JP2024504411A - β－ラクタマーゼ酵素活性の検出 - Google Patents

Abstract

抗生物質に対して多剤耐性である細菌、より具体的には腸内細菌の中で最も広く分布している、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を産生する腸内細菌を確実に同定するために、効率的で、シンプルな、迅速、かつ輸送可能なツールが不可欠である。本発明は、その使い易さと、そのスピードとを介して、この要件に合致するものである。本発明は、β－ラクタムの無傷な形態のβ－ラクタム環と、その加水分解産物との間で識別能を有する抗体を用いてβ－ラクタム加水分解の酵素活性を検出することに基づく。この抗体は、高価な装置を用いることなく（肉眼で可視できる小さなストリップで）、コロニーからの、または試料中の、ペニシリン型、プラスミド介在性、また過剰産生のＡｍｐＣ酵素、ＥＳＢＬ、またはカルバペネマーゼを産生する細菌の存在を迅速に（１時間未満で）検出することを可能とする、キットおよび方法にて使用され得る。

Description

概要
抗生物質に対して多剤耐性である細菌、より具体的には腸内細菌の中で最も広く分布している、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を産生する腸内細菌を確実に同定するための、効率的で、シンプルな、迅速、かつ輸送可能なツールのあることが不可欠である。本発明は、その使い易さと、そのスピードとを介して、この要件に合致するものである。本発明は、β－ラクタムの無傷な形態のβ－ラクタム環と、その加水分解産物との間で識別能を有する抗体を用いてβ－ラクタム加水分解の酵素活性を検出することに基づく。この抗体は、高価な装置を用いることなく（肉眼で可視できる小さなストリップで）、コロニーからの、またはサンプル中の、ペニシリン型、プラスミド介在性、また過剰産生のＡｍｐＣ酵素、ＥＳＢＬ、またはカルバペネマーゼを産生する細菌の存在を迅速に（１時間未満で）検出することを可能とする、キットおよび方法にて使用され得る。

１９２８年にペニシリンが発見されて以来、その使用は増加し続け、感染病と関連付けられる死亡率は大きく減少している。しかしながら、早くも１９４０年には、ペニシリンに対する最初の耐性が同定されており、特定の細菌に対してその有効性が疑問視された（Maugat, Berger-Carbonne, et Agence nationale de securite sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail（ANSES）, <Consommation d’antibiotiques et resistance aux antibiotiques en France：une infection evitee、c’est un antibiotique preserve! >, 2018）。ヒトおよび動物の健康において新たな抗生物質が多量に繰り返して使用されるため、一般に、この現象はその導入から２、３年して起こり、耐性の増加が経時的に生じる（Iredell, Brown, et Tagg,＜Antibiotic Resistance in Enterobacteriaceae＞, 2016）。実際、抗生物質は、治療対象の感染の原因となる細菌だけでなく、ヒト、動物および環境の様々な微生物叢を構成するすべての細菌に対しても作用する。かくして、すべての細菌は、ある細菌が自然に有する能力に加えて、染色体変異によるか、新たな耐性機構の獲得のよるかのいずれかで抗生物質に対する耐性を進化させる能力を有することとなる（Maugat, Berger-Carbonne, et Agence nationale de securite sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail（ANSES）, <Consommation d’antibiotiques et resistance aux antibiotiques en France：une infection evitee, c’est un antibiotique preserve! >, 2018）。大部分の抗生物質は、天然の微生物産物から直接的または間接的に誘導されるため、かかる耐性の出現および発生は意外なことではない（Iredell, Brown, et Tagg, <Antibiotic Resistance in Enterobacteriaceae>, 2016）。

１９８０年代の初めに、第３世代のセファロスポリン（３ＧＣ）が開発され、腸内細菌と効果的に闘うことが可能となった。しかしながら、早くも１９８３年には、既に知られている狭域スペクトルペニシリナーゼおよびセファロスポリナーゼ以外の、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ細菌（以下、「ＥＳＢＬ」細菌という）の出現と共に、耐性に関する最初のケースがヨーロッパで観察された。β－ラクタマーゼはβ－ラクタム環のアミド結合を開環させ、抗生剤を無効とし、細菌をその有害な作用に対して耐性のあるようにする。ＥＳＢＬの産生菌は、ペニシリン、ならびに様々な種類のセファロスポリン（１ＧＣ、２ＧＣ、３ＧＣ、４ＧＣ、５ＧＣ）などのβ－ラクタムにあるβ－ラクタム環を加水分解する能力を有する。それらは、主に、グラム陰性菌によって、より詳しくは、抗生物質耐性の主たる原因である腸内細菌にて発現される（Bonomo, ＜β-Lactamases＞, 2017）。１９９０年代には、新たなＣＴＸ－Ｍ型ＢＳＢＬが出現し、速やかに腸内細菌の臨床分離株の中で最も広く普及しているβ－ラクタマーゼとなった。現在のところ、それらは主にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）およびクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）にて存在する（Cattoir,＜Les nouvelles β-lactamases a spectre etendu（BLSE）＞, 2008）。

これらのＥＳＢＬ産生菌は真の公衆衛生問題を構成する。より具体的には、これらの細菌はますます頻繁に単離され、重度の感染用に、最終手腕の抗生物質（カルバペネム）に基づく治療を必要とし、それがカルバペネマーゼによるカルバペネムに対する耐性の出現をもたらす（Perezら、＜The Continuing Challenge of ESBLs＞）。抗生物質耐性がこのように進展することで、治療が手詰まりとなる件数が増え、かくして感染症を引き起こし、何もしなければ、２０５０年以降の死亡の主な原因の１つとなる。

ＢＳＢＬにはこれらの分子を加水分解する能力がないため、重篤なＥＳＢＬ産生腸内細菌感染の最近での治療はカルバペネムに、または特定の新規なβ－ラクタマーゼ阻害剤（アビバクタム、リレバクタム、バボルバクタム）に依存する。しかし、これらの抗生物質は、それらに耐性のある菌株の出現を制限するために、最終手段として使用される。セファロスポリンに基づく抗生物質治療が第１の応答として処方されることが多いが、感染菌がＥＳＢＬを産生する場合には、それは効果的でないことが証明されている。かくして、最適な治療および高い治療成功率を得るためには、抗生物質療法を、その耐性記録に応じて、各型の感染菌に調整し、このことをできるだけ早く行う必要がある（Maugat, Berger-Carbonne, et Agence nationale de securite sanitaire de l’alimentation、de l’environnement et du travail（ANSES）,＜Consommation d’antibiotiques et resistance aux antibiotiques en France：une infection evitee, c’est un antibiotique preserve!＞）。

このためには、抗生物質耐性菌を、特に３ＧＣを加水分解し、最終手段の抗生物質治療を必要とする細菌を確実に同定するための、強力で、シンプルな、迅速かつ輸送可能な装置を有することが不可欠である。

β－ラクタマーゼ活性を有し、かくしてβ－ラクタムに抵抗する能力を有する細菌を検出かつ同定するための、様々な遺伝子型および表現型の方法が過去数年にわたって開発されてきた。これらの方法には、各々、異なる要求および目的に応答する多数の試験が含まれる。すべての状況に理想的である単一の試験は存在せず、そのことによってこれらの診断試験を開発するための動機付けが説明される（Aquirre-Quinonero et Martinez-Martinez, 2017）。

特に、次の方法が特許文献にて記載される：
－ ＷＯ ２００８／１１４００１
この国際特許出願は、グラム陽性菌を死滅させるための抗生物質、抗真菌化合物、非ＥＳＢＬグラム陰性菌を死滅させる抗生物質、および着色インジケーターを含有する培地からなる、ＥＳＢＬ細菌を検出するためのキットを記載する。ＥＳＢＬ細菌の存在は、試験される試料を該支持体上に３６～３７℃で１８～２４時間にわたって置き、ＥＳＢＬ細菌の増殖とリンクした培地を酸性化することでｐＨインジケーターの色相の変化を測定することによって検出される。この測色方法は、使用が簡単であるが、色相変化の解釈が主観的である。その上、この色相変化は、細菌が増殖することによって緩衝化された培地の酸性化によって誘導される。この理由から、目的とする細菌の存在を明らかにするには、相対的に多くのインキュベーション時間（１６～２４時間）を必要とする。

－ ＷＯ ２０１１／１５４５１７
この国際特許出願に記載される方法は、細菌懸濁液を適切な基質（β－ラクタム抗生物質またはβ－ラクタムのカスタマイズされた誘導体）と数時間にわたって接触させて置き、ついで細菌がβ－ラクタマーゼを含有するならば、質量分析器（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）を用い、抗生物質の加水分解産物に相当するピークの出現を測定することを必要とする。活性β－ラクタマーゼの存在下では、基質の分子量は変化する；加水分解産物のピークが現れ、その一方で無傷の基質のピークが減少する。この方法には、装置が高価であること、労働者が資格を必要とすること、（予測されるピークおよび正確な質量を決定するために）質量スペクトルを自動解釈するソフトウェアを欠くこと、その分野において適用性がないこと、およびプロトコルの標準化が時に曖昧であること（インキュベーション時間、使用される基質、質量分析器の校正、細菌溶解条件が様々である等）などの欠点がある。

－ ＷＯ ２０１１／１０７７０３
この出願に記載の検出方法は、ＥＳＢＬ細菌の存在を検出可能とするβ－ラクタマーゼの発色または蛍光基質を用いることに依存する。それを実行するためには、ａ）所望により、微生物の培養工程の後でもよいが、生物学的試料中に存在する微生物を濃縮すること；ｂ）工程ａ）にて濃縮された微生物を、検出対象のβ－ラクタマーゼ酵素によって加水分解された後に発色団または蛍光団を放出し得る、β－ラクタマーゼの少なくとも１の発色または蛍光基質を含む溶液に懸濁させること；ｃ）工程ｂ）にて得られた発色団または蛍光団の放出の可能性を検出すること（ここで発色団または蛍光団の放出を検出することがβ－ラクタマーゼ、従ってＥＳＢＬ細菌の存在を指示する）を必要とする。基質を加水分解することで、培地にて着色、または蛍光シグナルの出現が惹起される。しかしながら、酵素活性が低い酵素の場合、インキュベーション時間は相対的に長くなることがある。さらには、あまり顕著でない着色では、解釈が困難な場合があり、蛍光基質用の読み取り装置が必要とされる。さらには、これらの基質は光に対して敏感であることがあり、その試験を野外で適用させなければならない場合に問題となる。

－ ＷＯ ２０１３／７２４９４
この出願にて記載される方法は、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ（セファロスポリンを加水分解する広域スペクトルβ－ラクタマーゼ）を産生する細菌を検出することを目的とする。この方法は、以下の工程：ａ）試料の細胞溶解を行う工程；ｂ）工程ａ）にて得られた懸濁液のフラクションを、ｉ）セファロスポリン、アズトレオナムおよびセファマイシンからなる群より選択される広域スペクトルβ－ラクタマーゼの基質、およびｉｉ）溶液のｐＨが６.４と８.４との間にある場合に色相が変化するｐＨインジケーターを含む試薬キットと反応させる工程を含む。ｐＨのこの変化は培地中に存在するセファロスポリンの加水分解によって誘発され、カルボン酸官能基を出現させる。工程ｂ）での色相の変化は、試料中の広域スペクトルβ－ラクタマーゼ産生菌が存在することを示す。この比色分析法（calorimetry）は、使用が簡単であるが、ＷＯ２００８／１１４００１と同様に、色の変更の解釈は主観的である。その上、この色相変化は、細菌の成長によって緩衝化された培地の酸性化によって誘発される。このため、目的の細菌の存在を明らかにするには、相対的に長いインキュベーション時間（１６～２４時間）が必要とされる。

－ ＷＯ ２０１６／１５６６０５
この電気化学的方法は、装置を用いて可視化できる、その電気化学特性を通してＥＳＢＬ細菌の存在を測定し得る。この技法は使用コストが高い（装置が高価であり、資格のある人を必要とする）。

－ ＵＳ２０１８／１５６７９６
この米国特許出願は、試料中にてβ－ラクタム環を有する抗生物質に対して耐性のある細菌の存在を検出する方法であって、該試料を、加水分解型β－ラクタム環を含有する分子を特異的に認識する抗体と接触して置くことによる、方法を記載する。加水分解型抗生物質が、支持体上に、例えば、ストリップ上に固定される。これらの方法では、加水分解型抗生物質の特異標識された抗体を、試料中で細菌と接触させて置き、ついでその混合物をその加水分解型抗生物質が固定されているストリップ上に付着させる。試料が抗生物質耐性菌を含有する場合（「陽性」結果）、その時には、標識された抗体は試料中に大量に存在する加水分解型抗生物質で飽和しており、従ってその標識抗体はストリップの固定された抗生物質とは結合せず：それでストリップの試験ゾーンには何のシグナルもない。反対のケースでは、すなわち、試料が非ＥＳＢＬ細菌を含有する場合（「陰性」結果）、その時には、試料中に導入された抗体はフリーなままで、ストリップ上に固定された加水分解型抗生物質と結合し、そのシグナルは試験ゾーン上で強くなる。検出しようとする酵素反応の産物（すなわち、抗生物質の加水分解された形態）の出現を検出すると、試料中の活性酵素の存在がこのようにシグナルの減少によって明らかとなる。

検出手段を選択する時には、コスト、結果を得るのに必要な時間、試験パフォーマンス、および試験で集められる情報などの数種類の要素を考慮しなければならない。感染した、またはコロニー形成の患者を同定することによって、感染した患者の治療を出来る限り最適な方法で、出来るだけ早く調整し、耐性菌株の蔓延を最大限に制限するために、抗生物質耐性の同定は出来る限り迅速かつ正確でなければならない。従って、これらの試験は、医療専門家にとって、地方および国家レベルで細菌感染の予防に関与している人々にとって極めて重要である（Lecour, ＜Detection des carbapenemases chez les enterobacteries＞；Lutgring et Limbago, ＜The Problem of Carbapenemase-Producing-Carbapenem-Resistant-Enterobacteriaceae Detection＞, 2016）。

本発明は、その使い易さと、そのスピードとを通してこの要件を満たすものである。本発明は、抗生物質のβ－ラクタム環の無傷な形態を特異的に認識する抗体を用い、酵素によるβ－ラクタム加水分解活性を検出することに基づく。次にこの抗体を、極めて迅速に（１時間未満で）、高価な装置を用いることなく（肉眼で読み取り可能なストリップで）、結果を得るための、免疫クロマトグラフィー用キットおよび試験に用いる。かかる抗体の使用は、試料中の活性酵素またはＥＳＢＬ細菌の存在（「陽性」結果）をシグナルの出現とリンクさせることを可能とし、先行技術の分野にある多くの文献によって提案されているように、そうではないとすることはできない。実際、（無傷のβ－ラクタム環を認識する）本発明の抗体を介して、基質（試料中に導入されている無傷の抗生物質）の消失は、（シグナルの減少を観察するよりも容易である）シグナルの出現を測定することによって、高い信頼性で、特異的であって、再現可能な方法にて測定することが可能である。

この理由から、本発明の試験は極めて信頼性が高い：多くの試験される細菌において、セファロスポリナーゼ活性（セフォタキシム加水分解の酵素活性）の検出に関して、４０分間で１００％の感度と、１００％の特異性が得られた（以下の実施例を参照のこと）。

本発明の目的である、検出用キットおよび方法は：
－ β－ラクタムの加水分解能を有する細菌の検出を容易とすることができ（シグナルの着色は陽性と同義である）、
－ 所望により、検出された細菌によって、如何なる型の酵素が発現されるかを同定してもよく、
－ β－ラクタムの加水分解能を有する細菌を検出するのに要する時間を短縮することができ（現在にて結果を得るのに必要とされる４０分を越えることはない）、
－ 既知であるか、未知であるかを問わず、β－ラクタマーゼを産生する全ての細菌を検出することができ（新たな変異が出現した場合であっても結論を出すことは可能である）、
－ 迅速性、コスト、容易性および感度の点で多くの利点を有する、免疫クロマトグラフィーを使用することができる。

本発明は、β－ラクタムの加水分解を検出するための、したがって試料中のβ－ラクタマーゼ産生菌の存在を明らかにするための、新規な手段に関する。これらの新規な手段は、無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質（その加水分解産物ではない）を認識するために、本発明者らによって特別に開発された抗体を用いることに基づく。この抗体は、有利には、下記にて説明される検出キットおよび検出方法にて使用され得る。非常に利点があることに、これらのキットはストリップ（本発明の態様それ自体でもある）を含有しており、その上に本発明の抗体が付着され、乾燥させてある。

本発明の状況下にあって、モノクローナル抗体は、無傷な形態のβ－ラクタム型抗生物質（すなわち、β－ラクタム核を含む）を特異的に認識するように産生かつ選択される（実施例１および２を参照のこと）。この目的を達成するために、免疫原（無傷のβ－ラクタム環を含有する）および選択試験が設計され、実施された。下記に示される本願の実施例１および２では、これらの免疫原がどのように設計され、そして産生されたかを、ついで識別性の高い抗体がどのように選択され得るかを説明する。これらの実施例で使用された抗生物質は、第三世代セファロスポリンである、セフォタキシム（実施例１）、および「カルバペネマーゼ」と称される特定のＥＳＢＬ酵素によって加水分解される新規な世代の抗生物質である、メロペネム（実施例２）である。

下記の実施例にて詳細に説明されるように、これらのモノクローナル抗体は、次の工程：
Ａ）無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質を、β－ラクタム核から離れている大きな免疫原性分子（ＢＳＡまたはヘモシアニン型）とカップリングさせる工程；このカップリングは、抗生物質を塩化アセチル活性化に付し、次にチオール官能基を大きな分子にグラフトさせ、ついで２つの活性化分子を接触して置くことにより実施された（このカップリング工程はまた、当業者に公知の様々な従来の化学的手段によっても実施され得る）。

Ｂ）マウスにその大きな免疫原性分子とカップリングさせた十分な量（例えば、５０μｇ）の無傷の抗生物質を注射することにより該動物を免疫化する工程；

Ｃ）免疫化された動物によって産生された抗体をサンプリングし、無傷のβ－ラクタム環を認識する抗体を同定する工程（図１に示される試験を参照のこと）；

Ｄ）（ネズミ骨髄細胞と融合させた免疫化マウスの脾臓細胞から）選択された抗体を産生するハイブリドーマを産生する工程；

Ｅ）ウェルにて産生された各ハイブリドーマを単離し、産生されたモノクローナル抗体がβ－ラクタム環が無傷である抗生物質を認識することを確認する工程（図１の試験、および図９の試験１を参照のこと）；

Ｆ）β－ラクタム環が加水分解されている抗生物質を全く認識しない抗体を産生するハイブリドーマを同定して選択する工程（図２および図９の試験２の陰性抗体）；

Ｇ）無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質（図２および図９の試験３および４）に関して、種々の濃度の無傷および加水分解型抗生物質を用いて、各選択された抗体の特異性を決定する工程；
を推し進めることで得られた。

このプロトコルを用いることにより、本発明者らは、無傷な形態のβ－ラクタム環に対して極めて強い親和性を有する、異なる識別抗体を産生する、多くのハイブリドーマを作製した（図２および図９の試験３において阻害剤の存在下でシグナルは弱くなり、図２および図９の試験４において阻害剤の存在下でシグナルは減少しなかった）。これらの抗体は無傷な形態の抗生物質に対して極めて特異的である（加水分解の形態では交差反応は観察されなかった；図３を参照のこと）。

本発明に係る他の識別抗体は、もう一つ別の抗生物質から開始して、これらの工程を再現することにより生成され得る。

発明の抗体
第１の態様において、本発明は、かくして、無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質の分子を特異的に認識するモノクローナル抗体に関するものであり、この抗体は、加水分解されている場合、すなわち、そのβ－ラクタム環が、例えば、β－ラクタマーゼによって加水分解されている場合には、同じ抗生物質の分子を認識しない。従って、本発明の抗体は、β－ラクタム環が無傷である抗生物質に対して独特な結合能を有する。従って、該抗体が無傷な形態の抗生物質と接触して置かれた場合には複合体を形成するであろうが、その加水分解された形態の存在下ではフリーなままであろうから、２つの形態の抗生物質を識別することができる。そこで、抗生物質が無傷であるか、加水分解された形態であるかどうかを知るためには、これらの複合体の存在を検出すれば十分である。このことが、本発明のモノクローナル抗体が、下記にて、本発明に係る「識別抗体」と称される、理由である。

本発明の意義の範囲内で、「無傷の」なる語は「非加水分解型」と同義である。かくして、「無傷の」β－ラクタム環は、β－ラクタマーゼによる加水分解を受けていないため、閉じた状態のβ－ラクタム環である。拡大解釈すれば、「無傷の」または「非加水分解型」抗生物質は、β－ラクタム環が閉じられており、従って機能的である（さらに具体的には、この環が抗生物質の抗微生物作用を提供する）抗生物質である。他方で、「加水分解型」なる語は、β－ラクタム環がβ－ラクタマーゼによって自然に（天然試料にて）または人工的に（例えば、合成酵素によって）加水分解されているために、該β－ラクタム環が開いている、抗生物質を示す。「加水分解型」抗生物質は、一般に、非機能的である、すなわち、抗微生物作用がほとんど、または全くない。

本明細書にて使用される場合、「モノクローナル抗体」なる語は、抗体の均一な集団から由来の抗体をいう。さらに言えば、モノクローナル抗体の集団の個々の抗体は同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は単細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた宿主真核生物細胞、該抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた宿主原核細胞等）の増殖に由来する抗体の均一な集団で構成される。それは、一般に、重鎖と軽鎖で特徴付けられる。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原に対して作用する。「抗原」は、抗体がエピトープと称される領域に選択的に結合し得る、所定の分子である。本発明の状況下にあって、標的となるエピトープには抗生物質のβ－ラクタム環が含まれる。

本明細書にて、「特異的に認識する」なる語は、本発明のモノクローナル抗体が無傷の標的となる抗生物質に対して非常に高い親和性を有し、例えばβ－ラクタマーゼによって加水分解されている抗生物質に対して極めて低い親和性を有することを意味する。好ましくは、標的となる抗生物質に対するその解離定数Ｋ_ｄは約１０ｎＭと約１ｐＭとの間にある。より好ましくは、該Ｋ_ｄは約１０ｐＭと約４０ｐＭとの間にある。「Ｋ_ｄ」なる語は所定の抗体－抗原の複合体の解離定数をいう。Ｋ_ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎであり、ここでｋ_ｏｆｆは抗体－抗原の複合体の抗体の解離についての「オフ速度」定数からなり、ｋ_ｏｎは抗体が抗原と結合するレベルを表す（Chen Y.ら、1999, J.Mol.Biol., 293：865-881）。Ｋ_ｄの逆数に相当する、その結合定数Ｋ_ａを測定することによって、本発明の抗体とその標的との親和性を測定することも可能である。本発明の抗体の標的となる抗生物質（無傷のβ－ラクタム環を有する）との結合定数Ｋ_ａは、好ましくは、約１０^９Ｍ^－１より大きく、より好ましくは、１０^１１Ｍ^－１より大きく、さらにより好ましくは、１０^１２Ｍ^－１より大きい。

標的に対して親和性の低い抗体は、一般に、この標的とゆっくりと結合し、容易に解離する傾向にあり、その一方で標的に対して高い親和性を有する抗体は、一般に、標的と迅速に結合し、長期間にわたって標的と結合したままとなる傾向にある。結合親和性を測定するのに種々の方法が知られており（例えば、平衡透析による、蛍光による、あるいはまたBiacore分析による）、そのいずれも本発明の目的に使用され得る。例えば、図２および９に示される試験を用いることも可能である。

本発明はまた、機能的である（すなわち、β－ラクタム環が無傷である場合には抗生物質の分子を特異的に認識するが、加水分解されている場合にはそうでない）、モノクローナル抗体のそれらのフラグメントを標的とする。このフラグメントは、例えば、フラグメントＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃおよび二重特異性抗体から選択され得る。

本発明のモノクローナル抗体は、細胞株の培養によって抗体分子の産生を可能とするいずれか既知の技法を用いる従来の手段によって産生かつ単離され得る。モノクローナル抗体を産生する技法には、ハイブリドーマ技法、ヒトＢ－細胞ハイブリドーマ技法およびＥＢＶ－ハイブリドーマ技法が含まれるが、これらに限定されない。

本願の実施例は、本発明に係る抗体をどのようにして得るか、具体的には標的となる抗生物質としてのセフォタキシムまたはメロペネムをどのように認識するかを説明する。他の標的となる抗生物質も使用され得る。

本発明の意義の範囲内で、「標的となる抗生物質」なる語は、その化学式中にβ－ラクタム環を含むことが知られている、いずれの抗生物質をも指す。別に「ベータ－ラクタム抗生物質」または「β－ラクタム抗生物質」としても知られており、ペニシリン系、セファロスポリン系、モノバクタム系、およびカルバペネム系より選択され、それらはすべてその分子構造にβ－ラクタム核を含有する。

標的となる抗生物質は、特に、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、メチシリン、ジクロキサシリン、フクロキサシリン、アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アズロシリン、およびカルベニシリンから選択されるペニシリンであり得る。

標的となる抗生物質は、特に、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロール、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフトリアキソン、セフィキシン、セフォタキシム、セフタジジム、セフェピム、セフピロム、セフタロリンおよびセフトビプロールから選択されるセファロスポリンであり得る。

標的となる抗生物質は、特に、チエナマイシン、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ビアペネム、テビペネムおよびドリペネムから選択されるカルバペネムであり得る。これら新世代の抗生物質はどのようなＥＳＢＬによっても加水分解されないが、「カルバペネマーゼ」と称される特定のＥＳＢＬ酵素によってのみ加水分解される。抗生物質をその無傷な形態と、その加水分解された形態との間で識別して生成し、試料中でカルバペネマーゼ酵素の存在を検出できるようにするために、この型の分子で動物を免疫処理することが有利であり得る。

標的となる抗生物質は、特に、アズトレオナムなどのモノバクタムであり得る。
標的となる抗生物質は、特に、セフメタゾールおよびラタモキセフから選択されるセファマイシンであり得る。

好ましい実施態様において、本発明の識別抗体は、それが、β－ラクタム環が無傷である、ペニシリン、セファロスポリン、モノバクタム、カルバペネム、およびセファマイシンから選択される抗生物質の分子を特異的に認識する点で特徴付けられる。

さらに好ましい実施態様において、本発明の抗体は、それが、β－ラクタム環が無傷である、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、メチシリン、ジクロキサシリン、フクロキサシリン、アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アズロシリン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロール、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフトリアキソン、セフィキシン、セフォタキシム、セフタジジム、セフェピム、セフピロム、セフタロリン、セフトビプロール、チエナマイシン、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ビアペネム、テビペネム、ドリペネム、アズトレオナム、セフメタゾールおよびラタモキセフからなる群より選択される抗生物質の分子を特異的に認識する点で特徴付けられる。

もう一つ別のさらに好ましい実施態様において、本発明の抗体は、それが、チエナマイシン、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、およびドリペネムからなる群より選択される抗生物質の分子を特異的に認識する点で特徴付けられる。

対照的に、該抗体は、β－ラクタム環が、例えば、β－ラクタマーゼ酵素の作用によって加水分解されている場合に、これらの抗生物質の分子を認識しない（またはその抗生物質との親和性が乏しい）。

本発明の状況下にあって、「β－ラクタマーゼ」なる語は、以下の酵素：ペニシリナーゼ（例えば、ＴＥＭ－１、ＳＨＶ－１...）、セファロスポリナーゼ（例えば、ＡｍｐＣ）、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ（例えば、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ－Ｍの誘導体...）ならびにカルバペネマーゼをいう。

本明細書にて、「広域スペクトルβ－ラクタマーゼ酵素」または「ＥＳＢＬ」は、そのスペクトルを第３世代のセファロスポリンに関して拡大したペニシリナーゼのスペクトルを有し、クラブラン酸による阻害を維持している酵素を意味する。

「広域スペクトルβ－ラクタマーゼ」（または「ＥＳＢＬ」）は、１９８０年代にフランスで、ついでドイツにて発見された、大型で非常に不均一な一連の細菌酵素である。該酵素は（頻繁には）プラスミドで、またはＳＨＶ β－ラクタマーゼをコードするクレブシエラ属にて天然ゲノムが変異するかのいずれかで誘発される。その２つの機構は、感染した細菌に多種多様なペニシリン系およびセファロスポリン系を加水分解する能力を付与する。ＥＳＢＬの大部分は、天然のβ－ラクタマーゼ、特にＴＥＭ－１、ＴＥＭ－２およびＳＨＶ－１の遺伝的変位の結果である。それらはペニシリン系に対して活性が非常に高く、第一世代のセファロスポリン系に対する活性は中程度である。ＥＳＢＬの起点での遺伝的変異は、これら酵素のスペクトルを拡張し、第三世代のセファロスポリン系（セフタジジムおよびセフォタキシム）およびモノバクタム系（アズトレオナム）にも影響を及ぼす。

下記の実施例は、本発明に係る抗体の存在を、無傷であるか、関連する抗生物質を加水分解する酵素（ここではクレブシエラ・ニューモニエのＣＴＸＭ－２酵素またはカルバペネマーゼ）を用いて加水分解されている、抗生物質の分子（ここではセフォタキシムまたはメロペネム）を用いることで、どのように同定するかを説明する。

本発明に係る抗体の加水分解されている形態の抗生物質に対する親和性は極めて低い。例えば、その加水分解Ｋ_ｄが無傷の抗生物質についての定数よりもずっと大きい（例えば、１００倍大きい）か、その結合定数Ｋ_ａが無傷の抗生物質にについての定数よりもずっと小さい（例えば、１００倍小さい）かのいずれかのようなものである。

本願の実施例は、無傷の標的となる抗生物質である、セフォタキシムまたはメロペネムを特異的に認識する抗体をどのように得るかを説明する。これらの抗体は、セフォタキシム／メロペネムがβ－ラクタマーゼ酵素で加水分解されている時には、それを認識しない。図２および図９に示される試験によって、本発明の方法にてＥＳＢＬ細菌を検出するのに用いることのできる適切な抗体を選択することが可能となる。

下記に示される特定の実施態様において、本発明の抗体が検出可能な形態にて利用可能であることは有利であり得る。このことが、本発明の抗体が、検出可能な程度にラベル化されていること、例えば、該抗体がフルオロクロム、放射性イオン、造影剤、金属イオンと、発色団、酵素、あるいは肉眼で見ることができるか、または画像処理により検出可能である、他の任意のマーカーと連結していることが好ましい理由である。

３ＧＣを加水分解するβ－ラクタマーゼを検出するための本発明の抗体の使用
本発明は、任意の試料中の、β－ラクタマーゼ酵素の酵素活性を、従ってβ－ラクタマーゼ活性を有する細菌（別途、「β－ラクタム耐性抗生物質」として知られる）の存在を迅速かつ非常に高い信頼性で検出するための試験における、本発明に係る識別抗体（上記される抗体）の使用に関する。より正確には、本発明の抗体は、試料中にある、広域スペクトルβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）活性を有する細菌の存在を迅速かつ高い信頼性で検出するのに使用され得る。抗体をかかる細菌の存在を検出するために使用することは、これまで当該分野にて提案されたことがない。

第２の態様において、本発明は、従って、試料中にある機能的な、好ましくは広域スペクトルのβ－ラクタマーゼ酵素の存在を検出するための、上記される本発明の識別抗体の使用を対象とする。

本発明の状況下にあって、「試料」なる語は、上記のようなβ－ラクタマーゼ酵素を、またはかかる酵素を発現する細菌を含有することが可能であり、該酵素が機能的な能力を有する、任意の固体または液体の生物学的または環境的フラクションを意味する。例えば、それは環境試料を、あるいはまたヒト、動物または植物の生物学的流体を包含してもよい。
本発明の方法にて使用される試料は細菌を含有することが好ましい。

本明細書にて使用される場合、「生物学的流体」なる語は、個々のヒト、動物、または植物から得られ、流動性または粘性のある、いずれの試料をもいう。例えば、尿、脳脊髄液、胸水、滑液、腹膜液、羊水、胃液、血液、血清、血漿、リンパ液、間質液、唾液、生理分泌物、涙、粘液、汗、乳汁、精子、精液、膣分泌液、潰瘍および他の表面発疹からの流体、水泡、糞便または膿腫などのヒトまたは動物によって生成される生物学的液体であってもよい。あるいはまた、樹液、流出水、または露などの植物によって生成される（または植物と接触している）流体とすることもできる。
実施態様において、該試料は、それが何であっても、細菌を含有することが好ましい。

本発明の抗体は、それが試料と接触して置かれた時に、無傷の抗生物質の量の減少を明確に検出することを可能とする任意の免疫学的試験にて使用され得る。この減少は試料中に存在するβ－ラクタマーゼ酵素の作用によるものであり、かくして本発明の抗体はその存在を明らかにすることができるであろう。

本発明の抗体は、競合による生物学的試験にて、すなわち、β－ラクタマーゼの存在が検出可能なシグナルの出現（減少ではない）によって明らかとされるであろう試験にて使用されるのが好ましい。このような競合による試験では、本発明の抗体は、標識化されるか、または固定化されるかのいずれかであり、その抗体が、自体が標識化されるか、または固定化されるであろう、特異的に認識する無傷の環を有する、抗生物質と接触して置かれるであろう。好ましい実施態様において、該試験は、標識された（移動可能であるが）本発明の抗体、および固定された無傷の抗生物質を含む。もう一つ別の好ましい実施態様において、該試験は、本発明の固定された抗体と、未標識および標識の（移動可能であるが）無傷の抗生物質とを含む。もう一つ別の実施態様において、該試験は完全に液相にて実施され、種々の検出可能なマーカーによって標識されるであろう本発明の抗体と、関連の抗生物質とを使用することを含む。使用される蛍光団が異なるならば、ＦＲＥＴ技法を用いて抗体／抗生物質の共同位置を測定することが可能であろう。

例えば、以下の条件下：
－ （ビオチンで、または他の任意のマーカーで）標識された無傷の抗生物質の存在下において、ウェル中に、または支持体に固定された本発明の抗体と接触して置く前に、試料を無傷の抗生物質の存在下にてインキュベートする場合；
－ 標識された無傷の抗生物質と接触して置く前に、本発明の抗体を、試料と接触して置かれたことがないか、抗生物質を加水分解する酵素を含有しない試料と接触して置かれたことがある、無傷の抗生物質と接触して置いた場合（シグナルはその場合に最小である）；
－ あるいはまた、標識された無傷の抗生物質と接触して置く前に、本発明の抗体を精製されたβ－ラクタマーゼと共にインキュベートした後に、該抗体を無傷の抗生物質と接触して置いた場合（シグナルはその場合に最大である）
にて得られるシグナルを比較することにより、β－ラクタマーゼの活性化の存在を検出することが可能である。

もちろん、このような実験を行うためには、使用する抗生物質（無傷な形態である）は、本発明の抗体によって特異的に認識されることが必要である。

特定の好ましい実施態様において、どの型の酵素が本発明に記載の抗体および方法を用いて検出されるＥＳＢＬに関与するかを特徴付けるために、特定のＣＴＸ－Ｍ酵素またはカルバペネマーゼを検出し得る抗体を使用することも有用であり得る。この活性の検出と、関与する酵素の同定とを、所定の試験を行う間に同時に実施することが可能であろう。

発明の方法およびキット
特定の態様において、本発明は、本発明に係る抗体、および該抗体が特異的に認識する抗生物質を用いて、機能的なβ－ラクタマーゼ酵素を産生する細菌を検出する方法に関する。

上記されるように、無傷の形態であり、所望により標識されてもよい、β－ラクタム環を有する抗生物質が、その抗生物質を特異的に検出するために所望により標識されてもよい抗体と一緒に利用可能である場合（というのも、該抗生物質は免疫原性剤として用いられ、上記されるように産生されるからである）、該方法は、有利には、次の工程：
ａ）試験される試料を該無傷の抗生物質と接触して置く工程、
ｂ）該抗体を該試料に加える工程、
ｃ）該抗体が該無傷の抗生物質と複合体を形成するかどうかを検出する工程
をこの順序で含み得る。

次に、得られたシグナルを、抗体および無傷の抗生物質が試料と接触して置かれなかった場合（それらが抗生物質を加水分解する酵素を含有しない試料と接触して置かれた場合）に、あるいは抗体と接触して置かれる前に、無傷の抗生物質がβ－ラクタマーゼにより加水分解される場合に、発生するシグナルと比較することも可能である。

より厳密には、固定された抗体、無傷の抗生物質、および標識された抗生物質を、次の条件下：
－ 標識されている抗生物質を添加する前で、本発明の抗体を（ウェル中にて、または支持体上に）固定して接触させて置く前に、抗生物質を加水分解する酵素を含有する試料を無傷の抗生物質と共にインキュベートする場合（その時、シグナルは最大である）；
－ 標識されている抗生物質を添加する前に、無傷の抗体を、試料と接触して置かれたことがない、本発明の抗体と接触して置くか、または抗生物質を加水分解する酵素を含有しない試料と接触して置く場合（シグナルは最小である）
で用いることで得られたシグナルを比較することによりβ－ラクタマーゼ活性の存在を検出することが可能である。

これらの方法は、工程ｄ）にて検出されるシグナルが、試料中に存在するβ－ラクタマーゼ酵素の量に比例するように、設計されている。試験される試料中の酵素の濃度が高ければ高いほど、無傷の抗生物質の加水分解は速くなり、試料に添加された抗体が多いほど、その後で接触して置かれるであろう、無傷の抗生物質と複合体を形成するのがフリーなままとなるであろう。無傷の抗生物質と本発明の抗体との結合を後に検出する際には、シグナルの強度は、試料中に最初に存在する酵素の濃度が高いほど、強くなるであろう。これらの方法は、シグナルの減少よりも、その出現を検出するのがずっと容易で、より信頼性が高いため、非常に有利である。

特定の実施態様において、本発明は、機能的な、好ましくは広域スペクトルのβ－ラクタマーゼ酵素を産生する細菌の存在を検出する方法であって、本発明にて定義される少なくとも１つの抗体、および該抗体によって特異的に識別される無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質の分子を用いる方法を標的とする。

より具体的には、該方法は、ｉ）上記のように、無傷のβ－ラクタム環を標識された形態および／または未標識の形態にて有する抗生物質と、ｉｉ）具体的には、この無傷な抗生物質を検出することを可能とする、上記されるように該抗生物質または免疫原性剤などの無傷なアナログを用いることで産生される、少なくとも１の抗体であって、固体の支持体上に固定されているか、または容易に検出可能である、抗体とを用いる。

本発明の方法はまた、特異的な無傷の抗体に加えて、細菌によって発現される加水分解性酵素を認識するための既知の捕捉抗体についても使用され得る。この工程は、試料中の細菌がＥＳＢＬ活性を有する場合に、どの酵素がこの活性に関与しているかを決定し、該細菌をこのパラメーターの関数として分類すること（または未知の型の酵素によって活性を検出すること）を可能とする。特に、研究された試料がＥＳＢＬ細菌を含有するとの情報を完成させるために、抗－ＣＴＸ－Ｍまたは当該分野にて既知の抗－カルバペネマーゼ抗体（例えば、Bernabeuら、2020；Boutalら、2018に記載の抗体）を用いることが可能である。

本発明はまた、かかる方法を実施するためのキットに関する。このキットは、少なくとも本発明の抗体と、場合によってはその産生に使用された抗生物質とを含有する。さらには、所望により、抗生物質および／または抗体を検出できるように、それまたはそれらを標識するための手段を含有してもよい。特定のキットでは、抗体および／または抗生物質は固体支持体（例えば、ストリップ）上に固定されるか、または予め標識されている。

本発明に係る方法は、例えば、次の工程：
ａ）試験される試料を未標識の無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質と接触して置く工程、
ｂ）試料を固体支持体上に固定されている（または検出可能である）抗体と接触して置く工程、
ｃ）標識された無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質を、該抗体と、または該抗体を含有する工程ｂ）の試料と接触して置く工程、
ｄ）該抗体が、工程ｃ）にて接触して置かれた標識された無傷の抗生物質と複合体を形成しているかどうかを検出する工程
をこの順序で含む。

β－ラクタマーゼが試料中に存在しないならば、試料に添加された（未標識の）抗生物質（工程ａ）は無傷な形態のままであり、本発明の抗体はこの無傷の抗生物質と結合し、工程ｃ）にて標識された無傷の抗生物質と結合できないであろう。対照的に、該酵素が試料中に存在するならば、（未標識の）抗生物質は工程ａ）において加水分解され、本発明の抗体はフリーなままで、工程ｃ）における標識された無傷の抗生物質と結合するであろう。工程ｄ）にて検出されるシグナルは、標識された抗生物質が本発明の抗体と結合する場合には、試料中での酵素の存在とかくして比例関係にある（シグナルは試料中に酵素が多いほど増大する、というのも競合の強制は未標識の抗体の後に添加される標識された抗生物質にも及ぶものだからである）。

次に、有利には、試料の存在下で得られたシグナルを、抗体および無傷の抗生物質が試料（または抗生物質を加水分解する酵素を含有しない試料）と接触して置かれたことがない場合に、あるいは抗体と接触して置かれる場合に、無傷の抗生物質がβ－ラクタマーゼによって加水分解されている場合に、生成されるシグナル（陰性および陽性対照）と比較することが可能である。

また、標識および未標識の抗生物質を用いる代わりに、異なる方法で標識され、相互に区別され得る抗生物質を用いることも可能である。

抗体が固定されている場合には、抗体が固定されている場所でシグナルの出現が観察され得る。抗体が検出可能な方法で標識されている場合、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、２つの抗体／抗生物質の標識の共位置を観察することが可能である。

使用者が、どのβ－ラクタマーゼまたはＥＳＢＬ酵素が細菌で発現されるかを同定し、本発明の試験によって活性であることを証明したい場合には、該使用者はまた、細菌を含有する試料をこれらの酵素（例えば、抗－ＣＴＸ－Ｍまたはカルバペネマーゼ）を特異的に認識する既知の抗体（これらの抗体は、その後の検出をより良くするために標識されている、および／または固定されている）と接触して置くこともできる。

本発明はまた、かかる方法を実施するためのキットに関する。このキットは、少なくとも本発明の抗体を含有し、所望によりその産生に使用された抗生物質を含有してもよい。また、所望により、抗生物質および／またはβ－ラクタマーゼ酵素を検出するための既知の抗体を検出できるように、それを標識するための手段を含有してもよい。特定のキットでは、抗体は、固体支持体（例えば、ストリップ）に既に固定されるか、または既に標識されて供給される。

もう一つ別の特定の実施態様において、本発明は、機能性β－ラクタマーゼを産生する細菌を検出する方法であって、少なくともｉ）上記されるβ－ラクタム環を無傷な形態にて有する抗生物質、およびｉｉ）該抗生物質を免疫原性剤として用いることにより上記されるように産生されるこの無傷の抗生物質を特異的に検出するための抗体（該抗体は検出可能なように標識されている）を用いる方法に関する。

本発明に係る方法は、例えば、次の工程：
ａ）試験される試料を未標識の無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質と接触して置く工程、
ｂ）工程ａ）の後の試料を、標識されている抗体と接触して置く工程、
ｃ）工程ｂ）の後に得られた抗体を、固体支持体上に固定されている、無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質と接触して置くか、または抗体とは別々に標識化されている無傷の抗生物質を添加する工程、
ｄ）該標識化された抗体が、工程ｃ）にて接触して置かれた無傷の抗生物質と複合体を形成しているかどうかを検出する工程
をこの順序で含む。

β－ラクタマーゼが試料中に存在しないならば、試料に添加された抗生物質（工程ａの後の未標識の抗生物質）は無傷な形態のままであり、本発明の抗体はこの無傷の抗生物質と結合し、工程ｃ）にて標識された無傷の抗生物質と結合できないであろう。対照的に、該酵素が試料中に存在するならば、工程ａ）において添加された（未標識の）抗生物質は加水分解され、工程ｂ）での本発明の標識化された抗体はフリーなままで、工程ｃ）の間に固定化または標識化された無傷の抗生物質と結合するであろう。工程ｄ）にて検出されるシグナルは、固定化された抗生物質が本発明の標識化された抗体と結合する場合には、試料中での酵素の存在とこのように比例関係にある（シグナルは試料中に酵素が多いほど増大する、というのも競合の強制は固定化された抗生物質にも及ぶものだからである）。

上記されるように、有利には、試料の存在下で得られたシグナルを、抗体および無傷の抗生物質が試料（または抗生物質を加水分解する酵素を含有しない試料）と接触して置かれていない場合に、あるいは無傷の抗生物質がβ－ラクタマーゼによって加水分解され、その後に抗体と接触して置かれる場合に、生成されるシグナル（陰性および陽性対照）と比較することが可能である。

抗生物質が固定されている場合には、抗生物質が固定されている場所でシグナルの出現が観察され得る。抗生物質が標識されている場合、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって、本発明の抗体の共位置を観察することが可能である。

上記されるように、使用者が、どれがβ－ラクタマーゼまたはＥＳＢＬ酵素であるかを同定したい場合には、本発明者は、細菌を含有する試料をこれらの酵素（例えば、抗－ＣＴＸ－Ｍまたはカルバペネマーゼ）を特異的に認識する既知の抗体（これらの抗体は、その後の検出をより良くするために標識されている、および／または固定されている）と接触して置くこともできる。

この特定の実施態様において、本発明の方法は、例えば、次の工程：
ａ）試験される試料を未標識の無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質の分子と接触して置く工程、
ｂ）工程ａ）から得られた試料を、工程ａ）において添加された無傷な形態の抗体を特異的に認識する本発明の抗体と、およびβ－ラクタマーゼ酵素（例えば、ＣＴＸ－Ｍまたはカルバペネマーゼ）を特異的に認識する少なくとも１の抗体（ここで該抗体は事前に標識されている）と接触して置く工程、
ｃ）工程ｂ）の溶液を、無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質の分子と、β－ラクタマーゼ酵素（例えば、抗－ＣＴＸ－Ｍまたはカルバペネマーゼ）を特異的に認識する抗体（ここでそれらは固体支持体上に固定されている）と接触して置く工程、
ｄ）該標識されている抗体が、無傷の抗生物質と、および／または工程ｃ）にて接触して置かれた抗－β－ラクタマーゼ酵素と複合した抗－β－ラクタマーゼ抗体と複合体を形成するかどうかを検出する工程
を含む。

本発明はまた、かかる方法を実施するためのキットに関する。このキットは、少なくとも本発明の抗体を含有し、所望によりその産生に使用された抗生物質を含有してもよい。また、所望により、該抗体および／またはβ－ラクタマーゼ酵素を検出するための既知の抗体を検出できるように、それを標識するための手段を含有してもよい。特定のキットでは、抗生物質は固体支持体（例えば、ストリップ）上に固定された形態であるか、または既に標識化されている。

本発明の識別抗体、ならびにそれを得るのに使用される抗生物質を用いることにより他の多少複雑な試験を開発し得る。
本発明のキットはすべて、本発明の抗体の特異性を確認するために使用され得るであろうβ－ラクタマーゼ酵素を含有することもできる。
本発明のキットはすべて、β－ラクタマーゼを含有しない、対照となる試料を含有することもできる。

本発明のキットはすべて、本発明の標識化されている抗体（マウス免疫イムノグロブリンの定常部分を認識する抗体）を検出するための手段を含有し得る。

最後に、本発明のキットはすべて、機能性β－ラクタマーゼを産生する細菌を迅速かつ効果的な方法で検出するために、実施されるべきである実験の詳細を使用者に説明するための説明書を含有し得る。

発明のストリップ
特定の実施態様において、本発明の免疫学的試験は、検出「ストリップ」を支持体として有する免疫クロマトグラフィー試験である。この場合には、本発明の試験は「ストリップ試験」と称され、本発明の方法にて使用される固体支持体はストリップである。このストリップは本発明の特に重要な態様を構成する。

実際、本発明者らは本発明の抗体がストリップ試験にて有利に使用され得ることを示した。かくして、本発明の抗体は、蛍光団または発光団と、または肉眼で可視化できる他の任意のマーカー、例えば、コロイド金とカップリングされるのが好ましい。

「ストリップ試験」は、単純、迅速で安価な検出システムであり、当該分野の専門家でなくても使用できる。ストリップは、一般に、３つの異なるゾーン：１）移動を容易にする吸収ゾーン、２）反応ゾーン（一般にニトロセルロース膜として形成される）、および３）吸収ゾーンの反対端に位置する、試験される試料を付着させる付着ゾーン（図５を参照のこと）で形成され、それらは、通常は、プラスチックである支持体に固定される。検出される標的に対して指向性を有し、一般に、比色または蛍光シグナルを得ることを可能とする分子に結合するために、「トレーサー」抗体と称される抗体を、吸収ゾーン上に付着させて乾燥させる。本発明の状況下にあって、該「トレーサー」抗体は、上記される、本発明の識別抗体であろう。

反応ゾーンには、一般に、２本のラインが存在する。これらのラインのうち、最初のラインは「テスト」ライン（ＴＬ）と称され、ここでは、β－ラクタム環を有する抗生物質で構成される。このテストラインで得られるシグナルは試料中のβ－ラクタマーゼの有無を示す。「コントロール」ライン（ＣＬ）と称される第２のラインは、本発明の抗体に対して指向される抗体からなるであろう。

有利には、β－ラクタマーゼ酵素を認識する抗体も、図１０にて提案されるように、本発明のストリップ上に固定され得る。これらの抗体は標識され、付着ゾーンで付着されており、また１または複数の試験ライン上に固定されるが、固定された抗生物質を含有するラインとは区別できることが好ましい。

この場合には、本発明に係るストリップは、複数の試験ラインと、１本のコントロールラインを含有してもよい。１本の試験ラインは、ＢＳＡと、またはもう一つ別の担体構造（例えば、カゼイン、デキストランまたはポリリジン）とカップリングした無傷の抗生物質が固定されているゾーンに対応し、他の試験ラインは、抗－β－ラクタマーゼ抗体が固定されているゾーンに対応する。この場合には、付着ゾーンは、検出可能な方法ですべてが標識されている（使用されるマーカーは別個または同一である）、本発明の抗体、ならびに抗－β－ラクタマーゼ抗体を含有するのが有利である。

この特定の実施態様において、専用のテストライン上に固定された抗－β－ラクタマーゼ抗体によって認識されるエピトープとは異なる、標的となる酵素のエピトープを認識する抗－β－ラクタマーゼ抗体を、付着ゾーンに、付着させることが好ましい（従って、抗体の２つの集団は同じβ－ラクタマーゼ酵素を認識する）。かくして、標的となる酵素の存在を検出することはさらに信頼性を高めることとなるであろう。

試料の細菌が、付着ゾーンに存在する標識されている抗体によって認識されるβ－ラクタマーゼ酵素を発現する場合、これらはβ－ラクタマーゼ酵素と結合し、該酵素はまた、試験ゾーンに固定された抗－β－ラクタマーゼ抗体とも結合し得るであろう。従って、これらの抗体に対応する標識化が試験ライン上に可視化され、ＥＳＢＬ活性を有する細菌が、このライン上に固定された抗体によって認識される酵素を発現するかどうかを推論することが可能となる。

反応ゾーンもまた、その上に種々の抗生物質が固定されている、複数の試験ラインを含有し得る。この場合には、これらの抗生物質の１の特異的トレーサーである、複数のモノクローナル抗体が付着ゾーンに存在するのが有利であろう。例えば、反応ゾーンは、無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質Ａが結合した試験ラインと、無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質Ｂ（ＢはＡとは異なる）が結合した試験ラインとを含有し得る。付着ゾーンでは、無傷の抗生物質ＡおよびＢと、加水分解された抗生物質ＡおよびＢとを区別するモノクローナル抗体が付着されているのが有利であり、その結果、試験試料中にβ－ラクタマーゼがあるならば、２本のラインにてシグナルが出現するであろう。

この状況下にあって、カルバペネマーゼ以外のＥＳＢＬ酵素に対して耐性であることが知られている、これらの新たな世代の抗生物質である、カルバペネムの無傷な形態と加水分解された形態とを識別する抗体を付着させるのも有利である。以下の実施例２は、本発明の方法およびキットにて使用され得る、かかる抗体をどのように得るかを正確に記載する。

この特定の実施態様において、カルバペネムの無傷な形態と加水分解された形態とを識別する抗体を付着ゾーンに付着させ、無傷のカルバペネム抗生物質を試験ラインに固定される。本発明の試験は、試料中のカルバペネマーゼ酵素の存在を同定し、従って、潜在的にこれらの酵素を発現する細菌の存在を同定し得る。

その上さらに好ましい実施態様において、本発明のストリップは、少なくとも２本の試験ラインを含有し、その上には、試料中の、カルバペネマーゼ以外のＥＳＢＬ酵素（例えば、セファロスポリナーゼ等）およびカルバペネマーゼの存在を同定するために、無傷な形態の非カルバペネム系抗生物質（例えば、セファロスポリン）および無傷な形態のカルバペネム系抗生物質が個々に固定化されている。（場合によっては異なるマーカーで）標識された個々の識別抗体は、それ自体が付着ゾーンで付着する。本発明のストリップは、その反応ゾーンにおいて、上記にて説明されるように、他の試験ラインを、その上に抗－β－ラクタマーゼ酵素の抗体が固定されているラインをさらに含有し得る。

酵素が試料中に存在しないならば、試料中に添加された抗生物質は無傷な形態のままであり、本発明の抗体はこの無傷な抗生物質と結合するであろうし、ＴＬの無傷な抗生物質ともはや結合できないであろう。対照的に、酵素が試料中に存在するならば、添加された抗生物質は加水分解され、本発明の抗体はＴＬに固定された無傷の固定化抗生物質との結合に対してフリーなままであろう。これらの２つの場合で、フリーな抗体、すなわち、試験ラインに固定されていないものは、本発明の抗体によってコントロールラインで捕捉されるであろう。

本発明の試験ストリップは、試験ラインでのシグナルが試料中に存在するβ－ラクタマーゼの量に伴って増加するように設計されている。酵素の濃度が試験試料中にて濃くなればなるほど、抗生物質の加水分解は速くなり、抗体はますます添加された抗生物質と複合体を形成しなくなり、それはＴＬ上で結合するようになるであろう：従って、ＴＬ上のシグナル強度はこの濃度に伴って増加するであろう。

さらには、本発明の試験ストリップは、それがシグナルの出現（その消失ではなく）を酵素の量とリンクさせている点で、非常に信頼性が高い。シグナルの減少よりもシグナルの出現を検出するほうが容易であって、信頼性がより高いことは周知である。

この好ましい実施態様において、本発明に係るストリップは、以下のように：
－ 好ましくは標識化された、本発明の抗体を、付着ゾーンにて付着させて、例えば乾燥させ、
－ 所望により、好ましくは標識化された、抗－β－ラクタマーゼ抗体もまた、付着ゾーンに付着させてもよく、
－ 無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質を、反応ゾーンにてＴＬ上に（例えば、抗生物質をニトロセルロース上で固定させる一方で、それを標識された抗体と相互作用させる、ＢＳＡ－抗生物質系を用いて）固定させ、
－ 所望により、抗－β－ラクタマーゼ抗体をまた、反応ゾーンのもう一つ別のライン上に固定してもよく、
－ ストリップの付着ゾーンに付着させた抗体（本発明の抗体、および任意の抗－β－ラクタマーゼ抗体）を認識する抗体を、例えば、吸着により、ＴＬとは反対側にあるＣＬ上に固定して
製造され得る。

特定の態様において、本発明は、従って、
１）試料を付着させるゾーン（そこでは、上記で定義される抗体を標識化し、付着させ、かつ乾燥させており、ならびに、所望により、標識した抗－β－ラクタマーゼ抗体を付着させてもよい）と、
２）次のライン：
－ 付着ゾーン１）に付着させる少なくとも１の抗体を産生するのに使用される、無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質が固定されている、少なくとも１の試験ラインと、
－ 所望により、抗－β－ラクタマーゼ抗体が固定されている、少なくとも１の試験ラインと、
－ ゾーン１）に存在する抗体を認識する抗体が固定されている、コントロールラインとを含む、
反応ゾーンと、
３）抗体の移動を促進する吸収ゾーンであって、付着ゾーン１）の反対側に位置する吸収ゾーンと
を含有するストリップに関する（図５および１０を参照のこと）。

標識化された抗体を、好ましくは乾燥によって、ストリップの表面に付着かつ保存させる。それらはまた、それをストリップに付着させる直前に試料に添加され得る。
反応ゾーンは、好ましくは、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ、セルロースまたはガラス繊維で製造される。

抗生物質をＴＬにて固定するのは、ＢＳＡまたはもう一つ別のキャリア分子（例えば、カゼイン、デキストランまたはポリリジン）と結合した抗生物質を吸着することで達成されるのが好ましく、そうすることで、吸収ゾーンに向かって移動する本発明の抗体を捕捉するのに不可欠な、β－ラクタム環をアクセス可能な状態なままとすることを可能となる。ビオチンと結合した抗生物質と複合体を形成したＢＳＡ－ストレプトアビジンを吸収させるか、または抗生物質を反応ゾーンで使用される膜の多孔度よりも大きな直径を有するビーズと結合させることも可能である。小分子を固定するのに当該分野にて知られる他の結合技法を用いることができる。

コントロールラインで、本発明のストリップで使用される抗体を認識する抗体は、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、またはネズミ抗体を認識する他の任意の系の、抗－ネズミ－免疫グロブリン－定常－部分抗体である。

従来の競合試験と同様に、固定または標識される抗体および抗生物質の量、または基質の量は、厳密に管理されなければならない。抗体の量が多すぎると、結合部位がすべて占領されるために高濃度の基質が必要とされ、従って、これらの部位の占領を有意に減少させるためには高濃度のβ－ラクタマーゼが必要となる。同様に、標識または固定される抗生物質の濃度が高すぎると、抗体による基質への結合に関して非常に高い競合が誘導され、それはβ－ラクタマーゼの不在下でもシグナルの出現を誘発するか、あるいは、この同じ基質による抗体の結合部位の全体としての占領を維持するために過剰量の基質を使用することとなる。この過剰量の基質は、感度の大きな減少、またはインキュベーション時間の長期化をもたらすであろう。

これらの最適化工程を示す実施例を以下に示す。表５から、シグナルを完全に消失させる基質の濃度が、各抗体で最適化される、標識化または固定化される抗体および抗生物質の量に依存しており、同一でないことが分かる。かくして、（ストリップ上のシグナルの消失によって示される）すべての結合部位の占領を可能とする抗体２の基質の濃度はより高くなる。

当業者であれば、本発明にて言及される表示をモニター観察して、使用される発色団および分析物に応じて、これらのパラメータを調節することが重要であることを理解する。当業者であれば、現在の技術および下記の実施例にて提供される説明を用い、抗体が認識する無傷の抗生物質について所定の親和性を有する抗体に関する各分析物の最適量を同定することができる。当業者であれば、特に、付着ゾーンに付着させる抗体の量は、本発明の方法またはストリップに使用される無傷の抗生物質と結合するすべての部位を飽和させることができるものでなければならないことを理解する。その上に、当業者であれば、最小量が抗生物質を含有する試験ライン上で最大シグナルを得ることを可能とする量であると理解する。

コロイド金で標識したセフォタキシムの場合（実施例１）、付着ゾーンに付着される抗体の最適量は、コロイド金に相対的な吸光度－ＤＯ－が０.１と１０の間にある１０μＬの溶液が付着する量である。その上、ラインＴＬ（１μＬ／ｃｍ）に固定される抗生物質の最適量は、理想的には、１μｇと１ｍｇ／ｍＬとの間にある。ＢＳＡ－抗生物質のよる結合が用いられる場合、例えば、約０.１ｍｇ／ｍＬの濃度で優れた結果が得られる。

一般に、特異的に認識する無傷の抗生物質に対して強い親和性（Ｋ_ｄが１ｐＭと約１０ｎＭの間にある）を有する他の抗体の場合、ストリップのＴＬライン上に、１ｃｍ当たり１μＬの溶液を付着させることで、１０μｇ～１ｍｇ／ｍＬ、５０μｇ～１ｍｇ／ｍＬ、１００μｇ～１ｍｇ／ｍＬ、または５０μｇ～０.５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する一定量の無傷の抗生物質を固定させ、ＤＯ（それがコロイド金で標識されている場合）が０.１～１０である１０μＬの溶液を用いることによって、一定量の抗体を付着ゾーンに付着させるのが有利である。

本発明のストリップの使用を容易にするために、本発明のストリップをプラスチック製カセットに挿入することが可能である。

本発明のストリップを含有する、本発明のキット
付着ゾーンに付着させる以前に、無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質は、それを本発明のストリップと接触して置く前に、試験される試料に添加されなければならない。

第３の態様において、本発明はまた、本発明のストリップに加えて、本発明の抗体を得るのに使用され、該ストリップの付着ゾーン１）に固定化された無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質を含有するキットに関する。この抗生物質は、該ストリップから分離された別個の容器に含有されるのが好ましい。

例えば、本発明の抗体が動物を抗生物質のセフォタキシムで免疫処理することにより産生される場合（下記の実施例１を参照のこと）、その時には本発明のキットはそこに該無傷の抗－セフォタキシム抗体が付着し、該無傷の抗生物質が固定されているストリップ、ならびに該無傷の抗生物質を含有するバイアルまたはチューブを含有するであろう。

例えば、本発明の抗体が、動物をカルバペネム類似体で免疫処理することにより産生された場合（下記の実施例２を参照のこと）、その時には本発明のキットは、無傷の抗－カルバペネム抗体を付着させ、該無傷の抗生物質が固定される、ストリップ、ならびに該無傷のカルバペネム抗生物質を含有するバイアルまたはチューブを含有するであろう。

このように、使用者は、本発明の試験を実施するためのすべての要素を有するであろうし、試験される試料に、本発明の試験を行うことを可能とするであろう試薬（抗生物質）を即座に添加し得る（下記参照のこと）。

試験ストリップが適切に特異的であることをチェックするために、本発明のキットはまた、機能性β－ラクタマーゼを含む容器を含むこともできる。使用者は、このように、例えば、試験される試料（すなわち、内因性β－ラクタマーゼが存在する可能性のある場合）、または外因性酵素が加えられている場合にて得られるシグナルの違いを比較することができる。この工程は試験が適切に機能的であることをチェックするのに使用され得る。

上記されるように、このキットにはまた、β－ラクタマーゼを含有しない対照となる試料、本発明の標識された抗体（例えば、マウス免疫グロブリンの定常部分を認識する抗体）を検出するための手段、および／または機能性β－ラクタマーゼを産生する細菌を迅速かつ効果的に検出するために実施すべき実験の詳細を使用者に説明するための説明書を含めることもできる。

かくして、本発明は、より詳細には：
－ 本発明に係る少なくとも１つのストリップ、および
－ ストリップの付着ゾーン１）上に固定された抗体を得るのに使用される無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質を含有する別個の容器、
－所望により、β－ラクタマーゼ酵素を、および／またはβ－ラクタマーゼ酵素を含有しない試料を含有してもよい、別個の容器
を含有するキットに関する。

本発明のストリップを用いる本発明の方法
最後の態様において、本発明は、β－ラクタマーゼを含有しうる試料中にて、該酵素を検出するための方法に関する。該試料は上記されているとおりである。
好ましい実施態様において、該方法は、上記されるような、該ストリップ、またはこのストリップを含有する本発明のキットを用いる。

この方法は、次の工程：
ａ）無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質を、試験される試料と接触して置き、ここで該抗生物質はストリップ上で標識され、かつ付着された本発明の抗体によって特異的に認識され、該ストリップ上のＴＬラインに固定される、工程；
ｂ）試料中に所望により存在してもよい酵素が抗生物質の無傷のβ－ラクタム環を加水分解し得るのに十分な時間にわたってインキュベートする、工程；
ｃ）このインキュベーションの後、該試料（例えば、１００μＬ）をストリップの付着ゾーン上に付着させるか、または該ストリップを試料に浸し、それを十分な時間にわたって反応させる、工程；
ｄ）結果を該ストリップの試験ラインで読み取る、工程
を利用する。

ＴＬ（例えば、ＴＬ：無傷の抗生物質）を用いて検出する場合（図５）、試験される試料が細菌として、または酵素として効果的に何を含有するかに応じて、２つのケースが生じる（図６）：

ケース１：試験される試料にはβ－ラクタマーゼを産生しない細菌が含まれる。インキュベーション時間の経過した後、（無傷の抗生物質および細菌を含有する）試料をストリップの付着ゾーンに付着させる。（試料中に活性化β－ラクタマーゼが含まれないため）抗生物質は加水分解されず、それと本発明の抗体との間で複合体が形成される。試験ラインに移動しても、このように複合体を形成した抗体は、そこに固定されている抗生物質と結合できない。対照的に、抗体は、本発明の抗－抗体抗体によってコントロールライン（ＣＬ）で固定されるであろう。かくして、ＣＬだけが可視できるであろう。試験は陰性となり、試験される試料中にβ－ラクタマーゼ産生菌は存在しないと結論付けられ得る。

ケース２：試験される試料にはβ－ラクタマーゼ酵素を産生する細菌が含まれる。インキュベーション時間の経過した後、該β－ラクタマーゼ酵素が無傷の抗生物質を加水分解しているため、試料中にはもはや該抗生物質は含まれない。それをストリップの付着ゾーンに付着させると、その加水分解型抗生物質と、本発明の抗体との間で複合体は形成されない。結合部位がフリーである本発明の抗体は、試験ラインに向かって移動し、そこで試験ラインに固定された無傷の抗生物質に結合し得る。過剰な本発明の抗体は、それ自体がコントロールライン（ＣＬ）で抗－抗体抗体によって固定される。この場合には、２本のライン（試験ラインおよびコントロールライン）が可視できる。試験は陽性と判定され、試料中にβ－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ、または他のβ－ラクタマーゼ）を産生する細菌が存在すると結論付けられる。

２本のＴＬ（例えば、ＴＬ１：無傷の抗生物質；ＴＬ２：抗－ＣＴＸ－Ｍ）を用いて検出する場合（図１０）、その時には、存在する細菌がβ－ラクタマーゼとして何を産生するかに応じて、４つのケースが発生する（図１１）：

ケース１：試験される試料はβ－ラクタマーゼを産生しない細菌を含有する。インキュベーション時間の経過した後、試料（無傷の抗生物質および細菌を含有する）をストリップの付着ゾーンに付着させる。（試料中には活性化β－ラクタマーゼが存在しないため）抗生物質は加水分解されず、それと本発明の抗体との間で複合体が形成される。標識された抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体は酵素のＣＴＸ－Ｍと結合しない。試験ライン１（ＴＬ１）に移動すると、こうして複合体を形成した本発明の抗体はそれ自体がそこに固定されている抗生物質と結合できないであろう。標識された抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体が酵素と複合体を形成しない場合、それらは試験ライン２（ＴＬ２）上で別の抗－ＣＴＸＭ抗体と結合できないであろう。対照的に、抗体は抗－抗体抗体によってコントロールライン（ＣＬ）で固定されるであろう。かくして、ＣＬだけが可視できるであろう。試験は陰性であり、試験される試料中にβ－ラクタマーゼを産生する細菌は存在しないと結論付けられ得る。

ケース２：試験される試料には、β－ラクタマーゼ産生菌が含有されるが、ＣＴＸ－Ｍ酵素は含まれていない。インキュベーション時間の経過した後、そのβ－ラクタマーゼ酵素が無傷の抗生物質を加水分解するため、試料にはもはや該抗生物質は含まれない。試料がストリップの付着ゾーンに付着すると、加水分解型抗生物質と本発明の抗体との間で複合体は形成されない。標識された抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体はＣＴＸ－Ｍ酵素と結合しない。結合部位がフリーである、本発明の抗体は、試験ラインに向かって移動し、そこで該抗体は試験ライン１（ＴＬ１）で固定されている無傷の抗生物質に結合し得る。標識された抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体は酵素と複合体を形成せず、それらは試験ライン（ＴＬ２）上で第２抗－ＣＴＸＭ抗体によって結合され得ないであろう。抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体および本発明の抗体で、過剰に存在するものは、それ自体が、抗－抗体抗体によってコントロールライン（ＣＬ）で固定される。この場合、試験ラインおよびコントロールラインが可視できる。試験は陽性と判定され、試料中にて抗生物質を加水分解しうるＣＴＸ－Ｍ酵素ではなく、β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ、または他のβ－ラクタマーゼ）を産生する細菌が存在すると結論付けられる。

ケース３：試験される試料はＣＴＸ－Ｍ型β－ラクタマーゼを産生する細菌を含有する。インキュベーション時間の経過した後、そのβ－ラクタマーゼ酵素が該抗生物質を加水分解しているため、試料中にはもはや無傷の抗生物質は含まれない。試料がストリップの付着ゾーンに付着すると、加水分解型抗生物質と本発明の抗体との間で複合体は形成されない。抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体が存在する酵素ＣＴＸ－Ｍと結合する。結合部位がフリーである、本発明の抗体は試験ラインに向かって移動し、そこで試験ライン１（ＴＬ１）で固定されている無傷の抗生物質に結合し得る。試験ライン（ＴＬ２）上に存在する抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体は、標識された抗－ＣＴＸＭ抗体と複合体を形成したＣＴＸ－Ｍ酵素と結合する。抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体および過剰量の本発明の抗体は、抗－抗体抗体によってコントロールライン（ＣＬ）で固定化される。この場合、試験１、試験２およびコントロールラインは可視できる。試験は陽性と判定され、試料中にて抗生物質を加水分解しうるＣＴＸ－Ｍ型β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ、または他のβ－ラクタマーゼ）を産生する細菌が存在すると結論付けられる。

この方法の工程ａ）において、無傷な形態である抗生物質（または「基質」）を試験される試料に添加する。無傷の抗生物質の量は、試験の感度が最適であるように調整され得る。本発明の試験が機能的であるためには、試料に添加される基質の量は、過剰ではなく、使用される抗体のすべての結合部位を占有し得ることが不可欠である。かくして、基質の量が本発明の抗体のすべての結合部位を占有するのにもはや十分でなくなった時にシグナルが出現するであろう。基質が過剰であると、低濃度の酵素を検出できず、インキュベーション時間を長期にわたって必要とし、それは迅速かつ簡単な試験とは相容れない。

当業者であれば、本発明にて（特に実施例にて）言及されるインジケーションをモニター観察することで、過剰になることなく、使用される抗体のすべての結合部位を占有できるように、該方法の最初の工程で試料中に添加される無傷の抗生物質の量を決定することができるであろう。

本発明に係る抗－セフォタキシム抗体が使用される場合（下記の実施例１を参照のこと）、例えば、最初の試料に１０ｎｇ／ｍＬと５０ｍｇ／ｍＬとの間のセフォタキシム抗生物質を添加することが可能である。

より一般には、他の抗体で、それらが特異的に認識する無傷の抗生物質について強い親和性（Ｋ_ｄが１ｐＭと約１０ｎＭの間にある）を有する抗体の場合、最初の試料（β－ラクタマーゼを産生する細菌、または産生しない細菌を含有する試料）中に、１ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬまたは１００ｎｇ／ｍＬ～０.５μｇ／ｍＬの無傷の抗生物質を添加することが可能であろう。

工程ｂ）のインキュベーションは外界温度で実施され得る。
この工程に要する時間は、試験の感度が最適となるように調整され得る。セフォタキシムが使用される場合（下記の実施例１を参照のこと）、このインキュベーション工程は１０分間～１時間にわたって続けることができる。試験した条件下では、３０分間で良好な結果が得られている。

一般に、他の抗体で、それらが特異的に認識する無傷の抗生物質について強い親和性（Ｋ_ｄが１ｐＭと約１０ｎＭの間にある）を有する抗体では、１０分間～１時間のインキュベーション時間が最適である。

工程ｃ）の開始時に、試料を付着ゾーンと接触して置いた後に、抗体を試験およびコントロールラインに移動させる時間を確保する。この移動工程は５～３０分間続けることができる。セフォタキシムを用いる場合（下記の実施例１を参照のこと）、試験条件下では、１０～２０分間で良好な結果が得られている。

従って、結果を読み取る工程ｄ）は、セフォタキシムが使用される場合で、試料および抗生物質を接触して置いてから約４０分間経過した後に行うことができる。

一般に、他の抗体で、それらが特異的に認識する無傷の抗生物質について強い親和性（Ｋ_ｄが１ｐＭと約１０ｎＭの間にある）を有する抗体では、結果は、試料をストリップと接触して置いた約１０分間～１時間後（好ましくは２０分間～４０分間後）に読み取ることができるであろう。
この方法の工程はすべて、外界温度で実施され得る。

利用可能であるためには、本発明の方法は、最小限の時間で、理想的には１時間未満で信頼できる結果を付与できなければならない。
本発明者らは、下記の実施例にて使用される条件下で、本発明の試験が、極めて良い結果である、１００％の特異性と１００％の感度を有することを実証できた。
本発明のストリップを用いる前に、特に該試料が固体であるならば、試験される試料を製造しておくのが有利であり得る。

試料が固体（例えば、土壌）である場合、それを抗生物質と接触して置く工程に進む前に、緩衝液を加えることでそれを希釈することが可能である。この緩衝液は、例えば、ＮａＣｌ、非特異的相互作用を減少させることが知られている分子（ＰＶＰ、ＰＶＡ、ＢＳＡ）および界面活性剤（ツィーン２０）を含んでもよい。そのｐＨは８であることが好ましい。ＮａＣｌの濃度は１５０ｍＭに近いことが好ましい。

細胞溶解は、可能性として試料の細菌中に含有されるβ－ラクタマーゼ酵素を放出し、その活性をより迅速に可視化するために行われるのが好ましい。従来の溶解緩衝液が使用され得る（下記の実施例を参照のこと）。

試料が液体（例えば、生物学的流体）である場合、それを抗生物質と接触して置く工程を進める前に、緩衝液を添加することでそれを希釈することが可能である。この緩衝液は、例えば、ＮａＣｌ、非特異的相互作用を減少させることが知られているタンパク質（ＰＶＰ、ＰＶＡ、ＢＳＡ）および界面活性剤（ツィーン２０）を含んでもよい。そのｐＨは８であることが好ましい。ＮａＣｌの濃度は１５０ｍＭに近いことが好ましい。

当業者はかかる利用可能な試料をどのようにして得るかを知っている。先行技術の他の試験と異なり、細菌濃度について上限はない。
これらの製造工程は、試料中に存在する可能性のあるβ－ラクタマーゼ酵素の活性に影響を及ぼすものであってはならない。

図面
本発明のシステムにて使用可能である、目的とする抗体を選択するのに本願にて使用される免疫酵素試験１の原理を説明する。この試験には、非加水分解型セフォタキシム－ビオチン（ＮＨ）、ハイブリドーマまたはセフォタキシムでの免疫処理に付したマウス血漿から由来の抗体、およびストレプトアビジン－アセチルコリンエステラーゼ（Ｇ４）が含まれる。該アセチルコリンエステラーゼは発色団と反応して着色生成物を生成する。

本発明のシステムにて使用可能である、目的とする抗体を選択するのに使用される、目的とする他の３種の免疫酵素試験の原理を説明する。試験２：加水分解型セフォタキシム－ビオチン（Ｈ）＋ハイブリドーマまたはセフォタキシムでの免疫処理に付したマウス血漿の抗体＋ストレプトアビジン－Ｇ４を使用する。試験３：非加水分解型セフォタキシム－ビオチン（ＮＨ）＋非加水分解型セフォタキシム（ＮＨ）＋ハイブリドーマまたはセフォタキシムでの免疫処理に付したマウス血漿の抗体＋ストレプトアビジン－Ｇ４を使用する。試験４：非加水分解型セフォタキシム－ビオチン（ＮＨ）＋加水分解型セフォタキシム（Ｈ）＋ハイブリドーマまたはセフォタキシムでの免疫処理に付したマウス血漿の抗体＋ストレプトアビジン－Ｇ４を使用する。

図３Ａおよび３Ｂは、加水分解型または非加水分解型セフォタキシム、および検討した種々のモノクローナル抗体（実線：非加水分解型セフォタキシム；点線：加水分解型セフォタキシム）とで得られる競合曲線を表す。Ａ：非加水分解型セフォタキシム（実線）および加水分解型セフォタキシム（点線）を用いて３種の抗体で得られる非同一競合曲線を示す。Ｂ：非加水分解型セフォタキシム（実線）および加水分解型セフォタキシム（点線）を用いて５種の抗体で得られる類似競合曲線を示す。

加水分解型または非加水分解型セフォタキシムと、１の非選択性モノクローナル抗体とで得られる競合曲線を示す。

分析体の検出を目的として使用される従来のストリップを構成する種々の要素を示す。

試料がＥＳＢＬ細菌またはβ－ラクタマーゼ酵素を含有する（陽性試験）と、含有しない（陰性試験）場合とで予想される２つのケースを説明する。

本発明のストリップを保護するのに使用され得るプラスチック製カセットを説明する。

実施例２（Ｂ）にて使用されるカルバペネム化合物の構造を示す。

実施例２（Ｃ）にて記載される試験１～４の原理を示す。

２本の試験ラインと、コントロールラインとを含有する、本発明に係るストリップを示す。第1の試験ラインはセフォタキシム－ＢＳＡが固定されているゾーンに対応し、第２の試験ラインは抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体が固定されているゾーンに対応する。コントロールラインは、本発明にて使用される他の標識抗体を認識する、第２抗体が固定されているゾーンに対応する。付着ゾーンにおいて、本発明の抗－セフォタキシム抗体および抗－ＣＴＸ－Ｍ抗体が付着し、その全てがコロイド金で標識される。

試料がＥＳＢＬまたはβ－ラクタマーゼ酵素を有する細菌を含有しない（陰性試験）、あるいはＥＳＢＬ細菌またはＣＴＸ－Ｍ以外のβ－ラクタマーゼ酵素を含有する（１ラインの陽性試験）またはＥＳＢＬ細菌またはＣＴＸ－Ｍ型β－ラクタマーゼ酵素を含有する（２ラインの陽性試験）とで予想される３つのケースを説明する。

実施例１：セフォタキシムに対して耐性を有する細菌の検出
Ａ． 免疫原の設計と製造
セフォタキシムは、抗体を得るのに不可欠な、免疫応答の誘発能を有しない小型分子である。従って、この抗生物質をより大きな免疫原性分子である、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にカップリングさせる必要があった。本発明の抗体が認識する際の違いはβ－ラクタム核で生じるため、β－ラクタム核の免疫系への最適な曝露を可能とする、特定の免疫原を設計した。従って、ＢＳＡとのカップリングは、β－ラクタム核から最も離れている官能基である、ＮＨ_２官能基で実施された。そのセフォタキシムを塩化クロロアセチルで活性化した（Rodriguez、「An improved Method for preparation of cefpodoxime proxetil」、2003）。これを行うために、２ｍｌのＤＭＡに溶かしたセフォタキシム（５００ｍｇ、１.０９ミリモル、１当量）の懸濁液を塩化クロロアセチル（１２８μｌ、１.６５ミリモル、１.５当量）に５℃～１０℃で添加した。次に該混合物を外界温度で１時間３０分撹拌した。その操作が完了すれば、該溶液を氷中に注いだ。沈殿物を濾過で集め、Ｈ_２Ｏ、エタノールおよびジエチルエーテルで連続して洗浄し、ついで所望の生成物を灰白色の粉末の形態で得るために乾燥させた（３４９ｍｇ、０.６６ミリモル、６０％）。この反応により、特にチオール官能基と反応し得るクロロアセトアミド官能基の形成がもたらされた。

並行して、３５ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ７.４）に溶かした。１２２ｍｇ／ｍｌのＮ－スクシンイミジル－ｓ－アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）のＤＭＦ中溶液（５０μｌ）を添加した（モル比 ＳＡＴＡ／ＢＳＡ＝５０）。４℃で１６時間反応させた後、セファデックスＧ２５中位カラムを用いるモレキュラーシーブクロマトグラフィーに付して精製した。次に、１００μｌのヒドロキシルアミン（１Ｍ、ｐＨ７）を２０℃で３０分間にわたって添加することでチオール官能基の保護基を取り除いた。チオールの濃度を、ＤＴＮＢとの反応で測定した（ＳＨ／ＢＳＡ＝２０.７）。この生成物は、次に、修飾セフォタキシムのクロロアセトアミド官能基と反応させることができる。

この理由から、ＤＭＳＯ中にて６ｍｇ／ｍｌのクロロアセトアミド－セフォタキシム（２.３４ｍｇ）をＢＳＡ－ＳＨ（２.７６ｍｇ）に添加した（クロロアセトアミド－セフォタキシム／ＳＨのモル比＝５）。２０℃で１時間３０分にわたって反応させ、５０μｌのホウ酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ９.０）を添加し、１時間３０分にわたってインキュベートした。３５００ ＭＷＣＯの透析カセットを用いて透析を行った。ついでＢＳＡ－セフォタキシムの濃度をＢＣＡ反応によって測定した。

セフォタキシム－ＢＳＡを用いてマウスを免疫処理に付した。免疫化を実施するために、５０μｇのセフォタキシム－ＢＳＡ／マウスの皮下注射を３週間毎に３か月にわたって（合計で４回の免疫処理）を行った。そのマウスを２カ月休ませた後、新たにセフォタキシム－ＢＳＡの注射（５０μｇの生成物／マウス、３日間にわたって１日に１回）を該マウスに対して静脈内で行った。２日休ませた後、該マウスの脾臓細胞をＮＳ１マウスの骨髄腫細胞と融合させ、免疫酵素試験を用いて、骨髄腫培養上清中の抗－セフォタキシム特異的抗体を検出した。

Ｂ． 種々の形態のセフォタキシムの産生および精製
本発明を適切に実施するには、本発明の抗体の、無傷の形態の抗生物質および加水分解された形態の抗生物質に対する親和性の差異が最大であることが不可欠である。これを行うには、非加水分解型セフォタキシムと、加水分解型セフォタキシムとが必要であった。他方で、非加水分解型セフォタキシム－ビオチン、および加水分解型セフォタキシム－ビオチンである、特異的抗体を検出できるようにする利用可能な「トレーサー」分子もまた、必要であった。これらの分子は、アセチルコリンエステラーゼ－ストレプトアビジン（Ｇ４）と反応させることによって検出され得る。アセチルコリンエステラーゼは発色原と反応して着色基質を生成する。

非加水分解型および加水分解型セフォタキシム－ビオチンの生成
非加水分解型セフォタキシム－ビオチンは、免疫原について上記された操作を用いて、クロロアセトアミド－セフォタキシムを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アームおよびチオール官能基と結合させたビオチン（ビオチン－ＰＥＧｘ－チオール）とカップリングさせることによって得られた。クロロアセトアミド－セフォタキシム（３１.６ｍｇ、０.０６ミリモル、１当量）およびビオチン－ＰＥＧｘ－チオール（９４ｍｇ、０.１１９ミリモル、２当量）を、ＤＭＦ（０.５ｍｌ）に溶かし、次にトリエチルアミン（２μｌ）をアルゴン下で該混合物に添加した。反応物を３日間撹拌した。反応を終えたならば、混合物を減圧下で蒸発させた。次に、生成物を０～４０％の水／アセトニトリル勾配での逆相クロマトグラフィーに付して精製した（２６％アセトニトリルが単離のピーク）。このトレーサーの分子量を、Ｃ１８カラムで１５分間の精製サイクルを行い、次に試料を四重極でイオン化する、質量分析でチェックした。

加水分解型セフォタキシム－ビオチンは、組換え型β－ラクタマーゼである、ＫＰＣ－２（クレブシエラ・ニューモニエ・カルバペネマーゼ）とカップリングしたビーズを用いる酵素反応によって得られた。これを行うために、５ｍｇのビーズ（Dynabeads M-280 Tosylactivated）をホウ酸緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ９.５）で洗浄した。１００μｇの組換え型タンパク質のＫＰＣ－２を１５０μｌの容量のビーズに添加した。次に、１００μｌのホウ酸緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ９.５）と、硫酸アンモニウム（３Ｍ）とを加えた。３７℃で１６時間反応させた後、１ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ７.４）＋塩化ナトリウム（０.１５Ｍ）＋０.５％ＢＳＡを添加した。３７℃で１時間反応させた後、そのカップリングした生成物をリン酸ナトリウム緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ７.４）＋塩化ナトリウム（０.１５Ｍ）＋０.１％ＢＳＡで洗浄し、濃縮して２０ｍｇ／ｍｌのビーズとした。この生成物の酵素活性をニトロセフィンを用いて試験した。このために、２０μｌのニトロセフィン（０.５ｍＭ）を１０μｇ／ｍｌのビーズ－ＫＰＣ－２の溶液に加え、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７.４）で希釈し、全容量を２００μｌとした。２０℃で３０分間反応させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定する。その後で、非加水分解型セフォタキシム－ビオチンから出発して、５０μｌの２０ｍｇ／ｍｌでのビルス（Billes）－ＫＰＣ－２溶液を、１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌでの非加水分解型セフォタキシム－ビオチンの溶液に添加した。２５℃で１６時間反応させた後、ビーズ－ＫＰＣ－２を磁石を用いて取り除いた。上清を回収し、０～４０％の水／アセトニトリル勾配での逆相クロマトグラフィーに付して精製した（２３％アセトニトリルが単離のピーク）。このトレーサーの分子量を、Ｃ１８カラムで１５分間の精製サイクルを行い、次に試料を四重極でイオン化する、質量分析でチェックした。

非加水分解型および加水分解型セフォタキシムの製造
非加水分解型セフォタキシム（Sigma-Aldrich）を、次に０～２０％の水／アセトニトリル勾配での逆相クロマトグラフィーに付して精製した（８.５％アセトニトリルが単離のピーク）。この生成物の分子量を、Ｃ１８カラムで１５分間の精製サイクルを行い、次に試料を四重極でイオン化する、質量分析でチェックした。

加水分解型セフォタキシムもまた、ＫＰＣ－２にカップリングしたビーズでの酵素反応によって得られた。上記と同じビーズ－ＫＰＣ－２カップリングプロトコルを行った。次に、非加水分解型セフォタキシムから開始し、５０μｌの２０ｍｇ／ｍｌでのビーズ－ＫＰＣ－２溶液を、１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌでの非加水分解型セフォタキシムの溶液に添加した。２５℃で１６時間反応させた後、ビーズ－ＫＰＣ－２を磁石を用いて取り除き、該溶液を０～２０％の水／アセトニトリル勾配での逆相クロマトグラフィーに付して精製した（２.５％アセトニトリルが単離のピーク）。このトレーサーの分子量を、Ｃ１８カラムで１５分間の精製サイクルを行い、次に試料を四重極でイオン化する、質量分析でチェックした。

種々の形態のセフォタキシムの精製
すべての溶液を１ｍｌ／ｍｌの水／アセトニトリル勾配での逆相クロマトグラフィーに付して精製した。非加水分解型セフォタキシムでは、単離のピークは８.５％アセトニトリルの時である。加水分解型セフォタキシムでは、ピークは２.５％の時である。非加水分解型セフォタキシム－ビオチンでは、それは２６％の時であるのに対して、加水分解型セフォタキシム－ビオチンでは、その単離のピークは２３.５％の時である。これら４つの化合物はすべて、質量分析によって特徴付けられた。このために、それらはＣ１８カラムで１５分間のサイクル（水／アセトニトリル勾配）に付して精製され、次に四重極でイオン化される。各化合物の分子量を同定した：非加水分解型セフォタキシムのｍ／ｚは４５６であり；加水分解型セフォタキシムのｍ／ｚは４１４であり；非加水分解型セフォタキシム－ビオチンのｍ／ｚは１２４１.５であり；加水分解型セフォタキシム－ビオチンのｍ／ｚは１２８３.５である。以下の化合物が得られた：

Ｃ． 目的とする抗体の産生および選択
４匹のマウスをセフォタキシム－ＢＳＡを用いる免疫処理に付した。このことを行うために、５０μｇのセフォタキシム－ＢＳＡ／マウスの皮下注射を３週間毎に３か月にわたって（合計で４回の免疫処理）を行った。そのマウスを３カ月休ませた後、免疫応答が最も良好なマウスを選択するために、最初の試験でそれらの抗体を分析した。この試験では、免疫化プロトコルの間に採取したネズミ抗体を、マイクロ滴定プレートのウェルの壁上に固定した第１ネズミ抗－抗体抗体（AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG+IgG (H+L)；Jackson Immunoresearch LABORATORIES）で捕捉した。１００μｌの１００ｎｇ／ｍｌでの非加水分解型セフォタキシム－ビオチンを各ウェルに添加した。４℃で一夜インキュベートし、洗浄に付した後、ビオチンとカップリングした無傷のセフォタキシムの存在を、従って、非加水分解型抗－セフォタキシム抗体の存在を明らかとするために、１００μｌのストレプトアビジン－Ｇ４を１ＥＵ／ｍｌで添加した。アセチルコリンエステラーゼ（Ｇ４）活性をエルマン方法（Ellmanら、1961）で測定した。エルマン媒体は、リン酸緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ７.４）中に７.５ｘ１０^－４Ｍのヨウ化アセチルチオコリン（酵素基質）および２.５ｘ１０^－４Ｍの５,５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（チオールの熱量測定用試薬）の混合物からなる。酵素活性はエルマン単位（ＥＵ）で表される。１ＥＵは、１ｃｍの光路長について１ｍｌの媒体中にて１分間に１単位の吸光度の増加をもたらす酵素の量として定義される：それは約８ｎｇの酵素に相当する。

外界温度で１時間インキュベートし、洗浄した後、２００μｌのエルマン媒体試薬をウェルに添加する。３０分間および／または１時間経過した後、シグナル強度を測定する。この試験で得られるシグナルの強度は、非加水分解型セフォタキシム特異的抗体の量に比例する。次に最も優れた免疫応答（より高い濃度の特異的抗体）を示すマウスにセフォタキシム－ＢＳＡを新たに注射した。このために、最も優れた応答のあったマウスに生成物を、５０μｇの生成物／マウスにて、１日に１回、３日間にわたって静脈内注射した。２日間休ませた後、マウスを殺し、ハイブリドーマ（抗体および不死細胞のプロデューサー）を得るために、その脾臓細胞（脾細胞）をＮＳ１マウス骨髄腫細胞とハイブリッド形成させた（Grassi,J.、Frobert,Y.、Lamourette,P.およびLagoutte,B.、1988, 「Screening of monoclonal antibodies using antigens labeled with acetylcholinesterase: application to the peripheral proteins of photosystem 1」, Anal. Biochem. 168, 436）。

融合の終わりの際に、すべての細胞を１０枚のマイクロ滴定プレートのウェルに分配した。１週間後、各ウェルにおけるセフォタキシムを認識する抗体の存在を試験１（図１）を用いて分析した。この試験では１０７ウェルの細胞を選択して保存することができた。この選択を精緻化し、非加水分解型セフォタキシムのみを認識する抗体を産生するハイブリドーマだけを保存するために、選択されたウェルの培養上清を４種の異なる試験（図１および２：試験１～４）を用いて分析した：

試験１：この試験では、培養上清中に存在する抗体を、マイクロ滴定プレートのウェルの壁上に固定した第１ネズミ抗－抗体抗体で捕捉する。非加水分解型セフォタキシム－ビオチンを各ウェルに加える。４℃で一夜インキュベートし、洗浄に付した後、ビオチンとカップリングした非加水分解型セフォタキシムの存在を、従って、非加水分解型抗－セフォタキシム抗体の存在を明らかとするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験２：この試験では、培養上清中に存在する抗体を、マイクロ滴定プレートのウェルの壁上に固定した第１ネズミ抗－抗体抗体で捕捉する。加水分解型セフォタキシム－ビオチンを各ウェルに加える。４℃で一夜インキュベートし、洗浄に付した後、ビオチンとカップリングした加水分解型セフォタキシムの存在を、従って、加水分解型抗－セフォタキシム抗体の存在を明らかとするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験３：この試験では、培養上清中に存在する特異的抗体による認識に関して、非加水分解型セフォタキシム－ビオチンを、非加水分解型セフォタキシムと競合して置く。４℃で一夜インキュベートし、洗浄に付した後、ビオチンとカップリングした無傷のセフォタキシムの存在を明らかとするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験４：この試験では、培養上清中に存在する特異的抗体による認識に関して、非加水分解型セフォタキシム－ビオチンを試験３に使用されるのと同じ非加水分解型セフォタキシムの濃度で、加水分解型セフォタキシムと競合して置く。４℃で一夜インキュベートし、洗浄に付した後、ビオチンとカップリングした無傷のセフォタキシムの存在を明らかとするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験１および２に関して、ウェルにおけるシグナルの出現は、各々、非加水分解型抗セフォタキシム抗体、および加水分解型抗セフォタキシム抗体の存在を示す。

試験３および４に関して、阻害剤の濃度に比例したシグナルの減少は、阻害剤：非加水分解型セフォタキシム（試験３）または加水分解型セフォタキシム（試験４）を認識する抗体の存在を明らかとする。他方で、これらの試験は、非加水分解型セフォタキシムと、加水分解型セフォタキシムとに対する抗体の相対的特異性の評価を可能とする。かくして、シグナルの減少が２つの形態のセフォタキシムで類似するならば、その場合、抗体はこれらの２つの分子に対して同じ親和性を有する。シグナルの減少が２つの形態のセフォタキシムの一方に対して弱いならば、その抗体はこの形態に対して弱い親和性を有する。

ウェルは、試験１ではシグナルが得られ、試験２ではシグナルが得られないように、試験３では最大のシグナル減少が得られ、試験４ではシグナルの減少が得られないように選択された。選択プロセスの最後には、モノクローナル抗体を産生するために、１８種のハイブリドーマが保存された。

Ｄ． モノクローナル抗体の特性評価
各モノクローナル抗体の特異性を評価するために、試験３および４を、種々の濃度の非加水分解型セフォタキシムと、競合体としての加水分解型セフォタキシムとを用いて実施した。２種の形態のセフォタキシムの間の交差反応のパーセンテージを算定することによって特異性を決定した。この算定を行うために、非加水分解型セフォタキシムの濃度をシグナルの同じ減少をもたらす、加水分解型セフォタキシムの濃度で割った。例えば、シグナルの減少が、１ナノモル／ｍｌの非加水分解型セフォタキシムと、１００ナノモル／ｍｌの加水分解型セフォタキシムとによって誘発される場合、その場合、交差反応の割合は：１／１００＝０.０１、従って、１％である。

これらの試験を実施するために、以下の溶液はすべて、組成について、０.１Ｍ ｐＨ７.４ リン酸カリウム緩衝液＋０.１％ ＰＶＰ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ＋０.０１％アジ化ナトリウムを有する緩衝液で製造された。無傷のセフォタキシム－ビオチンは０.３ピコモル／ｍｌで使用された。非加水分解型セフォタキシムおよび加水分解型セフォタキシムに関して、一連の濃度：２１０ピコモル／ｍｌ；２１ピコモル／ｍｌ；２.１ピコモル／ｍｌ；０.２１ピコモル／ｍｌおよび０ピコモル／ｍｌを生成した。

溶液を９６ウェルのマイクロプレートに付着させ、その壁面にマウス抗－抗体抗体（抗体の選択実験にて使用されるのと同じもの）を、２５μｌのマーカー（無傷のセフォタキシム－ビオチン）および２５μｌの競合物質（非加水分解型または加水分解型セフォタキシム）を一のレベルで予め固定した。次に５０μｌの抗体溶液を加えた。そのマイクロプレートを４℃で一夜インキュベートし、次に洗浄した後で、１００μｌのストレプトアビジン－Ｇ４を外界温度で撹拌しながら１時間にわたって添加した。ウェルを洗浄した後、２００μｌの発色剤（エルマン媒体）を付着させた。撹拌しながら１時間インキュベートした後、分光光度計によって４１４ｎｍでの吸光度の読取りを行った。得られたグラフはｆ（［セフォタキシム］）＝％Ｂ／Ｂｏである。シグナルＢｏは競合物質の不在下で得られる吸光度（最大吸光度）に相当する。シグナルＢは競合物質およびマーカーが抗体と相互作用する媒体での吸光度である。図面を読取り易くするために、数種の抗体で得られた結果だけを示す（図３Ａおよび３Ｂ）。

１６種の抗体に関して、最も高い濃度の加水分解型セフォタキシム（２１０ピコモル／ｍｌ）で、シグナルの減少が観察されなかった。従って、交差反応は０.１％未満である（（シグナルの減少を誘発する非加水分解型セフォタキシムの最小濃度／２１０ピコモル／ｍｌ）ｘ１００）。２種の他の抗体に関して、シグナルのわずかな減少が観察され、得られた交差反応はわずかに０.００８％と０.０４５％である。

非加水分解型セフォタキシムと、種々の抗体とで得られる競合曲線は同じでないことが、図３Ａにおいて示され得る。それに対して、他の抗体では、非加水分解型セフォタキシムとで得られる競合曲線は類似している（図３Ｂ）。

従って、非加水分解型セフォタキシムと、種々の抗体とで得られる競合曲線は同じでないことが、示され得る。これは、関与する抗体が異なることを意味する。かくして、本発明の抗体の特異性は、これらの抗体の結合部位の特定のタンパク質配列と関連付けられるものではない。かかる抗体を選択することを可能とするのは、免疫原の設計と、選ばれる選択方法とである。

これらの１８種の抗体の中で、非加水分解型セフォタキシムに対して最も親和性の大きな抗体（抗体３）を、活性化セファロスポリナーゼ検出試験を開発するために選択した。

選択の終わりに保持されなかった抗体の特異性も分析した。図４は、この保持されなかった抗体について、加水分解型セフォタキシムが、非加水分解型セフォタキシムよりもシグナルの減少がより大きいことを示し、このことは後者の形態が保持されなかった抗体によってあまり認識されないことを意味する。

Ｅ． 本発明によるβ－ラクタマーゼ活性検出試験
次に、選択された抗体（抗体１；２；３；４および５）を競合による試験ストリップに用いた。

上記されるように、ストリップは、４つの異なる部分：
１）試料を付着させるための試料紙（ＳＰ）；
２）標識された抗体（トレーサーとも称される）を乾燥させるコンジュゲート紙（ＣＰ）；この紙は、トレーサー抗体が液状フォーマットにて使用される場合に、アクセサリーとすることができる。この場合には、ストリップに付着させる前に、１０μｌのトレーサー抗体を１００μｌの試料に加える。
３）２本のライン（試験ライン（ＴＬ）：ＢＳＡ－無傷のセフォタキシム；コントロールライン（ＣＬ）：抗－抗体抗体トレーサー）を有するニトロセルロース膜（ＭｂＮＣ）
４）ストリップを通して試料の移動を可能とする吸収紙（ＡＰ）
から構成される。

試験ストリップのパラメータ
以下の溶液はすべて、組成が、０.１Ｍ ｐＨ８ トリス緩衝液／ＨＣＬ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ＋０.５％ツィーン２０＋１％チャプス（chaps）＋０.０１％アジ化ナトリウムである、緩衝液ストリップ（buffer strip）にて製造された。それにより、細菌の溶解およびその中身（例えば、酵素）の放出が可能となる。

次の３つのパラメータを最適化した：
－ トレーサーの量： 選ばれた抗体をコロイド金（着色マーカー）とカップリングさせ、その吸光度は５３０ｎｍで測定され得る。このために、結果では、コロイド金に対する吸光度（ＤＯ）なる語が利用される。そのために数種のＤＯが試験された。その目的は、試料をストリップに付着させてから１０分後に有意なシグナルが観察され得ることを可能とする、トレーサーの最小量を決定することであった。
－ ＢＳＡ－無傷のセフォタキシムのＴＬ上にある量： 抗体のＤＯを確定してから、数種の濃度のＢＳＡ－無傷のセフォタキシムをＴＬ上で試験した（１μＬ／ｃｍ）。その目的は、ＴＬで観察されるシグナルに対して制限のない最低濃度を確定することであった。
これら２つのパラメータの最適化は、選択された５種の抗体についても実施された。しかしながら、図面を簡略化するために、抗体３で得られた結果だけを報告した。

－ 試料に添加された非加水分解型セフォタキシムの量： 上記の２つのパラメータを決定した。その目的は、ＴＬ上でシグナルが観察されない無傷のセフォタキシムの最小濃度を確定することであった。並行して、抗体が非加水分解型の形態に対して本当に特異的であることを確認するために、加水分解型セフォタキシムを添加した。このために、一連の非加水分解型セフォタキシムおよび一連の加水分解型セフォタキシムを、緩衝液のストリップ：１０００ｎｇ／ｍｌ；１００ｎｇ／ｍｌ；１０ｎｇ／ｍｌ；１ｎｇ／ｍｌで製造した。

これら３つのすべてのパラメータについて、色相強度スケールを用いて、試験ストリップで得られた結果を評価した。このスケールは１～１０で定義され、各値はシグナル強度の増加に特徴的である。

これらすべての試験には、９６ウェルのマイクロプレートを用いた。試験を開始するために、１０μｌの液状形態のトレーサーを、１００μｌのセフォタキシムを含有する、または含有しない緩衝液に加えた。次に、試料紙、ニトロセルロース膜および吸収紙から構成されるストリップをウェルに付着させた。１０分間のインキュベーションを行い、ついでシグナル強度を色相強度スケールで評価した。

結果
トレーサーのＤＯを最初に最適化した。１ｍｇ／ｍｌのデフォルト濃度のＢＳＡ－無傷のセフォタキシムをＴＬ上に付着させた。試験結果を表１に示す。

十分なシグナル強度を得るために、強度スケール８.５／９に位置付けられる、ＤＯ：１が選択された。

次に、種々の濃度のＢＳＡ－非加水分解型セフォタキシムをＴＬ上に付着させた（１μＬ／ｃｍ）。トレーサー用に予め選択した濃度のＤＯ：１を使用した。

シグナルの強度は、ＢＳＡ－セフォタキシムの濃度が０.１ｍｇ／ｍｌを超えると極めて弱く増加するに過ぎない。これがこの濃度を選択した理由である。パラメータをより正確に調整するために、種々の量のトレーサーをこの量のＢＳＡ－セフォタキシムで試験した。

これらの結果を鑑みて、得られるシグナルは約８.５であったため、ＴＬ上のＢＳＡ－セフォタキシムの濃度は０.１ｍｇ／ｍｌを、トレーサーのＤＯは０.５を保持した。

ついで、試料に使用する非加水分解型セフォタキシムの濃度を決定した。ＴＬ上で得ることのできる最大シグナルを確認するために、対照（０ｎｇ／ｍｌの条件）を生成した（表４）。

非加水分解型セフォタキシムの場合、ＴＬ上でシグナルが可視できる濃度は１ｎｇ／ｍｌである。シグナルの完全な消失（トレーサー抗体のすべての認識部位の占有）を可能とする最低濃度は、従って、１０ｎｇ／ｍｌである。

加水分解型セフォタキシムの場合、シグナルは対照と同等である（トレーサーがＴＬ上で自ら結合する）。予想されるように、加水分解型セフォタキシムは、結合部位がフリーで、ＴＬのセフォタキシムと一体化するために、トレーサー抗体で認識されない。

次に、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＳＡ－セフォタキシムを用い、セフォタキシムの加水分解の速度論を研究した。同じ濃度の加水分解型セフォタキシムでは、シグナルの減少は観察されなかった。従って、試料ウェルでのセフォタキシムの加水分解は、ＴＬでシグナルの増加をもたらす。

一例として、他の抗体を試験した。抗体を使用する条件は次のとおりである：抗体１、ＤＯ０.５、０.３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－セフォタキシム；抗体２、ＤＯ１、０.３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－セフォタキシム；抗体３、ＤＯ０.５、０.１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－セフォタキシム；抗体４、ＤＯ０.５、０.３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－セフォタキシム；抗体５、ＤＯ０.５、０.３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－セフォタキシム（表５）

これらの結果を鑑みて、抗体３は、最も低い濃度の酵素でも酵素活性を検出できたため、ストリップ様式では最高の性能を示した。しかしながら、この結果は、他の抗体がこの方法の状況下にあっても使用され得ることを示す。残りの開発と最適化には、抗体３のみを用いた。

組換え酵素を用いた加水分解速度論
試験ストリップのパラメータが定められると、加水分解速度論が認識された。この研究では、エシェリヒア・コリから由来のＥＳＢＬである酵素ＣＴＸＭ－２を用いた。これらの速度論を研究する目的は、陽性シグナル「＋」（ＴＬ上で可視化されるシグナル）を出来るだけ早く、可能な限り低い酵素濃度で得るのに成功するためである。

これらの試験を実施するために、下記の溶液はすべて、組成が、０.１Ｍ ｐＨ８ トリス緩衝液／ＨＣＬ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ＋０.５％ツィーン２０＋１％チャプス＋０.０１％アジ化ナトリウムである、緩衝液ストリップにて製造された。それは細菌の溶解およびその中身の放出を可能とする。

使用される濃度は１０ｎｇ／ｍｌ；３ｎｇ／ｍｌ；１ｎｇ／ｍｌ；０.３ｎｇ／ｍｌ；０.１ｎｇ／ｍｌの酵素であり、それらを外界温度で無傷のセフォタキシムと共にインキュベートする。無傷のセフォタキシムのみ（トレーサーの結合部位のすべてが占有されているため、ＴＬ上でシグナルは観察されないはずである）、または緩衝液ストリップのみ（トレーサーの結合部位がすべてフリーであるため、ＴＬ上で最大シグナルが得ることができる）のいずれかを含有する２種の対照も生成する。

この研究では、第１工程にて、トレーサーを液体形態にて添加し（ＤＯ：０.５で１０μｌを１００μｌの酵素溶液に添加し）、次に第２工程にて、乾燥した様式にてコンジュゲート紙上に添加する（ＤＯ：０.９で１０μｌ）。次に、そのコンジュゲート紙を試料紙とニトロセルロース膜との間のストリップに挿入した。このために、コンジュゲート紙（ＣＰ）を含むか、または含まない、２種類のストリップを用いた。各実験では、どちらの型のストリップが使用されたかを示した。ニトロセルロース膜上のＴＬは、０.１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－非加水分解型セフォタキシムで構成される。種々の条件を整え、次に外界温度でインキュベートした。インキュベーション時間が経過したらすぐに、１００μｌの溶液をサンプリングし、マイクロプレートのウェルに、またはプラスチック製カセットの付着ウェルのいずれかに付着させた。

試料は、０分間；１５分間；３０分間；４５分間；６０分間のインキュベーションの後に試験された。試験ストリップの読取りは１０分間移動させた後になされた。ＴＬ上のシグナルは「Ｐ」と考えられる。ＴＬ上にシグナルのないことは「Ｎ」と考えられる。最初の加水分解動態は外界温度で作成された。試験は、９６ウェルのマイクロプレートにて、１００μｌの試料＋１０μｌのトレーサーを用いて、液体様式にて実施された。ＣＰを含まないストリップをウェルに付着させた。無傷のセフォタキシムの濃度は１０ｎｇ／ｍｌで、トレーサーのＤＯは０.５である（表６）。

シグナルは１０ｎｇ／ｍｌの酵素で１５分間、３ｎｇ／ｍｌの酵素で４５分間インキュベートした後に可視できる。同じ実験を、この時間であるが、３７℃でインキュベートして実施された（表７）。

表７から、３７℃でのインキュベーションは結果に影響を及ぼさないことが分かる。これが外界温度でのインキュベーションを選択した理由である。

取り扱う量を制限し、かくして試験の使用を容易にするために、トレーサーをＣＰ上で乾燥させた。再び溶解させた後、トレーサー抗体の一部がＣＰによって吸収されることが観察された。この吸収を補うために、トレーサーの使用量を増やす必要があった。この最初の試験で、ＣＰ上の最終トレーサーのＤＯは０.９であった。試験は９６ウェルのマイクロプレートで、１００μｌの試料を用いて行われた。非加水分解型セフォタキシムの濃度は１０ｎｇ／ｍｌであった。新たな加水分解動態がこのプロトコルで生成された（表８）。

シグナルは、３ｎｇ／ｍｌの酵素で１５分後に、１ｎｇ／ｍｌの酵素で４５分後に観察された。トレーサーを乾燥した様式に変更し、ＤＯを増大させることで、ＴＬ上の可視可能なシグナルを確認するために必要な酵素の濃度を下げることが可能となった。

試験の性能を常に改善することを目的として、ＣＰでのトレーサーの量を、ＤＯ：１で１０μｌ（表９）、またはＤＯ：１.５で１０μｌ（表１０）のいずれかであるように増大させた、２種の他の加水分解速度論を作成した。この研究では、ストリップをプラスチック製カセットに挿入し、１００μｌの試料を付着ウェルに付着させた。非加水分解型セフォタキシムの濃度は１０ｎｇ／ｍｌであった。結果は次のとおりであった。

トレーサーのＤＯを増加させることで、ＴＬ上で可視可能なシグナルを得るために必要とされる酵素の濃度を下げることが可能となった。ＤＯ１.５は、１ｎｇ／ｍｌで１５分後に検出され、より良い結果を示す。

得られた結果から、ＤＯ１.５が１５分間のインキュベーション後に酵素ＣＴＸＭ－２の１ｎｇ／ｍｌの検出限界を可能としたことが分かる。

適合の最終決定および試験ストリップの細菌コロニーでの妥当性確認
試験ストリップの適合を最終決定し、細菌コロニーでのその妥当性確認を行うために、２工程を実施した：

－ ＥＳＢＬ型細菌耐性を同定するために、非加水分解型セフォタキシムと細菌コロニーとのインキュベーション時間の同定
これらの試験を実施するために、下記の溶液はすべて、組成が、０.１Ｍ ｐＨ８ トリス／ＨＣＬ緩衝液＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ＋０.５％ツィーン２０＋１％チャプス＋０.０１％アジ化ナトリウムであり、それで細菌の溶解およびその中身の放出を可能となる、緩衝液ストリップにて製造された。

非加水分解型セフォタキシムの濃度は、緩衝液ストリップ中にて、１０ｎｇ／ｍｌであった。非加水分解型セフォタキシムのみ、または緩衝液ストリップのみのいずれかを含有する、２種の対照も生成した。トレーサーをＣＰ上で乾燥させた。ＴＬは０.１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－非加水分解型セフォタキシムで構成された。移動はプラスチック製カセットによって行われる。

１５０μｌの非加水分解型セフォタキシム溶液をサンプリングし、エッペンドルフ試験管に付着させた。細菌コロニーをＬＢ寒天から１μｌのオッセー（ｏｓｅ）でサンプリングし、ついで予め製造したエッペンドルフ試験管に付着させた。該試験管を５秒間かき混ぜ、次に外界温度で所望のインキュベーション時間にわたってインキュベートした。試料を５分間；１０分間；２０分間；３０分間にわたってインキュベートした後に試験した。インキュベーションを終えるや否や、１００μｌをサンプリングし、ストリップ上に付着させた。１０分間移動させた後に読取りを行った。ＴＬ上のシグナルは「Ｐ」であると考えられた。ＴＬ上にシグナルがない場合は「Ｎ」として規定された。

得られた結果を表１１に示す。３種の群：ＥＳＢＬの群、カルバペネマーゼの群（無傷のセフォタキシムをも分解する）、およびセフォタキシムに対して耐性のない細菌の群が定義された。

非耐性細菌の群では３０分間のインキュベーションの後に、ＴＬ上に可視可能なシグナルはなかった。ＥＳＢＬおよびカルバペネマーゼ群では、ＴＬ上に弱いシグナルを示した２つの細菌コロニーを除き、細菌コロニーはすべて、２０分間のインキュベーションの後に検出された。３０分間で、いわゆる耐性コロニーはすべて、本発明者らの試験では陽性であった。

得られた結果を考慮して、３０分間のインキュベーション時間を選択した。このインキュベーション時間を適用すると、耐性コロニーはすべてが陽性であり、非耐性コロニーは陰性である。従って、該試験ストリップは、細菌コロニーでの使用にうまく適合している。

－ 第３世代セファロスポリン（３ＧＣ）に対して感受性または耐性である、細菌株に対する試験ストリップの妥当性確認
試験ストリップのその臨床使用についての細菌コロニーに対する妥当性確認を行うために、セファロスポリンに対して耐性のある細菌株を用いた。

これらの試験を実施するために、下記の溶液はすべて、組成が、０.１Ｍ ｐＨ８ トリス緩衝液／ＨＣＬ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ＋０.５％ツィーン２０＋１％チャプス＋０.０１％アジ化ナトリウムである、緩衝液ストリップにて製造された。使用される非加水分解型セフォタキシムの濃度は、緩衝液ストリップ中で２５ｎｇ／ｍｌである。トレーサーはＣＰ上で乾燥した様式である。ＴＬは０.１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ－非加水分解型セフォタキシムで構成された。ＣＬが生成された。それは抗トレーサー抗体を構成する。移動はプラスチック製カセットにて行われる。

試験を実施するために、１５０μｌの非加水分解型セフォタキシム溶液をエッペンドルフ試験管に移した。細菌コロニーをＵＲＩ－４寒天から１μｌのオッセーでサンプリングし、ついで予め製造したエッペンドルフ試験管に付着させた。該試験管を５秒間かき混ぜ、次に外界温度で３０分間にわたってインキュベートした。インキュベーションを終えるや否や、１００μｌをサンプリングし、ストリップ上に付着させた。１０分間移動させた後に読取りを行う。ＴＬ上のシグナルは「Ｐ」であると考えられる。ＴＬ上にシグナルがないのは「Ｎ」と規定された。

結果を分析するために、細菌を２群：セフォタキシムを加水分解しないβ－ラクタマーゼ産生菌と、セフォタキシムを加水分解するβ－ラクタマーゼ産生菌に分けた（表１２）。

試験してセフォタキシムを加水分解できない３８個の菌株は陰性であった。従って、擬陽性はなかった。セフォタキシムを加水分解できる３００個の菌株では、すべての菌株がＴＬ上にてシグナルを示した。

結論
試験条件下で、本発明のストリップ試験は、４０分間（インキュベーション＋移動時間）でセファロスポリナーゼ活性の検出に対して１００％の感度および１００％の特異性を得ることができた。この性能は、臨床学的および獣医学的診断において、また環境評価の面で用いるのに最適である。

実施例２：カルバペネムに対して耐性のある菌の検出
Ａ． 免疫原の設計および生成
１）アルキン型カルバペネム（S. Saidjalolov、Chem. Eur. J., 2021）は、抗体を得るのに不可欠な、免疫応答の誘発能を有しない小型分子である。従って、この抗生物質をより大型の免疫原性分子のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とカップリングさせることが必要であった。免疫原Ａと称される、免疫原（カルバペネム－ＢＳＡ）の生成は、２工程：ＢＳＡアジドを生成することからなる工程１ａと、ＢＳＡアジドをアルキン型カルバペネムとカップリングさせる工程２ａとで実施される。

２）並行して、免疫原Ｂと称される、もう一つ別の免疫原（カルバペネム－ＢＳＡ）が別の化学反応で生成された。この第２免疫原の生成は、３工程：ＳＭＣ－ＢＳＡを生成することからなる工程１ａと、次にアミン－カルバペネム（Iannazzo Lら、2016）をＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル Ｓ－アセチルチオアセテート）とカップリングさせる工程２ａと、ＳＭＣ－ＢＳＡをＳＡＴＡ－カルバペネムとカップリングさせる工程３ａとでなされた。

３）免疫原Ａを用いてマウスに免疫性を付与した。免疫付与を行うために、５０μｇの免疫原Ａ／マウスの皮下注射を３週間毎に３か月にわたって実施した（合計で４回の免疫付与）。マウスを２カ月間休ませた後、免疫原Ａの新たな静脈内注射を、該マウスに対して、５０μｇの生成物／マウスの量で、１日に１回、３日間にわたって行った。２日間休ませた後、マウスの脾臓細胞をＮＳ１マウス骨髄腫細胞と融合させ、骨髄腫培養上清中にある抗－カルバペネム特異的抗体を免疫酵素試験を用いて検出した。

Ｂ． 種々の形態のカルバペネムの産生および精製
本発明を適切に実施するには、本発明の抗体の、無傷な形態または加水分解された形態の抗生物質に対する親和性の違いが最大であることが不可欠である。このためには、加水分解型カルバペネムと、非加水分解型カルバペネムとを入手する必要があった。

非加水分解型および加水分解型カルバペネム－ビオチンの生成
１） 非加水分解型カルバペネム－ビオチンは、アミン－カルバペネムと、ビオチンアミドヘキサン酸 Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル（ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン）とをカップリングさせることで得られた。化学反応は、アミンカルバペネムのＮＨ_２基と、ビオチンのＮ－ヒドロキシ－スクシンイミド基との間で引き起こされる。得られた生成物をトレーサーＡと称する。
２） 加水分解型カルバペネム－ビオチン（トレーサーＡ Ｈ）は、組換えβ－ラクタマーゼである、ＫＰＣ－２（クレブシエラ・ニューモニエ・カルバペネマーゼ）とカップリングしたビーズを用いる酵素反応により得られた。これを行うために、５０μｌのビーズ－ＫＰＣ－２の２０ｍｇ／ｍｌでの溶液を、１ｍｌのトレーサーＡ ＮＨの溶液に２ｍｇ／ｍｌで添加した。２５℃で１６時間反応させた後、ビーズ－ＫＰＣ－２を磁石を用いて除去した。トレーサーＡ Ｈを含有する上清を取り出し、逆相クロマトグラフィーで精製した。このトレーサーの分子量を質量分析で確認した。

３） 並行して、別の非加水分解型カルバペネム－ビオチンをもう一つ別の化学的方法によって生成した。それは、アルキン型カルバペネムを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アームおよびアジド官能基にカップリングさせたビオチン（ビオチン－ｄＰＥＧ（登録商標）７－アジド）とカップリングさせることで生成された。得られた生成物はトレーサーＢ ＮＨと称される。

４） 加水分解型カルバペネム－ビオチン（トレーサーＢ Ｈ）は、組換えβ－ラクタマーゼである、ＫＰＣ－２（クレブシエラ・ニューモニエ・カルバペネマーゼ）とカップリングさせたビーズを用いる酵素反応により得られた。このことを行うために、５０μｌのビーズ－ＫＰＣ－２の２０ｍｇ／ｍｌでの溶液を１ｍｌのトレーサーＡ ＮＨの溶液に２ｍｇ／ｍｌで添加した。２５℃で１６時間反応させた後、ビーズ－ＫＰＣ－２を磁石を用いて除去した。トレーサーＢ Ｈを含有する上清を取り出し、逆相クロマトグラフィーで精製した。このトレーサーの分子量を質量分析で確認した。

非加水分解型および加水分解型カルバペネムの生成
１） 抗体を選択するのに非加水分解型カルバペネムはメロペネム（Sigma-Aldrich）を用いる。非加水分解型メロペネムは、０～２０％の水／アセトニトリル勾配での逆相クロマトグラフィーに付して精製した（７.８％アセトニトリルが単離のピーク）。
２） 加水分解型メロペネムも、ＫＰＣ－２とカップリングしたビーズを用いる酵素反応によって得られた。得られた分子の分子量を質量分析で確認した。
３） 同じ操作を４種の他のカルバペネム系、すなわち、エルタペネム、テビペネム、ドリペネムおよびイミペネムで実施した。
４） 図８に記載の化合物を用いた。

Ｃ． 目的とする抗体の産生および選択
４匹のマウスを免疫原Ａで免疫処理に付した。これを行うために、５０μｇの免疫原Ａ／マウスの皮下注射を３週間毎に３か月にわたって実施した（合計で４回の免疫付与）。マウスを３カ月間休ませた後、最も優れた免疫応答を示すマウスを選択するために、それらの抗体を第１試験で分析した。この試験では、免疫付与プロトコルの間に採取されたネズミ抗体は、緩やかに撹拌しながら外界温度で４時間にわたってインキュベーションを行うことにより、マイクロ滴定プレートのウェルの壁面に固定された、第１ネズミ抗－抗体抗体（AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG + IgM（H+L）；Jackson Immunoresearch LABORATORIES）によって捕捉された。洗浄後、１００μＬのトレーサーＡ ＮＨを５０ｎｇ／ｍｌで各ウェルに加え、インキュベーションを４℃で一夜にわたって行った。洗浄後、１００μＬのストレプトアビジン－Ｇ４を１ＥＵ／ｍＬで添加し、トレーサーＡ ＮＨの存在を、従って非加水分解型抗－カルバペネム抗体の存在を明らかにした。アセチルコリンエステラーゼ（Ｇ４）活性をエルマン方法（Ellmanら、1961）で測定した。エルマン媒体は、７.５・１０^－４Ｍのヨウ化アセチルチオコリン（酵素基質）および２.５・１０^－４Ｍの５,５'－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）（チオールの熱量測定のための試剤）のリン酸緩衝液（０.１Ｍ，ｐＨ７.４）中の混合物からなる。酵素活性はエルマン単位（ＥＵ）で表される。１ＥＵは、１ｃｍの光路長で、１ｍｌの培地中にて１分間に１単位の吸光度の増加をもたらす酵素の量として定義され；それは約８ｎｇの酵素に相当する。

外界温度で１時間インキュベートし、洗浄した後、２００μｌのエルマン媒体試剤をウェルに加える。シグナル強度を１時間後に測定する。ここで、この試験の間に得られるシグナルの強度はトレーサーＡ ＮＨ特異的抗体の量に比例する。最も優れた免疫応答（最大濃度の特異的抗体）を示したマウスに、免疫原Ａを新たに静脈内注射した（５０μｇの生成物／マウス、一日に一回を３日間）。２日間の休息の後、該マウスを殺し、それらの脾細胞（脾臓細胞）を、ハイブリドーマを得るためにＮＳ１マウス骨髄腫細胞と雑種形成させた。

融合の終わりに、すべての細胞を１０枚のマイクロ滴定プレートのウェルに分配した。１週間後、各ウェルにおいてトレーサーＡ ＮＨを認識する抗体の存在を試験１を用いて分析した（図６）。この試験で、非加水分解型抗カルバペネム抗体を産生する９３個のウェルから細胞を選択し、保存することが可能となった。この選択を精緻化し、非加水分解型メロペネムに対して特異的な抗体を産生するハイブリドーマを保持するために、選択したウェルの培養上清を４つの異なる試験を用いて分析した（図６）：

試験１：この試験では、培養上清中に存在する抗体をマイクロ滴定プレートのウェルの壁面に固定した第１ネズミ抗－抗体抗体で捕捉する。インキュベーションを撹拌下にて外界温度で４時間行う。洗浄した後、トレーサーＡ ＮＨ－ビオチンを各ウェルに加える。４℃で一夜インキュベートし、洗浄した後、トレーサーＡ ＮＨの存在を、従って非加水分解型抗－セフォタキシム抗体の存在を明らかにするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験２：この試験では、培養上清中に存在する抗体をマイクロ滴定プレートのウェルの壁面に固定した第１ネズミ抗－抗体抗体で捕捉する。インキュベーションを撹拌下にて外界温度で４時間行う。洗浄した後、トレーサーＡ Ｈを各ウェルに加える。４℃で一夜インキュベートし、洗浄した後、トレーサーＡ Ｈの存在を、従って加水分解型抗－セフォタキシム抗体の存在を明らかにするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験３：この試験では、培養上清中に存在する特異的抗体による認識に関して、トレーサーＡ ＮＨを非加水分解型メロペネムと競合するように置く。これを行うために、培養上清中に存在する抗体をマイクロ滴定プレートのウェルの壁面に固定した第１ネズミ抗－抗体抗体で捕捉する。インキュベーションを撹拌下にて外界温度で４時間行う。洗浄した後、トレーサーＡ ＮＨおよび非加水分解型メロペネムを各ウェルに加える。４℃で一夜インキュベートし、洗浄した後、トレーサーＡ ＮＨの存在を明らかにするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験４：この試験では、培養上清中に存在する特異的抗体による認識に関して、トレーサーＡ ＮＨを、試験３にて使用される非加水分解型メロペネムと同じ濃度の、加水分解型メロペネムと競合するように置く。これを行うために、培養上清中に存在する抗体をマイクロ滴定プレートのウェルの壁面に固定した第１ネズミ抗－抗体抗体で捕捉する。インキュベーションを撹拌下にて外界温度で４時間行う。洗浄した後、トレーサーＡ ＮＨおよび加水分解型メロペネムを各ウェルに加える。４℃で一夜インキュベートし、洗浄した後、トレーサーＡ ＮＨの存在を明らかにするために、ストレプトアビジン－Ｇ４を添加する。

試験１および２で、ウェルにシグナルが出現することは、各々、非加水分解型抗－カルバペネム抗体、および加水分解型抗－カルバペネム抗体が存在することを示す（図９を参照のこと）。

試験３および４で、阻害剤の濃度に比例するシグナルの減少は、阻害剤：非加水分解型メロペネム（試験３）または加水分解型メロペネム（試験４）を認識する抗体の存在を明らかにする。これらの試験は、非加水分解型メロペネムおよび加水分解型メロペネムに対する抗体の相対的特異性を評価することを可能とする。かくして、シグナルの減少が２種の形態のメロペネムについて類似する場合、抗体はこれらの２種の分子に対して同じ親和性を有することとなる。シグナルの減少が２種の形態のメロペネムのうちの１つで弱い場合、その時には抗体はこの形態に対して弱い親和性を有する（図９）。

試験１ではシグナルが得られ、試験２ではシグナルがなく、試験３ではシグナルの最大シグナルが減少し、試験４ではシグナルの減少がない、ウェルが選択された。選択プロセスの終わりの際に、モノクローナル抗体を産生するために、２０種のハイブリドーマを保存した。

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Claims (17)

1. 試料中の機能的な、好ましくは広域スペクトルのβ－ラクタマーゼ酵素の存在を検出する方法であって、無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質の分子を特異的に認識するが、同じ抗生物質の分子であっても加水分解されている場合には認識しない、少なくとも１のモノクローナル抗体を使用しており、該抗生物質の分子が該抗体によって特異的に認識される無傷のβ－ラクタム環を含有する、方法。
2. 以下の工程：
   ａ）該試料を無傷のβ－ラクタム環を含有する該抗生物質の分子と接触して置く工程、
   ｂ）該モノクローナル抗体を、工程ａ）の終わりに得られた試料と接触して置く工程、
   ｃ）該モノクローナル抗体が該無傷の抗生物質と複合体を形成しているかどうかを検出する工程
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 以下の工程：
   ａ）試験される試料を、未標識の無傷のβ－ラクタム環を含有する該抗生物質の分子と接触して置く工程、
   ｂ）工程ａ）の後に得られた試料を、固体支持体上に予め固定されている、該抗体と接触して置く工程、
   ｃ）標識された無傷のβ－ラクタム環を含有する該抗生物質の分子を、該抗体と、または該抗体を含有する工程ｂ）の試料と接触して置く工程、
   ｄ）該抗体が、工程ｃ）にて加えられた該抗生物質の分子と複合体を形成しているかどうかを検出する工程
   を、この順序で含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 以下の工程：
   ａ）試験される試料を、未標識の無傷のβ－ラクタム環を含有する該抗生物質の分子と接触して置く工程、
   ｂ）工程ａ）の後に得られた試料を、標識されている該抗体と接触して置く工程、
   ｃ）工程ｂ）の溶液を、固体支持体に固定されている無傷のβ－ラクタム環を含有する該抗生物質の分子と接触して置く工程、
   ｄ）該標識されている抗体が、工程ｃ）において接触して置かれた無傷の抗生物質と複合体を形成しているかどうかを検出する工程
   を、この順序で含む、請求項２に記載の方法。
5. 以下の工程：
   ａ）試験される試料を、未標識の無傷のβ－ラクタム環を含有する該抗生物質の分子と接触して置く工程、
   ｂ）工程ａ）の後に得られた試料を、標識されている該抗体と、およびβ－ラクタマーゼ酵素を特異的に認識する少なくとも１の標識されている抗体と接触して置く工程、
   ｃ）工程ｂ）の溶液を、固体支持体に固定されている、無傷のβ－ラクタム環を含有する該抗生物質の分子、およびβ－ラクタマーゼ酵素を特異的に認識する抗体と接触して置く工程、
   ｄ）標識されている該抗体が、工程ｃ）において接触して置かれている、無傷の抗生物質と、および／または抗－β－ラクタマーゼ抗体と複合体を形成しているかどうかを検出する工程
   を、この順序で含む、請求項４に記載の方法。
6. 試料が細菌を含有することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 該固体支持体がストリップであることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 該抗体が、β－ラクタム環が無傷である、セフォタキシムまたはメロペネムを特異的に認識することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
9. １）無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質の分子を特異的に認識する少なくとも１の抗体が付着されており、該抗体は同じ抗生物質の分子であっても加水分解されている場合には認識せず、該抗体は予め標識されている、試料を付着させるゾーンと、
   ２） － 付着ゾーン１）に付着させた少なくとも１の抗体を産生するのに使用される、無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質が固定されている、少なくとも１本の試験ラインと、
   － ゾーン１）に存在する抗体を認識する抗体が固定されている、コントロールラインとを
   含む反応ゾーンと、
   ３）抗体の移動を容易にし、付着ゾーン１）の反対端に位置する吸収ゾーンと
   を含有する、ストリップ。
10. β－ラクタマーゼ酵素を認識する抗体もまた、好ましくは付着ゾーン１）に、および反応ゾーンの第２試験ラインに付着および／または固定されている、請求項９に記載のストリップ。
11. － 試料を付着させるゾーン１）であって、その上にまた、β－ラクタマーゼ酵素を認識する抗体を付着させ、ここで該抗体は予め標識されている、ゾーン１）と、
    － 少なくとも１の試験ラインをさらに含み、その上にβ－ラクタマーゼ酵素を認識する抗体が固定されている、反応ゾーン２）とを含有し、
    ゾーン１）で付着した抗－β－ラクタマーゼ抗体、および反応ゾーン２）に固定された抗－β－ラクタマーゼ抗体が、好ましくは、同じβ－ラクタマーゼ酵素の異なるエピトープを検出する、
    請求項１０に記載のストリップ。
12. 該抗体が、β－ラクタム環が無傷である、セフォタキシムまたはメロペネムを特異的に認識することを特徴とする、請求項９、１０または１１の一項に記載のストリップ。
13. － 請求項９、１０、１１または１２にて定義される少なくとも１のストリップと、
    － ストリップの付着ゾーン１）に固定されている抗体を得るのに使用される、無傷のβ－ラクタム環を有する抗生物質を含有する別の容器とを含有し、
    － 所望により、β－ラクタマーゼ酵素および／またはβ－ラクタマーゼ酵素を含有しない試料を含有する、別の容器を含有してもよい
    キット。
14. 試料中の機能的な、好ましくは広域スペクトルのβ－ラクタマーゼ酵素の存在を検出するための、無傷のβ－ラクタム環を含有する抗生物質の分子を特異的に認識するモノクローナル抗体の使用であって、該抗体は同じ抗生物質の分子であっても加水分解されている場合には認識しない、モノクローナル抗体の使用。
15. 抗体が、β－ラクタム環が無傷である場合に、ペニシリン系、セファロスポリン系、モノバクタム系、カルバペネム系およびセファマイシン系より選択される抗生物質の分子を特異的に認識することを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
16. 抗体が、β－ラクタム環が無傷である場合に、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、メチシリン、ジクロキサシリン、フクロキサシリン、アモキシシリン、アンピシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アズロシリン、カルベニシリン、セファレキシン、セファロチン、セファゾリン、セファクロール、セフロキシム、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セフトリアキソン、セフィキシン、セフォタキシム、セフタジジム、セフェピム、セフタロリン、セフトビプロール、セフピロム、チエナマイシン、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、アズトレオナム、セフメタゾールおよびラタモキセフより選択される抗生物質の分子を特異的に認識することを特徴とする、請求項１４または１５に記載の使用。
17. 抗体が、β－ラクタム環が無傷である場合に、セフォタキシムまたはメロペネムを特異的に認識することを特徴とする、請求項１４～１６の一項に記載の使用。

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