JP2561396B2 - Ｄｎａの塩基配列検出方法 - Google Patents
Ｄｎａの塩基配列検出方法Info
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- JP2561396B2 JP2561396B2 JP3098920A JP9892091A JP2561396B2 JP 2561396 B2 JP2561396 B2 JP 2561396B2 JP 3098920 A JP3098920 A JP 3098920A JP 9892091 A JP9892091 A JP 9892091A JP 2561396 B2 JP2561396 B2 JP 2561396B2
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- G01Q—SCANNING-PROBE TECHNIQUES OR APPARATUS; APPLICATIONS OF SCANNING-PROBE TECHNIQUES, e.g. SCANNING PROBE MICROSCOPY [SPM]
- G01Q60/00—Particular types of SPM [Scanning Probe Microscopy] or microscopes; Essential components thereof
- G01Q60/24—AFM [Atomic Force Microscopy] or apparatus therefor, e.g. AFM probes
- G01Q60/38—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders
- G01Q60/42—Functionalisation
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子生物分野、医療分
野、法医学分野、農林水産業、製薬業などに於いて有用
な、ＤＮＡの塩基配列の検出方法に関する。
野、法医学分野、農林水産業、製薬業などに於いて有用
な、ＤＮＡの塩基配列の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年バイオテクノロジーとして、生物の
遺伝子を操作して、より優れた有用な特性を有する生物
体を産出させたり、有用な物質をより効率良く産出させ
る生物体にするなどの研究が盛んに行われている。
遺伝子を操作して、より優れた有用な特性を有する生物
体を産出させたり、有用な物質をより効率良く産出させ
る生物体にするなどの研究が盛んに行われている。
【０００３】これらのバイオテクノロジー分野において
は、遺伝子の特性を左右するＤＮＡ（デオキシリボ核
酸）の塩基配列を知ることが重要であり、従来、いくつ
かのＤＮＡの塩基配列の検出方法が提案されている。
は、遺伝子の特性を左右するＤＮＡ（デオキシリボ核
酸）の塩基配列を知ることが重要であり、従来、いくつ
かのＤＮＡの塩基配列の検出方法が提案されている。
【０００４】図２から図４にそって、近年よく使われて
いるＤＮＡの塩基配列検出方法を説明する。図２は一本
鎖ＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡを構成する
４種類のヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡを合成す
る様子を示した概念図である。
いるＤＮＡの塩基配列検出方法を説明する。図２は一本
鎖ＤＮＡから、ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡを構成する
４種類のヌクレオチドを用いて、二本鎖ＤＮＡを合成す
る様子を示した概念図である。
【０００５】図２の（ａ）に示した如く、調べたいＤＮ
Ａ分子をアルカリ処理して一本鎖ＤＮＡ９にする。次
に、図２の（ｂ）に示した如く、この一本鎖ＤＮＡ９
に、放射性32Ｐを含むプライマー１０を付ける。この溶
液にＤＮＡの構成分子である４種類のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸１１（この分子の一般名称をヌクレオ
チドといい、塩基としてアデニンを含むもの（Ａ）、チ
ミンを含むもの（Ｔ）、シトシンを含むもの（Ｃ）、グ
アニンを含むもの（Ｇ）がある）とＤＮＡポリメラーゼ
を存在させておくと、図２の（ｃ）に示した如く、一本
鎖ＤＮＡ９上に相補的な塩基対（チミンにはアデニン
が、グアニンにはシトシンがそれぞれ特異的に水素結合
する）ができ、二本鎖のＤＮＡ１２ができあがる。
Ａ分子をアルカリ処理して一本鎖ＤＮＡ９にする。次
に、図２の（ｂ）に示した如く、この一本鎖ＤＮＡ９
に、放射性32Ｐを含むプライマー１０を付ける。この溶
液にＤＮＡの構成分子である４種類のデオキシリボヌク
レオシド三リン酸１１（この分子の一般名称をヌクレオ
チドといい、塩基としてアデニンを含むもの（Ａ）、チ
ミンを含むもの（Ｔ）、シトシンを含むもの（Ｃ）、グ
アニンを含むもの（Ｇ）がある）とＤＮＡポリメラーゼ
を存在させておくと、図２の（ｃ）に示した如く、一本
鎖ＤＮＡ９上に相補的な塩基対（チミンにはアデニン
が、グアニンにはシトシンがそれぞれ特異的に水素結合
する）ができ、二本鎖のＤＮＡ１２ができあがる。
【０００６】ところで、ヌクレオチドの構成分子である
デオキシリボースの３′位の水酸基を水素で置換したジ
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が少量存在する場合
を考えてみる。このような修飾ヌクレオチドがＤＮＡに
取り込まれると次のヌクレオチドの付加ができなくな
り、反応はここで止まる。
デオキシリボースの３′位の水酸基を水素で置換したジ
デオキシリボヌクレオシド三リン酸が少量存在する場合
を考えてみる。このような修飾ヌクレオチドがＤＮＡに
取り込まれると次のヌクレオチドの付加ができなくな
り、反応はここで止まる。
【０００７】従って、図３に示すように塩基としてアデ
ニンを持つ修飾ヌクレオチド１３を少量混ぜて一定時間
反応させると、このアデニンを持つ修飾ヌクレオチド１
３は、ランダム重合体を合成する場合のモノマーの如く
連鎖中にランダムに取り込まれるため、末端の塩基がア
デニンの長さの異なる種々の二本鎖ＤＮＡができる。図
３はこの様子をモデル的に示した末端がアデニンの種々
の長さのＤＮＡの作成方法を示したモデル図である。
ニンを持つ修飾ヌクレオチド１３を少量混ぜて一定時間
反応させると、このアデニンを持つ修飾ヌクレオチド１
３は、ランダム重合体を合成する場合のモノマーの如く
連鎖中にランダムに取り込まれるため、末端の塩基がア
デニンの長さの異なる種々の二本鎖ＤＮＡができる。図
３はこの様子をモデル的に示した末端がアデニンの種々
の長さのＤＮＡの作成方法を示したモデル図である。
【０００８】尚、図３中１４、１５、１６、１７はそれ
ぞれ一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌク
レオチドを示し、図２と同一のものについては符号を図
２と同一にしたので説明を省略する。
ぞれ一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌク
レオチドを示し、図２と同一のものについては符号を図
２と同一にしたので説明を省略する。
【０００９】図３中（ａ）は反応前の各成分を示し、
（ｂ）は反応して得られた末端の塩基がアデニンの種々
の二本鎖ＤＮＡのうちの１つをモデル的に示しており、
（ｃ）は末端の塩基がアデニンの長さの異なる種々の二
本鎖ＤＮＡを３種類モデル的に示したものである。
（ｂ）は反応して得られた末端の塩基がアデニンの種々
の二本鎖ＤＮＡのうちの１つをモデル的に示しており、
（ｃ）は末端の塩基がアデニンの長さの異なる種々の二
本鎖ＤＮＡを３種類モデル的に示したものである。
【００１０】同じように、他の３種類の塩基についても
同じ操作を繰り返して、それぞれアデニン、シトシン、
チミン、グアニンが末端のいろいろな長さのＤＮＡがで
きあがる。図４に示すようにこのようにしてできた４種
類のＤＮＡ溶液１８、１９、２０、２１の溶液を４つの
レーンで電気泳動することによって、図４のようなパタ
ーン２２がオートラジオグラフィーで観測できるので、
元のＤＮＡの塩基配列を検出することができる。尚、図
４中矢印２３は電気泳動の電界の向きを示す。
同じ操作を繰り返して、それぞれアデニン、シトシン、
チミン、グアニンが末端のいろいろな長さのＤＮＡがで
きあがる。図４に示すようにこのようにしてできた４種
類のＤＮＡ溶液１８、１９、２０、２１の溶液を４つの
レーンで電気泳動することによって、図４のようなパタ
ーン２２がオートラジオグラフィーで観測できるので、
元のＤＮＡの塩基配列を検出することができる。尚、図
４中矢印２３は電気泳動の電界の向きを示す。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】上述した従来のＤＮＡ
の塩基配列の検出方法は広く使われており、一日で数千
の塩基配列を読み取る事ができる。しかし、以下に述べ
るような問題点を含んでいる。 （１）大量のＤＮＡが必要である。 （２）放射性の32Ｐを用いるため、特殊な施設が必要で
あり、また、被爆の危険性もある。 （３）32Ｐの半減期は１４日と短く、常時試薬を調製し
なくてはならない。 （４）操作が何段階にも分かれているので、めんどうで
根気のいる仕事である。
の塩基配列の検出方法は広く使われており、一日で数千
の塩基配列を読み取る事ができる。しかし、以下に述べ
るような問題点を含んでいる。 （１）大量のＤＮＡが必要である。 （２）放射性の32Ｐを用いるため、特殊な施設が必要で
あり、また、被爆の危険性もある。 （３）32Ｐの半減期は１４日と短く、常時試薬を調製し
なくてはならない。 （４）操作が何段階にも分かれているので、めんどうで
根気のいる仕事である。
【００１２】そこで、安全に、簡単に、迅速に、しかも
少量のＤＮＡでも塩基配列を検出できる方法を提供する
ことは産業上重要な課題である。本発明は安全に、簡単
に、迅速に、しかも少量のＤＮＡでもその塩基配列を検
出できる方法を提供することを目的とするものである。
少量のＤＮＡでも塩基配列を検出できる方法を提供する
ことは産業上重要な課題である。本発明は安全に、簡単
に、迅速に、しかも少量のＤＮＡでもその塩基配列を検
出できる方法を提供することを目的とするものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法はＤＮＡを構成する
４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用を及ぼす
４種類の分子のいずれか１種類が固定された３種類また
は４種類の探針を用意し、これらの探針を原子間力顕微
鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれぞれの探
針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近させて、
力を測定しながら原子レベルの精度で走査することから
なるＤＮＡの塩基配列検出方法であって、前記相互作用
を及ぼす分子が、炭化水素鎖を有する単分子膜を介して
探針に固定されていることを特徴をする。
本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法はＤＮＡを構成する
４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用を及ぼす
４種類の分子のいずれか１種類が固定された３種類また
は４種類の探針を用意し、これらの探針を原子間力顕微
鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれぞれの探
針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近させて、
力を測定しながら原子レベルの精度で走査することから
なるＤＮＡの塩基配列検出方法であって、前記相互作用
を及ぼす分子が、炭化水素鎖を有する単分子膜を介して
探針に固定されていることを特徴をする。
【００１４】また、前記構成において、特異的に相互作
用を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含
む分子である事が好ましい。また、前記構成において、
特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡ（リ
ボ核酸）を構成する塩基を含む分子である事が好まし
い。
用を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含
む分子である事が好ましい。また、前記構成において、
特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡ（リ
ボ核酸）を構成する塩基を含む分子である事が好まし
い。
【００１５】本発明方法によれば、ＤＮＡを構成する４
種類の塩基を、化学的な相互作用によってそれぞれ直接
識別する事ができ、それにより、従来の問題を解決しよ
うとするものである。以下に詳細を示す。
種類の塩基を、化学的な相互作用によってそれぞれ直接
識別する事ができ、それにより、従来の問題を解決しよ
うとするものである。以下に詳細を示す。
【００１６】図１は本発明の検出方法の原理を示す模式
図である。図１に示すように、ＤＮＡを構成する４種類
の塩基のうち、塩基アデニン８を含む分子２を原子間力
顕微鏡（ＡＦＭ）の探針１に固定して、この探針１を基
板４の上に固定された一本鎖ＤＮＡ３上に接近させ、そ
の時の相互作用の結果生じる力を測定しながら原子レベ
ルの精度で走査する。尚、本発明は原子間力顕微鏡の探
針が、ＤＮＡを構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特
異的に相互作用を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類
が炭化水素鎖を有する単分子膜を介して固定された３種
類または４種類の探針を用いる点で特異性があるが、他
の点においては通常の原子間力顕微鏡とその構造、動作
原理などは基本的に同一であり、また、原子間力顕微鏡
はすでに知られているので、その構造などの詳細な説明
は省略する。
図である。図１に示すように、ＤＮＡを構成する４種類
の塩基のうち、塩基アデニン８を含む分子２を原子間力
顕微鏡（ＡＦＭ）の探針１に固定して、この探針１を基
板４の上に固定された一本鎖ＤＮＡ３上に接近させ、そ
の時の相互作用の結果生じる力を測定しながら原子レベ
ルの精度で走査する。尚、本発明は原子間力顕微鏡の探
針が、ＤＮＡを構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特
異的に相互作用を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類
が炭化水素鎖を有する単分子膜を介して固定された３種
類または４種類の探針を用いる点で特異性があるが、他
の点においては通常の原子間力顕微鏡とその構造、動作
原理などは基本的に同一であり、また、原子間力顕微鏡
はすでに知られているので、その構造などの詳細な説明
は省略する。
【００１７】探針１に固定された分子２中のアデニン８
がチミン６上に来た時、他の塩基アデニン８、グアニン
７、シトシン５の場合にはみられない、水素結合による
強い力が働く。この力の働く場所を調べることによっ
て、ＤＮＡ３中のチミン６の位置が分かる。図中（ａ）
の探針１の位置はＤＮＡ３中のグアニン７上に探針１に
固定されたアデニン８が位置している場合で、この場合
は水素結合による強い力が働いていない位置を示してい
る。図中（ｂ）の探針１の位置はＤＮＡ３中のチミン６
上に探針１に固定されたアデニン８が位置している場合
で、この場合は水素結合による強い力が働く位置に探針
１があることを示している。
がチミン６上に来た時、他の塩基アデニン８、グアニン
７、シトシン５の場合にはみられない、水素結合による
強い力が働く。この力の働く場所を調べることによっ
て、ＤＮＡ３中のチミン６の位置が分かる。図中（ａ）
の探針１の位置はＤＮＡ３中のグアニン７上に探針１に
固定されたアデニン８が位置している場合で、この場合
は水素結合による強い力が働いていない位置を示してい
る。図中（ｂ）の探針１の位置はＤＮＡ３中のチミン６
上に探針１に固定されたアデニン８が位置している場合
で、この場合は水素結合による強い力が働く位置に探針
１があることを示している。
【００１８】そして、チミンを含む分子、シトシンを含
む分子、グアニンを含む分子がそれぞれ固定された３種
類の探針を用いて、これらの操作を繰り返すことによっ
て、一本鎖ＤＮＡ３中のアデニン、グアニン、シトシン
の位置がそれぞれ分かる。
む分子、グアニンを含む分子がそれぞれ固定された３種
類の探針を用いて、これらの操作を繰り返すことによっ
て、一本鎖ＤＮＡ３中のアデニン、グアニン、シトシン
の位置がそれぞれ分かる。
【００１９】以上のことから、一本鎖ＤＮＡの塩基配列
が検出できる。なお、一本鎖ＤＮＡの塩基配列が分かる
ということは、アデニンはチミンと、また、グアニンは
シトシンとしか特異的に結合しないので、元の２本鎖Ｄ
ＮＡの塩基配列が分かるということになる。
が検出できる。なお、一本鎖ＤＮＡの塩基配列が分かる
ということは、アデニンはチミンと、また、グアニンは
シトシンとしか特異的に結合しないので、元の２本鎖Ｄ
ＮＡの塩基配列が分かるということになる。
【００２０】ところで、ＤＮＡはチミン、アデニン、シ
トシン、グアニンの４種類の塩基を含むので、原理的に
は、３種類の塩基の位置が検出できればＤＮＡの塩基配
列は分かる。従って、上記では４種類の探針を用いてい
るが、チミン、アデニン、シトシン、グアニンを含む分
子のそれぞれいずれか１種類が固定された４種類の探針
のうちのいずれか３種類の探針を用いてもＤＮＡの塩基
配列は検出される。
トシン、グアニンの４種類の塩基を含むので、原理的に
は、３種類の塩基の位置が検出できればＤＮＡの塩基配
列は分かる。従って、上記では４種類の探針を用いてい
るが、チミン、アデニン、シトシン、グアニンを含む分
子のそれぞれいずれか１種類が固定された４種類の探針
のうちのいずれか３種類の探針を用いてもＤＮＡの塩基
配列は検出される。
【００２１】また、探針に固定するのはチミン、アデニ
ン、シトシン、グアニンを含む分子に限る必要はなく、
ＤＮＡを構成する塩基と特異的に相互作用を及ぼすもの
であれば何でも良い。特異的相互作用としては例えば、
水素結合やイオン間力などの原子間力などが挙げられる
がこれのみに限定されるものではない。
ン、シトシン、グアニンを含む分子に限る必要はなく、
ＤＮＡを構成する塩基と特異的に相互作用を及ぼすもの
であれば何でも良い。特異的相互作用としては例えば、
水素結合やイオン間力などの原子間力などが挙げられる
がこれのみに限定されるものではない。
【００２２】たとえば、ＲＮＡを構成する塩基を含む分
子、叉はこれらの誘導物質など様々な分子を用いること
ができる。ＲＮＡの場合、ＲＮＡを構成する４種類の塩
基はウラシル、アデニン、シトシン、グアニンであり、
ウラシルはＤＮＡを構成する塩基のうちアデニンと特異
的に結合し、他の塩基については前述のＤＮＡの場合と
同様な特異的結合をする。
子、叉はこれらの誘導物質など様々な分子を用いること
ができる。ＲＮＡの場合、ＲＮＡを構成する４種類の塩
基はウラシル、アデニン、シトシン、グアニンであり、
ウラシルはＤＮＡを構成する塩基のうちアデニンと特異
的に結合し、他の塩基については前述のＤＮＡの場合と
同様な特異的結合をする。
【００２３】本発明におけるＤＮＡを構成する塩基と特
異的な相互作用をする分子は、炭化水素鎖を有する単分
子膜を介して探針に固定されているので、探針に直接固
定された分子に比べて自由に動け、そのため、ＤＮＡと
反応する際分子間の立体障害を受け難くなる。この結
果、効率よくＤＮＡの塩基配列を決定することが可能と
なる。
異的な相互作用をする分子は、炭化水素鎖を有する単分
子膜を介して探針に固定されているので、探針に直接固
定された分子に比べて自由に動け、そのため、ＤＮＡと
反応する際分子間の立体障害を受け難くなる。この結
果、効率よくＤＮＡの塩基配列を決定することが可能と
なる。
【００２４】また、ＤＮＡを構成する塩基と特異的に相
互作用を及ぼす分子が探針に直接結合されている場合、
探針をＤＮＡに近づけ過ぎた場合、探針とＤＮＡとの間
には大きな斥力が働き、この斥力のためにＤＮＡが変形
したり基板からはがれたりすることがあるが、ＤＮＡを
構成する塩基と特異的な相互作用をする分子が炭化水素
鎖を有する単分子膜を介して探針に固定されている場
合、炭化水素鎖が探針とＤＮＡ分子との間のクッション
の役目を果たすので、ＤＮＡ分子が変形したり、基板か
らはがれたりすることがなくなる。
互作用を及ぼす分子が探針に直接結合されている場合、
探針をＤＮＡに近づけ過ぎた場合、探針とＤＮＡとの間
には大きな斥力が働き、この斥力のためにＤＮＡが変形
したり基板からはがれたりすることがあるが、ＤＮＡを
構成する塩基と特異的な相互作用をする分子が炭化水素
鎖を有する単分子膜を介して探針に固定されている場
合、炭化水素鎖が探針とＤＮＡ分子との間のクッション
の役目を果たすので、ＤＮＡ分子が変形したり、基板か
らはがれたりすることがなくなる。
【００２５】本発明においては、ＤＮＡの塩基を含む位
置を上述のように分子１つ１つの単位で検出していくの
で、原子間力顕微鏡の探針を検出対象となる一本鎖ＤＮ
Ａ試料の固定された基板上に原子レベルの精度で走査す
る。原子間力顕微鏡はこの様な操作が出来るようになっ
ているが、例えば本発明方法においては、長さ約１μ
ｍ、根元部の幅約４μｍ程度の先細りの探針などを用い
て１μｍ角の領域を０．０１〜０．１オングストローム
程度の精度で３次元のＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸方向に動かして
走査し原子間力などの相互作用を記録する。
置を上述のように分子１つ１つの単位で検出していくの
で、原子間力顕微鏡の探針を検出対象となる一本鎖ＤＮ
Ａ試料の固定された基板上に原子レベルの精度で走査す
る。原子間力顕微鏡はこの様な操作が出来るようになっ
ているが、例えば本発明方法においては、長さ約１μ
ｍ、根元部の幅約４μｍ程度の先細りの探針などを用い
て１μｍ角の領域を０．０１〜０．１オングストローム
程度の精度で３次元のＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸方向に動かして
走査し原子間力などの相互作用を記録する。
【００２６】この様な精度で走査するには、通常原子間
力顕微鏡においては、試料を載せる台がピエゾ素子など
の電圧をかけることによりその長さが伸縮する圧電素子
などで構成されており、この圧電素子を３次元方向にコ
ントロールして動かすことで走査を行っているのが通常
である。
力顕微鏡においては、試料を載せる台がピエゾ素子など
の電圧をかけることによりその長さが伸縮する圧電素子
などで構成されており、この圧電素子を３次元方向にコ
ントロールして動かすことで走査を行っているのが通常
である。
【００２７】そして原子間力の測定は、センサーで原子
間力をキャッチして、原子間力が常に一定になるように
例えば強く原子間力が作用する位置では原子間力が当初
の一定値になるように試料と探針の位置を遠ざけるな
ど、試料と探針の距離を近づけたり、離したりして原子
間力が常に一定値になるようにし、この動きを電気信号
にして記録することにより検知するシステムとなってい
る。
間力をキャッチして、原子間力が常に一定になるように
例えば強く原子間力が作用する位置では原子間力が当初
の一定値になるように試料と探針の位置を遠ざけるな
ど、試料と探針の距離を近づけたり、離したりして原子
間力が常に一定値になるようにし、この動きを電気信号
にして記録することにより検知するシステムとなってい
る。
【００２８】なお、以下に、一本鎖ＤＮＡ分子の基板上
への固定方法と、ＤＮＡを構成する４種類の塩基とそれ
ぞれ特異的に相互作用を及ぼす分子のＡＦＭの探針への
固定方法の例を説明する。 １：一本鎖ＤＮＡの基板上への固定方法 １−１：物理吸着法 一本鎖ＤＮＡ溶液（１０〜５０μｇ／ｍｌ）をよく洗浄
された平面度の高いグラファイト、ガラス基板、金でコ
ーテイングされたガラス基板もしくは雲母上に滴下する
か、もしくはこれらの基板をこのＤＮＡ溶液中に浸し
て、一本鎖ＤＮＡをこれらの基板に固定する。その後、
これらの基板を純水でよく洗浄して測定用の基板とす
る。 １−２：化学結合法 基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
への固定方法と、ＤＮＡを構成する４種類の塩基とそれ
ぞれ特異的に相互作用を及ぼす分子のＡＦＭの探針への
固定方法の例を説明する。 １：一本鎖ＤＮＡの基板上への固定方法 １−１：物理吸着法 一本鎖ＤＮＡ溶液（１０〜５０μｇ／ｍｌ）をよく洗浄
された平面度の高いグラファイト、ガラス基板、金でコ
ーテイングされたガラス基板もしくは雲母上に滴下する
か、もしくはこれらの基板をこのＤＮＡ溶液中に浸し
て、一本鎖ＤＮＡをこれらの基板に固定する。その後、
これらの基板を純水でよく洗浄して測定用の基板とす
る。 １−２：化学結合法 基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
【００２９】まず、塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに
約１０μｇの一本鎖ＤＮＡを加える。次に、この溶液に
基板を入れ、室温付近で数時間反応させ、一本鎖ＤＮＡ
をこれらの基板に固定する。その後、これらの基板を蒸
留水でよくすすぎ、再びきれいな蒸留水に浸し洗浄して
測定用の基板とする。 １−３：化学結合法 基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
約１０μｇの一本鎖ＤＮＡを加える。次に、この溶液に
基板を入れ、室温付近で数時間反応させ、一本鎖ＤＮＡ
をこれらの基板に固定する。その後、これらの基板を蒸
留水でよくすすぎ、再びきれいな蒸留水に浸し洗浄して
測定用の基板とする。 １−３：化学結合法 基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
【００３０】まず、末端がトルエンカルボン酸でエステ
ル化されたシランカップリング剤［ＣＨ3 −Ｃ6 Ｈ4 −
ＯＯＣ−（ＣＨ2 ）ｎ−ＳｉＣｌ3 ］を有機溶剤（ヘキ
サデカン８０％、クロロホルム１２％、四塩化炭素８
％）に重量にして１％溶解して反応溶液とし、この反応
溶液に基板を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反応を行わ
せる。
ル化されたシランカップリング剤［ＣＨ3 −Ｃ6 Ｈ4 −
ＯＯＣ−（ＣＨ2 ）ｎ−ＳｉＣｌ3 ］を有機溶剤（ヘキ
サデカン８０％、クロロホルム１２％、四塩化炭素８
％）に重量にして１％溶解して反応溶液とし、この反応
溶液に基板を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反応を行わ
せる。
【００３１】次にこの基板を２つの糟のクロロホルム溶
液に１５分ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反
応においては、シランカップリング剤の化学式のｎの値
を１０〜２０とすることにより、ＤＮＡ等を構成する塩
基の反応性などが立体障害などにより影響を受けるのを
防止できるので好ましい。
液に１５分ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反
応においては、シランカップリング剤の化学式のｎの値
を１０〜２０とすることにより、ＤＮＡ等を構成する塩
基の反応性などが立体障害などにより影響を受けるのを
防止できるので好ましい。
【００３２】ひき続いて、この基板を数％のリチウムア
ルミニウムハイドライド（ＬｉＡｌＨ4 ）を含むエーテ
ル溶液中で室温下で２０分反応さる。この結果、ｎ＝１
０〜２０の場合、基板上には末端に水酸基を有する炭化
水素鎖含有の単分子膜が形成される。
ルミニウムハイドライド（ＬｉＡｌＨ4 ）を含むエーテ
ル溶液中で室温下で２０分反応さる。この結果、ｎ＝１
０〜２０の場合、基板上には末端に水酸基を有する炭化
水素鎖含有の単分子膜が形成される。
【００３３】最後に、この基板を、約１０μｇの一本鎖
ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに入
れ、室温付近で数時間反応させた後、蒸留水でよく洗浄
し、一本鎖ＤＮＡを固定する。 １−４：化学結合法 基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに入
れ、室温付近で数時間反応させた後、蒸留水でよく洗浄
し、一本鎖ＤＮＡを固定する。 １−４：化学結合法 基板としては、酸化膜の付いたシリコン基板、表面が酸
化されたグラファイト基板、雲母からなる基板もしくは
ガラス基板など水酸基のある比較的表面が平坦な基板が
用いられる。
【００３４】まず、末端がビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ2 ）
のトリクロロシランカップリング剤（ＣＨ2 ＝ＣＨ−
（ＣＨ2 ）ｎ−ＳｉＣｌ3 ）を有機溶剤（ヘキサデカン
８０％、クロロホルム１２％、四塩化炭素８％）に重量
にして１％溶解して反応溶液とし、この反応溶液に基板
を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反応を行わせる。
のトリクロロシランカップリング剤（ＣＨ2 ＝ＣＨ−
（ＣＨ2 ）ｎ−ＳｉＣｌ3 ）を有機溶剤（ヘキサデカン
８０％、クロロホルム１２％、四塩化炭素８％）に重量
にして１％溶解して反応溶液とし、この反応溶液に基板
を入れ、窒素雰囲気中で約２時間反応を行わせる。
【００３５】次にこの基板を２つの糟のクロロホルム溶
液に１５分ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反
応においては、シランカップリング剤の化学式のｎの値
は前述の場合と同様に１０〜２０の場合が好都合であ
る。
液に１５分ずつ浸水した後、水洗を行う。なお、この反
応においては、シランカップリング剤の化学式のｎの値
は前述の場合と同様に１０〜２０の場合が好都合であ
る。
【００３６】次に、この基板をジボランの溶解したテト
ラヒドロフラン溶液（１Ｍ）にアルゴン雰囲気中室温で
１分間反応させた後、過酸化水素と水酸化ナトリウムの
混合溶液（過酸化水素３０％、水酸化ナトリウム０．１
Ｍ）中で１分間反応させる。
ラヒドロフラン溶液（１Ｍ）にアルゴン雰囲気中室温で
１分間反応させた後、過酸化水素と水酸化ナトリウムの
混合溶液（過酸化水素３０％、水酸化ナトリウム０．１
Ｍ）中で１分間反応させる。
【００３７】この結果、ｎ＝１０〜２０の場合、基板上
には末端に水酸基を有する炭化水素鎖含有の単分子膜が
形成される。最後に、この基板を、約１０μｇの一本鎖
ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに入
れ、室温付近で数時間反応させた後、蒸留水でよく洗浄
し、一本鎖ＤＮＡを固定する。 ２：ＡＦＭの探針への分子の固定法 ２−１：ＡＦＭの探針上への、ＤＮＡを構成する４種類
の塩基の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
には末端に水酸基を有する炭化水素鎖含有の単分子膜が
形成される。最後に、この基板を、約１０μｇの一本鎖
ＤＮＡが溶けた塩酸溶液（５〜５０％）５０ｍｌに入
れ、室温付近で数時間反応させた後、蒸留水でよく洗浄
し、一本鎖ＤＮＡを固定する。 ２：ＡＦＭの探針への分子の固定法 ２−１：ＡＦＭの探針上への、ＤＮＡを構成する４種類
の塩基の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
【００３８】ＤＮＡを構成する塩基を含む分子として
は、ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。
１−３〜１−４のいずれかと同じ方法でヌクレオチドを
探針に固定する事ができる。但し、基板の代わりに上述
のＡＦＭの探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにヌクレオチ
ドをそれぞれ用いる。 ２−２：ＡＦＭの探針上への、ＲＮＡを構成する４種類
の塩基の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
は、ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。
１−３〜１−４のいずれかと同じ方法でヌクレオチドを
探針に固定する事ができる。但し、基板の代わりに上述
のＡＦＭの探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにヌクレオチ
ドをそれぞれ用いる。 ２−２：ＡＦＭの探針上への、ＲＮＡを構成する４種類
の塩基の固定方法 用いるＡＦＭの探針は窒化シリコンもしくは酸化シリコ
ンでできたものである。窒化シリコンの場合は、水酸化
ナトリウムによるアルカリ処理、熱硝酸による処理、熱
硫酸による処理、酸素雰囲気中での熱処理のいずれかに
よって探針を酸化して、表面に水酸基を付加する。
【００３９】ＲＮＡを構成する塩基を含む分子として
は、ＲＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。
１−３〜１−４と同じ方法でヌクレオチドを探針に固定
する事ができる。但し、基板の代わりに上述のＡＦＭの
探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにＲＮＡを構成するヌク
レオチドをそれぞれ用いる。
は、ＲＮＡを構成する４種類のヌクレオチドを用いる。
１−３〜１−４と同じ方法でヌクレオチドを探針に固定
する事ができる。但し、基板の代わりに上述のＡＦＭの
探針を、一本鎖ＤＮＡの代わりにＲＮＡを構成するヌク
レオチドをそれぞれ用いる。
【００４０】
【作用】本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法はＤＮＡを
構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類が固定された３
種類または４種類の探針を用意し、これらの探針を原子
間力顕微鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれ
ぞれの探針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近
させて、力を測定しながら原子レベルの精度で走査する
ので、放射性元素を用いる必要がないため安全で、工程
が簡単で、迅速に、しかもまた、原理的には、一個のＤ
ＮＡがあれば測定できるので従来法に比べてＤＮＡの量
は格段に少ない量のＤＮＡでもその塩基配列を検出でき
る方法を提供出来る。さらに、３種類、ないしは４種類
の微小探針を用いて同様の操作でルーチンワーク的にＤ
ＮＡの塩基配列を検出できるので、従来法より手間はか
からず、簡単、迅速にＤＮＡの塩基配列を決定できる。
そして、本発明におけるＤＮＡを構成する塩基と特異的
な相互作用をする分子は、炭化水素鎖を有する単分子膜
を介して探針に固定さ れているので、探針に直接固定さ
れた分子に比べて自由に動け、そのため、ＤＮＡと反応
する際分子間の立体障害を受け難くなる。この結果、効
率よくＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。
構成する４種類の塩基に対しそれぞれ特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子のいずれか１種類が固定された３
種類または４種類の探針を用意し、これらの探針を原子
間力顕微鏡の探針とし、前記原子間力顕微鏡によりそれ
ぞれの探針を基板上に固定された一本鎖ＤＮＡ上に接近
させて、力を測定しながら原子レベルの精度で走査する
ので、放射性元素を用いる必要がないため安全で、工程
が簡単で、迅速に、しかもまた、原理的には、一個のＤ
ＮＡがあれば測定できるので従来法に比べてＤＮＡの量
は格段に少ない量のＤＮＡでもその塩基配列を検出でき
る方法を提供出来る。さらに、３種類、ないしは４種類
の微小探針を用いて同様の操作でルーチンワーク的にＤ
ＮＡの塩基配列を検出できるので、従来法より手間はか
からず、簡単、迅速にＤＮＡの塩基配列を決定できる。
そして、本発明におけるＤＮＡを構成する塩基と特異的
な相互作用をする分子は、炭化水素鎖を有する単分子膜
を介して探針に固定さ れているので、探針に直接固定さ
れた分子に比べて自由に動け、そのため、ＤＮＡと反応
する際分子間の立体障害を受け難くなる。この結果、効
率よくＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。
【００４１】また、ＤＮＡを構成する塩基と特異的に相
互作用を及ぼす分子が探針に直接結合されている場合、
探針をＤＮＡに近づけ過ぎた場合、探針とＤＮＡとの間
には大きな斥力が働き、この斥力のためにＤＮＡが変形
したり基板からはがれたりすることがあるが、ＤＮＡを
構成する塩基と特異的な相互作用をする分子が炭化水素
鎖を有する単分子膜を介して探針に固定されている場
合、炭化水素鎖が探針とＤＮＡ分子との間のクッション
の役目を果たすので、ＤＮＡ分子が変形したり、基板か
らはがれたりすることがなくなる。
互作用を及ぼす分子が探針に直接結合されている場合、
探針をＤＮＡに近づけ過ぎた場合、探針とＤＮＡとの間
には大きな斥力が働き、この斥力のためにＤＮＡが変形
したり基板からはがれたりすることがあるが、ＤＮＡを
構成する塩基と特異的な相互作用をする分子が炭化水素
鎖を有する単分子膜を介して探針に固定されている場
合、炭化水素鎖が探針とＤＮＡ分子との間のクッション
の役目を果たすので、ＤＮＡ分子が変形したり、基板か
らはがれたりすることがなくなる。
【００４２】また、本発明において、特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出
来、また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤ
ＮＡの塩基配列を決定できる。
を及ぼす４種類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出
来、また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤ
ＮＡの塩基配列を決定できる。
【００４３】また、本発明において、特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出
来、また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤ
ＮＡの塩基配列を決定できる。
を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出
来、また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤ
ＮＡの塩基配列を決定できる。
【００４４】
【実施例】実施例１ ３０塩基対分だけ切断し取り出された大腸菌ＤＮＡの塩
基配列を本発明の方法で検出した。以下に詳細を示す。
基配列を本発明の方法で検出した。以下に詳細を示す。
【００４５】まず、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡを
２０μ／ｍｇ以下の濃度となるように１５ｍＭの塩化ナ
トリウムと１．５ｍＭのクエン酸ナトリウムの混合溶液
に溶かした。そして、この溶液を沸騰した湯浴に１０分
間つけた後、氷水で急冷して、大腸菌ＤＮＡを一本鎖Ｄ
ＮＡにした。
２０μ／ｍｇ以下の濃度となるように１５ｍＭの塩化ナ
トリウムと１．５ｍＭのクエン酸ナトリウムの混合溶液
に溶かした。そして、この溶液を沸騰した湯浴に１０分
間つけた後、氷水で急冷して、大腸菌ＤＮＡを一本鎖Ｄ
ＮＡにした。
【００４６】この一本鎖ＤＮＡを、前述の１−１の方法
を用いて、グラファイト基板上に分散して固定した。ま
た、前述の２−１の方法（この中でも特に、１−３の方
法を応用）を用いて、ＤＮＡを構成するヌクレオチドを
ＡＦＭの探針に固定した。
を用いて、グラファイト基板上に分散して固定した。ま
た、前述の２−１の方法（この中でも特に、１−３の方
法を応用）を用いて、ＤＮＡを構成するヌクレオチドを
ＡＦＭの探針に固定した。
【００４７】まず、アデニンを含むヌクレオチドが固定
された探針を一本鎖ＤＮＡの固定された基板表面に接近
させ、探針と基板表面間に働く力が一定になるように、
探針と基板表面の間の距離を調製しながら、原子レベル
の精度（０．１オングストロームの精度）でこの探針を
走査した。ここで、探針の走査範囲は１００×１００ｎ
ｍ2 とし、この時探針の軌跡が描く曲線群の形状を調べ
た。
された探針を一本鎖ＤＮＡの固定された基板表面に接近
させ、探針と基板表面間に働く力が一定になるように、
探針と基板表面の間の距離を調製しながら、原子レベル
の精度（０．１オングストロームの精度）でこの探針を
走査した。ここで、探針の走査範囲は１００×１００ｎ
ｍ2 とし、この時探針の軌跡が描く曲線群の形状を調べ
た。
【００４８】基板表面の様々な場所における曲線群の形
状を調べたところ、数箇所において、平面の上に半径が
数ナノメーターの棒状の物がのっているような形状が観
測された。しかも、この棒は７ヶ所に突起を持ってい
た。これらは、以下のように解釈された。
状を調べたところ、数箇所において、平面の上に半径が
数ナノメーターの棒状の物がのっているような形状が観
測された。しかも、この棒は７ヶ所に突起を持ってい
た。これらは、以下のように解釈された。
【００４９】まず、上に示した基板表面の観察方法は、
基本的には、従来のＡＦＭによる固体表面の形状の観察
方法と同じである。従って、探針の軌跡の描く曲線群の
形状は、基板表面の形状を表すので、棒状の物は一本鎖
ＤＮＡを示していると解釈された。
基本的には、従来のＡＦＭによる固体表面の形状の観察
方法と同じである。従って、探針の軌跡の描く曲線群の
形状は、基板表面の形状を表すので、棒状の物は一本鎖
ＤＮＡを示していると解釈された。
【００５０】しかし、チミンが存在する部分のＤＮＡの
見かけの形状は、従来のＡＦＭで示される形状と少し様
子が違ってくる。すなわち、探針に固定されたアデニン
とＤＮＡ中のチミン間には水素結合による力が働き、こ
の力は、この探針と他の塩基や基板表面間に働く力より
も充分大きく、そのため、探針は、ＤＮＡ中のチミン上
にきたとき、原子間力を一定にするためにＤＮＡから大
きく離れようとする。従って、従来のＡＦＭでは見られ
ない突起がＤＮＡを表す曲線群上に観測される。そこ
で、この突起の位置にチミンがあると判断された。以上
のことより、ＤＮＡ上にある７箇所のチミンの位置が判
った。
見かけの形状は、従来のＡＦＭで示される形状と少し様
子が違ってくる。すなわち、探針に固定されたアデニン
とＤＮＡ中のチミン間には水素結合による力が働き、こ
の力は、この探針と他の塩基や基板表面間に働く力より
も充分大きく、そのため、探針は、ＤＮＡ中のチミン上
にきたとき、原子間力を一定にするためにＤＮＡから大
きく離れようとする。従って、従来のＡＦＭでは見られ
ない突起がＤＮＡを表す曲線群上に観測される。そこ
で、この突起の位置にチミンがあると判断された。以上
のことより、ＤＮＡ上にある７箇所のチミンの位置が判
った。
【００５１】次に、チミン、グアニン、シトシンのいず
れかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定された３種類の
探針を用いて、同様な操作をして、ＤＮＡ上のアデニ
ン、シトシン、グアニンの位置がそれぞれ調べられた。
れかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定された３種類の
探針を用いて、同様な操作をして、ＤＮＡ上のアデニ
ン、シトシン、グアニンの位置がそれぞれ調べられた。
【００５２】以上の４種類の探針を用いて調べたＤＮＡ
中の塩基の位置から、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡ
の塩基配列が検出された。なお、チミン、グアニン、シ
トシンのいずれかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定さ
れた３種類の探針だけを用いても、ＤＮＡの塩基配列の
検出をすることができた。
中の塩基の位置から、３０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡ
の塩基配列が検出された。なお、チミン、グアニン、シ
トシンのいずれかを含むヌクレオチドがそれぞれ固定さ
れた３種類の探針だけを用いても、ＤＮＡの塩基配列の
検出をすることができた。
【００５３】すなわち、これらの３種類の探針をそれぞ
れ用いて一本鎖ＤＮＡを調べたところ、ＤＮＡを示す曲
線群上に多数の突起が観測され、これによって、アデニ
ン、シトシン、グアニンのＤＮＡ上の位置が分かった。
ところで、上記のどの探針を用いた場合にも、突起の現
れない場所がＤＮＡを示す曲線群上にあった。そこで、
この場所にチミンが存在すると判断された。しかも、こ
の場所の広さから、ここに存在しているチミンの数が分
かった。以上のことから、３０塩基対からなる大腸菌Ｄ
ＮＡの塩基配列か検出できた。 実施例２ 前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
へ固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によって、３
０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出でき
た。実施例３ 前述の２−２の方法（この中でも特に、１−３の方法を
応用）を用いてＲＮＡを構成するヌクレオチドをＡＦＭ
の探針に固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によっ
て、３０塩基対からなる大腸菌のＤＮＡの塩基配列が検
出できた。実施例４ 前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
へ固定し、また、前述の２−２の方法（この中でも特
に、１−３の方法を応用）を用いてＲＮＡを構成するヌ
クレオチドをＡＦＭの探針に固定した。それ以外は実施
例１と同じ方法によって、３０塩基対からなる大腸菌Ｄ
ＮＡの塩基配列が検出できた。
れ用いて一本鎖ＤＮＡを調べたところ、ＤＮＡを示す曲
線群上に多数の突起が観測され、これによって、アデニ
ン、シトシン、グアニンのＤＮＡ上の位置が分かった。
ところで、上記のどの探針を用いた場合にも、突起の現
れない場所がＤＮＡを示す曲線群上にあった。そこで、
この場所にチミンが存在すると判断された。しかも、こ
の場所の広さから、ここに存在しているチミンの数が分
かった。以上のことから、３０塩基対からなる大腸菌Ｄ
ＮＡの塩基配列か検出できた。 実施例２ 前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
へ固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によって、３
０塩基対からなる大腸菌ＤＮＡの塩基配列が検出でき
た。実施例３ 前述の２−２の方法（この中でも特に、１−３の方法を
応用）を用いてＲＮＡを構成するヌクレオチドをＡＦＭ
の探針に固定し、それ以外は実施例１と同じ方法によっ
て、３０塩基対からなる大腸菌のＤＮＡの塩基配列が検
出できた。実施例４ 前述の１−３の方法を用いて一本鎖ＤＮＡを雲母基板上
へ固定し、また、前述の２−２の方法（この中でも特
に、１−３の方法を応用）を用いてＲＮＡを構成するヌ
クレオチドをＡＦＭの探針に固定した。それ以外は実施
例１と同じ方法によって、３０塩基対からなる大腸菌Ｄ
ＮＡの塩基配列が検出できた。
【００５４】ＤＮＡの塩基配列を迅速に決めることは、
分子生物分野、医療分野、法医学分野、農林水産業、製
薬業の分野でたいへん重要である。特に、遺伝病の治療
や、ＤＮＡ操作による植物等の品種改良、有用物質の生
物による生産を行う場合、ＤＮＡの塩基配列を読みとる
ことは、これらを実施するための基礎技術として今後ま
すます重要になってくると考えられる。本発明は、今ま
での方法に比べて簡便で少量のＤＮＡしか必要としない
ので、これらの分野に有効に適用できる。
分子生物分野、医療分野、法医学分野、農林水産業、製
薬業の分野でたいへん重要である。特に、遺伝病の治療
や、ＤＮＡ操作による植物等の品種改良、有用物質の生
物による生産を行う場合、ＤＮＡの塩基配列を読みとる
ことは、これらを実施するための基礎技術として今後ま
すます重要になってくると考えられる。本発明は、今ま
での方法に比べて簡便で少量のＤＮＡしか必要としない
ので、これらの分野に有効に適用できる。
【００５５】さらに、現在、人のＤＮＡ配列をすべて決
めてしまおうとする“人ゲノム解析計画”が計画されて
いる。この場合読みとるべきヒトＤＮＡの塩基対の数は
２８億と非常に多く、迅速にしかも正確に塩基配列を読
みとる手段の開発が強く望まれている。本発明は、この
ゲノム解析の有力な手段としても期待できる。
めてしまおうとする“人ゲノム解析計画”が計画されて
いる。この場合読みとるべきヒトＤＮＡの塩基対の数は
２８億と非常に多く、迅速にしかも正確に塩基配列を読
みとる手段の開発が強く望まれている。本発明は、この
ゲノム解析の有力な手段としても期待できる。
【００５６】なお、実施例においては、ＤＮＡもしくは
ＲＮＡを構成する４種類のヌクレヲチドをＡＦＭの探針
に固定したが、これらの分子に限る必要はなく、前述し
た如くＤＮＡ上の塩基と特異的に相互作用を及ぼすもの
であればなんでも良いことは言うまでもない。
ＲＮＡを構成する４種類のヌクレヲチドをＡＦＭの探針
に固定したが、これらの分子に限る必要はなく、前述し
た如くＤＮＡ上の塩基と特異的に相互作用を及ぼすもの
であればなんでも良いことは言うまでもない。
【００５７】
【発明の効果】本発明におけるＤＮＡを構成する塩基と
特異的な相互作用をする分子は、炭化水素鎖を有する単
分子膜を介して探針に固定されているので、探針に直接
固定された分子に比べて自由に動け、そのため、ＤＮＡ
と反応する際分子間の立体障害を受け難くなる。この結
果、効率よくＤＮＡの塩基配列を決定することが可能と
なる。
特異的な相互作用をする分子は、炭化水素鎖を有する単
分子膜を介して探針に固定されているので、探針に直接
固定された分子に比べて自由に動け、そのため、ＤＮＡ
と反応する際分子間の立体障害を受け難くなる。この結
果、効率よくＤＮＡの塩基配列を決定することが可能と
なる。
【００５８】また、ＤＮＡを構成する塩基と特異的に相
互作用を及ぼす分子が探針に直接結合されている場合、
探針をＤＮＡに近づけ過ぎた場合、探針とＤＮＡとの間
には大きな斥力が働き、この斥力のためにＤＮＡが変形
したり基板からはがれたりすることがあるが、ＤＮＡを
構成する塩基と特異的な相互作用をする分子が炭化水素
鎖を有する単分子膜を介して探針に固定されている場
合、炭化水素鎖が探針とＤＮＡ分子との間のクッション
の役目を果たすので、ＤＮＡ分子が変形したり、基板か
らはがれたりすることがなくなる。
互作用を及ぼす分子が探針に直接結合されている場合、
探針をＤＮＡに近づけ過ぎた場合、探針とＤＮＡとの間
には大きな斥力が働き、この斥力のためにＤＮＡが変形
したり基板からはがれたりすることがあるが、ＤＮＡを
構成する塩基と特異的な相互作用をする分子が炭化水素
鎖を有する単分子膜を介して探針に固定されている場
合、炭化水素鎖が探針とＤＮＡ分子との間のクッション
の役目を果たすので、ＤＮＡ分子が変形したり、基板か
らはがれたりすることがなくなる。
【００５９】本発明のＤＮＡの塩基配列検出方法は安全
で、工程が簡単で、迅速に、しかもまた、少ない量のＤ
ＮＡでもその塩基配列を検出できる方法を提供出来る。
また、本発明において、特異的に相互作用を及ぼす４種
類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む分子である好
ましい態様にすることにより、基板への試料の固定と、
探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出来、また、相
互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡの塩基配
列を検出できる。
で、工程が簡単で、迅速に、しかもまた、少ない量のＤ
ＮＡでもその塩基配列を検出できる方法を提供出来る。
また、本発明において、特異的に相互作用を及ぼす４種
類の分子が、ＤＮＡを構成する塩基を含む分子である好
ましい態様にすることにより、基板への試料の固定と、
探針への分子の固定がほぼ同様の操作で出来、また、相
互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡの塩基配
列を検出できる。
【００６０】また、本発明において、特異的に相互作用
を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定が同様の操作で出来、
また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡ
の塩基配列を決定できる。
を及ぼす４種類の分子が、ＲＮＡを構成する塩基を含む
分子である好ましい態様にすることにより、基板への試
料の固定と、探針への分子の固定が同様の操作で出来、
また、相互作用も予め分っているのでより容易にＤＮＡ
の塩基配列を決定できる。
【図１】本発明によって一本鎖ＤＮＡの塩基配列を検出
する原理を示した模式図。
する原理を示した模式図。
【図２】一本鎖ＤＮＡから、２本鎖ＤＮＡを合成する様
子を示した概念図である。
子を示した概念図である。
【図３】末端がアデニンの種々の長さのＤＮＡの作成方
法を示したモデル図である。
法を示したモデル図である。
【図４】オートラジオグラフィーによって観測された４
種類のＤＮＡの混合溶液の電気泳動パターンを示す図で
ある。
種類のＤＮＡの混合溶液の電気泳動パターンを示す図で
ある。
１ ＡＦＭの探針 ２ ＤＮＡを構成する塩基を含む分子 ３ 一本鎖ＤＮＡ ４ 基板 ５ シトシン ６ チミン ７ グアニン ８ アデニン ９ 塩基配列を調べようとする一本鎖ＤＮＡ １０ プライマー １１ ＤＮＡを構成する４種類のヌクレオチド １２ 二本鎖ＤＮＡ １３ アデニンを塩基とするジデオキシヌクレオシド三
リン酸 １４ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド １５ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド １６ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド。 １７ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド。 １８ 末端がアデニンである種々の長さのＤＮＡ １９ 末端がチミンである種々の長さのＤＮＡ ２０ 末端がシトシンである種々の長さのＤＮＡ ２１ 末端がグアニンである種々の長さのＤＮＡ ２２ オートラジオグラフィーで観測した４種類の混合
溶液１８、１９、２０、２１の電気泳動パターン ２３ 電気泳動の電界の向き
リン酸 １４ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド １５ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド １６ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド。 １７ 一本鎖ＤＮＡ９を構成する塩基と水素結合したヌ
クレオチド。 １８ 末端がアデニンである種々の長さのＤＮＡ １９ 末端がチミンである種々の長さのＤＮＡ ２０ 末端がシトシンである種々の長さのＤＮＡ ２１ 末端がグアニンである種々の長さのＤＮＡ ２２ オートラジオグラフィーで観測した４種類の混合
溶液１８、１９、２０、２１の電気泳動パターン ２３ 電気泳動の電界の向き
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 37/00 Ｃ０９Ｄ 4/00 ＰＤＱ // Ｃ０９Ｄ 4/00 ＰＤＱ 201/10 ＰＤＰ 201/10 ＰＤＰ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (3)
- 【請求項１】 ＤＮＡを構成する４種類の塩基に対しそ
れぞれ特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子のいずれ
か１種類が固定された３種類または４種類の探針を用意
し、これらの探針を原子間力顕微鏡の探針とし、前記原
子間力顕微鏡によりそれぞれの探針を基板上に固定され
た一本鎖ＤＮＡ上に接近させて、力を測定しながら原子
レベルの精度で走査することからなるＤＮＡの塩基配列
検出方法であって、前記相互作用を及ぼす分子が、炭化
水素鎖を有する単分子膜を介して探針に固定されている
ことを特徴をするＤＮＡ塩基配列決定方法。 - 【請求項２】 特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子
が、ＤＮＡを構成する塩基を含む分子である請求項１記
載のＤＮＡの塩基配列検出方法。 - 【請求項３】 特異的に相互作用を及ぼす４種類の分子
が、ＲＮＡを構成する塩基を含む分子である請求項１記
載のＤＮＡの塩基配列検出方法。
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|---|---|---|---|
| JP3098920A JP2561396B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | Ｄｎａの塩基配列検出方法 |
| DE69212062T DE69212062T2 (de) | 1991-04-30 | 1992-04-29 | Raster-Abtastmikroskop, molekulares Verarbeitungsverfahren unter Verwendung des Mikroskops und Verfahren zum Wahrnehmen der DNA-Basen-Anordnung |
| US07/875,694 US5363697A (en) | 1991-04-30 | 1992-04-29 | Scanning probe microscope, molecular processing method using the scanning probe microscope and DNA base arrangement detecting method |
| EP92107342A EP0511662B1 (en) | 1991-04-30 | 1992-04-29 | Scanning probe microscope, molecular processing method using the scanning probe microscope and DNA base arrangement detecting method |
| US08/340,866 US5730940A (en) | 1991-04-30 | 1994-11-15 | Scanning probe microscope and molecular processing method using the scanning probe microscope |
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| JP3098920A JP2561396B2 (ja) | 1991-04-30 | 1991-04-30 | Ｄｎａの塩基配列検出方法 |
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|---|---|
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| JP2561396B2 true JP2561396B2 (ja) | 1996-12-04 |
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|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101355019B1 (ko) | 2013-03-04 | 2014-01-27 | 한국과학기술연구원 | 원자력 현미경용 캔틸레버 센서 및 이의 제조방법 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| GB2235049A (en) | 1989-06-20 | 1991-02-20 | Rosser Roy J | Chemical bond microscopy |
-
1991
- 1991-04-30 JP JP3098920A patent/JP2561396B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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| JPH04330281A (ja) | 1992-11-18 |
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| Watterson | Towards the development of a fiber-optic nucleic acid biosensor: An examination of factors affecting selectivity of detection of interfacial nucleic acid hybridization. |
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