterier (antigen) i at klæbe til =~ polystyren hætte-brøndene. De antigenbundne hætte-brønde fjernedes herefter fra prøveglassene for at foretsætte med antistofbaserede bekræftende forsøg.

=i 30

For at udføre EIA (enzymimmunoforsøg) delen af undersø-^ gelsen behandledes brøndene i 30 minutter ved 35 eC med en opløsning af 3 % bovint serumalbumin (BSA; Sigma Che-| mical Co., St. Louis, MO) i phosphatpufferet satvand 35 (PBS; NaCl, 8,5 g: Na2HP04, 1,02 g: NaH2P04-H2O, 0,386 g: destilleret vand, 1000 ml, pH 7,2) for at blokere eventuelle uvundne pladser på polystyrenen. Herefter afde- 69 DK 172940 B1 kanteredes BSA opløsningen, brøndene vaskedes 2 gange med PBS, herefter tilsattes 50 mikroliter af en hybridoma-cellesubernatant, der indeholdt monoklonale antistoffer rettet mod E. coliceller til hver brønd, og der 5 indkuberedes 1 time ved 35 "C for at muliggøre at antistoffet kunne reager med de specifikke antigener (E. coliceller) bundet til polystyrenen. Efter afdekantering af antistofsupernatantdelen fjernedes spor af eventuelt ubundet antistof ved at vaske brøndene 3 gange under an-10 vendelse af en PBS-Tween 20 opløsning (PBS + 0,05 % Tween 20, J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ). Et affi

nitets-renset alkalisk phosphortase-mærket gede-antistof over for muse-IgG (konjugat; KPL, Gaithersburg, MD) fortyndedes 1:1000 i PBS, og 50 mikroliterprøver blev sat 15 til hver brønd. Efter 1 times inkubation ved 35 eC

fjernedes eventuelt ubundet konjugat i brøndene ved 4 gange afvask med PBS-Tween 20 opløsning. Det alkaliske phosphatasesubstrat anvendt til afsløring var natri-umpara-nitrophenylphosphat eller Sigma-104 substrat 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), fremstillet i en slutkoncentration på 1 mg/ml i 10 % diethanol-aminpuffer (diethanolamin, 97 ml;NaN^· 0,2 g; MgCl26H20, 100 mg og destilleret vand, 800 ml, pH 9,8). Substratet indsattes i 100 raiokroliterprøver pr. brønd, hvorefter der inkube-25 redes 30 minutter ved 35 *C, hvorved reaktionen i brøndene kunne ses visuelt. For at kvantificere overførtes i dette eksempel den omsatte substratopløsningtil en mikro-titerplade og bestemtes instrumentalt ved hjælp af Titertek Multiscan (Flow Laboratories, Mcleans, VA) ud-30 styret med et 405 nm filter.

For at udføre almindelige bekræftende forsøg for fækale coliforme under anvendele af EC bullion (Difco Labs, Detroit, MI) overførtes aseptisk en øsefuld af væksten fra 35 hver af de over natten dyrkede PRLB dyrkninger til et reagensglas indeholdende 10 ml EC bouillon og udstyredes med et omvendt Durham glas. Herefter inkuberedes 24-48 70 DK 172940 B1 timer ved 44,5 °C, således som specificeret i standard-j metoder (1), hvorefter der undersøgtes for lactoseforgæ- ring (indesluttet gas i Durham-inassen). Eventuelle spor af gasbobler inden i glassene blev betragtet som positiv 5 reaktion.

De opsummerede resultater for hvert forsøg er angivet i _ tabel XII og tabel XIII. Resultaterne af forsøg 1 viser, at baseret på gasproduktion ud fra lactose, fås en posi-10 tiv kombination af 551, der ifølge den statistiske MPN tabel er 35 coliforme/ml (foreløbig undersøgelse). Blandt de gaspositive (+) prøveglas, var kun 4 (A2-A5) positive ved MUG forsøget, og de indeholder derfor sandsynligvis E. coli (foreløbig bekræftelse for E. coli eller fækale 15 coliforme). Blandt de bekræftende resultater viste almindelig EC undersøgelse 5 rør (A1-A5) sig at være ~ positive for fækale coliforme, medens kun 4 prøveglas viste positiv reaktivitet ved CAP-EIA metoden. De positive ElA aflæsninger lå fra 0,55 indtil 1,06 med den 20 negative reaktion omkring 0,20. De positive EIA resul tater er kraftigt understøttet af de positive MUG resules tater, på den måde at begge disse forsøg indicerer til stedeværelsen af fækalecoliforme I de samme prøveglas, A2-A5. Den kendsgerning, at prøveglas Al var negativ ved 25 MUG og EIA, men positiv ved EC, var ikke overraskende, fordi forekomsten af falske (+) og falske (-) reaktioner, der almindeligt Ses ved de almindelige MPN metoder (15, 16, 20). Selektiviteten af EC substratet sammen med de forhøjede inkubationstemperaturer er velkendt for at '1 30 påvirke genfindeisen af fækale coliformer. Ca. 7 % af de i fækale coliforme (E. coli) vil yderligere ikke frembringe gas på EC (falske negativer), og 8 % af ikke-fækale co-δ liformer har vist sig at være i stand til at vokse og frembringe gas I EC boullion (falske positive). EC reak-35 tionen observeret i rør Al kan derfor være en falsk positiv reaktion, der vil være en forklaring for dens uover-—- ensstemmelse med MUG og EIA resultaterne for rør Al. Med 71 DK 172940 B1 hensyn til de andre prøveglas (B1-B5, C1-C5) i samme forsøg observeredes glimrende korrealation mellem alle forsøgene. Ved andre ord, prøveglas der var MUG (-) var også EC (-) og EIA (-), hvilket bekræfter fravær af fæ-5 kale colifortne disse prøveglas.

I forsøg 2 var den anvendte vandprøve, der skulle bruges til inokulering af prøveglassene, kraftigere kontramineret, fordi alle sandlynlige rør var positive for glaspro-10 duktion. Baseret på den statistiske MPN tabel vil en positiv kombination af 5 5 5 indicere tilstedeværelsen af mere end 240 coliforme/ml. Ved sammenligning opnåedes ved det bekræftende forsøg glimrende korrealition mellem MUGA, EC og antistofbaseret EIA. Hver prøveglas, der vi-15 ste fluorescens (MUG +) var også positiv ved EC samt ved EIA. EIA reaktionerne lå fra ganske svagt positive aflæsninger på 0,46 (B2) til meget kraftige reaktioner på 2,15 observeret på C4.

20 Resultaterne af disse to forsøg viser, at den omhandlede antistofbaserede CAP-EIA undersøgelsesmetode er så effektiv som det EPA anerkendte EC forsøg til at bekræfte tilstedeværelsen af fækale coliformer. Yderligere som vist i tilfælde med prøveglas Al i forsøg 1, viste CAP-EIA 25 forsøget en mindre tendens til at blive falske positive eller negtlve reaktioner på grund af antistof-antigen-reaktionernes specifikke art. Yderligere frembryder CAP-EIA metoden adskillige klare fordele I forhold til den almindelige MPN undersøgelsesmetode, nemlig: 1) enkelhed, 30 både ved det foreløbige og det bekræftende forsøg, der kan foretages under anvendelse under det samme prøveglas uden behov for yderligere overførsler eller substrat; 2) hastigheden, CAP-EIA undersøgelsen kan udføres i en tredjedel til 1/2 af den tid, der er nødvendig for et 35 anmindeligt forsøg; og 3) specificiteten, antistofferne er højt specifikke for deres antigene targets.

72 DK 172940 B1

Disse fordele plus det enestående hætte-brønd design af CAP-EIA, der kan give 4 adskilte resultater (syre, gas, fluorescens og EIA) fra samme prøveglas gør metoden til et særdeles udmærket alternativ til den almindelige MPN 5 undersøgelsesmetode til analysering af coliforme og fæ-’ kale coliforme i vand og/eller fødevareprøver.

Metoden med at udføre EIA i et prøveglas eller reagensglashætte indeholdende et polystyrenindskud er ikke be-10 grænset til coliforme elkker fækale coliforme undersøgelser, men kan lige så vil anvendes til afsløring af andre bakterier.

EKSEMPEL 26 15

Fremstilling af 2-[3-(4-methyl-2,2,-bipyridin-4'-yl)-pro-py1]-1,3-dioxolan.

I en inert atmofære af argon sattes 30 ml tørt tetrahy-20 drofuran (THF), og 7,65 ml tør diisopropylamin (54,6 mmol) til en trehalset, 600 ml kolbe ved hjælp af en en injektionssprøjte under omrøring. Opløsningen afkøledes til -78 °C ved at neddyppe kolben i en blanding af tør is-isopropanol i et lavt bæger. 21,6 ml 2,5 Mn-butylli-25 thium (54 mmol) sattes langsomt til kolben. Den fremstillede opløsning omrørtes 15 minutter, og en opløsning af 9,58 g 4,4,-dimethyl-2,2,-bipyridin (52 mmol) opløst i 300 ml tør THF tildryppedes ved hjælp af en kanyle under omrøring i løbet af en time.

30

Den fremstillede brune blanding opmrørtes yderligere ved -78 °C i 2 timer, 10 g 2-(2-bromethyl)-l,3-diosylan (55 mmol) tilsattes via en injektionssprøjte, og den fremstillede blanding omrørtes ved -78 eC i 5 minutter. Reak-35 tionsbeholderen anbragtes herefter i et isbad (10 °C) og efter 30 minutters forløb begyndte farveforandring (efter 1 times forløb var farven mørk violet; efter 2 timer var 73 DK 172940 B1 farven blå; efter 2,5 timers forløb var farven grøn; og efter 3,25 timer var farven citrongul).

Reaktionsblandingen frakøledes med 30 ml mættet NaNl ef-5 terfulgt af 10 ml vand og 50 ml ether. Den vandige fase ekstrahederes 2 gange med 300 ml ether, og de kombinerede etherfaser blev ekstraheret igen med 100 ml vand og tørret over vandfrit natriumsulfat.

10 For at rense reaktionsproduktet adskiltes prøven på al-luminiumoxid (Merck) 90, aktivitet III, neutral. De anvendte elueringsmidler var petroleumsether/diethylether (2:1) efterfulgt af petroleumsether/diethylether (1:1) (udgangsmaterialer elueret fuldstændigt med petroleums-15 ether/diethylether (2:1) efterfulgt af slutproduktet).

Proton MNR analye bekræftede, at opbyning af det isolerede reaktionsprodukt er

/H

20 C«, CH

25 EKSEMPEL 27

Fremstilling og rensning af 4-(butan-l-al)-4'-methyl-2, 2 ' bipyridin.

30 2 g 2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4,-yl)-propyl]-l,3 di- oxolan opløses 1 50 ml IN HCL og opvarmes 2 timer ved 50 ®C. Opløsningen afkøledes, indstilledes til mellem pH 7 og 8 med natrium bicarbonat og ekstraheredes 2 gange med 100 ml chloroform.

35

De forenede chloroformfaser blev vasket med en ringe mængde vand, der tørret over natriumsulfat, filtreredes 74 DK 172940 B1 og inddampedes på roterende inddamper til opnåelse af en gul olie.

Den gule olie rensedes på en silicagelsøjle under anven- 5 delse af ethylacetat/toluen (1:1) som elueringsmiddel, i-, det urenheden blev elueret med methanol.

Protonanalyse [61,96-2,11 (m,2H); 2,43 (s,3H);2,46-2,50) (t,2H); 2,53-2,80 (m,2H); 7,12-7,14 (m,2H); 8,17-8,21 10 (br. s,2H); 8,52-8,58 (m,2H); 9,89 (s,IH)] bekræftede, at opbygningen af reaktionsproduktet er CHj c«i.· CX) EKSEMPEL 28 20 Fremstilling af 4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)smørsy-:: re.

0,5 g 4-(butan-l-al)-4'methyl-2,2'bipyridin (2,0 mmol) opløstes i 10 ml absolut acetone. 225 mg fint pulveri-“ 25 seret kaliumpermanganat (KMnO^; 1,42 mmol) sattes pores tionsvis til opløsningen under omrøring. Omsætningen fulgtes ved hjælp af et tyndt lag chromatografi (siliciumoxid; ethylacetat/toluen 50:50) der viste, at medens aldehydet gradvist forsvandt, dannedes en bipyridin med 30 lavt Rf.

fiiwB

Efter at omsætningen var afsluttet tilsattes vand, og

H

! Mn02 ffa^iltreredes og der vaskedes med en ringe mængde

^2^^(a<3·)· Acetonen fjernedes på en roterende inddamper 35 og remanensen extraheredes med CH2CI2 for at fjerne ikke-sure bipyridiner. Den vandige opløsning indstilledes til sur reaktion ved forsigtig tilsætning af 1,0 N HC1 til pH

75 DK 172940 B1 4,8. Opløsningen blev delvis uklar, når man nåede denne pH-værdi, og suspensionen opløstes atter ved lavere pH.

Blandingen extraheredes 5 gange med lige rumfang CH2C12, tørret over Na2SO^ og inddampet på en roterende Inddamper 5 til en olie, der straks størknede i vakuum. Det urensede faste stof omkrystalliseredes med chloroform: petroleums-ether, hvorved der opnåedes hvide krysteller med smeltepunkt 103,5 *C - 105,5 °C; IR: 1704 cm*^, proton NMR analyse var i overensstemmelse med følgende opbygning: 10 ctfj coon 15 ^ EKSEMPEL 29

Fremstilling af bis(2,2'bipyridin)[4-(butan-l-al)-4'-me-thyl-2,2'-bipyridin] ruthenium (II) diperchlorat: Forbin-20 delse I.

250 mg ruthenium bipyridyldichloriddihydrat (0,48 mmol) (Strem) i 50 ml ethylen glycol opvarmedes hurtigt til kogning og anbragtes herefter i et siliconeoliebad (130 25 9C. Til den fremstillede purpur-orange opløsning sattes 150 mg 2-[3-(-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-di-oxolan (0,53 mmol) i 10 ml ethylenglycol. Den fremstillede orangefarvede opløsning omrørtes 30 minutter ved 130 °C, afkøledes til stuetemperatur og fortyndedes 1:1 med 30 destilleret vand.

En koncentreret opløsning af natrium perchlorat i vand sattes til opløsningen, hvorved der dannedes et meget finkornet orange bundfald. Blandingen afkøledes natten 35 over, filtreres og bundfaldet vaskedes med vand.

Bundfaldet opløstes i varmt vand, og der omkrystallisere- 76 DK 172940 B1 des ved tilsætning af perchlorsyre til frembringelse af klar orange krysteller, der herefter filtreredes, vaskedes med koldt vand og tørredes. Opkrystallisationen blev 5 gentaget, hvorved der opnåedes 150 mg klart orange 5 krystaller.

i NMR analyse angav følgende opbygning - - 2 + 10

'ί-* J

é^/\

Cr<) ^ 20 - - I den foreliggende beskrivelse med krav omtales ovennævnte forbindelse som forbindelse I.

25 EKSEMPEL 30

Fremstilling af bis(2,2'-bipyridin)[4-(4-methyl-2,2'-bl-— pyridin-4'-yl)-smørsyre] ruthenium (II) dihexafluor- phosphat: Forbindelse II.

30 134 mg 4-(4-methyl-2,2'-bibyridin-4'-yl)smørsyre (0,52

Fa] , .. mml) opløstes i 50 ml vand. Opløsningen afgassedes med j argon, og 250 mg ruthenium bipyridyodichloriddihydrat ! (Strem) (0,48 mmol) tilsattes. Blandingen opvarmedes . 35 under argon med tilbagesvaling i 4 timer. Vandet fjer nedes ved afdampning på roterende inddamper, og remene-sensen opløstes i mindst mulig mængde vand og anbragtes mmm 77 DK 172940 B1 på en Sephadex SP-25- ionbyttersøjle. Efter eluering af urenheder med vand elueredes forbindelsen som et rødt bånd med 0,2 M NaCl opløsning, og forbindelsen isoleredes som hexafluorphosphatet ved tilsætning af en mættet 5 vandig opløsning af NH^PFg. Den urensede forbindelse gen-udfældedes 2 gange med vartn acetone med diethylether.

Analyse: Beregnet; C, 43,80 %; H, 3,36 %; N, 8,76 *.

Fundet? c, 43,82 %; H, 3,54 %; N, 8.55 %.

10 Proton NMR analyse var i overensstemmelse med følgende opbygning - - 2 + 15 -C«»·

(pfA

e</\

25 II

EKSEMPEL 31 30

Fremstilling af N-[4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4,-yl)-bu-tyl]-pthalimid. 1 en inert atmosfære af argon sattes 30 ml tørt tetra-35 hydrofuran (THF) og 7,65 ml tør diisopropylamin (54,6 mmol) til en trehalset, 600 ml kolbe ved hjælp af en Injektionssprøjte under omrøring, opløsningen afkøledes til 78 DK 172940 B1 -78 °C ved at neddyppe kolben i en blanding af tør is-isopropanol 1 et lavt bæger. 21,6 ml 2,5 N-butyllithium (54 mmol) sattes langsomt til kolben. Den fremstillede opløsning omrørtes 15 minutter, og en opløsning af 9,58 g 5 4,4'-dimethyl-2,2’-dipyridin (52 mmol) opløst i 300 ml = tør THF tildryppedes via injektionssprøjte i løbet af 1 time under omrøring.

Den fremstillede brune blanding omrørtes yderligere ved -10 78 °C i 2 timer, der tilsttes hurtigt 100 g 1,3-dibrom- propan (0,495 mol), og den fremstillede blanding omrørtes 1 1 time ved -78 "C. Herefter omrørtes blandingen y- derligere 2 timer ved stuetemperatur. Blandingens farve - forandredes fra brun til blå til gul. Det meste af opløs- 15 ningsmidlet fjernedes ved afdampning på roterende = inddamper, og 200 ml vand tilsattes, hvorved der dannedes 2 faser. Koncentreret HC1 tilsattes for at sænke pH til 0. Det organiske lag bortkastedes. Det vandige lag vaskedes 2 gange med 100 ml ether. pH hævedes til mellem 1 og 20 2. Der udskilte en rød olie, og der extraheredes med CH2CI2· Efter tørring og opløsning med vandfrit Na2CPOg, afdampedes det meste C^Clj på roterende inddamper, og prøven anbragtes på en silicagelsøjle. Prøven elueredes med chloroform, hvorved der opnåedes en lysegul olie, der 25 udkrystalliserédes efter afkøling natten over (12,37 g).

4 g af den urensede 4-(4-brombutyl)-41-methyl-2,2’-bipy-ridin (13,3 mmol) fremstillet på denne måde sattes herefter til en suspension af 2,46 g caliumphthalimid (13,3 " 30 mmol) i 60 ml dimethylformamid (DMF). Herefter omrørtes blandingen ved omtrent 50 °C i to timer. 90 ml CHClg sat-~= tes til blandingen, hvorefter der tilsattes 125 ml vand.

CHC1~ laget fraskiltes, og det vandige lag extraheredes 2 ! gange med 50 ml chloroform. De forenede CHCl^ lag 35 vaskedes med 50 ml H2O, der tørredes over vandfrit NajSO^ og inddampedes på roterende inddamper, hvorved der opnåedes en svagt orangefarvede olie, der størknede ved hen- 79 DK 172940 B1 stand natten over. Den urensede forbindelse omkrystalliseredes med acetone/ethanol, hvorved der opnåedes 2,21 g (44,5 %) hvide krystaller med (smeltepunkt 114,5-117,0 •C).

5 Analyse: Beregnet; C, 74,38 %; H, 5,70 %; N, 11,31 %.

Fundet; C, 73,98 %; H, 6,14 %; N, 11,28 %.

Ir: Phthalimidcarbonyl-strækning 1771 og 1704 cm’'1.

Proton NMR analyse viste aromatisk resonans (* 7,75-7,85, m, 4H) ud over de sædvanlige bipyrIdylderivatsignaler.

10 Disse resultater er i overensstemmelse med følgende opbygning o CX) EKSEMPEL 32 20

Fremstilling af theopyllin-8-smørsyre-[4-(4-methyl-2,2’-bipyridin-4’-yl)-butyl]amid: Forbindelse III.

370 mg (1 mmol) N-[4-(4-methyl-2,2’-bipyridin-4’-yl)-bu-25 tyl]-phthalimid opslemmedes i 100 ml ethanol, der behandledes med hydrazinhydrat (720 mg, 1,4 mmol), omrørtes og opvarmedes 4 timer ved tilbagesvaling, i løbet af hvilket tidsrum alt det faste materiale opløstes. Mod afslutningen af reaktionen begyndte et hvidt bundfald at 30 dannes.

Under afkøling indstilledes reaktionsblandingen til basisreaktion med 50 % NaOh, og herefter udhældes i 100 ml vand. Der opnåedes en opløsning, Na2CO^ tilsattes for at 35 udsalte forbindelsen som en olie. Aminen extraherede under anvendelse af tre 40 ml portioner CI^C^. Extrakterne tørredes med CaSO^, filtreredes og Inddampedes, hvorved 80 DK 172940 B1 amino bipyridinderlvatet opnåedes som en farveløs olie (udbytte · 0,135 g; 56 %).

! 1,34 g (5,6 mmol) 4-C4-(l-aminobutyl))4'-methyl-2,2’- 5 bipyridin og theopyllin-8-smørsyre (1,18 g; 4,4 mmol) ! opløstes ved stuetemperatur i 10 ml tør pyridin. Til opløsningen sattes 1,16 g (5,6 mmol) diclychlohexylcar-bodiimid. Der omrørtes natten over ved stuetemperatur. Tyndtlagschromatografi på alluminiumoxid (mobil fase « 15 10 % methanol/chloroform) afslørede en enkel produktplet med f en på 0,68. Det udfældede dicyclohexylures fjernedes ved filtrering, og pyridinen afstrippedes til opnåelse af et fast stof, der tritureredes i ether og filtreredes (udbytte * 2,13 g; 99 %).

15 EKSEMPEL 33 ^ Fremstilling af bis-(2,2'-bipyridin)[theopyllin-8-smørsy- re-4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-butylamid] ruthenium — 20 (II) dichlorid: Ru (II)-forbindelse III konjugat.

— Til en blanding af 154 mg (0,296 mmol) bis-)2,2'-bipyridin) ruthenium (II) dichlorid dihydrat og 175 mg (0,357 mmol) af forbindelse (III) beskrevet ovenfor sattes 40 ml 25 ethanol/vand (1:1, rumfang/rumfang). Denne blanding blev -- argonafgasset i mørke I 15 minutter og opvarmet med ~ tilbagesvaling i mørke under argon i 3 timer til frem stilling af en klar, kirsebærrød opløsning. Den frem-" stillede klare kirsebærrøde opløsning henstod for at af- — ? 30 køle til stuetemperatur, og opløsningsmidlet afstrippedes É--3j under anvendelse af en roterende inddamper, idet op- i løsningen forblev i mørke ved en temperatur på mindre end ^ eller lig med 37 °C.

" Ί 35 Den fremstillede remanens opløstes i ca. 1-3 ml methanol, påførtes en Sephadex LH-20 chromatografisk søjle, (75 cm x 3 cm) og elueredes med en gennemstrømningshastighed på

C^H

81 DK 172940 B1 ca. 0,4-0,7 ml/min. Et klart rødt bånd (forbindelsen) blev tat fulgt af et brunt, ikke-luminiscerende bånd (urenhed) og toluminiscerende bånd. Det røde produktbånd viste sig at vare kontamineret med en ringe mængde af 5 materiale fra det brune, ikke-luminiscerende bånd. Det kontaininerende materiale adskiltes fra slutproduktet ved at køre prøven på en anden Sehadex LH-20 søjle* under ligende betingelser.

10 Det røde fremstillede produkt opnåedes ved at afstrippe opløsningsmidlet ved roterende inddampning. Det fremkomne faste materiale opløstes i ca. 1 ml methanol og genud-fældedes i ca. 75 ml diethylether til opnåelse af et orangefarvet pulver, der frafiltreredes.

15 Analyse: Beregnet; C, 54,51 %; H, 5,72 %; N, 13,99 %; 0, 10,47 %; cl, 6,44 %.

Fundet; C, 55,04 %; H, 6,35 %; N, 13,18 %; 0, 10,62 %; cl, 6,68 %.

20 EKSEMPEL 34

Modulering af elektrokemiluminescenssignal frembragt af Ru (II)-forbindelse (III) konjugat under anvendelse af antistoffer specifikke for theophyllin.

25

Ru(II)-forbindelse (III) konjugatet beskrevet i eksempel 33 fortyndedes til en slutkoncentration på 150 nM under anvendelse af 0,1 M phosphatpuffer, pH 6,0 indeholdende 0,35 M natriumfluorid (PBF puffer). Monoklonalt antistof 30 (klon nr. 9,49, ascitesprøve nr. WO 399, katalog nr. 046) specifikt for theophyllin Indkøbtes fra Kallestad Laboratories, Inc. (Chaska, MN). Det monoklonale antistof for-tyndedes til forskellige koncentrationer under anvendelse af PBF puffer (mellem 21,9 mikrogram protein/ml til 700 35 mlkrogram/ml).

Et andet monoklonalt antistof (kontrol MAB) der ikke var 82 DK 172940 B1 reaktivt med theophyllin indkøbtes fra Sigma (St. Louis, MO) og fortyndedes til forskellige koncentrationer mellem ; 21,9 mikrogram protein/ml til 700 mikrogram/ml under an vendelse af PBF puffer. En standardopløsning af theophyl-5 lin fremstilledes under anvendesle af theophyllin leveret af Aldrich Chemical Co., (Milwaukee, WI, katalog nr. 26-140-8, molvægt 180,17). Theophyllin opløstes i PBF puffer til en slutkoncentration på 75 mikromolær og fortyndedes med PBF puffer til 6 mikromolær til anvendelse ved analy-10 sen. Inden man målte elektrokemiluminescensen tilsattes en opløsning indeholdende 250 mM oxalsyre og 5 rum-fang/rumfang-% Triton-X 100 (ECL opløsning) til reaktionsblandingen. Målingerne blev foretaget med et Berthold luminometer, mer var mdificeret for at muliggøre 15 anbringelsen af to platingazeelektroder i forsøgsglasset indeholdende reaktionsopløsningen. Elektroderne var forbundet til en potentiostat, og elektrokemiluminescensmålinger blev foretaget ved at føre et påtrykt potentiale over elektroderne fra 1,5-2,5 volt med en scanningshas-20 tighed på 50 mV/sek. Det anvendte Berthold luminometer til målingerne havde et høj forstærknings, rødtfølsomt fotoforstærkerrør. Luminumetereffekten til recorderen 5 justeredes til 10 tællinger/ volt. Målingerne registre-== redes på en X-Y-Y' recorder, og tophøjden anvendes som 25 måling på elektrokemiluminescens. Elektroderne rensedes mellem målingerne ved at afrense med en puffer med pH 4,2 indeholdende 0,1 M phosphat, 0,1 M citrat, 0,025 oxals-syre, og 1 % Triton X- 100; pulsere elektroderne i denne opløsning mellem +2,2 til -2,2 volt i 60 sekunder, hvor-30 efter man behandlede med +2,2 volt i 10 sekunder.

Herefter fjernedes elektroderne fra opløsningen, afrense-des i destilleret vand og blev tørret. Forsøget udførtes som vist i tabel XIV.

-t 35 En opløsning af kontrol monoklonale antistoffer, anti stoffer over for theophyllin eller PBF puffer sattes til et sæt forsøgsrør (trin 1). Til rørene sattes theophyllin

BHM

83 DK 172940 B1 eller PBF puffer (trin 2). Opløsningerne blev kort blandet ved at ryste reagensglassene og lade reagere 25 minutter ved stuetemperatur. Herefter sattes en opløsning af Ru(II)-forbindelse (III) konjugat til rørene (trin 3).

5 Reagensglassene rystedes og henstod ved stuetemperatur i 15 minutter. Til sidst sattes 100 mikroliter ECL opløsning til hvert rør, og elektrokemiluminescensen måltes som beskrevet ovenfor. Resultaterne er angivet i tabel XV.

10 15 20 25 30 35 84 DK 172940 B1

Tabel XIV

j Eksperimentel opbygning til undersøgelse af virkningen af antistof-Ru(II)-forbindelse (III) konjugatindvirkninger . 5 på elektrokemiluminescens.

Trin 1 Trin 2 Trin 3 100 mikroliter 200 mikroliter 100 mikroliter af: af: af: 10 _ _ _ A. Kontrol mono- Puffer Ru(II)-forbin-

klonalt anti- delse III

stof (2,19 mi- konjugat 15 krogram til 70 mikrogram) eller 20 B· Anti-theopyllin Puffer eller Ru(ll)-forbin-

antistof (2,19 theopyllin delse III

mikrogram til konjugat 70 mikrogram) 25 eller C. PBF puffer Puffer Ru(III)-forbin delse III konjugat 30 eller puffer Εϊ 35 85 DK 172940 B1

Tabel XV

Virkning af antistof og theophyllin på elektroluminescens af Ru(II)-forbindelse (III) konjugat 5

Antostof protein Kontrol koncen- MAB + Anti-theopyllin tration Ru(II) Anti-theopyllin MAB + theopyl- 10 mikro- forbin- MAB + Ru(II)- lin Ru( II ^for-

gram/rør delse III forbindelse III bindelse III

Luminescensmåling 15 2,19 55.000 40.000 43.000 55.000 41.000 57.000 4,38 57.000 22.500 37.000 57.000 25.000 36.000 8,75 53.000 20.000 33.500 20 50.000 22.000 30.500 35.0 43.000 13.500 17.500 41.000 14.000 16.000 70.0 42.000 11.000 11.000 37.500 12.000 12.500 25

Elektrokemiluminescensen af dobbelte prøver måltes som beskrevet ovenfor. Elektrokemiluminescensen af Ru(II)-forbindelse III konjugat anvendt i ovennævnte undersøgelse var 57.200, når der måltes i puffer uden tilsætning 30 af antistof. Baggrunden for pufferblandingen var 5750.

Resultaterne viser, at et monoklonalt antistof, der specifikt genkender theophyllin, dersom det bringes i kontakt med en analog af theophyllin, hvortil en rutheni-35 umforbindelse er knyttet f.eks. Ru(II)-forbindelse III vil bevirke nedgang i elektrokemiluminescensen. Nedgangen i elektrokemiluminescens er proportional med anti- 86 DK 172940 B1 stofkoncentrationen, dersom Ru(II)-forbindelse III kon-j jugatkoncentrationen holdes konstant. Dersom et antistof anvendes, der ikke reagerer med theophyllin, ses kun en ringe nedgang i elektrokemiluminescensen ved den højeste 5 koncentration af antistof.

Resultaterne viser også, at dersom theophyllin bringes i kontakt med anti-theophyllin-antistof og herefter Ru(II)-forbindelse III konjugatet sættes til denne blanding, er 10 størrelsen af elektrokemiluminescens større. Dette viser, at theophyllin konkurrere med binding af antistof til Ru(II)-forbindelse III konjugat hvilket bevirker en større mængde Ru(II)-forbindelse III konjugat, der kan frembringe elektrokemiluminescens.

i 15 EKSEMPEL 35

Analyse af theopyllin i serum baseret på et homogent elektrokemiluminescens immunoforsøg.

20

Baseret på resultaterne beskrevet i eksempel 34 udvikledes et homogent immunoforsøg for theophyllin under anvendelse af antistof over for theophyllin og Ru(II)-for-bindelse III konjugatet beskrevet i eksempel 33 i et kom-25 petitivt bindingsforsøg. De anvendte materialer var som beskrevet i eksempel 34, bortset fra at PBF puffere var 0,1 M phospha tpuf fer, pH 6,0 indeholdende 0,1 M na-triumchlorid. Til denne analyse udvalgtes en særlig koncentration af monoklonalt antistof overfor theophyllin.

30 Antistofkoncentrationen var 55 mikrogram/ml. Ru(II)-for-bindelser III konjugatkoncentrationen indstilledes til 175 nM. Theophylin sattes til humant serum til opnåelse *» af slutkoncentrationer på 2,5, 5, 10, 20 og 40 mikrogram theophyllin/ml serum. Analysen udførtes ved at sætte 10 35 mikroliter serum til 290 mikroliter anti/theophyllin monoklonalt antistof og holde opløsningen ved stueterneratur i 25 minutter. Herefter sattes 100 mikroliter Ru(II)-for- > i i 87 DK 172940 B1 blndelse III konjugat til hvert rør til opnåelse af en slutkoncentration på 35 nM, og herefter holdt man denne opløsning ved stuetemperatur 1 15 minutter. Dernæst tilsattes 100 mikroliter ECL opløsning beskrevet i eksempel 5 34 til hvert rør, og opløsningernes elektrokemilumine- scensegenskaber måltes som beskrevet tidligere under anvendelse af en trimmebølge på 1,5 volt til 2,5 volt ved 50 mV/sek. Resultaterne er angivet i figur 2 og viser, at der er en korrelation mellem koncentrationen af theophyl-10 lin i en serumprøve og mængden af elektrokemi luminescens udsendt af reaktionsblandingen. Denne observation viser, at det er muligt at udvikle en analysemetode for theo-phyllin.

15 Baseret på disse resultater kan fagmanden udvikle et homogent elektrokemiluminescens immunoforsøg til afsløring og kvantificering af en særlig analyt i et biologisk materiale.

20 EKSEMPEL 36

Analyse af theophyllin i hæmolyseret, lipeide, ikteriske og normale serumprøver baseret på en homogen elektrokemi-luminiscens immunoanalyse og sammenligning med en fluor-25 escenspolariseringsanalyse.

Koncentrationen af theophyllin i forskellige serumprøver bestemtes under anvendelse af en homonogen elektrokemiluminescens immunoanalysemetode. Opbygningen af forsøget 30 var et kompetitivt bindingsforsøg under anvendelse af et monoklonalt antistof specifikt for theophyllin og Ru(II)- forbindelse III konjugatet beskrevet i eksempel 33. Reagenser og metoder til frembringelse af elektrokemiluminescens er som beskrevet i det tidligere eksempel.

35

Fluorescenspolariseringsanalysen anvendt til at måle koncentration af theophyllin i forskellige serumprøver 88 DK 172940 B1 udførtes under anvendelse af et automatisk TDX Instrument fra Abbott Laboratories (North Chicago, IL). Hæmolysere-de, lipæmiske, Ikterlske og normale sera undersøgtes ved I analyserne, og resultaterfne for anormale sera er angivet 5 i tabel XVI nedenfor.

i Tabel XVI

Homogent theophylinanalysemetode, egenskaber ved poten-10 tielt problematiske sera.

i

Faktorkon- r Serum koncentration Normalt område “ 15 Hæmolyseret 12,4 mg/dl hæmo- 0-3,2 mg/dl globin

Lipæmisk 405 mg/dl trigly- 10-190 mg/dl cerider 196 mg/dl chole- 120-200 mg/dl 20 sterol

Ikterisk 10 mg/dl bilirubin 0-1,5 mg/dl

Forskellige mængder theophyllin sattes til serumprøverne til slutkoncentrationer på mellem 2,5 mikrogram theophyl-25 lin/ml og 40 mikrogram theophyllin/ml. Resultaterne af det homogene elektrokemiluminescens immunoforsøg er angivet I figur 3. Hver serumprøve analyseres også for koncentration af theophylin ved hjælp af en fluorescenspola-riseringsanalysemetode. Koncentrationen af theophyllin 30 målt ved hjælp af det homogene elektrokemiluminescens immunoforsøg og ved fluorescenspolariseringsanalysemetoden sammenlignedes. Resultaterne blev afsat som en spredning og er vist i figurerne 4A-D. Punkterne for resultaterne analyseredes ved hjælp af lineær regression og korrela-35 tionskoefficienterne beregnedes. Analysen viser en glimrende korrealation mellem de to analysemetoder. Korrelationskoefficienterne (r) var mellem 0,98 og 1,00. Hæld- 89 DK 172940 B1 ningerne på kurverne får normale, hæmolyserede og lipæ-miske serumprøver var mellem 0,8 og 1,2 , hvilket viste glimrende genfindelse af theophyllin fra disse serumprøver.

5

Skønt elektrokemiluminescensen udsendt af de ikteriske (gulsotholdige) serumprøver Indeholdende theophylin var større end for de andre serumprøver, var den proportional højere ved hver theophyllinkoncentration. Dette fremgår 10 af figur 4D. Korrealationskoefficienten er 1,00 for punkterne når man sammenligner elektrokemiluminescens og fluorescenspolarisering; imedlertid er hældningen 2,14, hviket viser højere genfindelse for theophyllin i den ikteriske serumprøve.

15

Baseret på disse resultater kan koncentrationen af theo-phyllin i en ekterisk prøve bestemmes ved at optegne en standardkurve for prøven ved at tilsætte kendte mængder Ru(II)-forbindelsekonjugat til prøver af den ikteriske 20 serum. Disse resultater viser, at et homogent elektrokemiluminescens inununoundersøgelsesmetode kan anvendes til at måle koncentrationen af theophyllin tilstede i serum-prøver indeholdende unormale niveauer af hæmoglobin, li-pider og bilirubin.

25

En homogen elektrokemiluminescens immunoundersøgelses-metode frembyder fordelse i forhold til en fluorescenspolariseringsmetode på grund af alsidigheden ved ECL de-tektion, f.eks. mere følsom detektion ved højere koncen-30 trationer af biologike molekyler.

Et homogent elektrokemiluminescens imunoforsøg frembyder yderligere fordele I forhold til en fluorescenspolariseringsmetode fordi ingen Indfaldende lyskilde er nød-35 vendig; Elektrisk stimulering er det eneste krav til effektiv lysfrembringelse. Som en følge heraf er der ikke behov for speciel optik. Da målingsprincippet er rent 90 DK 172940 B1 specifikt photonemmision induceret ved elektrokemisk stimulering, er systemets følsomhed potentiel betydeligt større end fluorescenspolarisering og større dynamisk område er opnåeligt. Måling af en betydelig større mængde 5 forskellige analyter er også mulig med en homogen elektrokemiluminescens immunoforsøgsmetode end hvad der opnås ved fluorescenspolariseringsmetoden på grund af den selektive modulering af elektrisk stimuleret kemiluminescens af biobolekylære genkendelsestildragelser som 10 f.eks. den gensidige indvirkning mellem antistof-antigen.

Baseret på disse resultater vil fagmanden vide, at homogene elektrokemiluminescens immunoanalysemetoder til at afsløre andre analyter i anormale serumprøver er mulige = 15 at udvikle.

EKSEMPEL 37 = Undersøgeslse for theophyllin i serumbaseret på en horao- ~ 20 gen elektrokemiluminescens immunoalalysemetode og sammen ligning med en højtryksvæskechromatografisk (HPLC) metode.

Forskellige mængder theophyllin sattes til humane serum-25 prøver til opnåelse af slutkoncentrationer mellem 2,5 mikrogram theophyllin/ml og 40 mikrogram theophyllin/ml.

= Hver prøve opdeltes herefter i 2 prøver, og koncentra tionen af theopyllin i prøven bestemtes ved hjælp af en homogen elektrokemiluminescens immunoanalysemetode og 30 sammenlignedes med de opnåede resultater for samme serumprøver under anvendelse af en HPLC metode. Af det homogene elektrokemiluminescens immunoforsøg var et kompe-titivt bindings forsøg under anvendelse af et monoklonalt = antistof specifikt for theophyllin og Ru(II)-forbindelse 35 ill konjugatet. Reagenserne og metoderne ved denne analysemetode er som beskrevet i det tidligere eksempel.

Den anvendte HPLC metode til at måle koncentrationen af il 91 DK 172940 B1 theophyllin i forskellige serumprøver er beskrevet nedenfor.

Theophyllin (1,3-dimethylxanthin) hældes fra serumprotei-5 ner ved udfældning af sidstnævnte med acetonitril. Den supernatante væske indeholdende theophyllin blev kørt på et HPLC system udstyret med en Waters Associates Micro Bondapak C18 søjle, (3,9 mm x 30 cm). Chromatogrammet var fuldstændig opløst i mindre tid end 10 minutter.

10 Følgende reagenser anvendtes: Natriumacetat (reagens

grad), afioniseret vand (renset ved hjælp af Millipore Milli Q* system), acetonitril (HPLC grad) og theyphyllin standard (Sigma). Opløsningmidlet anvendt til udfældning 15 af serumproteinerne var en 20 mM natriumacetatpuffer, pH

4.0 indeholdende 14 rumfang/rumfang-% acetonitril. Den HPLC mobile fasepuffer var 10 mM natriumacetatpuffer, pH

4.0 indeholdende 7 ruinfang/rumfang-% acetinitril. Strømningshastigheden var 1,5 ml/min., og eluanten kontrolle- 20 redes ved hjælp af et UV spektrometer ved 270 nm. Følsomheden af UVf absorbantdetektoren var sat til 0,02 ab-sorbansenhed fuld udslag (AUFS). Stuetemperaturen lå typisk mellem 22 og 24 °C.

25 Resultaterne af den homogene elektrokemiluminescerende immunoanalyse og HPLC anaysen til bestemmelse af koncentrationen af theophyllin i serum er angivet i figur 5. Resultaterne blev anbragt som punkter, og disse punkter analyseredes ved hjælp af lineær regression. Korrela-30 tionskoefficienten beregnedes. Korrelationskoefficienten (r) var 0,98, hvilket viser glimrende korrelation mellem de to undersøgelsesmetoder.

Hældningen på kurven var 1,197, hvilket viser glimrende 35 genfindelse af theophyllinet fra serumprøven ved den homogene elektrokemiluminescerende immunoanaysemetode i forhold til standardmetoden baseret på HPLC. Den homogene 92 DK 172940 B1 elektrokemilumimescensanalysemetode frembyder fordele I forhold til HPLC metoden, fordi den er hurtig, følsom, og man let kan håndtere flere prøver. Baseret på disse | resultater vil fagmanden erkende, at homogene elektro- 5 kemiluminescens immunoanalysemetoder til afsløring af særlige analyter, der kan afsløres ved hjælp af HPLC og lignende metoder kan udvikles.

EKSEMPEL 38 10

Fremstilling af theophyllin-bovint serumalbumin konju-gater.

Theophyllin bovint serumalbumin (BSA) konjugater frem-15 stilledes ud fra theophyllin-3-methyl-smørsyre, theophyllin- 8 -smørsyre og theophyllin-7-eddikesyre på følgende måde. 50 mg BSA opløstes i 1,5 ml 0,15 M NaHCO^, pH

9,0. For sig tilsattes 16 mg ethyl-3'3-dimethylamino-propylcarbodiimidhydrochlorid (EDC1), 11 mgf N-hydroxy- 20 succinimid (NHS) og enten 17, 8 mg theophyllin-7-eddi kesyre, 20 mg theophyllin-8-smørsyre eller 20.9 mg theo-phyllin-3-methylsmørsyre oplyst i dimethylsulfoxid, og opløsningen opvarmedes 1-2 timer ved 45 °C. Opløsningen sattes dråbevist til BSA opløsningen og reagerede 1 time.

25 Theophyllin konjugater af BSA rensedes ved gelfil-treringschromatografi på en Sephades G-25 søje (1,6 cm x 38 cm) under anvendelse af 0,15 M PBS/0,1 % azid, pH 7,4 som den mobile fase og en strømningshastighed på 30 ml/time.

30 EKSEMPEL 39

Fremstilling af theophyllin-BSA biomag* partikler.

35 4 ml rumfang af Biomag*-aminpartikler (Advanced Magnetis,

Inc., Cambridge, MA) vaskedes 2-3 gange i separate T-kolber med phosphatpufferet saltvand (Sigma) (PBS), pH

Π Ί 93 DK 172940 B1 7,4 indeholdende 0,008 % Nonidet P-40 (NP-40).j Til den våde Biomag' kage sattes 10 ml 5 % glutaraldehyd (Sigma) 1 PBS, og aktiveringen skred fremad i løbet af 3 timer ender anvendelse af en roterende blander. De aktiverede 5 Biomag’ partikler vaskedes som beskrevet ovenfor til et totalantal på 4 afvaskninger og overførdtes til en T-kol-be.

6,8 mg theopyllin-BSA fremstillet som beskrevet i eksem-10 pel 38 i 10 ml PBS/NP-40 sattes til den aktiverede våde kage af Biomag’. Der omsattes natten over ved 4 °C under blading.

Den våde kage af aktiveret Biomag' vaskedes 3 gange med 15 20 ml 1 % BSA/0,15 M PBS/0,1 % azid (pH 7,4) idet den første afvaskning varede omtrent 30 minutter under anvendelse af en roterende blander.

EKSEMPEL 40 20

Fremstilling af forbindelse I-anti-theophyllin konjugat.

1,1 ml af et muse-anti-theophylin monoklonalt antistof (Kallestad, fremstillings nr. W0399; 4,6 mg/ml) centri-25 fugeredes ved 10.000 g i 8 minutter. Pufferen ombyttedes med 0,2 NaHCO^, 0,15 M NaCl, med azid pH 9,0 under anvendelse af en Amicon Centricon’ 30 koncentrator (centrifugeret ved 3000 x g ). Antistofopløsningen fortyndedes til 2 ml, og 3,2 mg forbindelse I tilsattes. Der 30 omsattes i 2 timer ved stuetemperatur under omrøring og 79 mikroliter vandig NaBH^ i en mængde på 1 mg/ml tilsattes, og opløsningen omrørtes 30 minutter.

Den fremstillede opløsning anbragtes på en Sephadex G-25 35 søjle (1,0 cm x 18,0 cm) forudbragt i ligevægt med tris puffer, og der elueredes med en hastighed på 15 ml/time. Fraktionerne indeholdende forbindelse I-anti-theophyllin i 94 DK 172940 B1 konjugatet bev slået sammen, overført til dialyserør og dialyseret mod 0,15 M phosphat/0,15 M NaF (PBS) pH 6,9 ( 4 1).

5 EKSEMPEL 41

Analyse af theophylin i serum baseret på en heterogen elektrokemiluminescensanalysemetode.

10 Under anvendelse af en immunometrisk forsøgsopbygning udvikledes en heterogen analysemetode for theophytyllin ξ under anvendelse af et i-mærket anti-theophyllin antistof og theophyllin BSA immobiliseret på Biomag' magnetiske partikler. Antistofkoncentrationen var 20 mikrogram/ml.

15 Den magnetiske partikelkoncentration var en vægt/rumfang-% faste partikler, theopyllin tilsattes til en slutkon-centration op 10 og 40 mikrogram/ml serum. Theopyllin serumstandarderne fortyndedes 1000 gange i PBF puffer (na-triumphosphat puffer, pH 7,0, 0,1 M natriumfluorid) inde-20 holdende 0,1 % BSA.

Analysen udførtes ved tilsætning af 75 mikroliter af de fortyndede serumstandarder til 75 mikroliter antistof konjugeret til forbindelse I og indubere opløsningen 20 25 minutter ved stuetemperatur. Herefter tilsattes 50 mikroliter theophyllin-BSA-Biomag’ partikler, og suspensionen henstod i 5 minutter. Partiklerne fraskiltes magnetisk, ” og 100 mikroliter af den supernatante del måltes for elektrokemiluminescens som beskrevet i eksempel 48.

30

Theopyllinkoncentration ECL1 SD % CV

mikrogram/ml++ 0 8,758 81 0.9 % j. 10 11,078 368 3,0 % ] 35 40 14,106 674 4,8 % 5¾ ECL tællinger pr. 10 sekunder 95 DK 172940 B1 ++ korrigeret ved fortynding.

Baseret på disse resultater kan fagmanden udvikle en heterogen elektrokemiluminescens immunoundersøgelsesmetode 5 for andre analyter af interesse i et biologisk materiale.

EKSEMPEL 42

Fremstilling af et forbindelse II-digoxigenin konjugat.

10 100,2 mg (0,104 mmol) forbindelse II, 41 mg (0,105 mmol) digoxigenin (Sigma) og 28 mg (0,136 mmol) 1,3-dicychlo-hexylcarbodiimid (DCC) sattes til en 50 ml rundbundet kolbe udstyret med en omrører. Til den fremstilede blan-15 ding satte fi-10 ml vandfrit pyridin (Aldrich Sure-Seal) under anvendelse af en injektionssprøjte med en 18 gauge nål. Kolben tilproppedes, forsegledes med Teflon tape, og indholdet omrørtes forsigtigt til opnåelse af en rød opløsning. Kolben henstod i mørke under omrøring i inde-20 lukke i 24 timer, på hvilket tidspunkt 6 mg (0,015 mmol) digoxigenin og 20 mg (0,097 mmol) DCC tilsattes. Opløsningen tilpropedes, to der omrørtes i mørke ved stuetemperatur. Den næste dag sås ingen dicyclohexylurinstof-udfældning. Yderligere 18 mg (0,05 mmol) digoxigenin og 25 103 mg (0,50 mmol) DCC tilsattes. Kolben forsegledes at ter og omrøringen fortsatte i mørke. Efter 72 timers forløb tilsattes yderligere 103 mg DCC, og opløsningen omrørtes 3 timer I mørke.

30 5-10 dråber vand sattes til opløsningen, der herefter strippedes til tørhed på en roterende inddamper i mørke til frembringelse af et rødt fast stof.

Det fremkomne røde faste stof blev dækket med aluminium-35 folie og tørret natten over i vacuum over CaS04 i en es-sikator. Det tørrede faste materiale opløstes herefter i 3-5 ml methanol, og omtrent 0,25 g vandfrit fast LICIO^ 96 DK 172940 B1 tilsattes blandingen. Når LiC104 var opløst anbragtes op-! løsningen på en Sephadex LH-20 søje (75 cm x 19 mm), og ! der elueredes med methanol med en strømningshastighed på mellem 7-10 sekunder/dråbe.

5 . Der sås 3 bånd efterhånden som chroma tografien skred frem; et svagt orange (rødtluminiscerende) første bånd (fraktion 1); et mørkerødt andet bånd, der repræsenterer hoveddelen af reaktionsproduktet (fraktion 2), og et 10 tredje bånd, der fulgte efter de to første bånd (sandsynligvis uomsat udgangsmaterialed), der bortkastedes.

Fordi bånd 1 og 2 knapt var adskilte på søjlen isoleredes eventuelt orange produkt i bånd 2 ved at dyppe en me-15 thanolopløsning af fraktion 2 (15 ml) i omtrent 300 ml tør diethylether (omrørt). Det fremkomne bundfald frasu-gedes på et 15 ml medium glasfilter og vaskedes 5 gange med 15 ml diethylether. Den tilbageblevne ether fjernedes ved at tørre komplekset natten over over CaSO^ i en 20 vacuum esikator. Det faste materiale bestemtes til at væ-~ re .. Jf \ / Y*T (ck^c 25 ru7—\ ?

&XJ

crf5 HjIh

A ° O

30 Q

π f) Crb 35 in EKSEMPEL 43 97 DK 172940 B1

Elektorkemiluminescens (ECL) af forbindelse II-digoxige-nin konjugat: Modulering af ECL signal ved hjælp af anti-5 digoxin antistof.

Monoklonalt antistof overfor digoxin fortyndedes til følgende koncentrationer i immunoførsøgspuffer: 1, 10, 50, 200 og 400 mikrogram/ml.

10

Forbindelse II-digoxigenin konjugat (50 mikromolær) fortyndedes til 150 nM i immunoforsøgspuffer (0,1 M phos-phatpuffer, pH 6,0, indeholdende 0,1 M natrium fluorid).

15 Til 200 mikroliter immunoforsøgspuffer i polypropylenrør (12 mm x 75 mm) sattes 100 mikroliter af forskellige koncentrationer af digoxin antistof og 100 mikroliter forbindelse II-digoxigenin konjugat (150 nM). Rørerne blandedes på en hvirvelblander og inkuberedes 15 minutter ved 20 stuetemperatur. Efter inkubation tilsattes 100 mikroliter EC1 opløsning (beskrevet ovenfor) og elektrokemiluminescensen måltes. Resultater:

Specifik antistof koncentration x 25 mikrogram/rør ECL signal 0,1 108000 1 114000 5 82500 30 10 64000 20 52000 40 36000

Totale ECL tællinger for 30 nM forbindeler II-digoxigenin 35 konjugat - 113666 (tophøjde).

Ved en koncentration på 40 mikrogram/rør var ikke sped- 98 DK 172940 B1 fik antistofmodulering af signalet 67000 tællinger i forhold til 36000 tællinger i nærværelse af et specifikt antistof overfor digoxin.

5 Som det fremgår af figur 6 viste en stigende koncentra-; tion af anti-digoxin antistof, når der omsattes med en fast koncentration af forbindelse Il-digoxigenin konju-gat, stigende modulation af det elektrokemiluminescerende signal. Denne egenskab kan anvendes med fordel til at 10 udvikle en homogen elektrokemiluninescensbaseret analysemetode til måling af digoxin i serum eller plasma.

EKSEMPEL 44 15 Homogen digoxinanalyse.

Baseret på resultaterne beskrevet i eksempel 43 kan en homogen elektrokemiluminescens immunoanalyse for digoxin udvikles under anvendele af antistof overfor digoxin og 20 forbindelse Il-digoxigenin konjugat under anvendele af en kompetitiv bindingsforsøgsmetode. Reagenserne, der kan anvendes er beskrevet i eksempel 43. Til denne analyse udvælges en særlig koncentration af monokonalt antistof overfor digoxin. Antistofkoncentrationen kan være mellem 25 75-100 mikrogram pr. ml. Forbindelse Il-digoxigenin _ konjugatkoncentrationerne kan være mellem 5-15 nM (slut- « koncentration).

Digoxinstandard sættes til humant serum til opnåelse af 30 en slutkoncentration på 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 8 og 16 nano- gram digoxin pr. ml serum.

Analysen udføres ved at sætte 10-30 mikroliter serum til - -i 300 mikroliter anti-digoxin monoklonalt antistof og hen-1 35 sætte opløsningen 30 minutter ved stuetemperatur. Heref ter kan 100 mikroliter af forbindele Il-digoxigenin kon-jugatet sættes til hvert rør til opnåelse af en slutkon-

«MM

99 DK 172940 B1 centration inden for området 5-15 nM, og opløsningen inkuberes 20 minutter ved stuetemperatur- 100 mikroliter af ECL opløsningen beskrevet ovenfor kan tilsættes hvert rør, og ECL kan måes som beskrevet tidligere.

5 EKSEMPEL 45

Fremstilling af Oubain-bovint serumalbunin konjugat.

10 50 mg ouain octahydrat (Aldrich) opløstes i 5 ml afioni seret H20. 81 mg NalO^ sattes til det opløste oubain, og blandingen inkuberedes 2 timer ved stuetemperatur. Reaktionen blev afbrudt ved at lede blandingen over en Dowex 1X-8 ionbytter harpikssøjle (5 ml), der var ækvilibreret 15 med afioniseret vand intil pH var mellem 5 og 6. Den oxiderede oubainfraktion opsamledes, når dråber, der kom ind i affaldsbeholderen viste tegn på blanding.

100 mg krystallinsk lyophiliseret bovint serumalbumin 20 (Sigma) (BSA) opløstes i 5 ml 0,1 M kaliumphosphatpufferet saltvand, pH 7,4 indeholdende 0,05 % azid. Den oxiderede oubainopløsning dryppedes til BSA opløsningen under omrøring. Den fremstillede opløsning omsattes 1 time ved stuetemperatur, inden der tilsattes 30 mg NaCNBH^ 25 (Aldrich). Opløsningen omrørtes herefter natten over ved stuetemperatur.

opløsningen koncentreredesf (11 ml til 4 ml) under anvendelse af polyethylenglycol-8000, og fri oubain og o-30 verskud af borhydrid fjernedes fra opløsningen ved gelfiltrering på Sephadex G-25 (søjle - 0,6 cm x 37 cm; elu-eringsmiddel - 0,1 Μ K2P04/0,15 M MaCl, pH 7,5 0,05 %

NaN3). Fraktionerne 11-17 blev slået sammen, og protein-koncentrationen bestemtes ved at måle absorbans ved 280 35 ran (efter fortynding).

EKSEMPEL 46 100 DK 172940 B1

Fremstilling af oubain-BSA-Sepharose.

5 2 g cyanbromid aktiveret Sepharose 4A (Pfharmacia) vaske des med 400 ml 1 mM HC1 i 50 ml protioner på en glasbrink med sinteret skive. Harpiksen vaskedes herefter med 20 ml 0,1 M naHCO^, 0,5 M NaCl puffer, pH 9,0 (koblingspuffer).

Efter overførsel af harpiksen til en polypropylenbeholder 10 tilsattes 30 mg oubain-BSA opløst i 15 ml koblingspuffer.

Den aktiverede harpiks henstod for at reagere med oubain-BSA i 2 timer under roterende blanding. De tilbageblevne aktive pladser omsattes med 7 ml 0,5 M ethanolamin (pH 8,0) i 2 timer ved stuetemperatur. Under anendelse af en 15 tragt med sintret skive underkastedes harpiksen vask med 100 ml af hvert af følgende opløsninger: Koblingspuffer; 0,15 M PBS; 1 mM HC1; koblingspuffer; 0,2 % NP-40 i PBS og PBS. Harpiksen genopslemmedes til 11 mm, og en tilstrækkelig mængde af denne suspension sattes til en 1,0 20 cm indvendig diameter søjle (Pharmacia) til opnåelse af et totalt lejerumfang på 3,5 ml.

EKSEMPEL 47 25 Fremstilling og affinitetsrensning af et anti-digoxin- ss forbindelse I konjugat.

450 mikroliter af en 1 mg/ml stamopløsning af et muse-anti-digoxin monoklonalt antistof (Cambridge Medical

- 30 Diagnostics, katalog nr. 200M-014, omstillings nr. MA

2507F) koncentreredes til 100 mikroliter under anvendelse 1 af in amicon Centricon 30" koncentrerende enhed. Til dette koncentrat sattes 900 mikroliter 0,2 M natrium bi-carbonatpuffer, pH 9,6 og 0,6 mg forbindelse I. Reaktio-35 nen (amidering) skred frem ved stuetemperatur i 2 timer inden 30 mikroliter 1,0 NaBH^ (vandig) (Sigma) tilsattes.

Den fremstillede opløsning henstod 1 time.

101 DK 172940 B1

Overskud af forbindelse I og andre produkter adskiltes fra antistof konjugatet ved Sephadex G-25 chromatografi (søjle - 1,0 cm ID x 18 cm; elueringsmiddel - 0,1 M phos-5 phatpufferet saltvand). Pøven fraktioneredes i 1 ml portioner med en strømningshastighed på 20 ml/time, og absorbansen ved 280 nm kontrolleredes ved 2,0 AUFS og 0,5 AUFS.

10 Fraktionerne 5, 6, 7 og 8 blev slået sammen, anbragt for en forudvasket oubain-BSA-Sepharoseaffinitetssøjle (3,5 ml søjle med 1 cm diameter) og elueret med en strømningshastighed på 15 ml/time. Efter at ikke tilbageholdt materiale var elueret hævedes strømningshastigheden til 15 30 ml/time, indtil der var opsamlet 20 ml eluat. Salt vandskoncentrationen af den mobile fase forøgedes til 0,5 M og yderligere 20 ml elueredes gennem søjlen.

Oubainspecifikt anti-digoxin-forbindelse I konjugat fjer-20 nedes ved tilsætning af 4 M og 6 M KSCN. Fraktioner svarende til anti-digoxin-forbindelse I konjugat blev slået sammen og dialyseret mod 10 mM phosphatpufferet saltvand (4 1; pH 7,4) efterfulgt af 0,1 M phosphatpuffer ( 4 1; pH 7,0) 25 EKSEMPEL 48

Heterogent elektrokimiluninescens immunoanalyse for digoxin.

30 10 mg fast digoxin opløstes i 10 ml DMS0:H20 (8:2) til opnåelse af en digoxinkoncentration på 1 mg/ml (herefter stam standard).

35 Arbejdsstandarder blev fremstillet ud fra stamstandarden til følgende koncentrationer i 0,5 M phosphatpuffer, pH

7,0 indeholdende 0,12 % BSA og 0,15 M NaF (i det efter- 102 DK 172940 B1 følgende betegnet ECL puffer): 80 ng/ml, 40 ng/ml, 20 ng/ml, 10 mg/ml. 5 ng/ml, og 0 ng/ml.

75 mikroliter antl-digoxln-forbindelse I konjugat (for-5 tyndet 1:90) og 75 mikroliter af hver af standarderne pipetteredes i et glasrør, blandedes på et hvirvelapparat og inkuberedes 20 minutter ved stuetemperatur.

50 ml forudvasket oubain-BSA-biomag' partikler sattes til 10 hvert rør, blandedes på nævnte apparater oglnkuberedes 5 minutter ved stuetemperatur. Biomag' partiklerne fraskiltes, og den supernatante del overførtes til et separat rør.

15 100 mikroliter af den supernatante del blandedes med 400 mikroliter 0,125 M kaluimphosphat, 0,125 M citronsyre; 32 mM oxalsyre og 1,25 % Triton X-100 i et reagensglas.

Prøven anbragtes i et Berthold instrument, og elektro-20 kemiluminescensen måltes som tidligere beskrevet, bortset fra at proceduren blev modificeret ved at trin-dele det påtrykte potentiale fra den åbne strømkreds til 2,2 V og integrere photontællingerne i 10 sekunder.

25 Elektroden rensedes mellem målingerne under anvendelse af phosphat-citrat puffer som følger: 1 (a) Elektroden pulseres under anvendelse af 3 sekunders 1 intervaller svingende mellem -2,2 V og +2,2 Vil 30 minut.

(b) Hvil elektroden ved +2,2 V i 10 sekunder.

^ (c) Skyl elektroden med afioniseret vand og tryk tør.

1 35

Resultaterne er angivet i figur 7.

EKSEMPEL 49 103 DK 172940 B1 Mærkning af DNA med en elektrokemiluminescerende gruppe.

5 Følgende 2 metoder er blevet anvendt til at mærke DNA med en elektrokemiluminescerende gruppe.

Syntese A.

10 1,0 A260 leverandørsyntetiseret 38 mer (MBI 38) TCACCAATAAACCGCAAACACCATCCCGTCCTGCCAGT*

Hvor T* er thymidinmodificeret carbon 5 med 15 -ch=ch-co-nh-(ch2)7-nh2 opløstes i 100 mikroliter 0,01 M phosphatpuffer, pH 8,7.

100 mikroliter af en opløsning af bis(2,2'-bipyridin)[4-20 butan-l-al)-4’-methyl-2,2'-bipyridin]ruthenium (II) di- perchlorat (forbindelse I) (2,3 mg i 300 mikroliter af 0,01 M kaliumphosphatpuffer, pH 8,7) tilsattes. Indholdet omrørtes og henstod natten over ved stuetemperatur.

25 100 mikroliter af en mættet vandig opløsning af natrium- borhydrid sattes til blandingen for at omdanne den reversible Imin Schiffske basebinding til Ikke-reversIbel aminbinding. Omsætningen fik lov at foregå ved stuetemperatur I 2 timer. Opløsningen behandledes forsigtigt med 30 nogle få dråber fortyndet eddikesyre for at bratkøle o-verskud af natriumborhydrid. Reaktionsopløsningen anbragtes på en P-2gelfiltreringssøjle (18 inch x 1/2 Inch), der forud var bragt i ligevægt med 0,1 M triethyl-ammoniumacetat, pH 6,77. Søjlen elueredes med denne 35 puffer, og 2 ml fraktioner opsamledes med en gennemstrømningshastighed på 20 ml/time. DNA eluerede i fraktioner 9 og 10 og var udmærket adskilt fra uomsat ruthe- 104 DK 172940 B1 niumbipyridylkompleks. Den opsamlede DNA prøve udviste I typisk UV absorbtion og viste yderligere et fluorescens- , emmissionsspektrum ved 620 nm, når der magnitiseredes ved 450 nm. Fluorescensemmissionen viste tilstedeværelsen af 5 rutheniumbipyridylgruppen i DNA prøven. Produktet går som et enkelt orangefluorescerende bånd ved polyacrylamid gelelektroforese. Den elektroforetiske mobilitet af det mærkede DNA (MBI 38-forbindelse I konjugat) er omtrent den samme som det umærkede DNA.

10

Syntese B.

Rutheniumkomplekset omdannedes først til et N-hydroxysuc-cinimid derivat ved at opløse 3 mg i 60 mikroliter . 15 vandfrit dimethylformamid og behandle med en opløsning af

“ N-hydroxysuccinimid (52 mg) i 200 mikroliter vandfrit DMF

i nærværelse af 94 mg dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Man lod reaktionen skride fremad ved 0 °C i 4 timer. Udfældet dicyclohexylurinsto fracentrifugeredes, og den su-^ 20 pernatante del (200 mikroliter) sattes til oplsningen af amino-bundet DNA (beskrevet under syntese A) i 0,01 M phosphatpuffer pH 8,77 (2A jgg * mikroliter puffer).

Der omsattes natten over ved sturtemperatur. En betydelig mængde fast materiale kom til syne under omsætningen, der 25 fjernedes ved filtrering gennem glasuld. Filtratet ~~ koncentreredes og opløstes i 0,5 ml 1 M triethyl- ammoniumacetat (pH 6,8). Herefter chromatograferedes reaktionsblandingen som beskreved under syntese A. Det mærkede DNA viste alle spektrale og elektroforetiske e-30 genskaber som omtalt for materialet fremstillet under :- syntese A.

Ί EKSEMPEL 50 Ί 35 Elektrofrembragt kemiluminescensegenskaber ved mærket DNA.

105 DK 172940 B1

Den mærkede DNA prøve f.eks. 49, syntese A (MBI 38 forbindelse I) anvendtes til at undersøge forbindelsens e-lektrokemiluminiscerende egenskaber. Forskellige koncentrationer af mærket DHA opløstes i 0,5 ml 01 M phosphat-5 puffer, pH 4,2 indeholdende 0,1 M citrat, 25 mM oxalat og 1,0 % Triton X-100, og der måltes på et modificeret Berthold luminometer. Figur 8 viser responsen af det e-lektrokemiluminescerende signal på forskellige DNA koncentrationer .

10 EKSEMPEL 51

Hybridiseringsundersøgelser af forbindelse I-mærket oli-gonucleotid.

15

Den komplementære strand til den 38 mer-forbindelse beskrevet 1 eksempel 50 syntetiseredes under anvendelse af ABI model 380B DNA syntisatoren og betegnedes MGEN-38.

20 For at bestemme om den kovalente fastgørelse af forbindelse I til oligonucleotidet påvirkede hybridiseringseg-enskaberne af MBI 38 oligonucleotidet udførtes følgende forsøg. Forskellige koncentrationer af targetfragmentet (MGEN-38) blev anbrag som pletter på et lag Gelman RP ny-25 lonmembran, fixseret og afsøgt med probe med enten MBI 38 eller MBI 38-forbindelse I. Begge fragmenter behandledes 32 med T4 poynucleotidkinase og gamma P[ATP] og mærket med 32 P ved 5' enden. Hybridiseringsfølsomhederne af DNA og forbindelse I-mærket DNA sammenlignedes herefter.

30

Konsentrationen af MGEN-38 DNA, der lå fra 50 ng ned til 0,05 ng blev anbragt som pletter på en nylonmembran og lufttørret. Dobbelte membraner blev fremsillet. Pletterne blev behandlet i 2 minutter hver i: 1,5 M NaCl-0,5 M NaOH 35 for fuldstændigt at denaturere DNA; 1,5 M, NaCl-0,5 M TRIS for at neutraliserer blotten og endelige i 2X SSC.

Blotten blev bagt i vacuumovn ved 80 ' C i 2 timer.

106 DK 172940 B1

Hybridiseringsproben blev fremstillet på følgende måde: 3 mikrogram MBI 38 og MBI 38-forbindelse I blev kinasebe- handlet med 10 enheder T4 kinase og 125 mikrokurie af 32 5 gamma P-ATP. Procent isotopindarbejdelse i DNA blev be-= stemt og vist nedenfor.

MBI 38 totaltælling 4,1 x 10® cpm/mikroliter 5 10 Indarbejdede tællinger 3,1 x 10 cpm/mikroliter % indarbejdelse - 75,6 %

MBI 38-forbindelse I

15 totaltælling 3,2 x 10® cpm/mikroliter 5

Indarbejdet tælling 2,6 c 10 cpm/mikroliter % indarbejdelse 81,2 % 20 ___ Præhybridiserings- og hybridiseringsopløsninger fremstil ledes som beskrevet af Maniatis (24). Blots blev præhy-driseret i 4 timer ved 53 °C med 50 mikrogram/ml kalve-thymus DNA. Blottene blev herefter anbragt i hybridi-25 seringsopløsning indeholdende de respektive prober ved 10.000.000 cpm. og henstod for at hybridisere natten over (12 timer) ved 53 0 C. Den følgende dag blev blottene vasket på følgende måde: 30 To gange med 2X SSC + 0,1 % SDS ved 53 "C i 15 minutter for hver afvaskning —4 to gange med 0,2 x SSC + 0,1 % SDS (som ovenfor) 35 to gange med 0,16 x SSC + 0,1 % SDS (som ovenfor).

Blottene lufttørredes herefter og exponeredes for Kodak 107 DK 172940 B1 X-omat' film ved -70 eC.

Analyse af røngtenbillede (se fig. 9) viste, at meget ens hybridiseringsmønster observeredes mellem MBI 38 og MBI 5 38-forbindelse I proben. I begge tilfælde observeredes hybridisering af proben til 0,5 ng af target, og svage spor af hybridisering observeredes ned til 0,05 ng af target DNA. Der afsløredes ingen hybridiseringsaktivitet af proben for den negative kontrol DNA (fag lamba DNA 10 anbragt i en koncentration på 50 ng).

EKSEMPEL 52

Forbindelse I-mærket DNA probe hybridiseringsspecifici-15 tetundersøgelse.

Genom DNA fra adskillige E. coli og ikke-E. colistammer isoleredes som beskrevet af Maniatis (24). De anvendte organismer var: 20 E. coli stamme EC8 - naturligt isolat E. coli stamme PclA - enteropatogenstamme E. coli stamme 10H07 - enterotoxigenstamme E. coli stamme EC50 - anturligt isolat 25 E. coli stamme B - laboratoriestamme E. coli stamme K12 - laboratoriestamme

Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii 30 Salmonella paratyphi B

Salmonella potsdam.

DNA fra ovennævnte stammer blev pletanbragt dobbelt i 3 mikrogramprøver på en Gelman FP nylonmembran og på en S & 35 S nitrocellulosemembran. Som negativ kontrol pletan bragtes 50 ng fag lamda DNA. Positiv kontrol bestod af forskellige koncentrationer af den komplementære streng.

108 DK 172940 B1 MGEN-38, fra 50 ng ned til 0,5 ng. Blottene blev fremstillet og behandlet som beskrevet som i eksempel 51.

Probet DNA bestod af 3,0 mikrogram MBI 38-forbindelse I

5 fragment, der var T4 kinasebehandlet ved 120 mikrokurie 32 gamma P-ATP for at indarbejde radioaktivitet. Følgende mængde aktivitet indarbejdedes.

MBI 38-forbindelse totale tællinger - 3,35 se 10® cpm/mikroliter 10 indarbejdede tællinger - 1,50 x 10® cpm/mikroliter * % indarbejdelse - 44,7 %.

7 I dette forsøg anvendtes 2.600.000 cpm aktivitet som pro- beafsøgelse for hvert filter. Hybridiseringsopløsninger-15 ne, betingelserne, vaskeopløsningerne og forsøgsmetoderne var som beskrevet i eksempel 51.

Røntgenfilmen af blotten (fig. 10) viser, at både de positive og negative kontroller reagerede i overensstem-20 melse hermed. Der afsløredes ingen hybridiseringsaktivi-tet med lambda DNA (50 ng) og stærk hybridisering obser-ververedes ved den komplementære sekvens, MGEN-38, med til 0,5 ng koncentration. Disse fund er i fuldstændig overensstemmelse med resultaterne af sensitivitetsunder-25 søgelsen.

^ EKSEMPEL 53

Forbindelse I mærkning af humant IgG.

] 30

4 2 ml humant IgG (2,5 mg/ml) dialyseredes mod 2 1 0,2 M

natriumbicarbonatpuffer, pH 9,6, natten over ved 4 °C under sagte omrøring. Forbindelse I fremstilledes i et 100 mol overskud i forhold til tilstedeværende protein (2,7 35 mg/100 mikroliter dimethylformamid) og henstå for at oplyses. Det dialyserede protein tildryppedes tag-aldehydet under forsigtig omrøring ved stuetemperatur I 2 '3* 109 DK 172940 B1 timer. 100 mol overskud (i forhold til protein) af na-triumborhydrid (100 mikroliter af en 1,24 mg/ml opløsning i afioniseret vand) sattes til opløsningen om omrørtes forsigtigt yderligere 30 minutter ved stuetemperatur.

5 Konjugatet anbragtes på en Sephadex G-25 søjle (1,0 cm x 18,0 cm) bragt i ligevæget ved stuetemperatur med 0,2 M JTris, pH 8,0, og eluanten kontrolleredes ved 280 nm. Den tomme rumfangstop opsamledes, blev slået sammen og dialyseret mod 2 1 trispuffer. Konjugatet afprøvedes for immu-10 nologisk aktivitet bed standard ELISA forsøg og lagret ved 4 °C indtil brug.

EKSEMPEL 54 15 Biomag'/gede-anti-human IgG partikel præparation.

En 2,5 ml prøve af 5 % Biomag"-amin afsluttede partikler (Advanced Magnetics, Cambridge, MA) overførtes til en ren stor T-kolbe og vaskedes 5 gange med phosphatpufferet 20 saltvand (PBS). Den våde kage genopslemmedes i 12,5 ml 5 % frisk glutaraldehyd (Sigma) og roteredes over top og bund ved stuetemperatur i 3 timer. Den våde kage overførtes til en anden T-kolbe og vaskedes 3 gange med PBS.

De aktiverede partikler genopslemmedes til 12,5 ml med 25 PBS og overførtes til et 15 ml centrifugerør. Til denne suspension sattes 12,5 mg gede-anti-humant IgG (H+L) (Jackson Labs) i 2 ml PBS. røret roteredes top over bund i 3 timer ved stuetemperatur og herefter natten over ved 4 ’C. Den næste dag vaskedes partiklerne 2 gange med PBS 30 indeholdende 1 vægt/rumfang-% bovint serum albumin (BSA) efterfulgt af lagring I 12,5 ml PBS indeholdende 0,1 % BSA ved 4 °C indtil brugen.

EKSEMPEL 55 35

Pseudo-homogent humant IgG elektrokemiluminescensanalyse under anvendelse af Biomag' magnetisk baserede partikel- DK 172940 Bl uo analyse.

Forbindelse I-humant IgG konjugat fortyndedes 1:50 i 0,15 M phosphatpuffer indeholdende 0,1 % bsa og ombragtes i 5 portioner i 250 mikroliter/rør. 150 mikroliter af dilu-enten (PB w/BSA som ovenfor) sattes til hvert rør, hvorefter der sattes enten forskellige fortyndinger af analyten (humant IgG) eller diluenten (negative kontroller), Yderligere anvendtes en ikke-specifik analyt (gede-10 anti-kanin IgG) i visse rør, for at checke analysespecificiteten. 50 mikroliter 1 % Biomag' koblet med gede-anti-humant IgG (H&L) tilsattes hvert rør. Rørene blandedes på en hvirvelblander og inkuberedes ved stuetempera-5 tur i 15 minutter under forsigtig omrystning. Partiklerne I 15 fjernedes magnetisk fra opløsningen, og 100 mikroliter af den fremkomne supernatant overførtes til et Berthold rør, hvortil 400 mikroliter af en citrat-oxalat-Triton X-l-opløsning var sat. Rørene blandedes på en hvirvelblander og aflæstes i et modificeret Berthold luminumeter udsty-20 ret med et R-268 fotoforstærkerrør og en 0,29 inch diameter cirkulær 54 gauge dobbelt platinmesh elektrode understøtet med en ledende malings-beklædt polycarbonat-understøttelse og forbundet til spændingskilden gennem en 0,01 inch diameter platintråds/sølvmalingskontakt. Det 25 tilførte potentiale gik trinvis fra +1,4 til +2,15 V, medens en 10 sekunders Integration blev foretaget. Mellem aflæsningerne rensedes elektroden elektrokemisk ved afioniseret vand, neddyppedes herefter i 0,1 M phosphatci-tratpuffer indeholdende oxalsyre og Triton X-100 og trin-30 vis optrapning af den tilførte spænding fra -2,2 V til : +2,2 V (med 3 sekunder ved hver spænding) i 2 minutter og ! 20 sekunder, efterfulgt af en hvilepause ved spændingen på +2,2 V i 10 sekunder. Elektroden fjernedes fra rense-opløsningen, afrensedes med afioniseret vand og blev : 35 trukket tør med et absorberende stykke materiale. I denne forsøgsopstilling var elektrokemiluminescenssignalet direkte proportional med analytkoncentrationen.

EKSEMPEL 56 111 DK 172940 B1

Fremstilling af bis(2,2'-bipyridin)maleimidohexansyre, 4-methyl-2,2'-bipyridin-4,-butylamid ruthenium (II) di-5 perchorat: forbindelse IV.

4-[4-(1-aminobutyl)]-4'-methyl-2,2'-bipyidin, fremstillet _3 som beskrevet i eksempel 32 ud fra 500 mg (1,35 x 10 mol) phthalimid opløstes i 5 ml tør pyridin med 0,313 g _3 10 (1,48 x 10 mol) maleimid hexansyre og 0,306 g (1,48 x _3 10 mol) DCC. Efter lagring natten over frafiltreredes dicyclohexylurinstof, og pyridinen afstrippedes under vacuum. Remanensen rensedes ved søjlechromatografi (aktivi- 2 tets II aluminium oxid, 5 % MeOH/CI^Cl ) til opnåelse af 15 den rensede forbindelse. Udbytte 0,56 g -4 (95 %) 100 mg (2,3 x 10 mol) maleimido-hexansyre, 4-methyl-2,2,-bipyridin-4’-butylamid og 100 mg (2,06 x 10-4 mol) bis-(2,2'-bipyridin) rutheniumdichloriddihydrat op-20 løstes i 50 ml ethanol/vand (1:1), afgassedes med argon og opvarmedes 4 timer med tilbagesvaling. Den fremstillede klart orange opløsning fortyndedes med 25 ml fast NaC104 25 ml ethanol og 25 ml acetone og af dampedes langsomt i vacuum. Da materialet var tørt tilsattes yder-25 ligere 25 ml vand og 25 ml acetone, og opløsningen inddampedes på roterende inddamper til ca. 15-20 ml. Det faste udfældede materiale opsamledes, vaskedes med vand og tørredes. Prøven rensedes ved præparativtivt TLC på aluminiumoxid underanvendelse af 1:9 methanol/chloroform.

30 Det hurtigt løbende bånd isolierdes ved afskrabning fra pladen, og forbindelsen elueredes ved omrøring i methanol/chloroform (1:1). Efter filtrering for at fjerne aluminiumoxidet inddampedes den orangefarvede opløsning til tørhed til opnåelse af 86,7 mg renset forbindelse (72 35 %)· EKSEMPEL 57 112 DK 172940 B1 Mærkning af hCG peptid med foribindelse IV.

5 2 mg humant chorion gonadotropin (hCG) peptid (#109-145, JP141, Vemon Stevens, Ohio State University) opslemmedes i 1 ml 0,15 M citratpuffer, pH 6,0, og 1,13 mg forbindelse IV opløset i 300 mikroliter dlmethylformamid. Peptidopløsningen dryppedes til forbindelse IV opløsnln-10 gen i løbet af 1 minut. Opløsningen omrørtes forsigtigt 1 time ved stuetemperatur. Prøven anbragtes derefter på en Bio-gel P-2 søjle (Bio-Rad; 1 cm x 45 cm) der var bragt i ligevægt ved stuetemperatur ved 0,2 M Tris-base, pH 8,5 med en strømningshastighed på 15 ml/time, og eluanten 15 kontrolleredes ved 280 nm. Hulrumsrumfanget af gen-nemløbningen opsamledes, blev slået sammen og påført en QAE-Sephadex A-25 søjle (Pharmacia; 1 cm x 10 cm), der var bragt i ligevægt ved stuetemperatur med 50 mM Tris-HC1, pH 7,0. Dette blev foretaget for at fjerne e-20 ventuelle umærkede peptider (der vil adsorbere til den positivt ladede harpiks; den positive ladning af det mærkede peptid muliggør, at det kan passere gennem søjlen uden yderligere behandling). Eluanten undersøgtes ved 280 nm, og den første hovedtop opsamledes, blev slået sammen 25 og koncentreret ved lyophilisering. Den tørrede forbindelse påslemmedes i mindst muligt rumfang PBF. hCG peptid-forbindelse IV konjugatet lagredes ved 4 °C indtil anvendelsen.

30 EKSEMPEL 58

Rensning af kanin-anti-hCG peptid ved hjælp af DEAE

AFFI-gel blåt chromatografi.

35 4 ml DEAE-AFFI-gel blåt (Bio-Rad) hældtes på en chromatograf Isøj le (1 cm x 10 søjlestørrelse) og ækvilibreredes 113 DK 172940 B1 ved Stuetemperatur med 0,2 M Tris-HCl indeholdende 0,028 M NaCl, pH 8,0 i 1 time med en 40 ml/time gennemstrømningshastighed . Gennemstrømningshastigheden sænkedes til 20 ml/time og 1 ml kanin-anti-hCG peptid (antl 109-5 145, Vernon Stevens, Ohio State University), der var præ dialyseret overfor søjlepuffer, påførtes søjlen. 1 ml fraktioner opsamledes, og eluanten kontrolleredes ved 280 nm. Hulrumstoppen opsamledes, blev sléet sammen fra flere gennemløb og koncentreredes ved at anbringe eluanten i en 10 12K MMWC0 dialysesæk, der var omgivet af polyethylen- glycol 6000 (Sigma). Antistoffet undersøgtes for immuno-reaktivitet under anvendelse af standard ELISA metoder og for renhed ved hjælp af HPLC, hvilket bevirkede forekomsten af 1 hovedtop, der tydede på et rent aktivt præ-15 parat.

EKSEMPEL 59

Titrering af hCf peptid-forbindelse IV konjugat mod ren-20 set kanin-anti-hCG peptid: Elektrokemiluminescens signal modulering.

hCG peptid-forbindelse IV konjugat fortyndedes i 0,1 M phosphatpuffer indeholdende 0,1 M citrat, pH 6,2. Prøver 25 af denne blanding anbragtes i mikrofugerør. Det forud rensede anti-peptidantistof fortyndedes til forskellige koncentrationer og sattes til rørene, der blandedes i en hvirvelblander og inkuberedes 1 time ved stuetemperatur.

Lige inden aflæsning af elektrokemiluminescens overførtes 30 en prøve til et Berthold rør, hvortil oxalsyre og Triton X-100 (Sigma) var sat. Rørene blandedes på en hvirvelblander og aflæsningen under anvendelse af en trimmebølge (+1,5 til +2,5 V ved 50 mV/sek., ved hvilke 3 scanninger blev foretaget, idet man tog tophøjden af den 35 anden scanning som værdien) på et Berthold luminorneter under anvendelse af et R-268 fotoforstærkerrør med dobbelt platin mesh blev foretaget. Mellem aflæsningerne 114 DK 172940 B1 rensedes elektroden elektrokemisk ved først at rense den med af ioniseret vand og herefter neddyppe den i 0,1 M Phosphat-citratpuffer, pH 6,1 indeholdende 25 nM oxalat og 1 % Triton X-100. Den tilførte spænding blev tilslut-5 tet med 3 sekunder ved hver spænding mellem +2,2 og -2,2 Vil minut og 50 sekunder og bragt i ligevægt ved +2,2 V i 10 sekunder. Herefter blev strømmen afbrudt, og elektroden fjernet fra renseopløsningen og renset med af-ioniseret vand og trykket tør med et absorberende klæde.

10

Resultaterne viser en generel tendens, hvor elektrokemi-luminescenssignalet var direkte proportional med koncentrationen af antistof til peptidet. Dette er i modsætning til andre eksperimenter, ved hvilken elektrokemilu-15 minescenssignalet falder efterhånden som den elektrokemi-luminescensmærkede analyt bringes i kontakt med antistof.

EKSEMPEL 60 20 Elektrokemiluminescenssignalydelse: Stabilitetsdata for

Ru(II)-forbindelse III konjugat.

M

Ru(II)-forbindelse III konjugat fortyndedes til 300 nM I 0,1 M phosphat-ciratpuffer, pH 6,1 enten med eller uden 1 25 % normalt humant serum (NHS). Hver af puffertyperne in kuberedes ved 4 °, 20 ·, 37 0 og 55 "C og undersøgtes ved prøveudtagning på inkubationsdagene 3, 4 og 5. Prøverne ' bragtes i ligevægt ved stuetemperatur og bedømtes for =sj deres elektrokemiske signal. 400 mikroliter prøve 30 blandedes med 100 mikroliter 125 mM oxalsyre-5 % Triton X-100 i et rør, anbragtes i et modificeret Berthold lu-^ minometer med et Hamamatsu R-268 fotoforstærkerfør og en dobbelt mesh platingaze elektrode. Aflæsningen blev foretaget ved at variere den påførte spænding konstant mellem 35 +1,5 til +2,5 V med 50 mV/sek. i 3 behandlinger, og højden af den anden behandlingstop registreredes og omdannedes til elektrokemiluminescenttællinger. Mellem DK 172940 B1 lis tællingerne rensedes elektroden elektrokemisk ved at rense med afioniseret vand, neddyppe elektroden i 0,1 M phosphat-citratpuffer indeholdende 25 mM oxalat og 1 %

Triton X-100 og pulsere spændingen fra -2,2 til +2,2 V 5 med en 3 sekunders pause ved hver spænding i 1 minut og 50 sekunder. Spændingen forblev ved +2,2 V i 10 sekunder og blev herefter afbrudt. Elektroden fjernedes fra rense-opløsningen, der vaskedes med afioniseret vand og blev trukket tør med et absorberende klæde. Resultaterne vi-10 ser, at der var overensstemmende signal i hver puffertype under forsøgets varighed. Dette viser reagensets evne og stabilitet til at fremkalde et elektrokimiluminescerende signal.

15 EKSEMPEL 61

Immunoreaktivitetsundersøgelse af Ru(II)-forbindelse III konjugat: Stabilitetsundersøgelser.

20 Ru(II)-forbindelse III konjugat fortyndedes og inkubere des under de betingelser der er beskrevet i eksempel 60.

Prøver blev udtaget på dag 3, 4 og 5, afkølet til stuetemperatur og undersøgt for immunoreaktivitet ved hjælp af partikelkoncentratonsfluorescensimmunoforsøget (PCFIA) 25 under anvendelse af en Pandex Screen Machine indkøbt fra Pandex, Inc., Mundelein, IL. PCFIA blev foretaget som et kompetitivt forsøg. Latexpartiklerne (Pandex) konjugeredes med theophyllin-BSA. En konstant mængde af disse partikler blandedes med Ru(II)-forbindelse III konjugat-30 forsøgsopløsningen til slutkoncentrationer af anti-theopyllin monikonalt antistof (ascites, Hyclone katalog nr. E-3120M, forsøgsfremstilling nr. FD200) og en konstant mængde gede-anti-muse IgG-FlTC konjugat (Pandex, katalog nr. 33-020-1 forsøgsnr. COL). Efter inkubation 35 oparbejdedes prøverne og aflæstes på Pandex Screen Machine. Resultaterne viser, at der ikke var nogen betydende tab af aktivitet, selv efter 5 dages inkubation ved 55 EKSEMPEL 62 i 116 DK 172940 B1 °c· « 5 Elektrokemiluminescens af forskellige ruthenium- og osmi- = umforbindelser.

Elektrokemien ved forskellige osmium- og rutheniumforbin-; delser måltes som 1 mM opløsninger i 10 ml nitrogen- 10 gennemskyllet acettonitril med 0,1 M tetrabutylammonium tetrafluorborat som en elektrolyt. Arbejdselektroden var en platinskiveelektrode indkøbt hos Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, IH. En platintråds modelelektrode og en 1,0 mm sølvtråd anvendtes som en referen-15 ceelektrode. Målingerne blev foretaget ved at scanne fra -2,2 til +2,2 V (vs SCE) med en scanningshastighed på 100 mV/sekund. Efter hver elektrokemisk måling bestemtes spændingsforskellingen mellem en mættet Calomel referenceelektrode (SCE) og sølvtråden. Således er de an-20 givne værdier korrigeret til spænding over for SCE.

Elektrokemiluminescens (ECL) målinger blev foretaget i 0,5 ml vandige opløsninger indeholdende 0,1 M phosphate-citratpuffer (pH 4,2), 25 mM oxalsyre og 1 % Triton X-=: 25 100. Det anvendte elektrodesystem bestod af 2 platingaze (52 gauge) elektroder forbundet til en "Radio Shack" transistorsokkel (nr. 276-548) ved en 0,1 mm platintråd. Elektroderne blev anbragt på ydersiden af et 60 mm tykt stykke celluloseacetatplast. Plasten var udformet såle-30 des, at et ca. 0,5 cm diameter hul muliggjorde, at opløs-* ] ningerne let kunne flyde mellem arbejds og modrefe- ^ j renceelektroder. Elektroderne blev forbundet til poten- tiostaten, således at en elektrode fungerede som en ar-bejdselektrode (der var nærmere fotoforstærkerrøret) og 35 den anden elektrode fungerede som mod- og referenceelektrode. Målingerne blev foretaget ved at variere konstant fra 1,5 til 2,5 V (dobbeltspænding) med en scanningshas- 31 117 DK 172940 B1 tighed på 50 mV/sek. ECL målingerne er angivet som signal til støjforhold d.v.s. eller signal til baggrundsforhold og en given koncentration af forbindelsen. Baggrunden er defineret som luminescenstæl11nger observeret med puffer 5 og ingen tilsatte ECL forbindelser. Luminescensmålingerne var maximum lysafgivelsen observeret under den første eller anden lineære afsøgning.

Både elektrokemiluminescens (ECL) og cykliske spændingΞΙ 0 målinger af hver opløsning blev foretaget med enten en EG&Gf Model 273 potentiostat eller en bipotentiostat fra Ursar Scientific Instruments, Oxford, England. Photon-fluxen for hver ECL måling blev kontrolleret med et Bert-hold Biolumat LB95000 luminometer fra Wilebad, Vesttysk-15 land, modificeret således, at enten et to- eller tre- elektrodesystem kunne anbringes i 0,5 ml måleopløsning.

Både elektrokemiske og elektrokemiluminescensmålingerne blev registreret på en Kipp & Zonen Model BD 91 X, Y, Y* recorder fra Delft, Holland.

20

Fluorescensmålingerne blev foretaget med 50 mikromolær opøsninger af den ønskede forbindelse i 3,0 ml ECL opløsning, eller dersom uopløselig i ECL, opløsning i ace-tonitril. Målinger blev foretaget på et Perkin-Elraer LS-5 25 fluorescens spectrofotometer. Prescanninger af opløs ningernes excitations- og emissionsspektre blev udført inden excitations- og emissionsspektrene registreredes, såeldes at emissionsspektret kunne måles, medens der bestråledes ved maximum excitationsbølgelængde og omvendt, 30 idet excitationsspektret kunne registreres, medens man kontrollerede maximumemissionsbølgelængden.

35 118 DK 172940 B1

Forbindelse E . Fluorescens ECLiS/N)1 2 3 4 5 ox red ' vs. SCE emission max. 6 Conc.

5 a) Ru(biby), 1,07 V -1,52 625 nm 1 x 10"9M

(2.5) b) Ru(4,4'

-C02-bipy)3 1,19 V N.D. 628 nm 2 x 10~9M

(4.5) 10 c) Ru(4,4'C02

et-bipy)3 1,54 V -0,89 V 636 ran 1 x 10-10M

(2,01) d) Ru(bipy)2 (C-8-theo-15 pyllin

J C-4-bipy) 1,17 V N.D. 624 nm 1 x 10_9M

- (0.97) - e) OS(bipy)2

I (C0)(PY) 1,82 V -0,99 V 585 nm 1 x 10-8M

I 20 f) OS(DPPene) { BPY )

(bpyoxal) 1,60 V N.D. 630 nm 6 x 10-8M

(10,8) 25 1(S/N) er signal til støjforhold, hvor signalet er defineret som ECL output (luminescenstællinger) af en forbindelse ved en given koncentration, og støjen er luminescenstællinger af pufferen, hvori forbindelsen var op-30 løst.

modsætning til ECL af de andre forbindelser, der måltes 2 * ' ved pH 4,2, viste forbindelsen C også signifikant ECL ved 3 den physiologiske værdi oH 7,0.

4 35 5 a) Tris (2,2'-bipyridin)-ruthenium 2+ 2 + 119 DK 172940 B1 b) Tris (4,41-carboxylat-2,21-bipyridin-ruthenium 2 + c) Tris (4,4'-carboethoxy-2,2’-bipyridin)-ruthenium 5 d) bis(2,2,-bipyridin)[theophyllin-8-smørsyre-4-(4-me-thyl-2,2'-bipyridin)-4’-yl)butyl)amid]ruthenium(II) dichlorid e) [bis-(2,2'-bipyridin){monocarbonyl}pyridyl]osmium(II) 10 dihexafluorphsphat f) (2,2'-bipyridin[cis-bis(1,2-diphenyphosphin)ethylen] (2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)propyl]-1,3-di-oxolan}2-osmium(II) dichlorid.

15 20 25 30 35 120a DK 172940 B1

UTTERATRULISTE

1. Weber, S.G., et al«, Photoelectroanalytical

Chemistry: Possible Interference in Serum and

Selective Detection of Tris (2, 2 - bypyridine) 5 ruthenium(II) in the Presence of Interferents,

Clinical Chemisty, 29, 1665-1672 (1983).

2. Rubinstein, I. og· Bard, A.J., Electrogenerated Chemiluminescence. 37. Aqueous ECL Systems Based jQ On Ru (2, 2 - bypyridine) 32+ and Oxalate or

Organic Acids, J. Am. Chem. Soc., 103, 512-516 ( (1981).

3. White, H.S. og Bard, A.J., Electrogenerated 15 Chemiluminescence. 41. Electrogenerated ^ Chemiluminescence and Chemiluminescence of the Ru (2, 2' - bpy)3+2 - S2°8~2 Si,ste,n in Acetonitrile -i Water Solutions, J. Am. Chem. Soc., 104, 6891 (1982).

i 20 -I 4. Curtis, et al.. Chemiluminescence; A New Method for

Detecting Fluorescent Compounds Separated By Thin Layer Chromatography, J. Chromatography, 134, 343-350 (1977) .

25 j 5. Sprintschnik, G., et al. , Preparation and

Photochemical Reactivity of Surfactant Ruthenium (II) Complexes in Monolayer Assemblies and at t Water - Solid Interface, J. Am Chem. Soc., 99, 30 4947-4954 (1977).

4 6. Minnich, S.A., et al., Enzyme immunoassay for

Detection of Salmonellae in Foods, Appl. and Environ. Micro., 43, 1124-1127 (1982).

35 120b DK 172940 B1 7. Thomason, B.M., Current status of Immunofluorescent Methodology for Salmonellae, J. Food Prot., 44, 381-384 (1981).

5 8. Mattingly, J.A. , A.n Enzyme Immunoassay for the

Detection of All Salmonella Using a Combination of a Myeloma Protein and a Hybridoma Antibody, J.

Immunol. Meth., 73, 147-156 (1964).

10 9. Thompson, N.E. et al., Detection of Staphylococcal enterotoxins by enzyme-linked immunosorbent assays and radio-immunoassays: Comparison of monoclonal and polyclonal antibody systems, Appl. and

Environ. Micro., forelæsning.

15 10. American Public Health Association, Standard methods for the examination of water and wastewater. 15. udg. American Public Health Association, Inc., New York (1980).

20 11. American Public Health Association, Compendium of methods for the microbiological examination of foods. American Public Health Association, Washington, D.C (1976).

25 12. Clark, H.F., Geldreich, E.E., Lester, H.L.,.- °.9 Kabler, P.W., The membrane filter in sanitary microbiology, Public Health Rep. 66:951-957 (1951).

30 13. Feng, P. , og Hartman, P.A., Fluocogenic assays for immediate confirmation of Escherjchia coli.. Appl. Environ. Microbiol. 43:1320-1329 (1982).

35 120c DK 172940 B1 14. Geldreich, E.E., Standard method Revisions (16.

I .

. udgave for Conventional coliform Procedures.

I : New developments in drinking water ; microbiology workshop, 85th Annual Meeting of the 5 American society for Microbiology (1985) .

15. Hussong, D. , Colwell, R.R., og Weiner R.M.,

Rate of occurrence of false-positive results from total coliforms most-probable-number analysis of 10 shellfish and estuaries. Appl. Environ.

Microbiol. 40:981-983 (1980).

16. Hussong, D., Demare, J.M., Weiner, R.M., og Colwell, R.R. , Bacteria associated with false- 15 positive most-probable-number coliform test results for shellfish and estuaries, Appl.

Environ. Microbiol 41:35-45 (1981).

17. Lin, S., Evaluation of coliform tests for 20 chlorinated secondary effluents, J. Water

Pollut. Control Fed. 45:498-506 (1973).

’ 18. Mckee, J.E., McLaughlin, R.T. og Lesgourgues, P., Application of molecular filter techniques __ 25 to the bacterial assay of sewage III. Effects of physical and chemical disinfection, Sewage Ind.

Waste 30:245-252 (1958).

19. Mead, J.A.R., Smith, J.N., og Williams, R.T., 30 The biosynthesis of the glucuronides of j umbel 1 iferone and 4-methylumbel1 iferone and their use in fluorimetric determination of beta-glucuronidase, Biochem,. J. 61: 569-574 (1954).

35 ϋϋϊ 120d DK 172940 B1 20. Olson, B.H., Enhanced accuracy of col iform testing in seawater by modification of the most-probable-number method. Apl. Environ. Microbiol, 36:438-444 (1978).

5 21. Presnell, H.W. , Evaluation of membrane filter methods for enumerating coliforms and fecal coliforms in estuarine waters, Proc. National Shellfish Sanitation Workshop. 1974:127-131 (1974).

10 22. Pressvood, W.G. og Strong, D.K., Modification of mFC medium by eliminating roSolic acid, Appl.

Environ. Microbiol. 36:90-94 (1978).

15 23. Warr, G.W. and Marchalonis, J.J., Purification of

Antibodies. I : Anti body as j Tool , J. Wiley and

Sons, NY, pp. 59-96. (1982) 24. Maniatis, T. , Fritsch, E. F. og Sambrook, J., 2o Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p. 150- 160, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).

25 30 35

Claims (22)

1. Fremgangsmåde til i en multikomponentvæskeprøve med 5 afmålt volumen at detektere en partikel, et molekyle eller en ion, der er til stede i prøven i en koncentration på under ca. ΙΟ'3 M svarende til en mængde på under ca. 10zo partikler, molekyler eller ioner pr. liter, hvorved man 10 a. bringer prøven i kontakt med et reagens omfattende en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe konjugeret til en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, et prion, et viroid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et polysaccharid bortset fra sukker, et protein, et 1 15 lipoprotein, et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et i peptid, en cellulær metabolit, et hormon, et farmakologisk præparat, en tranquilizer, et bariturat, et alkaloid, et I steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et i 20 organometallisk molekyle eller et uorganisk molekyle, der (i) kan påvirkes til at udsende elektromagnetisk stråling ved eksponering for en vis mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling, og som (ii) er i stand til at 25 forbinde sig med den pågældende analyt, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, at analyt og reagens forenes; . b. eksponerer den resulterende prøve for en mængde elek- ~ 30 trokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til " at påvirke reagenset til at udsende stråling, idet ~ eksponeringen udføres under betingelser, der påvirker reagenset til gentagne gange at udsende elektromagnetisk .1 stråling; og 35 c. detekterer den således udsendte elektromagnetiske stråling, hvorved komplekset mellem analyt og reagens be~ stemmes, idet reagenset er mærket med et detekterbart a 2 DK 172940 B1 mærke, kendetegnet ved, at det detekterbare mærke er elektrokemiluminescerende.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at man inden trin (b) skiller eventuelt reagens, der ikke er forenet med den pågældende analyt, fra prøven, der kommer fra trin (a).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at man, inden man bringer prøven i kontakt med reagenset i trin (a), behandler prøven på en sådan måde, at den pågældende analyt immobiliseres.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 15 at den pågældende analyt er en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, et prion, et viroid, et fedtstof, en fedtsyre, en nucleinsyre, et polysaccharid, et protein, et lipoprotein, et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et hormon, et farmakologisk 20 præparat, en tranquilizer, et barbiturat, et alkaloid, et steroid, et vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organometallisk molekyle eller et uorganisk molekyle.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at reagenset omfatter en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe konjugeret til et antistof, et antigen, en nucleinsyre, et hapten, en ligand eller et enzym eller til biotin, avidin eller streptavidin. 30

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe består af en metalholdig organisk forbindelse, hvor metallet er valgt blandt ruthenium, osmium, rhenium, iridium, rhodium, 35 platin, palladium, molybdæn og technetium.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe er bis 3 DK 172940 B1 [(4,41-carbomethoxy)-2,2'-bipyridin]2-[3-(4-methyl-2,2'-bi pyridin-4-yl)propyl]-1,3-dioxolan ruthenium(II).

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 5 at den elektrokemi lumineseerende kemiske gruppe er bis (2,2'-bipyridin)[4-(butan-l-al)-41-methyl-2,21-bipyridin] ruthenium(II).

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, 10 at den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe er bis (2,2’-bipyridin)[4-(4-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-smørsyre]ruthenium(II).

10. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet 15 ved, at den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe er - (2,2’-bipyridin)[cis-bis(l,2-diphenylphosphino)ethylenl- (2-[3-(4-methyl-2,21-bipyridin-41-yl)propyl1-1,3-dioxolan)-osmium(II).

11. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe er bis (2,2'-bipyridin)[4-(4'-methyl-2,21-bipyridin)butylamin] ruthenium(II).

12. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet - ved, at den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe er bis (2,2’-bipyridin)[l-brom-4(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4- yl)butan]ruthenium(II).

13. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den elektrokemiluminescerende kemiske gruppe er bis (2,21-bipyridin)maleimidohexansyre, 4-methyl-2,2’-bi- pyridin-4'-butylamid ruthenium(II) diperchlorat. i , 35

14. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, ! at prøven indeholder acetonitril, dimethylsulfoxid, dimethylformamid, n-methylpyrrolidinon eller tert-butyl-alkohol. 4 DK 172940 B1

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at prøven yderligere indeholder et reducerende middel.

16. Fremgangmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at prøven yderligere indeholder et oxiderende middel.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til i en multikomponent-væskeprøve med afmålt volumen at detektere 10 en analyt, der er til stede i prøven i en koncentration på under ca. ΙΟ"3 M, hvorved man a. bringer prøven i kontakt med et reagens, der kan påvirkes til at udsende elektromagnetisk stråling ved eks- 15 ponering for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling; b. eksponerer den resulterende prøve for en mængde elek-20 trokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling, idet eksponeringen udføres under betingelser, der påvirker reagenset til gentagne gange at udsende elektromagnetisk stråling; og 25 c. detekterer den således udsendte elektromagnetisk stråling og derved afslører tilstedeværelsen af den pågældende analyt i prøven, kendetegnet ved, at reagenset er i stand til at konkurrere med den pågældende analyt om 30 bindingspladserne på et komplementært materiale, der normalt ikke forefindes i prøven, og med det komplementære materiale, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, at den pågældende analyt og reagenset kompetitivt binder sig til det komplementære materiale. 35

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at den pågældende analyt konjugeres til en elektrokemi luminescerende kemisk gruppe. 5 DK 172940 B1

19. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at reagenset er analogt med den pågældende analyt konjugeret til en elektrokemiluminescerende kemisk gruppe. 5

20. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at det komplementære materiale er en hel celle, en subcellulær partikel, et virus, et prion, et viroid, et lipid, en fedtsyre, en nucleinsyre, et 10 polysaccharid, et protein, et lipoprotein, et lipopolysaccharid, et glycoprotein, et peptid, en cellulær metabolit, et hormon, et farmakologisk præparat, en tranquilizer, et barbiturat, et alkaloid, et steroid, et ' vitamin, en aminosyre, en sukkerart, en ikke-biologisk l 15 polymer, et syntetisk organisk molekyle, et organometallisk 9 molekyle eller et uorganisk molekyle,

^ 21. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til i en multikomponent- væskeprøve med afmålt volumen at detektere en analyt, der Ξ 20 er til stede i prøven, hvorved man a. bringer prøven i kontakt med et reagens, der (i) kan bringes til at udsende elektromagnetisk stråling ved eksponering for en mængde elektrokemisk energi fra en passende 25 kilde, der kan påvirke reagenset til at udsende stråling, og som (ii) er i stand til at forbinde sig med den pågældende analyt, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, at analyt og reagens forenes med hinanden; og 3 30 1 b. eksponerer den resulterende prøve for en mængde elek trokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling, idet ^ eksponeringen udføres under betingelser, der påvirker 35 reagenset til gentagne gange at udsende elektromagnetisk stråling; kendetegnet ved, at man 6 DK 172940 B1 c. kvantitativt bestemmer mængden af den således udsendte stråling og derved kvantitativt bestemmer mængden af den pågældende analyt, der forefindes i prøven, idet reagenset (i) anvendes i en på forhånd fastlagt mængde. 5

22. Fremgangsmåde til i en multikomponent-væskeprøve med afmålt rumfang kvantitativt at bestemme mængden af en analyt, der er tilstede i prøven, kendetegnet ved, at man 10 a. bringer prøven i kontakt med et reagens, der kan påvirkes til at udsende elektromagnetisk stråling ved eksponering for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at 15 udsende stråling; b. eksponerer den resulterende prøve for en mængde elektrokemisk energi fra en passende kilde, der er i stand til at påvirke reagenset til at udsende stråling, idet 20 eksponeringen udføres under betingelser, der bringer reagenset til gentagne gange at udsende elektromagnetisk stråling; og c. kvantitativt bestemmer mængden af stråling udsendt på 25 denne måde og herved kvantitativt bestemmer den pågældende analyt i prøven, kendetegnet ved, at reagenset er i stand til at konkurrere med den pågældende analyt om bindingspladserne på et komplementært materiale, der normalt ikke er til stede i prøven, og med en kendt mængde 30 af det komplementære materiale, idet kontakten bringes i stand under sådanne betingelser, at den pågældende analyt og reagenset kompetitivt binder det komplementære materiale. 35