WO2021100204A1 - Ｄｎａ増幅方法、ｄｎａ増幅キット及び鑑定／診断方法 - Google Patents

Ｄｎａ増幅方法、ｄｎａ増幅キット及び鑑定／診断方法 Download PDF

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dna amplification
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麻生川　稔
あすみ 稲熊
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a DNA amplification method, a DNA amplification kit, and an appraisal / diagnosis method.
  • it relates to a DNA amplification method for amplifying a DNA sequence containing microsatellite, a DNA amplification kit, and an identification / diagnosis method for performing DNA analysis and / or cancer diagnosis using a DNA amplification method.
  • Cited Document 1 discloses a technique for eliminating an adverse effect of stutter by estimating the maximum height at which a stutter peak can occur and interpreting a peak below that as a stutter peak.
  • Citation 1 is a technique premised on the occurrence of stutter. That is, if the generation of stutter can be prevented or suppressed, the adverse effect of the generation of stutter can be fundamentally eliminated, and the technique of Cited Document 1 becomes unnecessary. Therefore, it is desired to provide a technique for preventing or suppressing the generation of stutter.
  • an object of the present invention is to provide a technique that contributes to improving the accuracy of DNA testing and cancer diagnosis by preventing or suppressing the generation of stutter.
  • Steps to prepare a reaction solution containing template DNA containing microsatellite, primers, polymerase, and recombinase Steps to prepare a reaction solution containing template DNA containing microsatellite, primers, polymerase, and recombinase.
  • a DNA amplification method comprising the above is provided.
  • Polymerase, recombinase, prepared in a reaction solution for amplifying a DNA sequence containing microsatellite, A primer for amplifying the DNA sequence and A DNA amplification kit containing the above is provided.
  • the step of amplifying the DNA sequence containing the microsatellite according to the DNA amplification method of the first viewpoint The step of analyzing the repeat number of the repeat sequence by subjecting the reaction solution after the amplification reaction to electrophoresis and / or DNA sequence, and A step of performing DNA analysis and / or cancer diagnosis using the analysis result of the above analysis, and Appraisal / diagnostic methods including
  • DNA analysis and DNA analysis using a DNA amplification method, a DNA amplification kit, and a DNA amplification method that contribute to improving the accuracy of DNA analysis and cancer diagnosis by preventing or suppressing the generation of stutter. / Or an appraisal / diagnostic method for diagnosing cancer is provided.
  • microsatellite means the repeat sequence itself and the region and position (locus, site, position) containing the repeat sequence, but in the present application, it also means the name of the locus.
  • Microsatellite is also generally referred to as an STR (Short Tandem Repeat) sequence.
  • STR Short Tandem Repeat
  • D1S1656 and CSF1PO whose isoalleles are identified during DNA testing, are also included in the term "microsatellite".
  • D1S1656 is known to have a repeat sequence described as [TAGA] n [TGA] 0-1 [TAGA] n [TAGG] 0-1 [TG] 5 (NIST (National Institute of).
  • the D1S1656 isoaller referred to as type 15.3, has a repeat sequence labeled [TAGA] 4 TGA [TAGA] 10 TAGG [TG] 5. In some cases, [TG] 5 is not included in the repeat sequence.
  • Template DNA means DNA that serves as the first template in DNA amplification, and particularly means DNA contained in a sample to be DNA-tested and / or a sample collected from a subject for cancer diagnosis. That is, cells are collected from a subject using a cotton swab or the like during DNA testing such as paternity testing, and the DNA contained in these cells corresponds to template DNA.
  • DNA analysis is performed for the purpose of identifying the criminal from the blood stains left at the scene of the incident, the DNA contained in the blood stains, body fluids, secretions or the residue thereof corresponds to the template DNA.
  • the DNA contained in the cells collected from the subject at the time of cancer diagnosis corresponds to the template DNA.
  • the cancer diagnosis also includes a microsatellite instability (MSI) test (see, for example, Promega's https://www.promega.co.jp/msi_analysis/).
  • MSI microsatellite instability
  • the template DNA can be a sample to be DNA-tested and / or a sample collected from a subject for cancer diagnosis.
  • the sample to be DNA-tested may be a sample containing DNA of a plurality of persons.
  • the sample to be DNA-tested may be a sample containing DNA of a plurality of persons in different proportions (that is, blood stains and the like).
  • the template DNA may be prepared in advance. For example, for the purpose of preparing an index for determining the number of repeats (that is, control, standard), a sample (amplicon) in which the number of repeats is determined in advance is used as template DNA.
  • cDNA complementary DNA prepared by a reverse transcription method (Reverse Transcription) using RNA (ribonucleic acid) as a template is also included in the template DNA.
  • the template DNA also includes an amplicon prepared by performing PCR for several cycles (about 4 cycles) on a sample to be DNA-tested and / or a sample collected from a subject for cancer diagnosis.
  • Stutter means an artifact in which the number of repeats increases or decreases compared to the original sequence during DNA amplification.
  • the sequence in which stutter is generated is referred to as a stutter sequence
  • the amplification product in which stutter is generated (that is, an amplicon)
  • an amplification product when the original sequence is correctly amplified may be called a True allele.
  • the basic embodiment of the DNA amplification method of the present invention will be described as the first embodiment.
  • a reaction solution containing a template DNA containing microsatellite, a primer, a polymerase, and a recombinase is prepared. Then, by subjecting the prepared reaction solution to a homeothermic incubation, the DNA sequence containing the microsatellite in the template DNA is amplified.
  • a commercially available DNA amplification kit using Recombinase Polymerase Amplification can be used.
  • RPA Recombinase Polymerase Amplification
  • Primer A (10 ⁇ M) 2.4 ⁇ l
  • Primer B (10 ⁇ M) 2.4 ⁇ l
  • Rehydration buffer 29.5 ⁇ l Template and dH 2 O 13.2 ⁇ l (Total Volume 47.5 ⁇ l)
  • Primer A is a so-called forward oligonucleotide having a sequence of, for example, 5'-AAGCCTGTGTTGCTCAAGGGTCAACTGTAT-3'.
  • Primer B is a so-called reverse oligonucleotide having, for example, a sequence of 5'-[FL] -GGATTCTTCAGAGAAATAGAATCACTAGGGAACC-3' and a fluorescent substance (FL: fluorescent).
  • FL fluorescent
  • Such primers are designed based on the sequence before and after the microsatellite (the sequence of the flanking region).
  • STRBase discloses a primer set for amplifying a DNA sequence containing a repeat sequence of D1S1656.
  • TwistAmp recommends primers having a length of 30 to 35 nucleotides and a GC content of 40 to 60%, and when the sequence is redesigned to satisfy the recommended conditions, the above Primers A and B can be obtained. Become. Primers A and B are just examples.
  • primer design considers the complementarity of forward / reverse oligonucleotides, dimerization of each primer, and self-annealing (including the formation of hairpin structures). It is within the technical category.
  • Template is the first template DNA in DNA amplification as defined above for template DNA and can be prepared using a commercially available nucleic acid extraction kit or the like.
  • reaction pellet For each sample, transfer 47.5 ⁇ l of rehydration solution to the reaction pellet. Then pipette up and down until the entire pellet is resuspended.
  • the reaction pellet is a microtube containing a freeze-dried polymerase and a recombinase, and a reaction system is established by injecting a rehydration solution.
  • the solution in this state is referred to as a reaction solution in the present application.
  • Magnesium acetate is a reagent that triggers an amplification reaction.
  • the solution in which magnesium acetate is injected may be referred to as a reaction solution.
  • the above protocol can be modified as long as it does not deviate from the purpose of the protocol.
  • agitation can turn pipetting into tube reversal.
  • the incubation time is a guide and can be extended or shortened as needed.
  • Such a modification of the protocol is also included in the present invention, and the optimum conditions can be determined by conducting a preliminary test.
  • the reaction solution containing the amplified DNA sequence as described above is subjected to electrophoresis and / or DNA sequencing.
  • the repeat number of the repeat sequence in the amplified DNA sequence is analyzed. That is, for electrophoresis or the like, any method can be adopted as long as the number of repeats of the repeat sequence in the amplified DNA sequence can be analyzed. It is also conceivable that the amplicon amplified by RPA is purified and then subjected to electrophoresis.
  • the effect of the DNA amplification method of the present invention will be described using a waveform model obtained by polyacrylamide gel capillary electrophoresis.
  • capillary electrophoresis the amplified DNA sequence is applied to the upstream side of the capillary, migrated downstream by the current applied to the capillary, and detected by a fluorescence detector that monitors the downstream side of the capillary.
  • sequences having a short nucleotide length are detected before sequences having a long nucleotide length.
  • FIGS. 1 and 2 The graph in FIG.
  • FIG. 1 is a partially modified version of the model disclosed to NIST (FIG. 2: https://strbase.NIST.gov/pub_pres/Aponte-AAFS2016-sequence-based-STR-stutter.pdf). It is a thing.
  • stutter product peaks occur before and after the peak of the correctly amplified DNA sequence (True allele).
  • products derived from the plurality of template DNAs may be superimposed on the same peak. Such a condition can be a fatal defect in DNA testing and cancer diagnosis.
  • a plurality of template DNAs are contained in different proportions, it may not be possible to distinguish between the stutter product and the true allele.
  • n-4 stutter product derived from the victim's DNA and the true allele derived from the criminal's DNA are superimposed on the same peak. Therefore, let alone profiling the criminal, it is unknown whether the blood stains left at the scene of the incident contained the criminal's DNA.
  • the generation of stutter is prevented or suppressed, so that the graph shown in FIG. 1 (B) can be obtained. That is, the n-4 stutter product derived from the victim's DNA and the true allele derived from the criminal's DNA do not overlap. Therefore, due to the difference in peak height, the high peak can be regarded as a true allele derived from the victim's DNA, and the low peak can be regarded as a true allele derived from the criminal's DNA. That is, according to the DNA amplification method of the present invention, profiling of a criminal becomes possible.
  • the DNA amplification method of the present invention follows a general recombinase polymerase amplification (RPA) protocol and is characterized by the use of template DNA containing microsatellite.
  • RPA general recombinase polymerase amplification
  • DNA amplification by RPA is a technology developed around 2006, and has a shorter history than PCR (Polymerase Chain Reaction). Therefore, DNA amplification by PCR is adopted in DNA testing and cancer diagnosis where reliability is important. PCR also has the advantage that the primers are shorter than RPA.
  • FIG. 3 is a partially modified version of the figure shown in the review.
  • double-stranded DNA double-stranded DNA
  • ssDNA single stranded DNA
  • primers are annealed, and then an extension reaction is performed by polymerase (FIG. 3 (A)).
  • the extended chain and the template chain are bonded by a transient hydrogen bond, and the extended chain and the template chain are repeatedly cleaved and recombined (FIG. 3 (B)).
  • the template chain may recombine with the extended chain while forming a bulge structure (FIG. 3 (C)). If the elongation reaction proceeds in such a state, a stutter amplicon with a reduced number of repeats is generated (FIG. 3 (D)).
  • FIG. 4 is a model disclosed in the Combined Instruction Manual of Twist Amp (registered trademark) Liquid DNA Amplification Kits of Twist Dx (trademark).
  • the inventor of the present application came to the present invention by the following approach.
  • (1) The problem of preventing or suppressing the generation of stutter has been reached.
  • (2) The formation of a bulge structure due to transient cleavage and recombination of the extension chain and the template chain was focused on as the cause of stutter generation.
  • (3) RPA was found to have a feature that transient cleavage and recombination of the extension strand and the template strand are unlikely to occur, and was adopted for DNA amplification of template DNA containing microsatellite. That is, even a person skilled in the art cannot reach the present invention without going through such an approach. In other words, such an approach is explained as one of the technical significances of the present invention.
  • the present invention can be provided as a DNA amplification kit.
  • the DNA amplification kit includes a polymerase prepared in a reaction solution for amplifying a DNA sequence containing microsatellite, a recombinase, and a primer for amplifying the DNA sequence.
  • a DNA amplification kit used for DNA testing such as paternity testing includes microtubes corresponding to each of microsatellite such as D1S1656 and CSF1PO.
  • the microtube contains, in addition to the polymerase and recombinase, a primer for amplifying the template DNA containing the corresponding microsatellite.
  • This primer can be prepared with reference to NIST's STRBase, etc., as described above.
  • Such a DNA amplification kit is provided as a kit specialized for DNA analysis, unlike the commercially available DNA amplification kit using RPA as described above. The same applies when the kit is provided as a kit specialized for cancer diagnosis.
  • the present invention is provided as an appraisal / diagnosis method for performing DNA appraisal and / or cancer diagnosis. That is, as shown in FIG. 5, the appraisal / diagnosis method of the present invention includes a reaction solution preparation step (step S01), an amplification step (step S02), an analysis step (step S03), and an appraisal / diagnosis step (step). S04) is included. Specifically, in step S01, a reaction solution containing a template DNA containing microsatellite, a primer, a polymerase, and a recombinase is prepared. Next, in step S02, the reaction solution is subjected to isothermal incubation to amplify the DNA sequence containing the microsatellite in the template DNA.
  • step S03 the reaction solution after the amplification reaction is subjected to electrophoresis and / or DNA sequence to analyze the repeat number of the repeat sequence. Then, in step S04, DNA analysis and / or cancer diagnosis is performed using the analysis result.
  • RPA is an isothermal incubation reaction system, unlike PCR, there is no concept of "cycle".
  • the amount of the primer it is conceivable to use the amount of the primer as a bottleneck. That is, if the protocol is designed so that the primers are depleted, the DNA amplification reaction can be stopped due to the depletion of the primers.
  • the period from the addition of the primer once to the depletion of the primer can be regarded as a pseudo one cycle.
  • the primer is prepared in the state of double-stranded DNA and the protocol is designed so that the primer is denatured into single-stranded DNA by temporary heating
  • one heating step can be regarded as one cycle. That is, since the primer does not function as a primer in the state of double-stranded DNA bound to the complementary strand, it can be said that the state in which the primer exists in the double-stranded DNA is a pseudo primer depletion state.
  • the primer of the double-stranded DNA is denatured into the single-stranded DNA by heating, the primer can be annealed to the template DNA, and the depleted state of the primer is released.
  • the temperature of temporary heating is such that the primer is denatured into single-stranded DNA, but the template DNA is at least partially maintained in the state of double-stranded DNA, and the polymerase and recombinase are not inactivated. Can be defined as temperature.
  • the temperature at which the primer denatures into single-stranded DNA can be set by modifying the primer sequence (modification of the sequence in view of the Tm (Melting Temperature) value) or by introducing a mismatched sequence into the complementary strand. ..
  • the design of such a primer and a complementary strand should be able to prevent or suppress the generation of stutter in conclusion.
  • RPA recombinase polymerase amplification
  • PCR performed before RPA can also be expressed as "pre-PCR: pre-PCR” or "pre-amplification", and is a template to be used for RPA. It is considered a step for preparing DNA.
  • pre-PCR pre-PCR
  • pre-amplification a template to be used for RPA. It is considered a step for preparing DNA.
  • stutter may be generated in this pre-PCR, the generation of stutter can be suppressed by combining PCR and RPA as compared with DNA amplification by PCR alone. That is, for example, in DNA amplification in which 4-cycle PCR and RPA are combined as compared with DNA amplification by 30-cycle PCR, DNA amplification corresponding to the 5th and subsequent cycles of PCR is replaced with RPA, so that stutter is generated. It can be suppressed.
  • the number of pre-PCR cycles can be set in consideration of the quality of the original sample, the quality of the primer, etc., and is not limited to 4 cycles.
  • the quality of the sample (template DNA) can be further improved by purifying the DNA amplified by PCR.
  • Example An experiment was conducted in which a DNA sequence was actually amplified using the DNA amplification method of the present invention.
  • the materials & methods, results, and considerations in this experiment are described as examples.
  • the results of comparative experiments when DNA amplification by PCR is performed are described as comparative examples.
  • Protocol of Comparative Example (PCR Only) As shown below, 30 PCR cycles including a 98 ° C. denatured step, a 60 ° C. primer annealing step, and a 68 ° C. extension step were performed.
  • Example (PCR + RPA) The electrophoresis result of Example (PCR + RPA) is shown in FIG. 6 (B).
  • PCR + RPA DNA amplification combining PCR and RPA, a stutter peak of 1.4% was generated with respect to the peak of True allele.
  • the PCR + RPA DNA amplification of the examples produced a 1.4% stutter peak, which was significantly less than the 2.8% stutter peak of the comparative PCR-only DNA amplification. It is not possible to determine whether this 1.4% stutter peak occurred in the 4-cycle PCR in the example or in the subsequent RPA. However, it can be said that the generation of stutter is less in the DNA amplification by RPA than in the fifth and subsequent cycles of PCR in the comparative example.
  • the primers used in the above examples are 23 mer (Forward) and 26 mer (Reverse), which are shorter than the 30-35 nucleotide length recommended in a general RPA kit. Therefore, it seems that DNA amplification is possible without prior PCR by using primers having a length of 30 to 35 nucleotides.
  • the PCR amplicon is purified, but this purification is not an indispensable step.
  • recombinase may be added to the reaction system at the PCR stage, and PCR and RPA may be performed as a continuous operation. It should be noted that some modifications may be required regarding the buffer composition, etc., but these modifications are considered to be within the technical scope of those skilled in the art. Alternatively, the recombinase may be added directly to the reaction system after PCR.
  • the reaction solution is subjected to isothermal incubation to amplify the microsatellite-containing DNA sequence in the template DNA.
  • DNA amplification method including.
  • Appendix 2 The DNA amplification method according to Appendix 1, wherein the template DNA is a sample to be DNA-tested and / or a sample collected from a subject for cancer diagnosis.
  • Appendix 3 The DNA amplification method according to Appendix 2, wherein the sample to be DNA-tested is a sample containing DNA of a plurality of persons.
  • Appendix 4 The DNA amplification method according to Appendix 3, wherein the sample to be DNA-tested is a sample containing DNA of a plurality of persons in different proportions.
  • Appendix 7 A step of amplifying a DNA sequence containing the microsatellite according to the DNA amplification method described in Appendix 1, and a step of amplifying the DNA sequence.

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Abstract

スタッターの発生を防止又は抑制することで、ＤＮＡ鑑定やガン診断の精度の向上に寄与する技術を提供する。マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡと、プライマーと、ポリメラーゼと、リコンビナーゼとを含む反応溶液を調製し、反応溶液を等温インキュベートに供して、テンプレートＤＮＡの中のマイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するＤＮＡ増幅方法が提供される。

Description

ＤＮＡ増幅方法、ＤＮＡ増幅キット及び鑑定／診断方法
　本発明は、ＤＮＡ増幅方法、ＤＮＡ増幅キット及び鑑定／診断方法に関する。特に、マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するためのＤＮＡ増幅方法、ＤＮＡ増幅キット、及びＤＮＡ増幅方法を使用してＤＮＡ鑑定及び／又はガン診断を行う鑑定／診断方法に関する。
　マイクロサテライトに含まれるリピート配列の数に基づいて、ＤＮＡ（deoxyribonucleic acid）鑑定やガン診断を行う技術が存在する。一般的なＤＮＡ鑑定やガン診断では、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によるサンプルＤＮＡ配列の増幅が行われるが、その際に発生するスタッター（stutter）と称されるアーチファクトが鑑定や診断の精度に悪影響を及ぼす。例えば引用文献１には、スタッターピークの起こり得る最大の高さを見積もり、それ以下のピークはスタッターピークとして解釈することによって、スタッターによる悪影響を排除する技術が開示されている。
特開２００６－１６３７２０号公報
　以下の分析は、本発明の観点からなされたものである。なお、上記先行技術文献の各開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。
　引用文献１はスタッターの発生を前提とした技術である。すなわち、スタッターの発生を防止又は抑制することができれば、スタッターの発生に伴う悪影響を根本的に排除でき、引用文献１の技術は不要となる。そのためスタッターの発生を防止又は抑制する技術の提供が望まれている。言い換えると、本発明は、スタッターの発生を防止又は抑制することで、ＤＮＡ鑑定やガン診断の精度の向上に寄与する技術を提供することを目的とする。
　本発明の第１の視点によれば、
　マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡと、プライマーと、ポリメラーゼと、リコンビナーゼとを含む反応溶液を調製するステップと、
　前記反応溶液を等温インキュベートに供して、前記テンプレートＤＮＡの中のマイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するステップと、
　を含むＤＮＡ増幅方法が提供される。
　本発明の第２の視点によれば、
　マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するための反応溶液に調製されるポリメラーゼと、リコンビナーゼと、
　前記ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーと、
　を含む、ＤＮＡ増幅キットが提供される。
　本発明の第３の視点によれば、
　第１の視点のＤＮＡ増幅方法に従って前記マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するステップと、
　増幅反応後の反応溶液を電気泳動及び／又はＤＮＡシーケンスに供して、リピート配列のリピート数を解析するステップと、
　前記解析による解析結果を用いてＤＮＡ鑑定及び／又はガン診断を行うステップと、
　を含む鑑定／診断方法が提供される。
　本発明の各視点によれば、スタッターの発生を防止又は抑制することでＤＮＡ鑑定やガン診断の精度の向上に寄与するＤＮＡ増幅方法、ＤＮＡ増幅キット、及びＤＮＡ増幅方法を使用してＤＮＡ鑑定及び／又はガン診断を行う鑑定／診断方法が提供される。
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅と、本発明のＤＮＡ増幅との相違点を説明するための図である。 スタッターに関するモデル図である。 スタッターの発生機構に関するモデル図である。 ＲＰＡによるＤＮＡ増幅に関するモデル図である。 本発明の鑑定／診断方法による処理の流れを示すフローチャート図である。 ＰＣＲのみによるＤＮＡ増幅結果（Ａ）及びＰＣＲとＲＰＡとを組み合わせによるＤＮＡ増幅結果（Ｂ）を示す図である。
　本発明のとり得る好適な実施形態について図面を参照して詳細に説明する。なお本発明は下記の実施例には限定されるものではなく、下記の実施例から見いだされる本発明の技術的意義を逸脱しないように、修正、変更、応用（部分的なものを含む）及びそれらの組み合わせが可能である。
　まず、本願で使用する用語について説明する。
　マイクロサテライトとは、リピート配列そのもの及びリピート配列を含む領域、位置（locus、site、position）を意味するが、本願では遺伝子座の名称も意味する。マイクロサテライトは、一般的にはＳＴＲ（Short Tandem Repeat）配列とも称される。一例をあげると、ＤＮＡ鑑定の際にアイソアレルが特定されるD1S1656やCSF1POも、用語としての「マイクロサテライト」に含まれる。ここで、D1S1656は、［ＴＡＧＡ］ｎ［ＴＧＡ］０－１［ＴＡＧＡ］ｎ［ＴＡＧＧ］０－１［ＴＧ］５と表記されるリピート配列を有することが知られている（NIST（National Institute of Standards and Technology）のSTRBaseのhttps://strbase.NIST.gov/str_D1S1656.htmなどを参照）。例えば、１５．３型と称されるD1S1656のアイソアレルは、［ＴＡＧＡ］４ＴＧＡ［ＴＡＧＡ］１０ＴＡＧＧ［ＴＧ］５と表記されるリピート配列を有する。なお、［ＴＧ］５を、リピート配列に含めない場合もある。
　テンプレートＤＮＡとは、ＤＮＡ増幅における最初の鋳型となるＤＮＡを意味し、特にＤＮＡ鑑定対象の試料及び／又はガン診断の被検者から採取された試料に含まれるＤＮＡを意味する。すなわち、親子鑑定などのＤＮＡ鑑定の際に、綿棒などを用いて被検者から細胞が採取されるが、この細胞に含まれるＤＮＡがテンプレートＤＮＡに相当する。また、事件現場に残された血痕から犯人を特定する目的でＤＮＡ鑑定を行う場合には、血痕、体液、分泌物又はその残渣に含まれるＤＮＡがテンプレートＤＮＡに相当する。また、ガン診断の際に被検者から採取される細胞に含まれるＤＮＡがテンプレートＤＮＡに相当する。なお、ガン診断にはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ：microsatellite Instability）検査も含まれる（例えば、プロメガ社のhttps://www.promega.co.jp/msi_analysis/などを参照）。
　すなわち、テンプレートＤＮＡは、ＤＮＡ鑑定対象の試料及び／又はガン診断の被検者から採取された試料であり得る。また、ＤＮＡ鑑定対象の試料は、複数の人物のＤＮＡが含まれている試料であり得る。また、ＤＮＡ鑑定対象の試料は、複数の人物のＤＮＡが異なる割合で含まれている試料（すなわち血痕など）であり得る。なお、テンプレートＤＮＡは、予め調製されたものであっても良い。例えば、リピート数の判定の指標（すなわちコントロール、スタンダード）を調製する目的では、予めリピート数が決定されているサンプル（アンプリコン）がテンプレートＤＮＡとして使用される。また、ＲＮＡ（ribonucleic acid）を鋳型として用いる逆転写法（Reverse Transcription）によって調製されるｃＤＮＡ（complementary DNA）もテンプレートＤＮＡに含まれる。さらに、ＤＮＡ鑑定対象の試料及び／又はガン診断の被検者から採取された試料に対して、数サイクル（約４サイクル）のＰＣＲを行って調製したアンプリコンもテンプレートＤＮＡに含まれる。
　スタッター（stutter）とは、ＤＮＡ増幅の際に元の配列よりもリピート数が増加又は減少するアーチファクトを意味する。なお、スタッターが発生した配列をスタッター配列と称し、スタッターが発生した増幅プロダクト（すなわちアンプリコン）をスタッタープロダクト（stutter product）と称する。その一方で、元の配列が正しく増幅された場合の増幅プロダクトをTrue alleleと称する場合がある。
［実施形態１］
　まず、本発明のＤＮＡ増幅方法の基本形態を実施形態１として説明する。実施形態１のＤＮＡ増幅方法では、まず、マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡと、プライマーと、ポリメラーゼと、リコンビナーゼとを含む反応溶液が調製される。そして、調製された反応溶液を恒温インキュベートに供することで、テンプレートＤＮＡの中のマイクロサテライトを含むＤＮＡ配列が増幅される。
　具体的なプロトコルとしては、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ：Recombinase Polymerase Amplification）を利用した市販のＤＮＡ増幅キットのものを利用することができる。以下では、一例として、TwistDx（商標）社のTwistAmp（登録商標）Basicを利用して、D1S1656のリピート配列を含むＤＮＡ配列を増幅する場合について、当該キットのマニュアルｖｅｒ．０１に記載のプロトコルを補足しつつ説明する。
１．各サンプルについて次のようにrehydration溶液を調製する。
　Primer A (10μM)       2.4μl
　Primer B (10μM)       2.4μl
　Rehydration buffer      29.5μl
　Template and dH2O     13.2μl
　(Total Volume          47.5μl)
よく撹拌して短時間スピンダウンする。

　ここでPrimer Aは、例えば、5'-AAGCCTGTGTTGCTCAAGGGTCAACTGTAT-3'なる配列を有する、いわゆるforwardのオリゴヌクレオチドである。また、Primer Bは、例えば、5'-[FL]-GGATTCTTCAGAGAAATAGAATCACTAGGGAACC-3'なる配列及び蛍光物質（FL：fluorescent）を有する、いわゆるreverseのオリゴヌクレオチドである。
　このようなプライマーは、マイクロサテライトの前後の配列（フランキング領域の配列）に基づいて設計される。例えば、STRBaseには、D1S1656のリピート配列を含むＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーセットが開示されている。ここで、TwistAmp（登録商標）では３０～３５ヌクレオチド長で、ＧＣ含量が４０～６０％のプライマーが推奨されており、推奨条件を満足するように配列を再設計すると上記のPrimer A、Bになる。なお、Primer A、Bは一例に過ぎない。また、プライマーの設計には、forward/reverseのオリゴヌクレオチドの相補性や、各プライマーの二量化（ダイマリゼーション）及び自己アニーリング（ヘアピン構造の形成なども含む）が考慮されるが、当業者の技術範疇内である。
　Templateは、上記のテンプレートＤＮＡの定義のようにＤＮＡ増幅における最初の鋳型ＤＮＡであり、市販の核酸抽出キットなどを使用して調製することができる。
２．各サンプルについて、47.5μlのrehydration溶液を反応ペレットに移す。そして、ペレット全体が再懸濁されるまで、ピペットで上下に混合する。

　ここで、反応ペレットとは凍結乾燥したポリメラーゼ及びリコンビナーゼを内包するマイクロチューブであり、rehydration溶液の注入によって反応系が確立する。この状態の溶液を本願では反応溶液と称する。
３．各サンプルについて、2.5μlの280mM酢酸マグネシウムを添加し、よく混合する。

　酢酸マグネシウムは、増幅反応のトリガーとなる試薬である。本願では、酢酸マグネシウムが注入された状態の溶液を反応溶液と称する場合もある。
４．適切なインキュベータブロック（最適３７～４２℃）にチューブを挿入し、４分間インキュベートする。
５．４分後、サンプルをインキュベータから取り出し、８～１０回激しく逆転させて混合してからスピンダウンし、サンプルをインキュベータブロックに戻す。
６．トータル２０～４０分を目安にインキュベーション／検出を続ける。

　これらのステップについては、本願において、「反応溶液を等温インキュベートに供して、テンプレートＤＮＡの中のマイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅する」とも言い換えられる。
　なお、上述のプロトコルはプロトコルの趣旨を逸脱しない限り改変され得る。例えば、撹拌は、ピペッティングをチューブの逆転に変えことができる。また、インキュベーション時間は目安であり必要に応じて延長、短縮され得る。このようなプロトコルの改変も本発明に含まれ、最適な条件は予備テストを行うことで決定可能である。
　上述のように増幅されたＤＮＡ配列を含む反応溶液は、電気泳動及び／又はＤＮＡシーケンスに供される。ここで、増幅されたＤＮＡ配列におけるリピート配列のリピート数が解析される。すなわち、電気泳動などは、増幅されたＤＮＡ配列におけるリピート配列のリピート数が解析できれば良く、いずれの手法も採用することができる。なお、ＲＰＡによって増幅したアンプリコンを精製した後に電気泳動に供することも考えられる。
　ここで、ポリアクリルアミドゲルキャピラリ電気泳動によって得られる波形のモデルを用いて本発明のＤＮＡ増幅方法による効果を説明する。キャピラリ電気泳動では、増幅されたＤＮＡ配列は、キャピラリの上流側にアプライされ、キャピラリに印可される電流によって下流側へ泳動し、キャピラリの下流側をモニタする蛍光検出装置によって検出される。この時に、分子ふるい効果によって、ヌクレオチド長の短い配列が長い配列よりも先に検出される。蛍光検出装置によって検出される蛍光輝度の経時的な変化をグラフにすると、図１、２に示すものになる。なお、図１のグラフは、NISTに開示されるモデル（本願図２：https://strbase.NIST.gov/pub_pres/Aponte-AAFS2016-sequence-based-STR-stutter.pdf）を一部改変したものである。
　NISTに開示されるモデル（本願図２）のように、単一のテンプレートＤＮＡをＰＣＲによってＤＮＡ増幅した場合には、正しく増幅されたＤＮＡ配列（True allele）のピークの前後にスタッタープロダクトのピークが現れる。ここで、テンプレートＤＮＡが複数になると、複数のテンプレートＤＮＡ由来のプロダクトが同一のピークに重畳することがある。このような状態は、ＤＮＡ鑑定やガン診断において致命的な欠陥となり得る。また、複数のテンプレートＤＮＡが異なる割合で含まれていると、stutter productとTrue alleleとを見分けることができない場合もある。
　一例として、事件現場に残された血痕から犯人を特定する目的でＤＮＡ鑑定を行う場合を想定する。事件現場に残された血痕には、被害者のＤＮＡが多量に含まれ、犯人のＤＮＡは少量であると考えられる。ここで、被害者がアイソアレルＡのホモであり、犯人がアイソアレルＢのホモであると仮定する。なお、アイソアレルＢは、アイソアレルＡのn-4 stutter productと同一のヌクレオチド長を有するものとする。上記の血痕をＰＣＲに供して、増幅されたＤＮＡ配列を検出すると、図１（Ａ）に示すグラフが得られる。なお、図１における実線は実波形のモデルであり、点線はテンプレートＤＮＡが犯人のＤＮＡのみであると仮定した場合の波形モデルである。ここで、被害者のＤＮＡに由来するn-4 stutter productと、犯人のＤＮＡに由来するTrue alleleとが同一のピークに重畳する。そのため、犯人のプロファイリングはおろか、事件現場に残された血痕に犯人のＤＮＡが含まれていたか否かも分からない。
　これに対して、本発明のＤＮＡ増幅方法では、スタッターの発生が防止又は抑制されているため、図１（Ｂ）に示すグラフが得られる。すなわち、被害者のＤＮＡに由来するn-4 stutter productと、犯人のＤＮＡに由来するTrue alleleの重畳が生じない。そのため、ピークの高さの違いから、高ピークを被害者のＤＮＡに由来するTrue alleleとみなし、低ピークを犯人のＤＮＡに由来するTrue alleleとみなすことができる。つまり、本発明のＤＮＡ増幅方法によれば犯人のプロファイリングが可能になる。
［本発明のＤＮＡ増幅方法の技術的意義］
　上記のプロトコルに記載のように、本発明のＤＮＡ増幅方法は、一般的なリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のプロトコルに沿ったものであり、マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡを使用することに特徴を有する。以下では、この「マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡを使用する」という特徴についての技術的意義を説明する。
　ＲＰＡによるＤＮＡ増幅は２００６年頃に開発された技術であり、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）に比べると歴史が浅い。そのため信頼性が重要視されるＤＮＡ鑑定やガン診断では、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅が採用される。また、ＰＣＲは、ＲＰＡに比べるとプライマーが短いという利点もある。
　しかしながら、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅では、スタッターが生じてＤＮＡ鑑定やガン診断の精度に悪影響を及ぼす。スタッターが発生する機構については諸説あるが、例えば、Nature Reviews Genetics, volume 5, pages 435-445 (2004)を参考にすると、図３のようなモデルで説明される。図３は、当該レビューに示された図を一部改変したものである。
　ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ：double stranded DNA）を１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ：single stranded DNA）に変性し、プライマーをアニールした後に、ポリメラーゼによる伸長反応を行う（図３（Ａ））。ここで伸長鎖と鋳型鎖はトランジェント（transient：一過性の）な水素結合で結合しており、伸長鎖と鋳型鎖は開裂と再結合を繰り返している（図３（Ｂ））。その際に、鋳型鎖がバルジ構造（bulge structure）を形成しつつ伸長鎖と再結合することがある（図３（Ｃ））。このような状態のままで伸長反応が進むと、リピート数が減少したスタッターアンプリコンが生成される（図３（Ｄ））。
　このようなスタッター発生機構に鑑みて、本願発明者は、スタッターの発生を防止又は抑制する目的でＲＰＡによるＤＮＡ増幅を採用するに至った。ここで、ＲＰＡによるＤＮＡ増幅は、図４に示すモデルで説明される。本願発明者の着目点として顕著なのは、ＲＰＡによるＤＮＡ増幅では、２本鎖ＤＮＡをできる限り維持したままでポリメラーゼによる伸長反応が行われるという点である。なお、図４は、TwistDx（商標）社のTwistAmp（登録商標） Liquid DNA Amplification KitsのCombined Instruction Manualに開示されるモデルである。
　まとめると、本願発明者は以下のアプローチによって本発明に至った。
（１）スタッターの発生を防止又は抑制するという課題に到達した。
（２）伸長鎖と鋳型鎖のトランジェントな開裂と再結合に起因するバルジ構造の形成をスタッターの発生原因として着目した。
（３）ＲＰＡは、伸長鎖と鋳型鎖のトランジェントな開裂と再結合が生じ難いという特徴を有することを見出し、マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡのＤＮＡ増幅に採用した。
　つまり、このようなアプローチを経なければ当業者であれども本発明に到達することはできない。言い換えると、このようなアプローチこそが本発明の技術的意義の１つとして説明される。
［実施形態２］
　次に、実施形態１のＤＮＡ増幅方法の応用形態を実施形態２として説明する。
　本発明は、ＤＮＡ増幅キットとして提供され得る。該ＤＮＡ増幅キットは、マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するための反応溶液に調製されるポリメラーゼと、リコンビナーゼと、ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーとを含む。
　例えば、親子鑑定などのＤＮＡ鑑定に用いられるＤＮＡ増幅キットは、D1S1656やCSF1POなどのマイクロサテライトの各々に対応するマイクロチューブを含む。マイクロチューブは、ポリメラーゼ及びリコンビナーゼに加えて、各々に対応するマイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡを増幅するためのプライマーを含む。このプライマーは、上述のように、NISTのSTRBaseなどを参照して調製され得る。このようなＤＮＡ増幅キットは、上記のようなＲＰＡを利用した市販のＤＮＡ増幅キットと異なり、ＤＮＡ鑑定に特化したキットとして提供される。ガン診断に特化したキットとして提供する場合も同様である。
　本発明は、ＤＮＡ鑑定及び／又はガン診断を行う鑑定／診断方法として提供される。すなわち、本発明の鑑定／診断方法は、図５に示すように、反応溶液調製ステップ（ステップＳ０１）と、増幅ステップ（ステップＳ０２）と、解析ステップ（ステップＳ０３）と、鑑定／診断ステップ（ステップＳ０４）を含む。具体的には、ステップＳ０１において、マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡと、プライマーと、ポリメラーゼと、リコンビナーゼとを含む反応溶液を調製する。次に、ステップＳ０２において、反応溶液を等温インキュベートに供して、テンプレートＤＮＡの中のマイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅する。次に、ステップＳ０３において、増幅反応後の反応溶液を電気泳動及び／又はＤＮＡシーケンスに供して、リピート配列のリピート数を解析する。そして、ステップＳ０４において、解析結果を用いてＤＮＡ鑑定及び／又はガン診断を行う。
［実施形態３］
　次に、実施形態１のＤＮＡ増幅方法の変化形態を実施形態３として説明する。
　ＲＰＡは等温インキュベートの反応系であるため、ＰＣＲと異なり「サイクル」という概念が無い。ここで、ＤＮＡ増幅反応が不必要に進み過ぎる（言い換えると、アンプリコンが不必要に増えすぎる）ことを防止するために、プライマーの量をボトルネックとすることが考えられる。すなわち、プライマーが枯渇するようにプロトコルを設計すれば、プライマーの枯渇に起因してＤＮＡ増幅反応を停止することができる。
　ここで、例えば、プライマーを徐序に添加するようにプロトコルを設計すれば、１回プライマーを添加してからプライマーが枯渇するまでを疑似的な１サイクルとみなすことができる。
　また、プライマーを２本鎖ＤＮＡの状態で調製し、一時的な加熱によってプライマーを１本鎖ＤＮＡに変性するようにプロトコルを設計すれば、１回の加熱ステップを１サイクルとみなすことができる。すなわち、プライマーは相補鎖と結合した２本鎖ＤＮＡの状態ではプライマーとしての機能を果たさないため、プライマーが２本鎖ＤＮＡで存在する状態は疑似的なプライマーの枯渇状態であると言える。ここで、加熱によって２本鎖ＤＮＡのプライマーを１本鎖ＤＮＡに変性すると、プライマーがテンプレートＤＮＡに対してアニールできるようになり、プライマーの枯渇状態が解除される。なお、一時的な加熱の温度は、プライマーは１本鎖ＤＮＡに変性するが、テンプレートＤＮＡは２本鎖ＤＮＡの状態を少なくとも部分的に維持する温度であり、かつ、ポリメラーゼ及びリコンビナーゼが失活しない温度と定義され得る。プライマーが１本鎖ＤＮＡに変性する温度は、プライマー配列を改変すること（Ｔｍ（Melting Temperature）値に鑑みた配列の改変）でも設定できるし、相補鎖にミスマッチ配列を導入することによっても設定できる。このような、プライマー及び相補鎖の設計は、結論的にスタッターの発生を防止又は抑制することができればよい。
［実施形態４］
　次に、実施形態１のＤＮＡ増幅方法において、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅の前にテンプレートＤＮＡを調製するためのＰＣＲを行う実施形態を実施形態４として説明する。
　上記のようにリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、市販のＤＮＡ増幅キットのものを利用する場合であってもプライマーの設計などにＰＣＲと比べて厳密な条件が設定される。すなわち、ＲＰＡは、ＰＣＲと比べて難易度が高いＤＮＡ増幅方法であると言える。ここで、事件現場に残された血痕など、品質が悪い試料の場合には、ＰＣＲを用いたＤＮＡ増幅ですら難易度が高いため、ＲＰＡではさらに高難度になる。
　そのため、ＰＣＲとＲＰＡとを組み合わせることによってＤＮＡ増幅の難易度を下げることが考えられる。すなわち、まず、数サイクルのＰＣＲを行うことによって試料の品質を改善する。次に、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ（すなわちアンプリコン）をテンプレートＤＮＡとして用いたＲＰＡを行う。このようにすれば、ＤＮＡ増幅の難易度を低下させることができる。
　なお、ＰＣＲとＲＰＡとを組み合わせたＤＮＡ増幅において、ＲＰＡの前に行わるＰＣＲは、「事前ＰＣＲ：pre-PCR」、「事前増幅：pre-amplification」とも表現することができ、ＲＰＡに供するテンプレートＤＮＡを調製するためのステップとみなされる。この事前ＰＣＲにおいてスタッターが発生する可能性はあるが、ＰＣＲのみでのＤＮＡ増幅と比べて、ＰＣＲとＲＰＡとを組み合わせることによってスタッターの発生を抑えることができる。すなわち、例えば、３０サイクルのＰＣＲによるＤＮＡ増幅と比べて、４サイクルのＰＣＲとＲＰＡとを組み合わせたＤＮＡ増幅では、ＰＣＲの５サイクル目以降に相当するＤＮＡ増幅がＲＰＡに置き換わるため、スタッターの発生を抑えることができる。
　ここで、事前ＰＣＲのサイクル数は、元の試料の品質や、プライマーの品質などを考慮して設定することができ、４サイクルに限定されない。また、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを精製して試料（テンプレートＤＮＡ）の品質を更に改善することもできる。
［実施例］
　本発明のＤＮＡ増幅方法を用いて実際にＤＮＡ配列を増幅する実験を行った。以下ではこの実験におけるマテリアル＆メソッド、結果、考察について実施例として記載する。また、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行った場合の比較実験結果を比較例として記載する。
（マテリアル＆メソッド）
試薬
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
装置
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
比較例（ＰＣＲのみ）のプロトコル
　以下に示すように、９８℃のディネイチャリングステップ、６０℃のプライマーアニーリングステップ、６８℃のエクステンションステップを含むＰＣＲサイクルを３０回行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
実施例（ＰＣＲ＋ＲＰＡ）のプロトコル
　まず、９８℃のディネイチャリングステップ、６０℃のプライマーアニーリングステップ、６８℃のエクステンションステップを含むＰＣＲサイクルを４回行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　次に、上記のＰＣＲによって生じたＰＣＲアンプリコンを、NucleoSpin のプロトコルに従って精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　続いて、精製したＰＣＲアンプリコンをテンプレートＤＮＡとしたＲＰＡを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　そして、上記のＲＰＡによって生じたＲＰＡアンプリコンを、NucleoSpin のプロトコルに従って精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
（結果）
　比較例（ＰＣＲのみ）の電気泳動結果を図６（Ａ）に示す。ＰＣＲのみのＤＮＡ増幅では、True alleleのピークに対して、２．８％のスタッターピークが生じた。
　実施例（ＰＣＲ＋ＲＰＡ）の電気泳動結果を図６（Ｂ）に示す。ＰＣＲとＲＰＡを組み合わせたＤＮＡ増幅では、True alleleのピークに対して、１．４％のスタッターピークが生じた。
（考察）
　実施例のＰＣＲ＋ＲＰＡのＤＮＡ増幅では１．４％のスタッターピークが生じたが、比較例のＰＣＲのみのＤＮＡ増幅による２．８％のスタッターピークと比べて顕著に少なかった。この１．４％のスタッターピークは、実施例における４サイクルのＰＣＲにおいて生じたものであるのか、又はその後のＲＰＡにおいて生じたものであるのかが判別できない。しかしながら、比較例におけるＰＣＲの５サイクル目以降と比較して、ＲＰＡによるＤＮＡ増幅ではスタッターの発生が少ないと言える。
　また、上記の実施例で使用したプライマーは２３ｍｅｒ（Forward）及び２６ｍｅｒ(Reverse)であり、一般的なＲＰＡのキットで推奨される３０～３５ヌクレオチド長のよりも短い。そのため、３０～３５ヌクレオチド長のプライマーを使用すれば事前ＰＣＲを行わなくてもＤＮＡ増幅が可能であると思われる。
　また、上記の実施例ではＰＣＲアンプリコンの精製を行っているが、この精製は必須のステップではない。例えば、ＰＣＲの段階でリコンビナーゼを反応系に添加しておき、ＰＣＲとＲＰＡを一続きの作業としても良い。なお、バッファ組成などに関して若干の修正が必要になる可能性があるが、この修正は当業者の技術範疇内であると考えられる。また、ＰＣＲの後にリコンビナーゼを反応系に直接添加しても良い。
　上記の実施形態の一部又は全部は、以下の付記のようにも記載され得るが、以下には限られない。
（付記１）
　マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡと、プライマーと、ポリメラーゼと、リコンビナーゼとを含む反応溶液を調製するステップと、
　前記反応溶液を等温インキュベートに供して、前記テンプレートＤＮＡの中のマイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅ステップと、
　を含むＤＮＡ増幅方法。
（付記２）
　前記テンプレートＤＮＡが、ＤＮＡ鑑定対象の試料及び／又はガン診断の被検者から採取された試料である、付記１に記載のＤＮＡ増幅方法。
（付記３）
　前記ＤＮＡ鑑定対象の試料が、複数の人物のＤＮＡが含まれている試料である、付記２に記載のＤＮＡ増幅方法。
（付記４）
　前記ＤＮＡ鑑定対象の試料が、複数の人物のＤＮＡが異なる割合で含まれている試料である、付記３に記載のＤＮＡ増幅方法。
（付記５）
　ＰＣＲによって前記テンプレートＤＮＡを調製するステップをさらに含む、付記１～４のいずれか１つに記載のＤＮＡ増幅方法。
（付記６）
　マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するための反応溶液に調製されるポリメラーゼと、リコンビナーゼと、
　前記ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーと、
　を含む、ＤＮＡ増幅キット。
（付記７）
　付記１に記載のＤＮＡ増幅方法に従って前記マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するステップと、
　増幅反応後の反応溶液を電気泳動及び／又はＤＮＡシーケンスに供して、リピート配列のリピート数を解析するステップと、
　前記解析による解析結果を用いてことでＤＮＡ鑑定及び／又はガン診断を行うステップと、
　を含む鑑定／診断方法。
　なお、上記の特許文献及びその他の先行技術文献の開示を、本書に引用をもって繰り込むものとする。本発明の全開示（請求の範囲を含む）の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素（各請求項の各要素、各実施形態ないし実施例の各要素、各図面の各要素等を含む）の多様な組み合わせ、ないし選択（部分的選択、非選択を含む）が可能である。すなわち、本発明は、請求の範囲を含む全開示、技術的思想にしたがって当業者であればなし得るであろう各種変形、修正を含むことは勿論である。なお、引用した先行技術文献の一部又は全部を本書の記載に組み合わせて用いることも、本願の開示事項に含まれるとみなされる。

Claims (7)

  1. 　マイクロサテライトを含むテンプレートＤＮＡと、プライマーと、ポリメラーゼと、リコンビナーゼとを含む反応溶液を調製するステップと、
    　前記反応溶液を等温インキュベートに供して、前記テンプレートＤＮＡの中のマイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するステップと、
    　を含むＤＮＡ増幅方法。
  2. 　前記テンプレートＤＮＡが、ＤＮＡ鑑定対象の試料及び／又はガン診断の被検者から採取された試料である、請求項１に記載のＤＮＡ増幅方法。
  3. 　前記ＤＮＡ鑑定対象の試料が、複数の人物のＤＮＡが含まれている試料である、請求項２に記載のＤＮＡ増幅方法。
  4. 　前記ＤＮＡ鑑定対象の試料が、複数の人物のＤＮＡが異なる割合で含まれている試料である、請求項３に記載のＤＮＡ増幅方法。
  5. 　ＰＣＲによって前記テンプレートＤＮＡを調製するステップをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のＤＮＡ増幅方法。
  6. 　マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するための反応溶液に調製されるポリメラーゼと、リコンビナーゼと、
    　前記ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーと、
    　を含む、ＤＮＡ増幅キット。
  7. 　請求項１に記載のＤＮＡ増幅方法に従って前記マイクロサテライトを含むＤＮＡ配列を増幅するステップと、
    　増幅反応後の反応溶液を電気泳動及び／又はＤＮＡシーケンスに供して、リピート配列のリピート数を解析するステップと、
    　前記解析による解析結果を用いてＤＮＡ鑑定及び／又はガン診断を行うステップと、
    　を含む鑑定／診断方法。
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