KR20150071876A - Ａｆｍ을 이용한 핵산의 서열 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원자힘 현미경 (AFM, atomic force microscope)을 이용한 염기 서열 분석 방법에 대한 것으로, 특히 AFM용 캔틸레버의 팁에 부착된 중합효소 및 프라이머와, dNTP가 부착된 기판 상의 dNTP 사이의 물리적인 힘을 통해 핵산의 염기 서열을 분석하는 것을 특징으로 한다.

Description

ＡＦＭ을 이용한 핵산의 서열 분석 방법{METHOD FOR SEQUENCING NUCLEIC ACIDS USING ATOMIC FORCE MICROSCOPE}

본 발명은 핵산의 서열 분석(sequencing) 방법에 관한 것으로, 특히 정확도 및 진행성(processivity)이 개선된 원자힘 현미경(AFM, atomic force microscope)을 이용한 핵산의 서열 분석 방법에 대한 것이다.

핵산의 서열 분석 (또는 염기 서열 분석) 기술의 발전은 질병의 예방 및 정확한 진단을 가능하게 하였고, 이를 통해 개인 맞춤 의료 시대를 열었다. 그동안 표적 핵산(target nucleic acids)의 염기 서열을 분석하기 위한 다양한 시도가 있었다.

종래 기술은 주로 PCR(polymerase chain reaction)을 응용한 염기 서열을 광학적 방법으로 분석하는 방법으로, 이 방법은 신호 증폭을 위해 복제의 과정을 거쳐야만 서열 분석이 가능하고, 한 번 분석하는데 정확도가 80 내지 90% 정도 수준이어서 99% 이상의 정확도를 확보하기 위해서는 10회 이상의 반복 실험이 불가피하다. 따라서, 상기 PCR 응용한 광학적 방법은 많은 소모성 시약이 필요하여 분석 비용이 높은 단점이 있다.

근래에는 단일 분자 DNA(single molecule DNA)만으로 서열 분석이 가능한 차세대 서열 분석 기술이 연구되고 있다. 상기 단일 분자 DNA 서열 분석법은 DNA 복제라는 시간 및 시약의 소비를 초래하는 단계를 생략할 수 있다. 즉, 상기 방법은 표적(target)이 되는 단일 분자 DNA를 주형(template)으로 하여 중합효소(polymerase)로 상보적인 염기 서열(DNA 또는 RNA)을 합성하는 과정을 통해 주형이 되는 단일 분자 DNA의 염기 서열을 순차적으로 분석하는 방법이다. 단일 분자 DNA 염기 서열 분석은 기존의 방법에서 주로 발생하는 DNA 증폭 과정에서 기인하는 오류를 배제할 수 있으며, 비용을 절감할 수 있다. 그러나 이러한 단일 분자 DNA 염기 서열 분석법은 주로 형광이나 전기적 신호를 이용하는데, 4개의 염기 특이적인 신호 구별의 어려움과 광퇴색(photo-bleaching) 및 낮은 신호 대 잡음 비(signal-to-noise ratio)로 인한 신호가 소실된다는 단점, 및 네 종류의 dNTP의 변형체를 투입하는데 소요되는 비용이 크다는 문제점이 있다. 또한, 2009년에 Science에 보고한 바에 따르면 상술한 방법의 대표적인 예이자, 형광을 이용한 단일 분자 서열 분석법인 SMRT(Pacific Biosciences)에서 150개의 염기 서열을 분석하였을 때, 정확하게 분석된 것이 131개에 불과하여, 정확도가 역시 90%에 못 미치는 정도로 낮다(논문 [John Eid, et al . Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules, Science 323, 133 (2009)] 참조). 따라서, 정확한 서열 분석을 위하여 반복 실험이 필요하므로, 분석 비용이 상승하는 단점이 있다.

한편, 원자힘 현미경(AFM, atomic force microscope)은 나노미터 단위의 매우 높은 해상도를 가진 주사 탐침 현미경(scanning probe microscope)의 일종으로, 물질을 나노미터 수준의 해상도로 이미지화하고, 측정하고, 조작할 수 있는 최첨단 기구 중의 하나이다.

또한, AFM은 다양한 모드를 사용하여, 금속 표면과 같은 단단한 물질뿐만 아니라 생체 조직과 같은 부드러운 물질을 분석할 수 있고, 생체 분자 간의 상호작용을 측정할 수 있다. AFM을 사용하여 분석할 수 있는 생체 분자 간의 상호작용은, 예를 들어 DNA 혼성화, 단백질 항원-항체 결합, RNA-단백질 상호작용, 펩타이드-약물 상호작용 및 막 단백질 상에 리간드-결합 등을 포함한다. 따라서, AFM은 생체 분자들간의 다양한 반응 기작을 이해하는 중요한 수단으로서 사용될 수 있으며, 이를 이용하여 핵산 서열 분석에도 활용될 수 있다.

미국 특허등록번호 제6,555,362호는 단일 염기를 AFM 팁에 부착하여 고정된 ssDNA를 스캔하여 서열을 분석하는 방법을 제안하였다. 그러나, AFM 탐침에 탄소 나노튜브를 고정하고, 나노튜브 말단에 한 종류의 염기를 고정한 경우에도 탄소 나노튜브의 두께와 단일가닥 DNA의 꼬임 및 겹침 현상으로 단일 가닥 DNA 상에 있는 염기를 개별적으로 인식할 수 있는 공간 해상도를 확보하는 것은 매우 어렵다. 또한 이러한 단일 염기 사이의 결합력은 현존하는 AFM으로 인지될 수 없을 정도로 작다는 것이 일반적으로 알려진 바이다. 그리고 하나의 탐침으로 스캔하는 것이 아닌 네 종류의 탐침으로 스캔하여 각 염기의 위치를 알아내고 이를 병합하는 과정은 고해상도 이미징과 동시에 진행된 경우에만 가능할 것이며, 염기 하나 수준의 해상도를 갖는 이미징을 성공적으로 진행하는 것은 매우 긴 시간이 소요된다.

미국 특허등록번호 제5620854호와 미국 특허등록번호 제6280939호는 AFM 팁에 중합효소(polymerase)를 연동하여 염기 서열을 측정하였다. 그러나, 미국 특허등록번호 제5620854호의 경우 네 종류의 염기에 중합효소에 의해 반응개시 DNA에 편입(incorporation)될 때 나타나는 중합효소의 움직임이나 발생하는 에너지가 서로 다를 것이라는 개념과 물리적인 예측값을 제시하였으나 실제로 관측된 바는 없다. 또한, 미국 특허등록번호 제6280939호의 경우도 네 종류의 염기 편입시 나타나는 중합효소의 움직임을 구분하기 위해 염기의 농도나 크기를 각각 다르게 하는 방법을 제시하였으나 역시 구현된 바 없으며, 단일 분자의 움직임은 확률론적이므로 각 염기의 농도 차이가 있는 경우에도 중합효소의 움직임이 나타나는 시점과 염기의 종류를 일치시키는 것은 실현이 어려울 것으로 예상된다. 또한 상기 두 가지 방법은 모두 DNA 중합효소에 염기가 결합하고 편입되는 과정 속에 나타나는 DNA 중합효소의 움직임을 캔틸레버 팁을 통해 읽어내려고 했으나 캔틸레버 팁이 읽어낼 수 있는 움직임은 z축에 한정되는데 반해 중합효소의 용액 속에서 움직임은 브라우니안 운동에 따라 달라질 수 있으며, 특히 중합효소가 고정되는 위치에 따라 움직이는 방향 역시 달라질 수 있기 때문에 실용성의 한계가 있다. 더욱이 중합효소의 염기 결합과 편입시 나타나는 움직임이 실제 AFM 반응 용액 속에서 측정가능한 수준으로 노이즈 레벨보다 크게 관측될 수 있다는 것은 보고된 바가 전무하다. 뿐만 아니라, 크기가 서로 다른 분자들이 말단에 결합된 dNTP를 사용하므로, 네 가지의 dNTP 변형체를 고농도로 사용해야 하므로 고비용이 소요된다.

따라서 AFM을 사용한 상술된 세 가지 특허는 모두 개념을 제시하는데 그쳤으며, 실질적으로 서열 분석에 성공한 예는 없다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 구체적으로 원자힘 현미경(AFM)을 이용하여 핵산의 서열을 분석하되, 상기 핵산의 분석의 정확도 및 진행성이 높은 핵산 서열 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은, 원자힘 현미경(AFM, atomic force microscope)의 캔틸레버 팁(cantilever tip)에 중합효소(polymerase) 및 프라이머(primer)가 각각 부착되고, 상기 중합효소 및 상기 프라이머와, 분석하고자 하는 핵산이 결합되어 핵산-중합효소 복합체(nucleic acid-polymerase complex)를 형성하는 단계; 상기 캔틸레버 팁이 기판에 종류별로 고정된 dNTP 구역 통과시 발생되는 신호를 읽어 표적 핵산의 염기 서열에 따라 상보적인 dNTP를 인식하는 단계; 상기 인식된 상보적인 dNTP를 염기 서열로 합성하는 단계; 상기 중합효소가 표적 핵산의 다음 위치로 이동하는 단계; 및 상기 인식, 합성 및 이동 단계를 서열 분석이 완료될 때까지 반복하는 단계를 포함하는 AFM을 이용한 핵산의 염기 서열 분석 방법에 관한 것이다.

상기 원자힘 현미경의 캔틸레버 팁에 중합효소 및 프라이머가 각각 부착되고, 상기 중합효소 및 상기 프라이머와, 분석하고자 하는 핵산이 결합되어 핵산-중합효소 복합체를 형성하는 단계는, 프라이머가 결합된 주형 핵산을 중합효소와 결합시켜 핵산-중합효소 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 복합체에서 중합효소 및 프라이머가 AFM의 캔틸레버 팁에 각각 부착되는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 주형 핵산과 분석하고자 하는 핵산이 서로 상이한 경우, 상기 부착 단계 후, 주형 핵산을 씻어내는 단계; 및 분석의 대상이 되는 핵산을 첨가하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

상기 캔틸레버 팁에 덴드론 분자(dendron molecular)를 추가적으로 부착하여 중합효소 및 프라이머의 부착을 매개할 수 있다. 이때, 상기 덴드론 분자(dendron molecular)는 3세대 덴드론 분자일 수 있다. 상기 기판에는 dNTP가 종류별로 구분되어 배열되어 있을 수 있다. 또한, 상기 기판에 덴드론 분자(dendron molecular)를 추가적으로 부착하여 dNTP의 고정을 매개할 수 있다. 이때, 상기 덴드론 분자(dendron molecular)는 3세대 덴드론 분자일 수 있다.

또한, 상기 합성 단계는, 상기 인식 단계와 동일한 장소에서 이루어질 수 있고, 또는 상기 인식 단계의 기판과 분리된 단일 dNTP 용액 내에서 이루어질 수 있다.

본 발명에 따르는 AFM을 이용한 핵산의 염기 서열 분석 방법은, 핵산 분자의 염기 서열 분석의 정확도를 높이면서, 동시에 분석에 필요한 시약을 최소화하며, 고가의 형광 염료(dye)를 사용하지 않아 비용을 낮출 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 AFM을 이용한 핵산 염기 서열 분석 원리를 나타내는 모식도이다.
도 2는 핵산의 상보적인 염기쌍이 일치하는 경우 신호가 발생하는 원리를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 AFM을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법을 설명하기 위한 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 AFM을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에서, 캔틸레버의 팁(프로브)에 나노콘이 부착되고, 상기 나노콘에 중합효소 및 프라이머가 각각 부착된 상태를 설명하기 위한 모식도이다.
도 5는 본 발명에 따른 AFM을 이용한 핵산 염기 서열 분석 방법에서, 도 4와 같이 캔틸레버의 팁에 중합효소 및 프라이머가 각각 부착되는 방법을 설명하는 모식도이다.
도 6은 염기 서열의 인식 및 합성이 같은 장소에서 일어나는 경우를 설명하는 모식도이다.
도 7은 염기 서열의 인식과 합성이 분리되어 일어나는 경우를 설명하는 모식도이다.
도 8은 실시예 3에 따른 일부 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 다양한 변형을 가할 수 있으며, 여러 가지 실시예를 가질 수 있으며, 하기 특정 실시예들은 단지 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변형물, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "핵산(nucleic acid)"은 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. 또한 용어 "핵산(nucleic acid)"은 염기 서열을 분석하고자 하는 핵산을 의미하며, 또는 주형(template) 핵산으로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또는 경우에 따라 분석하고자 하는 핵산과 주형 핵산은 상이할 수 있다. 상기 핵산은, 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 등을 포함하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "프라이머(primer)"는 적합한 재료(예, dNTP 및 중합 효소) 및 조건 하에서 주형에 대한 상보적인 염기 서열 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30개 염기 정도의 올리고뉴클레오티드이다. 일반적으로 프라이머 분자의 길이가 짧을수록 더 낮은 반응 온도에서도 주형(template)과 충분히 안정적으로 혼성화될 수 있다. 프라이머의 디자인은 서열 분석을 원하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어 프라이머 디자인용 프로그램(예를 들어, Vector NTI, PRIMER 3 프로그램 등)을 이용하여 제작할 수 있다. 또한 유니버설 프라이머(universal primer)가 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "dNTP(deoxynucleoside triphosphate)"는, 달리 지시가 없는 한, dNTP인 dATP, dGTP, dTTP, dUTP, dCTP 등뿐만 아니라, NTP인 ATP, GTP, UTP, CTP 등을 포함하는 개념으로 사용되며, 뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analog)를 포함할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analog)란 핵산의 합성 및 가공, 바람직하게는 화학적 합성 및 가공뿐만 아니라 효소적 합성 및 가공에 의하여, 자연적으로 존재하는 염기를 대신하여 사용될 수 있는 분자들, 특히 염기쌍을 형성하는 가능한 변형된 뉴클레오타이드, 및 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘, 우라실, 또는 소수 염기들을 포함하지 않는 임의로 합성된 염기들을 포함한다. 이러한 용어는 변형된 퓨린 및 피리미딘, 소수 염기, 전환가능한 뉴클레오사이드, 퓨린 및 피리미딘의 구조적 유사체, 표지화(labeled), 유도체화 및 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드, 컨주게이티드된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드, 서열 변형제(modifier), 말단 변형제, 스페이서 변형제, 및 골격이 변형된 뉴클레오타이드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따르는 핵산 분석 방법에서 사용되는 dNTP는 분석하고자 하는 핵산의 종류와 목적에 따라 당업자가 적절하게 정할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "중합효소"는 표적 핵산을 주형으로 하여 핵산의 중합 반응을 일으키는 효소로서, DNA 중합효소, RNA 중합효소 또는 역전사효소를 포함할 수 있다. 상기 중합효소의 출처, 종류 또는 크기나 모양은 특별히 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 "덴드론" 또는 "덴드론 분자"는 어떤 초점으로부터 방사된 분지(branch)를 갖는 덴드리머의 일종으로, 중심에 연결되어 있거나 연결될 수 있고, 직접 또는 연결부위를 통하여 덴드리머(dendrimer)를 형성할 수 있다. 상기 덴드리머는 중심, 적어도 하나 이상의 내부 분지층, 및 표면 분지층(branched layer)에 의하여 특정된다. 많은 덴드리머는 공통된 중심에 연결된 둘 또는 그 이상의 덴드론을 포함한다. 그러나, 상기 덴드리머는 넓게는 하나의 덴드론을 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이러한 덴드론의 예로서, 나노콘(nanocone)을 들 수 있다. 또한, 덴드론 또는 덴드론 분자는 내부 중심으로부터 연결된 분자가 몇 번에 걸쳐 층(layer)를 이루는지에 따라 세대가 정해진다. 예를 들어, 나노콘의 경우, 1세대는 중심-표면(3 브랜치), 2세대는 중심-층-표면(9), 3세대는 중심-층-층-표면(27)과 같이 정점의 브랜치(branch) 개수가 세대에 따라 3배수로 증가한다. 따라서, 세대가 증가함에 따라 분자의 크기도 커지게 되며, 덴드론 중심과 정점(apex) 사이의 거리도 달라진다.

본 발명은 원자힘 현미경(AFM, atomic force microscope)을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에서 원자힘 현미경(AFM, atomic force microscope)의 캔틸레버 팁(cantilever tip)에 중합효소(polymerase) 및 프라이머(primer)가 각각 부착되고, 상기 중합효소 및 상기 프라이머와, 분석하고자 하는 핵산이 결합되어 핵산-중합효소 복합체(nucleic acid-polymerase complex)를 형성하는 단계; 상기 캔틸레버 팁이 기판에 고정된 dNTP 구역 통과시 발생되는 신호를 읽어 핵산의 염기 서열에 따라 상보적인 dNTP를 인식하는 단계; 상기 인식된 상보적인 dNTP를 염기 서열로 합성하는 단계; 상기 중합효소가 표적 핵산의 다음 위치로 이동하는 단계; 및 상기 인식, 합성, 이동 단계를 핵산의 염기 서열 분석이 완료될 때까지 반복하는 단계를 포함하는 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서, 먼저 원자힘 현미경(AFM, atomic force microscope)의 캔틸레버 팁(cantilever tip)에 중합효소(polymerase) 및 프라이머(primer)가 각각 부착되고, 상기 중합효소 및 상기 프라이머와, 분석하고자 하는 핵산이 결합되어 핵산-중합효소 복합체(nucleic acid-polymerase complex)를 형성한다.

원자힘 현미경(AFM)은 당분야에서 통상적인 원자힘 현미경을 활용할 수 있다. 상기 원자힘 현미경은 캔틸레버를 포함하며, 캔틸레버 끝에 설치된 뾰족한 팁(또는 탐침(probe))와 시료 표면 간에 작용하는 원자간력(또는 원자힘)을 이용하여 시료 표면의 삼차원 상을 포함한 여러 가지 관련 정보를 얻을 수 있다. 원자힘 현미경은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 포스로봇(ForceRobot) 300(JPK 인스트러먼츠(Instruments) 사), 바이오스코프 캐탈리스트(BioScope Catalyst)(브루커 코포레이션(Bruker Corporation)), 6000ILM AFM (어질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies)), MFP-3D-BIO (어실럼 리서치(Asylum Research))를 사용할 수 있다.

상기 AFM의 캔틸레버의 팁은 그대로 사용될 수 있으며, 또는 덴드론 분자를 부착하여 사용될 수 있다. 상기 덴드론 분자는 나노콘(nanocone)이라고도 한다. 캔틸레버 팁과 기판에 분자가 고정되는 경우에 고정되는 분자의 밀도와 분자 간의 간격을 적절하게 조절하지 않으면 단일 분자 간의 상호작용을 관찰하기 어려울 수 있는데, 상기 덴드론 분자는 원뿔 모양의 분자이고, 주변부(periphery)의 여러 개의 카르복실기(carboxyl)와 기판 표면의 작용기(하이드록실기, 아민기 등)간의 다중 공유 결합을 통해 고정될 수 있기 때문에, 분자 사이의 간격 조절에 특히 유리하다. 예를 들어, 3세대 덴드론 분자의 정점(apex)에 분자가 고정될 경우, 대략 적어도 6 내지 7 nm의 간격으로 고정될 수 있어서 분자 활성을 갖기 위한 충분한 공간이 보장되므로, 캔틸레버 팁이 기판에 접근할 때 단일 분자 간의 상호작용이 일어날 수 있다. 따라서 덴드론 분자의 정점에 중합효소와 프라이머를 고정함으로써, 효율적인 중합효소의 관찰 및 조작이 가능하다.

도 1 내지 도 3을 참고하여, 본 발명에 따르는 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법을 설명한다.

먼저, 도 1에 도시된 바와 같이, AFM의 캔틸레버의 끝 부분인 팁에 중합효소 및 프라이머가 결합되어 준비되고, 기판 상에 4가지 종류의 dNTP가 구역을 나누어 구분되어 배열된다. 상기 dNTP는, 예를 들어 다수의 dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP를 의미한다. 상기 dNTP는 기판 위에 종류별로 구분되어 부착되어 있는 것이 바람직한데, 예를 들면 dCTP, dGTP, dTTP 및 dATP는 4개의 행으로 배열되고, 각각의 dNTP는 각 행에서 일렬로 부착되는 방식으로 패턴을 형성할 수 있다. 이와 같이 dNTP가 종류별로 구분되는 위치의 규칙성에 의하여, 본 발명은 상기 중합효소가 중합하는 염기 서열을 더욱 정확하게 예측할 수 있다. 상기 상이한 종류의 dNTP는 서로 구분되어 있으면 충분하고, 부착된 위치나 형태 및 순서 등은 제한되지 않는다. 예를 들어, 상이한 종류의 dNTP는 서로 구별되도록 원심형으로 배열될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 dNTP는 분석하고자 하는 핵산의 종류와 사용되는 중합효소의 종류에 따라서 결정될 수 있다.

본 발명에서 dNTP가 종류별로 부착되는 기판은, 당 기술분야에서 일반적으로 사용되는 기판으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 도체 또는 부도체 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 은, 구리, 금, 알루미늄, 유리, 세라믹, 실리콘, Si/SiO₂ 웨이퍼, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드로 이루어된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 구체적으로, 상기 기판 표면은 dNTP의 용이한 부착을 위하여 금(gold)으로 이루어질 수 있고, 또는 실리콘 질화막(silicone nitrade) 상에 금 층이 형성된 것도 가능하며, 카르복실기(-COOH), 티올기(-SH), 수산기(-OH), 실란기, 아민기 또는 에폭시기 등을 갖도록 표면 개질 되어 사용될 수도 있다. 또한, 기판의 형태는 dNTP가 고정될 수 있는 어떠한 형태라도 가능하지만, 플레이트 형태인 것이 가장 바람직하다.

dNTP는, 예를 들어 dNTP의 γ 인산염에 링커와 결합할 수 있는 분자가 연결되어 있는 dNTP 변형체의 형태로 기판 상에 부착될 수 있다. 더욱 구체적으로, dNTP의 변형체는 dNTP의 γ 인산염에, 여러 종류의 스페이서(예, 인산기, 탄소 골격(carbon chain), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol (PEG) 등)를 통해, 특정 링커 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 분자가 연결되어 있다. 상기 특정 링커 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 분자는 공유결합으로 분자-특이적인 링커 분자와 결합할 수 있는 아민기(amine), 티올기(thiol) 등이 될 수 있으며, 또는 비공유결합을 통해 특이적으로 결합할 수 있는 바이오틴(biotin)(스트렙타비딘과 결합), 단백질(항체와 결합) 등이 될 수 있다. 이러한 분자는 해당 분야의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.

또한, dNTP를 기판 표면에 부착하기 위하여, 덴드론 분자를 선택적으로 기판 표면에 먼저 도입할 수 있다. 예를 들어, 기판의 표면에 덴드론 분자를 도입한 후, 정점(apex)에 바이오틴을 고정하고, 그 위에 스트렙타비딘을 결합시킴으로써 스트렙타비딘의 비특이적인 흡착으로 인한 구조 변화를 방지할 수 있다. 그리고 기판의 4 개의 바이오틴 결합 부위를 갖는 스트렙타비딘 위에 최종적으로 바이오틴이 결합된 dNTP 변형체를 고정함으로써 dNTP의 표면 고정을 완성할 수 있다.

한편, 본 발명에 따르면, 분석하고자 하는 핵산을 주형(template)으로 하여, 이에 중합효소 및 프라이머가 함께 핵산-중합효소 복합체(nucleic acid-polymerase complex)를 형성하여, 주형에 상보적이며 프라이머 바로 다음 위치에 배열되어야 하는 dNTP의 종류를 인식하여 상보적인 가닥에 편입(incorporation)시킬 수 있다. 상기 부착된 중합효소에 의한 표적 핵산의 염기 서열에 상보적인 염기쌍의 인식은, 하술되는 바와 같이, AFM의 캔틸레버 팁에서 발생하는 힘(force)의 변화를 통하여 실시간으로 측정할 수 있다.

상보적인 염기 서열 인식 과정은 도 2에 도시된 바와 같이, 상보적으로 일치하는 염기쌍의 경우 발생하는 힘을 AFM을 사용하여 읽음으로써 인식이 가능하다. 즉, 캔틸레버의 팁에 주형인 표적 핵산에서 해당 위치의 염기가 C(사이토신)인 경우, 상보적인 염기인 G(구아닌)과 상호작용할 때만 특이적인 상호작용을 함으로써 신호(signal)가 발생하고, AFM 탐침(팁)을 접근과 후퇴를 반복함으로써 이러한 데이터를 모아 주형 핵산의 염기서열을 정확하게 인식을 할 수 있다. 이와 관련하여, C(사이토신)은 G(구아닌)과 상보적으로 염기쌍을 이루고, A(아데닌)은 T(티민)과 상보적으로 염기쌍을 이루므로, 상보적인 염기쌍 정보로부터 주형의 염기 서열을 알 수 있다.

이어서, 도 3에 도시된 바와 같이, 주형에 상보적인 염기서열을 인식하여 합성이 완료되면 중합효소는 주형의 다음 위치로 이동하게 되고, 이어서 상술한 바와 동일한 방식으로 상보적인 염기서열 인식 및 합성을 반복할 수 있다.

다음으로, 도 4 및 도 5를 참고하여, 상기 원자힘 현미경의 캔틸레버 팁에 중합효소 및 프라이머가 각각 부착하도록 준비하는 방법을 설명한다.

도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에서 중합효소 및 프라이머는 각각 캔틸레버의 팁에 부착되어 사용되는데, 부착하는 방법은 도 5에 도시된 바와 같다. 먼저, 아민기가 5' 말단에 결합된 프라이머가 결합된 주형 핵산을 상기 중합효소에 결합시켜 주형 핵산, 프라이머 및 중합효소의 핵산-중합효소 복합체(nucleic acid-polymerase complex)를 형성한다. 이어서, 상기 복합체 중에서, 중합효소 및 프라이머가 각각 AFM의 캔틸레버 팁에 부착되도록 한다. 부착은, 당분야에 공지된 다양한 링커를 사용할 수 있으며, 상기 링커는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 디석신이미딜 카보네이트(disuccinimydil carbonate), 디메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate), 디석신이미딜 글루타레이트(disuccinimidyl glutarate) 등을 포함할 수 있다. 부착은 캔틸레버의 팁에 존재하는 아민기와 프라이머의 5 말단에 결합시킨 아민기 또는 중합효소에 존재하는 아민기의 결합을 통해 이루어진다. 또한 부착을 보다 용이하게 하기 위하여, 선택적으로 캔틸레버의 팁에 덴드론 분자(dendron molecule)인 나노콘(nanocone)을 미리 부착시킨 후 사용할 수 있다. 구체적으로, 나노콘의 정점(apex)에는 아민기가 존재하므로, 중합효소와 프라이머가 각각 아민-아민 결합을 통해 부착될 수 있다. 또한, 나노콘을 사용한 경우 캔틸레버의 팁에 부착될 분자가 표면에 비특이적으로 흡착되는 것을 최소화하고 고정되는 분자 간의 간격을 조절할 수 있기 때문에, 고정된 중합효소 및 프라이머의 간격을 조절하여 활성 공간을 보장할 수 있어서, 단일 분자의 관찰과 조작에 더욱 유리하다.

상기 주형 핵산과 분석하고자 하는 핵산이 서로 상이한 경우, 상술한 중합효소와 프라이머의 부착이 완료된 후, 주형 핵산을 씻어내는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 이때 사용한 주형 핵산은 캔틸레버의 팁에 중합효소 및 프라이머를 부착하기 위하여 사용된 것이므로, 프라이머가 유니버설 프라이머(universal primer)인 경우이거나, 또는 부착을 위해 사용된 핵산의 서열이 분석하고자 하는 핵산의 서열과 프라이머 결합 부분을 제외하고는 상이한 경우, 세정을 통해 제거되는 단계를 거쳐야 한다. 그 후, 서열 분석을 하고자 하는 핵산을 도입하여 혼성화시킴으로써 염기 서열 분석을 시행할 수 있다.

본 발명에 따르는 핵산 서열 분석 방법에서는, 캔틸레버의 팁에 중합효소와 프라이머를 각각 부착시킴으로써 중합효소의 서열 인식 및 합성의 진행성(processivity)을 높이고, 서열 인식의 오류(error)를 줄일 수 있다. 즉, 중합효소는 주형 핵산과 중합 과정에서 자연스럽게 분리될 수 있는데, 분리 후 다시 주형 핵산과 결합하여 중합 과정을 이어나갈 수 있다. 그러나 이러한 분리 및 결합 과정이 반복되다 보면, 중합 효소가 핵산과 분리된 후 서로의 거리가 멀어지게 되어 결합까지 지나치게 시간이 오래 걸리거나 아예 결합이 안 되는 경우가 발생할 수 있으며, 서열 분석 중인 주형 핵산이 아닌 새로운 핵산이 대신 결합할 수도 있다. 이는 염기 서열을 분석하는 측면에서, 길수록 분리 후 재결합이 어려울 수 있으므로 분석 가능한 핵산 서열 길이를 제한하는 요소가 되며, 여러 개의 핵산 가닥이 용액에 존재할 경우 서열 분석에 치명적인 오류를 일으킬 수 있다.

이어서, 본 발명에 따르는 핵산 서열 분석은 상기 캔틸레버 팁이 기판에 종류별로 고정된 dNTP 구역 통과시 발생되는 신호를 읽어 주형 핵산의 서열에 따라 상보적인 dNTP를 인식하는 단계; 상기 인식된 서열에 따라 상보적인 dNTP를 상보적인 염기 서열로 합성하는 단계; 상기 중합효소가 표적 핵산의 다음 위치로 이동하는 단계; 및 상기 인식, 합성, 이동 단계를 표적 핵산의 염기 서열 분석이 끝날 때까지 반복하는 단계를 통해 이루어지는데, 이때 인식 및 합성이 같은 소에서 이루어질 수 있고, 또는 분리되어 이루어질 수 있다.

서열 인식 및 합성이 동일한 공간에서 이루어지는 것은 도 6에 예시되어 있다. 도 6을 참고하면, 기판에 구역이나 패턴으로 상이한 종류의 dNTP, 여기서는 구체적으로 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 구분되게 부착되어 있어, 인식과 동시에 합성이 이루어진다. 예를 들어, 상술한 4가지 종류의 dNTP가 고정된 구역을 각각 스캔하여 상보적인 염기를 결정한 후, 상보적인 염기의 편입을 위해, 상보적인 염기가 고정된 구역에서 AFM을 force-clamp 모드로 작동하면서, 0 pN에서 10초 동안 대기하도록 설정할 수 있다. 또한, 도 6의 4번 그림에서 볼 수 있듯이, 기판에서 부착되어 있던 dNTP에서 α 인산염과 β 인산염 사이의 결합이 끊어지면서 해당 염기와 α 인산염이 합성되는 DNA 가닥에 편입(incorporation)되는 것을 확인할 수 있다.

다르게는, 도 7에 예시된 바와 같이, 서열 인식 및 합성이 분리되어 이루어질 수 있다. 즉, 상술한 방법에 따라 AFM 장치 내에서 주형의 DNA 서열 상의 염기와 기판 상에 부착된 dNTP의 염기와 상보적인 상호작용을 통해 편입될 염기를 인식한 후에, 해당 dNTP가 종류별로 존재하는 별도의 AFM 용액 챔버로 이동하여 편입되도록 배양한다. 그 후, 다시 인식을 위한 기판으로 돌아와서, 다음 염기 서열을 인식이 이루어지고 해당 염기 서열에 맞추어 용액 내에서 합성이 이루어지도록 반복하는 방법이다. 이러한 과정은 컴퓨터 장치 등을 통하여 제어될 수 있다.

한편, 본 발명에 따르는 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법을 사용하여 염기 서열 분석의 정확도를 높일 수 있는데, 그 원리는 하술될 실시예 3의 실제 결과를 나타내는 도 8에 예시된다. 즉, 원자힘 현미경을 이용하여 캔틸레버의 팁에 부착된 중합효소와 이에 결합된 DNA를 포함한 복합체를 4개의 dNTP가 각각 분리되어 부착된 4개의 구역에서 탐침의 접근과 후퇴를 여러 번 반복하도록 설정하여 가장 높은 인식율을 가진 염기쌍으로 상보적인 염기 서열을 결정함으로써, 서열 인식의 오류를 줄일 수 있다. 도 8에는 편의상 dATP와 dGTP만 표시되어 있으나, 기판 상에는 4개의 dNTP가 각각 분리되어 부착된 4개의 구역이 모두 존재하며, 해당 구역 상에서 일치에 해당되는 상호작용이 일어나는 정도를 측정하여, 표적 핵산에 상보적인 정확한 염기쌍을 찾을 수 있다. 특히, 상술한 방법은 하나의 신호를 분석하여 4종류의 염기 중 어느 것에서 기인하는 신호인지를 알아내는 것이 아니라 염기의 편입 이전에 4종류의 염기와 결합을 각각 모두 확인하여 상보적인 염기가 무엇인지 알아낼 수 있는 방법이므로, 오류의 확률이 매우 낮다.

이하, 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 예시하기 위한 것으로, 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예

실시예 1

원자힘 현미경(AFM)은 JPK 사의 모델명: 포스로봇(ForceRobot) 300을 사용하였다. 우선, AFM의 캔틸레버 팁 상에 20% 질산 용액을 이용한 하이드록실기 생성과 N-(3-(트라이에톡시실릴)-프로필)-O-폴리에틸렌옥사이드 우레탄 박막 제조를 통해 3세대 덴드론 분자를 부착하였다.

이어서, 하기에 기재된 서열의 프라이머(primer)로서 바이오니아(Bioneer, 대한민국)에서 주문 제작하여 입수한 5' 아민기가 T20 페이서를 통해 연결된 20-mer DNA를, 주형 핵산(template nucleic acids)이자 표적 핵산으로서 역시 바이오니아에서 주문 제작하여 입수한 50-mer DNA를 각각 사용하였다.

프라이머(DNA): 5'-NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGTGCTCATCATAGTAACC-3'(T20; 스페이서, 밑줄 친 부분이 핵산과 결합하는 부분)

표적 핵산(DNA): 5'-TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGGTTACTATGATGAGCACGGGCGGCACTGA-3'(밑줄 부분이 프라이머가 결합되는 서열).

상기 두 핵산을 동일하게 10 μM로 중탄산나트륨 버퍼에 섞은 후 95 ℃에서 3분간 배양하고 상온으로 천천히 식혀서 dsDNA를 형성하도록 두었다. DNA 중합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)의 상품명 써미네이터(Therminator) DNA 폴리머레이즈(polymerase))는 보관 용액을 중탄산나트륨 버퍼로 치환한 후, 상기 형성된 dsDNA와 함께 동일하게 각각 1 μM씩로 1 시간 동안 상온에서 배양하여, 핵산-중합효소 복합체(nucleic acid-polymerase complex)를 형성하였다. 상기 복합체가 포함된 용액에 3세대 나노콘(덴드론 분자)이 부착되고 링커 분자 디석신이미딜 카보네이트(disuccinimydil carbonate)가 도입된 캔틸레버의 팁을 담그고 2 시간 동안 상온에서 배양함으로써, 중합효소와 프라이머가 각각 인접한 나노콘에 부착되었다.

이어서, AFM을 사용하여 4종류의 dNTP가 고정된 구역에서 스캐닝하여 프라이머 다음에 위치하는 표적 DNA의 상보적인 염기를 확인한다. 이후 확인된 염기를 편입시키기 위해서 force-clamp 모드로 작동하면서 0 pN에서 10초 정도 대기하여 편입하였다. 해당 결과를 컴퓨터 처리 장치에서 수신하여 표적 핵산의 염기 서열 정보를 분석을 완료하였다. 상술한 방식으로 표적 DNA의 염기서열 확인 및 편입을 실시하고 DNA 중합효소가 다음 염기로 이동한 후 같은 과정을 반복하여, 해당 염기 서열 분석을 완료하였다.

실시예 2

주형 핵산을 씻어낸 후, 별도의 상이한 표적 핵산을 도입하는 방법으로서, 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTACTATGATGAGCACGGGCGGCACTGA-3'(밑줄 친 부분은 프라이머임)를 주형 핵산으로 사용하고 중합효소와 프라이머를 캔틸레버 팁에 부착한 후 70℃에서 PBST(phosphate buffered saline, 0.05% tween 20)를 사용하여 30분 동안 씻어내고, 5'-ACAGAGACCAGAACCGAACTGGTTACTATGATGAGCACGGGCGGCACTGA-3'(밑줄 친 부분은 프라이머임)를 표적 핵산으로 사용하여 혼성화하여 준비한 점을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 핵산 서열 분석을 완료하였다.

실시예 3

실시예 1과 동일하게 AFM으로 4 종류의 dNTP가 고정된 구역을 각각 스캐닝하여 상보적인 염기를 인식하게 하였다. 상보적인 염기 인식 후, 캔틸레버 팁을 상보적인 염기가 1 mM의 농도로 존재하는 반응 버퍼(20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 5 mM MgSO₄, 0.02% IGEPAL CA-630 (v/v), pH 9.2)로 이동시켜 상온에서 5분 동안 담그어 해당 염기의 편입시키고, 상보적인 염기가 고정된 구역에서 스캐닝을 다시 실시하여 염기의 편입이 이뤄졌는지 확인하였다. 이를 반복하여 표적 핵산의 염기 서열을 분석하였다. 해당 결과를 컴퓨터 처리 장치에서 수신하여 표적 핵산의 염기 서열 정보를 분석을 완료하였다. 그 초기 5개의 결과를 도 8에 개시하였다. 도 8에 예시된 바와 같이, 연속적인 5개의 시토신과 티민이 반복적으로 나타나는 경우도 한 번의 오류도 없이 구분될 수 있다. 또한 시도한 조건에서 상보적인 염기의 편입도 성공적으로 일어난 것으로 확인되었다.

Claims (10)

1. 원자힘 현미경(AFM, atomic force microscope)의 캔틸레버 팁(cantilever tip)에 중합효소(polymerase) 및 프라이머(primer)가 각각 부착되고, 상기 중합효소 및 상기 프라이머와, 분석하고자 하는 핵산이 결합되어 핵산-중합효소 복합체(nucleic acid-polymerase complex)를 형성하는 단계;
   상기 캔틸레버 팁이 기판에 고정된 dNTP 구역 통과시 발생되는 신호를 읽어 핵산의 염기 서열에 따라 상보적인 dNTP를 인식하는 단계;
   상기 인식된 상보적인 dNTP를 염기 서열로 합성하는 단계;
   상기 중합효소가 표적 핵산의 다음 위치로 이동하는 단계; 및
   상기 인식, 합성, 이동 단계를 핵산의 염기 서열 분석이 완료될 때까지 반복하는 단계를 포함하는 AFM을 이용한 핵산의 염기 서열 분석 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   원자힘 현미경의 캔틸레버 팁에 중합효소 및 프라이머가 각각 부착되고, 상기 중합효소 및 프라이머와 분석하고자 하는 핵산이 결합되어 핵산-중합효소 복합체를 형성하는 방법은,
   프라이머가 결합된 주형 핵산을 중합효소에 결합시켜 핵산-중합효소 복합체를 형성하는 단계; 및
   상기 복합체에서 중합효소 및 프라이머가 AFM의 캔틸레버 팁에 각각 부착되는 단계를 포함하는 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
3. 제 2 항에 있어서,
   주형 핵산과 분석하고자 하는 핵산이 서로 상이한 경우,
   상기 부착 단계 후, 주형 핵산을 씻어내는 단계; 및
   분석의 대상이 되는 핵산을 첨가하는 단계를 더욱 포함하는 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 캔틸레버 팁에 덴드론 분자(dendron molecular)를 추가적으로 부착하여 중합효소 및 프라이머의 부착을 매개하는 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 덴드론 분자(dendron molecular)는 3세대 덴드론 분자인 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 기판에는 dNTP가 종류별로 구분되어 배열되어 있는 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 기판에 덴드론 분자(dendron molecular)를 추가적으로 부착하여 dNTP의 고정을 매개하는 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 덴드론 분자(dendron molecular)는 3세대 덴드론 분자인 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 합성 단계는 상기 인식 단계와 동일한 공간에서 이루어지는 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.
10. 제 1 항에 있어서,
    상기 합성 단계는, 상기 인식 단계의 기판과 분리된 단일 dNTP 용액 내에서 이루어지는 것인 AFM을 이용한 표적 핵산의 염기 서열 분석 방법.

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