JP2007267644A - 単位塩基の繰り返し回数の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】標的核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を、簡便且つ高精度で測定する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】標的核酸が有し得る繰り返し回数がA又はB(ここで、A<B)であり、(B−A)/B<0.20である場合に、前記標的核酸配列中の繰り返し領域及びその隣接領域の配列と相補的な配列を有し、且つ、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブ[ここで、p及びsは、0.20≦{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数である]を用いることを特徴とする、単位塩基の繰り返し回数を測定する方法を提供する。
【選択図】 図2
【解決手段】標的核酸が有し得る繰り返し回数がA又はB(ここで、A<B)であり、(B−A)/B<0.20である場合に、前記標的核酸配列中の繰り返し領域及びその隣接領域の配列と相補的な配列を有し、且つ、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブ[ここで、p及びsは、0.20≦{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数である]を用いることを特徴とする、単位塩基の繰り返し回数を測定する方法を提供する。
【選択図】 図2
Description
本発明は、核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を測定する方法に関する。
近年、個人の遺伝子配列を解析し、遺伝子多型を判別することが様々な分野で応用されている。例えば医療分野では薬物に対する反応性を予測し、また法医学の分野では個人の識別や証拠サンプルと容疑者との照合を行うことが可能となっている。現在有用とされている遺伝子多型は2種類あり、一つはDNA配列中の1ヶ所の塩基が他の塩基で置換された一塩基多型である。もう一つは2〜数十塩基からなる単位塩基が数回から数十回繰り返す、「繰り返し配列」における単位塩基の繰り返し回数であり、サテライト多型と呼ばれるものである。この繰り返し回数は個体ごとに異なるため、種々の解析に都合よく用いることができる(例えば特許文献1)。
サテライト多型については、例えば医療分野において、UGT1A1遺伝子中に繰り返される単位塩基の繰り返し回数を検出することで、イリノテカン投与に対する副作用が予測されている。また法医学の分野においては、15領域のマイクロサテライト多型の繰り返し回数を判別することにより、個人を識別したり、証拠サンプルと照合したりする手法が標準化されている。
このような多型の測定には、DNAチップ等のマイクロアレイが好適に用いられる。従来、繰り返し回数を識別するためのDNAチップには、検出すべき標的核酸と同じ繰り返し回数を有する核酸プローブを用いていた。
しかしながら、標的核酸の繰り返し回数が、核酸プローブの繰り返し回数と異なる場合であっても、過剰分の塩基がループアウトして結合する場合がある。この場合の結合力は、標的核酸と核酸プローブの繰り返し回数が同じである場合の結合力と同程度である場合もあり、そのため、繰り返し回数の判定が困難であるという問題があった。
特表平11−503019
上記問題に鑑み、本発明は、標的核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を、簡便且つ高精度で測定する方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明は、標的核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を測定する方法であって、核酸プローブを調製する工程と、前記調製された核酸プローブを基体に固定する工程と、前記基体に固定された核酸プローブと、前記標的核酸とのハイブリダイゼーションを行う反応工程と、前記反応工程において核酸プローブと結合した標的核酸を検出する工程と、前記検出工程で得られた結果から、前記標的核酸の繰り返し回数を判定する工程とを具備し、前記標的核酸が有し得る繰り返し回数がA又はB(ここで、A<B)であり、(B−A)/B<0.20である場合に、前記核酸プローブが、前記標的核酸配列中の繰り返し領域及びその隣接領域の配列と相補的な配列を有し、且つ、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブである[ここで、p及びsは、0.20≦{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数である]ことを特徴とする測定方法を提供する。
ここで、前記繰り返し回数を判定する工程は、前記第一の核酸プローブから得られる結果と、前記第二の核酸プローブから得られる結果を比較することにより、標的核酸が有する繰り返し回数を判定する工程であることが好ましい。また、前記標的核酸が3種以上の異なる繰り返し回数を有し得る場合に、任意に選択される2種から成る組合せの全てにおいて、請求項1に記載の条件が満たされることが好ましい。
前記核酸プローブは、前記基体に設けられた電極に固定化され、該核酸プローブに結合した標的核酸は電気化学的に検出されることが好ましい。
また、本発明の他の側面から、繰り返し回数の測定方法に用いるための、上記のような核酸プローブが固定された核酸プローブ固定化基体が提供される。
本発明に拠れば、標的核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を、簡便且つ高精度で測定することが可能であり、またさらに、該測定方法のための核酸プローブ固定化基体を提供することができる。
本発明は、標的核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を測定する方法を提供する。本発明において「繰り返し領域」とは、ゲノムDNA配列中に存在する、単位塩基が繰り返される配列部分を意味するように意図される。ここで、「単位塩基」とは、繰り返しの単位と成る塩基であって、数個から数十個の塩基から成る配列を意味するように意図される。例えば、ミニサテライト多型における単位塩基は十数〜数十塩基であり、マイクロサテライト多型における単位塩基は2〜4塩基であるが、単位塩基に含まれる塩基の数はこれらに限定されない。
本発明で測定される「繰り返し回数」とは、上記の繰り返し領域に含まれる単位塩基の数、即ち単位塩基が繰り返す回数を意味する。繰り返し回数は個体によって異なるため、測定された繰り返し回数は医療分野や法医学の分野で有効に利用することができる。
ゲノムDNAには繰り返し領域が多く含まれるが、繰り返し回数を測定する領域は任意に決定すればよい。現在のDNA鑑定などでは、特定の領域(STR:マイクロサテライトの1種で単位塩基が4塩基のもの)を中心に利用されているが、個体識別や疾病関連の調査などの種々の目的に従って決定すればよい。
本発明において「標的核酸」とは、繰り返し領域を有する核酸であって、その繰り返し回数の測定が望まれる核酸を意味する。標的核酸は、繰り返し領域と、その隣接領域(即ち、その上流及び下流の領域)の配列を有し、その配列を標的配列とも称する。
標的核酸は、標的核酸を含む試料溶液として用いる。検体から採取した核酸をそのまま用いてもよいが、例えばPCR、LAMP、ICAN等の手法によって、標的配列部分を予め増幅して標的核酸としてもよい。このとき、標的核酸の長さは任意に決定すればよいが、例えば30〜500bp程度の長さにしてもよい。標的核酸の長さは、プライマーを適宜設計することで調節することができる。
標的核酸は、直鎖状構造、或いはループ構造の何れの構造を有してもよい。標的核酸の長さや構造を適切に選択することにより、核酸プローブとのハイブリダイゼーションの効率を上昇させることができる。
本発明の測定方法では、標的配列を検出するために、該標的核酸と相補的な配列を有する核酸プローブを用いる。この核酸プローブは、下記の条件に従って調製し、基体に固定して用いる。このようにして核酸プローブが固定された基体に、標的核酸を含み得る試料溶液を適用し、核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーションを行う。この反応において核酸プローブに結合した核酸が、所望の配列を有する標的核酸である。何れの核酸プローブに結合したかを検出することによって、標的核酸が有する繰り返し回数を判定することができる。
核酸プローブは、基体に設けられた電極に固定化されることが好ましい。電極を用いることによって、核酸プローブに結合した標的核酸を電気化学的に検出することが可能である。一つの電極には単一の核酸プローブが固定されるが、同じ基体に複数の電極が備えられても良い。
核酸プローブの長さは、基体に固定し、ハイブリダイズするのに適切な長さを適宜選択してよく、標的核酸より短くても良い。例えば、約3〜約1000bpであってよく、好ましくは約10〜約200bpであってよい。
本発明で用いる核酸プローブは、前記標的核酸配列中の繰り返し領域及びその隣接領域の配列と相補的な配列を有するように調製する。ここで「相補的」とは、50%〜100%の範囲で相補的であることを意味する。ただし、繰り返し領域における配列については、次に記載する条件に従う。
本発明は、標的核酸が有し得る繰り返し回数をA又はB(ここで、A<B)としたとき、(B−A)/B<0.20である場合に有利な効果を有するものである。核酸プローブは、上記したように標的核酸の繰り返し領域及びその隣接領域の配列と相補的な配列を含む。しかしながら、繰り返し領域の部分は完全に相補的な配列ではなく、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブ[ここで、p及びsは、0.20≦{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数である]とする。第一の核酸プローブ、及び第二の核酸プローブは、それぞれ一種であってもよいが、二種以上であってもよい。
ここで、標的核酸が有する繰り返し回数が6又は7である場合を例にとり、図面を用いて説明する。図1は、従来の測定方法の概要を示した図である。従来は、標的核酸と同じ繰り返し回数を有する核酸プローブを用いていた。即ち、繰り返し回数が6である核酸プローブと、7である核酸プローブを用い、標的核酸とのハイブリダイゼーションを行っていた。
しかしながら、図2に示したように、標的核酸と核酸プローブの繰り返し回数が異なっていても、過剰分の塩基がループアウトして結合し得ることがある。このとき、繰り返し回数が異なる核酸同士の結合力は、標的核酸と核酸プローブの繰り返し回数が同じである核酸同士の結合力と比較すると減少している。しかし、その減少程度はわずかであり、したがって検出されるシグナルもわずかに減少するに留まる。このときに検出されるシグナルの模式図を図5(a)に示した。
図5(a)は、繰り返し回数が6と7の標的核酸を、繰り返し回数が6と7の核酸プローブで検出した場合の図である。繰り返し回数が6の標的核酸は、繰り返し回数が6の核酸プローブに多く結合しているが、繰り返し回数が7の核酸プローブにも多く結合しており、その差はわずかである。同様に、繰り返し回数が7の標的核酸は、繰り返し回数が7の核酸プローブに多く結合しているが、繰り返し回数が6の核酸プローブにも多く結合しており、その差はわずかである。よって、従来の方法では、標的核酸が有する繰り返し回数を判定することは困難である。
一方、本発明の方法では、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブ[ここで、p及びsは、0.20≦{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数である]を用いる。ここで、A及びB(ここで、A<B)は、標的核酸が有する繰り返し回数であり、この例においては6及び7である。また、p=1、及びs=1とする。
以上の条件から、図3に示したように、第一の核酸プローブは繰り返し回数が5の核酸プローブであり、第二の核酸プローブは、繰り返し回数が8の核酸プローブである。なお、理解を容易にするために、繰り返し回数が6及び7である核酸プローブの図も記載してある。
以上の4種類の核酸プローブを用いて標的核酸をハイブリダイズさせた場合の模式図を図4に例示する。図2と同様に、繰り返し回数が等しい核酸同士の場合の結合力を基準とすると、繰り返し回数が8の核酸プローブと、繰り返し回数が6の標的核酸が結合した場合は、結合力が著しく低下する。また、繰り返し回数が5の核酸プローブと、繰り返し回数が7の標的核酸が結合した場合も、同様に結合力が著しく低下する。このときに検出されるシグナルの模式図を図5(b)に示した。
図5(b)は、繰り返し回数が6と7の標的核酸を、繰り返し回数が3〜10の核酸プローブで検出した場合の図である。ここで、繰り返し回数が6である標的核酸についてみると、繰り返し回数が8である核酸プローブと比較して、繰り返し回数が5である核酸プローブにより多く結合している。この差は、繰り返し回数が6と7の核酸プローブの間の差と比べてより顕著である。
一方、繰り返し回数が7である標的核酸についてみると、繰り返し回数が5である核酸プローブと比較して、繰り返し回数が8である核酸プローブにより多く結合している。この差は、繰り返し回数が6と7の核酸プローブの間の差と比べてより顕著である。
従って、ここで説明したように、標的核酸の繰り返し回数とは異なる繰り返し回数を有する核酸プローブを用いることによって、核酸プローブの相違によるシグナルの差異が顕著になり、繰り返し回数の判定をより明確に行ことが可能である。
このように、本発明においては、標的核酸が有する繰り返し回数を基に、上記の条件を満たす核酸プローブを用いることによって、繰り返し回数の相違による結合力の差異を明確にすることができ、測定の精度を向上させることができる。
本発明の方法に従って繰り返し回数を測定する場合、標的核酸が有し得る繰り返し回数(ここではAとB)の、絶対値における割合の差が問題となる。例えばA=6、B=7である場合、(B−A)/B=0.11であり、上記の図1及び2の例から、識別が困難である。一方、本願発明によって、p=1、s=1とすると、{(B+s)-(A-p)}/(B+s)=0.30となり、上記図3及び4の例から、識別がより明確となる。このことから、本願発明は(B−A)/B<0.20であるときに有利な効果を得ることができ、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブを用い、p及びsが、0.20≦{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数であるとすることによって、繰り返し回数を精度よく測定することが可能である。
(B-A)/Bが小さい場合、具体的には0.20未満である場合は、従来法によれば識別が困難である。しかしながら、本願発明の式{(B+s)-(A-p)}/(B+s)を適用することによって、この値を0.2以上とすることができる。即ち、識別するべき2つの繰り返し回数の差異(即ちB-A)の、より大きい繰り返し回数に対する割合(即ち(B-A)/B)を、本発明の式{(B+s)-(A-p)}/(B+s)を適用することによって大きくすることができる。
従って、本発明のA−p及びB+sの繰り返し回数を有するプローブ核酸を用いることにより、プローブ核酸と標的核酸が同じ繰り返し回数を有する場合と比較して、結合力の減少をより顕著にすることができる。そのため、結合した標的核酸の量を検出することで、標的核酸の繰り返し回数をより明確に識別することが可能である。なお、{(B+s)-(A-p)}/(B+s)の値が大きすぎる場合、即ち、BとAとの差が大きい場合には、本願発明の効果は低くなる。従って、{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50であることが好ましい。
本発明において、核酸プローブとハイブリダイズした標的核酸の検出は、任意の方法で行えばよいが、特に電気化学的な検出が好ましい。それぞれの核酸プローブに結合した標的核酸の量を、例えば電流値でもって検出することができる。そして、それぞれの核酸プローブについて検出された結果から、標的核酸の繰り返し回数を判定する。具体的には、第一の核酸プローブから得られた結果と、第二の核酸プローブから得られた結果とを比較し、より多くの標的核酸が結合したプローブに適用したA又はBの値が、標的核酸が有する繰り返し回数である。
さらに、標的核酸が3種以上の異なる繰り返し回数を有し得る場合には、そのうちの任意の二種で組合せを作り、その全ての組合せにおいて、本発明の条件を満たすように核酸プローブを調製する。
本発明において使用され得る基体は、核酸プローブが固定可能な基体であればよく、例えば非多孔性、硬質及び半硬質な材質による、ウェル、溝または平らな表面を有する板状形体、又は、球体などの立体形状を有するものであってよい。基体は、これに限定されるものではないが、シリコン、ガラス、石英ガラス、石英などのシリカ含有基材、およびポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、等のプラスチックおよびポリマーなどで製造され得る。
本発明のプローブ固定化基体は、基体に固定化された核酸プローブと標的核酸がハイブリダイズして生じた二本鎖の存在を検知するための手段として、電気化学的方法を用いることができるが、これに限定されない。
電気化学的方法により二本鎖核酸を検出する方法では、基体に電極を設け、核酸プローブはこの電極に固定される。電極は、特に限定されるものではないが、例えば、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極、Si、Ge、ZnO、CdS、TiO2、GaAsのような半導体電極、チタン等によって形成されることができる。これらの電極は導電性高分子によって被覆しても、単分子膜によって被覆してもよく、所望に応じてその他の表面処理剤を処理してもよい。
電気化学的方法による二本鎖核酸の検出は、例えば、公知の二本鎖核酸認識物質を用いて行えばよい。ここで二本鎖核酸認識物質とは、電気化学的活性を有し且つ核酸に結合する分子を意味する。二本鎖認識物質は特に限定されるものではないが、例えば、ヘキスト33258、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーターおよびポリインターカレーター等を用いることが可能である。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。また、その他の公知の二本鎖認識物質も使用可能である。
核酸プローブの固定化は、公知の手段によって行えばよい。例えば、スペーサーを電極に固定し、該スペーサーに核酸プローブを固定することによって、スペーサーを介して核酸プローブを電極に固定してもよい。または、予め核酸プローブにスペーサーを結合させ、そのスペーサーを介して電極に固定してもよい。或いは、電極上でスペーサーと核酸プローブを公知の手段によって合成してもよい。また、スペーサーを介しての核酸プローブの固定は、処理又は無処理の電極表面に対して当該スペーサーを、共有結合、イオン結合又は物理吸着などによって直接固定化してもよい。或いは、スペーサーを介した核酸プローブの固定を助けるリンカー剤を用いても良い。また、電極に対する被検核酸の非特異的な結合を防止するためのブロッキング剤をリンカー剤と共に電極に処理しても良い。また、ここで使用されるリンカー剤及びブロッキング剤は、例えば、電気化学的検出を有利に行うための物質であってもよい。
さらに、他の一般的な電気化学的検出法と同じように、対極および/または参照極を基体に備えてもよい。参照極を設置する場合、例えば、銀/塩化銀電極や水銀/塩化水銀電極などの一般的な参照極を使用することができる。
本発明に従った繰り返し回数の測定は、例えば以下のように行うことができる。
まず、ヒトを含む動物などの個体、組織または細胞などの対象から採取した試料より、核酸成分を試料核酸として抽出する。得られた試料核酸は、必要に応じて、逆転写、伸長、増幅および/または酵素処理などの処理をしてもよい。必要に応じて前処理された試料核酸を、核酸プローブ固定化基体に固定化された核酸プローブと接触させ、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応させる。そのような適切な条件は、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブ固定化基体に具備されるスペーサーおよび核酸プローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。
まず、ヒトを含む動物などの個体、組織または細胞などの対象から採取した試料より、核酸成分を試料核酸として抽出する。得られた試料核酸は、必要に応じて、逆転写、伸長、増幅および/または酵素処理などの処理をしてもよい。必要に応じて前処理された試料核酸を、核酸プローブ固定化基体に固定化された核酸プローブと接触させ、適切なハイブリダイゼーションが可能な条件下で反応させる。そのような適切な条件は、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブ固定化基体に具備されるスペーサーおよび核酸プローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。
ハイブリダイゼーション反応は、例えば次のような条件下で行ってもよい。
ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中を用いる。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子DNA、牛胸腺DNA、EDTAおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、90℃以上で熱変性させる。この溶液中に、核酸の変性直後、あるいは0℃に急冷後に核酸プローブ固定化基体を挿入する。或いは、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
ハイブリダイゼーション反応溶液は、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液中を用いる。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストラン、並びに、サケ精子DNA、牛胸腺DNA、EDTAおよび界面活性剤などを添加してもよい。ここに得られた試料核酸を添加し、90℃以上で熱変性させる。この溶液中に、核酸の変性直後、あるいは0℃に急冷後に核酸プローブ固定化基体を挿入する。或いは、基体上に液を滴下することでハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。
反応中は、撹拌、あるいは振盪などの操作で反応速度を高めてもよい。反応温度は、例えば、10℃〜90℃の範囲で、反応時間は1分以上1晩程度で行えばよい。ハイブリダイゼーション反応後、電極を洗浄する。洗浄液は、例えば、イオン強度0.01〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いる。試料核酸中に標的配列を含む標的核酸が存在した場合、核酸プローブとハイブリダイズし、基体上に二本鎖核酸が生じる。
続いて、電気化学的手段により二本鎖核酸の検出を行う。検出手順は一般に、ハイブリダイゼーション反応後に基体を洗浄し、電極表面に形成された二本鎖部分に二本鎖認識物質を作用させて、それにより生じる信号を電気化学的に測定する。
二本鎖認識物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には1ng/mL〜1mg/mLの範囲で使用する。この際は、イオン強度0.001〜5の範囲で、pH5〜10の範囲の緩衝液を用いればよい。
電気化学的測定は、例えば、二本鎖認識物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、二本鎖認識物質に由来する反応電流値を測定することによって可能である。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してもよい。測定の際に、例えば、ポテンショスタット、デジタルマルチメーターおよびファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御してもよい。さらに、得られた電流値を基に、検量線から標的核酸の濃度を算出してもよい。得られた結果を比較し、標的核酸がより多く結合している核酸プローブを決定する。これによって、標的核酸に含まれる繰り返し回数を判定する。
また、本発明の他の側面から、繰り返し回数の測定方法に用いるための、核酸プローブ固定化基体が提供される。本発明における核酸プローブ固定化基体は、上述した核酸プローブが基体に固定されたものである。本発明の核酸プローブ固定化基体は、任意の形状であってよいが、基板状の基体が好適に用いられ、ここではアレイ或いはチップとも称することができる。
なお、本明細書で使用される「核酸」という用語は、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、ペプチド核酸(PNA)、メチルフォスホネート核酸、S−オリゴ、cDNA及びcRNA等、並びに何れのオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド等、核酸及び核酸類似体を総括的に示す語である。また、そのような核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。ここで核酸配列は、ゲノムDNA配列であってもよく、またゲノム全体が確保されない断片的な配列であってもよい。
本発明の方法に従う単位塩基の繰り返し回数の測定方法は、例えば薬効判定(薬物投与時の効果や副作用など)、個体識別(本人であることを確認するための本人認証、親子鑑定等)のために用いることもできるが、これらに限定されない。個体識別とは、個体が有する核酸配列と、試料とする核酸配列との一致を判定することを意味する。例えば、犯罪捜査において残留血痕や毛髪などの遺留品が、被疑者や被害者等のものであるかを特定するために用いられることができる。したがって、試料とする核酸配列は、それらの残留物等に含まれる核酸であってよいが、これらに限定されない。なお、その対象は、好ましくはヒトであるが、その他に家畜やペット等、或いは栽培植物や野生植物を含んでもよい。個体識別は、本発明の方法によって決定された繰り返し回数を、サンプル間で比較し、両者が一致するか否かを判定することによって行うことができる。
以下、単位塩基が2塩基(TA)であり、繰り返し回数が8及び9である標的核酸を検出する例を記載する。
<標的核酸配列>
以下の配列を有する核酸鎖を標的核酸とする。
<標的核酸配列>
以下の配列を有する核酸鎖を標的核酸とする。
5’GGAATCAGCTGCCCAGATACAAAGATGGGATTCAGGTGGCAGATGGACCC[TA]nGAAGAGGACATGGAGAGAAAGAGGAAGCTCCTACAGACAC3’
ここで、n=8 (配列番号1)又はn=9(配列番号2)である。
ここで、n=8 (配列番号1)又はn=9(配列番号2)である。
<核酸プローブ>
標的核酸の繰り返し領域とその周辺領域を含む配列に対して相補的な配列を持つ核酸プローブを以下のように設定した。
標的核酸の繰り返し領域とその周辺領域を含む配列に対して相補的な配列を持つ核酸プローブを以下のように設定した。
5’ CATGTCCTCTTC[TA]nGGGTCCATCTG 3’ (配列番号2)
ここで、n=5、6,7,8,9,10、11又は12である(それぞれ、配列番号3〜10)。なお、ここでn=8及び9は従来技術にあるプローブ、n=5〜7及び10〜12は、本発明に従って用いる核酸プローブである。
ここで、n=5、6,7,8,9,10、11又は12である(それぞれ、配列番号3〜10)。なお、ここでn=8及び9は従来技術にあるプローブ、n=5〜7及び10〜12は、本発明に従って用いる核酸プローブである。
<支持体(DNAチップ)>
本実施例では基体に金電極を作製して使用し、複数の金電極が一枚のガラス基板上に配置されているDNAチップ用電極基板を作製した。このDNAチップ用電極基板には、プローブを固定する作用極の他に、参照極、対極、及び各電極に配線され、電流値を検出するための電極パットが配置されている。
本実施例では基体に金電極を作製して使用し、複数の金電極が一枚のガラス基板上に配置されているDNAチップ用電極基板を作製した。このDNAチップ用電極基板には、プローブを固定する作用極の他に、参照極、対極、及び各電極に配線され、電流値を検出するための電極パットが配置されている。
<核酸プローブ固定化電極の作製>
上記核酸プローブ配列の3’末端にチオール(SH)基を修飾し、これを含む溶液を核酸プローブ溶液とした。各種核酸プローブ溶液を上記DNAチップに配置されている各電極に滴下して放置し、各種核酸プローブを各電極に固定した。
上記核酸プローブ配列の3’末端にチオール(SH)基を修飾し、これを含む溶液を核酸プローブ溶液とした。各種核酸プローブ溶液を上記DNAチップに配置されている各電極に滴下して放置し、各種核酸プローブを各電極に固定した。
<標的核酸の検出>
標的核酸を含む溶液を上記核酸プローブ電極が覆われるように添加して放置し、標的核酸を核酸プローブに結合(ハイブリダイズ)させた。その後、非特異的に吸着、結合している標的核酸を除去するため、適当な緩衝液で洗浄した。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。ここで作用極に対して電位を掃引し、挿入剤を酸化させて電流値を検出した。
標的核酸を含む溶液を上記核酸プローブ電極が覆われるように添加して放置し、標的核酸を核酸プローブに結合(ハイブリダイズ)させた。その後、非特異的に吸着、結合している標的核酸を除去するため、適当な緩衝液で洗浄した。洗浄用緩衝液を除去したあと、核酸に結合する挿入剤としてヘキスト33258を添加した。ここで作用極に対して電位を掃引し、挿入剤を酸化させて電流値を検出した。
標的核酸溶液の添加、設定温度での放置、洗浄用緩衝液の添加、設定温度での放置、挿入剤の添加、電流検出、各電極から得られる電流値の比較は、これらに必要な送液制御系、温度制御系、ポテンシオスタットを含む自動検出装置、および各部の制御及び電流値の比較から繰り返し回数を判別するソフトウェアを使用して行った。
<結果>
各核酸プローブ固定化電極から得られた電流値を、図6に示した。繰り返し回数が8又は9である標的核酸に対し、従来技術のとおり、繰り返し回数が同じであるプローブ(8、9)を使用した場合、標的核酸に依存した電流値の差異が認められたものの、その差はわずかであった。
各核酸プローブ固定化電極から得られた電流値を、図6に示した。繰り返し回数が8又は9である標的核酸に対し、従来技術のとおり、繰り返し回数が同じであるプローブ(8、9)を使用した場合、標的核酸に依存した電流値の差異が認められたものの、その差はわずかであった。
一方、本発明に従った繰り返し回数を有するプローブ(7、10)を使用した場合、標的核酸に依存した電流値の差異が認められ、その差は、従来法によるプローブ(8,9)を使用した場合と比較して大きかった。
このように、標的核酸に対して完全に相補的なプローブではなく、標的核酸中の繰り返し回数と異なる繰り返し回数を有する核酸プローブを使用することにより、標的核酸中に存在する繰り返し回数をより明確に測定することが可能である。
Claims (8)
- 標的核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を測定する方法であって、
核酸プローブを調製する工程と、
前記調製された核酸プローブを基体に固定する工程と、
前記基体に固定された核酸プローブと、前記標的核酸とのハイブリダイゼーションを行う反応工程と、
前記反応工程において核酸プローブと結合した標的核酸を検出する工程と、
前記検出工程で得られた結果から、前記標的核酸の繰り返し回数を判定する工程とを具備し、
前記標的核酸が有し得る繰り返し回数がA又はB(ここで、A<B)であり、(B−A)/B<0.20である場合に、前記核酸プローブが、前記標的核酸配列中の繰り返し領域及びその隣接領域の配列と相補的な配列を有し、且つ、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブである[ここで、p及びsは、0.20≦ {(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数である]ことを特徴とする測定方法。 - 前記繰り返し回数を判定する工程は、前記第一の核酸プローブから得られる結果と、前記第二の核酸プローブから得られる結果を比較することにより、標的核酸が有する繰り返し回数を判定する工程である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が3種以上の異なる繰り返し回数を有し得る場合に、任意に選択される2種から成る全ての組合せにおいて、請求項1に記載の条件が満たされることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記核酸プローブが、前記基体に設けられた電極に固定化され、該核酸プローブに結合した標的核酸を電気化学的に検出することを特徴とする、請求項1〜3の何れか一項に記載の方法。
- 前記電気化学的な検出は、電気化学的活性を有し且つ核酸に結合する分子を、核酸プローブと標的核酸からなる二本鎖核酸に結合させ、その酸化還元反応により得られる電流値を検出することによって行うことを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 標的核酸配列中の繰り返し領域が有する、単位塩基の繰り返し回数を測定するための核酸プローブ固定化基体であって、
前記標的核酸が有し得る繰り返し回数がA又はB(ここで、A<B)であり、(B−A)/B<0.20である場合に、前記標的核酸配列中の繰り返し領域及びその隣接領域の配列と相補的な配列を有し、且つ、A−pの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第一の核酸プローブ、及び、B+sの値から選択される繰り返し回数を有する少なくとも一つの第二の核酸プローブ[ここで、p及びsは、0.20≦{(B+s)-(A-p)}/(B+s)≦0.50を満たす自然数である]が、基体に固定されたことを特徴とする核酸プローブ固定化基体 - 前記核酸プローブが、前記基体に設けられた電極に固定されることを特徴とする、請求項6に記載の核酸プローブ固定化基体。
- 前記核酸プローブ固定化基体が、DNAチップであることを特徴とする、請求項6又は7に記載の核酸プローブ固定化基体。
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WO2021100204A1 (ja) * | 2019-11-22 | 2021-05-27 | 日本電気株式会社 | Dna増幅方法、dna増幅キット及び鑑定/診断方法 |
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