WO2023195805A9 - Itgb2 매개 약물전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 M2 종양 관련 대식세포의 ITGB2에 특이적으로 결합하는 약물전달체에 관한 것으로, 본 발명의 ITGB2(Integrin beta 2)에 특이적으로 결합하는 ITGB2 결합 모이어티를 포함하는 약물전달체는 M2 종양 관련 대식세포에만 선택적으로 (또는 특이적으로) 작용함으로써 약물 부작용은 경감되고 약물의 약효는 증대시킬 수 있는 효과를 가지므로, 세포사멸 유도제, 항암제, 조영제 등의 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ITGB2 매개 약물전달체

본 발명은 ITGB2에 특이적으로 결합하는 약물전달체에 관한 것이다.

기존의 항암치료는 암세포를 직접 공격하거나 암세포를 공격하는 체내 면역세포의 활성을 강화시키는 방향으로 연구되어 왔다. 그러나 이러한 항암제는 암세포 외의 다른 정상세포 또한 공격하여 탈모, 오심, 구토등의 많은 부작용을 가져왔고, 면역세포의 과도한 증가로 인한 부가적 반응을 초래한다. 기존의 화학적 요법이나 방사선 치료방법에 비하여 부작용을 최소화할 수 있는 항암면역치료방법은 체내의 면역시스템을 이용하여 암을 치료하는 방법이며, 이러한 항암면역치료기법 중에는 치료용 면역세포인 T 세포 (CAR-T 포함), 수지상세포(Dendritic Cells), 자연살해세포(Natural Killer Cells) 등을 체외에서 활성화 시킨 후에 체내에 직접 주입하는 세포치료제방법과 암 항원과 면역활성화 물질을 체내에 주입함으로써, 체내에 존재하는 면역세포를 직접적으로 활성화함으로써 항암효능을 높이는 항암백신에 대한 방법 등이 활발하게 진행되고 있다. 하지만, 이러한 세포치료제나 암백신은 주로 혈액암 관련 질병에 주로 사용되고 있고, 고형암에서는 대부분 그 치료효능이 매우 낮다는 단점을 갖고 있다. 이러한 이유 중의 하나는 고형암 주위에서 면역기능을 억제하는 미세환경 요인에 기인한다. 실제로, 종양미세환경에서 면역세포의 기능을 저하시키는 세포 (MDSC: myeoloid-derived stromal cells, Treg: regulatory T cell, TAM: tumor-assocaited macrophages)나 면역억제유발 사이토카인, 대사체 등이 활발하게 작용함으로써, 면역활성화 물질과 치료용 면역세포의 활성을 급격하게 저하시키는 것이다. 따라서 종양세포 및 면역세포에 직접적인 영향없이 종양세포의 주변 미세환경만을 조절하여 종양세포로의 영양분 공급, 종양세포 주변의 혈관신생등을 차단하여 항암효과를 갖는 치료제 개발이 중요해지고 있다. 종양 미세 환경은 악성 세포의 증식 및 생존, 혈관 신생, 전이, 비정상 적응 면역 및 호르몬 및 화학요법제에 대한 반응 감소에 기여하여 치료 목표로 크게 고려되고 있다.

종양 주변의 미세환경(microenvironment)은 내피세포, 염증성 세포 및 섬유아세포로 구성되어 있으며, 1970년대에 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophage, TAM)가 종양의 성장에 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 종양 관련 대식세포는 암의 성장, 전이 등 전반적인 종양 미세환경과 관련하여 중요한 역할을 담당하며, 종양억제 M1형 대식세포 또는 종양지지 M2형 대식세포의 두 가지 표현형으로 분류된다. M1형 대식세포는 항원을 제시하는 강력한 능력을 갖고, 일반적으로 인터페론-γ, 지방당류(LPS), 종양 괴사 인자(TNF)-α에 의하여 활성화 되며, 전염증 작용 및 살균 작용을 한다. M2형 대식세포는 다양한 세포 외 기질성분, 혈관 신생 및 주화성 인자를 방출함으로써 면역억제, 종양형성 및 혈관형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, IL-4와 IL-13에 의해 유도되며, 아르기나제-1, mannose(MMR, CD206), 스캐빈저 수용체(SR-A, CD204), CD163, IL-10과 같은 마커를 발현함으로써 M1형 종양 관련 대식세포와 구별된다. 종양 주변에 존재하는 종양 관련 대식세포는 종양 세포의 성장, 전이와 밀접하게 관련이 되어 있으며, 암 환자에서 많은 숫자의 M2형 종양 관련 대식세포가 종양 주변에 존재하면 환자의 예후 및 생존률이 좋지 못한 것으로 보고되고 있다. M2형 대식세포는 암의 성장을 촉진하는 IL-10, TGFβ 및 CCL18과 같은 사이토카인을 생성하며, M2형 종양 관련 대식세포의 표면에 존재하는 PDL1 및 B7-1/2와 같은 수용체들은 T 세포, NK 세포의 항종양 활성을 억제하는 것으로 보고되고 있다. M2형 종양 관련 대식세포가 다량으로 존재하는 미세환경에서는 종양의 성장, 분화 및 전이가 활발하게 이루어지므로, M2형 종양 관련 대식세포를 표적으로 하는 표적 치료제의 개발이 필요하다.

본 발명의 목적은 M2 대식세포를 표적화하는 약물전달체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 약물을 M2 종양 관련 대식세포에 특이적으로 전달하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 M2 대식세포를 표적화하는 항암제에 대한 반응성을 갖는 환자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 약물전달체를 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 ITGB2 결합 모이어티; 및 이와 결합된 약물을 포함하는 약물전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약물을 M2 종양 관련 대식세포에 특이적으로 전달하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 M2 대식세포를 표적화하는 항암제에 대한 반응성을 갖는 환자를 선별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 약물전달체를 약학적으로 유효한 양으로 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 약물전달체를 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에서는 ITGB2가 M2 대식세포 매개 암에 특이적인 마커임을 확인하였으며, 본 발명의 ITGB2(Integrin beta 2)에 특이적으로 결합하는 ITGB2 결합 모이어티를 포함하는 약물전달체는 M2 종양 관련 대식세포에만 선택적으로 (또는 특이적으로) 작용함으로써 약물 부작용은 경감되고 약물의 약효는 증대시킬 수 있는 효과를 가지므로, 세포사멸 유도제, 항암제, 조영제 등의 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 TAMpep의 M2 대식세포에 대한 친화도를 유세포 분석으로 확인한 도이다.

도 1b는 TAMpep의 M2 대식세포에 대한 친화도를 정량화한 그래프이다 (*P < 0.05 versus the M0.).

도 2a는 M2/M0 및 M1/M0 비율 분석 벤다이어그램으로 M2 대식세포에서 TAMpep과 결합하는 단백질을 식별한 도이다.

도 2b는 M2/M0 비율의 산점도 플롯(scatter plots) 분석으로 M2 대식세포에서 TAMpep과 결합하는 단백질을 식별한 도이다.

도 2c는 M1/M0 비율의 산점도 플롯 분석으로 M2 대식세포에서 TAMpep과 결합하는 단백질을 식별한 도이다.

도 2d는 M2/M1 비율의 산점도 플롯 분석으로 M2 대식세포에서 TAMpep과 결합하는 단백질을 식별한 도이다.

도 3은 M0, M1 및 M2 대식세포에서 각각 추출한 세포막 단백질과 TAMpep826-비오틴을 반응시켜 얻은 LC-MS 크로마토그램 데이터를 나타낸 도이다.

도 4는 LC-MS/MS 프로테오믹스를 이용하여 TAMpep826의 타겟 단백질을 동정한 도이다.

도 5는 Quantitative RT-PCR 조건을 나타낸 도이다.

도 6은 M2 대식세포에서 ITGB2 mRNA 발현을 확인한 도이다.

도 7은 M2 대식세포에서 ITGB2 단백질 발현을 확인한 도이다.

도 8은 면역형광분석으로 M2 대식세포에서 ITGB2 단백질의 발현을 확인한 도이다.

도 9는 M2 대식세포의 세포막에서 ITGB2의 발현을 확인한 도이다.

도 10은 M2 대식세포에서 TAMpep826 및 ITGB2의 상호작용을 풀-다운 분석(Pull-down assay)으로 확인한 도이다.

도 11은 면역형광분석으로 M2 대식세포에서 TAMpep826 및 ITGB2의 상호작용 확인한 도이다.

도 12 및 13은 TB511과 ITGB2의 결합 부위를 도킹 시뮬레이션으로 확인한 도이다.

도 14는 본 발명의 ITGB2 결합 ADC 제작에 사용된 항-CD18 항체가 CD18의 M2 TAM에서의 활성형 구조 (Extended-open form)에 특이적으로 결합하는 것을 나타낸 모식도이다.

도 15는 센서 칩 표면에 ITGB2을 고정화하고 확인한 도이다.

도 16은 항-ITGB2 항체와 ITGB2 단백질의 결합력을 SPR로 확인한 도이다.

도 17은 Melittin-dKLA와 ITGB2 단백질의 결합력을 SPR로 확인한 도이다.

도 18은 M2 대식세포에서 Crispr/cas9을 통해 확립한 ITGB2 발현 억제 세포 모델에서 ITGB2의 mRNA 발현을 확인한 도이다.

도 19는 M2 대식세포에서 ITGB2 발현 억제에 의한 Melittin-dKLA의 세포사멸 감소 효과를 확인한 도이다.

도 20은 M2 대식세포에서 ITGB2 발현 억제에 의한 TB511(TAMpep826-dKLA)의 세포사멸 유도 감소 효과를 확인한 도이다.

도 21은 M2 대식세포에서 ITGB2 항체에 의한 TB511의 세포사멸 유도 감소 효과를 확인한 도이다.

도 22 및 23은 유방암 3D 오가노이드에서 TB511의 효과를 확인한 도이다.

도 24 및 25는 폐암 3D 오가노이드에서 TB511의 효과를 확인한 도이다.

도 26은 폐암 3D 오가노이드에서 M-DM1의 효과를 확인한 도이다.

도 27 및 28는 항암제 내성 폐암 3D 오가노이드에서 TB511의 효과를 확인한 도이다.

도 29 및 30은 항암제 내성 전립선암 3D 오가노이드에서 TB511의 효과를 확인한 도이다.

도 31은 유방암 3D 오가노이드에서 CD18-DM1의 효과를 확인한 도이다.

도 32는 유방암 3D 오가노이드에서 CD18-MMAE의 효과를 확인한 도이다.

도 33 및 34는 폐암 3D 오가노이드에서 ADC (CD18-DM1 및 CD18-MMAE)의 효과를 확인한 도이다.

도 35 및 36은 항암제 내성 폐암 3D 오가노이드에서 ADC (CD18-DM1 및 CD18-MMAE)의 효과를 확인한 도이다.

도 37는 및 38은 항암제 내성 전립선암 3D 오가노이드에서 ADC (CD18-DM1 및 CD18-MMAE)의 효과를 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.

본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:

알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.

일 측면에서, 본 발명은 ITGB2(Integrin beta 2) 결합 모이어티; 및 이와 결합된 약물을 포함하는 약물전달체에 관한 것이다.

일 구현예에서, ITGB2는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, ITGB2 결합 모이어티는 M2 종양 관련 대식세포의 세포막에 존재하는 ITGB2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있으며, ITGB2와 특이적으로 결합하는 소분자, 바이러스, 항체, 항체 단편, 압타머, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 리간드, 사이토카인의 일부 영역인 펩타이드 또는 리간드의 일부 영역인 펩타이드를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 결합 모이어티에 반감기 또는 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적을 위해 설계된 표적화 서열, 태그, 표지된 잔기 또는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 ITGB2 결합 모이어티는 CD18가 확장된(extended) 활성형 구조(Active conformation)에 특이적으로 결합할 수 있다.

일 구현예에서, ITGB2 결합 모이어티는 ITGB2의 449 내지 617의 아미노산과 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 ITGB2 결합 모이어티는 ITGB2의 466 내지 565의 아미노산과 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 ITGB2 결합 모이어티는 멜리틴, 이의 변이체 또는 이들의 유사체를 포함할 수 있으며, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약물전달체는 서열번호 3 내지 6의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약물전달체는 펩타이드-약물 접합체(peptide-drug conjugate, PDC)일 수 있고, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 Melittin-dKLA일 수 있으며, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 TB511일 수 있고, 말레이미드-변형된 멜리틴에 약물 DM1이 컨쥬게이트된 M-DM1일 수 있다.

일 구현예에서, TB511는 ITGB2의 466 내지 565의 아미노산과 결합할 수 있고, TB511의　LEU(6)은　ITGB2의　LEU(528), THR(538), LEU(556), CYS(557)　및　PHE(558)　부위와 결합(bindin)할 수 있고, TB511의　TRP(12)는　ITGB2의　GLU(466), ILE(469), CYS(470)　및　ARG(471)과 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 ITGB2 결합 모이어티는 ITGB2(CD18)의 732 내지 748의 아미노산을 포함하는 에피토프 (서열번호 9), 504 내지 508의 아미노산을 포함하는 에피토프, 534 내지 546의 아미노산을 포함하는 에피토프, 449 내지 617의 아미노산을 포함하는 에피토프, 또는 23 내지 700 (Gln23-Asn700)의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 ITGB2 결합 모이어티는 상기 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')₂, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약물전달체는 항체-약물 접합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)일 수 있다.

일 구현예에서, 약물전달체의 ITGB2 결합 모이어티와 약물은 링커를 매개로 공유적으로 결합하거나 링커의 매개없이 비공유적으로 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 약물전달체의 ITGB2 결합 모이어티와 약물은 링커를 매개로 연결/결합될 수 있으며, 링커는 펩타이드나 리간드, 항체, 항체 단편 등의 단백질의 아민기(amine group), 카르복시기(carboxyl group) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl group)나 압타머 등의 핵산의 인산기(phosphate group, 히드록시기(hydroxyl group)를 통해 결합할 수 있는 작용기를 가진 임의의 링커를 사용할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 링커는 약물에 따라 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 약물에, 알데하이드 반응기를 가지는 링커를 연결하고 약물전달체의 ITGB2 결합 모이어티인 항체(세포 표적화 영역)의 N 말단의 아미노기에 결합시킬 수 있다.

이러한 링커의 작용기는 아이소티오시아네이트(isothiocyanate), 아이소시아네이트(isocyanates), 아실 아자이드(acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 알데하이드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭사이드(epoxide), 옥시레인(oxirane), 칼보네이트(carbonate), 아릴 할라이드(arylhalide), 이미도에스터(imidoester), 카보이미드(carbodiimide), 안하이드라이드(anhydride), 플루오로페닐 에스터(fluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 또는 비닐술폰(vinylsulfone) 등일 수 있다. 링커는 프로테아제에 의해서 절단 가능하거나, 산이나 염기 조건에서 절단 가능하거나, 고온이나 광조사에 의해서 절단 가능하거나 또는 환원 또는 산화 조건에서 절단 가능한 링커일 수 있고, 또는 이러한 조건들에서 절단 가능하지 않은 링커일 수도 있다. 절단 가능한 링커로서는 예컨대 산성 조건에서 절단되는 히드라존(hydrazone) 링커, 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 링커, 환원 조건에서 절단되는 디설파이드(disulfide) 작용기를 갖는 링커 등을 들 수 있고, 절단 가능하지 않은 링커로서는 MCC(Maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate) 링커, MC(maleimidocaproyl) 링커, 또는 그 유도체로서 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC) 링커나 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-sMCC)를 들 수 있다.

또한 링커는 자가 희생 링커(self-immolative linker) 또는 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커(traceless linker)일 수 있다. 자가 희생 링커는 예컨대 발명의 명칭이 "Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof "인 미국 특허 제9,089,614호에 개시된 링커, 명칭이 "SELF-IMMOLATIVE LINKERS CONTAINING MANDELIC ACID DERIVATIVES, DRUG-LIGAND CONJUGATES FOR TARGETED THERAPIES AND USES THEREOF"인 국제공개 제WO2015038426호에 개시된 링커를 들 수 있으며, 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커로서는 페닐하이드라지드 링커, 아릴-트리아젠 링커, 문헌[Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem Rev. 102: 2607-2024 (2002)]에 개시된 링커 등일 수 있다.

당업계에서는 상기 예시한 바의 링커 이외에도 본 발명에 적용 가능한 수많은 링커가 상당한 수의 문헌을 통해 공지되어 있다. 그러한 문헌으로서 구체적으로 문헌[Castaneda, et al, "Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibodydrug conjugation," Chem Commun. 49: 8187-8189 (2013)], 문헌[Lyon, et al, "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)], 문헌[Dawson, et al "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779], 문헌[Dawson, et al "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J Am Chem Soc. 1997, 119, 4325-4329] 문헌[Hackeng, et al "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology," Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 10068-10073], 문헌[Wu, et al "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew Chem Int Ed 2006, 45, 4116-4125], 문헌[Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R Liss, Inc, 1988, pp 199-218], 문헌[Fields, G and Noble, R (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int J Peptide Protein Res 35:161-214] 등이나, 미국 특허 제6,884,869호, 미국 특허 제7,498,298호, 미국 특허 제8,288,352호, 미국 특허 제8,609,105호, 미국 특허 제8,697,688호, 미국 특허공개 제2014/0127239호, 미국 특허공개 제2013/028919호, 미국 특허공개 제2014/286970호, 미국 특허공개 제2013/0309256호, 미국 특허공개 제2015/037360호, 미국 특허공개 제2014/0294851호, 국제 특허공개 WO2015057699, 국제 특허공개 WO2014080251, 국제 특허공개 제WO2014197854, 국제 특허공개 WO2014145090, 국제 특허공개 WO2014177042 등을 참조할 수 있다.

본 발명의 약물전달체의 ITGB2 결합 모이어티와 약물은 생체 적합성 고분자를 매개로 또는 캐리어로 하여 결합될 수도 있다. 생체적합성 고분자는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 가지고 있는 고분자를 의미한다.

상기 생체적합성 고분자로서의 합성 중합체는 폴리에스테르, 폴리하이드 록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머(EVOH), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌과 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 스틸렌-이소브틸렌-스틸렌 트리블록 공중합체, 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 메틸에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리플루오로알켄, 폴리퍼플루오로알켄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 아로마틱스, 폴리스틸렌, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스틸렌 공중합체, ABS 수지와 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 폴리아마이드, 알키드 수지, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴산-co-말레산 또는 폴리아미노아민이며, 천연 중합체는 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 히알루론산, 알기네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐이다.

ITGB2 결합 모이어티와 약물의 결합에 사용되는 링커는 표적세포 밖에서 안정적이어서 절단되지 않고, 표적세포 내 산성 조건인 엔도좀이나 리조솜에서도 절단되지 않는 링커인 것이 바람직할 것이다. 이러한 링커는 표적세포 밖에서 안정적이어서 절단되지 않음으로서 약물이 세포 내로 이동되도록 하고, 산성 조건인 엔도좀이나 리조좀에서 절단되지 않으로써 엔도좀이나 리조솜에서 세포질로 이동될 수 있도록 한다.

본 발명의 약물전달체에서, 약물은 ITGB2 결합 모이어티에 비공유적으로 결합할 수도 있다. 예컨대 핵산에 인터컬레이션(intercalation)되어 효과를 발휘하는, 항암제 일종인 독소루비신과 같은 인터컬레이터제(intercalator agents)는 약물전달체의 세포 표적화 영역으로서 압타머를 사용할 경우에 압타머에 비공유적으로 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 결합될 수 있다. 압타머는 올리고뉴클레오타이드 분자이기 때문에, 뉴클레오타이드 염기들의 염기 스태킹(base stacking)이 있으며, 이 염기 스태킹 사이에 약물이 인터컬레이션(intercalation) 방식으로 결합할 수 있게 된다.

일 구현예에서, 상기 ITGB2 결합 모이어티에 RNA, DNA, 항체, 이펙터, 약물, 전구약물, 독소, 펩티드 또는 전달 분자가 추가로 접합(conjugate)될 수 있다 (Shoari et al., Pharmaceutics 13:1391, pp. 1-32 (2021) 참조).

본 발명의 약물전달체에서, 약물은 그것이 세포 내로 이동하여 효과를 발휘할 수 있는 약물이면 특별한 제한이 없다. 그러한 약물은 세포독성 항암제 등의 임의의 저분자 화합물로 된 약물, 재조합 단백질, siRNA 등의 임의의 바이오의약품일 수 있다. 또한 약물은 효능 면에서 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스 질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 혈관신생억제제, 면역억제제, 면역촉진제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환치료제, 조영제 등의 진단제 등일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약물은 화합물, RNA, DNA, 항체, 이펙터, 전구약물, 독소, 펩티드 또는 방사선 핵종일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약물은 면역원성 세포사멸 유도제, 전세포사멸성(pro-apoptotic) 펩타이드, 이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터컬레이터(DNA intercalators), 독소(toxin) 또는 항암제일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 전세포사멸성 펩타이드는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, Brevenin-2R, 부포린 IIb(Buforin IIb), 세크로핀 A-마가이닌 2(cecropin A-Magainin 2, CA-MA-2), 세크로핀 A(Cecropin A), 세크로핀 B(Cecropin B), 크리소피신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(Gomesin), 락토페리신 B(Lactoferricin B), LLL27, LTX-315, 마가이닌 2(Magainin 2), 마가이닌 II-봄패신 결합체(Magainin II-bombesin conjugate, MG2B), 파르닥신(Pardaxin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 항암제는 SN-38(7-에틸-10-히드록시-캠토테신, 7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 발루비신(valrubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 이리도테칸(iridotecan), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 벤다무스틴(bendamustine), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 에토포사이드(etoposide), 미토산트론(mitoxantrone), 이자베필론(izabepilone), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1(mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E, MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, DM1 또는 MMAE일 수 있다.

본 발명에서 약물은 바람직하게는 세포독성 항암제이이다. 세포독성 항암제는 대사길항제(Antimetabolites), 미세관(microtubulin) 표적화제(Tubulin polymerase inhibitor 및 Tubulin depolymerisation), 알킬화제(Alkylating agents), 유사분열 억제제(Antimitotic Agents), DNA 절단제(DNA cleavage agent), DNA 가교제(DNA cross-linker agent), DNA 인터컬레이터제(DNA intercalator agents), DNA 토포아이소머라아제 억제제(DNA topoisomerase inhibitor) 등으로 대별될 수 있는데, 대사길항제로서는 메토트렉세이트(Methotrexate) 등의 폴산(Folic acid) 유도체, 클라드리빈(Cladribine) 등의 퓨린(Purine) 유도체, 아자시티딘(Azacitidine) 등의 피리미딘(pyrimidine) 유도체, 독시플루리딘(Doxifluridine), 플루오로우라실(Fluorouracil) 등이 당업계에 공지되어 있고, 미세관 표적화제로서는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 돌라스타틴 등의 아우리스타틴 계열의 약물, 메이탄신(Maytansines) 등이 당업계에 공지되어 있으며, 알킬화제로서는 부설판(Busulfan), 트레오설판(Treosulfan) 등의 알킬 설포네이트(Alkyl Sulfonate) 제제, 벤다머스틴(Bendamustine) 등의 니트로젠 머스타드(Nitrogen Mustard) 유도체, 시스플라틴(Cisplatin), 헵타플라틴(Heptaplatin) 등의 플라티늄(Platinum) 제제 등이 당업계에 공지되어 있다. 또 유사분열 억제제(Antimitotic Agents)로서는 도세탁셀(Docetaxel), 파크리탁셀(Paclitaxel) 등의 탁산(Taxane) 제제, 빈플루닌(Vinflunine) 등의 빈카 알칼리드(Vinca alkalids), 에토포시드(Etoposide) 등의 포도필로톡신(Podophyllotoxin) 유도체 등이 당업계에 공지되어 있고, DNA 절단제(DNA cleavage agent)로서는 칼리채미신(Calicheamicins) 등이 공지되어 있으며, DNA 가교제(DNA cross-linker agent)로서는 PBD 이중체 등이 공지되어 있다. 또 DNA 인터컬레이터제로서는 독소루비신 등이 당업계에 공지되어 있으며 DNA 토포아이소머라아제 억제제로서는 SN-28 등이 당업계에 공지되어 있다.

또한 약물은 유전자, 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 펩티드, 리보자임, 바이러스 입자, 면역조절제, 단백질, 조영제 등일 수도 있다. 보다 구체적으로 약물은 망막모세포종 종양 서프레서 유전자의 변이체인 Rb94를 코딩하는 유전자, 종양 세포에서만 세포자멸을 유도하는 아폽틴을 코딩하는 유전자일 수 있고, 치료 표적이 되는 HER-2 등에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열: 5'-TCC ATG GTG CTC ACT-3')수 있으며, MRI 조영제인 Gd-DTPA 물질 등의 진단 조영제일 수도 있다.

본 발명의 약물전달체과 약물의 복합체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형의 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 약물전달체는 상기 약물을 M2 종양 관련 대식세포에 특이적으로 전달할 수 있다.

본 발명에서, ITGB2 결합 모이어티는 표적 세포인 M2 종양 관련 대식세포의 ITGB2와의 결합을 통해 선택적인 결합이 가능하게 함으로써 표적 기능을 제공한다. 이 ITGB2 결합 모이어티는 표적세포의 표면에 존재하는 ITGB2와 특이적으로 결합하여 엔도시토시스(endocytosis)를 유도함으로써, 이와 결합하는 약물의 세포 내로의 이동을 가능하게 한다.

본 발명에서, 항체, 압타머, 특정 세포에서 분비되어 표적세포인 다른 세포의 표면 수용체에 작용함으로써 세포 사이에서의 신호 전달의 역할을 하는 호르몬(예컨대 erythropoietin hormone), 사이토카인이나 케모카인(예컨대 IL13), 표적세포 표면 수용체 결합하는 VEGF(Vascular endothelial growth factor), BDNF(Brain-derived neurotrophic factor) 등의 생체 분자인 리간드, 수용체와의 특이적 결합 능력을 보유한 이들 인자의 일부 영역인 펩타이드 등이 이러한 ITGB2 결합 모이어티로 이용될 수 있다. 대표적으로 항체 또는 압타머가 사용될 수 있으며, ITGB2 결합 모이어티로서의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체뿐만 아니라 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프를 인식하는 항체로서 이특이적 항체 등을 말함)이거나, ITGB2와 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 한, 항체의 단편, 화학적으로 수식된 항체, 키메릭 항체(인간과 마우스의 키메릭 항체, 인간과 원숭이 키메릭 항체 등), 면원원성을 낮춘 인간화 항체나 인간 항체 등 임의의 항체일 수 있다. 또한 항체 단편, 화학적 수식된 항체의 다양한 형태들이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')₂, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디(diabody) 등이나 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편 등을 들 수 있다.

항체의 제조 방법, 천연 항체에 인위적 변형을 가하여 표적 항원에 대한 특이성을 항상시키거나 면역원성을 개선시킨 항체 등과 관련해서는 당업계에 공지된 다양한 문헌 예컨대 미국 특허 4,444,887, 미국 특허 4,716,111, 미국 특허 5,545,806, 미국 특허 5,814,318, 국제 공개특허 WO 98/46645, 국제 공개특허 WO 98/50433, 국제 공개특허 WO 98/24893, 국제 공개특허 WO 98/16654, 국제 공개특허 WO 96/34096, 국제 공개특허 WO 96/33735, 문헌[Protein Eng 1994, 7(6):805-814], 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91:969-973] 등을 참조할 수 있다.

세포 표적화 영역으로서의 압타머는 단일가닥 DNA 압타머 또는 단일가닥 RNA 압타머일 수 있다. 압타머는 항체와 마찬가지로 표적 항원 등 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 리간드를 의미하는데, 표적분자와 특이적으로 결합할 수 있다면, 압타머는 이중가닥 DNA 또는 RNA 압타머일 수도 있다. 이러한 표적분자와의 특이적 결합할 수 있는 압타머의 제조, 선별 방법 등은 모두 당업계에 공지되어 있다. 압타머의 선별을 위한 구체적인 방법이나 적절한 시약, 재료 등의 사용에 대해서는 문헌[Methods Enzymol 267:275-301, 1996], 문헌[Methods Enzymol 318:193-214, 2000] 등을 참조할 수 있다. 압타머는 생체 내 반감기 향상을 위하여 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 것일 수 있다. 이러한 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드는 당업계에 그 제조방법을 포함하여 구체적으로 공지되어 있다. 예컨대 당에서 변형된 뉴클레오티드는, 그 당의 하이드록실 기(OH group)가 할로겐 기, 지방족 기, 에테르 기, 아민 기 등으로 수식된 것, 당인 리보스 또는 디옥시 리보오스 자체가 이를 대신할 수 있는 당 유사체 α-아노머 당(α-anomeric sugars), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xyloses) 또는 릭소오스(lyxoses)와 같은 에피머 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars) 등으로 치환된 것을 들수 있다. 또한 예컨대 포스페이트에서의 변형은 포스페이트가 P(O)S(thioate), P(S)S(dithioate), P(O)NR2(amidate), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2(formacetal)로의 변형된 것 등을 들수 있다. 여기서 상기 R 또는 R'는 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 등이며, 포스페이트에서 변형될 경우 그 연결기는 -O-, -N-, -S- 또는 -C-가 되어, 이러한 연결기를 통해 인접 뉴클레오티드가 서로 결합하게 된다.

본 발명의 약물전달체는 M2 종양 관련 대식세포의 세포막에 발현된 ITGB2, 특히, M2 TAM에서의 활성형 구조(Active conformation)의 ITGB2 (CD18)에 특이적으로 직접 결합하므로 약물 효과가 비선택적으로 나타나는 부작용이 없이 표적분자인 ITGB2가 발현되고 활성화된 M2 종양 관련 대식세포에 대해서만 선택적으로 약물 효과가 나타내는 것을 가능하게 한다.

일 측면에서, 본 발명은 멜리틴, 이의 변이체 또는 이들의 유사체를 포함하는 ITGB2 결합 모이어티; 및 이와 결합된 약물을 포함하는 펩타이드-약물 접합체(peptide-drug conjugate, PDC)에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 PDC는 ITGB2의 466 내지 565의 아미노산과 결합할 수 있으며, ITGB2의 LEU(528), THR(538), LEU(556), CYS(557), PHE(558), GLU(466), ILE(469), CYS(470) 또는 ARG(471)과 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 PDC는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 Melittin-dKLA일 수 있으며, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 TB511일 수 있고, 말레이미드-변형된 멜리틴에 약물 DM1이 컨쥬게이트된 M-DM1일 수 있다.

일 구현예에서, TB511는 ITGB2의 466 내지 565의 아미노산과 결합할 수 있고, TB511의　LEU(6)은　ITGB2의　LEU(528), THR(538), LEU(556), CYS(557)　및　PHE(558)　부위와 결합(bindin)할 수 있고, TB511의　TRP(12)는　ITGB2의　GLU(466), ILE(469), CYS(470)　및　ARG(471)과 결합할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 ITGB2에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편; 및 이와 결합된 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 ADC는 ITGB2의 732 내지 748의 아미노산을 포함하는 에피토프, 504 내지 508의 아미노산을 포함하는 에피토프, 534 내지 546의 아미노산을 포함하는 에피토프, 449 내지 617의 아미노산을 포함하는 에피토프, 또는 23 내지 700의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 ADC는 항체-약물 접합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC) 링커를 추가로 포함할 수 있으며, ADC 링커는 6-말레이미도카프로일(MC), 말레이미도프로파노일(MP), 발린-시트룰린(val-cit), 알라닌-페닐알라닌(ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐(PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트(SMCC), 발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(val-cit-PAB) 또는 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB)일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 항체-약물 접합체는 ADC 링커를 통해 항-CD18 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 약물과 복합체를 형성할 수 있다.

상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합(disulfide bond)으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.

본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 면역학적 활성을 가진 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 생체에서 분리된 (생체에 존재하지 않는) 것 또는 비자연적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있으며, 예컨대, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 자연적 또는 비자연적(예컨대, 합성적 또는 재조합적)으로 얻어질 수 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

본 발명에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1 , C_H2 및 C_H3 과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

본 발명에서 용어, "가변 영역(variable region) 또는 가변 부위 (variable domain)"는 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변 영역에는 상보성 결정 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다. 상기 "상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.

본 발명에서 용어, "scFv(single chain fragment variable)"는 유전자 재조합을 통해 항체의 가변영역만을 발현시켜 만든 단쇄항체를 말하며, 항체의 VH 영역과 VL 영역을 짧은 펩티드 사슬로 연결한 단일쇄 형태의 항체를 말한다. 상기 용어 "scFv"는 달리 명시되지 않거나, 문맥상 달리 이해되는 것이 아니라면, 항원 결합 단편을 비롯한 scFv 단편을 포함하고자 한다. 이는 통상의 기술자에게 자명한 것이다.

본 발명에서 용어, "상보성결정영역(complementarity determining region, CDR)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1, CDRH2,CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 항원결정부위에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.

본 발명에서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "항원결합단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv) 2 , scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab') 2 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항원결합단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab') 2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원결합단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab') 2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, C_H1 및 C_H2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다. 예컨대, 상기 힌지는 인간 항체로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편의 폴리펩타이드 서열을 코딩한 후, 원하는 경우, 숙주세포 내로 클로닝되고, 발현 및 검정되는 핵산 형성에 이용된다. 이를 위한 다양한 방법이 문헌 (Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed., Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons)에 기재되어 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산은 단백질 발현을 위해 발현벡터에 삽입될 수 있다. 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어(regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. 적절한 상태에서, 핵산으로 형질전환된 숙주세포, 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 코딩하는 핵산 함유 발현벡터를 배양하여 단백질 발현을 유도하는 방법에 의해 본 발명에 따른 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편이 생산될 수 있다. 포유류 세포, 박테리아, 곤충 세포, 및 효모를 포함하는 다양한 적절한 숙주세포가 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 생산비가 저렴하여 산업적 이용가치가 높은 대장균을 숙주세포로 하여 본 발명에 따른 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 생산한다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 ITGB2에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 항원 결합 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor: CAR)에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 키메라 항원 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 키메라 항원 수용체 발현 세포에 관한 것이다.

일 구현예에서, 키메라 항원 수용체 발현 세포는 키메라 항원 수용체 발현 대식세포(CAR-macrophage), 키메라 항원 수용체 발현 T(CAR-T) 세포, 키메라 항원 수용체 발현-감마-델타 T(CAR-Gamma-delta T) 세포 또는 자연살해(CAR-NK) 세포일 수 있다.

본 발명에서 용어, "CAR(chimeric antigen receptor)"는, 면역 효과기 세포에 특정 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있는, 자연적으로 존재하지 않는 수용체를 의미한다. 보통, 상기 CAR은 T 세포에 단일클론항체의 특이성을 이식하기 위하여 사용되는 수용체를 말한다. CAR은 대개 세포 외 도메인(Ectodomain), 막투과성 도메인(transmembrane domain) 및 세포 내 도메인(Ectodomain)으로 구성된다.

상기 세포 외 도메인은 항원 결합 부위(antigen recognition region)를 포함하며, CAR의 막통과 도메인은 세포 외 도메인과 연결된 형태로, 자연적 또는 합성된 것에서 유래한 것일 수 있다. 자연적으로 존재하는 것에 유래한 경우, 막 결합 또는 막투과성 단백질에서 유래한 것일 수 있으며, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 체인, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD 154 또는 CD8 등 다양한 단백질의 막 투과성 영역에서 유래한 부분일 수 있다. 이러한 막통과 도메인의 서열은 막투과성 단백질의 막투과성 영역 부분을 공지하고 있는 통상의 기술분야에 공지된 문헌 등으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 막통과 도메인이 합성된 것일 경우, 이는 류신 및 발린과 같은 소수성 아미노산 잔기를 주로 포함할 수 있으며, 그 예로 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛(triplet)이 합성된 막통과 도메인에 존재할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 막통과 도메인에 대한 서열정보는 합성된 막통과 도메인에 대한 통상의 기술분야에 공지된 문헌으로부터 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 CAR에서 상기 세포 내 도메인은 세포 내에 존재하는 CAR의 도메인 일부로서, 막통과 도메인과 연결된 형태이다. 본 발명의 상기 세포 내 도메인은 CAR의 항원 결합 부위에 항원이 결합하면 T 세포 활성화, 바람직하게는 T 세포 증식을 가져오는 것이 특징인, 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 상기 세포 내 신호전달 도메인은 세포 외에 존재하는 항원 결합 부위에 항체가 결합하면, T 세포 활성화를 가져올 수 있는 신호를 전달하는 부분이라면 특별히 그 종류에 제한되지 않으며, 다양한 종류의 세포 내 신호전달 도메인이 사용될 수 있으며, 그 예로 면역수용체 티로신-기초한 활성화 모티프(tyrosine-based activation motif) 또는 ITAM일 수 있으며, 상기 ITAM은 CD3 제타(ξ, zeta), FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d 또는 FcεRIγ에서 유래한 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

CAR는 T-세포 신호화 분자의 세포질 도메인에 경첩 및 막관통 영역을 통해 커플링되는 종양 연계 항원 (TAA)에 특이적인 항체의 단쇄 단편 가변부 (scFv)를 포함한다. 대부분의 통상적인 림프구 활성화 모이어티는 T-세포 촉발 (예를 들어 CD3ζ) 모이어티를 갖는 탠덤(tandem)에서 T-세포 공자극 (예를 들어 CD28, CD137, OX40, ICOS, 및 CD27) 도메인을 포함한다. CAR-매개 입양 면역요법은 CAR-이식된 세포가 비-HLA-제한 방식으로 표적 종양 세포 상의 TAA를 직접 인식하게 한다.

본 발명에서 용어, "키메라 항원 수용체 발현 T(CAR-T) 세포"는 CAR을 발현하는 T 세포를 의미한다. 상기 키메라 항원 수용체 발현 T(CAR-T) 세포는 ⅰ) HLA(human leukocyte antigen)에 비의존적인 방식으로 암 항원을 인지하므로, 세포 표면에 HLA 발현을 감소시켜 항암제의 작용을 회피하는 암들을 치료할 수 있는 이점을 지니며, ⅱ) HLA 타입과 무관하므로, 환자의 HLA 타입과 관계없이 치료에 이용할 수 있으며, ⅲ) 짧은 시간 내에 많은 양의 암 특이적 T 세포를 만들어 낼 수 있으므로, 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있는 이점을 지닌다.

상기 T 세포는 CD4⁺ T세포(도움 T 세포, TH 세포), CD8⁺ T세포(세포독성 T 세포, CTL), 기억 T 세포, 조절 T 세포(Treg 세포) 자연살해 T 세포 등 있으며, 본 발명에서 CAR이 도입되는 T 세포는 바람직하게는 CD8⁺ T세포 이나, 이에 제한되지 않는다.

일 구현예에서, 본 발명은 ITGB2에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 T 세포 관여자(T-cell engager)에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 T 세포 관여자는 예를 들어, 이중-특이적 T-세포 관여자 (bispecific T-cell engager, BiTE)일 수 있다. 상기 BiTE는 인공 이중특이적 모노클로날 항체의 부류로, 약 55 킬로달톤의 단일 펩티드 사슬 상에 4 개의 상이한 유전자로부터 아미노산 서열 또는 상이한 항체의 2 개의 단쇄 가변부 단편(scFv) 으로 구성되는 융합 단백질이다. scFv 중 하나는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고, 다른 하나는 종양 특이적인 분자를 통해 종양 세포에 결합한다. 다른 이중특이적 항체와 유사하게, 그리고 보통의 모노클로날 항체와는 달리, BiTE는 T 세포와 종양 세포 사이에서 연결을 형성한다. 이는 퍼포린 및 그랜자임과 같은 단백질을 생산함으로써 MHC I 또는 공자극 분자의 존재와는 독립적으로 T 세포가 종양 세포 상에서 세포독성 활성을 발휘하게 한다. 이들 단백질은 종양 세포로 진입하고 세포의 세포사멸을 개시한다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약물전달체, 펩타이드-약물 접합체 또는 항체-약물 접합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 약물전달체, 펩타이드-약물 접합체 또는 항체-약물 접합체를 유효성분으로 포함하는 면역항암제에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 암은 M2 종양 관련 대식세포 매개 암일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 M0 대식세포 및 M1 대식세포에 비하여, M2 대식세포에서 ITGB2의 발현이 상향조절된 환자를 대상으로 투여될 수 있다.

일 구현예에서, 암은 뇌종양, 흑색종, 골수종, 비소세포성폐암, 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 삼중음성유방암(Triple Negative Breast Cancer, TNBC), 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 항암제 내성 암일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 생물학적 요법, 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 본 발명을 암의 예방 및 치료에 이용하는 경우 상기 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 정상 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 ITGB2(Integrin beta 2)에 후보물질을 처리하는 단계; 및 ITGB2과 결합하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 약물을 M2 종양 관련 대식세포에 특이적으로 전달하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 확장된(extended) 활성형 구조(Active conformation)의 CD18에 특이적으로 결합하는 후보물질을 선별할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 분리된 시료에서 ITGB2의 발현양을 확인하는 단계를 포함하는 M2 대식세포를 표적화하는 항암제에 대한 반응성을 갖는 환자를 선별하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 M2 대식세포에서 ITGB2의 발현양이 M0 대식세포 및 M1 대식세포에 비해 높은 경우, M2 대식세포를 표적화하는 항암제에 대한 반응성을 갖는 환자로 판별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 ITGB2 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 고형암 진단용 마커에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 ITGB2의 발현양을 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 제제를 포함하는, 고형암 진단용 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, mRNA 수준에서 측정하는 제제는, 상기 유전자의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라미어 쌍, 프로브, 또는 프라이머 쌍 및 프로브일 수 있으며, 상기 측정은 중합효소연쇄반응, 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응(Competitive RT-PCR), Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이, 노던블랏, DNA 칩, multiplex PCR 또는 ddPCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 단백질 수준에서 측정하는 제제는, 상기 유전자의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)일 수 있으며, 상기 측정은 웨스턴블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석 또는 단백질 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3 hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 ITGB2와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 상기 유전자 발현 정도를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시키는 적합한 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcidHybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate),1mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 면역항암제를 처리한 시료에서 ITGB2의 발현양을　확인하는 단계를 포함하는, M2 대식세포를 표적화하는 면역항암제에 대한 반응성 예측 또는 예후 진단 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 면역항암제 처리 후 시료에서 ITGB2 단백질의 발현량이 감소한 경우 면역항암제에 대한 반응성이 좋은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 양수, 타액, 복수, 골수, 누액, 담즙, 폐세척액, 뇌척수액, 흉수, 활액, 림프, 정액, 뇨, 또는 조직 생검 또는 세포로부터 단백질을 추출한 용액일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 대상으로부터 분리된 시료에서　ITGB2의 발현양을　확인하는 단계; 대조군과 ITGB2의 발현양을 비교하는 단계; 및 ITGB2가 대조군에 비해 과발현된 대상을 분류하는 단계를 포함하는, 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, ITGB2가 대조군에 비해 과발현된 대상을 암에 걸린 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약물전달체를 약학적으로 유효한 양으로 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 개체는 M0 대식세포 및 M1 대식세포에 비하여, M2 대식세포에서 ITGB2의 발현이 상향조절된 환자일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약물전달체를 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. M2 종양 관련 대식세포(M2 TAM) 표적화 펩타이드 합성

하기 표 1의 멜리틴(Melittin) 및 TAMpep826을 GenScript (Piscataway, NJ, USA)에 합성 의뢰하여 공급받았으며, 이후 실험에서 D-PBS에 5 mg/ml로 녹여 사용되었다.

명칭	서열	서열번호	설명
Melittin	GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ	1	멜리틴 펩타이드
TAMpep826	VLTTGLPALISWIKRKRQQ	2	멜리틴의 첫 7개의 아미노산이 제거된 펩타이드

실시예 2. M2 TAM 표적화 분석

2-1. 멜리틴의 M2 TAM에 대한 친화도(Affinity) 확인

상기 실시예 1에서 제작한 멜리틴이 M2 종양 관련 대식세포(M2 TAM)에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해, 인간 단핵구 세포주 THP-1를 M0, M1 및 M2 대식세포로 분화시키고, FITC 컨쥬게이트된 멜리틴을 처리하여 유세포 분석으로 확인하였다. 구체적으로, THP-1 세포는 100 nM의 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)를 37℃에서 24시간 동안 처리하였고 (M0 대식세포), 분화된 M0 대식세포를 100 nM의 LPS 및 20 ng/ml의 IFN-γ와 37℃에서 72시간 동안 배양하여 M1 대식세포 (M1)로 분화시켰으며, 20 ng/ml의 IL-4 및 IL-13와 37℃에서 72시간 동안 배양하여 M2 대식세포 (M2)로 분화시켰다. 분화된 세포에 FITC 컨쥬게이트된 멜리틴 50 nM을 1시간 동안 처리하고 BD FACS CantoII instruments (BD biosciences, San Jose, CA, USA)로 세포를 검출하여 FlowJo software (BD biosciences)로 분석하였다.

그 결과, FITC 양성 세포는 M0 및 M2 대식세포에 비해 M2 대식세포에서 현저히 증가하였다 (도 1a 및 b). 이를 통해, 멜리틴이 M2 대식세포에 우선적으로 결합하는 것을 확인하였다.

2-2. 멜리틴의 M2 TAM 결합 표적 단백질 식별

M2 대식세포의 어떤 단백질이 멜리틴과 M2 대식세포의 특이적 결합에 관련되었는지 확인하기 위해, 비오틴-컨쥬게이트된 멜리틴 (멜리틴-biotin)을 합성하였다. THP-1 세포 (5 Х 10⁶ cells)를 M0, M1 및 M2 대식세포로 분화시킨 뒤, 스크래퍼를 이용하여 세포를 모아 원심분리 (300 Х g, 5분)를 통해 세포를 세척하고 세포막 단백질 추출 키트(membrane protein extraction kit) (Thermo Fisher scientific)을 사용하여 대식세포의 세포막 단백질을 얻었다. 멜리틴에 비오틴(biotin)이 결합된 멜리틴-비오틴 (200 μg)과 상온 (20~24℃)에서 1시간 동안 반응시킨 후 스트렙타비딘 레진(streptavidin resin) (Thermo Fisher scientific)을 이용하여 멜리틴과 결합한 단백질을 얻었다. 염을 제거하기 위해, 100% 메탄올, 0.1% 포름산 및 80% CAN을 각각 100㎕씩 18 Micro Spin-Column에 첨가하여 준비하고, 준비된 컬럼에 시료를 로딩하고 50 ㎕의 0.1% 포름산을 첨가하여 불필요한 물질을 제거하였다. 그 후, 80% CAN 100 ㎕를 첨가하여 펩타이드를 용리시켰다. 탈염이 끝나면 Speed-vac으로 건조시켜 용액을 모두 제거하고, 하기 표 2의 조건으로 UPLC-Exactive equipment (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 LC-MS/MS로 분석하였다. MaxQuant 및 MPP (Mass Profiler Professional)를 이용하여 M0 대식세포에 비해 M1 및 M2 대식세포에서 상향 조절된 단백질에 대해 데이터를 분석하였다. 데이터 분석을 위해 각 시표 별로 LC-MS/MS 데이터를 Proteome Discoverer를 이용하여 분석하였고, 데이터베이스는 Uniprot의 human database를 사용하여, LFQ(Label-Free Quantification)로 진행하였다. Modificaiton은 Oxidation(M), Carbamyl(N-term), Carbamidomethyl(C)를 추가하였고, Baseline option은 none으로 하였다.

그 결과, M2/M0에서 53개의 단백질이, M1/M0에서 123개의 단백질이 상향조절되었다 (도 2a). M2 대식세포보다 더 많은 상향조절된 단백질들이 M1 대식세포와 상호작용하였으나, 세포막에 존재하는 단백질은 그렇지 않았다. 막 단백질들 중, ITGB2가 M2 대식세포에서 상향조절되는 것으로 나타났다 (도 2b). 또한, M1 대식세포의 마커로 알려진 IL-10 및 CXCL10와 같은 사이토카인들이 M1 대식세포에서 상향조절되었다 (도 2v). 또한, 단백질들이 M1에 비해 M2에서 상향조절된 단백질들이 확인되었으나, 막 단백질들 중 ITGB2만이 M2 대식세포에서 상향조절되는 것으로 확인되었다 (도 2d). 이를 통해, 멜리틴이 M2 대식세포의 막 단백질 ITGB2과 상호작용하고 결합하는 것을 확인하였다.

2-3. TAMpep826의 M2 TAM 결합 표적 단백질 식별

상기 실시예 2-2에서와 같이, M0, M1 및 M2 대식세포에서 각각 추출한 세포막 단백질과 TAMpep826-비오틴을 반응시켜 LC-MS/MS proteomics를 통해 타겟 단백질을 확인하였다.

그 결과, 세포막 단백질 중 ITGB2가 M0 및 M1 대식세포에 비해 M2 대식세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 것으로 나타나 (도 4), TAMpep826의 M2 대식세포 결합 표적 단백질로서 선별되었다.

실시예 3. M2 대식세포의 ITGB2 발현 확인

3-1. ITGB2 mRNA 발현 확인

M0, M1, M2 대식세포 및 TAMs에서 ITGB2의 mRNA 발현 수준을 평가하기 위해 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 구체적으로, M0, M1 또는 M2 대식세포로 분화된 세포에서 easy-BLUE total RNA Extraction Kit (iNtRON)를 이용하여 RNA를 추출하고, CycleScript-Reverse Transcriptase (Bioneer)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. Actin 또는 ITGB2 유전자의 프라이머 (표 3)를 사용하고 도 5의 조건으로 real-time PCR (CFX96, Bio-rad)을 진행하여 Actin 대비 각 유전자의 발현량을 상대정량(Relative quantification)으로 비교 및 분석하였다.

Target cDNA	Forward/Reverse	Sequences (5' to 3')
β-Actin	F	GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG
	R	ATGCCACAGGATTCCATACC
ITGB2	F	GAGGTCAGGAGGATTTGGGG
	R	TACAAGTGTTGGGGAGCCAG

그 결과, ITGB2의 mRNA 발현은 M0 및 M1에 비해 M2 대식세포 및 TAM에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (도 6).

3-2. ITGB2 단백질 발현 확인

M0, M1, M2 대식세포 및 TAMs에서 ITGB2의 단백질 발현 수준을 평가하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 구체적으로, M0, M1 및 M2 대식세포로 분화된 각각의 세포에서 Proprep solution (iNtRON)를 이용하여 단백질을 추출하고, 전기영동법으로 멤브레인에 단백질을 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 5% BSA에 담가 블로킹한 뒤, 1 차 항체 (ITGB2)를 24시간 동안 4℃에서 처리하고 2차 항체를 1시간 동안 상온에서 처리한 뒤, D-Plus^TM ECL Pico System (동인LS)을 처리하고 Davinch-Chemi^TM imaging system (Intoxia)으로 단백질 밴드 사진을 촬영하였다.

그 결과, ITGB2의 단백질 발현은 M0 및 M1에 비해 M2 대식세포 및 TAM에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (도 7).

3-3. 면역형광법을 통한 ITGB2 단백질 발현 확인

M0, M1, M2 대식세포 및 TAMs에서 ITGB2의 단백질 발현 수준을 평가하기 위해 면역형광분석을 수행하였다. 구체적으로, M0, M1 및 M2 대식세포로 분화된 각각의 세포를 4% 포르말린으로 고정시킨 뒤, PBS로 세척하고 5% BSA에 담가 블로킹한 뒤, 1 차 항체(ITGB2)를 24시간 동안 4℃에서 처리하고 2차 항체를 2시간 동안 상온에서 처리하여 염색을 수행하였다. 염색된 세포는 DAPI mounting 후 LSM800 (Zeiss)으로 형광 사진을 촬영하였다.

그 결과, ITGB2의 단백질은 M0 및 M1에 비해 M2 대식세포 및 TAM에서 높은 발현 수준을 나타냈다 (도 8).

실시예 4. M2 TAM 표적화 펩타이드와 ITGB2의 상호작용 확인

4-1. M2 대식세포 세포막에서 ITGB2의 발현 확인

ITGB2이 M2 대식세포의 세포막에서 발현되는지 확인하기 위해, M2 대식세포에서 세포막 단백질 및 세포질(cytosol) 단백질을 각각 분리 추출하여 비오틴화된 TAMpep826과 반응시켜 ITGB2의 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. 그 결과, ITGB2 단백질은 M2 대식세포의 세포막에서 발현되는 것으로 나타났다 (도 9).

4-2. TAMpep826 및 ITGB2의 상호작용 확인

M2 대식세포에서 TAMpep826이 ITGB2과 상호작용하는지 확인하기 위해, TAMpep826 및 비오틴화된 TAMpep826의 경쟁적인 반응을 통해 ITGB2의 발현을 평가하였다. 구체적으로, M2 대식세포로 분화된 세포를 스크래퍼로 모아 원심분리 (300 Х g, 5분)로 세포를 세척하고, 세포막 단백질 추출 키트 (Thermo Fisher scientific)를 사용하여 대식세포의 세포막 단백질을 얻었다. TAMpep826 또는 scramble 펩타이드를 농도별 (0.001, 0.01, 0.1, 1 및 10 μg)로 1시간 동안 전처리한 후 단백질에 비오틴이 결합된 TAMpep826 (200 μg)과 상온 (20~24℃)에서 1시간 동안 반응시킨 후 Dynabeads^TM M-280 Streptavidin (Thermo Fisher scientific)을 이용하여 TAMpep826과 결합한 단백질을 얻었다. 단백질을 웨스턴 블롯 분석하여 ITGB2의 발현을 확인하였다.

그 결과, scrambled 펩타이드를 전처리하였을 때 비오틴화된 TAMpep826과 결합된 ITGB2의 발현은 영향이 없는 것으로 나타난 반면, TAMpep826으로 전처리하였을 때는 농도에 따라 ITGB2 발현이 억제되는 것으로 나타났다 (도 10). 이를 통해, TAMpep826이 M2 대식세포의 세포막에서 ITGB2과 상호작용하는 것을 확인할 수 있었다.

4-3. 면역형광법을 이용한 TAMpep826 및 ITGB2의 상호작용 확인

M2 대식세포의 세포막에서 ITGB2 및 TAMpep826이 co-localization하는지 확인하기 위해, FITC가 결합된 TAMpep826을 이용하여 면역형광분석을 수행하였다. 그 결과, TAMpep826과 ITGB2은 M2 대식세포의 세포막에 집중적으로 분포되어 있는 것으로 나타났다 (도 11).

4-4. TB511과 ITGB2의 결합 부위 확인

CD18(ITGB2)의 시스테인(cysteine) rich 부분의 서열을 바탕으로 (uniport_p05107, Cystein-rich tandem repeats region : 449-617), trRosetta 알고리즘(algorithm)을 이용하여 3차 구조(teritiary structure)를 구성하였다 (https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/). 그 후, TB511과 CD18의 도킹 시뮬레이션(Docking simulation)은 trRosetta로 만든 CD18 PDB 파일과 TB511의 아미노산 서열을 가지고, CABS-dock server를 통해 이루어졌다 (http://biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSdock/). 도킹 시뮬레이션 결과 만들어진 10개의 모델 중, TB511 서열의 알라닌 치환 결과를 바탕으로 대표 모델을 선정하였다 (도 12).

그 결과, TB511의 LEU(6)은 CD18의 LEU(528), THR(538), LEU(556), CYS(557) 및 PHE(558) 부위와 결합(bindin)하는 것으로 예측되었으며, TB511의 TRP(12)는 CD18의 GLU(466), ILE(469), CYS(470) 및 ARG(471)과 결합하는 것으로 예측되었다. 또한, TB511의 LEU(6) 및 TRP(12)을 각각 알라닌으로 치환하여 CD18과의 결합을 시뮬레이션하면 두 부위 모두 CD18의 어느 서열과도 결합하지 않는 것으로 나타났다. 따라서 TB511의 LEU(6) 및 TRP(12)은 TB511과 CD18간의 도킹에서 핵심적인 부분이며, TB511은 CD18의 466 내지 565에 결합하는 것으로 예측할 수 있다 (도 13).

실시예 5. ITGB2 결합 모이어티 합성

5-1. ITGB2 결합 PDC(peptide-drug conjugate) 합성

하기 표 4의 Melittin-dKLA 및 TB511 펩타이드들을 GenScript (Piscataway, NJ, USA)에 합성 의뢰하여 공급받았으며, 이후 실험에서 D-PBS에 5 mg/ml로 녹여 사용되었다. dKLA는 펩타이드간 아미드 결합을 통해 연결하였으며, 멜리틴 또는 TAMpep826과 dKLA간의 상호작용 및 폴드를 최소화하기 위해 중간에 4개의 글리신 및 1개의 세린으로 구성된 링커를 배치하여 양단을 구분하였고, KLA는 체내 분해를 최소화 하기 위해 L형이 아닌 D형 이성질체를 사용하였다. 또한, M-DM1을 제작하기 위해, 25 mM 붕산나트륨 완충액 (25mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 녹인 말레이미드(Maleimide)-변형된 멜리틴 (GenScript, Beijing, China) (100 μM, 1 mL, 0.1 mmoL)에 DM1(Mertansine) (MedChem Express, Princeton) (1.1당량, DMF 중 10mM) 및 DMF(Dimethylformamide)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 생성물을 Dulbecco의 인산완충식염수 (DPBS; Welgene)에서 한외 여과로 3회 여과함으로써, 말레이미드(Maleimide)-변형된 멜리틴 M의 N-말단에 DM1을 결합시켜 PDC를 제작하였으며, M-DM1으로 명명하였다. 제작한 M-DM1은 Poroshell 120 C18 column (2.7 μm, 3 × 50 mm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 5 μL, 0.5 mL/min의 속도로 주입하여 특성을 분석하였다.

명칭	서열	서열번호	설명
Melittin	GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ	1	멜리틴 펩타이드
TAMpep826	VLTTGLPALISWIKRKRQQ	2	멜리틴의 첫 7개의 아미노산이 제거된 펩타이드
링커	GGGGS	3
dKLA	d[KLAKLAKKLAKLAK]	4	pro-apoptosis 펩타이드
Melittin-dKLA	GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-GGGGS-d[KLAKLAKKLAKLAK]	5	멜리틴에 링커 및 약물 dKLA가 부착된 펩타이드
TB511	VLTTGLPALISWIKRKRQQ-GGGGS-d[KLAKLAKKLAKLAK]	6	TAMpep826에 링커 및 약물 dKLA가 부착된 펩타이드
M-DM1			말레이미드-변형된 멜리틴에 약물 DM1이 컨쥬게이트된 PDC

5-2. ITGB2 결합 ADC(Antibody-drug conjugate) 합성

5-2-1. 항-CD18 항체 및 DM1의 ADC 제작

대식세포-1 항원(Macrophage-1 antigen, Mac-1) 중 하나인, CD18의 M2 TAM에서의 활성형 구조(Active conformation)에 특이적으로 결합하는 항체 (도 14)를 제작하기 위해, 항-CD18 항체를 분비하는 하이브리도마 (MM18/2.a.8) 세포의 배양액을 모아 2,500rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻은 후 단백질 G-세파로스 컬럼 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. PBS로 미리 평형화시킨 단백질 G-세파로스 컬럼(Pharmacia, 스웨덴)에 항체 용액을 천천히 통과시키고 컬럼을 페리스타틱 펌프(peristatic pump)에 연결하여 PBS로 충분히 세척하였다. 세척 완료 후, 0.2M의 글리신(glycin)-HCl(pH 2.7)으로 항체를 용출하였다. 이때 미리 준비한 1M의 Tris(pH 9.0)를 포함한 튜브에 상기 용출액을 완충시켰다. 이 항체를 PBS에 투석 (dialysis) 한 후 사용하였다. BCA 단백질 분석 키트 (BCA^TM Protein Assay Kit, Pierce)를 이용하여 정제된 항체량을 측정하고, Flow cytometry 분석을 통해 항체의 결합능을 확인하였다. 정제한 항-CD18 항체를 PBS (pH 7.4)로 버퍼 교체하고, 항-CD18 항체 (1 mg/ml, 6.67 μM)에 DMSO에 녹인 SMCC-DM1 (mertansine, 120 μM) (MedChemExpress)을 1: 18의 비율로 섞어 상온에서 4~20 시간 동안 반응시켰다. 미반응한 DM1을 제거하기 위해 10 KDa cutoff centrifugal filter를 이용하여 CD18-DM1을 PBS (pH 7.4)로 버퍼 교체하고, 0.2 μm 시린지 필터로 여과하였다. UV-Vis spectroscopy를 이용하여 항-CD18 항체 (280 nm)에 결합된 DM1 (252 nm)의 양을 측정하여 DM1과 항-CD18 항체의 비율(drug antibody ratio, DAR)을 계산하였고, DAR 값은 5.8로 나타났다. 이렇게 제작된 항-CD18 항체와 DM1이 결합된 ADC를 CD18-DM1으로 명명하였다.

5-2-2. 항-CD18 항체 및 MMAE(Monomethyl auristatin E)의 ADC 제작

상기 실시예에서 정제한 항-CD18 항체를 PBS (pH 7.4)로 버퍼 교체하고, CD18 항체의 이황화 결합 (disulfide bond)을 부분적으로 환원하기 위해서 항-CD18 항체 (1 mg/ml, 6.67 μM)에 1mM DTT (66.7 μM)를 1: 10의 비율로 섞어 37 ℃에서 1~2 시간 동안 반응시키고 PBS (pH 7.4)로 버퍼 교체하였다. 부분적으로 환원된 항-CD18 항체 (1 mg/ml, 6.67 μM)에 10mM Suo-Val-Cit-PAB-MMAE (MedChemExpress)를 1:20 내지 1:40의 비율로 섞어 4 ℃에서 12 시간 동안 반응시키고 PBS (pH 7.4)로 버퍼 교체하였다. UV-Vis spectroscopy를 이용하여 항-CD18 항체 (280 nm)에 결합된 vc-MMAE (248 nm)의 양을 측정하여 vc-MMAE와 항-CD18 항체의 비율(drug antibody ratio, DAR) 을 계산하였고, DAR 값은 2.8 내지 5.4로 나타났다. 이렇게 제작된 항-CD18 항체와 MMAE가 결합된 ADC를 CD18-MMAE로 명명하였다.

실시예 6. ITGB2 결합 PDC의 M2 TAM 결합 확인

ITGB2 및 Melittin-dKLA의 결합력을 확인하기 위해, ITGB2 단백질을 골드 박막 센서칩 위에 코팅한 후 양성 대조군으로 ITGB2 항체 및 Melittin-dKLA를 각각 흘려 반사광을 측정하고, 표면 플라즈몬 공명 (Surface plasmon resonance, SPR) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 센서 칩 표면에 ITGB2을 고정시킨 후 아민 커플링(amine coupling)을 이용하여 하기 표 5의 조건으로 고정화(immobilization)를 수행하였다 (도 15). 그 후, ITGB2이 코팅된 센서칩에 여러 농도의 ITGB2 항체 및 Melittin-dKLA을 흘려 결합(association) 및 해리(dissociation) 구간을 관찰하고 센서그램을 통해 하기 표 6의 분자간 결합 속도상수 분석(kinetic evoluation) 조건으로 분자간 결합 속도상수(kinetic prarmeter)를 계산하였다.

그 결과, 양성 대조군인 ITGB2 항체의 두 분자 사이의 결합력을 평가하는 해리속도상수 (kd; dissociation rate constant)를 결합속도상수 (ka; association rate constant)로 나누어 얻는 평형해리상수 (KD; equilibrium dissociation constant)가 1.14^-8로 나타났고, Melittin-dKLA의 평형해리상수는 7.86^-8로 나타났다 (도 16 및 17). 따라서, Melittin-dKLA이 ITGB2과 결합력을 가지고 있음을 확인하였다.

실시예 7. PDC의 ITGB2을 통한 M2 TAM 세포사멸 효과 확인

7-1. ITGB2의 발현 억제 세포 모델 제작

M2 대식세포에서 ITGB2을 통해 세포사멸을 유도하는지 확인하는데 사용하기 위한 세포 모델로서, Crispr/cas9를 이용하여 M2 대식세포에서 ITGB2의 발현이 억제된 세포 모델을 제작하였다. 구체적으로, M2 대식세포로 분화된 세포를 Opti-MEM 배지에서 배양하였다. Crispr/cas9은 CRISPRMAX^TM Reagent kit (Thermo Fisher scientific)의 Cas9 protein V2 (Thermo Fisher scientific)와 gRNA (Genscript; ITGB2; 표 7)를 Cas9 Plus^TM Reagent (Thermo Fisher scientific)와 함께 섞고, CRISPRMAX^TM Reagent를 Opti-MEM 배지에 희석한 후 모두 섞어 5 - 10분 동안 반응시킨 뒤, M2 대식세포로 분화된 세포에 첨가하여 37℃에서 2-3일간 배양하였다. 그 후, ITGB2의 mRNA 발현 수준을 확인하였다.

sgRNA	Sequences (5' to 3')
ITGB2	mG*mU*mU*rCrArArCrGrUrGrArCrCrUrUrCrCrGrGrCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrA rGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrC rArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrU*mU*mU* mU

그 결과, ITGB2 sgRNA를 주입한 M2 대식세포는 ITGB2의 발현이 대조군에 비해 유의하게 감소되는 것으로 나타났다 (도 18).

7-2. Melittin-dKLA의 ITGB2을 통한 M2 TAM 세포사멸 확인

Melittin-dKLA가 M2 대식세포에서 ITGB2에 결합하여 세포자멸사(apoptosis)를 유도하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 7-1에서 제작한 Crispr/cas9에 의해 ITGB2 발현이 억제된 M2 대식세포에 Melittin-dKLA (1 μM)를 24시간 동안 처리하고, CCK-8 분석 방법을 이용하여 세포 생존율을 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 7-1에서 제작한 ITGB2 낙다운 대식세포에 Melittin-dKLA (1 μM)을 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 배지를 교체하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 생존능을 확인하기 위해 CCK-8 reagent (Enzo Life Sciences)를 배지의 1/10으로 넣고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 흡광도는 microplate leader (Molecular Devices)로 450 nm에서 측정하였다.

그 결과, 대조군 M2 대식세포에서 Melittin-dKLA에 의해 세포 생존율이 현저히 감소하였으나, ITGB2가 낙다운된 M2 대식세포에서는 Melittin-dKLA에 의한 세포 생존율 감소가 억제되는 것으로 나타났다 (도 19). 따라서, 이를 통해, Melittin-dKLA가 M2 대식세포의 ITGB2와 특이적으로 결합함으로써 M2 대식세포의 세포자멸사를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

7-3. TB511의 ITGB2을 통한 M2 TAM 세포사멸 확인

TB511(TAMpep826-dKLA)이 M2 대식세포에서 ITGB2을 통해 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 7-1에서 제작한 Crispr/cas9에 의해 ITGB2 발현이 억제된 M2 대식세포에 TB511을 반응시켰다. 그 결과, M2 대식세포는 TB511에 의해 50% 정도의 세포 생존능을 나타냈으나, ITGB2 발현이 억제된 세포에서는 세포 생존능이 유의하게 증가하는 것을 나타냈다 (도 20).

7-4. ITGB2 항체에 의한 TB511의 세포사멸 유도 감소 확인

TB511이 M2 대식세포에서 ITGB2을 통해 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 7-1에서 제작한 ITGB2 발현이 억제된 M2 대식세포에 항-ITGB2 항체(Polyclonal Rabbit anti-Human ITGB2/CD18 항체) (LS-C312785; LS Bio) (1 μg)을 1시간 동안 전처리한 후 TB511 (1 μM)을 1시간 동안 반응시킨 뒤, 세포사멸 유발 여부를 CCK-8 분석을 이용한 세포생존능 분석으로, 세포사멸 마커인 caspase-3의 단백질 발현을 웨스턴 블롯 분석으로, caspase-3, caspase-8, caspase-9의 유전자 발현을 Real-time PCR로, 및 caspase-3의 단백질 발현 유도를 면역형광법을 통해 확인하였다.

그 결과, M2 대식세포는 ITGB2 항체에 의해서는 세포 생존능에는 영향이 없었으며, TB511에 의해서는 세포 생존능이 유의하게 감소하였다. 반면에 ITGB2 항체를 전처리한 M2 대식세포에서는 TB511에 의한 세포 생존능이 유의하게 증가한 것으로 나타났다 (도 21). 또한, M2 대식세포는 TB511에 의해 caspase-3 발현이 유의하게 증가한 반면, ITGB2 항체를 전처리한 M2 대식세포에서는 TB511에 의한 caspase-3 발현이 유의하게 감소하였다 (도 21). 또한, M2 대식세포는 TB511에 의해 caspase-3, caspase-8 및 caspase-9의 발현이 유의하게 증가한 반면, ITGB2 항체를 전처리한 M2 대식세포에서는 TB511에 의한 caspase-3, caspase-8 및 caspase-9의 발현이 유의하게 감소하였다 (도 21). M2 대식세포는 TB511에 의해 caspase-3 발현이 증가한 반면, ITGB2 항체를 전처리한 M2 대식세포에서는 TB511에 의한 caspase-3 발현이 감소하였다 (도 21). 추가적으로, TB511의 미토콘드리아 표적화를 확인한 결과, ITGB2 항체를 전처리한 M2 대식세포는 ITGB2 전처리하지 않은 세포와 비교해서 미토콘드리아와 TB511의 co-localization이 감소하였다 (도 21).

실시예 8. 3D 암 오가노이드에서 PDC의 효능 확인

8-1. 유방암 3D 오가노이드에서 TB511의 효과 확인

in vitro에서의 한계점을 보완하고 in vivo를 대체하고자 유방암의 암 미세환경(Tumor microenvironment; TME)을 모사한 3D 오가노이드를 제작하고, 이에 대한 TB511의 효과를 확인하였다. 구체적으로, RPMI-1640 배양액에 마트리젤(matrigel)이 3 %가 되도록 혼합하고 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, CAF(Cancer-associated Fibroblast) 및 Incucyte®Nuclight Lentivirus Reagents (Sartorius)를 이용하여 GFP를 발현하도록 제작한 THP-1 세포를 계수하고 5:1:1의 비율로 200 μl가 되도록 96 u-bottom 3-D cultue plate (Sbio)에 분주하였다. 배양 후 1200 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포를 모아준 뒤 37 ℃ 인큐베이터에서 48시간 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성하였다. 스페로이드 형성 2일차부터 TB511을 1 μM, 2 μM, 4 μM 및 8 μM 농도로 3일마다 각각 처리하고, 형광현미경으로 이미지를 촬영하였으며, Bright-field 이미지를 촬영한 뒤 페렛의 직경을 측정방법으로 스페로이드 영역(spheroid area)을 측정하였다. 또한, 평균 종양 회전 타원체 직경은 오픈 소스를 사용하여 스페로이드 당 평균 3개 직경을 측정하여 ImageJ (software version 1.47m)로 사이즈를 분석하였으며, 스페로이드 크기는 Bright-field 이미지를 촬영한 뒤 (20X), 평균 종양 회전 타원체 직경을 스페로이드 당 평균 3개씩 측정하여 ImageJ (software version 1.47m)로 분석하였다. 아울러, 약물처리 10일차에 스페로이드를 고정하여 종양 증식 인자인 ki-67에 대한 항체 (abcam)를 반응시켜 면역형광염색을 수행하였다 (대조 염색: DAPI). THP-1의 경우 별도의 염색을 진행하지 않고 세포내에 발현하는 GFP 형광을 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하고 형광을 발현하는 세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 약물을 처리하지 않은 군은 시간이 지날수록 스페로이드의 크기가 점점 커져, 단핵구(monocyte)인 THP-1 세포가 암세포 및 CAF와 공배양시 암세포 및 TME에 의해서 TAM로 분화되어 종양 성장을 촉진하는 것으로 나타났다. 반면, TB511을 처리한 군에서는 10일차에 1 μM 농도에서부터 농도 의존적으로 스페로이드의 크기가 감소하는 것을 확인하였으며 (도 22), GFP 형광을 발현하는 THP-1 세포의 수가 약물 무처리군에 비해 농도 의존적으로 현저히 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 23). 따라서, ITGB2 결합 PDC인 TB511가 THP-1 세포에 선택적으로 결합하여 MDA-MB-231 인간 유방암의 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다.

8-2. 폐암 3D 오가노이드에서 TB511의 효과 확인

상기 실시예 8-1의 방법으로 A549 인간 폐암 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 폐암 3D 스페로이드를 제작한 뒤, TB511을 1 μM, 2 μM 및 4 μM 농도로 각각 처리하고 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다. 스페로이드 제작시, 암세포 단독 또는 암세포+CAF 세포만을 혼합하여 3D 스페로이드도 제작하여 스페로이드의 크기를 비교하였다.

그 결과, A549 세포 단독 또는 A549+CAF 세포만으로 스페로이드를 형성하였을 때보다 A549+CAF+THP-1 세포로 스페로이드를 형성하였을 때 스페로이드의 크기가 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 또한 TB511을 처리하지 않은 군에 비하여 TB511을 처리한 군에서 스페로이드의 크기가 TB511의 농도 의존적으로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 24). 또한, 약물 처리 후 10일차에 스페로이드를 형광 염색하여 관련 마커를 확인한 결과, TB511을 처리하지 않은 군에 비하여 THP-1 세포의 수가 농도 의존적으로 현저하게 감소하였으며, 종양 증식 인자 ki-67도 농도의존적으로 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 25).

8-3. 폐암 3D 오가노이드에서 M-DM1의 효과 확인

폐암에 대한 M-DM1(Mel-DM1)의 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1의 방법으로 A549 인간 폐암 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 폐암 3D 스페로이드를 제작한 뒤, M-DM1을 1 μM, 2 μM 및 4 μM 농도로 각각 처리하고 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다.

그 결과, M-DM1을 처리하지 않은 군에 비하여 M-DM1을 처리한 군에서 농도 의존적으로 스페로이드의 크기가 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 26).

실시예 9. 항암제 내성 3D 암 오가노이드에서 PDC의 효능 확인

9-1. 항암제 내성 폐암 3D 오가오이드에서 TB511의 효과 확인

카보플라틴(Carboplatin) 내성 폐암에 대한 TB511의 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1의 방법으로 카보플라틴 내성 A549 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 3D-스페로이드를 형성하고 TB511을 1 μM, 2 μM 및 4 μM 농도로 각각 처리한 뒤, 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다.

그 결과, A549 내성 세포 단독 또는 A549+CAF 세포만으로 스페로이드를 형성하였을 때보다 A549+CAF+THP-1 세포로 스페로이드를 형성하였을 때 스페로이드의 크기가 현저히 증가하는 것으로 나타났으며, TB511을 처리하지 않은 군에 비하여 TB511을 처리한 군에서 스페로이드의 크기가 TB511 농도 의존적으로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 27). 또한, 약물 처리 후 10일차에 스페로이드를 면역형광염색하여 관련 마커를 확인한 결과, TB511 무처리군에 비해 TB511을 처리한 군에서 THP-1 세포의 수가 농도 의존적으로 현저하게 감소하였고, 종양 증식 인자 ki-67도 2 μM에서부터 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 28).

9-2. 항암제 내성 전립선암 3D 오가오이드에서 TB511의 효과 확인

도세탁셀(Docetaxel) 내성 전립선암에 대한 TB511의 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1의 방법으로 도세탁셀 내성 PC3 전립선암 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 3D-스페로이드를 형성하고 TB511을 1 μM, 2 μM 또는 4 μM 농도로 각각 처리한 뒤, 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다.

그 결과, PC3 내성 세포 단독 또는 PC3+CAF 세포만으로 스페로이드를 형성하였을 때보다 PC3+CAF+THP-1 세포로 스페로이드를 형성하였을 때 그 크기가 현저하게 증가하였으며, TB511을 처리하지 않은 군에 비하여 TB511을 처리한 군에서 스페로이드의 크기가 TB511 농도 의존적으로 현저하게 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 29). 또한, 약물 처리 후 10일차에 스페로이드를 면역형광염색하여 관련 마커를 확인한 결과, TB511 무처리군에 비해 TB511을 처리한 군에서 THP-1 세포의 수가 농도 의존적으로 현저히 감소하였고, 종양 증식 인자 ki-67도 감소하는 경향을 나타냈다 (^** p < 0.01, ^*** p < 0.001) (도 30).

실시예 10. 3D 암 오가노이드에서 ADC의 효능 확인

10-1. 유방암 3D 오가노이드에서 ADC의 효과 확인

유방암에 대한 ITGB2 결합 ADC(Antibody-drug conjugate)의 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1의 방법으로 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 3D-스페로이드를 형성하고, 본 발명의 ADC인 CD18-DM1 또는 CD18-MMAE을 10 μg 및 20 μg의 농도로 각각 처리한 뒤, 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다.

그 결과, ADC를 처리하지 않은 군은 시간이 지날수록 유방암 스페로이드의 크기가 점점 커졌으나 ADC를 처리한 군에서는 8일차에 스페로이드의 크기가 감소하는 것으로 나타났다 (도 31 및 32). 또한, ADC를 처리하지 않은 군에서 GFP 양성 THP-1 세포가 강하게 증가하였으나 CD18-DM1 또는 CD18-MMAE 처리군에서는 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 31 및 32).

10-2. 폐암 3D 오가노이드에서 ADC의 효과 확인

폐암에 대한 ADC의 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1의 방법으로 A549 인간 폐암 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 3D-스페로이드를 형성하고, 본 발명의 ADC인 CD18-DM1 또는 CD18-MMAE을 10 μg의 농도로 각각 처리한 뒤, 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다.

그 결과, ADC를 처리하지 않은 군은 시간이 지날수록 스페로이드의 크기가 점점 커진 반면, CD18-DM1 또는 CD18-MMAE를 처리한 군에서는 8일차에 스페로이드의 크기가 감소하는 것으로 나타났다 (도 33). 또한, 약물 처리 후 8일차에 스페로이드를 면역형광염색하여 관련 마커를 확인한 결과, ADC를 처리하지 않은 군에서 THP-1 세포가 강하게 증가한 반면, ADC 처리군에서는 현저히 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 34).

실시예 11. 항암제 내성 3D 암 오가노이드에서 ADC의 효능 확인

11-1. 항암제 내성 폐암 3D 오가오이드에서 ADC의 효과 확인

카보플라틴 내성 폐암에 대한 ADC의 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1의 방법으로 카보플라틴 내성 A549 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 3D-스페로이드를 형성하고 CD18-DM1 또는 CD18-MMAE를 각각 10μg 농도로 처리한 뒤, 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다.

그 결과, ADC를 처리하지 않은 군은 시간이 지날수록 스페로이드의 크기가 점점 커진 반면, CD18-DM1 또는 CD18-MMAE를 처리한 군에서는 8일차에 스페로이드의 크기가 감소하는 것으로 나타났다 (도 35). 또한, 약물 처리 후 8일차에 스페로이드를 면역형광염색하여 관련 마커를 확인한 결과, ADC를 처리하지 않은 군에 비해, CD18-DM1 또는 CD18-MMAE를 처리한 군에서 THP-1 세포의 수가 유의성있게 감소하였고 종양 증식 인자 ki-67도 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 36).

11-2. 항암제 내성 전립선암 3D 오가오이드에서 ADC의 효과 확인

도세탁셀 내성 전립선암에 대한 ADC의 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 8-1의 방법으로 도세탁셀 내성 PC3 전립선암 세포, CAF 및 THP-1 세포를 혼합하여 3D-스페로이드를 형성하고 CD18-DM1 또는 CD18-MMAE를 각각 10μg 농도로 처리한 뒤, 그 효과를 상기 실시예 8-1에서와 같이 분석하였다.

그 결과, ADC를 처리하지 않은 군은 시간이 지날수록 스페로이드의 크기가 점점 커진 반면, CD18-DM1 또는 CD18-MMAE를 처리한 군에서는 8일차에 스페로이드의 크기가 감소하는 것으로 나타났다 (도 37). 또한, 약물 처리 후 8일차에 스페로이드를 면역형광염색하여 관련 마커를 확인한 결과, ADC를 처리하지 않은 군에서는 형광이 강하게 증가한 반면, CD18-DM1 또는 CD18-MMAE를 처리한 군에서는 THP-1 세포의 수가 현저하게 감소하였고, 종양 증식 인자 ki-67도 감소하는 것으로 나타났다 (^*** p < 0.001) (도 38).

Claims (32)

1. ITGB2 결합 모이어티; 및 이와 결합된 약물을 포함하는 약물전달체.
2. 제 1항에 있어서, ITGB2 결합 모이어티는 ITGB2와 특이적으로 결합하는 소분자, 바이러스, 항체, 항체 단편, 압타머, 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 리간드, 사이토카인의 일부 영역인 펩타이드 또는 리간드의 일부 영역인 펩타이드인, 약물전달체.
3. 제 1항에 있어서, ITGB2 결합 모이어티는 CD18가 확장된(extended) 활성형 구조(Active conformation)에 특이적으로 결합하는, 약물전달체.
4. 제 1항에 있어서, ITGB2는 서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는, 약물전달체.
5. 제 1항에 있어서, ITGB2 결합 모이어티는 ITGB2의 449 내지 617의 아미노산에 결합하는, 약물전달체.
6. 제 5항에 있어서, ITGB2 결합 모이어티는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는, 약물전달체.
7. 제 5항에 있어서, 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는, 약물전달체.
8. 제 1항에 있어서, ITGB2 결합 모이어티는 ITGB2의 449 내지 617의 아미노산에 결합하는, 약물전달체.
9. 제 1항에 있어서, ITGB2 결합 모이어티는 ITGB2의 732 내지 748의 아미노산, 504 내지 508의 아미노산, 534 내지 546의 아미노산, 449 내지 617의 아미노산, 또는 23 내지 700의 아미노산에 결합하는, 약물전달체.
10. 제 1항에 있어서, ITGB2 결합 모이어티는 항-CD18 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는, 약물전달체.
11. 제 10항에 있어서, 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')₂, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약물전달체.
12. 제 1항에 있어서, 약물은 화합물, RNA, DNA, 항체, 이펙터, 전구약물, 독소, 펩티드 또는 방사선 핵종인, 약물전달체.
13. 제 1항에 있어서, 약물은 면역원성 세포사멸 유도제, 전세포사멸성(pro-apoptotic) 펩타이드, 이크로튜불린(microtubulin) 구조 형성 억제제, 유사분열(meiosis) 억제제, 토포아이소머라아제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터컬레이터(DNA intercalators), 독소(toxin) 또는 항암제인, 약물전달체.
14. 제 13항에 있어서, 전세포사멸성 펩타이드는 KLA, 알파-디펜신-1(alpha-defensin-1), BMAP-28, Brevenin-2R, 부포린 IIb(Buforin IIb), 세크로핀 A-마가이닌 2(cecropin A-Magainin 2, CA-MA-2), 세크로핀 A(Cecropin A), 세크로핀 B(Cecropin B), 크리소피신-1(chrysophsin-1), D-K6L9, 고메신(Gomesin), 락토페리신 B(Lactoferricin B), LLL27, LTX-315, 마가이닌 2(Magainin 2), 마가이닌 II-봄패신 결합체(Magainin II-bombesin conjugate, MG2B), 파르닥신(Pardaxin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 약물전달체.
15. 제 13항에 있어서, 면역원성 세포사멸 유도제는 안트라사이클린계열 항암제, 탁산 계열 항암제, 항-EGFR 항체, BK 채널 작용제, 보르테조밉(Bortezomib), 강심성 배당체(cardiac glycoside), 사이클로포스마이드 계열 항암제, GADD34/PP1 저해제, LV-tSMAC, Measles 바이러스, 블레오마이신(bleomycin), 미토잔트론(mitoxantrone), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 약물전달체.
16. 제 13항에 있어서, 항암제는 SN-38(7-에틸-10-히드록시-캠토테신, 7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 픽산트론(pixantrone), 사바루비신(sabarubicin), 발루비신(valrubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부실(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 이리도테칸(iridotecan), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 벤다무스틴(bendamustine), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 에토포사이드(etoposide), 미토산트론(mitoxantrone), 이자베필론(izabepilone), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1(mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E, MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는, 약물전달체.
17. 제 1항에 있어서, 약물을 M2 종양 관련 대식세포에 특이적으로 전달하는, 약물전달체.
18. 멜리틴, 이의 변이체 또는 이들의 유사체를 포함하는 ITGB2 결합 모이어티; 및 이와 결합된 약물을 포함하는 펩타이드-약물 접합체(peptide-drug conjugate, PDC).
19. 제 18항에 있어서, ITGB2의 466 내지 565의 아미노산과 결합하는, 펩타이드-약물 접합체.
20. 제 18항에 있어서, ITGB2의 LEU(528), THR(538), LEU(556), CYS(557), PHE(558), GLU(466), ILE(469), CYS(470) 또는 ARG(471)과 결합하는, 펩타이드-약물 접합체.
21. ITGB2에 결합하는 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편; 및 이와 결합된 약물을 포함하는 항체-약물 접합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC).
22. 제 21항에 있어서, ITGB2의 732 내지 748의 아미노산을 포함하는 에피토프, 504 내지 508의 아미노산을 포함하는 에피토프, 534 내지 546의 아미노산을 포함하는 에피토프, 449 내지 617의 아미노산을 포함하는 에피토프, 또는 23 내지 700의 아미노산을 포함하는 에피토프에 결합하는, 항체-약물 접합체.
23. 제 21항에 있어서, 항체-약물 접합체 링커를 추가로 포함하는, 항체-약물 접합체.
24. 제 23항에 있어서, ADC 링커는 6-말레이미도카프로일(MC), 말레이미도프로파노일(MP), 발린-시트룰린(val-cit), 알라닌-페닐알라닌(ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐(PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트(SMCC), 발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(val-cit-PAB) 또는 N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트(SIAB)인, 항체-약물 접합체.
25. 제 1항의 약물전달체, 제 18항의 펩타이드-약물 접합체 또는 제 21항의 항체-약물 접합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
26. 제 25항에 있어서, M0 대식세포 및 M1 대식세포에 비하여, M2 대식세포에서 ITGB2의 발현이 상향조절된 환자를 대상으로 투여하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
27. ITGB2(Integrin beta 2)에 후보물질을 처리하는 단계; 및 ITGB2과 결합하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 약물을 M2 종양 관련 대식세포에 특이적으로 전달하는 물질을 스크리닝하는 방법.
28. 제 27항에 있어서, 확장된(extended) 활성형 구조(Active conformation)의 CD18에 특이적으로 결합하는 후보물질을 선별하는, 약물을 M2 종양 관련 대식세포에 특이적으로 전달하는 물질을 스크리닝하는 방법.
29. 분리된 시료에서 ITGB2의 발현양을 확인하는 단계를 포함하는 M2 대식세포를 표적화하는 항암제에 대한 반응성을 갖는 환자를 선별하는 방법.
30. 제 29항에 있어서, M2 대식세포에서 ITGB2의 발현양이 M0 대식세포 및 M1 대식세포에 비해 높은 경우, M2 대식세포를 표적화하는 항암제에 대한 반응성을 갖는 환자로 판별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
31. 제 1항의 약물전달체, 제 18항의 펩타이드-약물 접합체 또는 제 21항의 항체-약물 접합체를 약학적으로 유효한 양으로 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.
32. 암의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한, 약물전달체의 용도.

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