JP2503716B2 - 酸性ホスファタ―ゼ活性測定法 - Google Patents
酸性ホスファタ―ゼ活性測定法Info
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- JP2503716B2 JP2503716B2 JP9189690A JP9189690A JP2503716B2 JP 2503716 B2 JP2503716 B2 JP 2503716B2 JP 9189690 A JP9189690 A JP 9189690A JP 9189690 A JP9189690 A JP 9189690A JP 2503716 B2 JP2503716 B2 JP 2503716B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酸性ホスファターゼ活性測定法に関する。
本発明によれば酸性ホスファターゼ活性の高感度測定が
可能であり、臨床検査用測定法として医学的治療や臨床
検査の分野において極めて有用である。
本発明によれば酸性ホスファターゼ活性の高感度測定が
可能であり、臨床検査用測定法として医学的治療や臨床
検査の分野において極めて有用である。
［従来の技術］ 酸性ホスファターゼ（以下Acpと記す）は、酸性条件
下（pH4〜６）において、リン酸モノエステルを加水分
解する酸素で、前立腺癌、骨移転をもつ乳癌や骨疾患、
肝及び腎疾患患者で血清、血漿または尿中のAcp活性の
上昇が見られ、特に前立腺癌において著しく上昇するこ
とから、Acp活性は腫瘍マーカーとして極めて重要とさ
れている。
下（pH4〜６）において、リン酸モノエステルを加水分
解する酸素で、前立腺癌、骨移転をもつ乳癌や骨疾患、
肝及び腎疾患患者で血清、血漿または尿中のAcp活性の
上昇が見られ、特に前立腺癌において著しく上昇するこ
とから、Acp活性は腫瘍マーカーとして極めて重要とさ
れている。
これまでにAcp活性を、基質としてフェニルリン酸、
ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、プロ
パンジオールリン酸、チモールフタレインリン酸、フェ
ノールフタレインリン酸、アデノシンモノリン酸、ナフ
チルリン酸、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸、
2,6−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸を用いて測
定する方法が報告されている。しかし、これらの基質に
は以下に示すように種々の問題点があり、測定上の不便
さ、あるいは測定値の不正確さを有するため、日常の臨
床検査に実用化されたものでも信頼度は低い。
ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、プロ
パンジオールリン酸、チモールフタレインリン酸、フェ
ノールフタレインリン酸、アデノシンモノリン酸、ナフ
チルリン酸、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸、
2,6−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸を用いて測
定する方法が報告されている。しかし、これらの基質に
は以下に示すように種々の問題点があり、測定上の不便
さ、あるいは測定値の不正確さを有するため、日常の臨
床検査に実用化されたものでも信頼度は低い。
基質としてフェニルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン
酸、β−グリセロリン酸、プロパンジオールリン酸、チ
モールフタレインリン酸、フェノールフタレインリン
酸、アデノシンモノリン酸を用いた場合は、反応に長時
間を要する、あるいは停止呈色反応を必要とするため初
速度分析ができず、自動分析装置への適応も不可能であ
る。また基質として、ナフチルリン酸、２−クロロ−４
−ニトロフェニルリン酸、2,6−ジクロロ−４−ニトロ
フェニルリン酸を用いた場合は、反応までに大きなラグ
タイムがあり、測定値に大きな誤差が発生することが避
けられない、あるいは分光分析の測定波長が400nm近傍
であるため、やはりその波長域に高い吸光を示す血清中
のヘモグロビンやビリルビンの影響を受けやすい。
酸、β−グリセロリン酸、プロパンジオールリン酸、チ
モールフタレインリン酸、フェノールフタレインリン
酸、アデノシンモノリン酸を用いた場合は、反応に長時
間を要する、あるいは停止呈色反応を必要とするため初
速度分析ができず、自動分析装置への適応も不可能であ
る。また基質として、ナフチルリン酸、２−クロロ−４
−ニトロフェニルリン酸、2,6−ジクロロ−４−ニトロ
フェニルリン酸を用いた場合は、反応までに大きなラグ
タイムがあり、測定値に大きな誤差が発生することが避
けられない、あるいは分光分析の測定波長が400nm近傍
であるため、やはりその波長域に高い吸光を示す血清中
のヘモグロビンやビリルビンの影響を受けやすい。
一方、生体試料中の酸性ホスファターゼ活性を測定す
る際、本発明者らの先願発明に係る一般式（Ｉ） ［式中,Rは−(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）、Ｘはハロゲ
ン原子を表す。］で表されるホスホモノエステルまたは
その塩を基質として用いた場合、初速度分析が可能であ
り、かつヘモグロビンやビリルビンの影響を受けにくい
紫外領域に測定波長を有するため、自動分析装置を用い
て極めて正確で再現性の良いAcp活性の測定が可能であ
る（特願平１−128431）。
る際、本発明者らの先願発明に係る一般式（Ｉ） ［式中,Rは−(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）、Ｘはハロゲ
ン原子を表す。］で表されるホスホモノエステルまたは
その塩を基質として用いた場合、初速度分析が可能であ
り、かつヘモグロビンやビリルビンの影響を受けにくい
紫外領域に測定波長を有するため、自動分析装置を用い
て極めて正確で再現性の良いAcp活性の測定が可能であ
る（特願平１−128431）。
しかし、一般に血清、血漿、または尿など生体試料中
のAcp活性は、それ自体が比較的低いため一般式（Ｉ）
で表されるホスホモノエステルまたはその塩を基質に用
いて測定しても、それだけで高い測定感度を得ることは
困難である。
のAcp活性は、それ自体が比較的低いため一般式（Ｉ）
で表されるホスホモノエステルまたはその塩を基質に用
いて測定しても、それだけで高い測定感度を得ることは
困難である。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、一般式（Ｉ）で表されるホスホモノ
エステルまたはその塩を基質を用いて感度の高いAcp活
性の測定を可能とすることである。
エステルまたはその塩を基質を用いて感度の高いAcp活
性の測定を可能とすることである。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、Acp活性測定の際に一般式（Ｉ）で表
される基質と種々のアルコールの添加を組み合わせるこ
とを検討した結果、より高感度の測定が可能なことを見
出だした。本発明は、この知見に基づいてなされたもの
である。
される基質と種々のアルコールの添加を組み合わせるこ
とを検討した結果、より高感度の測定が可能なことを見
出だした。本発明は、この知見に基づいてなされたもの
である。
すなわち本発明は、一般式（Ｉ） ［式中,Rは−(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）、Ｘはハロゲ
ン原子を表す。］で表されるホスホモノエステルまたは
その塩を基質として用い、かつ３〜６個の炭素原子を含
有する少なくとも１種の直鎖状アルコールを、酸性ホス
ファターゼ活性化剤として反応液中に基質と共存させる
ことを特徴とする酸性ホスファターゼ活性の高感度測定
法である。
ン原子を表す。］で表されるホスホモノエステルまたは
その塩を基質として用い、かつ３〜６個の炭素原子を含
有する少なくとも１種の直鎖状アルコールを、酸性ホス
ファターゼ活性化剤として反応液中に基質と共存させる
ことを特徴とする酸性ホスファターゼ活性の高感度測定
法である。
上記式（Ｉ）のＲは、メチル、エチル、プロピルまた
はブチルである。Ｘは、例えば塩素、臭素、フッ素など
のハロゲン原子である。上記式（Ｉ）のホスホモノエス
テルの塩を基質として用いる場合、その塩としては、例
えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、シクロヘ
キシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などのアミ
ン塩等が挙げられる。
はブチルである。Ｘは、例えば塩素、臭素、フッ素など
のハロゲン原子である。上記式（Ｉ）のホスホモノエス
テルの塩を基質として用いる場合、その塩としては、例
えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、シクロヘ
キシルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩などのアミ
ン塩等が挙げられる。
Acp測定の際に基質として用いるときの濃度は50μＭ
〜5mMの範囲であり、前立腺由来酸性ホスファターゼに
対するKm値が0.14mMであることから好ましくは1mM〜2mM
である。
〜5mMの範囲であり、前立腺由来酸性ホスファターゼに
対するKm値が0.14mMであることから好ましくは1mM〜2mM
である。
基質に共存させるAcp活性化剤のアルコールは、３〜
６個の炭素原子を有する直鎖状アルコールであり、好ま
しくはｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタ
ノール、ｎ−ヘキサノール、1,4−ブタンジオール、1,2
−ペンタンジオール、1,5−ペンタンジオール、1,2−ヘ
キサンジオール、特に好ましくは、1,4−ブタンジオー
ルまたは1,5−ペンタンジオールである。これらのアル
コールは、測定の際単独で用いても数種類組み合わせ用
いても構わない。
６個の炭素原子を有する直鎖状アルコールであり、好ま
しくはｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタ
ノール、ｎ−ヘキサノール、1,4−ブタンジオール、1,2
−ペンタンジオール、1,5−ペンタンジオール、1,2−ヘ
キサンジオール、特に好ましくは、1,4−ブタンジオー
ルまたは1,5−ペンタンジオールである。これらのアル
コールは、測定の際単独で用いても数種類組み合わせ用
いても構わない。
本発明で用いるアルコールの反応液中での濃度は、一
般に10mM〜2000mMであり、好ましくは100mM〜1000mMで
ある。
般に10mM〜2000mMであり、好ましくは100mM〜1000mMで
ある。
反応時のpHは4.0〜6.5、好ましくは5.0〜6.0に設定す
る。pHをその範囲で一定に保つための緩衝剤として、ク
エン酸、酢酸、コハク酸、フタル酸およびその塩などが
使用できる。それら以外の緩衝剤でもpH4.0〜6.5の範囲
で緩衝能を維持できるものであれば用いることが可能で
ある。緩衝剤の濃度は一般的に50mM〜300mM、好ましく
は50mM〜100mMに設定する。
る。pHをその範囲で一定に保つための緩衝剤として、ク
エン酸、酢酸、コハク酸、フタル酸およびその塩などが
使用できる。それら以外の緩衝剤でもpH4.0〜6.5の範囲
で緩衝能を維持できるものであれば用いることが可能で
ある。緩衝剤の濃度は一般的に50mM〜300mM、好ましく
は50mM〜100mMに設定する。
また、反応液には診断目的に好適な添加剤、例えばBr
ij−35、トリトンＸ−100のような界面活性剤、あるい
はマグネシウムイオンのような安定化剤を加えることも
可能である。
ij−35、トリトンＸ−100のような界面活性剤、あるい
はマグネシウムイオンのような安定化剤を加えることも
可能である。
本発明の方法によるAcp活性の測定は、通常次のよう
に実施する。まず、適当な活性化剤であるアルコールを
含む緩衝液に測定すべき生体試料を混合し、その溶液を
20℃〜40℃で２分間〜10分間、好ましくは30℃〜37℃で
３分間〜５分間インキュベートする。次に、その混合液
に一般式（Ｉ）で表されるホスホモノエステル又はその
塩を基質として含む液を加えて急速に撹拌し、そこで起
こるAcpによる基質分解反応を分光光度計にて300nm〜37
0nm、好ましくは330nm〜340nmの波長における吸光度変
化として測定し、それをもとに１分間当りの吸光度の増
加を求めることにより活性を測定する。
に実施する。まず、適当な活性化剤であるアルコールを
含む緩衝液に測定すべき生体試料を混合し、その溶液を
20℃〜40℃で２分間〜10分間、好ましくは30℃〜37℃で
３分間〜５分間インキュベートする。次に、その混合液
に一般式（Ｉ）で表されるホスホモノエステル又はその
塩を基質として含む液を加えて急速に撹拌し、そこで起
こるAcpによる基質分解反応を分光光度計にて300nm〜37
0nm、好ましくは330nm〜340nmの波長における吸光度変
化として測定し、それをもとに１分間当りの吸光度の増
加を求めることにより活性を測定する。
［実施例］ 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
が、本発明はこれによって限定されるものではない。
実施例１ 基質として2,6−ジクロロ−４−アセチルフェニルリ
ン酸、活性化剤として1,5−ペンタンジオールを用いて
ヒト前立腺由来の酸性ホスファターゼの活性を測定し
た。基質の合成は特願平１−128431記載の方法によっ
た。以下に測定の概要を示す。
ン酸、活性化剤として1,5−ペンタンジオールを用いて
ヒト前立腺由来の酸性ホスファターゼの活性を測定し
た。基質の合成は特願平１−128431記載の方法によっ
た。以下に測定の概要を示す。
0.1％トリトンＸ−100および種々の濃度の1,5−ペン
タンジオールを含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.4）2mlに
試料のヒト前立腺由来酸性ホスファターゼ（シグマ社
製）0.1mlを加え、37℃で３分間インキュベートする。
これに、0.01Mクエン酸緩衝液（pH3.0）に2,6−ジクロ
ロ−４−アセチルフェニルリン酸を6mMとなるように溶
解して得た基質液を0.5ml加えて反応を開始させ、分光
光度計（日立220A型）にて340nmでの吸光度変化を測定
し、１分間当たりの吸光度変化を求めた。
タンジオールを含む0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.4）2mlに
試料のヒト前立腺由来酸性ホスファターゼ（シグマ社
製）0.1mlを加え、37℃で３分間インキュベートする。
これに、0.01Mクエン酸緩衝液（pH3.0）に2,6−ジクロ
ロ−４−アセチルフェニルリン酸を6mMとなるように溶
解して得た基質液を0.5ml加えて反応を開始させ、分光
光度計（日立220A型）にて340nmでの吸光度変化を測定
し、１分間当たりの吸光度変化を求めた。
その測定結果を、1,5−ペンタンジオールが無添加の
場合の活性値と共に第１表に示す。
場合の活性値と共に第１表に示す。
実施例２ 1,5−ペンタンジオールを１−プロパノール、１−ブ
タノール、1,4−ブタンジオール、1,2−ペンタンジオー
ル、1,2−ヘキサンジオール、プロピレングリコールに
代えて、実施例１と同様の操作で測定を行った。
タノール、1,4−ブタンジオール、1,2−ペンタンジオー
ル、1,2−ヘキサンジオール、プロピレングリコールに
代えて、実施例１と同様の操作で測定を行った。
測定結果を第２表に示す。
［発明の効果］ 本発明の方法によりAcp活性を測定すると、実施例に
示す通り対照値と比較して相対活性は著しく向上する。
したがって本発明は、種々の長所を有する基質である一
般式（Ｉ）で表されるホスホモノエステルまたはその塩
について極めて高感度のAcp活性測定を提供し、これを
もって日常の臨床検査の実施に貢献するものである。
示す通り対照値と比較して相対活性は著しく向上する。
したがって本発明は、種々の長所を有する基質である一
般式（Ｉ）で表されるホスホモノエステルまたはその塩
について極めて高感度のAcp活性測定を提供し、これを
もって日常の臨床検査の実施に貢献するものである。
Claims (1)
- 【請求項１】一般式（Ｉ） ［式中,Rは−(CH2)nCH3（ｎ＝０〜３）、Ｘはハロゲン
原子を表す。］で表されるホスホモノエステルまたはそ
の塩を基質として用い、かつ３〜６個の炭素原子を含有
する少なくとも１種の直鎖状アルコールを、酸性ホスフ
ァターゼ活性化剤として反応液中に基質と共存させるこ
とを特徴とする酸性ホスファターゼ活性測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9189690A JP2503716B2 (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | 酸性ホスファタ―ゼ活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9189690A JP2503716B2 (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | 酸性ホスファタ―ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03290199A JPH03290199A (ja) | 1991-12-19 |
| JP2503716B2 true JP2503716B2 (ja) | 1996-06-05 |
Family
ID=14039332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9189690A Expired - Fee Related JP2503716B2 (ja) | 1990-04-06 | 1990-04-06 | 酸性ホスファタ―ゼ活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2503716B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6811995B1 (en) | 1996-04-26 | 2004-11-02 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive enzyme screen for cancer |
| EP0900381A1 (en) * | 1996-04-26 | 1999-03-10 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive enzyme screen for tissue remodelling-associated conditions |
-
1990
- 1990-04-06 JP JP9189690A patent/JP2503716B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03290199A (ja) | 1991-12-19 |
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