FR2565599A1 - Sequence d'adnc codant pour la beta fsh porcine, vecteur la comprenant, beta fsh produite et son utilisation - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
L'INVENTION A POUR OBJET UNE SEQUENCE D'ADNC CODANT POUR LA BETA FSH PORCINE. CETTE SEQUENCE PEUT ETRE INSEREE DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION, SELON DES METHODES CLASSIQUES. LA BETA FSH PORCINE AINSI OBTENUE PEUT ETRE UTILISEE POUR PRODUIRE DES ANTICORPS ANTIBETA FSH UTILISABLES DANS DES DOSAGES, PAR EXEMPLE DANS DES ESSAIS RADIO-IMMUNOLOGIQUES. ELLE PEUT EGALEMENT ETRE UTILISEE SEULE OU EN COMBINAISON AVEC L'ALPHA FSH POUR INDUIRE UNE SUPEROVULATION CHEZ LES ANIMAUX D'ELEVAGE OU POUR TRAITER DES DEREGLEMENTS HYPOPHYSAIRES. LA FIGURE 2 REPRESENTE L'INSERTION DE L'ADNC DE BETA FSH PORCINE DANS UN VECTEUR D'EXPRESSION.
Description
"Séquence d'ADNc codant pour la bêta FSH porcine1 vecteur
la comprenant, bêta FSH produite et son utilisation"
L ! invention est relative à des hormones de la
fertilité produites par des techniques d'ADN recombinant.
la comprenant, bêta FSH produite et son utilisation"
L ! invention est relative à des hormones de la
fertilité produites par des techniques d'ADN recombinant.
Les mammifères, y compris les êtres humains, sé
crètent plusieurs hormones de la fertilité, par exemple
l'hormone lutéinisante (LH) et 1' h o r m o n e follicu
1 o s t í m u 1 a n t e (FSH), qui sont hétérodiméri
ques et, à l'intérieur d'une espèce, présentent en commun
une chaîne alpha, la chaîne bêta de chacune lui conférant
sa spécificité. I1 est également connu que la FSH d'un cer
tain nombre d'espèces de mammifères est suffisamment simi
laire pour que l'administration de FSH obtenue à partir de
l'hypophyse d'une espèce soit biologiquement active dans
une autre. Il a été montré que la FSHporcine induit une
superovulation dans le bétail, chez les porcs, les moutons
et les chevaux.
crètent plusieurs hormones de la fertilité, par exemple
l'hormone lutéinisante (LH) et 1' h o r m o n e follicu
1 o s t í m u 1 a n t e (FSH), qui sont hétérodiméri
ques et, à l'intérieur d'une espèce, présentent en commun
une chaîne alpha, la chaîne bêta de chacune lui conférant
sa spécificité. I1 est également connu que la FSH d'un cer
tain nombre d'espèces de mammifères est suffisamment simi
laire pour que l'administration de FSH obtenue à partir de
l'hypophyse d'une espèce soit biologiquement active dans
une autre. Il a été montré que la FSHporcine induit une
superovulation dans le bétail, chez les porcs, les moutons
et les chevaux.
- De façon générale, l'invention concerne, selon
l'un de ses aspects, une séquence d'ADNc codant pour la
bêta FSH porcine.
l'un de ses aspects, une séquence d'ADNc codant pour la
bêta FSH porcine.
Selon un autre aspect, l'invention est relative
à un vecteur, de préférence un plasmide, contenant une sé
quence d'ADN codant pour la bêta FSH porcine.
à un vecteur, de préférence un plasmide, contenant une sé
quence d'ADN codant pour la bêta FSH porcine.
L'invention peut permettre la production de bêta
FSH porcine hautement purifiée, sans contamination par de
la LH ou d'autres hormones.
FSH porcine hautement purifiée, sans contamination par de
la LH ou d'autres hormones.
L'ADNc selon l'invention est supérieur à 1'ADN
de bêtaFSH porcine génomique, car l'ADNc'ne comprend pas
d'introns non translatés et par conséquent peut être plus
facilement utilisé dans des cellules hôtes procaryotiques.
de bêtaFSH porcine génomique, car l'ADNc'ne comprend pas
d'introns non translatés et par conséquent peut être plus
facilement utilisé dans des cellules hôtes procaryotiques.
D'autres caractéristiques et avantages de l'in Invention apparaîtront à la lecture de la description suivante de ses modes de réalisation préférés.
Les dessins seront tout d'abord décrits.
La figure 1 est une représentation sous forme de diagramme du gène de la bêta FSH porcine comprenant des ré- gions de "flanquement", présentant des sites de restriction uniques et illustrant deux régions d'ADN qui ont été fusionnées pour former la séquence complète codant pour la bêta
FSH porcine.
FSH porcine.
La figure 2 est une représentation sous forme de diagramme d'un processus pour insérer le gène de la bêta
FSH porcine dans un vecteur d'expression.
FSH porcine dans un vecteur d'expression.
ADNc de la bêta FSH porcine.
Ci-dessous est représéntée la séquence nucléotidique qui a été déterminée pour l'ADNc de la bêta FSH porcine selon l'invention. Les nombres indiquent les nombres de paires de bases; les paires de bases initiales 53 de flanquement, ne codant pas, ne sont pas données. Les paires de bases initiales (5') représentées ne sont pas translatées. I1 y a un encadrement (rectangle) autour de 1'ATG (bases 108-111) qui commence la séquence "conductrice" qui est clivée de façon post-translationnelle. La protéine mature commence avec l'aminoacide Cys codé par le triplet entouré par un cercle TGT, bases 169-171. I1 y a un encadrement autour des bases numéros 494-496, TAA, qui représente la fin de la région codante.
@2 112
GTA CTT TCA CGG TCT CGT ACA CCA GCT CCT TAA TTG TTT GGT CAC CCC AAG A@@ @@@ @@@
Val L@@ Ser Arg Ser Arg The Pro Ala Pro End L@u Phe @@@ Phe His Pro Lys @et Lys
142 172
TCD CTO CAG TTT TGC TTC CTA TTC TGT TGC TGC AAA GCC ATC TGC TGC AAT AGC TGT DAG
S@@ L@@ Gln Phe Cys Phe Leu Phe Cys Cys Tro Lys Ala Ile Cys Cys @@@ S@@ Cys Glu
202 232
CTG ACC AAC ATC ACC ATC ACA GTG GAG AAA GAG GAG TGT AAC TTC TGC ATA AGC ATC AAC
Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu L@@ Glu Glu Cys aSN Phe Cys Ile S@@ Ile Asn @@@ @@@
ACC ACG TGG TGT GCT GGC TAT TGC TAC ACC CGC GAC CTG GTA TAC AAG GAC CCA GCC AGG
Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp PrO Ala Arg @@@ @@@
CCC AAC ATC CAG AAA ACA TGT ACC TTC AAG GAG CTG GTG TGC GAG ACC GTG AAA GTA CCT
Pra Asn Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro @@@
GGC TGT GCT CAC CAT GCA GAC TCC CTG TAT ACG TAT CCA GTA GCC ACC GAA TGT CAC TGT
Gly Cys Als His His Ala A@@ S@@ L@@ @@@ Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu Cy# His Cys
442 472
GCC AAG TGT CAC AGT GAC AGT ACT GAC TCC ACC GTG ACA GGC CTG GGG CCC AGC TAC TGC
Gly Lys Cys Asp Ser @@@ @@@ Thr Asp Cys Thr Val A@@ Gly L@@ Gly Pra S@@ Tyr Cys
302 332
TCC TTC AGT GAA ATG AAA GAA TAA AGA GCA GTG GAC ATT TCA TGC TTC CTA CCC TTG TCT
S@@ Phe Ser Glu @@@ Lys Glu En@ Arg Ala Val Asp Ile Ser Cys Phe Lou Pro Leu Ser
362 572
GAA GGA CCA AGA CGT CCA AGA AGT TTG TGT GTA CAT GTG CCC ACG CTG CAA ACC ACT ATG
Glu Gly Pro Arg Arg Pro Arg Ser Leu Cys Val Hle Val @@@ @@@ L@@ Gln Thr Thr @@@
422 452
AGA CAC CCC ACT GAT CCC TGC TGT CCT GTG GAG GAG GAG CTC CAG GAA TGC AGA GTG CTA Arg A@@ P@@ @@@ @@@ @@@ CyS Cys Pro Val Glu Glu Glu Leu Gln Glu Cys A@@ Vla L@@
482 712
GGG CCT CAG TCC CAT CAC CAC TCA ACC CTG TAT TTT GGG TCT GGT TCC ATA AGT TTT ATT
Gly Pre @@@ Ser His His His Ser Thr Leu Tyr Phe Glu Ser Glu Ser Ile @@@ @@@ Ile
742 772
CGG TCT TTT TTT TTT AAA TTA CTC AAT GAA TTT TAT TAC ATT TAT AAT TGT AGC AAG GAT
Arg @@@ Phe Phe Phe Lys Leu Leu Asn Glu Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn Cys @@@ Lys Asp
CAT CAC AA
His His
Ci-dessous se trouve une reproduction de la sé quence représentée plus haut non interrompue en triplets, pr6sentant des sites de restriction ; le groupement ATG commençant la région codante est encadré.
GTA CTT TCA CGG TCT CGT ACA CCA GCT CCT TAA TTG TTT GGT CAC CCC AAG A@@ @@@ @@@
Val L@@ Ser Arg Ser Arg The Pro Ala Pro End L@u Phe @@@ Phe His Pro Lys @et Lys
142 172
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202 232
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ACC ACG TGG TGT GCT GGC TAT TGC TAC ACC CGC GAC CTG GTA TAC AAG GAC CCA GCC AGG
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CCC AAC ATC CAG AAA ACA TGT ACC TTC AAG GAG CTG GTG TGC GAG ACC GTG AAA GTA CCT
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GGC TGT GCT CAC CAT GCA GAC TCC CTG TAT ACG TAT CCA GTA GCC ACC GAA TGT CAC TGT
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442 472
GCC AAG TGT CAC AGT GAC AGT ACT GAC TCC ACC GTG ACA GGC CTG GGG CCC AGC TAC TGC
Gly Lys Cys Asp Ser @@@ @@@ Thr Asp Cys Thr Val A@@ Gly L@@ Gly Pra S@@ Tyr Cys
302 332
TCC TTC AGT GAA ATG AAA GAA TAA AGA GCA GTG GAC ATT TCA TGC TTC CTA CCC TTG TCT
S@@ Phe Ser Glu @@@ Lys Glu En@ Arg Ala Val Asp Ile Ser Cys Phe Lou Pro Leu Ser
362 572
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422 452
AGA CAC CCC ACT GAT CCC TGC TGT CCT GTG GAG GAG GAG CTC CAG GAA TGC AGA GTG CTA Arg A@@ P@@ @@@ @@@ @@@ CyS Cys Pro Val Glu Glu Glu Leu Gln Glu Cys A@@ Vla L@@
482 712
GGG CCT CAG TCC CAT CAC CAC TCA ACC CTG TAT TTT GGG TCT GGT TCC ATA AGT TTT ATT
Gly Pre @@@ Ser His His His Ser Thr Leu Tyr Phe Glu Ser Glu Ser Ile @@@ @@@ Ile
742 772
CGG TCT TTT TTT TTT AAA TTA CTC AAT GAA TTT TAT TAC ATT TAT AAT TGT AGC AAG GAT
Arg @@@ Phe Phe Phe Lys Leu Leu Asn Glu Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn Cys @@@ Lys Asp
CAT CAC AA
His His
Ci-dessous se trouve une reproduction de la sé quence représentée plus haut non interrompue en triplets, pr6sentant des sites de restriction ; le groupement ATG commençant la région codante est encadré.
62 72 82 92 @@@ @@@
CTCCTTTCAC GGTCTCCTAC ACCAGCTCCT TCATTGTTTG GTTTCCACCC C@@@@@@@@@@
@ @ @
@ @ @
@ @ @
@ @ @
122 132 142 1@@ 162 172
TCGCTGCAGT TTTGCTTCCT ATTCTGTTGC TGGAAAGCCA TCTGCTGCAA TAGCTGTGAG @@ @ @ @
@@ @ @ @
@@ @ U @
@@ @ I @
182 192 202 212 @@@ @@@
CTGACCAACA TCACCATCAC AGTGGGGAAA GAGGAGTGTA ACTTCTCCAT AAGCATCAAC H M @
P N @
H L @
I I @
242 252 @@@ 272 @@@ 272
ACCACGTGGT GTCCTGGCTA TTGCTACACC CGGGACCTGG TATACAAGGA CCCAGCAGG @@ A H S A @ S
MC V S N V @ A @@ A T A A @ U
@@ @ I 1 @ @ I
292 312 222 222 @@@ @@@
CCCAACATCC AGAAAACATG TACCTTCAAG GAGCTGGTGT ACGAGACCGT GA@@@TACCT F @ @ @ @ A A R @
O @ @ L S S @
K @ @ U A A @
I @ @ I I I I
362 372 382 @@@ @@@ @@@
GGCTGTGCTC ACCATGCCGA CTCCCTGTAT AGGTATCCAG TAGCCACCCA ATGTCACTGT
H H H @ S @ P I N
@ H N A
@ I 1 I
472 482 442 @@@ 462 472
GGCAAGTGTG ACAGTGACAG TACTGACTGC ACCGTGAGAG GCCTGGGGCC CAGCTACTGC
@@ MSH B AS A
@@ NTA S FA L
@@ LUE T AU U @@ @@@ I II I
482 @@2 @@@ @@@ 522 @@@
TCCTTCAGTG AAATGAAAGA ATAAAGAGCA GTGGACATTT CATGCTTCCT ACCCTTGTCT
542 @@@ @62 572 582 592 GAAGGACCAA GACGTCCAAG A@GTTTGTGT GTACATGTGG CCAGGCTGCA AACCACTATG
A A R A @ @
V A S F @ @
A T A L T V
- Z Z I @ I I
402 412 422 432 442 452
AGAAACCCCA CTGATCCCTG CTGTCCTGTG GAGGAGGAGC TCCAGGAATG CAGAGTGCTA
S H H @@ @
I H H AL S
H L L CU T I I I @@ I
442 472 482 492 702 712
@GGCCTCAGT CCCATCACCA CTCAACCCTG TATTTTGGGT CTCCTTCCAT AAGTTTTATT
SH NO H
AA NO P
UE LE H @@ 11 I
722 732 742 732 742 772
.CGGTCTTTTT TTTTTAAATT ACTCAATGAA TTTTATTACA TTTATAATTG TAGCAAGGAT A @@
H @@
A @@
I @@
CATCACAA
La séquence codante représentée ci-dessus code pour la bêta FSH porcine dont la séquence d'amino-acides diffère selon un certain nombre d'aspects de celle qui a été publiée par Closset et coll. (1978) dans Eur. J. Biochem. 86, 115. Les différences peuvent être résumées comme suit.
CTCCTTTCAC GGTCTCCTAC ACCAGCTCCT TCATTGTTTG GTTTCCACCC C@@@@@@@@@@
@ @ @
@ @ @
@ @ @
@ @ @
122 132 142 1@@ 162 172
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@@ @ @ @
@@ @ U @
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182 192 202 212 @@@ @@@
CTGACCAACA TCACCATCAC AGTGGGGAAA GAGGAGTGTA ACTTCTCCAT AAGCATCAAC H M @
P N @
H L @
I I @
242 252 @@@ 272 @@@ 272
ACCACGTGGT GTCCTGGCTA TTGCTACACC CGGGACCTGG TATACAAGGA CCCAGCAGG @@ A H S A @ S
MC V S N V @ A @@ A T A A @ U
@@ @ I 1 @ @ I
292 312 222 222 @@@ @@@
CCCAACATCC AGAAAACATG TACCTTCAAG GAGCTGGTGT ACGAGACCGT GA@@@TACCT F @ @ @ @ A A R @
O @ @ L S S @
K @ @ U A A @
I @ @ I I I I
362 372 382 @@@ @@@ @@@
GGCTGTGCTC ACCATGCCGA CTCCCTGTAT AGGTATCCAG TAGCCACCCA ATGTCACTGT
H H H @ S @ P I N
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@ I 1 I
472 482 442 @@@ 462 472
GGCAAGTGTG ACAGTGACAG TACTGACTGC ACCGTGAGAG GCCTGGGGCC CAGCTACTGC
@@ MSH B AS A
@@ NTA S FA L
@@ LUE T AU U @@ @@@ I II I
482 @@2 @@@ @@@ 522 @@@
TCCTTCAGTG AAATGAAAGA ATAAAGAGCA GTGGACATTT CATGCTTCCT ACCCTTGTCT
542 @@@ @62 572 582 592 GAAGGACCAA GACGTCCAAG A@GTTTGTGT GTACATGTGG CCAGGCTGCA AACCACTATG
A A R A @ @
V A S F @ @
A T A L T V
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402 412 422 432 442 452
AGAAACCCCA CTGATCCCTG CTGTCCTGTG GAGGAGGAGC TCCAGGAATG CAGAGTGCTA
S H H @@ @
I H H AL S
H L L CU T I I I @@ I
442 472 482 492 702 712
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SH NO H
AA NO P
UE LE H @@ 11 I
722 732 742 732 742 772
.CGGTCTTTTT TTTTTAAATT ACTCAATGAA TTTTATTACA TTTATAATTG TAGCAAGGAT A @@
H @@
A @@
I @@
CATCACAA
La séquence codante représentée ci-dessus code pour la bêta FSH porcine dont la séquence d'amino-acides diffère selon un certain nombre d'aspects de celle qui a été publiée par Closset et coll. (1978) dans Eur. J. Biochem. 86, 115. Les différences peuvent être résumées comme suit.
N de l'aminoacide Closset et coll. bêta FSH porcine
codée par l'ADNc de ~~~~~~~~~~~~~~~ de l'invention
2 Glx Glu
11 Glx Glu
12 Val Lys
13 Lys Glu
14 Cys Glu
15 Leu Cys
16 Thr Asn
31 Thr Tyr
33 Gly
35 Asx Asp
40 Asx Asp
45 Asx Asn
47 Glx Gln
52 Tyr Phe
53 Arg Lys
54 Glx Glu
58 Glx Glu
70 Asx Asp
80 Glx Glu
87 Asx Asp
89 Asx Asp
92 Asx Asp
106 Gly Ser
108-110 --- Met-Lys-Gly
Production d'ADNc.
codée par l'ADNc de ~~~~~~~~~~~~~~~ de l'invention
2 Glx Glu
11 Glx Glu
12 Val Lys
13 Lys Glu
14 Cys Glu
15 Leu Cys
16 Thr Asn
31 Thr Tyr
33 Gly
35 Asx Asp
40 Asx Asp
45 Asx Asn
47 Glx Gln
52 Tyr Phe
53 Arg Lys
54 Glx Glu
58 Glx Glu
70 Asx Asp
80 Glx Glu
87 Asx Asp
89 Asx Asp
92 Asx Asp
106 Gly Ser
108-110 --- Met-Lys-Gly
Production d'ADNc.
La première étape de la production d'ADNc de la bêta FSH porcine a été d'extraire les glandes hypophyses de porcs20 à 30 minutes après la mort. Puis 1'ARN total a été extrait comme suit. L'homogénéisation du tissu a été effectuée dans un mélange 1:1 de phénol:acétate de Na 100 mM (pH 5,5) contenant de L'ENTA lmM tiédi à 605C pendant 20 minutes. Après refroidissement sur de la glace pendant 10 minutes, les phases ont été séparées par centrifugation.
L'extraction au phénol chaud a été répétée deux fois de plus, suivie par deux extractions au chloroforme.
L'ARN a été précipité à partir de la phase aqueuse finale par addition de 2,5 volumes d'éthanol.
Afin d'enrichir en poly A+ ARNm, on a fait passer 1'ARN sur de l'oligo-(dT)-cellulose dans du NaCl 0,5 M tamponné avec du Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, et on a lavé avec la même solution. Le poly A+ ARNm a été élué avec du Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), de 1'ENTA 1 mM, du SDS (dodécylsulfate de sodium) à 0,05 % et précipité deux fois à 1'méthanol.
On a constitué une banque d'ADNc de bêta FSH porcine par transcription inverse d'ARNm hypophysaire,synthèse de la deuxième couche en utilisant de 1'ADN polymérase I de
E. coli (grand fragment), traitement par de la SI nucléase et fixation d'une "queue" dhomopolymère (dC) au moyen de désoxynucléotidyltransférase terminale ; toutes ces façons de procéder ont été mises en oeuvre selon des techniques classiques.
E. coli (grand fragment), traitement par de la SI nucléase et fixation d'une "queue" dhomopolymère (dC) au moyen de désoxynucléotidyltransférase terminale ; toutes ces façons de procéder ont été mises en oeuvre selon des techniques classiques.
Les molécules d'ADNc ont été ensuite mises sous forme d'anneaux avec des fragments d'ADN du plasmide pBR322 qui avait été digéré par PstI et auquel on avait ajouté des "queues" de dG. Ces plasmides recombinants ont été ensuite utilisés pour transformer des cellules de E. coli pour générer une banque d'ADNc (les cellules transformées ont été sélectionnées sur la base de la résistance à la tétracycline).
La banque d'ADNc a ensuite été analysée (soumise à un "screening") en utilisant de longues sondes choisies
"au jugé" ; le concept de base de telles sondes, exposé par Jaye et coll. (1983) dans Nucleic Acids Research 11(8) 2325, est que si la séquence d'aminoacide d'une protéine désirée est au moins partiellement connue, une longue sonde peut être construite dans laquelle des fragments "au jugé" choisis de façon raisonnée (educated guesses) sont introduits en ce qui concerne le triplet codant pour tout aminoacide qui peut être codé par plus d'un triplet et par pas plus de quatre triplets différents. Tout fragment "au jugé" correct augmente la proportion d'homologie et améliore la spécificité des résultats.Pour obtenir des régions désirées d'ADNc, on a utilisé deux sondes marquées de 45 "bases" (45-mer): la TB36, homologue des aminoacides 56-70 de la bêta FSH porcine, et la TB21, homologue des aminoacides 72-87. Ces sondes présentent les compositions suivantes en nucléotides(les aminoacides correspondants sont également indiqués)
TB36 : Val-Tyr-Glu-Thr-Val-Lys-Val (AA56-70) 3' CAC ATG CTC TGG CAC TCT CAC
Pro-Gly-Cys-Ala-His-His-Ala-Asp
GGT CCG ACG CGG GTG GTG CGA CTG 5'
TB21 : Tyr-Thr-Tyr-Pro-Val-Ala-Thr (AA72-87) 3' ATG TGC ATG GGT CAC CGA TGT
Glu-Cys-His-Cys-Gly-Lys-Cys-Asp
CTC ACA GTG ACG CCG TTT ACG CTG 5'
Les sondes ci-dessus ont été utilisées pour "analyser" la banque d'ANDc comme suit.Les échantillons ont été marqués au 32p et utilisés pour "analyser" la banque d'ADNc selon le processus d'hybridation en colonies de
Grunstein et coll. (1975) PNAS USA 72, 3961. La solution de préhybridation a été'maintenue à 555C et avait la composition : NaCl 0,75 M ; Tris HC1 0,15 M, pH 8,0 ; EDTA 10 mM; 5 x solution de Denhardt ; 0,1 % de pyrophosphate de sodium; 0,1 % de SDS; 100 g/ml d'ARNt de E. coli. La solution dhy- bridation avait la même composition si ce n'est qu'elle était maintenue à 425C et contenait la sonde à une concentration d'environ 0,5 x 106 cpm/ml.
"au jugé" ; le concept de base de telles sondes, exposé par Jaye et coll. (1983) dans Nucleic Acids Research 11(8) 2325, est que si la séquence d'aminoacide d'une protéine désirée est au moins partiellement connue, une longue sonde peut être construite dans laquelle des fragments "au jugé" choisis de façon raisonnée (educated guesses) sont introduits en ce qui concerne le triplet codant pour tout aminoacide qui peut être codé par plus d'un triplet et par pas plus de quatre triplets différents. Tout fragment "au jugé" correct augmente la proportion d'homologie et améliore la spécificité des résultats.Pour obtenir des régions désirées d'ADNc, on a utilisé deux sondes marquées de 45 "bases" (45-mer): la TB36, homologue des aminoacides 56-70 de la bêta FSH porcine, et la TB21, homologue des aminoacides 72-87. Ces sondes présentent les compositions suivantes en nucléotides(les aminoacides correspondants sont également indiqués)
TB36 : Val-Tyr-Glu-Thr-Val-Lys-Val (AA56-70) 3' CAC ATG CTC TGG CAC TCT CAC
Pro-Gly-Cys-Ala-His-His-Ala-Asp
GGT CCG ACG CGG GTG GTG CGA CTG 5'
TB21 : Tyr-Thr-Tyr-Pro-Val-Ala-Thr (AA72-87) 3' ATG TGC ATG GGT CAC CGA TGT
Glu-Cys-His-Cys-Gly-Lys-Cys-Asp
CTC ACA GTG ACG CCG TTT ACG CTG 5'
Les sondes ci-dessus ont été utilisées pour "analyser" la banque d'ANDc comme suit.Les échantillons ont été marqués au 32p et utilisés pour "analyser" la banque d'ADNc selon le processus d'hybridation en colonies de
Grunstein et coll. (1975) PNAS USA 72, 3961. La solution de préhybridation a été'maintenue à 555C et avait la composition : NaCl 0,75 M ; Tris HC1 0,15 M, pH 8,0 ; EDTA 10 mM; 5 x solution de Denhardt ; 0,1 % de pyrophosphate de sodium; 0,1 % de SDS; 100 g/ml d'ARNt de E. coli. La solution dhy- bridation avait la même composition si ce n'est qu'elle était maintenue à 425C et contenait la sonde à une concentration d'environ 0,5 x 106 cpm/ml.
Le processus d'analyse ("screening") de l'hybri- dation a fourni deux séquences d'ADNc, PF55 et PF434, représentées à la figure 1, qui illustre également leur relation avec la séquence complète de bêta FSH porcine. Les deux séquences ont été scindées par AvaI, qui scinde sur le site unique SmaI, et fusionnées pour former le clone de bêta FSH porcine complète, avec des régions de flanquement non translatées. La séquence d'ADNc, insérée dans le plasmide pBR322 de E. coli, a été déposée à l'Agricultural
Research Culture Collection (NRRL), peoria, Illinois (USA) et a reçu le numéro d'accès NRRL B-15793.
Research Culture Collection (NRRL), peoria, Illinois (USA) et a reçu le numéro d'accès NRRL B-15793.
Insertion dans un vecteur d'expression.
La séquence d'ADNc de bêta FSH porcine selon l'invention peut être insérée, en utilisant des techniques traditionnelles, dans n'importe lequel d'un grand nombre de vecteurs d'expression, pour la production de bêta FSH porcine.
Si l'on se réfère maintenant à la figure 2, la séquence d'ADNc de bêta FSH porcine peut, par exemple, être insérée dans un vecteur d'expression de virus de papillome bovin (BPV) dans lequel la séquence d'ADNc est sous le contrôle du promoteur méta-llothionéine de souris (MMT). La première étape de ce processus sera de séparer l'ADNc à partir du pBR322 en utilisant PstI et SacI, qui scinderont à l'extrémité 5' juste en aval de 1'ATG, et à l'extrémité 3', en aval à partir de l'extrémité de la région codante (voir le schéma de restriction ci-dessus).Une séquence synthétique sera ajoutée à l'extrémité 5' qui complétera le gène jusqu'à 1'ATG et contiendra un "site en "surplomb"
(overhang) pour BamHI.A l'extrémité 3', le "site en surplomb" pour SacI sera "émoussé" et un lien (linker) pour BamHI sera fixé. La séquence modifiée sera insérée dans pBR322 sur le site Bam pour former le plasmide pFSH 55/434 Bam
(figure 2).
(overhang) pour BamHI.A l'extrémité 3', le "site en surplomb" pour SacI sera "émoussé" et un lien (linker) pour BamHI sera fixé. La séquence modifiée sera insérée dans pBR322 sur le site Bam pour former le plasmide pFSH 55/434 Bam
(figure 2).
Puis le plasmide CL28 (identique au plasmide
JYMMT(E); Hamer et coll. (1983) J. Mol. Applied Gen. 1, 273-288), contenant le promoteur métallothionéine murin, 1'ADN SV40; et les séquences de pBR322, est scindé par l'en- donucléase de restriction BglII. Sur ce site est inséré 1'ADNc de FSH, contenant une région non translatée à l'ex- trémité 3'.
JYMMT(E); Hamer et coll. (1983) J. Mol. Applied Gen. 1, 273-288), contenant le promoteur métallothionéine murin, 1'ADN SV40; et les séquences de pBR322, est scindé par l'en- donucléase de restriction BglII. Sur ce site est inséré 1'ADNc de FSH, contenant une région non translatée à l'ex- trémité 3'.
Le plasmide résultant est digéré par les enzymes de restriction BamHI et SalI pour libérer les séquences d'ADN SV40.
Le plasmide pB2-2, qui contient le génome entier
BPV, et quelques'séquences de pBR322, est digéré par
BamHI et SalI pour fournir le génome BPV avec des extrémités BamHI/SalI; ce fragment est "ligaturé" dans le plasmide ci-dessus contenant les séquences métallothionéine
FSH, pour former le plasmide ppFSH d'expression, comme représenté.
BPV, et quelques'séquences de pBR322, est digéré par
BamHI et SalI pour fournir le génome BPV avec des extrémités BamHI/SalI; ce fragment est "ligaturé" dans le plasmide ci-dessus contenant les séquences métallothionéine
FSH, pour former le plasmide ppFSH d'expression, comme représenté.
Le plasmide ppFSH peut ensuite être alors utilisé pour transformer des cellules hôtes de mammifères, et la bêta FSH porcine peut être isolée et purifiée, selon des méthodes classiques.
Utilisation.
La bêta FSH porcine peut être utilisée pour produire des anticorps anti-bêta FSH, en utilisant des mé- thodes classiques, lesquels peuvent être marqués et utilisés dans des essais radio-immunologiques relatifs à desflui- des biologiques de porcs et d'autres animaux ainsi que d'êtres humains,pour la bêta FSH. La mesure des niveaux de bêta
FSH peut être importante dans le diagnostic, la surveillance et la caractérisation des tumeurs hypophysaires et d'autres disfonctions hypophysaires.
FSH peut être importante dans le diagnostic, la surveillance et la caractérisation des tumeurs hypophysaires et d'autres disfonctions hypophysaires.
La bêta FSH porcine selon l'invention peut également être utilisée seule ou en combinaison avec de l'alpha FSH pour induire une superovulation dans des animaux de la ferme, par exemple des porcs, du bétail, des chevaux, des moutons et des chèvres. L'alpha FSH (bovine) a été clonéeet séquencée, et décrite par Erwin et coll. (1983) dans
Biochemistry 22, 4856. La FSH est également disponible dans le commerce, par exemple auprès de la division Reheis de
Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, Illinois (USA), et la sous-unité alpha peut être obtenue à partir du dimère commercial. La bêta et l'alpha FSH peuvent s'associer spontanément sous la forme dimère sans nécessiter de conditions de réaction spéciales.De même, les e s p è c e s
dont les deux sous-unités sont dérivées n'ont pas à être les mêmes pour qu'un dimère fonctionnel soit formé.
Biochemistry 22, 4856. La FSH est également disponible dans le commerce, par exemple auprès de la division Reheis de
Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, Illinois (USA), et la sous-unité alpha peut être obtenue à partir du dimère commercial. La bêta et l'alpha FSH peuvent s'associer spontanément sous la forme dimère sans nécessiter de conditions de réaction spéciales.De même, les e s p è c e s
dont les deux sous-unités sont dérivées n'ont pas à être les mêmes pour qu'un dimère fonctionnel soit formé.
D'autres utilisations de la FSH porcine sont le traitement, chez les animaux, de l'infantilisme génital, de la régression gonadale, du développement folliculaire incomplet, des kystes lutéaux persistants, de l'asper- mie, et de l'infertilité.
La bêta FSH porcine selon l'invention peut être administrée à des animaux selon des techniques et des dosages établis d'administration de la FSH,qu'elle soit administrée seule ou sous forme d'un dimère avec l'alpha FSH. La bêta
FSH seule peut être efficace étant donné que l'hypophyse normalement surproduit la sous-unité alpha qui est disponible pour la formation d'un dimère avec la bêta FSH in vive.
FSH seule peut être efficace étant donné que l'hypophyse normalement surproduit la sous-unité alpha qui est disponible pour la formation d'un dimère avec la bêta FSH in vive.
L'invention vise tout particulièrement une séquence d'ADNc codant pour la bêta FSH porcine ; un vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour la bêta FSH porcine, ledit vecteur étant de préférence un plasmide.
Claims (5)
1. Séquence d'ADNc codant pour la bêta FSH porcine.
2. Vecteur comprenant une séquence d'ADN codant pour la bêta FSH porcine.
3. Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
4. Bêta FSH porcine obtenue au moyen d'un vec
teur selon la revendication 2 ou 3.
5. Utilisation de la bêta FSH porcine selon la revendication 4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61846684A | 1984-06-08 | 1984-06-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2565599A1 true FR2565599A1 (fr) | 1985-12-13 |
| FR2565599B1 FR2565599B1 (fr) | 1989-08-25 |
Family
ID=24477824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR858508647A Expired FR2565599B1 (fr) | 1984-06-08 | 1985-06-07 | Sequence d'adnc codant pour la beta fsh porcine, vecteur la comprenant, beta fsh produite et son utilisation |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2509557B2 (fr) |
| KR (1) | KR860000380A (fr) |
| DE (1) | DE3520404C2 (fr) |
| FR (1) | FR2565599B1 (fr) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0211894A1 (fr) * | 1985-01-30 | 1987-03-04 | Vemuri B Reddy | Fsh. |
| US5639640A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | DNA encoding the beta subunit of human follide stimulating hormone and expression vectors and cells containing same |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4859765B2 (ja) * | 2007-06-21 | 2012-01-25 | 株式会社日立国際電気 | 電子機器の冷却構造 |
| JPWO2014147961A1 (ja) * | 2013-03-19 | 2017-02-16 | 富士電機株式会社 | 電子機器冷却装置およびこれを備える電力変換装置 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0120694A2 (fr) * | 1983-03-25 | 1984-10-03 | Celltech Limited | Procédés pour la production des polypeptides ou protéines à chaînes multiples |
| WO1985001958A1 (fr) * | 1983-11-02 | 1985-05-09 | Reddy Vemuri B | Production d'hormones heterodimeriques de la fertilite chez l'homme |
-
1985
- 1985-06-07 FR FR858508647A patent/FR2565599B1/fr not_active Expired
- 1985-06-07 DE DE3520404A patent/DE3520404C2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-08 JP JP60124997A patent/JP2509557B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-08 KR KR1019850004051A patent/KR860000380A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0120694A2 (fr) * | 1983-03-25 | 1984-10-03 | Celltech Limited | Procédés pour la production des polypeptides ou protéines à chaînes multiples |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 89, no. 5, 31 juillet 1978, page 201, résumé no. 38346t, Columbus, Ohio, US; J. CLOSSET et al.: "Porcine follitropin. Isolation and characterization of the native hormone and its alpha and beta subunits", & EUR. J. BIOCHEM. 1978, 86(1), 105-13 * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 89, no. 5, 31 juillet 1978, page 201, résumé no. 38347u, Columbus, Ohio, US; J. CLOSSET et al.: "Porcine follitropin. The amino-acid sequence of the beta subunit", & EUR. J. BIOCHEM. 1978, 86(1), 115-20 * |
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| US5639640A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | DNA encoding the beta subunit of human follide stimulating hormone and expression vectors and cells containing same |
| US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
| US5856137A (en) * | 1983-11-02 | 1999-01-05 | Genzyme Corporation | Nucleic acids encoding and recombinant production of the β subunit of lutenizing hormone |
| EP0211894A1 (fr) * | 1985-01-30 | 1987-03-04 | Vemuri B Reddy | Fsh. |
| EP0211894A4 (fr) * | 1985-01-30 | 1987-10-12 | Vemuri B Reddy | Fsh. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2565599B1 (fr) | 1989-08-25 |
| JPS6112290A (ja) | 1986-01-20 |
| DE3520404A1 (de) | 1986-03-27 |
| KR860000380A (ko) | 1986-01-28 |
| DE3520404C2 (de) | 1994-06-16 |
| JP2509557B2 (ja) | 1996-06-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |