JPH0920796A - ヒトサイトメガロウイルスによって誘発され且つプロテインキナーゼ活性をもつポリペプチド - Google Patents

ヒトサイトメガロウイルスによって誘発され且つプロテインキナーゼ活性をもつポリペプチド

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JPH0920796A
JPH0920796A JP8162050A JP16205096A JPH0920796A JP H0920796 A JPH0920796 A JP H0920796A JP 8162050 A JP8162050 A JP 8162050A JP 16205096 A JP16205096 A JP 16205096A JP H0920796 A JPH0920796 A JP H0920796A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトサイトメガロウイルスによって誘発され
且つプロテインキナーゼ活性を示すポリペプチドを得
る。 【解決手段】 約６８，０００の分子量を有し、プロテ
インキナーゼ活性を有し、リンの転移能を有し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで自己リン酸化し得、感熱性を有するポリペ
プチド又はそのフラグメント。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗ヒトサイトメガロ
ウイルス（ＨＣＭＶ）モノクローナル抗体とヒトサイト
メガロウイルスにより誘発される感染のｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ診断法とに係る。本発明はより特定的にはヒトのサイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）と、ＣＭＶに感染したヒト
細胞と、ポリペプチド特にＨＣＭＶによって誘発され且
つプロテインキナーゼ活性を示すタンパク質とを同時に
検出し得る前記タイプの抗体に係る。
【０００２】本発明は更に前記プロテインキナーゼ活性
をもつ前記ポリペプチドにも係る。
【０００３】周知の如くＣＭＶは軽いものから特に重度
の奇型の如き先天性のものに至るまで何段階かに亘って
顕われる多くの臨床感染の原因となる。ＣＭＶはまた腎
臓等の臓器移植を受けた患者の罹患及び死亡の原因であ
ることも認められている。従ってＣＭＶの診断は極めて
重要な問題である。また、ＣＭＶに対する免疫を与える
性質をもつ又はもつようにし得るポリペプチド又はタン
パク質を識別し分離することは、現在殆んど治療不可能
な前述の如き合併症を予防する大きな可能性を開くこと
になる。
【０００４】ヒトサイトメガロウイルスに対するモノク
ローナル抗体の使用を基礎とし得る診断技術はこれまで
にも注目を浴び、種々の文献に著わされてきた。しかし
ながら現在までのところサイトメガロウイルス感染の簡
単で信頼できる診断を実現せしめるようなモノクローナ
ル抗体は提供されていない。
【０００５】実際、ＣＭＶ（ヘルペスウイルス科の一
員）は種々の感染プロセス段階で、且つ細胞の種々の感
染レベルで相当な数のポリペプチドを感染細胞中に誘発
することが知られている。エル．エヌ．ペレイラ（Ｌ．
Ｎ．ＰＥＲＥＩＲＡ）他（「感染と免疫（Infection an
d Immunity）」、１９８２年６月、９２４−９３２ペー
ジ）は、予め感染させた未固定細胞内でこれら細胞の培
養株内のＣＭＶにより誘発されたポリペプチドまたは糖
タンパク質を識別し得るモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマを多数つくったと報告している。ペレイ
ラ等はウイルス自体と、感染した細胞と、これら細胞抽
出物から分離し得るタンパク質、糖タンパク質もしくは
ポリペプチドとに対する種々の抗体の反応レベルにおい
て観察された差異に基づき次の仮説をうちたてた。即
ち、ＣＭＶ感染した細胞の膜の表面でこれら抗体の或る
ものによって識別されるウイスル糖タンパク質の構造は
ビリオンのエンベロープの構造と異なり得るというもの
である。分離した抗体のうち特定のものを前述の如き診
断操作の実施に使用することはこのペレイラ等によって
提起された。しかしながらこれまでに行なわれた実験の
結果によれば、最も有利とされていたモノクローナル抗
体は多くのポリペプチドを同時に沈殿させ得るものでも
あった。従って、これら抗体による認識には判別性がな
いため、これら抗体を抗原決定基又は特異エピトープの
識別に使用することはできなかった。
【０００６】エル．シー．ゴールドスタイン（Ｌ．Ｃ．
ＧＯＬＤＳＴＥＩＮ）他（「感染と免疫（Infection an
d Immunity）」、１９８２年１０月，２７３−２８１ペ
ージ）も、ＣＭＶに感染した細胞の核もしくは細胞質封
入体中に局在する或る種のポリペプチドを識別し得る幾
つかのモノクローナル抗体について記述している。これ
らのモノクローナル抗体は予め無水メタノールで固定し
空気で乾燥させたＣＭＶ感染細胞と反応する力に基づき
選別したものである。しかしながらこの記述からはこれ
らモノクローナル抗体が未処理の感染細胞を識別し得る
という結論は得られない。
【０００７】シー．アマディ（Ｃ．ＡＭＡＤＥＩ）他
（ビールス学年報（Ａｎｎ．Ｖｉｒｏｌ．）１９８３
年，パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅ
ｕｒ），１３４Ｅ，１６５−１８０）はヒトサイトメガ
ロウイルスに対する２４個のモノクローナル抗体からな
るグループについて記述している。得られるモノクロー
ナル抗体の大部分は恐らくこれら抗体の検出に用いられ
た技術と係りがある。特にこの場合は予め感染させてア
セトンで固定し且つ空気で乾燥しておいた細胞が有する
抗体の検出に蛍光抗体法を使用している。これと同一の
モノクローナル抗体が同一のウイルスに予め感染させた
同一の細胞系から得られる細胞に対して示す活性は、こ
れら感染細胞をメタノールで予め固定しておいた場合に
は、殆んどゼロであることが判明した。既にエル・シー
・ゴールドスタイン等が分離に成功したＨＣＭＶ感染細
胞に対する選択的モノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマの個数が少ないことの原因は恐らくこの現象中
に求められるべきであろう。
【０００８】これらのモノクローナル抗体のうち或るも
のは多くのウイルス株を中和する性質をもつことが判明
した。この種のモノクローナル抗体は１９８３年３月３
１日に出願された仏国特許出願第８３ ０５３８４号に
開示されている。これら特定モノクローナル抗体はＨＣ
ＭＶ感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断テストを実現するため
に得たものである。しかしながら前記仏国特許出願でも
前述の論文でも、記載された種々のハイブリドーマのう
ち、診断操作に特に有効であって、或る種のポリペプチ
ド、即ちＨＣＭＶにより誘発され得且つ極めて精密な診
断操作を可能にする生物学的性質を備えたポリペプチド
を分離するのに適したモノクローナル抗体を分泌するこ
とがその後判明したハイブリドーマについての認識は未
だなかった。
【０００９】本発明の目的はこれまでに開示された全て
のモノクローナル抗体の中から選択した数種のモノクロ
ーナル抗体を使用する診断方法を提供することにある。
これら選択抗体は容易に且つ信頼性をもってｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ診断テストに使用できる。これら抗体は蛍光抗体
テストにおいて未処理（ｉｎｔａｃｔ）の感染細胞中に
存在するＨＣＭＶにより誘発されるタンパク質をも識別
する。これらの抗体は感染サイクルのほぼ全般に亘って
陽性反応を示し得る。診断は酵素活性測定テストによっ
てより精密になり且つその正確さを認識し得る。感染細
胞はＨＣＭＶによって誘発されるポリペプチド，タンパ
ク質又は糖タンパク質を産生する。これらポリペプチド
は連続配列（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｏｎｔｉｎｕ）
エピトープ即ち抗原決定基を担持している。「エピトー
プ即ち抗原決定基を担持している」とは、ウイルスの天
然の、又はウイルスに感染した細胞内で該ウイルスによ
り誘発されたポリペプチド，タンパク質もしくは糖タン
パク質におけるこの部位の特定コンフォーメーションと
は無関係に抗体によって認識される決定基であると理解
されたい。
【００１０】本発明の前述のモノクローナル抗体分泌ハ
イブリドーマがこれらの条件全てに適合するという本発
明者等の発見に基づくものである。より特定的には本発
明は、約６８，０００の分子量を有し、ＣＭＶ株に感染
した細胞の抽出物から変質せずに分離され得るタンパク
質に担持された連続配列抗原決定基のｉｎ ｖｉｔｒｏ
検出に、対応分泌ハイブリドーマによって産生されるモ
ノクローナル抗体を使用することに係る。前記タンパク
質はプロテインキナーゼの性質をも有する。
【００１１】換言すれば、本発明の方法でヒトサイトメ
ガロウイルスにより誘発される感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ
診断と、ヒト細胞特にヒト細胞系内でヒトサイトメガロ
ウイルスにより誘発され得るプロテインキナーゼの検出
とに使用される抗ヒトサイトメガロウイルスモノクロー
ナル抗体は該抗体の下記の如き能力の結集によって規定
される。
【００１２】−予めＨＣＭＶに感染させ且つアセトン
で固定したヒトの培養細胞において、蛍光抗体法により
検出し得る反応を生起せしめる。
【００１３】−予めＨＣＭＶに感染させたヒト細胞内
でＨＣＭＶにより誘発され、約６８，０００の分子量を
有し、連続配列エピトープを担持するウイルスポリペプ
チドのみと本質的に反応する。このポリペプチドは核内
に発生し、次いで少なくとも一部分が前記感染細胞の細
胞質中に拡散し、この細胞質から分離され得る。
【００１４】−好ましくはプロテインＡに固定され
る。
【００１５】更に詳細には本発明は、前述の使用の範囲
内で、下記の特性をもつポリペプチドを識別するモノク
ローナル抗体に係る。
【００１６】−細胞内に早期に出現する（細胞へのウ
イルス吸着後３〜５時間で発見し得る）。
【００１７】−ヒトＣＭＶに特異なポリペプチドであ
る。
【００１８】−ＣＭＶに感染した細胞内に蓄積され
る。発生後少なくとも４日間はこれら細胞内に存在する
（特にＭＲＣ−５型ヒト肺繊維芽細胞内で）。
【００１９】−後述の特性をもつ好ましいポリペプチ
ドの性質を全て有する。
【００２０】好ましいモノクローナル抗体とはＩｇＧの
非特異的レセプタと反応しないもの、より特定的には由
来を問わず任意のＨＣＭＶに感染した細胞、例えばタウ
ン（Ｔｏｗｎｅ）及びディヴィス（Ｄａｖｉｓ）のＡｄ
−１６９の名称で知られている株に感染した細胞内で前
記ポリペプチドを検出できるという特徴をもつ抗体であ
る。好ましいモノクローナル抗体の一例として、１９８
４年３月２７日にＮoＩ−２８９で国立微生物培養コレ
クション（la Collection Nationale des Cultures de
Micro-Organismes（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．））に寄託された
ハイブリドーマにより産生されるものが挙げられる。
【００２１】前記モノクローナル抗体は、Ａｄ−１６９
ＨＣＭＶ株の如きＨＣＭＶに対し予め免疫しておいた
動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞との間で予め形成した、Ｈ
ＣＭＶウイルスを中和するモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマを用いる方法によって得られる。この
方法はより特定的には下記のステップからなることを特
徴とする。
【００２２】−前記中和作用をもつ抗体を、予めＨＣ
ＭＶに感染させ且つアセトンで固定し好ましくは空気で
乾燥させたヒト培養細胞と反応させる。
【００２３】−クローンのうち、アセトンで固定した
後の前記ヒト細胞において蛍光抗体法により検出し得る
固定反応を生起するものを第１に選択する。
【００２４】−必要であれば、前記第１選択の結果得
られるモノクローナル抗体のうち、明らかに前記感染細
胞の核内で誘発されその後細胞質中に拡散し、且つこの
細胞質から任意に分離し得るウイルスタンパク質と選択
的に反応するものを第２に選択する。前記タンパク質は
分子量が約６８，０００であり、プロテインキナーゼの
性質も有するようなタンパク質である。
【００２５】−得られた反応生成物から選択抗体を回
収する。
【００２６】モノクローナル抗体の回収はそれ自体公知
の任意の方法、例えば形成された反応生成物とプロテイ
ンＡ特に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus ）の
プロテインＡとの複合体を予め形成しておき、この複合
体を適切なイオン緩衝液中で解離するという方法により
実施しえる。
【００２７】プロテインキナーゼ活性をもつ分子量６
８，０００のポリペプチドの少なくとも一部分を分離す
るには、感染細胞から得られる細胞質抽出物中にやはり
含まれる異なる分子量のタンパク質又はポリペプチドを
予め分離してもよい。
【００２８】より特定的に、前述ハイブリドーマにより
産生されるモノクローナル抗体によって識別される前記
ポリペプチドの産生に使用し得るヒト細胞としては、Ｈ
ＣＭＶの複製に耐え得る任意のタイプの細胞を使用して
よい。このような使用に有利な細胞はＭＲＣ−５型ヒト
肺繊維芽細胞である。
【００２９】本発明は、分子量が約６８，０００に達し
得、プロテインキナーゼ活性をもち、連続配列エピトー
プを担持し、感染細胞内でＨＣＭＶにより誘発され得る
ポリペプチドにも係る。この種のポリペプチドはＨＣＭ
Ｖ特にＡｄ−１６９菌株の培養物に予め感染させたヒト
肺繊維芽細胞の如きヒト細胞の培養株から得ることがで
きる。このポリペプチドは感染細胞の細胞質から分離し
得る。但し本発明は前記モノクローナル抗体によって識
別される連続配列エピトープをやはり含む分子量のより
小さい全てのポリペプチドにも係る。当業者には明らか
なように、本発明のモノクローナル抗体を使用すれば、
特定部位でペプチドを切断し得る酵素により未処理の最
初のペプチドを切断するというそれ自体公知の方法を用
いることにより、分子量約６８，０００の前記ポリペプ
チドから同一の抗原決定基を含むより小さいペプチド配
列を分離することが可能になる。この種のタンパクとし
ては例えば黄色ブドウ球菌酵素Ｖ８，アルファキモトリ
プシン，ベーリンガー（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ）社より
市販の「マウス顎下腺プロテアーゼ(mouse submaxillar
y gland protease) 」，ジペプチド Ｇｌｙ−Ｐｒｏ及
びＧｌｙ−Ａｌａを特異的に識別するビブリオアルギノ
ルテクスケモーバーイオファクス（Vibrioalginoluticu
s chemovar iophacus ）コラゲナーゼが挙げられる。
【００３０】従って、前述の如き酵素により調節的に切
断したペプチドから、モノクローナル抗体と反応する抗
原部位を含み且つ必要であれば前述のプロテインキナー
ゼ活性をも保持するものを検出することが可能になる。
【００３１】本発明の好ましいポリペプチトは更に下記
の特性を有する。
【００３２】−カゼインキナーゼIIタイプのプロテイ
ンキナーゼ活性を示す。特に、リンをＡＴＰからカゼイ
ン及びその他の基質、例えばホスビチン，グリコーゲン
シンテターゼ，ヒストン，アルファホスホリラーゼ等に
転移するのに適している。
【００３３】−プロテインキナーゼ活性がクエルシチ
ン（ｑｕｅｒｃｉｔｉｎｅ）によって阻害される。
【００３４】−ｉｎ ｖｉｔｒｏで自己リン酸化し得
る。
【００３５】−感熱性を有する（−７０℃及び１００
℃で失活）。
【００３６】より特定的には本発明は前述のモノクロー
ナル抗体を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法に係る。こ
の方法では前記モノクローナル抗体を検出すべき感染性
をもつ又はもたない細胞と接触させ、好ましくは処理さ
れたこれら細胞を破壊することのない蛍光抗体法によっ
て前記ポリペプチドを検出する。テストの実施に使用し
得る好ましい条件については後で説明する。
【００３７】これら特定のモノクローナル抗体は感染後
直ぐに利用できるため診断テストに使用すると極めて有
利である。実際、誘発されるタンパク質は感染後３〜５
時間で出現し、感染サイクルの間中存続することが観察
された。これらモノクローナル抗体は特にこの性質によ
って他のモノクローナル抗体と一線を画する。実際には
感染開始時点は通常わからないため、サイトメガロウイ
ルスに感染したと思われる患者の組織又は他の細胞採取
物のバイオプシーによって得た細胞に関して診断テスト
を行なう場合には特に前記モノクローナル抗体を使用す
ると有利である。
【００３８】本発明の範囲内で使用されるモノクローナ
ル抗体は、ＨＣＭＶの連続配列抗原決定基を含み及び／
又は同様にプロテインキナーゼ活性を有するポリペプチ
ド，タンパク質もしくは糖タンパク質又はこれらの断片
をＨＣＭＶに予め感染させたヒト細胞培養株の抽出物又
は溶解物から精製する方法と見なされ得るものの基礎を
もなし得る。この方法の好ましい実施例では前述タイプ
のモノクローナル抗体を固体サポート、例えばスウェー
デンのファルマシア・エー・ジー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＡＧ）社によりセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）
の商品名で市販されている立方細網状アガロース格子上
に臭化シアンの如き物質で固定させたものを使用し得
る。
【００３９】本発明のポリペプチドの抗原決定基の連続
配列性は、強力洗浄剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ），デオキシコール酸ナトリウム，又はトリト
ン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００の商品名で市販されてい
る洗剤の存在下でベータメルカプトエタノールと共に又
は無しで分離操作を実施しても、この抗原決定基を有す
るポリペプチドが感染細胞の細胞質抽出物から必ず分離
し得るという事実から推論される。実際、前掲の洗浄剤
はタンパク質をいわば解きほぐす（“ｄｅｆａｉｒｅ”
又は“ｄｅｐｌｉｅｒ”）能力があることで知られてい
る。従って全ての「コンフォーメーション」抗原決定基
はモノクローナル抗体により認識されなくなると考えら
れる。この推論は特に、「コンフォーメーション部位」
が天然タンパク質の初期コンフォーメーションに起因し
てこの天然タンパク質中で互に非直接的に結合する配列
の接近によってしか相互に接近し合わないようなアミノ
酸配列を利用すると仮定した場合に引き出される。この
考え方に立てば、前記抗原部位を担持するこのタンパク
質又はポリペプチドは恐らく免疫原でもあり、従ってウ
イルス自体を中和する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発
し得ることになる。
【００４０】本発明の抗体が必要に応じ酵素による分解
に対して保護した細胞抽出物中で分子量約６８，０００
のタンパク質のみを特異的に検出し、これとは明らかに
異なる分子量をもつ他の全てのポリペプチド又はタンパ
ク質は検出しないとすれば、このポリペプチド又はタン
パク質自体を細胞融合によって得たハイブリドーマによ
り産生し得るモノクローナル抗体の選択と分離とに使用
できることになる。尚前記細胞融合は別のタイプの骨髄
腫とこれら骨髄腫細胞に融合すべき脾臓細胞を免疫する
ための別のＨＣＭＶとを使用して行なわれる。
【００４１】
【実施例】本発明の他の特徴は、ハイブリドーマの形成
と、これらハイブリドーマのうち本発明に適合する抗体
を産生し得るものを分離する操作とに関する以下の実施
例から明らかにされよう。
【００４２】これら実施例で使用される技術は下記の操
作法に従って実施した。
【００４３】１） ハイブリドーマの形成 解凍したヒト感染細胞ＭＲＣ−５の懸濁液を腹腔内注射
してマウスに免疫を与える。これら細胞はＡｄ−１６９
ＨＣＭＶ株に感染させた後５日間冷凍しておいてもので
ある。３〜４週間後これらマウスに２次注射(une infec
tion de rappel) を行なう。マウスを殺し、脾臓を取出
す。これは２次注射の３日後に細胞融合を行なうためで
ある。脾臓細胞を骨髄腫細胞ＳＰ2 ／ＯＡｇ１４（シュ
ルマン（ＳＣＨＵＬＭＡＮＮ）他の株，「ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）」，１９７８年，２７６ ，２６９／
２７０）と融合させ、形成されたハイブリドーマを、ポ
リオウイルスに対するモノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマの形成についてアール・クレイニック
（Ｒ．ＣＲＡＩＮＩＣ）他により「デペロップ．バイオ
ロ．スタンダード（Develap. Biol. Standard ）」，１
９８２年，５０，２２９−２３４に記載されている方法
に従い、ヒポキサンチン（５ｍＭ）とアザセリン（１ｍ
Ｍ）とを含むＲＰＭＩ培地中で選別にかける。
【００４４】２） 陽性のハイブリドーマの選択 このようにして得たハイブリドーマの培養の上清部を遅
延抗原製剤（preparation dantigene tardif）を用いて
間接蛍光抗体法により選択処理し、ＨＣＭＶに対する特
異抗体を分泌し得るものを得た。一連の陽性のハイブリ
ドーマを限定希釈法によってクローン化し、次いで前出
のシー・アマデイ等の論文に記載の方法に従いこれらク
ローンの上清部を間接蛍光抗体法により同様にテストす
る。このようにしてシー・アマデイ等のモノクローナル
抗体Ｆ６ｂと類似の特性をもつモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを選択する。Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に
Ｎo Ｉ−２８９の番号で寄託されたのはこれらの株の１
つである。
【００４５】３） モノクローナル抗体の標識 シー・アマデイ等による方法に従い前記クローン（２×
１０6 細胞）を35Ｓ−メチオニン又は 3Ｈ−メチオニン
で標識する。
【００４６】４） プロテインＡへの固定の検出 これもアマデイ他の論文に記載の方法で行なう。
【００４７】前述の３）及び４）のテストはより特定的
には、ＨＣＭＶに予め感染させたヒト培養細胞を用いる
免疫蛍光法により検出し得る反応を生起する、更にプロ
テインＡにより沈殿し得るというモノクローナル抗体の
能力を識別するためのものである。
【００４８】これらのモノクローナル抗体から分子量約
６８，０００のポリペプチドとしか反応し得ないものを
検出する場合には、予め感染させておいたヒト細胞に放
射性又はこれと類似の標識を前もって与えておき、後で
これら細胞の細胞抽出物を回収するようにするのが好ま
しい。次いでこれらの細胞抽出物を選択すべき未標識モ
ノクローナル抗体と反応させる。
【００４９】５） 抗原の抽出 感染又は未感染細胞をカルシウムイオン及びマグネシウ
ムイオンを含むリン酸緩衝生理食塩水（完全ＰＢＳ）に
よりその場で２回洗浄し、フッ化フェニルメチルスルホ
ニル１０-4Ｍ（ＰＭＳＦ）とジイソプロピルフルオロホ
スフェート１０-4（ＤＦＰ）とを含む完全ＰＢＳ中で掻
き取り（ｒａｃｌａｇｅ）により回収する。次いでこれ
ら細胞を１９７９年のビールス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）３２，２５９−２６７に記載のマイケルソン（Ｍ
ＩＣＨＥＬＳＯＮ）他の方法に従い、塩含有率とｐＨと
が高く、ＮＰ−４０の名称で市販されている洗浄剤を
０．５％含む溶液中で抽出処理にかける。場合によって
は細胞を低張緩衝液中で膨張させ、ＮＰ−４０を加え
（最終濃度０．５％）且つ該細胞懸濁液をプランジャピ
ストンの作用下において細胞を粉砕した後細胞質から核
を分離した（マイケルソン等の方法による）。前記懸濁
液を４℃で５分間８００ｇの遠心分離にかけると形成さ
れた沈殿物中に核が捕捉される。細胞質画分を構成する
上清を回収し、前記核を前述と同様の抽出処理にかけ
た。
【００５０】全ての抽出物を４℃で１５−３０分間、１
５，０００ｇの遠心分離にかけ、使用時まで−７０℃で
凍結した。ホスホトランスフェラーゼ活性測定テストの
場合には後述の条件で所望の抗原の即時免疫沈降（immu
noprecipitation immediate）を行なう。この抗原は黄
色ブドウ球菌に結合した状態で保存し得る。
【００５１】６） 免疫沈降 この沈降は５μｌの腹水液を用いて２００μｇの抽出タ
ンパク質により実施する。抗原及びモノクローナル抗体
（Ｆ６ｂ）を室温で１時間半撹拌しながらインキュベー
トする。熱で不活化し且つホルムアルデヒドで固定した
カウアン（Ｃｏｗａｎ）の血清型Ｉの黄色ブドウ球菌株
を１０％含む懸濁液の形状でプロテインＡを添加する
（腹水液５μｌ当り５０μｌ）。抗原−抗体複合体をＮ
ＥＴＳ媒質（エス・ダブル・ケスラー（KESSLER S. W.
），免疫学誌（J. Immunol. ）１９７５年，１１５，
１６１７−１６２４）中で３回洗浄し、４℃で１０％懸
濁液の形状でこの緩衝液中に保存する。この複合体は１
００℃で５分間加熱することにより電気泳動緩衝液中で
解離させてもよい。免疫沈降物をドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミド電気泳動ゲル（１０％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）を用いて分析した。タンパク質の分解を３０−
３５ｍＡの電流下における示差移動（migrationdiffire
ntielle）によって実施した。必要に応じ欧州生化学誌
（Eur. J. Biochem.），１９７４年４６，８３−８８に
記載のボナー（ＢＯＮＮＡＲ）他の方法によって、但し
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をベースとする単一
浴を３７℃で１５分間使用し且つＤＭＳＯ＋２０％の
２，５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ）からなる単
一浴を３７℃で３０分間使用して、フルオログラフィー
を行なった。
【００５２】７） 細胞の放射性標識 幾つかの感染細胞を感染の１時間後に選択し且つ１５分
間メチオニン除去処理にかける。次いで１０μＣｉ／ｍ
ｌの35Ｓ−メチオニンを含む媒質中でウイルス吸収操作
を行なう。残りの感染細胞試料に関してはウイルスを１
時間吸収させ且つ増殖培地を加えた。全ての細胞を１５
分間メチオニン除去処理にかけ、その後２時間標識処理
し、その後で感染後夫々３，９，２４，４８，７２及び
９６時間の時点で採取した。未感染細胞も同様の方法で
標識した。標識媒質としては１０μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−
メチオニンを含みメチオニンを除去したイーグル（Ｅａ
ｇｌｅ）最小必須培地を使用した（アメルシャム（ＡＭ
ＥＲＳＨＡＭ），１３００Ｃｉ／ｍＭの比放射能）。リ
ンタンパク質の標識処理はリン酸塩を含まず１００μＣ
ｉ／ｍｌの32Ｐ−オルトリン酸塩を含む改変ダルベッコ
（ＤＵＬＢＥＣＣＯ）培地中で３時間実施した。
【００５３】８） プロテインキナーゼ活性の検出 特に断りがない限りプロテインキナーゼ活性のテスト
は、ｐＨ６．８のリン酸マグネシウム２２ｍＭ緩衝液Ｋ
Ｐｉと、硫酸マグネシウムＭｇＳＯ4 ５ｍＭと、ＥＤＴ
Ａ０．１５ｍＭと、ＡＴＰ０．１ｍＭと、３μＣｉの32
Ｐ−ＡＴＰと、１ｍｇ／ｍｌのカゼインとを含む媒質
（最終容量１００μｌ）中でバクテリアに結合した酵素
５０μｌを用いて行なう。カゼインはＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルにおける免疫沈降物の分析テストでは使用しない。
次いで免疫沈降物を前述の方法で洗浄し、反応混合物中
に再懸濁させ、３０℃で３０分間インキュベートする。
１０μｌのＥＤＴＡ０．３Ｍ溶液を用いて反応を停止さ
せる。遠心分離を５０００ｇ、４℃で４分間行なって免
疫沈降物を分離する。上清部をトリクロル酢酸（ＴＣ
Ａ）５％溶液によって沈殿させる。沈殿物をソーダ１Ｍ
溶液中に溶解し、ＴＣＡによって再沈降させ、ワットマ
ン（ＷＨＡＴＭＡＮ）Ｇ．Ｆ．／Ｃ．の名称で市販され
ているフィルタで濾過することにより洗浄する。エタノ
ールで更に洗浄した後前記フィルタを乾燥させ、パッカ
ード（ＰＡＣＫＡＲＤ）液体シンチレータ中でインパル
スの計数を行なう。ゲルで分析すべき免疫沈降物をＫＰ
ｉ緩衝液中で３度洗浄し、電気泳動緩衝液中に懸濁さ
せ、前述の条件下で１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルを用い
て分析する。
【００５４】９） 沈降係数の計算 35 Ｓ−メチオニンで標識された抗原を形成し、前述の如
き感染細胞からの抽出処理に１２０時間かけた。この抗
原をＰＢＳ中に形成した５−２５％スクロース勾配の上
層部に置き、４℃、３５，０００回転／分で１７．２５
時間、ベックマン（ＢＥＣＫＭＡＮ）ＳＷ−４１ロータ
で遠心分離処理する。画分を回収し、各画分をモノクロ
ーナル抗体Ｆ６ｂで免疫沈降させ、次いでＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分析した。
【００５５】１０） 32Ｐで標識したアミノ酸の電気泳
動 カゼンインを存在させずに得た免疫沈降物を用いるプロ
テインキナーゼ反応の後、32Ｐで標識された生成物を
０．１％のＳＤＳを含むＮＨ4 ＨＣＯ3 ０．１％溶液で
分離する。この試料を真空下で乾燥し、ＨＣｌ６Ｍ中に
懸濁させた後１１０℃で一晩加水分解する。ＨＣｌ蒸発
後試料を電気泳動緩衝液中に懸濁させる。セルロースで
被覆された薄いプレート（マシェレイ−ナゲル・アンド
・カンパニー（MACHEREY-NAGEL & Co.）社より市販）を
使用しホスホアミノ酸を１０００Ｖで４５分間ｐＨ３．
５で分離処理する（５０ｍｌ／ｌの酢酸と５ｍｌ／ｌの
ピリジンとで調製した媒質を使用）。標準試料（ｅｔａ
ｌｏｎ）をカドミウム−ニンヒドリン試薬で着色し（生
物学化学誌（J. Biol. Chem.）１９８２年，２５７，１
５１５６−１５１６１にドリッケーマー（ＤＲＩＣＫＡ
ＭＥＲ）他により記述）、前記プレートをコダック（Ｋ
ｏｄａｋ）Ｘ−Ｏｍａｔフイルムに一週間さらした。
【００５６】モノクローナル抗体Ｆ６ｂにより免疫沈降
したポリペプチドは約６８，０００の分子量を有する
（ｐ６８）。このポリペプチドは感染後３時間で感染細
胞の核から免疫沈降し得る。これはまた感染後２４時間
で細胞質抽出物から免疫沈降させることもできる。抽出
タンパク質全体に対するこのポリペプチドの含量は感染
後９６時間で０．５％に達し得る（回収した免疫沈降物
に含まれる放射能のパーセンテージに基づいて算出）。
このポリペプチドは２０°の水中で６．９の沈降係数を
示す（カタラーゼからなる標識及び子牛血清アルブミン
からなる標識と比較）。
【００５７】周知の分子量をもつ下記の４種の物質の同
一電気泳動システム内での移動距離に対するｐ６８の分
子量を評価した。
【００５８】−ホスファリラーゼ（９４，０００）− 子牛血清アルブミン（６８，０００）− フマラーゼ（４９，０００）− アルドラーゼ（４０，０００） このポリペプチドは前述のｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化能
力を示す。アクセプタとして使用されるカゼインとのプ
ロテインキナーゼ反応はｐＨ６−６．５で最適に生起す
る。この反応はより酸性又はよりアルカリ性のｐＨをも
つ媒質中では早急に衰える。この反応はＭｇ2+イオンの
存在に依存する。これらの反応はｃＡＭＰ依存反応では
ない。リン酸塩転移反応は高いｐＨでのマンガンの存在
下では生起しない。このポリペプチド（又はこの酵素）
は安定であり、黄色ブドウ球菌と結合した状態で保存し
得、４℃で６週間保存した後でも失活しない。モノクロ
ーナル抗体Ｆ６ｂと複合体化しても活性は失われない。
【００５９】この酵素は自己リン酸化し得、これはスレ
オニンとセリンとからなるアミノアシル残基部分で生起
する。
【００６０】約６８，０００の分子量をもち且つ前述の
特性を有するポリペプチドは他のサイトメガロウイルス
株、特にタウン及びディヴィスのヒト菌株により感染し
たヒト細胞特に肺繊維芽細胞内で誘発される。これに対
し、サルに特異的なサイトメガロウイルス株（コルバー
ン（ＣＯＬＢＵＲＮ）株及びＳＧＣ株）は株Ｆ６Ｂによ
り分泌されるモノクローナル抗体によって識別し得る分
子量６８，０００のタンパク質の産生を誘発しない。
【００６１】従って本発明はより特定的にはモノクロー
ナル抗体Ｆ６ｂの特性を有するモノクローナル抗体を産
生する株の選択に係る。
【００６２】実際、このモノクローナル抗体を使用する
とＨＣＭＶウイルス感染をｉｎ ｖｉｔｒｏで確実に診
断できる。前述の如くこの検出は特に蛍光抗体反応によ
り感染サイクルの実質的に如何なる時点でも行ない得
る。このモノクローナル抗体は更に、蛍光抗体法によっ
て実現される診断をヒトサイトメガロウイルスにより誘
発されるタンパク質と共に複合体を形成するという同一
抗体の能力によつ確認し得るという大きな利点をも有す
る。前記タンパク質の存在はプロテインキナーゼ活性に
よって発見できる。これらの活性はかなり正確に検出し
える。また、前述タイプのモノクローナル抗体の使用は
感染したヒト細胞の感染度の定量テストでも利用し得
る。
【００６３】本発明は例えばサイトメガロウイルスにお
ける分類がアプリオリに定かでないウイルスを識別する
テストなどで重要な生物学的試薬として用いられるポリ
ペプチド自体にも係る。逆に、このポリペプチドは診断
「キット」を構成する最も有効なモノクローナル抗体を
選択するのに使用し得る。
【００６４】本発明はまた前述の如きｉｎ ｖｉｔｒｏ
診断を行なうための「キット」にも係る。このキットは
主として− 少なくとも１つのマイクロプレートと、− その診断に適したモノクローナル抗体を含む製剤
と、− 対照細胞抽出物（ヒト細胞特にＭＲＣ−５型細胞か
ら得たもの。これら細胞は予めＨＣＭＶに感染又は未感
染）と、− ヒト血液の免疫グロブリンに対する標識した（放射
性、酵素、蛍光性その他の標識で）抗体と、− 種々の操作と、反応した生成物の蛍光顕微鏡による
最終検査とに適した緩衝液とで構成される。
【００６５】このようなキットは例えば下記の手順で使
用する。
【００６６】−細胞バイオプシーによって得た検査す
べき細胞抽出物を滴定プレートの１つ又は複数の杯状部
に配置し、表面に吸着させる。
【００６７】−マイクロプレートの杯状部即ち凹部に
モノクローナル抗体製剤を適量導入する。
【００６８】−前記プレートを適温でインキュベート
する。
【００６９】−次いでこのマイクロプレートを十分に
洗浄する。
【００７０】−血液免疫グロブリンに対抗し、従って
モノクローナル抗体に対抗する標識した抗体をマイクロ
プレートの凹部に導入し、このプレートを再度インキュ
ベートする。
【００７１】−標識を検出する（例えば標識が酵素の
場合は適切な基質への作用などによって）。
【００７２】これら一連の操作は比較のために対照細胞
抽出物に関しても行なう。
【００７３】有利には、例えば前述の如き条件下で得ら
れた細胞抽出物を例えば前述の如きアガロースゲルに固
定されたモノクローナル抗体を含むアフィニティ・クロ
マトグラフィ・カラムに通し、使用するモノクローナル
抗体とこれら抗体により特異的に認識されるポリペプチ
ドとの複合体を形成した場合にはこの複合体を解離し、
且つ前記ポリペプチドの定量をそのプロテインキナーゼ
活性を利用して行なうことにより検出テスト及び定量テ
ストを実施してもよい。
【００７４】以上の説明からも明らかなように、本発明
は前述の特定実施例及び使用例には限定されず、あらゆ
る変形例を包含する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 594198569 アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・ サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メ デイカル フランス国、75013・パリ、リユ・ドウ・ トルビアツク、101 (72)発明者 フロリアン・オロー フランス国、92190・ムードン、リユ・ア ルベール−ドウ−マン、２ (72)発明者 スーザン・ミシエルソン フランス国、78590・ノワジー・ル・ロワ、 リユ・アンドレ・ルブールブラン、１、 ラ・ガイヤルドリ・ニユメロ・キヤトル (72)発明者 オクタヴイアン・バルズ フランス国、91300・マツシー、リユ・ド ウ・ラ・ソーセイ、30 (72)発明者 アンドレ・ブー フランス国、78210・サン−シール・レコ ル、リユ・ドユ・ドクトウール・ヴアイヤ ン、７ (72)発明者 クレール・アマデ フランス国、92400・クルブヴオワ、リ ユ・ピエール−キユリー、15

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトサイトメガロウイルスによりヒト由
    来の細胞内に誘発されるポリペプチド又はそのフラグメ
    ントであって、該ポリペプチドが− 約６８，０００の分子量を有し、− カゼインキナーゼIIタイプのプロテインキナーゼ活
    性を有し、− リンをＡＴＰからカゼイン，ホスビチン，グリコー
    ゲン−シンテターゼ，ヒストン及びアルファ−ホスホリ
    ラーゼに転移でき、− 該プロテインキナーゼ活性がクエルシチンによって
    阻害され、− ｉｎ ｖｉｔｒｏで自己リン酸化し得、− 感熱性を有する（−７０℃及び１００℃で活性消
    失） ことを特徴とし、該フラグメントが該ポリペプチドの配
    列エピトープを含み、該エピトープは− 予めＨＣＭＶに感染させ且つアセトンで固定したヒ
    ト由来培養細胞において蛍光抗体法により検出し得る反
    応を生起し、− 予めＨＣＭＶに感染させたヒト細胞内でＨＣＭＶに
    より誘発され、プロテインキナーゼII活性を有し、細胞
    内に早期に出現し（細胞へのウイルス吸着後３〜５時間
    で検出可能）、ＨＣＭＶに感染した細胞内に蓄積され、
    出現後少なくとも４日間はこの細胞内に存在し、約６
    ８，０００の分子量をもち、連続配列エピトープを担持
    し、前記感染細胞の核内に現われ次いで少なくとも一部
    分が細胞質中に拡散し、この細胞質から分離され得る単
    一のウイルスポリペプチドと本質的に反応し、且つ− プロテインＡと反応するか又はしない という諸性質によって規定されるモノクローナル抗体と
    反応することを特徴とする、上記のポリペプチド又はそ
    のフラグメント。
  2. 【請求項２】 Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．にＮo Ｉ−２８９で寄
    託されたモノクローナル抗体により複合体化されること
    を特徴とする請求項１に記載のポリペプチド又はそのフ
    ラグメント。
  3. 【請求項３】 プロテインキナーゼ活性がＭｇ2+イオン
    の存在には依存するが、マンガンイオンの存在にもｃＡ
    ＭＰの存在にも依存しない請求項１に記載のポリペプチ
    ド。
  4. 【請求項４】 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aure
    us）のプロテインＡに結合されることを特徴とする請求
    項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド又はそのフラ
    グメント。
  5. 【請求項５】 該モノクローナル抗体との複合体の形態
    を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記
    載のポリペプチド又はそのフラグメント。
  6. 【請求項６】 サイトメガロウイルスに感染した疑いの
    ある患者から採取した細胞試料に由来し、特にｉｎ ｖ
    ｉｔｒｏ診断用であるヒト細胞中でヒトサイトメガロウ
    イルスにより生起した感染の存在を検出するための、未
    処理状態の該細胞又は該細胞から得た細胞抽出物とモノ
    クローナル抗体とを接触させることからなる方法に使用
    するためのモノクローナル抗体を選択する方法であっ
    て、請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド又は
    そのフラグメントと選択した抗体とを接触させ、形成し
    た複合体中に選択した抗体を保持することを含む方法。
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