JP2025511684A - 新規ペプチドベースの免疫抗癌剤 - Google Patents

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Abstract

Figure 2025511684000001
本発明は、新規ペプチドベースの免疫抗癌剤に関するものであって、メリチン、その変異体またはこれらの類似体、またはこれらと薬物が連結された複合体の免疫抗癌剤用途に関するものであって、本発明におけるメリチン、その変異体またはこれらの類似体は、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの細胞膜に発現されるＩＴＧＢ２に特異的に結合し、Ｍ２腫瘍関連マクロファージを死滅させ、メリチン、その変異体またはこれらの類似体に薬物としてプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された複合体が前記のＭ２腫瘍関連マクロファージのアポトーシス効果を著しく増加させるため、これを腫瘍の生長と転移を抑制用抗癌組成物として活用することができる。
【選択図】図１７

Description

本発明は、新規ペプチドベースの免疫抗癌剤に関するものであって、メリチン、その変異体またはこれらの類似体、またはこれらと薬物が結合された複合体の免疫抗癌剤の用途に関するものである。
既存の抗癌治療は、癌細胞を直接攻撃したり、癌細胞を攻撃する体内の免疫細胞の活性を強化させる方向で研究されてきた。しかし、このような抗癌剤は、癌細胞以外の他の正常な細胞もまた攻撃をし、脱毛、吐き気、嘔吐などの多くの副作用を引き起こし、免疫細胞の過度な増加による付加的な反応をもたらす。既存の化学的療法や放射線療法に比べて副作用を最小化することができる抗癌免疫療法は、体内の免疫システムを用いて癌を治療する方法であり、このような抗癌免疫療法の内には、治療用免疫細胞であるＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ含む）、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ）、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ）などを体外で活性化させた後に、体内に直接注入する細胞療法と癌抗原と免疫活性化物質を体内に注入することによって、体内に存在する免疫細胞を直接活性化することで抗癌効能を高める抗癌ワクチンに対する方法などが活発に進められている。しかし、このような細胞療法や癌ワクチンは、主に血液癌関連の疾患に主に用いられており、固形癌ではほとんどがその治療効能が極めて低いという短所がある。このような理由のうちの一つは、固形癌の周囲で免疫機能を抑制する微小環境要因に起因する。実際、腫瘍微小環境において、免疫細胞の機能を低下させる細胞（ＭＤＳＣ：ｍｙｅｏｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ、Ｔｒｅｇ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ、ＴＡＭ：ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃａｉｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）や免疫抑制誘発サイトカイン、代謝物などが活発に作用することによって、免疫活性化物質と治療用免疫細胞の活性を急激に低下させるものである。したがって、腫瘍細胞および免疫細胞に直接的な影響なしに腫瘍細胞の周囲の微小環境のみを調節し、腫瘍細胞への影響分供給、腫瘍細胞周囲の血管新生などを遮断し、抗癌効果を有する治療剤の開発が重要となっている。腫瘍微小環境は、悪性細胞の増殖および生存、血管新生、転移、異常な適応免疫およびホルモンおよび化学療法剤に対する反応減少に寄与し、治療目標として大いに考慮されている。
腫瘍周囲の微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）は、内皮細胞、炎症性細胞および線維芽細胞から構成されており、１９７０年代に腫瘍関連マクロファージ（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＴＡＭ）が腫瘍の成長において重要な役割を果たすことが明らかになった。腫瘍関連マクロファージは、癌の成長、転移などの全般的な腫瘍微小環境と関連し、重要な役割を担っており、腫瘍抑制Ｍ１型マクロファージまたは腫瘍支持Ｍ２型マクロファージの二つの表現型に分類される。Ｍ１型マクロファージは、抗原を提示する強力な能力を有し、一般にインターフェロン－γ、リポ多糖（ＬＰＳ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αによって活性化され、炎症誘発性作用および殺菌作用をする。Ｍ２型マクロファージは、多様な細胞外マトリックス成分、血管新生および走化性因子を放出することによって、免疫抑制、腫瘍形成および血管形成を促進することが知られている。一般に、ＩＬ－４とＩＬ－１３によって誘導され、アルギナーゼ－１、ｍａｎｎｏｓｅ（ＭＭＲ、ＣＤ２０６）、スカベンジャー受容体（ＳＲ－Ａ、ＣＤ２０４）、ＣＤ１６３、ＩＬ－１０などのようなマーカーを発現することにより、Ｍ１型腫瘍関連マクロファージと区別される。腫瘍周囲に存在する腫瘍関連マクロファージは、腫瘍細胞の成長、転移と密接に関連しており、癌患者において、多数のＭ２型腫瘍関連マクロファージが腫瘍周囲に存在すると、患者の予後および生存率が良くないことが報告されている。２型マクロファージは、癌の成長を促進するＩＬ－１０、ＴＧＦβおよびＣＣＬ１８のようなサイトカインを生成し、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージの表面に存在するＰＤＬ１およびＢ７－１／２のような受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を抑制することが報告されている。Ｍ２型腫瘍関連マクロファージが多量存在する微小環境では、腫瘍の成長、分化および転移が活発になされるので、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージを標的とする標的治療剤の開発が必要である。
本発明の目的は、腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、癌の治療方法を提供することである。
併せて、本発明の目的は、本発明における結合体の癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための用途を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を有効成分として含む、腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を薬学的に有効な量で癌に罹患したオブジェクトに投与する段階を含む、癌の治療方法を提供する。
併せて、本発明は、癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体の用途を提供する。
本発明におけるメリチン、その変異体またはこれらの類似体は、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの細胞膜に発現されるＩＴＧＢ２に特異的に結合し、Ｍ２腫瘍関連マクロファージを死滅させ、メリチン、その変異体またはこれらの類似体に薬物としてプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された複合体が、前記のＭ２腫瘍関連マクロファージのアポトーシス効果を著しく増加させるので、これを腫瘍の生長と転移の抑制用抗癌組成物として活用することができる。
ＴＡＭｐｅｐのＭ２マクロファージに対する親和度をフローサイトメトリーにより確認した図である。 ＴＡＭｐｅｐのＭ２マクロファージに対する親和度を定量化したグラフである（＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ｔｈｅ Ｍ０．）。 Ｍ２／Ｍ０およびＭ１／Ｍ０の比率のベンダイアグラム解析により、Ｍ２マクロファージにてＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。 Ｍ２／Ｍ０の比率のスキャッタープロット（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔｓ）分析により、Ｍ２マクロファージにてＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。 Ｍ１／Ｍ０の比率のスキャッタープロット分析により、Ｍ２マクロファージにてＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。 Ｍ２／Ｍ１の比率のスキャッタープロット分析により、Ｍ２マクロファージにてＴＡＭｐｅｐと結合するタンパク質を識別した図である。 Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージにおいて、それぞれ抽出した細胞膜タンパク質とＴＡＭｐｅｐ８２６－ビオチンを反応させて得たＬＣ－ＭＳクロマトグラムデータを示す図である。 ＬＣ－ＭＳ／ＭＳプロテオミックスを用いてＴＡＭｐｅｐ８２６のターゲットタンパク質を同定した図である。 Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ条件を示す図である。 Ｍ２マクロファージにおけるＩＴＧＢ２ ｍＲＮＡ発現を確認した図である。 Ｍ２マクロファージにおけるＩＴＧＢ２タンパク質発現を確認した図である。 免疫蛍光分析によりＭ２マクロファージにおけるＩＴＧＢ２タンパク質の発現を確認した図である。 Ｍ２マクロファージの細胞膜におけるＩＴＧＢ２の発現を確認した図である。 Ｍ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用をプルダウンアッセイ（Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）で確認した図である。 免疫蛍光分析によりＭ２マクロファージにおけるＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用を確認した図である。 ＴＢ５１１とＩＴＧＢ２の結合部位をドッキングシミュレーションで確認した図である。 ＴＢ５１１とＩＴＧＢ２の結合部位をドッキングシミュレーションで確認した図である。 本発明のＩＴＧＢ２結合ＡＤＣ作製に用いられた抗－ＣＤ１８抗体がＣＤ１８のＭ２ ＴＡＭにおける活性型構造（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｏｐｅｎ ｆｏｒｍ）に特異的に結合することを示す模式図である。 センサーチップ表面にＩＴＧＢ２を固定化して確認した図である。 抗－ＩＴＧＢ２抗体とＩＴＧＢ２タンパク質の結合力をＳＰＲで確認した図である。 Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡとＩＴＧＢ２タンパク質の結合力をＳＰＲで確認した図である。 Ｍ２マクロファージにおいて、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９により確立したＩＴＧＢ２発現抑制細胞モデルにおけるＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現を確認した図である。 Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２発現抑制によるＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡの細胞死滅の減少効果を確認した図である。 Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２発現抑制によるＴＢ５１１（ＴＡＭｐｅｐ８２６－ｄＫＬＡ）の細胞死滅誘導減少効果を確認した図である。 Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２抗体によるＴＢ５１１の細胞死滅誘導減少効果を確認した図である。 乳癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 乳癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 肺癌３ＤオルガノイドにおけるＭ－ＤＭ１の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果を確認した図である。 乳癌３ＤオルガノイドにおけるＣＤ１８－ＤＭ１の効果を確認した図である。 乳癌３ＤオルガノイドにおけるＣＤ１８－ＭＭＡＥの効果を確認した図である。 肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。 肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。 抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣ（ＣＤ１８－ＤＭ１およびＣＤ１８－ＭＭＡＥ）の効果を確認した図である。
以下、添付された図面を参照して本発明の具現例でもって本発明を詳細に説明する。但し、下記の具現例は、本発明に対する例示として提示されるものであり、当業者に周知著名な技術または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にするおそれがあると判断された場合には、その詳細な説明を省略することができ、これによって本発明が制限されるものではない。本発明は後述する特許請求の範囲の記載およびそれより解釈される均等範疇内で多様な変形及び応用が可能である。
また、本明細書にて使用される用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、本発明の好ましい実施例を適切に表現するために使用された用語であって、これは使用者、運用者の意図または本発明が属する分野の慣例などによって異なり得る。したがって、本用語に対する定義は、本明細書の全般にわたった内容に基づいて下されるべきである。明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とした時、これは特に相反する記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
本発明にて使用される全ての技術用語は、特に断りがない限り、本発明の関連分野における通常の当業者が一般に理解されることと同様の意味で使用される。また、本明細書には好適な方法または試料が記載されるが、これと類似または同等のものも本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、本発明に組み込まれる。
本明細書の全体を通して、天然に存在するアミノ酸に対する通常の１文字および３文字のコードが用いられるだけでなく、Ａｉｂ（α－アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｇｌｙｃｉｎｅ）などのような他のアミノ酸に対して一般的に許容される３文字のコードが使用される。また、本発明において、略語として言及されたアミノ酸は、次のようにＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法に基づいて記載された：
アラニン：Ａ、アルギニン：Ｒ、アスパラギン：Ｎ、アスパラギン酸：Ｄ、システイン：Ｃ、グルタミン酸：Ｅ、グルタミン：Ｑ、グリシン：Ｇ、ヒスチジン：Ｈ、イソロイシン：Ｉ、ロイシン：Ｌ、リジン：Ｋ、メチオニン：Ｍ、フェニルアラニン：Ｆ、プロリン：Ｐ、セリン：Ｓ、トレオニン：Ｔ、トリプトファン：Ｗ、チロシン：Ｙおよびバリン：Ｖ。
一側面において、本発明は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を有効成分として含む、腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージ（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、ＴＡＭ）を除去するための薬学的組成物に関するものである。
一具現例において、前記腫瘍関連マクロファージは、ＩＧＢＴ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２）を発現するＭ２腫瘍関連マクロファージであってもよい。
一具現例において、前記組成物は、Ｍ１マクロファージは、除去することなく、Ｍ２マクロファージのみを除去することができる。
一具現例において、メリチンは、配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。
一具現例において、メリチンの変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、１～７位のアミノ酸が欠失したペプチドであってもよく、配列番号２のアミノ酸配列を含むことができる。
一具現例において、ＩＴＧＢ２は、配列番号７または８のアミノ酸配列を含むことができる。
一具現例において、前記メリチン、その変異体またはこれらの類似体は、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）が拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に特異的に結合することができる。
一具現例において、メリチン、その変異体またはこれらの類似体がＩＴＧＢ２の４６６～５６５のアミノ酸と結合することができる。
一具現例において、前記組成物は、配列番号５または６のアミノ酸配列を含むペプチドを含むことができる。
一具現例において、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体は、ペプチド－薬物複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＰＤＣ）であってもよく、ＰＤＣは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡであってもよく、配列番号６のアミノ酸配列を含むＴＢ５１１であってもよく、マレイミド－修飾されたメリチンに薬物ＤＭ１がコンジュゲートされたＭ－ＤＭ１であってもよい。
一具現例において、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）は、ＩＴＧＢ２のＬＥＵ（５２８）、ＴＨＲ（５３８）、ＬＥＵ（５５６）、ＣＹＳ（５５７）、およびＰＨＥ（５５８）部位と結合（ｂｉｎｄｉｎ）することができ、ＴＢ５１１のＴＲＰ（１２）は、ＩＴＧＢ２のＧＬＵ（４６６）、ＩＬＥ（４６９）、ＣＹＳ（４７０）、およびＡＲＧ（４７１）と結合することができる。
一具現例において、メリチン、その変異体またはこれらの類似体とプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤は、リンカーを媒介に共有結合するか、リンカーの媒介なしに非共有結合することができる。
一具現例において、前記リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列を含むことができる。
一具現例において、メリチン、その変異体またはこれらの類似体に半減期または安定性を増加させるための特定の目的のために設計された標的配列、タグ、標識残基またはアミノ酸配列をさらに含むことができる。
一具現例において、前記プロアポトーシス性ペプチドは、ＫＬＡ、アルファ－ディフェンシン－１（ａｌｐｈａ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ－１）、ＢＭＡＰ－２８、Ｂｒｅｖｅｎｉｎ－２Ｒ、ブフォリンＩＩｂ（Ｂｕｆｏｒｉｎ ＩＩｂ）、セクロピンＡ－マガイニン２（ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ－Ｍａｇａｉｎｉｎ ２、ＣＡ－ＭＡ－２）、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）、セクロピンＢ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ）、クリソフィシン－１（ｃｈｒｙｓｏｐｈｓｉｎ－１）、Ｄ－Ｋ６Ｌ９、ゴメシン（Ｇｏｍｅｓｉｎ）、ラクトフェリシンＢ（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ Ｂ）、ＬＬＬ２７、ＬＴＸ－３１５、マガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ ２）、マガイニンＩＩ－ボンベシン結合体（Ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ－ｂｏｍｂｅｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＭＧ２Ｂ）、パルダキシン（Ｐａｒｄａｘｉｎ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択されることができ、Ｄ型異性体ＫＬＡであることがより好ましく、配列番号４のアミノ酸配列を含むことができる。
一具現例において、前記抗癌剤は、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン、７－Ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ：ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ：ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ：ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｄｏｔｅｃａｎ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、トリプラチンテトラナイトレート（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）およびこれらの誘導体からなる群から選択されることができ、ＤＭ１またはＭＭＡＥであってもよい。
一具現例において、前記メリチン、その変異体またはこれらの類似体とプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤は、化学的リンカーまたは直接結合により連結されることができ、化学的リンカーは、メリチン、その変異体またはこれらの類似体とプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤上のアミン基（ａｍｉｎｅ）、カルボキシ基（ｃａｒｂｏｘｙｌ）またはスルフィドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ）を介して連結されることができる。
一具現例において、前記化学的リンカーは、両末端にカルボジイミド基（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ；ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ）、ペンタフルオロフェニルエステル（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ハロアセチル（ｈａｌｏａｃｅｔｙｌ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、チオスルホナート（ｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ビニルスルホン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）およびこれらの組み合わせから選択される作用基を含むことができ、ＥＤＣ（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ＳＡＴＡ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、スルホ－ＳＭＣＣ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－（ＮＤｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＤＭＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ ２ＨＣｌ）、ＤＭＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ ２ＨＣｌ）、ＤＭＳ（ｄｉｍｅｔｈｙｌＳｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ ２ＨＣｌ）、ＤＴＢＰ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ３，３’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｄａｔｅ ２ＨＣｌ）、スルホ－ＳＩＡＢ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４－ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＳＩＡＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（４－ｉｏｄｏａｃｅｔｙｌ）ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＳＢＡＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＩＡ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－（［Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］－＃ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｅｓｔｅｒ、ｎ＝２、４、６、８、１２または２４）、ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－（Ｎ－Ｄｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＬＣＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙ－（６－ａｍｉｄｏｃａｐｒｏａｔｅ））、スルホ－ＥＭＣＳ（Ｎ－εｅｓｔｅｒ）、ＥＭＣＳ（Ｎ－εスルホ－ＧＭＢＳ（Ｎ－γｅｓｔｅｒ）、ＧＭＢＳ（Ｎ－γｅｓｔｅｒ）、スルホ－ＫＭＵＳ（Ｎ－κｅｓｔｅｒ）、スルホ－ＭＢＳ（ｍ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＭＢＳ（ｍ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、スルホ－ＳＭＰＢ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（ｐ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＳＭＰＢ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（ｐｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＡＭＡＳ（Ｎ－α－ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｃｅｔ－ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＢＭＰＳ（Ｎ－β－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＳＭＰＨ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ６－［（β－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ］）、ＰＥＧ１２－ＳＰＤＰ（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ－ｔｅｔｒａｏｘａｏｃｔａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｅ－Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ、スルホ－ＬＣＳＰＤＰ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ６－［３’－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＰＤＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＬＣ－ＳＰＤＰ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６－［３’－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、ＳＭＰＴ（４－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌ－ａｌｐｈａ（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＢＳ（ＰＥＧ）５（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｅｎｔａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））、ＢＳ（ＰＥＧ）９（ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｎｏｎａ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））、ＢＳ３（ｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ］ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＢＳＯＣＯＥＳ（ｂｉｓ［２－（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＰＤＰＨ（３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ＤＳＧ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｇｌｕｔａｒａｔｅ）、ＤＳＰ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］）、ＢＭ（ＰＥＧ）ｎ（１，８－ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏ－ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ｎ＝２または３）、ＢＭＢ（１，４－ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔａｎｅ）、ＢＭＤＢ（１，４－ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｅ）、ＢＭＨ（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅ）、ＢＭＯＥ（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈａｎｅ）、ＤＴＭＥ（ｄｉｔｈｉｏｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈａｎｅ）、ＴＭＥＡ（ｔｒｉｓ（２－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ）、ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＤＳＴ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｔａｒｔａｒａｔｅ）、ＤＴＳＳＰ（３，３’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］）、ＥＧＳ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ］）、スルホ－ＥＧＳ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ［ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ］）およびＴＳＡＴ（ｔｒｉｓ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌａｍｉｎｏｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、ＤＦＤＮＢ（１，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）およびこれらの組み合わせから選択されることができる。
本発明において、前記ペプチドは、前記アミノ酸配列を有することが好ましいが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい具現例によれば、前記ペプチドは、前記アミノ酸の割合が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いことが好ましい。
本発明において、前記ペプチドは、標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基、半減期またはペプチドの安定性を増加させるための特定の目的で考案された追加のアミノ酸配列も含むことができる。また、本発明のペプチドは、エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）、薬物、プロドラッグ、毒素、ペプチド、伝達分子などのカップリングパートナーと連結されることができる。
本発明において、前記ペプチドは、薬学的に許容可能な塩の形態で製造されることができる。具体的には、酸を添加することで塩を形成することができ、例えば、無機酸（例：塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸など）、有機カルボン酸（例：酢酸、トリフルオロ酢酸のようなハロ酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、サリチル酸）、および酸性糖（グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコン酸、アスコルビン酸）、酸性多糖類（例：ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、アルギニン酸）、コンドロイチン硫酸などのスルホン酸糖エステルを含む有機スルホン酸（例：メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸）などを添加して塩を形成することができる。
本発明の用語、「結合体」は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体ペプチドとプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された複合体であって、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージを標的とすることができる。前記結合体は、ターゲティングするＭ２型マクロファージに結合し、マクロファージのミトコンドリアを損傷させることで腫瘍の生長と転移を抑制し、周囲の血管新生を選択的に抑制することによって癌を抑制することができる。
すなわち、本発明の複合体は、抗癌剤に比べて抗癌活性が向上したものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記結合体は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体をＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３）を介してプロアポトーシス性ペプチドと連結することができ、またはＳＰＤＰリンカーを介してＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ、Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ、ＰｒａｌａｔｒｅｘａｔｅおよびＬｏｒｌａｔｉｎｉｂのような抗癌剤と連結するものであってもよい。また、抗癌剤中、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ ＤＭ１、Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ ＤＭ３およびＭａｙｔａｎｓｉｎｅ ＤＭ４は、リンカーなしに直接連結して結合されることができるが、これらに制限されるものではない。
すなわち、本発明の結合体は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体が化学的リンカーを介したり、または、直接抗癌剤と連結された形態であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明の用語、「メリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ；ＭＥＬ）」は、ハチ毒の主要成分を構成するペプチドである。前記本明細書にて使用される用語「ハチ毒（ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ；ＢＶ）」は、ミツバチ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の腹部で生成される酸性および塩基性分泌物の混合物であって、苦い無色の液体形態を帯び、その主な成分は、ペプチドであるメリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、アパミン（ａｐａｍｉｎ）、マスト細胞脱顆粒（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ；ＭＣＤ）ペプチド、および酵素であるホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２；ＰＬＡ２）などであり、この他に多様な微量の成分を含む。したがって、本発明のメリチンは、ミツバチ（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のハチ毒から分離されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明にて用いられた用語「ペプチド」は、アミノ酸重合体であって、天然アミノ酸だけでなく、非タンパク質性アミノ酸も構成要素として含むことができる。
本発明にて使用された、用語「変異体」は、基準物質と比較したとき、最低１個のアミノ酸の差（置換、挿入または欠損）を含む対応するアミノ酸配列を指す。特定の具体例において、「変異体」は、基準配列と比較したとき、高いアミノ酸配列相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）および／または保存的アミノ酸置換、欠損および／または挿入を有する。
本発明にて使用された、用語「ペプチド類似体」は、アミノ酸の側鎖またはアルファ－アミノ酸バッグボーンに対して、一つ以上の他の機能基で置換された類似体を含むことができる。側鎖若しくはバッグボーンが改質化されたペプチド類似体の例としては、ピロリジン環がヒドロキシ基で置換されたヒドロキシプロリンや、Ｎ－メチルグリシン「ペプトイド」が挙げられるが、これに制限されるものではない。ペプチド類似体の種類については、当業界に公知されている。
本発明によるタンパク質変異体は、特定のアミノ酸残基位置でアミノ酸残基が保存的に置換された変異体も含む意味として解釈される。
本発明にて「保存的置換」とは、１個以上のアミノ酸を当該メリチンタンパク質変異体の生物学的または生化学的機能の損失を惹起しない類似する生化学的特性を有するアミノ酸で置換することを含む変異体の変形を意味する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似する側鎖を有するアミノ酸残基に代替させる置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基部類は、当該技術分野に規定されており、広く知られている。これらの部類は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電しない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非－極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベタ－分枝の側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
本発明によるペプチドは、標準合成方法、再組み合わせ発現システム、または任意の他の当該分野の方法により製造されることができる。したがって、本発明によるペプチドは、例えば、次を含む方法を含む多数の方法により合成されることができる：
（ａ）ペプチドを固相法または液相法の手段で段階的にまたは断片組立により合成し、最終ペプチド生成物を分離し精製する方法；または
（ｂ）ペプチドをインコーディングする核酸作製物を宿主細胞内で発現させ、発現生成物を宿主細胞培養物から回収する方法；または
（ｃ）ペプチドをインコーディングする核酸作製物の無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を行い、発現生成物を回収する方法；または
（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせによりペプチドの断片を得て、次いで断片を連結させてペプチドを得て、当該ペプチドを回収する方法。
一側面において、本発明は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物に関するものである。
一具現例において、前記癌は、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳癌、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ、ＴＮＢＣ）、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、子宮頸部癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、卵管癌、肛門癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎臓骨盤癌、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つ以上であることができ、抗癌剤耐性癌であってもよい。
一具現例において、前記組成物は、Ｍ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにてＩＴＧＢ２の発現が上方制御された患者を対象に投与することができる。
一具現例において、前記組成物は、標的抗癌剤であってもよい。
本発明における薬学的組成物は、単独の療法で用いられることができるが、他の通常の生物学的療法、化学療法または放射療法と共に用いられることもでき、このような並行療法を実施する場合には、より効果的に癌を治療することができる。本発明を癌の予防および治療に用いる場合、前記組成物と共に用いられることができる化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ブスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）およびメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に用いられることができる放射療法は、Ｘ－線照射およびγ－線照射などである。
本発明において、用語「予防」とは、本発明による組成物の投与により癌の発生、拡散および再発を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。
本発明の組成物の治療的に有効な量は、多様な要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって異なり得る。したがって、人体に使用時の投与量は、安全性および効率性を共に考慮し、適正量で決定されるべきである。動物実験を通じて決定した有効量からヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量を決定する際に、考慮すべきこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．（２００１）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。
本発明における薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明にて使される用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を引き起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、配合または同時に使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野で公知の要素によって決定されることができる。本発明の組成物は、個別の治療剤として投与することができるか、または他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単回または複数回投与することができる。前記した要素を全て考慮して、副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
本発明における薬学的組成物は、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。本発明にて使用される用語、「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物に露出される正常な細胞やヒトに毒性のない特性を示すことを意味する。前記担体は、組成物を生体内送達に適したものであれば、特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分中、１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法によりまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を用いて各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
一具現例において、前記薬学組成物は、経口型剤形、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液および噴霧剤を含む群から選択される一つ以上の剤形であってもよい。
本発明における組成物はまた、生物学的製剤に通常使用される担体、希釈剤、賦形剤または二つ以上のこれらの組み合わせを含むことができる。薬学的に許容可能な担体は、組成物を生体内送達に適したものであれば、特に制限されず、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１３ｔｈ ｅｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．Ｉｎｃ．に記載された化合物、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分中、１成分以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。さらに当分野の適正な方法によりまたはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ、１８ｔｈ、１９９０）に開示されている方法を用いて各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
本発明における組成物にさらに同一または類似する機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。本発明における組成物は、組成物の総重量に対して前記タンパク質を０．０００１～１０重量％、好ましくは０．００１～１重量％を含む。
本発明における薬学的組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、このとき、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化デンプン、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、デンプングリコール酸ナトリウム、カルナウバロウ、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトールおよびタルクなどが用いられることができる。本発明による薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して０．１重量部～９０重量部含まれることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
本発明における組成物は、目的とする方法に従って、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）するか、経口投与することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。本発明による組成物の一日の投与量は、０．０００１～１０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．０００１～５ｍｇ／ｍｌであり、一日に１回～数回に分けて投与することがより好ましい。
本発明における組成物の経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内服液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純な希釈剤である水、液体パラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが共に含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。
一側面において、本発明は、本発明における組成物を試験管のＭ２腫瘍関連マクロファージに処理する段階を含む、Ｍ２型腫瘍関連マクロファージ除去方法に関するものである。
一側面において、本発明は、本発明における組成物を含む癌診断用組成物に関するものである。
一側面において、本発明は、本発明における癌診断用組成物を含む、癌診断キットに関するものである。
本発明において、用語「癌診断キット」とは、本発明の癌診断用組成物が含まれたキットを意味する。したがって、前記表現「癌診断キット」とは、「癌診断用組成物」と互いに交差または混用して使用が可能である。本明細書にて用語「診断」とは、特定の疾病または疾患に対する一つのオブジェクトの感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、一つのオブジェクトが特定の疾病または疾患を現在有しているか否かを判定すること、特定の疾病または疾患に罹患したオブジェクトの予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）（例えば、前－転移性または転移性癌状態の同定、癌のステージ決定または治療に対する癌の反応性決定）を判定すること、またはテラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に対する情報を提供するために、オブジェクトの状態をモニタリングすること）を含む。
本発明におけるメリチン、その変異体またはこれらの類似体は、Ｍ２腫瘍関連マクロファージの細胞膜に発現されるＩＴＧＢ２に特異的に結合することによって、これら自体またはこれらと連結された薬物（プロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤）がＭ２腫瘍関連マクロファージを死滅させることによって、腫瘍の生長と転移を抑制し、周囲の血管新生を選択的に抑制することによって抗癌活性を有し、Ｍ２腫瘍関連マクロファージを特異的に結合するため、癌の診断にも使われるテラノスティック製剤として使用されることができる。また、抗癌剤と共に同時に、別途にまたは順次投与される抗癌補助剤としても使用されることができる。併せて、メリチン、その変異体またはこれらの類似体がＭ２腫瘍関連マクロファージと特異的に結合するため、これを標的化する薬物伝達体としても用いられることができる。
一側面において、本発明は、対象から分離された生物学的試料と本発明の組成物を接触させる段階；および正常対照群試料と比較する段階を含む、癌診断のための情報提供方法に関するものである。
一具現例において、対象から分離された生物学的試料でのＭ２腫瘍関連マクロファージレベルが正常対照群試料に比べて高い場合、前記検査対象が癌であると判断する段階をさらに含むことができる。
本発明にて用いられた用語、「試料（サンプル）」とは、対象または患者から得た生物学的試料を意味する。生物学的試料の供給源は、新鮮な、凍結されたおよび／または保存された臓器または組織サンプルまたは生検または吸引物からの固形組織；血液または任意の血液成分；対象の妊娠または発生の任意の時点の細胞であってもよい。
一側面において、本発明は、本発明におけるメリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を薬学的に有効な量で癌に罹患したオブジェクトに投与する段階を含む、癌の治療方法に関するものである。
一具現例において、前記オブジェクトは、Ｍ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにてＩＴＧＢ２の発現が上方制御された患者であってもよい。
一側面において、本発明は、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体の癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための用途に関するものである。
下記の実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、下記実施例は、本発明の内容を具体化するためのものに過ぎず、これにより本発明が限定されるものではない。
実施例１．Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（Ｍ２ＴＡＭ）標的化ペプチドの合成
下記表１のメリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）およびＴＡＭｐｅｐ８２６をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に合成依頼して供給を受け、その後、実験にてＤ－ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶かし、用いられた。
実施例２．Ｍ２ ＴＡＭ標的化の分析
２－１．メリチンのＭ２ ＴＡＭに対する親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）の確認
前記実施例１にて作製したメリチンが、Ｍ２腫瘍関連マクロファージ（Ｍ２ ＴＡＭ）に特異的に結合するか否かを確認するため、ヒト単球細胞株ＴＨＰ－１をＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージに分化させ、ＦＩＴＣコンジュゲートされたメリチンを処理し、フローサイトメトリーにより確認した。具体的に、ＴＨＰ－１細胞は、１００ｎＭのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ １２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－ａｃｅｔａｔｅ）を３７℃で２４時間処理し（Ｍ０マクロファージ）、分化されたＭ０マクロファージを１００ｎＭのＬＰＳおよび２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－γと３７℃で７２時間培養し、Ｍ１マクロファージ（Ｍ１）に分化させ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４およびＩＬ－１３と３７℃で７２時間培養し、Ｍ２マクロファージ（Ｍ２）に分化させた。分化された細胞にＦＩＴＣコンジュゲートされたメリチン５０ｎＭを１時間処理し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で細胞を検出し、ＦｌｏｗＪｏｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。
その結果、ＦＩＴＣ陽性細胞は、Ｍ０およびＭ２マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにおいて、著しく増加した（図１ａおよびｂ）。これを通じて、メリチンがＭ２マクロファージに優先的に結合することが確認された。
２－２．メリチンのＭ２ ＴＡＭ結合標的タンパク質の識別
Ｍ２マクロファージのあるタンパク質がメリチンとＭ２マクロファージの特異的結合に関連しているか否かを確認するため、ビオチン－コンジュゲートされたメリチン（メリチン－ｂｉｏｔｉｎ）を合成した。ＴＨＰ－１細胞（５Х１０６ ｃｅｌｌｓ）をＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージに分化させた後、スクレーパーを用いて細胞を集めて、遠心分離（３００Хｇ、５分）を通じて細胞を洗浄し、細胞膜タンパク質抽出キット（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマクロファージの細胞膜タンパク質を得た。メリチンにビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）が結合されたメリチン－ビオチン（２００μｇ）と常温（２０～２４℃）で１時間反応させた後、ストレプトアビジン・レジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｒｅｓｉｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメリチンと結合したタンパク質を得た。塩を除去するため、１００％のメタノール、０．１％のギ酸および８０％のＣＡＮをそれぞれ１００μlずつ１８ Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ－Ｃｏｌｕｍｎに添加して用意し、用意したカラムに試料をロードし、５０μlの０．１％のギ酸を添加し、不要な物質を除去した。その後、８０％のＣＡＮ １００μlを添加し、ペプチドを溶離させた。脱塩が終わると、Ｓｐｅｅｄ－ｖａｃで乾燥させ、溶液を全部除去し、下記表２の条件でＵＰＬＣ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＭａｘＱｕａｎｔおよびＭＰＰ（Ｍａｓｓ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）を用いて、Ｍ０マクロファージに比べて、Ｍ１およびＭ２マクロファージにおいて、上方制御されたタンパク質に対してデータを分析した。データを分析するために、各指標別にＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを用いて分析し、データベースは、Ｕｎｉｐｒｏｔのｈｕｍａｎ ｄａｔａｂａｓｅを用いて、ＬＦＱ（Ｌａｂｅｌ－Ｆｒｅｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により進めた。Ｍｏｄｉｆｉｃａｉｔｏｎは、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）、Ｃａｒｂａｍｙｌ（Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ）を追加し、Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｏｐｔｉｏｎは、ｎｏｎｅとした。
その結果、Ｍ２／Ｍ０にて５３個のタンパク質が、Ｍ１／Ｍ０にて１２３個のタンパク質が上方制御された（図２ａ）。Ｍ２マクロファージよりもより多くの上方制御されたタンパク質がＭ１マクロファージと相互作用したが、細胞膜に存在するタンパク質はその限りでない。膜タンパク質中、ＩＴＧＢ２がＭ２マクロファージにおいて、上方制御されることが示された（図２ｂ）。また、Ｍ１マクロファージのマーカーとして知られたＩＬ－１０およびＣＸＣＬ１０のようなサイトカインがＭ１マクロファージにおいて、上方制御された（図２ｖ）。また、タンパク質がＭ１に比べてＭ２にて上方制御されたタンパク質が確認されたが、膜タンパク質中、ＩＴＧＢ２のみがＭ２マクロファージにおいて、上方制御されることが確認された（図２ｄ）。これを通じて、メリチンがＭ２マクロファージの膜タンパク質ＩＴＧＢ２と相互作用し、結合することが確認された。
２－３．ＴＡＭｐｅｐ８２６のＭ２ ＴＡＭ結合標的タンパク質の識別
前記実施例２－２からみられるように、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージからそれぞれ抽出した細胞膜タンパク質とＴＡＭｐｅｐ８２６－ビオチンを反応させて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓを通じてターゲットタンパク質を確認した。
その結果，細胞膜タンパク質中、ＩＴＧＢ２がＭ０およびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにおいて、より高いレベルで発現されることが示され（図４）、ＴＡＭｐｅｐ８２６のＭ２マクロファージ結合標的タンパク質として選別された。
実施例３．Ｍ２マクロファージのＩＴＧＢ２発現の確認
３－１．ＩＴＧＢ２ ｍＲＮＡ発現の確認
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現レベルを評価するために、リアルタイム重合酵素連鎖反応を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１またはＭ２マクロファージに分化された細胞において、ｅａｓｙ－ＢＬＵＥ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ）を用いてＲＮＡを抽出し、ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いてｃＤＮＡで合成した。ＡｃｔｉｎまたはＩＴＧＢ２遺伝子のプライマー（表３）を用い、図５の条件でｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ－ｒａｄ）を進め、Ａｃｔｉｎに比べて各遺伝子の発現量を相対定量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により比較および分析した。
その結果、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現は、Ｍ０およびＭ１に比べてＭ２マクロファージおよびＴＡＭにおいて、有意に増加したことが示された（図６）。
３－２．ＩＴＧＢ２タンパク質発現の確認
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現レベルを評価するために、ウェスタンブロット解析を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化されたそれぞれの細胞からＰｒｏｐｒｅｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｉＮｔＲＯＮ）を用いてタンパク質を抽出し、電気泳動法によりメンブレンにタンパク質をトランスファーした。メンブレンを５％のＢＳＡに浸してブロックした後、１次抗体（ＩＴＧＢ２）を２４時間４℃で処理し、２次抗体を１時間常温で処理した後、Ｄ－Ｐｌｕｓ(商標出願)ＥＣＬ Ｐｉｃｏ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｏｎｉｎｇ ＬＳ）を処理し、Ｄａｖｉｎｃｈ－Ｃｈｅｍｉ（商標出願）ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｔｏｘｉａ）でタンパク質バンド写真を撮影した。
その結果、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現は、Ｍ０およびＭ１に比べて、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭにおいて、有意に増加したことが示された（図７）。
３－３．免疫蛍光法によるＩＴＧＢ２タンパク質発現の確認
Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭｓにおいて、ＩＴＧＢ２のタンパク質発現レベルを評価するために、免疫蛍光分析を行った。具体的には、Ｍ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージに分化されたそれぞれの細胞を４％のホルマリンで固定させた後、ＰＢＳで洗浄し、５％のＢＳＡに浸してブロックした後、１次抗体（ＩＴＧＢ２）を２４時間４℃で処理し、２次抗体を２時間常温で処理し、染色を行った。染色した細胞は、ＤＡＰＩ ｍｏｕｎｔｉｎｇ後、ＬＳＭ８００（Ｚｅｉｓｓ）で蛍光写真を撮影した。
その結果、ＩＴＧＢ２のタンパク質は、Ｍ０およびＭ１に比べて、Ｍ２マクロファージおよびＴＡＭにて高い発現レベルを示した（図８）。
実施例４．Ｍ２ ＴＡＭ標的化ペプチドとＩＴＧＢ２の相互作用の確認
４－１．Ｍ２マクロファージ細胞膜におけるＩＴＧＢ２の発現の確認
ＩＴＧＢ２がＭ２マクロファージの細胞膜にて発現されるか否かを確認するため、Ｍ２マクロファージから細胞膜タンパク質およびサイトゾル（ｃｙｔｏｓｏｌ）タンパク質をそれぞれ分離抽出し、ビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６と反応させ、ＩＴＧＢ２の発現をウェスタンブロット解析により評価した。その結果、ＩＴＧＢ２タンパク質は、Ｍ２マクロファージの細胞膜にて発現されることが示された（図９）。
４－２．ＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用の確認
Ｍ２マクロファージにおいて、ＴＡＭｐｅｐ８２６がＩＴＧＢ２と相互作用するか否かを確認するために、ＴＡＭｐｅｐ８２６およびビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６の競争的な反応を通じてＩＴＧＢ２の発現を評価した。具体的には、Ｍ２マクロファージに分化された細胞をスクレーパーで集めて、遠心分離（３００Хｇ、５分）により細胞を洗浄し、細胞膜タンパク質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマクロファージの細胞膜タンパク質を得た。ＴＡＭｐｅｐ８２６またはｓｃｒａｍｂｌｅペプチドを濃度別（０．００１、０．０１、０．１、１および１０μｇ）に１時間前処理した後、タンパク質にビオチンが結合されたＴＡＭｐｅｐ８２６（２００μｇ）と常温（２０～２４℃）で１時間反応させた後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標出願）Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＴＡＭｐｅｐ８２６と結合したタンパク質を得た。タンパク質をウェスタンブロット解析して、ＩＴＧＢ２の発現を確認した。
その結果、ｓｃｒａｍｂｌｅｄペプチドを前処理したとき、ビオチン化されたＴＡＭｐｅｐ８２６と結合されたＩＴＧＢ２の発現は、影響がないことが示されたのに対し、ＴＡＭｐｅｐ８２６で前処理したときは、濃度によってＩＴＧＢ２発現が抑制されることが示された（図１０）。このことから、ＴＡＭｐｅｐ８２６がＭ２マクロファージの細胞膜において、ＩＴＧＢ２と相互作用することを確認することができた。
４－３．免疫蛍光法を用いたＴＡＭｐｅｐ８２６およびＩＴＧＢ２の相互作用の確認
Ｍ２マクロファージの細胞膜において、ＩＴＧＢ２およびＴＡＭｐｅｐ８２６がｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎするか否かを確認するために、ＦＩＴＣが結合されたＴＡＭｐｅｐ８２６を用いて免疫蛍光分析を行った。その結果、ＴＡＭｐｅｐ８２６とＩＴＧＢ２は、Ｍ２マクロファージの細胞膜に集中的に分布されていることが示された（図１１）。
４－４．ＴＢ５１１とＩＴＧＢ２の結合部位の確認
ＣＤ１８（ＩＴＧＢ２）のシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）ｒｉｃｈ部分の配列を基に（ｕｎｉｐｏｒｔ＿ｐ０５１０７、Ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔｓ ｒｅｇｉｏｎ：４４９－６１７）、ｔｒＲｏｓｅｔｔａアルゴリズム（ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて、３次構造（ｔｅｒｉｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を構成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｙａｎｇｌａｂ．ｎａｎｋａｉ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｔｒＲｏｓｅｔｔａ／）。その後、ＴＢ５１１とＣＤ１８のドッキングシミュレーション（Ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、ｔｒＲｏｓｅｔｔａで作ったＣＤ１８ＰＤＢファイルとＴＢ５１１のアミノ酸配列を有し、ＣＡＢＳ－ｄｏｃｋ ｓｅｒｖｅｒを通じて行われた（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｏｍｐ．ｃｈｅｍ．ｕｗ．ｅｄｕ．ｐｌ／ＣＡＢＳｄｏｃｋ／）。ドッキングシミュレーションの結果、作られた１０個のモデルのうち、ＴＢ５１１配列のアラニン置換の結果を基に代表モデルを選定した（図１２）。
その結果、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）は、ＣＤ１８のＬＥＵ（５２８）、ＴＨＲ（５３８）、ＬＥＵ（５５６）、ＣＹＳ（５５７）およびＰＨＥ（５５８）部位と結合（ｂｉｎｄｉｎ）することが予測され、ＴＢ５１１のＴＲＰ（１２）は、ＣＤ１８のＧＬＵ（４６６）、ＩＬＥ（４６９）、ＣＹＳ（４７０）およびＡＲＧ（４７１）と結合することが予測された。また、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）およびＴＲＰ（１２）をそれぞれアラニンで置換し、ＣＤ１８との結合をシミュレーションすると、二つの部位全部ＣＤ１８のどの配列とも結合しないことが示された。したがって、ＴＢ５１１のＬＥＵ（６）およびＴＲＰ（１２）は、ＴＢ５１１とＣＤ１８間のドッキングにおいて核心的な部分であり、ＴＢ５１１は、ＣＤ１８の４６６～５６５に結合することが予測され得る（図１３）。
実施例５．ＩＴＧＢ２結合部分の合成
５－１．ＩＴＧＢ２結合ＰＤＣ（ｐｅｐｔｉｄｅ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の合成
下記表４のＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡおよびＴＢ５１１ペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）に合成依頼して供給を受け、その後、実験にてＤ－ＰＢＳに５ｍｇ／ｍｌで溶かし、用いられた。ｄＫＬＡは、ペプチド間アミド結合を通じて連結しており、メリチンまたはＴＡＭｐｅｐ８２６とｄＫＬＡ間の相互作用および折り畳みを最小化するため、真ん中に４個のグリシンおよび１個のセリンで構成されたリンカーを配置し、両端を区分し、ＫＬＡは、体内の分解を最小化するために、Ｌ型でないＤ型異性体を用いた。また、Ｍ－ＤＭ１を作製するために、２５ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶かしたマレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）－修飾されたメリチン（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）（１００μＭ、１ｍＬ、０．１ｍｍｏＬ）にＤＭ１（Ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）（１．１当量、ＤＭＦ中１０ｍＭ）およびＤＭＦ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を添加し、３７℃で１時間反応させた後、生成物をＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ）で限外濾過により３回濾過することによって、マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）－修飾されたメリチンＭのＮ－末端にＤＭ１を結合させてＰＤＣを作製し、Ｍ－ＤＭ１として命名した。作製したＭ－ＤＭ１は、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（２．７μｍ、３×５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）にて逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を５μＬ、０．５ｍＬ／分の速度で注入し、特性を分析した。
５－２．ＩＴＧＢ２結合ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の合成
５－２－１．抗－ＣＤ１８抗体およびＤＭ１のＡＤＣの作製
マクロファージ－１抗原（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－１ ａｎｔｉｇｅｎ、Ｍａｃ－１）のうちの一つである、ＣＤ１８のＭ２ ＴＡＭにおける活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に特異的に結合する抗体（図１４）を作製するために、抗－ＣＤ１８抗体を分泌するハイブリドーマ（ＭＭ１８／２．ａ．８）細胞の培養液を集めて、２，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄み液を得た後、タンパク質Ｇ－セファロースカラムクロマトグラフィー方法により精製した。ＰＢＳで予め平衡化させたタンパク質Ｇ－セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）に抗体溶液をゆっくりと通過させ、カラムをペリスタルティックポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｔｉｃ ｐｕｍｐ）に連結し、ＰＢＳで十分に洗浄した。洗浄完了後、０．２Ｍのグリシン（ｇｌｙｃｉｎ）－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）で抗体を溶出した。このとき、予め用意した１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ９．０）を含むチューブに前記溶出液を緩衝させた。この抗体をＰＢＳに透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）した後、用いた。ＢＣＡタンパク質分析キット（ＢＣＡ（商標出願）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製された抗体量を測定し、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ分析を通じて、抗体の結合能を確認した。精製した抗－ＣＤ１８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）にＤＭＳＯに溶かしたＳＭＣＣ－ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、１２０μＭ）（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を１：１８の比率で混ぜ、常温で４～２０時間反応させた。未反応のＤＭ１を除去するため、１０ＫＤａ ｃｕｔｏｆｆ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒを用いて、ＣＤ１８－ＤＭ１をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、０．２μｍシリンジフィルターでろ過した。ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを用いて、抗－ＣＤ１８抗体（２８０ｎｍ）に結合されたＤＭ１（２５２ｎｍ）の量を測定し、ＤＭ１と抗－ＣＤ１８抗体の比率（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を計算し、ＤＡＲ値は５．８として示された。このように作製された抗－ＣＤ１８抗体とＤＭ１が結合されたＡＤＣをＣＤ１８－ＤＭ１と命名した。
５－２－２．抗－ＣＤ１８抗体およびＭＭＡＥ（Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）のＡＤＣの作製
前記実施例にて精製した抗－ＣＤ１８抗体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換し、ＣＤ１８抗体のジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）を部分的に還元するために、抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）に１ｍＭ ＤＴＴ（６６．７μＭ）を１：１０の比率で混ぜ、３７℃で１～２時間反応させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。部分的に還元された抗－ＣＤ１８抗体（１ｍｇ／ｍｌ、６．６７μＭ）に１０ｍＭ Ｓｕｏ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）を１：２０～１：４０の比率で混ぜ、４℃で１２時間反応させ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを用いて、抗－ＣＤ１８抗体（２８０ｎｍ）に結合されたｖｃ－ＭＭＡＥ（２４８ｎｍ）の量を測定し、ｖｃ－ＭＭＡＥと抗－ＣＤ１８抗体の比率（ｄｒｕｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）を計算し、ＤＡＲ値は、２．８～５．４として示された。このように作製された抗－ＣＤ１８抗体とＭＭＡＥが結合されたＡＤＣをＣＤ１８－ＭＭＡＥと命名した。
実施例６．ＩＴＧＢ２結合ＰＤＣのＭ２ ＴＡＭ結合の確認
ＩＴＧＢ２およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡの結合力を確認するために、ＩＴＧＢ２タンパク質を金薄膜センサーチップ上にコーティングした後、陽性対照群としてＩＴＧＢ２抗体およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡをそれぞれ流し、反射光を測定し、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）分析を行った。具体的に、センサーチップ表面にＩＴＧＢ２を固定させた後、アミンカップリング（ａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を用いて、下記表５の条件で固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った（図１５）。その後、ＩＴＧＢ２がコーティングされたセンサチップに多様な濃度のＩＴＧＢ２抗体およびＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡを流し、結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）区間を観察し、センサーグラムを通じて下記表６の分子間結合速度定数分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｖｏｌｕａｔｉｏｎ）条件で分子間結合速度定数（ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒａｒｍｅｔｅｒ）を計算した。
その結果、陽性対照群であるＩＴＧＢ２抗体の二つの分子間の結合力を評価する解離速度定数（ｋｄ；ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を結合速度定数（ｋａ；ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ）に分けて得る平衡解離定数（ＫＤ；ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）が１．１４－８で、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡの平衡解離定数は、７．８６－８で示された（図１６および１７）。したがって、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡがＩＴＧＢ２と結合力を有していることが確認された。
実施例７．ＰＤＣのＩＴＧＢ２によるＭ２ ＴＡＭ細胞死滅効果の確認
７－１．ＩＴＧＢ２の発現抑制細胞モデルの作製
Ｍ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２を通じて細胞死滅を誘導するか否かを確認することに使用するための細胞モデルとして、Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を用い、Ｍ２マクロファージにてＩＴＧＢ２の発現が抑制された細胞モデルを作製した。具体的には、Ｍ２マクロファージに分化された細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で培養した。Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標出願）Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＣａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とｇＲＮＡ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；ＩＴＧＢ２；表７）をＣａｓ９ Ｐｌｕｓ（商標出願）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に混ぜ、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標出願）ＲｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地に希釈した後、全部混ぜて５－１０分間反応させた後、Ｍ２マクロファージに分化された細胞に添加し、３７℃で２～３日間培養した。その後、ＩＴＧＢ２のｍＲＮＡ発現レベルを確認した。
その結果、ＩＴＧＢ２ ｓｇＲＮＡを注入したＭ２マクロファージは、ＩＴＧＢ２の発現が対照群に比べて有意に減少することが示された（図１８）。
７－２．Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡのＩＴＧＢ２によるＭ２ ＴＡＭ細胞死滅の確認
Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡがＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２に結合し、細胞アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＣｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９によりＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージにＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡ（１μＭ）を２４時間処理し、ＣＣＫ－８分析方法を用いて細胞生存率を分析した。具体的には、前記実施例７－１にて作製したＩＴＧＢ２ロックダウンマクロファージにＭｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡ（１μＭ）を１時間反応させた。反応後、培地を交換し、３７℃で２４時間培養した。細胞生存能を確認するために、ＣＣＫ－８ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培地の１／１０入れ、３７℃で３時間反応させた。吸光度は、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍにて測定した。
その結果、対照群Ｍ２マクロファージにおいて、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡにより細胞生存率が著しく減少したが、ＩＴＧＢ２がロックダウンされたＭ２マクロファージでは、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡによる細胞生存率の減少が抑制されることが示された（図１９）。したがって、これを通じて、Ｍｅｌｉｔｔｉｎ－ｄＫＬＡがＭ２マクロファージのＩＴＧＢ２と特異的に結合することによってＭ２マクロファージの細胞アポトーシスを誘導することを確認することができた。
７－３．ＴＢ５１１のＩＴＧＢ２によるＭ２ ＴＡＭ細胞死滅の確認
ＴＢ５１１（ＴＡＭｐｅｐ８２６－ｄＫＬＡ）がＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２により細胞死滅を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＣｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９によりＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージにＴＢ５１１を反応させた。その結果、Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１により５０％程度の細胞生存能を示したが、ＩＴＧＢ２発現が抑制された細胞からは細胞生存能が有意に増加することが示された（図２０）。
７－４．ＩＴＧＢ２抗体によるＴＢ５１１の細胞死滅誘導減少の確認
ＴＢ５１１がＭ２マクロファージにおいて、ＩＴＧＢ２により細胞死滅を誘導するか否かを確認するために、前記実施例７－１にて作製したＩＴＧＢ２発現が抑制されたＭ２マクロファージに抗－ＩＴＧＢ２抗体（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩＴＧＢ２／ＣＤ１８抗体）（ＬＳ－Ｃ３１２７８５；ＬＳ Ｂｉｏ）（１μｇ）を１時間前処理した後、ＴＢ５１１（１μＭ）を１時間反応させた後，細胞死滅誘発するか否かをＣＣＫ－８分析を用いた細胞生存能分析により、細胞死滅マーカーであるｃａｓｐａｓｅ－３のタンパク質発現をウェスタンブロット解析により、ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－９の遺伝子発現をＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲにより、およびｃａｓｐａｓｅ－３のタンパク質発現誘導を免疫蛍光法により確認した。
その結果、Ｍ２マクロファージは、ＩＴＧＢ２抗体によっては細胞生存能には影響がなく、ＴＢ５１１によっては細胞生存能が有意に減少した。その反面、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１による細胞生存能が有意に増加したことが示された（図２１）。また、Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１によりｃａｓｐａｓｅ－３発現が有意に増加するのに対し、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１によるｃａｓｐａｓｅ－３発現が有意に減少した（図２１）。また、Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１によりｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８およびｃａｓｐａｓｅ－９の発現が有意に増加するのに対し、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１によるｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８およびｃａｓｐａｓｅ－９の発現が有意に減少した（図２１）。Ｍ２マクロファージは、ＴＢ５１１によりｃａｓｐａｓｅ－３発現が増加するのに対し、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージでは、ＴＢ５１１によるｃａｓｐａｓｅ－３発現が減少した（図２１）。さらに、ＴＢ５１１のミトコンドリア標的化を確認した結果、ＩＴＧＢ２抗体を前処理したＭ２マクロファージは、ＩＴＧＢ２前処理していない細胞に比べて、ミトコンドリアとＴＢ５１１のｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎが減少した（図２１）。
実施例８．３Ｄ癌オルガノイドにおけるＰＤＣの効能の確認
８－１．乳癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの限界点を補完し、ｉｎ ｖｉｖｏを代替すべく乳癌の癌微小環境（Ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）を模擬した３Ｄオルガノイドを作製し、これに対するＴＢ５１１の効果を確認した。具体的には、ＲＰＭＩ－１６４０培養液にマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）が３％となるように混合し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞、ＣＡＦ（Ｃａｎｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）およびＩｎｃｕｃｙｔｅ(登録商標)Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、ＧＦＰが発現されるように作製したＴＨＰ－１細胞を計数し、５：１：１の比率で２００μｌとなるように９６ｕ－ｂｏｔｔｏｍ ３－Ｄｃｕｌｔｕｅ ｐｌａｔｅ（Ｓｂｉｏ）に分注した。培養後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、細胞を集めた後、３７℃のインキュベーターで４８時間培養し、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を形成した。スフェロイド形成２日目からＴＢ５１１を１μＭ、２μＭ、４μＭおよび８μＭの濃度で３日毎にそれぞれ処理し、蛍光顕微鏡で画像を撮影し、Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｅｌｄ画像を撮影した後、ペレットの直径を測定方法により、スフェロイド領域（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ａｒｅａ）を測定した。また、平均腫瘍回転楕円体直径は、オープンソースを用いて、スフェロイド当たり平均３個の直径を測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ１．４７ｍ）によりサイズを分析し、スフェロイドの大きさは、Ｂｒｉｇｈｔ－ｆｉｅｌｄ画像を撮影した後、（２０Ｘ）、平均腫瘍回転楕円体直径をスフェロイド当たり平均３個ずつ測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．４７ｍ）により分析した。併せて、薬物処理１０日目にスフェロイドを固定し、腫瘍増殖因子であるｋｉ－６７に対する抗体（ａｂｃａｍ）を反応させて免疫蛍光染色を行った（対照染色：ＤＡＰＩ）。ＴＨＰ－１の場合、別途の染色を進めず、細胞内に発現するＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡で画像を撮影し、蛍光を発現する細胞の数を測定した。
その結果、薬物を処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなり、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）であるＴＨＰ－１細胞が癌細胞およびＣＡＦと共培養時、癌細胞およびＴＭＥによってＴＡＭに分化され、腫瘍成長を促進することが示された。その反面、ＴＢ５１１を処理した群では、１０日目に１μＭの濃度で濃度依存的にスフェロイドの大きさが減少することが確認され（図２２）、ＧＦＰ蛍光を発現するＴＨＰ－１細胞の数が薬物無処理群に比べて濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２３）。したがって、ＩＴＧＢ２結合ＰＤＣであるＴＢ５１１がＴＨＰ－１細胞に選択的に結合し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌の細胞死滅を誘導することが確認された。
８－２．肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、肺癌３Ｄスフェロイドを作製した後、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理し、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。スフェロイド作製時、癌細胞単独または癌細胞＋ＣＡＦ細胞のみを混合して、３Ｄスフェロイドも作製し、スフェロイドの大きさを比較した。
その結果、Ａ５４９細胞単独またはＡ５４９＋ＣＡＦ細胞のみでスフェロイドを形成したときよりもＡ５４９＋ＣＡＦ＋ＴＨＰ－１細胞でスフェロイドを形成したときのスフェロイドの大きさが著しく増加することが示された。また、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、スフェロイドの大きさがＴＢ５１１の濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２４）。また、薬物を処理してから１０日目にスフェロイドを蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＨＰ－１細胞の数が濃度依存的に著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も濃度依存的に減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２５）。
８－３．肺癌３ＤオルガノイドにおけるＭ－ＤＭ１の効果の確認
肺癌に対するＭ－ＤＭ１（Ｍｅｌ－ＤＭ１）の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合して、肺癌３Ｄスフェロイドを作製した後、Ｍ－ＤＭ１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理し、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
その結果、Ｍ－ＤＭ１を処理していない群に比べて、Ｍ－ＤＭ１を処理した群において、濃度依存的にスフェロイドの大きさが減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２６）。
実施例９．抗癌剤耐性３Ｄ癌オルガノイドにおけるＰＤＣの効能の確認
９－１．抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）耐性肺癌に対するＴＢ５１１の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりカルボプラチン耐性Ａ５４９細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭおよび４μＭの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
その結果、Ａ５４９耐性細胞単独またはＡ５４９＋ＣＡＦ細胞のみでスフェロイドを形成したときよりも、Ａ５４９＋ＣＡＦ＋ＴＨＰ－１細胞でスフェロイドを形成したときのスフェロイドの大きさが著しく増加することが示され、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、スフェロイドの大きさがＴＢ５１１濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２７）。また、薬物を処理してから１０日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＴＢ５１１無処理群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、ＴＨＰ－１細胞の数が濃度依存的に著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も２μＭから有意的に減少したことが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２８）。
９－２．抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＴＢ５１１の効果の確認
ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）耐性前立腺癌に対するＴＢ５１１の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりドセタキセル耐性ＰＣ３前立腺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＴＢ５１１を１μＭ、２μＭまたは４μＭの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
その結果、ＰＣ３耐性細胞単独またはＰＣ３＋ＣＡＦ細胞のみでスフェロイドを形成したときよりも、ＰＣ３＋ＣＡＦ＋ＴＨＰ－１細胞でスフェロイドを形成したとき、その大きさが著しく増加しており、ＴＢ５１１を処理していない群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、スフェロイドの大きさがＴＢ５１１濃度依存的に著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図２９）。また、薬物を処理してから１０日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＴＢ５１１無処理群に比べて、ＴＢ５１１を処理した群において、ＴＨＰ－１細胞の数が濃度依存的に著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も減少する傾向を示した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３０）。
実施例１０．３Ｄ癌オルガノイドにおけるＡＤＣの効能の確認
１０－１．乳癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
乳癌に対するＩＴＧＢ２結合ＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、本発明のＡＤＣであるＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを１０μｇおよび２０μｇの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれて乳癌スフェロイドの大きさがだんだん大きくなったが、ＡＤＣを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３１および３２）。また、ＡＤＣを処理していない群において、ＧＦＰ陽性ＴＨＰ－１細胞が強く増加したが、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥ処理群では、濃度依存的に減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３１および３２）。
１０－２．肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
肺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりＡ５４９ヒト肺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、本発明のＡＤＣであるＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを１０μｇの濃度でそれぞれ処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなるのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３３）。また、薬物を処理してから８日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＡＤＣを処理していない群において、ＴＨＰ－１細胞が強く増加するのに対し、ＡＤＣ処理群では、著しく減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３４）。
実施例１１．抗癌剤耐性３Ｄ癌オルガノイドにおけるＡＤＣの効能の確認
１１－１．抗癌剤耐性肺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
カルボプラチン耐性肺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりカルボプラチン耐性Ａ５４９細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥをそれぞれ１０μｇの濃度で処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなるのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３５）。また、薬物を処理してから８日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＡＤＣを処理していない群に比べて、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群において、ＴＨＰ－１細胞の数が有意に減少し、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３６）。
１１－２．抗癌剤耐性前立腺癌３ＤオルガノイドにおけるＡＤＣの効果の確認
ドセタキセル耐性前立腺癌に対するＡＤＣの効能を確認するため、前記実施例８－１の方法によりドセタキセル耐性ＰＣ３前立腺癌細胞、ＣＡＦおよびＴＨＰ－１細胞を混合し、３Ｄ－スフェロイドを形成し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥをそれぞれ１０μｇの濃度で処理した後、その効果を前記実施例８－１と同様に分析した。
その結果、ＡＤＣを処理していない群は、時間が経つにつれてスフェロイドの大きさがだんだん大きくなるのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、８日目にスフェロイドの大きさが減少することが示された（図３７）。また、薬物を処理してから８日目にスフェロイドを免疫蛍光染色し、関連マーカーを確認した結果、ＡＤＣを処理していない群では、蛍光が強く増加するのに対し、ＣＤ１８－ＤＭ１またはＣＤ１８－ＭＭＡＥを処理した群では、ＴＨＰ－１細胞の数が著しく減少しており、腫瘍増殖因子ｋｉ－６７も減少することが示された（＊＊＊ｐ＜０．００１）（図３８）。

Claims (17)

  1. メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を有効成分として含む、腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージ（ｔｕｍｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、ＴＡＭ）を除去するための薬学的組成物。
  2. 腫瘍関連マクロファージは、ＩＧＢＴ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ２）を発現するＭ２腫瘍関連マクロファージである、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  3. メリチン、その変異体またはこれらの類似体がＣＤ１８が拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）活性型構造（Ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に特異的に結合する、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  4. メリチン、その変異体またはこれらの類似体がＩＴＧＢ２の４４９４６６～５６５のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  5. メリチンは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  6. メリチンの変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  7. リンカーにより結合された、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  8. リンカーは、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  9. 配列番号５または６のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  10. プロアポトーシス性ペプチドは、ＫＬＡ、アルファ－ディフェンシン－１（ａｌｐｈａ－ｄｅｆｅｎｓｉｎ－１）、ＢＭＡＰ－２８、Ｂｒｅｖｅｎｉｎ－２Ｒ、ブフォリンＩＩｂ（Ｂｕｆｏｒｉｎ ＩＩｂ）、セクロピンＡ－マガイニン２（ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ－Ｍａｇａｉｎｉｎ ２、ＣＡ－ＭＡ－２）、セクロピンＡ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ａ）、セクロピンＢ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ）、クリソフィシン－１（ｃｈｒｙｓｏｐｈｓｉｎ－１）、Ｄ－Ｋ６Ｌ９、ゴメシン（Ｇｏｍｅｓｉｎ）、ラクトフェリシン Ｂ（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ Ｂ）、ＬＬＬ２７、ＬＴＸ－３１５、マガイニン２（Ｍａｇａｉｎｉｎ ２）、マガイニンＩＩ－ボンベシン結合体（Ｍａｇａｉｎｉｎ ＩＩ－ｂｏｍｂｅｓｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＭＧ２Ｂ）、パルダキシン（Ｐａｒｄａｘｉｎ）およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  11. 抗癌剤は、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン、７－Ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙ－ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、マスタード（ｍｕｓｔａｒｄ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ：ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ：ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ：ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（ｉｒｉｄｏｔｅｃａｎ）、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ベンダムスチン（ｂｅｎｄａｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）、トリプラチンテトラナイトレート（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、６－メルカプトプリン（６－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、クロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、シスタルビン（ｃｙｓｔａｒｂｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、イキサベピロン（ｉｚａｂｅｐｉｌｏｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、ＤＭ１（ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ、メルタンシン）、ＤＭ４、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、アウリスタチンＦ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ、ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ）およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の腫瘍微小環境における腫瘍関連マクロファージを除去するための薬学的組成物。
  12. メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物。
  13. 癌は、脳腫瘍、黒色腫、骨髄腫、非小細胞性肺癌、口腔癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、乳癌、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ、ＴＮＢＣ）、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部癌、子宮頸部癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、卵管癌、肛門付近癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎臓骨盤癌、中枢神経系腫瘍、一次中枢神経系リンパ腫、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫および下垂体腺腫からなる群から選択されるいずれか一つ以上である、請求項１２に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
  14. 癌は、抗癌剤耐性癌である、請求項１２に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
  15. Ｍ０マクロファージおよびＭ１マクロファージに比べて、Ｍ２マクロファージにてＩＴＧＢ２の発現が上方制御された患者を対象として投与するものである、請求項１２に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
  16. メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体を薬学的に有効な量で癌に罹患したオブジェクトに投与する段階を含む、癌の治療方法。
  17. 癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に用いるための、メリチン、その変異体またはこれらの類似体にプロアポトーシス性ペプチドまたは抗癌剤が結合された結合体の用途。
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