JP2516452B2 - サイレ―ジ保存剤組成物およびそれによるサイレ―ジの保存方法 - Google Patents

サイレ―ジ保存剤組成物およびそれによるサイレ―ジの保存方法

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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、嫌気性条件下で貯蔵後の動物飼料に用いら
れる農産物の保存方法及び保存剤組成物に関する。
［従来の技術］ サイレージ（サイロに貯蔵した嫌気的発酵させた飼
料）添加剤の利用は、農業界の多くの分野で、広範に実
用化が受け入れられるようになっている。
サイレージとサイレージ添加剤の反応の機序を理解す
るには、サイロ貯蔵過程で生起する、基本的な生化学的
および微生物学的変化を、初めに観察するのが役立つも
のと思われる。
例えばトウモロコシでは、寸断直後から好気的呼吸が
開始される。この初期段階の間に、植物組織中の可溶性
炭化水素は、酸化され、二酸化炭素および水に転化され
る。
この過程は、酸素が枯渇するか、水溶性炭水化物が消
費され尽くすかするまで、継続することになる。
理想的条件下では、サイロ貯蔵材料は適切に充填かつ
密閉されており、呼吸は数時間しか継続しない。この期
間に増殖する微生物は、好気性細菌、酵母、糸状菌な
ど、酸素に耐溶性を有するものに限られる。これらの微
生物は、糖を、二酸化炭素、熱、および水に代謝するこ
とから、概して、この反応系に否定的な意義を有すると
されている。
この初期段階に生起する他の重要な変化の一つは、植
物プロテアーゼによる植物蛋白質の分解である。蛋白質
はアミノ酸に減成され、更に代謝されて、アンモニアお
よびアミンを生じる。サイレージ中のpHが低下する速度
によっては、全蛋白質の50％までが、この過程で分解さ
れ得るとの報告がある。
嫌気性条件が確立してしまうと、嫌気性細菌が増殖す
る。一般的には、腸内細菌、およびヘテロ発酵性の乳酸
菌が、定着するに至る最初の個体群である。これらの生
物は、グルコースおよびフルクトースの発酵から、主と
して酢酸、エタノール、および二酸化炭素を生成する。
pHが低下し始めると、乳酸をもっぱら産生するホモ発
酵性乳酸菌の個体群が著しい増加を示す。乳酸の濃度の
急激な増加は、pHの４前後までの低下をもたらす。この
時点で、サイロに貯蔵された物質は、妨げられることが
なければ、貯蔵期間を通じて、概して安定に保たれる。
以上を要約すれば、酸素の濃度が限定されている構造
物、例えば蓋をしたサイロに材料が初めて充填される場
合、pHは低下し、残存酸素が消費されて、材料は、いわ
ゆる乳酸発酵を受けるのである。材料は、このような条
件において安定的に保たれ、したがって、何カ月も貯蔵
することが可能となる。
サイレージが、飼料に供しうるまでに至ると、天蓋を
取り外し、サイロは、飼料提供のために開放される。そ
の結果、材料は空気にさらされ、もはや嫌気的ではなく
なる。
サイレージ自体の、あるいは空中を運ばれた汚染物中
の微生物叢は、存在する酸類の酸化を開始できるように
なる。この酸化は、飼料の質量、すなわち乾燥物質の減
少を生起し、したがって、飼料の損失を招く。
更に、結果的なpHおよび温度の上昇は、動物にとって
は不快であって、発熱開始後の飼料は、動物から拒絶さ
れる。
実際に観察される好気性不安定性は、サイル貯蔵され
た材料がサイロから取り出される速度、および材料が開
放前にサイロ貯蔵されていた時間の長さに左右される。
サイレージが緩慢に取り出される場合は、開放された
サイレージ表面に劣化が生じるまでに許される時間が、
より長くなる。サイロ貯蔵の時間を延長すると、酸濃度
が上昇し、かつすべての微生物叢が減少する傾向にある
ため、一般に、より安定なサイレージが形成される。
通常、サイレージは、開放後少なくとも５日間は安定
でなければならない。そうすれば、サイレージが取り出
されるのに適切な時間が許されることになる。
近年、細菌を用いた接種物が、牧草サイレージと穀草
サイレージの双方を含めて、サイレージの保存に役立つ
ことが公知となるに至った。
例えば、発酵段階における乳酸菌の接種は、発酵過程
に有益となり得ることが、ヒル（Hill）による1989年６
月27付け米国特許第4,842,871号明細書、並びに本明細
書に引用の参照文献に開示されている。
高湿での穀草の安定性が増大するのは、接種物が、嫌
気的発酵、およびpH低下の速度を高めるためであると思
われる。これが有益であるのは、好気的なpH感受性微生
物叢によって引き起こされる初期段階での酸化による損
失が、上記の理由で回避されるからである。
その他のサイレージ、例えば穀草の全植物体、ムラサ
キウマゴヤシ等々においては、接種物は、繊維の利用可
能性を増大させるため、サイレージの消化性に対して
も、有益な効果を及ぼすことが可能である。
［発明が解決しようとする課題］ 現時点では、サイロが空気に対して開放されたときに
出現する過程の第２の部分において、安定性に効果を及
ぼすような利用可能な接種物は存在しない。このような
効果的な接種物の不在の一つの理由は、嫌気的保存剤と
好気的保存剤との拮抗的な性格である。いずれの一方
も、他方の性能に干渉し得るのである。
したがって、本発明の第１の目的は、当初の嫌気的な
２段階の双方において有効であり、かつサイロが空気に
対して開放された場合の初期の好気的段階においても、
有効性が持続されるような細菌によるサイレージ接種物
を提供することである。
本発明の第２の目的は、やはり嫌気性細菌であって、
当初の嫌気的段階に存在する可能性のあるいかなる乳酸
産生細菌による接種物に対しても、いかなる形式によっ
ても、干渉することのない、第２段階の接種物ととも
に、両段階において有効なサイレージ接種物を提供する
ことである。
本発明の第３の目的は、乳酸菌が存在する環境におい
て、互いに拮抗作用を及ぼし合うことなく、有効に機能
することが判明している、プロピオン酸菌属（Propioni
bacterium）の特定の菌種を含有するサイレージ接種物
を提供することである。
その結果、当初は嫌気的段階において、かつプロピオ
ン酸菌の代謝産物によって、その後の好気的段階におい
ても、ともにサイレージ保存剤としての有効な能力がも
たらされる。
本発明の個々の目的を他の目的とともに達成する方
法、および様式は、以下に述べる詳細な説明により、明
らかとなるものと思う。
［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、サイロ貯蔵過程の当初の嫌気的段
階、並びにサイロが開放された後の好気性条件の初期段
階の双方において、牧草または穀草のサイレージを含め
たサイレージが保存される。
保存は、好気的段階において持続的な安定性をもたら
すように機能する代謝産物を生成する、ある特定の複数
の嫌気性細菌による接種を混合することによって達成さ
れる。一方の接種物は、プロピオニバクテリウム・ジェ
ンセニー（Propionibacterium jensenii）種のピー・ナ
イン（Ｐ−９）株或いはピー・ファーゴ（Ｐ−Fargo）
株の細菌であって、他方の嫌気性細菌と共存可能なこと
が重要であり、したがって、いかなる形式によっても、
サイロ貯蔵過程を阻害することがない。
嫌気的段階での保存のために添加される細菌接種物
は、典型的な乳酸桿菌属（Lactobacillus）の細菌であ
って、これが、発酵に際して乳酸を生成する。プロピオ
ン酸菌も嫌気性細菌であるが、その代謝産物は、好気的
段階の安定をもたらす原因となる。
プロピオニバクテリウム・ジェンセニー（Propionibact
erium jensenii）種のピー・ナイン（Ｐ−９）株或いは
ピー・ファーゴ（Ｐ−Fargo）株が好適である。
要約すれば、本発明によれば、小量ではあるが、サイ
レージ保存有効量のプロピオン酸菌属の何らかの種、特
定にはジェンセニー種、最も特定的にはATCC番号がそれ
ぞれ第53951号および第53962号であるピー・ナイン（Ｐ
−９）株およびピー・ファーゴ（Ｐ−Fargo）株を、好
ましくは乳酸産生微生物と併用して、サイレージに投与
する段階からなるサイレージの処理方法が提供される。
損傷性の生物の増殖によって生起される劣化による、
農産物、例えば乾牧草、穀草およびその類似物の損傷
は、農業界における重大問題である。例えば、穀草を高
湿のサイロに貯蔵した場合、産出されるサイレージは、
栄養価が著しく劣り、多量の糸状菌を視認し得ることが
しばしばである。
本明細書で用いる「サイレージ」なる用語は、例えば
牧草サイレージ、ムラサキウマゴヤシのサイレージ、穀
草サイレージ、モロコシのサイレージ、発酵穀物、牧草
混合物など、すべての形態の発酵農産物を包含するもの
とする。本発明の接種物を用いることによって、これら
すべてを、成功裡に処理することが可能となる。
本発明の方法によれば、サイレージ保存有効量の乳酸
桿菌属の生物、例えば1989年６月27日づけ米国特許第4,
842,871号明細書に公的に属するそれらを用いてサイレ
ージを処理する。
しかし、サイレージ保存効率を最大に高めるには、前
述の通り、サイロを開放し、あるいは、サイレージをサ
イロから取り出して飼料槽に移した場合の好気性条件を
無視することはできない。それまでの嫌気性条件で安定
な産物が、一旦空気にさらされてしまうと急速に劣化す
るのは、珍しいことではない。
ところが、サイレージへの接種物が、一部を慣用の嫌
気性細菌接種物、例えば乳酸桿菌属の生物とし、残りの
部分を、その代謝産物が、好気性条件下で保存的に機能
する特定の嫌気性細菌による接種物として構成される場
合は、好気的および嫌気的の両段階で保存作用が生じ、
いずれもが、他に対して拮抗的に作用しないことが発見
されたのは予想外であった。
本発明の驚異的な部分は、プロピオン酸菌属の特定の
種のみが、本発明において有効に機能することである。
一般的に言って、プロピオン酸菌をサイレージに添加
することは公知であって、例えば、アール・エー・フロ
レス−ガラルサ（R.A.Flores−Galarza）およびビー・
エー・グラーツ（B.A.Glatz）の論文［ジャーナル・オ
ブ・フード・プロテクション（J.Food Protection）、
第48巻（1985年）407〜411頁］が参照される。
さらに同誌には、パーカー（Parker）および本発明の
発明者であるエヌ・ジェー・ムーン（N.J.Moon）による
論文「混合培養における乳酸桿菌とプロピオン酸菌の相
互作用（Interactions of Lactobacillus and Propioni
bacterium in Mixed Culture）」が掲載されている［ジ
ャーナル・オブ・フード・プロテクション、第45巻（19
82年）326〜330ページ］。この論文は、プロピオン酸菌
属の別の種を用いている点が本発明と異なっており、こ
の論文の種は、本発明に用いるには充分でない。
本明細書で指名された種を用いずに、プオピオン酸菌
属の他の種を用いた場合は、好気的状態における効果が
得られず、その併用による相互作用は、現実には、改善
されるどころか悪化する可能性がある。
要するに、本発明は、プロピオン酸菌に関しては、必
然的に種特異的である。特に、本発明において有効に作
用することが判明しているプロピオン酸菌属の種は、プ
ロピオニバクテリウム・ジェンセニーであり、プロピオ
ニバクテリウム・ジェンセニーのピー・ファーゴ株、お
よびプロピオニバクテリウム・ジェンセニーのピー・ナ
イン株が最も好適である。ただし、本発明は、株特異的
ではあるものの、これらの種およびその遺伝学的等価
種、あるいは、指名された種および株が有する所望の特
性を示すそれらの有効な突然変異株をも、その対象範囲
に含めることを意図していることは、理解されなければ
ならない。
このようなその遺伝学的等価種あるいは突然変異株
は、それらを派生させた種と、機能的には等価であると
考えられる。当業界の通常の技量の習塾者にとっては、
微生物における自然発生的な突然変異の出現は珍しいこ
とではなく、また、各種公知の技術を用いて、突然変異
を意図的に発生させるのが可能なことも周知のことであ
る。例えば、化学物質、放射性物質、またはDNA組換え
技術を用いて、突然変異を生起させることが可能であ
る。
突然変異、あるいは遺伝学的等価種の誘発方法が何で
あれ、決定的に重要な課題は、それらを派生させた種ま
たは株に関して記載された通りにサイレージを保存する
よう、それらが機能することである。換言すれば、本発
明は、例えば分類学上の些細な変更のような、僅かな変
化をもたらすような突然変異をも包含するのである。
本発明の処理に有用な組成物は、典型的には、サイロ
貯蔵産物の処理に有用な範囲、すなわち、一般的には、
生菌数がトンあたり108〜1014、好ましくはトンあたり1
012〜1012の範囲内の乳酸桿菌を含有しているのが良
い。
プロピオニバクテリウム・ジェンセニー、および特に
好適なピー・ナイン株およびピー・ファーゴ株に関して
は、サイレージ１トンあたりの生菌数は、108〜1014/ト
ン、好ましくは1010〜1012/トンの範囲内でなければな
らない。所望の場合、プロピオン酸菌を単独で用いるこ
ともできるが、乳酸産生生物とともにそれらを併用する
方が好ましい。
また、本発明の組成物には、例えば、乳酸桿菌属（La
ctobacillus）、連鎖球菌属（Streptococcus）、および
ペディオコッカス属（Pediococcus）属のような他の一
般的サイレージ保存用生物、および真菌または細菌由来
のある種の酵素をも、それらが、活性のある好気性生物
に対して決して拮抗的に作用しないことを条件として、
含めることができる。
通常は技量の習塾者は、定型的な実験法を用いて、他
の適当な担体および投与形態を知ることもあり、あるい
は、それらを確認することも可能であると思われる。
さらに、通常の技量の習塾者に共通の標準的手法、例
えば噴霧、撤粉などを用いて、各種組成物の投与を実施
することもできる。
［実施例］ 上記開示は、本発明の一般的な記述である。説明のみ
を目的とし、別途指示のない限り、本発明を制約するこ
とを目的とせずにここに記載した次の実施例により、さ
らに詳細な理解を得ることができるのと思う。
後出の諸表に示した実施例の実行において、処理、調
製、および貯蔵の方法は、次の通りである。
1986年〜1988年にかけて実施されたサイレージ試験に
用いられたプロピオン酸菌属に種には、プロピオニバク
テリウム・ジェンセニー種のピー・ナイン株およびピー
・ファーゴ株の双方とともに、比較のために、他のプロ
ピオン酸菌も含まれていた。
プロピオニバクテリウム・ジェンセニー種は、アイオ
ワ州立大学培養コレクション（Culture Collection at
Iowa State University）から公共的に入手可能であ
り、また、アメリカ模式菌培養コレクション（ATCC）に
預託番号第53961号および第53962号として預託されてい
る。
試験では、Ｐ−19として表されるプロピオニバクテリ
ウム・シャーマニー（P.shermanii）、およびＰ−８と
して表されるプロピオニバクテリウム・トエニー（P.th
oenii）を比較のために用い、本発明の要件を満たすの
は、プロピオニバクテリウム・ジェンセニー、またはそ
の等価種のみであることを示すデータを得た。
接種物の量は、１グラムあたり105であった。これ
は、１トンあたり1011の生物数に相当する。処理法とし
ては、液体としてこれを投与した。
処理した穀物を等量に分割し、密着して重ねられるゴ
ム製ガスケット付きの蓋を有する５ガロン（約18.9リッ
トル）入りのプラスチック製バケツに充填する。蓋には
圧力解放弁を取り付け、ガスの漏出は可能であって、し
かも、嫌気生活が維持されるようになっている。サイロ
の条件を模倣するため、バケツは、蓋を開ける前に、こ
れを20〜25℃にて30〜120日間貯蔵する。
バケツの蓋を開けて、視覚的な色の変化、および臭気
について評点を与え、次いで、内容をプラスチック製シ
ート上に取り出す。穀物を掻き混ぜ、微生物学的および
化学的分析用に試料を採取する。
残った穀物を、500gずつに分割し、保温のために、壁
の厚さを約5cmとした特製のスタイロフォーム（Styrofo
am:商品名）製のコンテナに入れる。各コンテナ内の物
質の中央にサーミスタを立て、７〜10日目まで、１時間
ごとに温度を測定する。スピアポイント（spear poin
t）式のpH計を用いて、１日２回pH値を測定する。
適当な培地および条件（例えば、TSA、MRS、MS、NA
L、RBC、NBARC）を用いて、好気性生物、微好気性生
物、乳酸菌、連鎖球菌、乳酸利用生物、大腸菌、およ
び、酵母および糸状菌、さらに、放線菌の個体数を測定
する。穀物中の個体数の測定は、サイロ貯蔵する際に、
またサイレージを空気に接触させたときに、好気性条件
での安定性測定の０日目としてこれを行う。
サイロ貯蔵過程の開始時に飼料価値について試料を評
価し、穀物を開放した時点で、それらの好気的条件での
安定性を評価する。ADF、ADF−Ｎ、NDF、Ｎ、ASHなど、
常用飼料評価パラメータを測定した。穀物開放の日に好
気性条件での安定性について発酵酸も測定した。
乳酸菌属の細菌と併用した事例においては、一般的に
入手可能であって、パイオニア印第1186号（Pioneer Br
and 1186）として公知のパイオニア・ハイ−ブレッド・
インターナショナル社（Pioneer Hi−Bred Internation
al,Inc.）の市販製品を用いた。
パイオニア印第1186号は、米国特許第4,842,871号明
細書に記載のラクトバシラス・プランタールム（Lactob
acillus Plantarum）を含有する高湿の穀草接種物であ
る。上記発明の内容は、参照として本発明に組み込まれ
る。
後出の第１表乃至第３表は、試験結果を要約したもの
である。
「対照」には接種物を全く投与せず、「1186」はプロ
ピオン酸菌を含有しない。「Ｐ−８」は、本発明のプロ
ピオン酸菌属とは種とは異なる種であり、「Ｐ−19」も
同様である。「Ｐ−９」、「PF」は、それぞれピー・ナ
イン株、ピー・ファーゴ株を示す。データは、プロピオ
ニバクテリウム・ジェンセニー含有の開放後のサイレー
ジについては、pHが5.0を上回るまでに上昇し、かつ温
度が1.5℃上昇するには、概してより多くの時間が必要
であること、および、Ｐ−８およびＰ−19は、1186の存
在下で作用せず、実際には、1186単独での本来の性能に
対して拮抗的であるらしいことを示している。
1987年の研究では（第３表）、添加する株を単独で、
あるいは1186と併用して用い、サイレージを60日間空気
に接触させた。これら研究では、好気的条件で最も安定
なサイレージは、プロピオン酸菌属の種、すなわちＰ−
９、PF、およびＰ−８を単独で用いて再び処理したサイ
レージであった。これらは、８日間にわたって温度およ
びpHが安定であり、その時点で実験を終了した。最も不
安定であったのは、接種しなかった対照群であって、速
やかなpHの不安定性、および温度の上昇を示した。
Ｐ−19＋1186、および1186は、対照群よりも約１日だ
け長く安定であった。その他の混合物は、pHおよび温度
についての安定性は中間的であった。
プロピオン酸菌および1186の各株の混合物は、純粋な
プロピオン酸菌株のいずれよりも不安定であり、プロピ
オン酸の濃度が低かった。したがって、これらの研究で
は、1186とＰ−９およびPF以外の特定のプロピオン酸菌
株との混合接種を用いた場合に拮抗的応答が認められ
た。
1988年には、発酵の推移、および安定性に対する効果
を評価するために開放後の時間を更に長くし、かつＰ−
８およびＰ−９の２種類のプロピオン酸菌株のみを用い
た以外は、同一の設定を用いて試験を実施した。Ｐ−９
は、1186との併用において有効に作用したが、Ｐ−８は
作用しなかった。
第１表および第２表は、高湿の穀草の安定性に対する
処理の効果に関して、1986〜1988年に行われた試験結果
をまとめたものである。安定性は、pHが5.0を超えるま
でに上昇し、かつ内部温度が環境温度よりも、1.5℃上
回って上昇するのに要する時間として定義される。
第３表は、1986年から1988年までに実施した試験の要
約である。接種生物を全く含まないものを対照群とし、
これと比較しての安定性の増加または減少（−）を時間
で示した。
乳酸桿菌と本発明のプロピオニバクテリウム・ジェン
セニーとの特定の株同士の混合物による組合わせが有効
に作用する理由は、正確には不明であるが、好気的な劣
化過程における酵母、その他の有害微生物叢の生育を抑
制するのに充分な量の、酢酸およびプロピオン酸の産生
によることは間違いないものと思われる。
また発明者らが、高濃度の乳酸、および、pH3.8〜4.5
という、通常はプロピオン酸菌の活性と切り離せない環
境の値である5.0よりも低いpH値に対して、より強い耐
容性を有するプロピオニバクテリウム・ジェンセニーの
特定の株を発見したことも間違いないと思われる。
場合によっては、これらのプロピオン酸菌を接種した
サイレージは、サイレージを開放した時点での酵母の個
体数が相対的に少ないこともあり、サイロ貯蔵の過程に
おいて酵母の増殖が阻害されたことが示唆される。
このような例は、この効果が種特異的であって、この
属のずべての種、あるいは株が等しく効果的に作用する
わけではないことを証明している。プロピオニバクテリ
ウム・ジェンセニーなる種は最も強力であり、なかんず
く、ピー・ナイン株、およびピー・ファーゴ株が最良で
ある。
既に明らかにされた通り、好気的環境での保存効果を
得るには、接種物はプロピオニバクテリウム・シェンセ
ニー単独でも良く、あるいは、保存作用を有する嫌気性
生物と併用することも可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:225） Ｃ１２Ｒ 1:225）

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少量で、サイレージ保存に有効な量のプロ
    ピオニバクテリウム・ジェンセニー（Propionibacteriu
    m jensenii）種のピー・ナイン（Ｐ−９）株或いはピー
    ・ファーゴ（Ｐ−Fargo）株を用いて、サイレージを処
    理する工程によることを特徴とするサイレージの保存方
    法。
  2. 【請求項２】サイレージ１トン当りの生菌の量が、108
    〜1014/トンの菌数の範囲内である請求項１に記載のサ
    イレージの保存方法。
  3. 【請求項３】サイレージ１トン当りの生菌の量が、1010
    〜1012/トンの菌数の範囲内である請求項２に記載のサ
    イレージの保存方法。
  4. 【請求項４】サイレージ１トン当りの生菌の量が、1011
    /トンの菌数である請求項３に記載のサイレージの保存
    方法。
  5. 【請求項５】乳酸生産性微生物を用いて処理することを
    含む請求項１に記載のサイレージの保存方法。
  6. 【請求項６】乳酸桿菌（Lactobacillus）属の生物を用
    いて処理することを含む請求項１に記載のサイレージの
    保存方法。
  7. 【請求項７】乳酸桿菌（Lactobacillus）属の生物は、A
    TCC（米国模式培養コレクション）第53187号のラクトバ
    シラス・プランタールム（Lactobacillus plantarum）
    である請求項６に記載のサイレージの保存方法。
  8. 【請求項８】少量で、サイレージ保存有効量のプロピオ
    ニバクテリウム・ジェンセニー（Propionibacterium je
    nsenii）種のピー・ナイン（Ｐ−９）株或いはピー・フ
    ァーゴ（Ｐ−Fargo）株と、少量で、サイレージ保存有
    効量の乳酸桿菌（Lactobacillus）属とを併用すること
    を特徴とするサイレージ保存剤組成物。
  9. 【請求項９】適当な培養担体を含む請求項８記載のサイ
    レージ保存剤組成物。
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