JP2571358B2 - ヒトサイトメガロウイルスによる感染の検出法及びそれに用いるキット - Google Patents

ヒトサイトメガロウイルスによる感染の検出法及びそれに用いるキット

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JP2571358B2
JP2571358B2 JP60090741A JP9074185A JP2571358B2 JP 2571358 B2 JP2571358 B2 JP 2571358B2 JP 60090741 A JP60090741 A JP 60090741A JP 9074185 A JP9074185 A JP 9074185A JP 2571358 B2 JP2571358 B2 JP 2571358B2
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ANSUCHI PASUTSUURU
SANTORU NASHIONARU DO RA RUSHERUSHU SHIANTEIFUITSUKU
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ANSUCHI NASHIONARU DO RA SANTE E DO RA RUSHERUSHU MEDEIKARU
ANSUCHI PASUTSUURU
SANTORU NASHIONARU DO RA RUSHERUSHU SHIANTEIFUITSUKU
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）モノク
ローナル抗体とヒトサイトメガロウイルスにより誘発さ
れる感染のin vitro診断法とに係る。本発明はより特定
的にはヒトのサイトメガロウイルス（CMV）と、CMVに感
染したヒト細胞と、ポリペプチド特にHCMVによつて誘発
され且つプロテインキナーゼ活性を示すタンパク質とを
同時に検出し得る前記タイプの抗体に係る。
本発明は更に前記プロテインキナーゼ活性をもつ前記
ポリペプチドにも係る。
周知の如くCMVは軽いものから特に重度の奇型の如き
先天性のものに致るまで何段階かに亘つて顕われる多く
の臨床感染の原因となる。CMVはまた腎臓等の臓器移植
を受けた患者の罹患及び死亡の原因であることも認めら
れている。従つてCMVの診断は極めて重要な問題であ
る。また、CMVに対する免疫を与える性質をもつ又はも
つようにし得るポリペプチド又はタンパク質を識別し分
離することは、現在殆んど治療不可能な前述の如き合併
症を予防する大きな可能性を開くことになる。
ヒトサイトメガロウイルスに対するモノクローナル抗
体の使用を基礎とし得る診断技術はこれまでにも注目を
浴び、種々の文献に著わされてきた。しかしながら現在
までのところサイトメガロウイルス感染の簡単で信頼で
きる診断を実現せしめるようなモノクローナル抗体は提
供されていない。
実際、CMV（ヘルペスウイルス科の一員）は種々の感
染プロセス段階で、且つ細胞の種々の感染レベルで相当
な数のポリペプチドを感染細胞中に誘発することが知ら
れている。エル．エヌ．ペレイラ（L.N.PEREIRA）他
（「感染と免疫（Infection and Immunity）」、1982年
６月、924−932ページ）は、予め感染させた未固定細胞
内でこれら細胞の培養株内のCMVにより誘発されたポリ
ペプチド又は糖タンパク質を識別し得るモノクローナル
抗体を分泌するパイブリドーマを多数つくつたと報告し
ている。ペレイラ等はウイルス自体と、感染した細胞
と、これら細胞の抽出物から分離し得るタンパク質，糖
タンパク質もしくはポリペプチドとに対する種々の抗体
の反応レベルにおいて観察された差異に基づき次の仮説
をうちたてた。即ち、CMV感染した細胞の膜の表面でこ
れら抗体の或るものによつて識別されるウイルス糖タン
パク質の構造はビリオンのエンベロープの構造と異なり
得るというのである。分離した抗体のうち特定のものを
前述の如き診断操作の実施に使用することはこのペレイ
ラ等によつて提起された。しかしながらこれまでに行な
われた実験の結果によれば、最も有利とされていたモノ
クローナル抗体は多くのポリペプチドを同時に沈殿させ
得るものであつた。従つて、これら抗体による認識には
判別性がないため、これら抗体を抗原決定基又は特異エ
ピトープの識別に使用することはできなかつた。
エル．シー．ゴールドスタイン（L.C.GOLDSTEIN）他
（「感染と免疫（Itfection and Immunity）」,1982年1
0月,273−181ページ）も、CMVに感染した細胞の核もし
くは細胞質封入体中に局在する或る種のポリペプチドを
識別し得る幾つかのモノクローナル抗体について記述し
ている。これらのモノクローナル抗体は予め無水メタノ
ールで固定し空気で乾燥させたCMV感染細胞と反応する
力に基づき選別したものである。しかしながらこの記述
からはこれらモノクローナル抗体が未処理の感染細胞を
識別し得るという結論は得られない。
シー．アマデイ（C.AMADEI）他（ビールス学年報（An
n.Virol.）1983年，パスツール研究所（Institut Paste
ur）,134E,165−180）はヒトサイトメガロウイルスに対
する24個のモノクローナル抗体からなるグループについ
て記述している。得られるモノクローナル抗体の大部分
は恐らくこれら抗体の検出に用いられた技術と係りがあ
る。特にこの場合は予め感染させてアセトンで固定し且
つ空気で乾燥しておいた細胞が有する抗体の検出に蛍光
抗体法を使用している。これと同一のモノクローナル抗
体が同一のウイルスに予め感染させた同一の細胞系から
得られる細胞に対して示す活性は、これら感染細胞をメ
タノールで予め固定しておいた場合には、殆んどゼロで
あることが判明した。既のエル・シー・ゴールドスタイ
ン等が分離に成功したHCMV感染細胞に対する選択的モノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマの個数が少な
いことの原因は恐らくこの現象中に求められるべきであ
ろう。
これらのモノクローナル抗体のうち或るものは多くの
ウイルス株を中和する性質をもつことが判明した。この
種のモノクローナル抗体は1983年３月31日に出願された
仏国特許出願第83 05384号に開示されている。これら
特定モノクローナル抗体はHCMV感染のin vitro診断テス
トを実現するために得たものである。しかしながら前記
仏国特許出願でも前述の論文でも、記載された種々のハ
イブリドーマのうち、診断操作に特に有効であつて、或
る種のポリペプチド、即ちHCMVにより誘発され得且つ極
めて精密な診断操作を可能にする生物学的性質を備えた
ポリペプチドを分離するのに適したモノクローナル抗体
を分泌することがその後判明したハイブリドーマについ
ての認識は未だなかつた。
本発明の目的はこれまでに開示された全てのモノクロ
ーナル抗体の中から選択した数種のモノクローナル抗体
を使用する診断方法を提供することにある。これら選択
抗体は容易に且つ信頼性をもつてin vitro診断テストに
使用できる。これら抗体は蛍光抗体テストにおいて未処
理（intact）の感染細胞中に存在するHCMVにより誘発さ
れるタンパク質をも識別する。これらの抗体は感染サイ
クルのほぼ全般に亘つて陽性反応を示し得る。診断は酵
素活性測定テストによつてより精密になり且つその正確
さを確認し得る。感染細胞はHCMVによつて誘発されるポ
リペプチド，タンパク質又は糖タンパク質を産生する。
これらポリペプチドは連続配列（ｓquential contin
u）エピトープ即ち抗原決定基を担持している。「エピ
トープ即ち抗原決定基を担持している」とは、ウイルス
の天然の、又はウイルスに感染した細胞内で該ウイルス
により誘発されたポリペプチド，タンパク質もしくは糖
タンパク質におけるこの部位の特定コンフオーメーシヨ
ンとは無関係に抗体によつて認識される決定基であると
理解されたい。
本発明は前述のモノクローナル抗体分泌ハイブリドー
マがこれらの条件全てに適合するという本発明者等の発
見に基づくものである。より特定的には本発明は、約6
8,000の分子量を有し、CMV株に感染した細胞の抽出物か
ら変質せずに分離され得るタンパク質に担持された連続
配列抗原決定基のin vitro検出に、対応分泌ハイブリド
ーマによつて産生されるモノクローナル抗体を使用する
ことに係る。前記タンパク質はプロテインキナーゼの性
質をも有する。
換言すれば、本発明の方法でヒトサイトメガロウイル
スにより誘発される感染のin vitro診断と、ヒト細胞特
にヒト細胞系内でヒトサイトメガロウイルスにより誘発
され得るプロテインキナーゼの検出とに使用される抗ヒ
トサイトメガロウイルスモノクローナル抗体は該抗体の
下記の如き能力の結集によつて規定される。
−予めHCMVに感染させ且つアセトンで固定したヒトの培
養細胞において、蛍光抗体法により検出し得る反応を生
起せしめる。
−予めHCMVに感染させたヒト細胞内でHCMVにより誘発さ
れ、約68,000の分子量を有し、連続配列エピトープを担
持するウイルスポリペプチドのみと本質的に反応する。
このポリペプチドは核内に発生し、次いで少なくとも一
部分が前記感染細胞の細胞質中に拡散し、この細胞質か
ら分離され得る。
−好ましくはプロテインＡに固定される。
更に詳細には本発明は、前述の使用の範囲内で、下記
の特性をもつポリペプチドを識別するモノクローナル抗
体に係る。
−細胞内に早期に出現する（細胞へのウイルス吸着後３
〜５時間で発見し得る）。
−ヒトCMVに特異なポリペプチドである。
−CMVに感染した細胞内に蓄積される。発生後少なくと
も４日間はこれら細胞内に存在する（特にMRC−５型ヒ
ト肺繊維芽細胞内で）。
−後述の特性をもつ好ましいポリペプチドの性質を全て
有する。
好ましいモノクローナル抗体とはIgGの非特異的レセ
プタと反応しないもの、より特定的には由来を問わず任
意のHCMVに感染した細胞、例えばタウン（Towne）及び
デイヴイス（Davis）のAd−169の名称で知られている株
に感染した細胞内で前記ポリペプチドを検出できるとい
う特徴をもつ抗体である。好ましいモノクローナル抗体
の一例として、1984年３月27日にN0I−289で国立微生物
培養コレクシヨン（la Collection Nationale des Cult
ures de Micro−Organismes（C.N.C.M.））に寄託され
たハイブリドーマにより産生されるものが挙げられる。
前記モノクローナル抗体は、Ad−169HCMV株の如きHCM
Vに対し予め免疫しておいた動物の脾臓細胞と骨髄腫細
胞との間で予め形成した、HCMVウイルスを中和するモノ
クローナル抗体を分泌するハイブリドーマを用いる方法
によつて得られる。この方法はより特定的には下記のス
テツプからなることを特徴とする。
−前記中和作用をもつ抗体を、予めHCMVに感染させ且つ
アセトンで固定し好ましくは空気で乾燥させたヒト培養
細胞と反応させる。
−クローンのうち、アセトンで固定した後の前記ヒト細
胞において蛍光抗体法により検出し得る固定反応を生起
するものを第１に選択する。
−必要であれば、前記第１選択の結果得られるモノクロ
ーナル抗体のうち、明らかに前記感染細胞の核内で誘発
されその後細胞質中に拡散し、且つこの細胞質から任意
に分離し得るウイルスタンパク質と選択的に反応するも
のを第２に選択する。前記タンパク質は分子量が約68,0
00であり、プロテインキナーゼの性質を有するようなタ
ンパク質である。
−得られた反応生成物から選択抗体を回収する。
モノクローナル抗体の回収はそれ自体公知の任意の方
法、例えば形成された反応生成物とプロテインＡ特に黄
色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテイン
Ａとの複合体を予め形成しておき、この複合体を適切な
イオン緩衝液中で解離するという方法により実施し得
る。
プロテインキナーゼ活性をもつ分子量68,000のポリペ
プチドの少なくとも一部分を分離するには、感染細胞か
ら得られる細胞質抽出物中にやはり含まれる異なる分子
量のタンパク質又はポリペプチドを予め分離してもよ
い。
より特定的に、前述のハイブリドーマにより産生され
るモノクローナル抗体によつて識別される前記ポリペプ
チドの産生に使用し得るヒト細胞としては、HCMVの複製
に耐え得る任意のタイプの細胞を使用してよい。このよ
うな使用に有利な細胞はMRC−５型ヒト肺繊維芽細胞で
ある。
本発明は、分子量が約68,000に達し得、プロテインキ
ナーゼ活性をもち、連続配列エピトープを担持し、感染
細胞内でHCMVにより誘発され得るポリペプチドにも係
る。この腫のポリペプチドはHCMV特にAd−169菌株の培
養物に予め感染させたヒト肺繊維芽細胞の如きヒト細胞
の培養株から得ることができる。このポリペプチドは感
染細胞の細胞質から分離し得る。但し本発明は前記モノ
クローナル抗体によつて識別される連続配列エピトープ
をやはり含む分子量のより小さい全てのポリペプチドに
も係る。当業者には明らかなように、本発明のモノクロ
ーナル抗体を使用すれば、特定部位でペプチドを切断し
得る酵素により未処理の最初のペプチドを切断するとい
うそれ自体公知の方法を用いることにより、分子量約6
8,000の前記ポリペプチドから同一の抗原決定基を含む
より小さいペプチド配列を分離することが可能になる。
この種のタンパクとしては例えば黄色ブドウ球菌酵素V
8,アルフアキモトリプシン，ベーリンガー（BOEHRINGE
R）社より市販の「マウス顎下腺プロテアーゼ（mouse s
ubmaxillary gland protease）」，ジペプチドGly−Pro
及びGly−Alaを特異的に識別するビブリオアルギノルテ
クスケモーバーイオフアクス（Vibrio alginoluticus
chemovar iophacus）コラゲナーゼが挙げられる。
従つて、前述の如き酵素により調節的に切断したペプ
チドから、モノクローナル抗体と反応する抗原部位を含
む且つ必要であれば前述のプロテインキナーゼ活性をも
保持するものを検出することが可能になる。
本発明の好ましいポリペプチドは更に下記の特性を有
する。
−カゼインキナーゼIIタイプのプロテインキナーゼ活性
を示す。特に、リンをATPからカゼイン及びその他の基
質、例えばホスビチン，グリコーゲンシンテターゼ，ヒ
ストン，アルフアホスホリラーゼ等に転移するのに適し
ている。
−プロテインキナーゼ活性がクエルシチン（quercitin
e）によつて阻害される。
−in vitroで自己リン酸化し得る。
−感熱性を有する（−70℃及び100℃で失活）。
より特定的には本発明は前述のモノクローナル抗体を
使用するin vitro診断法に係る。この方法では前記モノ
クローナル抗体を検出すべき感染性をもつ又はもたない
細胞と接触させ、好ましくは処理されたこれら細胞を破
壊することのない蛍光抗体法によつて前記ポリペプチド
を検出する。テストの実施に使用し得る好ましい条件に
ついては後で説明する。
これら特定のモノクローナル抗体は感染後直ぐに利用
できるため診断テストに使用すると極めて有利である。
実際、誘発されるタンパク質は感染後３〜５時間で出現
し、感染サイクルの間中存続することが観察された。こ
れらモノクローナル抗体は特にこの性質によつて他のモ
ノクローナル抗体と一線を画する。実際には感染開始時
点は通常わからないため、サイトメガロウイルスに感染
したと思われる患者の組織又は他の細胞採取物のバイオ
プシーによつて得た細胞に関して診断テストを行なう場
合には特に前記モノクローナル抗体を使用すると有利で
ある。
本発明の範囲内で使用されるモノクローナル抗体は、
HCMVの連続配列抗原決定基を含み及び／又は同様にプロ
テインキナーゼ活性を有するポリペプチド，タンパク質
もしくは糖タンパク質又はこれらの断片をHCMVに予め感
染させたヒト細胞培養株の抽出物又は溶解物から精製す
る方法と見なされ得るものの基礎をもなし得る。この方
法の好ましい実施例では前述タイプのモノクローナル抗
体を固体サポート、例えばスウエーデンのフアルマシア
・エー・ジー（Pharmacia AG）社によりセフアロース
（SEPHAROSE）の商品名で市販されている立方細網状ア
ガロース格子上に臭化シアンの如き物質で固定させたも
のを使用し得る。
本発明のポリペプチドの抗原決定基の連続配列性は、
強力洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS），
デオキシコール酸ナトリウム，又はトリトン（TRITON）
Ｘ−100の商品名で市販されている洗剤の存在下でベー
タメルカプトエタノールと共に又は無しで分離操作を実
施しても、この抗原決定基を有するポリペプチドが感染
細胞の細胞質抽出物から必ず分離し得るという事実から
推論される。実際、前掲の洗浄剤はタンパク質をいわば
解きほぐす（“ｄfaire"又は“ｄplier"）能力があ
ることで知られている。従つて全ての「コンフオーメー
シヨン」抗原決定基はモノクローナル抗体により認識さ
れなくなると考えられる。この推論は特に、「コンフオ
ーメーシヨン部位」が天然タンパク質の初期コンフオー
メーシヨンに起因してこの天然タンパク質中で互に非直
接的に結合する配列の接近によつてしか相互に接近し合
わないようなアミノ酸配列を利用すると仮定した場合に
引き出される。この考え方に立てば、前記抗原部位を担
持するこのタンパク質又はポリペプチドは恐らく免疫原
でもあり、従つてウイルス自体を中和する抗体のin vit
ro産生を誘発し得ることになる。
本発明の抗体が必要に応じ酵素による分解に対して保
護した細胞抽出物中で分子量約68,000のタンパク質のみ
を特異的に検出し、これとは明らかに異なる分子量をも
つ他の全てのポリペプチド又はタンパク質は検出しない
とすれば、このポリペプチド又はタンパク質自体を細胞
融合によつて得たハイブリドーマにより産生し得るモノ
クローナル抗体の選択と分離とに使用できることにな
る。尚前記細胞融合は別のタイプの骨髄腫とこれら骨髄
腫細胞に融合すべき脾臓細胞を免疫するための別のHCMV
とを使用して行なわれる。
本発明の他の特徴は、ハイブリドーマの形成と、これ
らハイブリドーマのうち本発明に適合する抗体を産生し
得るものを分離する操作とに関する以下の実施例から明
らかにされよう。
これら実施例で使用される技術は下記の操作法に従つ
て実施した。
１） ハイブリドーマの形成 解凍したヒト感染細胞MRC−５の懸濁液を腹腔内注射
してマウスに免疫を与える。これら細胞はAd−169HCMV
株に感染させた後５日間冷凍しておいたものである。３
〜４週間後これらマウスに２次注射（une injection de
rappel）を行なう。マウスを殺し、脾臓を取出す。こ
れは２次注射の３日後に細胞融合を行なうためである。
脾臓細胞を骨髄腫細胞SP2/OAg14（シユルマン（SCHULMA
NN）他の株，「ネーチヤー（Nature）」,1978年，276,2
69/270）と融合させ、形成されたハイブリドーマを、ポ
リオウイルスに対するモノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマの形成についてアール・クレイニツク（R.
CRAINIC）他により「デベロツプ．バイオロ．スタンダ
ード（Develap.Biol.Standard）」,1982年，50,229−23
4に記載されている方法に従い、ヒポキサンチン（5mM）
とアザセリン（1mM）とを含むRPMI培地中で選別にかけ
る。
２） 陽性のハイブリドーマの選択 このようにして得たハイブリドーマの培養の上清部を
遅延抗原製剤（prparation d′antigne tardif）を
用いて間接蛍光抗体法により選択処理し、HCMVに対する
特異抗体を分泌し得るものを得た。一連の陽性のハイブ
リドーマを限定希釈法によつてクローン化し、次いで前
出のシー・アマデイ等の論文に記載の方法に従いこれら
クローンの上清部を間接蛍光抗体法により同様にテスト
する。このようにしてシー・アマデイ等のモノクローナ
ル抗体F6bと類似の特性をもつモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを選択する。C.N.C.M.にN0I−289
の番号で寄託されたのはこれらの株の１つである。
３）モノクローナル抗体の標識 シー・アマデイ等による方法に従い前記クローン（２
×106細胞）を35S−メチオニン又は3H−メチオニンで標
識する。
４）プロテインＡへの固定の検出 これもアマデイ他の論文に記載の方法で行なう。
前述の３）及び４）のテストはより特定的には、HCMV
に予め感染させたヒト培養細胞を用いる免疫蛍光法によ
つて検出し得る反応を生起する、更にプロテインＡによ
つて沈殿し得るというモノクローナル抗体の能力を識別
するためのものである。
これらのモノクローナル抗体から分子量約68,000のポ
リペプチドとしか反応し得ないものを検出する場合に
は、予め感染させておいたヒト細胞に放射性又はこれと
類似の標識を前もつて与えておき、後でこれら細胞の細
胞抽出物を回収するようにするのが好ましい。次いでこ
れらの細胞抽出物を選択すべき未標識モノクローナル抗
体と反応させる。
５）抗原の抽出 感染又は未感染細胞をカルシウムイオン及びマグネシ
ウムイオンを含むリン酸緩衝生理食塩水（完全PBS）に
よりその場で２回洗浄し、フツ化フエニルメチルスルホ
ニル10-4M（PMSF）とジイソプロピルフルオロホスフエ
ート10-4（DFP）とを含む完全PBS中で掻き取り（raclag
e）により回収する。次いでこれら細胞を1979年のビー
ルス学誌（J.Virol.）32,259−267に記載のマイケルソ
ン（MICHELSON）他の方法に従い、塩含有率とpHとが高
く、NP−40の名称で市販されている洗浄剤を0.5％含む
溶液中で抽出処理にかける。場合によつては細胞を低張
緩衝液中で膨張させ、NP−40を加え（最終濃度05％）且
つ該細胞懸濁液をプランジヤピストンの作用下において
細胞を粉砕した後細胞質から核を分離した（マイケルソ
ン等の方法による）。前記懸濁液を４℃で５分間800gの
遠心分離にかけると形成された沈殿物中に核が捕捉され
る。細胞質画分を構成する上清を回収し、前記核を前述
と同様の抽出処理にかけた。
全ての抽出物を４℃で15−30分間、15,000gの遠心分
離にかけ、使用時まで−70℃で凍結した。ホスホトラン
スフエラーゼ活性測定テストの場合には後述の条件で所
望の抗原の即時免疫沈降（immunoprcipitation imm
diate）を行なう。この抗原は黄色ブドウ球菌に結合し
た状態で保存し得る。
６） 免疫沈降 この沈降は５μの腹水液を用いて200μｇの抽出タ
ンパク質により実施する。抗原及びモノクロナール抗体
（F6b）を室温で１時間半撹拌しながらインキユベート
する。熱で不活化し且つホルムアルデヒドで固定したカ
ウアン（Cowan）の血清型Ｉの黄色ブドウ球菌株を10％
含む懸濁液の形状でプロテインＡを添加する（腹水液５
μ当り50μ）。抗原−抗体複合体をNETS媒質（エス
・ダブル・ケスラー（KESSLER S.W.），免疫学誌（J.Im
munol.）1975年,115,1617−1624）中で３回洗浄し、４
℃で、10％懸濁液の形状でこの緩衝液中に保存する。こ
の複合体は100℃で５分間加熱することにより電気泳動
緩衝液中で解離させてもよい。免疫沈降物をドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動ゲル（10％SD
S−PAGE）を用いて分析した。タンパク質の分解を30−3
5mAの電流下における示差移動（migration diffirentie
lle）によつて実施した。必要に応じ欧州生化学誌（Eu
r.J.Biochem.）,1974年46,83−88に記載のボナー（BONN
AR）他の方法によつて、但しジメチルスルホキシド（DM
SO）をベースとする単一浴を37℃で15分間使用し且つDM
SO＋20％の2,5−ジフエニルオキサゾール（PPO）からな
る単一浴を37℃で30分間使用して、フルオログラフイー
を行なつた。
７）細胞の放射性標識 幾つかの感染細胞を感染の１時間後に選択し且つ15分
間メチオニン除去処理にかける。次いで10μCi/mlの35S
−メチオニンを含む媒質中でウイルス吸収操作を行な
う。残りの感染細胞試料に関してはウイルスを１時間吸
収させ且つ増殖培地を加えた。全ての細胞を15分間メチ
オニン除去処理にかけ、その後２時間標識処理し、その
後で感染後夫々3,9,24,48,72及び96時間の時点で採取し
た。未感染細胞も同様の方法で標識した。標識媒質とし
ては10μCi/mlの35S−メチオニンを含みメチオニンを除
去したイーグル（Eagle）最小必須培地を使用した（ア
メルシヤム（AMERSHAM）,1300Ci/mMの比放射能）。リン
タンパク質の標識処理はリン酸塩を含まず100μCi/mlの
32P−オルトリン酸塩を含む改変ダルベツコ（DULBECC
O）培地中で３時間実施した。
８） プロテインキナーゼ活性の検出 特に断りがない限りプロテインキナーゼ活性のテスト
は、pH6.8のリン酸マグネシウム22mM緩衝液KPiと、硫酸
マグネシウムMgSO45mMと、EDTA0.15mMと、ADP0.1mMと、
３μCiの32P−ATPと、1mg/mlのカゼインとを含む媒質
（最終容量100μ）中でバクテリアに結合した酸素50
μを用いて行なう。カゼインはSDS−PAGEゲルにおけ
る免疫沈降物の分析テストでは使用しない。次いで免疫
沈降物を前述の方法で洗浄し、反応混合物中に再懸濁さ
せ、30℃で30分間インキユベートする。10μのEDTA0.
3M溶液を用いて反応を停止させる。遠心分離を5000g、
４℃で４分間行なつて免疫沈降物を分離する。上清部を
トリクロル酢酸（TCA）５％溶液によつて沈澱させる。
沈澱物をソーダ1M溶液中に溶解し、TCAによつて再沈降
させ、ワツトマン（WHATMAN）G.F./C.の名称で市販され
ているフイルタで過することにより洗浄する。エタノ
ールで更に洗浄した後前記フイルタを乾燥させ、パツカ
ード（PACKARD）液体シンチレータ中でインパルスの計
数を行なう。ゲルで分析すべき免疫沈降物をKPi緩衝液
中で３度洗浄し、電気泳動緩衝液中に懸濁させ、前述の
条件下で10％SDS/PAGEゲルを用いて分析する。
９） 沈降係数の計算 35S−メチオニンで標識された抗原を形成し、前述の
如き感染細胞からの抽出処理に120時間かけた。この抗
原をPBS中に形成した５−25％スクロース勾配の上層部
に置き、４℃、35,000回転／分で17.25時間、ベツクマ
ン（BECKMAN）SW−41ロータで遠心分離処理する。画分
を回収し、各画分をモノクローナル抗体F6bで免疫沈降
させ、次いでSDS−PAGEにより分析した。
10）32Pで標識したアミノ酸の電気泳動 カゼインを存在させずに得た免疫沈降物を用いるプロ
テインキナーゼ反応の後、32Pで標識された生成物を0.1
％のSDSを含むNH4HCO30.1％溶液で分離する。この試料
を真空下で乾燥し、HCl6M中に懸濁させた後110℃で一晩
加水分解する。HCl蒸発後試料を電気泳動緩衝液中に懸
濁させる。セルロースで被覆された薄いプレート（マシ
エレイ−ナゲル・アンド・カンパニー（MACHEREY−NAGE
L＆Co.）社より市販）を使用しホスホアミノ酸を1000V
で45分間pH3.5で分離処理する（50ml/の酢酸と5ml/
のピリジンとで調製した媒質を使用）。標準試料（ta
lon）をカドミウム−ニンヒドリン試薬で着色し（生物
学化学誌（J.Biol.Chem.）1982年,257,15156−15161に
ドリツケーマー（DRICKAMER）他により記述）、前記プ
レートをコダツク（Kodak）Ｘ−Omatフイルムに一週間
さらした。
モノクローナル抗体F6bにより免疫沈降したポリペプ
チドは約68,000の分子量を有する（p68）。このポリペ
プチドは感染後３時間で感染細胞の核から免疫沈降し得
る。これはまた感染後24時間で細胞質抽出物から免疫沈
降させることもできる。抽出タンパク質全体に対するこ
のポリペプチドの含量は感染後96時間で0.5％に達し得
る（回収した免疫沈降物に含まれる放射能のパーセンテ
ージに基づいて算出）。このポリペプチドは20゜の水中
で6.9の沈降係数を示す（カタラーゼからなる標識及び
子牛血清アルプミンからなる標識と比較）。
周知の分子量をもつ下記の４種の物質の同一電気泳動
システム内での移動距離に対するp68の分子量を評価し
た。
−ホスフアリラーゼＡ（94,000） −子牛血清アルブミン（68,000） −フマラーゼ（49,000） −アルドラーゼ（40,000） このポリペプチドは前述のin vitroリン酸化能力を示
す。アクセプタとして使用されるカゼインとのプロテイ
ンキナーゼ反応はpH6−6.5で最適に生起する。この反応
はより酸性又はよりアルカリ性のpHをもつ媒質中では早
急に衰える。この反応はMg2+イオンの存在に依存する、
これらの反応はcAMP依存反応ではない。リン酸塩転移反
応は高いpHでのマンガンの存在下では生起しない。この
ポリペプチド（又はこの酵素）は安定であり、黄色ブド
ウ球菌と結合した状態で保存し得、４℃で６週間保存し
た後でも失活しない。モノクローナル抗体F6bと複合体
化しても活性は失われない。
この酵素は自己リン酸化し得、これはスレオニンとセ
リンとからなるアミノアシル残基部分で生起する。
約68,000の分子量をもち且つ前述の特性を有するポリ
ペプチドは他のサイトメガロウイルス株、特にタウン及
びデイヴイスのヒト菌株により感染したヒト細胞特に肺
繊維芽細胞内で誘発される。これに対し、サルに特異的
なサイトメガロウイルス株（コルバーン（COLBURN）株
及びSGC株）は株F6bにより分泌されるモノクローナル抗
体によつて識別し得る分子量68,000のタンパク質の産生
を誘発しない。
従つて本発明はより特定的にはモノクローナル抗体F6
bの特性を有するモノクローナル抗体を産生する株の選
択に係る。
実際、このモノクローナル抗体を使用するとHCMVウイ
ルス感染をin vitroで確実に診断できる。前述の如くこ
の検出は特に蛍光抗体反応により感染サイクルの実質的
に如何なる時点でも行ない得る。このモノクローナル抗
体は更に、蛍光抗体法によつて実現される診断をヒトサ
イトメガロウイルスにより誘発されるタンパク質と共に
複合体を形成するという同一抗体の効力によつて確認し
得るという大きな利点をも有する。前記タンパク質の存
在はプロテインキナーゼ活性によつて発見できる。これ
らの活性はかなり正確に検出し得る。また、前述タイプ
のモノクローナル抗体の使用は感染したヒト細胞の感染
度の定量テストでも利用し得る。
本発明は例えばサイトメガロウイルスにおける分類が
アプリオリに定かでないウイルスを識別するテストなど
で重要な生物学的試薬として用いられるポリペプチド自
体にも係る。逆に、このポリペプチドは診断「キツト」
を構成する最も有効なモノクローナル抗体を選択するの
に使用し得る。
本発明はまた前述の如きin vitro診断を行なうための
「キツト」にも係る。このキツトは主として −少なくとも１つのマイクロプレートと、 −その診断に適したモノクローナル抗体を含む製剤と、 −対照細胞抽出物（ヒト細胞特にMRC−５型細胞から得
たもの。これら細胞は予めHCMVに感染又は未感染）と、 −ヒト血液の免疫グロブリンに対する標識した（放射
性、酵素、蛍光性その他の標識で）抗体と、 −種々の操作と、反応した生成物の蛍光顕微鏡による最
終検査とに適した緩衝液 とで構成される。
このようなキツトは例えば下記の手順で使用する。
−細胞バイオプシーによつて得た検査すべき細胞抽出物
を滴定プレートの１つ又は複数の杯状部に配置し、表面
に吸着させる。
−マイクロプレートの杯状部即ち凹部にモノクローナル
抗体製剤を適量導入する。
−前記プレートを適温でインキユベートする。
−次いでこのマイクロプレートを十分に洗浄する。
−血液免疫グロブリンに対抗し、従つてモノクローナル
抗体に対抗する標識した抗体をマイクロプレートの凹部
に導入し、このプレートを再度インキユベートする。
−標識を検出する（例えば標識が酵素の場合は適切な基
質への作用などによつて）。
これら一連の操作は比較のために対照細胞抽出物に関
しても行なう。
有利には、例えば前述の如き条件下で得られた細胞抽
出物を例えば前述の如きアガロースゲルに固定されたモ
ノクローナル抗体を含むアフイニテイ・クロマトグラフ
イ・カラムに通し、使用するモノクローナル抗体とこれ
ら抗体により特異的に認識されるポリペプチドとの複合
体を形成した場合にはこの複合体を解離し、且つ前記ポ
リペプチドの定量をそのプロテインキナーゼ活性を利用
して行なうことにより検出テスト及び定量テストを実施
してもよい。
以上の説明からも明らかなように、本発明は前述の特
定実施例及び使用例には限定されず、あらゆる変形例を
包含する。
フロントページの続き (73)特許権者 999999999 アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシ ユ・メデイカル フランス国、75013・パリ、リユ・ド ウ・トルビアツク、101 (72)発明者 フロリアン・オロー フランス国、92190・ムードン、リユ・ アルベール―ドウーマン、２ (72)発明者 スーザン・ミシエルソン フランス国、78590・ノワジー・ル・ロ ワ、リユ・アンドレ・ルブールブラン、 １、ラ・ガイヤルドリ・ニユメロ・キヤ トル (72)発明者 オクタヴイアン・バルズ フランス国、91300・マツシー、リユ・ ドウ・ラ・ソーセイ、30 (72)発明者 アンドレ・ブー フランス国、78210・サン―シール・レ コル、リユ・ドユ・ドクトウール・ヴア イヤン、７ (72)発明者 クレール・アマデ フランス国、92400・クルブヴオワ、リ ユ・ピエール―キユリー、15 (56)参考文献 Ａｎｎ．Ｖｉｒｏｌ．，134〔２〕 （1983）Ｐ．165−175，177−180

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】特にサイトメガロウィルス感染のin vitro
    診断のための、サイトメガロウィルスに感染したと思わ
    れる患者から採取した細胞試料に由来するヒト細胞内で
    のヒトサイトメガロウイルスによる感染の存在の検出法
    であって、前記細胞を未処理状態で又はこれら細胞から
    得た細胞抽出物の形態でモノクローナル抗体と接触させ
    ることからなり、このモノクローナル抗体が、 −予めHCMVに感染させ且つアセトンで固定したヒト由来
    培養細胞において蛍光抗体法により検出し得る反応を生
    起し、 −予めHCMVに感染させたヒト細胞内でHCMVにより誘発さ
    れ、プロテインキナーゼII活性を有し、前記細胞内に早
    期に出現し（細胞へのウイルス吸着後３〜５時間で検出
    可能）、前記細胞内に蓄積され、出現後少なくとも４日
    間は前記細胞内に存在し、約68、000の分子量をもち、
    連続配列エピトープを担持し、前記感染細胞の核内に現
    われ次いで少なくともその一部分が細胞質中に拡散し、
    この細胞質から分離され得る単一のウイルスポリペプチ
    ドと本質的に反応し、 −好ましくはプロテインＡと反応する という諸性質によって規定されるモノクローナル抗体で
    あることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】ヒトサイトメガロウイルスにより細胞内に
    誘発されるポリペプチドをこの細胞の抽出物中で検出す
    る方法であって、細胞抽出物を −予めHCMVに感染させ且つアセトンで固定したヒト由来
    培養細胞において蛍光抗体法により検出し得る反応を生
    起し、 −予めHCMVに感染させたヒト細胞内でHCMVにより誘発さ
    れ、プロテインキナーゼII活性を有し、前記細胞内に早
    期に出現し（細胞へのウイルス吸着後３〜５時間で検出
    可能）、前記細胞内に蓄積され、出現後少なくとも４日
    間は前記細胞内に存在し、約68、000の分子量をもち、
    連続配列エピトープを担持し、前記感染細胞の核内に現
    われ次いで少なくともその一部分が細胞質中に拡散し、
    この細胞質から分離され得る単一のポリペプチドと本質
    的に反応し、 −好ましくはプロテインＡと反応する という諸性質によって規定されるモノクローナル抗体と
    反応させ、且つ前記モノクローナル抗体と前記ポリペプ
    チドとの間に形成された複合体を前記ポリペプチドのプ
    ロテインキナーゼ活性の測定により検出することを特徴
    とする方法。
  3. 【請求項３】ヒトサイトメガロウイルスによる細胞感染
    の診断に用いられるキットであって、 −少なくとも１つのマイクロプレートと、 −予めHCMVに感染させ且つアセトンで固定したヒト由来
    培養細胞において蛍光抗体法により検出し得る反応を生
    起し、予めHCMVに感染させたヒト細胞内でHCMVにより誘
    発され、プロテインキナーゼII活性を有し、前記細胞内
    に早期に出現し（細胞へのウイルス吸着後３〜５時間で
    検出可能）、前記細胞内に蓄積され、出現後少なくとも
    ４日間は前記細胞内に存在し、約68、000の分子量をも
    ち、連続配列エピトープを担持し、前記感染細胞の核内
    に現われ次いで少なくともその一部分が細胞質中に拡散
    し、この細胞質から分離され得る単一のウイルスポリペ
    プチドと本質的に反応し、好ましくはプロテインＡと反
    応するという諸性質によって規定されるモノクローナル
    抗体を含む製剤と、 −細胞抽出物（ヒト細胞特にMRC−５型ヒト細胞から得
    た対照抽出物、これら細胞は予めHCMVで感染したもの又
    は未感染のもの）と、 −上記モノクローナル抗体に対する標識された抗体（放
    射活性、酵素、蛍光又はその他の標識を使用）と、 −種々の操作の実施と、蛍光顕微鏡による反応生成物の
    最終検査とに適した緩衝液 とを含むことを特徴とするキット。
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