JP2509557B2

JP2509557B2 - ブタ・ベ―タｆｓｈ

Info

Publication number: JP2509557B2
Application number: JP60124997A
Authority: JP
Inventors: アントン・ケイ・ベツク
Original assignee: INTEGUREETETSUDO JENETEITSUKUSU Inc
Current assignee: INTEGUREETETSUDO JENETEITSUKUSU Inc
Priority date: 1984-06-08
Filing date: 1985-06-08
Publication date: 1996-06-19
Anticipated expiration: 2011-06-19
Also published as: FR2565599A1; JPS6112290A; DE3520404A1; FR2565599B1; KR860000380A; DE3520404C2

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明は、組み換えDNA技術によつて生産される生殖
ホルモンに関するものである。

哺乳類は、ヒトを含めて、数種の生殖ホルモン、すな
わち、黄体形成ホルモン（LH）および濾胞刺激ホルモン
（FSH）を分泌し、それらは互いに異なる二つの部分か
らなつており（ヘテロダイマー性）、同一生物種内に於
いて、アルフア鎖は共通で、それぞれのβ鎖が特異性を
与えている。また、いくつかの哺乳類種のFSHはかなり
似ているので、ある哺乳類種の脳下垂体から得られたFS
Hの投与は生物学的に、互いに有効である、ということ
も知られている。ブタFSHは、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウ
マの過剰排卵を誘発することが観察されている。

発明の要約総括的には、本発明は一つの見地から言うと、ブタ・
ベータFSHをコード化するcDNA塩基配列を特徴とする。

別の見地から言えば、本発明はブタベータFSHをコー
ド化するDNA塩基配列を含有するベクター、特にプラス
ミドを、特徴とする。

本発明は、LH及び他のホルモンの混入することなく、
高度に純粋化されたブタベータFSHの生産を可能にする
ものである。

cDNAは、翻訳されないイントロンを持たないため、原
核細胞宿主に於いてより容易に使用できるので、本発明
のcDNAは、ブタベータFSHのゲノムDNAよりも優れてい
る。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の好ましい態様の
記述及び特許請求の範囲から明らかであろう。

好ましい態様（実施例）（１）ブタ・ベータFSH cDNA 下式は、本発明のブタベータFSH cDNAについて決定さ
れたヌクレオチド配列である。番号は塩基対の番号を示
し、コードしていない始めの隣接する53塩基対は示され
ていない。示されている初め（５′）の方の塩基対は翻
訳されない。リーダー配列の開始するATG（塩基108-11
1）を箱で囲んであるが、このATGは翻訳後に切断され
る。完成したタンパク質は、塩基169-171の丸で囲んで
あるトリプレツトTGTによつてコード化されているアミ
ノ酸システインから始まる。塩基番号494-496のTAAを箱
で囲んであるが、これは、コード領域の終わりを示す。

下式は、上記配列をトリプレツトに分割せずに、制限
酵素切断部位を示したものの再掲であつて、コード領域
を開始するATGは、箱で囲んである。

上記コード配列はブタベータFSHをコードするが、そ
のアミノ酸配列は、クロセツト（Closset）他著ヨーロ
ピアン・ジヤーカル・オブ・バイオケミストリー（Eur.
J.Biochem.）86,115（1978年）で公表されたものと、多
くの箇所で異なつている。この相違は以下のように要約
できる。

（２）cDNAの生成ブタベータFSHのcDNAの調製に於ける第一段階は、死
後20〜30分のブタから脳下垂体を採取することであつ
た。次に、以下のようにして、全RNAを抽出した。組織
の均質化（ホモジナイズ）は、フエノール:1mM EDTAを
含む100mM酢酸ナトリウム（pH5.5）の1:1の混合液中、6
0℃で20〜40分間行なわれた。氷上で10分間冷却後、遠
心によつて、液層を分離した。熱フエノールでの抽出
を、さらに２回行ない、その後クロロフオルムでの抽出
を２回行なつた。

RNAは2.5倍量のエタノールの添加により、最終的に得
られた水層から沈澱として得た。

ポリA⁺mRNAを濃縮するために、RNAを10mMトリス−HC
l、pH7.5で緩衝化した0.5MNaCl中でオリゴ（dT）−セル
ロースを通過させ、同じ溶液で洗浄した。ポリA⁺mRNAは
10mMトリス−HCl（pH7.5）,1mM EDTA,0.05％SDSで溶離
し、エタノールで２回沈殿させた。

ブタベータFSHのcDNAライブラリーは、脳下垂体mRNA
の逆転写、大腸菌（E.coli）のDNAポリメラーゼＩ（大
フラグメント）を用いての二本鎖の第二の鎖の合成、SI
ヌクレアーゼ処理、ターミナルヌクレオチジルトランス
フエラーゼによるホモポリマーのテーリング（dC）によ
つて作製された。これらの全ての処理は、常套的に行な
われる技術によるものである。

次に、PstIで切断し、dG“テイル”を付加してあるプ
ラスミドpBR322のDNA断片に、cDNA分子をアニーリング
させた。その後cDNAライブラリーを生成するために、こ
れらの大腸菌（E.coli）細胞の形質転換に使用した（形
質転換された細胞は、テトラサイクリン抵抗性を基準と
して選択された。）。

次にcDNAライブラリーは、“推測された”長プローブ
（long probe）を用いてスクリーニングを行なつた。こ
のようなプローブの基本的概念は、ジュイエ（Jaye）
他、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids
Research）11（８）,2325（1983年）で示されたもの
で、求めるタンパク質のアミノ酸配列が少なくとも部分
的に知られている場合、あらゆるアミノ酸（１種類以上
４種類以下の異なるトリプレツトにコードされている）
をコードするトリプレツトについて、知識に基づく推測
による、長プローブを構成することができる。どのよう
な正確な推測も、結果の相同性及び特異性を増大させ
る。cDNAの求める領域を得るために、ラベルされた２本
の45-merプローブとして、TB36（ブタベータFSHの56〜7
0番目のアミノ酸と相同のプローブ、およびTB21（72〜8
7番目のアミノ酸と相同のプローブ）を使用した。これ
らのプローブは、下に示すヌクレオチド構成を持つ。
（対応するアミノ酸も示す。）上記プローブをcDNAライブラリーのスクリーニングの
ために、以下のように使用した。プローブは、³²Pでラ
ベルし、グルンシユタイン（Grunstein）他、PNAS USA
72,3961（1975年）の、コロニーハイブリダイゼーシヨ
ン法によつて、cDNAをスクリーニングするのに用いた。
ハイブリダイゼーシヨン前の溶液は55℃に保たれ、次の
ような組成であつた:0.15M NaCl;0.15Mトリス塩酸（pH
8.0）;10mM EDTA;5×デンハルト（Denhardt′ｓ）溶液;
0.1％ピロリン酸ナトリウム;0.1％SDS;100g/ml大腸菌
（E.coli）t-RNA。ハイブリダイゼーシヨン溶液は、42
℃に保たれ、約0.5×10⁶cpm/mlの濃度でプローブを含む
こと以外は、上記溶液と同じ組成であつた。

このハイブリダイゼーシヨン法のスクリーニング処理
において、第１図に示されるPF55及びPF434の２つのcDN
A断片が得られた。第１図にはさらにそれらの断片とブ
タベータFSHの全配列との関係も示している。２つの断
片を、唯一SmaI部位で切断を行なうAvaIで切断し、翻訳
されない隣接する領域とともに、完全なブタベータFSH
のクローンを形成するように結合した。上記cDNA配列
は、大腸菌（E.coli）プラスミドpBR322に挿入され、イ
リノイ州，ペオリア（Peoria）のアグリカルチユラル・
リサーチ・カルチヤー・コレクシヨン（NRRL）に寄託さ
れており、NRRL受託番号B-15793が与えられている。本
出願の特許の発行とともに寄託されているプラスミドの
入手可能性についての全ての制限は最終的に解除され、
プラスミドは、特許権の有効である限り、保持されるで
あろうということは合意されている。

（３）形質発現ベクターへの挿入本発明のブタベータFSHのcDNA配列は、常套的手法を
用いて、ブタベータFSHを生成するように様々な形質発
現ベクターに挿入することができる。

第２図に関して言うと、ブタベータFSHのcDNA配列
は、例えば、ウシ乳頭腫ウイルス（BPV）形質発現ベク
ターに挿入し、そのベクター中では、上記cDNA配列が、
マウスのメタロチオネイン（MMT）のプロモーターの制
御下にあるようにすることが可能である。この方法の最
初の段階は、pBR322からPstI及びSacIを用いてcDNAを切
断することであるが、PstIはATGのすぐ後の５′末端
を、SacIはコード領域の最後よりもさらに後の３′末端
を切断するものである。（前記制限酵素切断地図参
照）。合成された配列を、ATGまで遺伝子を完成させ、B
amHIの腕（overhang）を含むように５′末端に付加させ
る。３′末端のSacIの腕は平滑とし、BamHIのリンカー
（linker）を付加させる。修飾された配列は、プラスミ
ドpFSH55/434Bam（第２図）を形成するように、Bam部位
でpBR322に挿入される。

次にマウスのメタロチオネインプロモーター、SV40 D
NA,上記PBR322断片を含むプラスミドCL28〔プラスミドJ
YMMT（Ｅ）；ヘイマー（Hamer）他、ジヤーナル・オブ
・モレキユラー・アンド・アプライド・ジエネテイクス
・（J.Mol.Applied Gen.）,1,273-288;に等しい〕を制
限酵素BglIIで切断する。この部位に３′末端に翻訳さ
れない領域を含む上記FSHのcDNAが挿入される。

得られたプラスミドは、SV40のDNA配列を遊離させる
ため、制限酵素BamHI及びSalIで切断される。

プラスミドpB2-2は、BPVの全ゲノムと、pBR322の配列
の一部を持つが、これを、BamHI及びSalIで、BamHI/Sal
I末端を持つ・BPVゲノムが得られるように切断する；こ
の断片を、上に示したように、形質発現プラスミドppFS
Hを形成するために、メタロチオネイン−FSH配列を含む
上記プラスミドに合成される。

以上のようにして得られたプラスミドppFSHは、哺乳
類宿主細胞の形質転換に使用することができ、常套的手
法によつて、ブタベータFSHを単離・精製することがで
きる。

（４）用途ブタベータFSHは、常套的手法を用いて、抗一ベータF
SH抗体を生産するのに使用でき、その抗体にラベルし
て、ヒト同様、ブタその他の動物の生物学的分泌液中に
存在するベータFSHに対するラジオイムノアツセイを行
なうことができる。ベータFSHの水準を測定すること
は、脳下垂体の腫瘍や、他の脳下垂体異常の診断、追
跡、および判定に於いて重要になるであろう。

また、本発明のブタベータFSHは、単独で、あるいは
アルフアFSHとの組み合わせで、家畜、すなわち、ブ
タ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの過剰排卵を誘発す
るのに使用できる。アルフアFSH（ウシ）はクローン化
および配列決定されており、アーウイン（Erwin）他、
バイオケミストリー（Biochemistry）22,4856（1983
年）に詳述されている。FSHはまた、市販されているも
の、例えばイリノイ州ケンタツキーのアーマー・フアー
マスーテイカル社レハイス部門（The Reheis division
of Armour Pharmaceutical Company）のものなどを入手
でき、この市販ダイマーからアルフア・サブユニツトを
得ることもできる。ベータ及びアルフアFSHは、特別な
反応条件を必要とすることなしに、自然にダイマーの形
に会合し得る。また、機能的ダイマーの形成には、２つ
のサブユニツトの由来する種は、同じものである必要は
ない。

ブタベータFSHの別の用途は、動物に於ける生殖器発
背不全、生殖腺退化、濾胞発育不全、持続性黄体嚢胞、
無精液症、不妊などの治療である。

本発明のブタベータFSHは単独であるいはアルフアFSH
とのダイマーの形のいずれによつても既定のFSH投与法
及び投与量に従つて、動物に投与することができる。脳
下垂体は、通常、生体内でベータFSHとダイマーを形成
することのできるアルフア・サブユニツトを過剰生成し
ているので、ベータFSHのみでも効力を発揮し得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ブタベータFSH遺伝子の模式図であつて、隣
接する領域を含み、特異的な制限酵素切断部位を示し、
完全なブタベータFSHをコードする配列を形成するため
に結合された２つのDDNA領域を図示している。第２図は、ブタベータFSH遺伝子を形質発現ベクターに
挿入するための手法の説明図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ブタFSHのβサブユニットをコードするcDN
Aであって、その際成熟βサブユニットが式：で表されるcDNA。
【請求項２】βサブユニットのシグナルペプチド；をコードするcDNA部分を５′末端にさらに含む特許請求
の範囲第１項記載のcDNA。
【請求項３】ブタFSHのβサブユニットをコードするcDN
Aであって、その際成熟βサブユニットが式：で表されるcDNAを含有するベクター。
【請求項４】ベクター中のcDNAが、βサブユニットのシ
グナルペプチド：をコードするcDNA部分を５′末端にさらに含む特許請求
の範囲第３項に記載のベクター。
【請求項５】プラスミドである、特許請求の範囲第３項
または第４項記載のベクター。