JP2024503140A - Hsv治療用ワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、対象においてHSV1に対する交差反応性免疫応答を生成する際の使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントに関する。また、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を生成する際の使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントも提供される。【選択図】なし
Description
本発明は、対象におけるHSV感染を治療するための単純ヘルペスウイルス(HSV1及びHSV2を含むHSV)Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントに関する。特に、本発明は、対象においてHSV-1又はHSV-2に対する交差反応性免疫応答を誘導することができるHSV2若しくはHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントを提供する。
単純ヘルペスウイルス(HSV、HSV1及びHSV2を含む)は、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)のアルファヘルペスウイルス亜科(Alphaherpesvirinae)(α-ヘルペスウイルス)のメンバーである。単純ヘルペスウイルスは、機能性タンパク質をコードする少なくとも74の遺伝子を含有するエンベロープを持つ二本鎖DNAウイルスである。HSV1及びHSV2は粘膜上皮細胞に感染し、一次感染が起こった粘膜を神経支配する感覚ニューロンにおいて生涯の持続性感染を樹立する。HSV1とHSV2は双方とも、神経細胞体で樹立された潜伏期から定期的に再活性化することができ、口唇ヘルペス(単純疱疹)又は性器ヘルペス(GH)のいずれかを招く。
性器ヘルペスの世界的な有病率は、15歳から49歳の間の個体で4億1700万人と推定されるが、疾患の負担はアフリカにおいて不釣り合いに大きい。HSV1は、資源保有国における初回の性器ヘルペスの原因として、HSV2とおよそ同じくらい一般的である。再発感染については、HSV1後ではHSV2性器感染ほど一般的ではない。したがって、HSV2は依然として再発性器ヘルペスの優勢な原因のままである。重度で頻発の陰部潰瘍を有する感染個体もいれば、一方、軽度又は無症状感染を有する個体もいるが、全ての個体が性器ヘルペスをその親密なパートナーに伝染させるリスクがある。
再発GHとは、仙骨神経節からのHSV2(及びある程度のHSV1)の再活性化、これに続くニューロン軸索に沿ったウイルスカプシドの順方向の遊走の結果であり、したがって、ウイルス粒子の集合体、細胞間融合、ウイルス拡散及び生殖器粘膜からの周囲上皮細胞の感染にいたる。
抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、バラシクロビル及びファムシクロビルは、一次感染又は再発感染の両方で及びHSV1又はHSV2の起源に関係なく、GHの治療に使用される。これらの薬物は、作用に関するそれらの生物学的メカニズムがウイルス複製機構をブロック又は妨害するので、宿主からウイルスを根絶するわけではない。無作為化比較試験が実証したところは、これら3種の薬物のいずれかを用いた短期治療によると、再発の症状又は臨床的兆候の開始後に早期に開始した場合、1~2日だけ症状再発の重症度が減少及び期間が短縮することが実証された。しかし、そのような断続的なレジメンによって1年当たりの再発数が減少することはない。
HSV再発向けの現在の治療オプションには、不完全な抗ウイルス有効性、短期間の有効性、治療レジメンへの遵守、抗ウイルス剤耐性の出現、治療の費用、及び副作用を含めて限界がある。現在のところ、症候再発の長期予防をもたらす戦略は知られていない。
したがって、当技術分野では、再発ヘルペスウイルス感染、特にHSV2及びHSV1の各感染に関する改善された治療が必要である。
本発明の以下の態様が本明細書において提供される:
- 対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV-2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV-2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 対象に投与された場合にHSV-2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV-1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV-2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV-2又はその断片由来の結合パートナー及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 対象に投与された場合にHSV-2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV-1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV-1又はその断片由来の結合パートナー及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を治療する方法であって、免疫学的に有効量のHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントを対象に投与することを含み、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントが、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる、方法。
- それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を治療するであって、免疫学的に有効量のHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントを対象に投与することを含み、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントが、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる、方法。
本発明は、HSVに対する治療用ワクチンにおける、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、特に、HSV1又はHSV2由来の糖タンパク質gEの単独又はその結合パートナーgIとの使用に関し、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、対象に投与された場合にHSV1又はHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導する。本発明者らは、ヒト抗体のFc部分への結合を低減若しくは消失させるgE/gIの突然変異を有するHSV2 Fc受容体の外部ドメイン(特に、gE/gI)のバリアント又はHSV2 Fc受容体の外部ドメインでのマウスの免疫化は、HSV1ウイルス又はHSV1抗原に対する機能的交差反応性免疫応答をもたらすことを示した。ヒト抗体への結合を低減若しくは消失させるgE/gIの突然変異を有するHSV1 Fc受容体の外部ドメイン(特に、gE/gI)のバリアント又はHSV1 Fc受容体の外部ドメインでのマウスの免疫化は、HSV2ウイルス又はHSV2抗原に対する機能的交差反応性免疫応答をもたらすことも実証された。HSV1 KOS系統とHSV2 SD90e系統の間のアミノ酸配列アラインメントは、gE及びgIタンパク質がそれぞれ76.10%/67.4%及び78.68%/75.5%の同一性/類似性を共有することを示した。しかしながら、HSV-1とHSV-2 gE/gIの間の機能的交差反応性免疫応答は予期しないものであった。抗原間の有意に高いレベルの配列類似性であっても、これは機能的交差反応性免疫応答を暗示しない。例えば、一部のインフルエンザウイルスHA抗原(2009年後の系統に由来する)は、およそ90%のアミノ酸配列類似性を共有するが、機能的交差反応性免疫応答を示さない。したがって、第1のHSV血清型をコードする核酸の投与が、異なるHSV血清型に対して対象において交差反応性を示し、免疫応答を誘発することは驚くべきことであった。
したがって、対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供される。また、対象に投与された場合にHSV-2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントも提供される。HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、HSV1及び/又はHSV2に感染した対象の治療において、好ましくは、汎HSVワクチンとして使用するために使用され得る。HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、HSV1及び/又はHSV2に感染した対象の治療において、好ましくは、汎HSVワクチンとして使用するために使用され得る。本発明のHSV1又はHSV2 Fc受容体又は免疫原性断片若しくはバリアントは、特に、HSV1及び/又はHSV2の再発感染並びに関連する臨床及び準臨床的兆候に対して使用され得る。
交差反応性免疫応答
免疫応答は、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントが、それが由来するもの以外のHSVの血清型に由来する抗原に対して抗原特異的体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導することができる、すなわち、交差血清型反応を誘導する、という点において、交差反応性である。例えば、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントの場合には、HSV1に対して体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導でき、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントの場合には、HSV2に対して体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導することができる。したがって、一実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSVの相同及び異種血清型の両方に対して体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導する。したがって、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、それが由来するHSVの血清型に対して及びFc受容体が由来しないHSVの別の血清型の両方に対して免疫応答を誘導し得る。HSVの2つの血清型(HSV1及びHSV2)があるので、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV1及びHSV2両方に対する体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導し得る。体液性免疫応答は、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントが由来するもの以外のHSVの血清型に由来する抗原に結合する抗体の生成を含み得る。或いは又はさらに、交差反応性免疫応答は、特異的Tリンパ球細胞応答の生成、例えばCD4+T細胞応答及び/又はCD8+T細胞応答につながり得る。
免疫応答は、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントが、それが由来するもの以外のHSVの血清型に由来する抗原に対して抗原特異的体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導することができる、すなわち、交差血清型反応を誘導する、という点において、交差反応性である。例えば、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントの場合には、HSV1に対して体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導でき、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントの場合には、HSV2に対して体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導することができる。したがって、一実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSVの相同及び異種血清型の両方に対して体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導する。したがって、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、それが由来するHSVの血清型に対して及びFc受容体が由来しないHSVの別の血清型の両方に対して免疫応答を誘導し得る。HSVの2つの血清型(HSV1及びHSV2)があるので、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV1及びHSV2両方に対する体液性及び/又は細胞性免疫応答を誘導し得る。体液性免疫応答は、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントが由来するもの以外のHSVの血清型に由来する抗原に結合する抗体の生成を含み得る。或いは又はさらに、交差反応性免疫応答は、特異的Tリンパ球細胞応答の生成、例えばCD4+T細胞応答及び/又はCD8+T細胞応答につながり得る。
免疫応答は、例えば、抗体がFc受容体抗原又は抗原関連分子若しくは細胞へ結合するだけでなく、有効な免疫応答に寄与する下流エフェクター機能を開始する点で機能的であり得る。一実施形態では、機能的抗体応答が誘導される。例えば、機能的抗体応答は、補体、顆粒球及び/若しくは細胞傷害性T細胞の活性化、ウイルス粒子の中和又はHSVを阻害若しくは固定化する他の手段又はHSVの免疫回避活性の阻害を含み得る。交差反応性機能的免疫応答として、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、それが由来しないHSVの血清型に対して下流エフェクター機能(例えば、補体、顆粒球及び/若しくは細胞傷害性T細胞の活性化、中和又はHSVを阻害若しくは固定化する他の手段又はHSVの免疫回避活性の阻害)を開始し得る、すなわち、交差血清型応答を生じる。好ましくは、機能的抗体応答はHSVの免疫回避活性の阻害を含む。後者は、HSV Fc受容体に結合し、HSV Fc受容体のヒトIgGへの結合を阻害する抗体の生成によって達成され得る。このようにして、機能的免疫応答は、抗体バイポーラブリッジング(bipolar bridging)、例えば、HSV感染細胞の表面に結合された抗体のバイポーラブリッジングの阻害を含み得る。
例えば、HSV Fc受容体に結合する交差反応性抗体の生成は、Fc受容体抗原が由来するものではないHSVの血清型に結合する交差反応性抗体の検出のために、当業者に周知の技術、例えば、ELISA又は間接ELISAによって測定することができる。免疫回避活性を阻害する能力は、例えば、in vitroでHSV Fc受容体によるヒトIgG Fc結合を減少させるワクチン特異的抗体の能力を評価する競合的ELISA法によって測定され得る。中和アッセイを使用して、交差中和抗体の存在を評価することができる。中和抗体は、許容宿主細胞、HSVの浸透及び増殖を許す細胞におけるHSVの複製を妨げることがある。中和アッセイは、例えば、このような抗体を含有する血清の存在下又は非存在下でウイルス感染宿主細胞の細胞変性効果を評価することによって、ウイルス系統を中和する抗体の能力を評価することができる。
機能的免疫応答は、交差反応性(例えば、交差血清型)T細胞応答の生成を含み得る。特異的T細胞応答の2つの主な細胞性エフェクターとして、CD4+ヘルパーT細胞及びCD8+Tリンパ球(又は細胞傷害性Tリンパ球又はCTL)がある。CD4+T細胞の活性化は、それらにサイトカインを放出させ、これは、Bリンパ球、CTL及び抗原提示細胞(APC)などの多数の細胞種の活性に影響を及ぼす。CD4+T細胞は、Th1型サイトカイン(例えば、IL-2及びIFN-γ)及びTh2型サイトカインを生成するTh1及びTh2にさらに細分できる。CD4+T細胞の活性化及びサイトカインの分泌は、免疫系の細胞媒介性及び抗体媒介性ブランチの両方を刺激することができる。好ましくは、交差反応性CD4+T細胞応答は、主に、Th1細胞媒介性免疫応答であり、例えば、IL-2及び/又はIFN-γを誘導する。CD8+T細胞(又は細胞傷害性T細胞(CTL))はまた、T細胞媒介性免疫応答に関与することがあり、ウイルスに感染した細胞の死滅を誘導することができる。CD8+T細胞は、特異的抗原刺激後に活性化されるサイトカイン(例えば、IFN-γ)を産生することができる。CD4+ヘルパーT細胞又はCD8+T細胞の活性化の際のサイトカインの放出を測定して、この活性化を評価し、定量化することができる。当業者に周知の技術を使用して、CD4+/CD8+T細胞活性化と関連するサイトカイン応答を測定してもよく、それだけには限らないが、サイトカイン、例えば、IFN-γ、IL-2及び/又は他のものの測定のために設計された特異的ELISA又はELISPOT又はフローサイトメトリーの使用が挙げられる。特に、これらの細胞において細胞内サイトカイン染色アッセイを使用して、細胞内サイトカイン検出し、次いで、例えば、フローサイトメトリーを使用して測定してもよい。細胞毒性は、例えば、抗原負荷標的細胞がワクチン接種又は感染後にin vivoで生成される特異的細胞傷害性T細胞によって溶解されるin vitro細胞溶解アッセイを使用して評価することができる。このための技術は当業者に周知であり、例えば、クロム放出アッセイ又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)バイオアッセイが挙げられる。ADCCバイオアッセイは、膜表面抗原が特異的抗体によって結合された場合に細胞傷害性経路が活性化された後に標的細胞の死滅(例えば、PBMC又はNK細胞による)を検出し得る。Promega ADCCリポーターバイオアッセイなどの代替アッセイは、ヒトFcyRIIIa誘導性ルシフェラーゼを安定に発現する細胞系統においてルシフェラーゼ活性のFcyR媒介性活性化を検出し得る。標的細胞に結合された関連抗体のFc領域との会合後、FcyRIIIaを発現するバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを伝達し、ルシフェラーゼ活性をもたらし、これは容易に定量化することができる。さらなる実施形態では、免疫学的に有効な量のHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントの投与後に対象において交差反応性免疫応答を決定する方法であって、対象から組織(例えば、血液)試料を採取すること及びin vitroアッセイを実施して、HSV2に対する交差反応性免疫応答を検出することを含む、方法が提供される。さらなる実施形態では、免疫学的に有効量のHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントの投与後に対象において交差反応性免疫応答を決定する方法であって、対象から組織(例えば、血液)試料を採取すること及びin vitroアッセイを実施して、HSV1に対する交差反応性免疫応答を検出することを含む、方法が提供される。一実施形態では、血液試料における交差反応性抗体を検出するためのin vitroアッセイが使用される。
一実施形態では、交差反応性免疫応答が、好ましくは、汎HSVワクチンとして使用するための、HSV1に対する交差血清型抗体応答を含む、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供される。さらなる実施形態では、交差反応性免疫応答が、好ましくは、汎HSVワクチンとして使用するための、HSV2に対する交差血清型抗体応答を含む、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供される。
一実施形態では、対象に投与された場合に異なる血清型のHSVに対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントが提供される。
一実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSV1に対する交差血清型抗体応答を含み、及び
- HSV2 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV2 Fc受容体は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントである。
- 交差反応性免疫応答は、HSV1に対する交差血清型抗体応答を含み、及び
- HSV2 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV2 Fc受容体は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントである。
さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSV2に対する交差血清型抗体応答を含み、及び
- HSV1 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV1 Fc受容体は、HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントである。
- 交差反応性免疫応答は、HSV2に対する交差血清型抗体応答を含み、及び
- HSV1 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV1 Fc受容体は、HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントである。
一実施形態では、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、及び汎HSVワクチンとして使用するための、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSV1に対する交差血清型抗体応答である、又はそれを含み、及び
- HSV2 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV2 Fc受容体は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントである。
- 交差反応性免疫応答は、HSV1に対する交差血清型抗体応答である、又はそれを含み、及び
- HSV2 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV2 Fc受容体は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントである。
さらなる実施形態では、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、及び汎HSVワクチンとして使用するための、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSV2に対する交差血清型抗体応答であるか又はそれを含み、及び
- HSV1 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV1 Fc受容体は、HSV1 gE1又はその免疫原性断片又はバリアントである。
- 交差反応性免疫応答は、HSV2に対する交差血清型抗体応答であるか又はそれを含み、及び
- HSV1 Fc受容体は、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、HSV1 Fc受容体は、HSV1 gE1又はその免疫原性断片又はバリアントである。
一実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSV1に対する交差血清型抗体応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は、HSV1に対する交差血清型抗体応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2と一緒の対象への投与を含まない。
さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSV2に対する交差血清型抗体応答である、又はそれを含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は、HSV2に対する交差血清型抗体応答である、又はそれを含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1と一緒の対象への投与を含まない。
一実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され、交差反応性免疫応答は、交差血清型抗体応答、交差血清型細胞傷害性抗体応答、交差血清型T細胞応答及び/又はHSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体の生成を含む。
さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され、交差反応性免疫応答は、交差血清型抗体応答、交差血清型細胞傷害性抗体応答、交差血清型T細胞応答及び/又はHSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体の生成を含む。
一実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体の生成を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は、HSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体の生成を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、HSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体の生成を含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は、HSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体の生成を含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
一実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は、交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は、交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は、交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
一実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- 交差反応性免疫応答は交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- 交差反応性免疫応答は交差血清型T細胞応答を含み、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
単純ヘルペスウイルス及び免疫回避
アルファヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス(HSV)は、上皮組織及び神経組織においてウイルス伝播を可能にする特殊なメカニズムを進化させてきた。一次感染は、粘膜上皮細胞への侵入、これに続くそれら細胞間での急速なウイルス伝播を伴う。ウイルスの複製と伝播に関するそういったフェーズでは、ウイルスがビリオンエンベロープとニューロン膜の融合によって感覚ニューロンに侵入し、その結果、カプシドが細胞質へと送達される。カプシドは、神経節の神経細胞体又は核に向かって微小管上での逆行性の軸索輸送を受け、そこで潜伏性が樹立される。後に、ニューロンの刺激を受けて、潜伏ウイルスが再活性化し、ウイルス粒子が産生され、この粒子は、細胞体から軸索先端への順行性方向で微小管上での高速軸索輸送を受ける。単純ヘルペスウイルス(HSV)及びその他のアルファヘルペスウイルスの生活史の重要なフェーズとは、潜伏期から再活性化し、次いで感染したニューロンから上皮組織に伝播する能力である。この伝播には、少なくとも2つのステップが関与する: (i)軸索先端への順行性輸送とこれに続く(ii)開口放出及び軸索から上皮細胞への細胞外伝播。HSV gE/gIは、2つのウイルス膜糖タンパク質gEとgIから形成されるヘテロ二量体である。HSV gE/gIヘテロ二量体は、ウイルス伝播を容易にすることが示されてきた。(Howard, Paul W., et al. "Herpes simplex virus gE/gI extracellular domains promote axonal transport and spread from neurons to epithelial cells." Journal of virology 88.19 (2014): 11178-11186.)
アルファヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス(HSV)は、上皮組織及び神経組織においてウイルス伝播を可能にする特殊なメカニズムを進化させてきた。一次感染は、粘膜上皮細胞への侵入、これに続くそれら細胞間での急速なウイルス伝播を伴う。ウイルスの複製と伝播に関するそういったフェーズでは、ウイルスがビリオンエンベロープとニューロン膜の融合によって感覚ニューロンに侵入し、その結果、カプシドが細胞質へと送達される。カプシドは、神経節の神経細胞体又は核に向かって微小管上での逆行性の軸索輸送を受け、そこで潜伏性が樹立される。後に、ニューロンの刺激を受けて、潜伏ウイルスが再活性化し、ウイルス粒子が産生され、この粒子は、細胞体から軸索先端への順行性方向で微小管上での高速軸索輸送を受ける。単純ヘルペスウイルス(HSV)及びその他のアルファヘルペスウイルスの生活史の重要なフェーズとは、潜伏期から再活性化し、次いで感染したニューロンから上皮組織に伝播する能力である。この伝播には、少なくとも2つのステップが関与する: (i)軸索先端への順行性輸送とこれに続く(ii)開口放出及び軸索から上皮細胞への細胞外伝播。HSV gE/gIは、2つのウイルス膜糖タンパク質gEとgIから形成されるヘテロ二量体である。HSV gE/gIヘテロ二量体は、ウイルス伝播を容易にすることが示されてきた。(Howard, Paul W., et al. "Herpes simplex virus gE/gI extracellular domains promote axonal transport and spread from neurons to epithelial cells." Journal of virology 88.19 (2014): 11178-11186.)
HSV1又はHSV2が感染細胞内で再活性化する場合、ウイルスは免疫システムに対してより認められやすくなり、したがってより脆弱となる。通常は、宿主IgGはビリオン上で又は感染細胞の細胞表面でウイルス抗原を認識し、宿主IgG Fcドメインは、NK細胞、顆粒細胞及びマクロファージ上のFcガンマ受容体と相互作用することにより重要な抗体エフェクター活性を媒介して、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘発することができ、且つ、マクロファージ、単球、好中球及び樹状細胞上のFcガンマ受容体と相互作用することにより重要な抗体エフェクター活性を媒介して、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス(ADCP)を誘発することができる。
HSV1 gE又はHSV2 gEは、HSV1又はHSV2(それぞれ)糖タンパク質I(gI)と非共有結合のヘテロ二量体複合体を形成することができる。gEgIヘテロ二量体は、ウイルスFcガンマ受容体(FcγR)として機能し、これはヒトIgGのFc部分と相互作用する能力を有することを意味する。実際、HSV1若しくはHSV2のgE若しくはgE/gIヘテロ二量体は、HSV感染細胞の細胞表面に提示される場合、そのFc部分を通して宿主IgGに結合する。gEとgIの間の相互作用は、gE単独と比較してFc結合親和性を約100倍上昇させると考えられている。この相互作用は、免疫回避メカニズムに関連付けられてきた。実際、IgG Fabドメインを通してビリオン又は感染細胞上のHSV1又はHSV2の抗原(例えばgD)に結合することができるヒトIgGは、そのFcドメインを通してウイルスgE上のFc結合ドメインに結合することもでき、その結果、クラスリン媒介性メカニズムを通して免疫複合体のエンドサイトーシスを招く。このメカニズムは抗体バイポーラブリッジングと呼ばれ、自然免疫細胞の活性化と競合する主要な免疫回避戦略であると仮定されている。抗体Fc結合を通して、ウイルスFcγRは、補体結合及び抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を含むIgG Fc媒介性活性を阻害し、ウイルスが免疫システムによる認識を回避することを可能にする。(Ndjamen, Blaise, et al. "The herpes virus Fc receptor gE-gI mediates antibody bipolar bridging to clear viral antigens from the cell surface." PLoS pathogens 10.3 (2014): e1003961.; Dubin, G., et al. "Herpes simplex virus type 1 Fc receptor protects infected cells from antibody-dependent cellular cytotoxicity." Journal of virology 65.12 (1991): 7046-7050.; Sprague, Elizabeth R., et al. "Crystal structure of the HSV1 Fc receptor bound to Fc reveals a mechanism for antibody bipolar bridging." PLoS biology 4.6 (2006): e148.)
HSV2予防的サブユニットgD2ワクチンは、ヒトの治験においてHSV-2の疾患又は感染を効率的に防止しなかった(Johnston, Christine, Sami L. Gottlieb, and Anna Wald. "Status of vaccine research and development of vaccines for herpes simplex virus." Vaccine 34.26 (2016): 2948-2952)。Matrix-M2を用いてアジュバント化された短縮型gD2抗原及びICP4.2抗原をベースとした別のHSV2ワクチン候補物質は、第2相治験で生殖器のHSV2排出及び病変率を減少させた(Van Wagoner, Nicholas, et al. "Effects of different doses of GEN-003, a therapeutic vaccine for genital herpes simplex virus-2, on viral shedding and lesions: results of a randomized placebo-controlled trial." The Journal of infectious diseases 218.12 (2018): 1890-1899.)。ウイルス侵入分子(gD2)とHSV2免疫回避をブロックする2つの抗原、補体を阻害するgC2及びgE2とを含む3価のアジュバント化ワクチンは、動物モデルで有効性を示した。(Awasthi, Sita, et al. "Blocking herpes simplex virus 2 glycoprotein E immune evasion as an approach to enhance efficacy of a trivalent subunit antigen vaccine for genital herpes." Journal of virology 88.15 (2014): 8421-8432.; Awasthi, Sita, et al. "An HSV2 trivalent vaccine is immunogenic in rhesus macaques and highly efficacious in guinea pigs." PLoS pathogens 13.1 (2017): e1006141.; Awasthi, Sita, et al. "A trivalent subunit antigen glycoprotein vaccine as immunotherapy for genital herpes in the guinea pig genital infection model." Human vaccines & immunotherapeutics 13.12 (2017): 2785-2793.; Hook, Lauren M., et al. "A trivalent gC2/gD2/gE2 vaccine for herpes simplex virus generates antibody responses that block immune evasion domains on gC2 better than natural infection." Vaccine 37.4 (2019): 664-669.)。
gEのFc結合ドメインに対して免疫応答を方向付けることにより、上記の免疫回避メカニズム(抗体バイポーラブリッジング)を防止又は妨害する可能性があり、ウイルスタンパク質、特に免疫優性のHSV1 gD又はHSV2 gDの抗原への自然免疫がより強力となることを可能にする。ワクチン接種によるgE又はgE/gIヘテロ二量体の特異的ターゲティングにより、準優性な免疫応答、特に抗体依存性細胞傷害性(ADCC)及び抗体依存性細胞ファゴサイトーシス(ADCP)を増強し、免疫システムを保護メカニズムへと再度方向付けすることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らはしたがって、gE単独で又はそのヘテロ二量体結合パートナーgIとの組合せでワクチン接種による交差反応性免疫応答を特異的に高めることにより、HSV1若しくはHSV2に感染した対象を効果的に治療する、又は対象がHSV1若しくはHSV2に感染することを防ぐことが可能であると考える。一部の態様では、gE単独で又はそのヘテロ二量体結合パートナーgIとの組合せでワクチン接種による交差反応性免疫応答を特異的に高めることにより、HSV1若しくはHSV2の潜在性ウイルス感染を低減若しくは消失させるために、対象を効果的に治療する、及び/又はHSV1若しくはHSV2の潜在性ウイルス感染から生じる急性感染を治療若しくは低減することが可能である。
ヘルペスウイルスによって既に感染した対象(血清陽性の対象)の治療については、対象が症候期であれそれとも無症候期であれ、免疫優性抗原、例えばHSV gDを治療組成物に含めずともよい可能性がある。実際、gDは優性抗原であり、血清陽性の対象は、症候性にしろ無症候性にしろ、gDに対して高レベルの自然生成の中和抗体を既に有する(Cairns, Tina M., et al. "Patient-specific neutralizing antibody responses to herpes simplex virus are attributed to epitopes on gD, gB, or both and can be type specific." Journal of virology 89.18 (2015): 9213-9231.)。ウイルスFc受容体、例えばHSV gE又はHSV gE/gIに対して免疫応答を誘導することにより、本発明者らは、gE/gI免疫回避メカニズムが迂回されることになり、自然免疫は、特に免疫優性抗原、例えばgDに対して方向付けられる自然抗体応答は、その役割をより完全に果たすことになるであろうと仮説を立てた。免疫回避メカニズムに作用することに加えて、gE又はgE/gIの抗原はまた、細胞傷害性及び/又はファゴサイトーシスメカニズム(ADCC/ADCP)によって、感染細胞の破壊を招くと思われる液性応答(抗gE抗体又は抗gE抗体及び抗gI抗体)を誘導することができる。血清陽性の対象の場合、ADCC及び/又はADCPメカニズムは、初期段階のウイルス複製を制御するのに、中和抗体メカニズム(例えば優性なHSV抗原gDによって駆動される応答)よりも効率的であり得る。最後に、gE抗原又はgE/gI抗原によるCD4+ T細胞の誘導も、再発HSV感染に対して役に立つ、と本発明者らは仮説を立てた。
Fc受容体
第1の態様において、本発明は、対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV-2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントを提供する。第2の態様において、対象に投与された場合にHSV-2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV-1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供される。
第1の態様において、本発明は、対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV-2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントを提供する。第2の態様において、対象に投与された場合にHSV-2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV-1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供される。
本明細書で使用される場合、「Fc受容体」(又は「FcR」)とは、ある特定の細胞の表面に見いだされ、抗体のFc領域に結合する能力を有するタンパク質である。Fc受容体は、認識する抗体のタイプに基づいて分類される。最も一般的なクラスの抗体であるIgGに結合するFc受容体は「Fc-ガンマ受容体」(又は「FcγR」)と呼ばれ、IgAに結合するFc受容体は「Fc-アルファ受容体」(又は「FcαR」)と呼ばれ、IgEに結合するFc受容体は「Fc-イプシロン受容体」(又は「FcεR」)と呼ばれる。本明細書では、内在性遺伝子の発現の結果として所与の多細胞生物から細胞の表面に提示されるFc受容体は、「宿主Fc受容体」という。宿主Fc受容体は、特に宿主免疫エフェクター細胞、例えばBリンパ球、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ヒト血小板及び肥満細胞の表面に見いだされる。Fab領域を通して感染細胞又は侵入病原体に結合した抗体のFc領域への宿主Fc受容体の結合は、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス(ADCP)又は抗体依存性細胞傷害性(ADCC)による感染細胞又は侵入病原体のファゴサイトーシス又は破壊を誘発する。
適切には、FcR又はその免疫原性断片はサブユニット形態であり、このことは、それが全ウイルスの一部ではないことを意味する。適切には、FcR又はその免疫原性断片は単離されたものである。
一部のウイルス、特にヘルペスウイルスは、宿主IgGのFc部分に結合するウイルスFc受容体を発現し、それによって免疫エフェクター細胞上の宿主Fc受容体へのIgGの結合を防止するとともに、ウイルスが宿主のADCC又はADCP免疫応答を回避することを可能とする。
一実施形態では、HSV Fc受容体はFcγRである。好ましくは、FcγRは、HSV2 gE2及びHSV1 gE1から選択される。
本明細書では、「HSV2 gE2」(又は「HSV2 gE」)とは、HSV2遺伝子US8によってコードされ、感染細胞の表面で提示され、ウイルスFcγRとして機能するHSV2 gE糖タンパク質である。適切には、HSV2 gE2は、表1に示されるHSV2 gE糖タンパク質、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントから選択される。
好ましい実施形態では、HSV2 gE2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するHSV2系統SD90e由来のgE(Genbank受託番号AHG54732.1、UniProtKB受託番号: A7U881)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
本明細書で使用される場合、「バリアント」とは、参照抗原配列とは配列において異なるが、参照抗原の少なくとも1つの本質的な特性を保持するペプチド配列である。ペプチドバリアントの配列の変化は限定的又は保存的とすることができ、その結果、参照ペプチドとバリアントの配列は全体として密接に類似しており、多くの領域で同一である。バリアント及び参照抗原は、任意の組合せで1以上の置換、付加又は欠失によってアミノ酸配列において異なることができる。抗原のバリアントは、天然に存在する例えば対立遺伝子バリアントであってもよく、天然に存在することが知られていないバリアントであってもよい。核酸及びポリペプチドの天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技法によって又は直接合成によって作製することができる。好ましい実施形態では、バリアントによって保持される本質的な特性とは、免疫応答、適切には液性応答又はT細胞応答を誘導する能力であり、この応答は参照抗原によって誘導される免疫応答に類似している。適切には、バリアントは、マウスにおいて液性応答又はT細胞応答を誘導するが、これは、参照抗原によって誘導される免疫応答に対して、10分の1より低いことはなく、より適切には5分の1より低いことはなく、2分の1より低いことはなく、又は低いことはない。
本明細書では、「HSV1 gE1」(又は「HSV1 gE」)とは、HSV1遺伝子US8によってコードされ、感染細胞の表面に提示され、ウイルスFcγRとして機能するHSV1 gE糖タンパク質である。適切には、HSV1 gE1は、配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するHSV1系統KOS321由来のgE(UniProtKB受託番号: Q703E9)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
一実施形態では、HSV Fc受容体の免疫原性断片が使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫原性断片」とは、宿主の免疫システムを刺激して液性及び/又は細胞性抗原特異的免疫応答(すなわち、天然に存在するポリペプチド、例えばウイルス又は細菌のタンパク質を特異的に認識する免疫応答)を生じうる1以上のエピトープ(例えばリニア、コンホメーション又は双方)を含有する参照抗原の断片をいう。「エピトープ」とは、その免疫学的特異性を決定する抗原の部分である。T細胞及びB細胞のエピトープは、経験的に特定することができる(例えば、PEPSCAN又は同様の方法を使用して)。好ましい実施形態では、免疫原性断片は、免疫応答、適切には液性又はT細胞の応答を誘導するが、この応答は参照抗原によって誘導される免疫応答に類似している。適切には、免疫原性断片は、マウスにおいて液性応答又はT細胞応答を誘導するが、これは、参照抗原によって誘導される免疫応答に対して、10分の1よりも低いことはなく、より適切には5分の1よりも低いことはなく、2分の1よりも低いことはなく、又は低いことはない。
本明細書で使用される場合、「HSV Fc受容体の免疫原性断片」とは、少なくとも10、15、20、30、40、50、60、100、200、300個以上のアミノ酸を有する天然に存在するウイルスFc受容体の断片、又は天然に存在するウイルスFc受容体と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は99.5%の配列同一性のアミノ酸配列を有するペプチド(又は少なくとも約10、15、20、30、40、50、60個以上のアミノ酸を有する、天然に存在するウイルスFc受容体の断片)をいう。したがって、抗原性ウイルスFc受容体の免疫原性断片は、天然に存在するウイルスFc受容体の、少なくとも10個のアミノ酸の断片とすることができ、且つ1以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができる。
コードされたHSV Fc受容体免疫原性断片のいずれもが、必要な場合に最初のメチオニン残基をさらに含むことができる。
適切には、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片は機能的な膜貫通ドメインを含まない。適切には、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片は細胞質ドメインを含まない。好ましくは、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片は機能的な膜貫通ドメインも細胞質ドメインも含まない。換言すれば、好ましい実施形態では、HSV Fc受容体又は免疫原性断片はHSV FcR外部ドメイン(又は細胞外ドメイン)からなる。より好ましくは、HSV Fc受容体又は免疫原性断片は、HSV2 gE2外部ドメイン又はHSV1 gE1外部ドメインを含むか又はそれらからなる。
好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインは、配列番号7(配列番号1のアミノ酸残基1~419に対応する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gE2外部ドメインである。適切には、ウイルスFcR外部ドメインは、表1又は図77に示される配列から選択される配列を有する。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインは、配列番号7と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV2 gE2外部ドメインである。
適切には、HSV2 Fc受容体外部ドメインは、配列番号7に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、HSV2 FcR外部ドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1~417に対応するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gE2外部ドメインである。適切には、HSV2 Fc受容体外部ドメインは、配列番号1のアミノ酸残基1~417に対応するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、HSV1 FcR外部ドメインは、配列番号9(配列番号3のアミノ酸残基1~421に対応する)に示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV1 gE1外部ドメインである。好ましい実施形態では、HSV1 FcR外部ドメインは、配列番号9と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV1 gE1外部ドメインである。
適切には、HSV Fc受容体HSV1外部ドメインは、配列番号9に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、HSV1 FcR HSV1外部ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基1~419に対応するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなる。適切には、HSV1 Fc受容体 HSV1外部ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基1~419に対応するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含み得る。
別の実施形態では、HSV1又はHSV2 FcRの免疫原性断片は、HSV FcR由来のFc結合ドメイン又はそれのバリアントを含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、HSV2 FcRの免疫原性断片は、HSV2 gE由来のFc結合ドメイン、例えば、配列番号1のアミノ酸残基233~378に対応するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなる。適切には、ウイルスFc受容体HSV2 Fc結合ドメインは、配列番号1のアミノ酸残基233~378に対応するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
一実施形態では、HSV1 FcRの免疫原性断片は、HSV1 gE由来のFc結合ドメイン、例えば、配列番号3のアミノ酸残基235~380に対応するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなる。適切には、HSV1 Fc受容体HSV1 Fc結合ドメインは、配列番号3のアミノ酸残基235~380に対応するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
好ましい実施形態では、ヒト抗体Fcドメインに結合するHSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントの能力は、対応する天然HSV Fc受容体と比較して減少又は消失している。適切には、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片は、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片の天然配列と比較して1個以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでおり、この置換、欠失又は挿入によって、天然HSV Fc受容体と比較してHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインと間の結合親和性が減少又は消失している。
HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性は、当業者によく知られている方法によって決定することができる。例えば、会合速度(kon)、解離速度(koff)、平衡解離定数(KD=koff/kon)及び平衡会合定数(KA=1/KD=kon/koff)をバイオレイヤー干渉計法によって決定され得る。
好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkonよりも低い(遅いバインダー)。
好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(速いリリーサー)。
より好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkonよりも低く、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(遅いバインダー/速いリリーサー)。
好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のKDよりも高い。
HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の相対親和性は、天然HSV FcRについて決定されたKDをHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントについて決定されたKDにより除算する(割る)ことによって決定することができる。
好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間の親和性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%又は10%未満である。より好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間の親和性の15%未満、より好ましくはさらに10%未満である。
好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、2×10-7Mより高く、好ましくは5×10-7Mより高く、より好ましくは1×10-6Mより高い。
或いは、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片がヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、バイオレイヤー干渉計法アッセイで応答(nmで表現して)を測定することによって評価することができる。
好ましい実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の結合に対応するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、対応する天然HSV Fc受容体で得られた応答の80%未満、適切には、70%、60%、50%、40%未満である。好ましい実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の結合に対応するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、0.4nmより低く、適切には0.3nm、0.2nm又は0.1nmより低い。
適切には、HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、配列番号1に示されるHSV2 gE2配列のN241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338又はV340から選択される位置に1以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の単一点置換突然変異(の例えば少なくとも1つ)が含まれる:
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の二重点置換突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、単独で又は置換突然変異との組合せで、配列番号1に示される配列の位置P319及び/又はR320での欠失突然変異、特に以下から選択される突然変異も含まれる:
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、以下から選択される、配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。(Δは欠失残基を意味する)。
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。(Δは欠失残基を意味する)。
より好ましい実施形態では、HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、338_インサートARAA; P317R; P319D; R320D; A248T_V340W; V340W; A248T; P318I及びA246Wから選択される配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な置換、選択及び挿入の突然変異に対して、他のHSV2 gE2配列、例えば、表1に列記されており図77に提供されるアラインメント上で示されている配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
適切には、HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、配列番号3に示されるHSV1 gE1配列のH247、P319及びP321から選択される位置に1以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV1 gE1又はその免疫原性断片と抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号3に示される配列の単一点置換突然変異: H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、並びに、以下から選択される、配列番号3に示される配列の二重点置換突然変異: H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G及びA340G/S341G/V342Gが含まれる。
HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、以下から選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む: P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
より好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、P319R、P321D、R322D、N243A_R322D又はA340G_S341G_V342Gから選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV1 gE1配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントがHSV FcR外部ドメインである場合、抗体Fcドメインに結合する外部ドメインの能力は、天然HSV Fc受容体と比較して減少又は消失している。適切には、HSV FcR外部ドメインは、HSV FcR外部ドメインの天然配列と比較して1個以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでおり、この置換、欠失又は挿入によって、天然HSV FcRと比較してHSV FcR外部ドメインと抗体Fcドメインと間の結合親和性が減少又は消失している。
HSV FcR外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性は、上記の方法によって決定することができる。
好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonよりも低い(遅いバインダー)。
好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(速いリリーサー)。
より好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkonよりも低く、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(遅いバインダー/速いリリーサー)。
好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、対応する天然HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間のKDよりも高い。
好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間の親和性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%又は10%未満である。より好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間の親和性の15%未満、より好ましくはさらに10%未満である。
好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、2×10-7Mより高く、好ましくは5×10-7Mより高く、より好ましくは1×10-6Mより高い。
或いは、HSV FcR外部ドメインがヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、バイオレイヤー干渉計法アッセイで応答(nmで表現して)を測定することによって評価することができる。好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインとヒトIgGとの間の結合に対応するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、対応する天然HSV FcR外部ドメインで得られた応答の80%未満、適切には、70%、60%、50%、40%未満である。好ましい実施形態では、ウイルスFcR外部ドメインとヒトIgGとの間の結合に対応するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、0.6nmより低く、適切には0.5nm、0.4nm、0.3nm又は0.2nmより低い。
適切には、HSV2 gE2外部ドメインは、配列番号7に示されるHSV2 gE2外部ドメイン配列のN241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338又はV340から選択される位置に1以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号7に示される配列の単一点置換突然変異(の例えば少なくとも1つ)が含まれる:
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号7に示される配列の二重点置換突然変異も含まれる:
H245A及びP319A; H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;及びP319L;V340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
H245A及びP319A; H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;及びP319L;V340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、単独で又は置換突然変異との組合せで、配列番号7に示される配列の位置P319及び/又はR320での欠失突然変異、特に以下から選択される突然変異も含まれる:
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
HSV2 gE2外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
・ 配列番号7のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサート ADIGL)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S338とT339の間の挿入ペプチド配列ARAA(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号7のアミノ酸残基H346とA347の間の挿入ペプチド配列ADIT(346_インサート_ADIT)。
・ 配列番号7のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサート ADIGL)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号7のアミノ酸残基S338とT339の間の挿入ペプチド配列ARAA(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号7のアミノ酸残基H346とA347の間の挿入ペプチド配列ADIT(346_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV2 gE2外部ドメインは、以下から選択される、配列番号7に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。
289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。
より好ましい実施形態では、HSV2 gE2外部ドメインは、338_インサートARAA; P317R; P319D; R320D; A248T_V340W; V340W; A248T; P318I及びA246Wから選択される、配列番号7に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な置換、欠失及び挿入の突然変異に対して、他のHSV2 gE2外部ドメイン配列、例えば、表1に列記されており図77に提供されるアラインメント上で示されている配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
適切には、HSV1 gE1外部ドメインは、配列番号9に示されるHSV1 gE1外部ドメイン配列のH247、P319及びP321から選択される位置に1以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
HSV1 gE1外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号9に示される配列の単一点置換突然変異(の例えば少なくとも1つ): H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、並びに、以下から選択される、配列番号9に示される配列の二重点置換突然変異: H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G及びA340G/S341G/V342Gが含まれる。
HSV1 gE1外部ドメインと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
・ 配列番号9のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号9のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート ADIGL);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号9のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
・ 配列番号9のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号9のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート ADIGL);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号9のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号9のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV1 gE1外部ドメインは、以下から選択される、配列番号9に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
より好ましい実施形態では、HSV1 gE1外部ドメインは、P321D; R322D; A340G_S341G_V342G及びP319Rから選択される、配列番号9に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV1 gE1外部ドメイン配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、前記ウイルス由来の結合パートナー又はその断片とのヘテロ二量体の一部である。
本明細書で使用される場合、「結合パートナー」とは、Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントと非共有結合のヘテロ二量体複合体を形成するウイルスタンパク質(又は糖タンパク質)又はその断片である。
好ましい実施形態では、HSV Fc受容体は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントであり、結合パートナーは、HSV2 gI2又はその断片である。別の実施形態では、HSV Fc受容体は、HSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントであり、結合パートナーは、HSV1 gI1又はその断片である。
本明細書では、「HSV2 gI2」(又は「HSV2 gI」)とは、HSV2遺伝子US7によってコードされ且つ感染細胞の表面に提示されるHSV2 gI糖タンパク質であり、その表面でこれはHSV2 gE2と会合してヘテロ二量体を形成する。適切には、HSV2 gI2は、表2に示されるHSV2 gI糖タンパク質、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントから選択される。
好ましい実施形態では、HSV2 gI2は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するHSV2系統SD90e由来のgI(Genbank受託番号AHG54731.1、UniProtKB受託番号: A8U5L5、配列番号2)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
別の好ましい実施形態では、HSV Fc受容体はHSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントであり、結合パートナーはHSV1 gI1又はその断片である。別の実施形態では、HSV Fc受容体は、HSV1 gE1又はその免疫原性断片又はバリアントであり、結合パートナーは、HSV2 gI2又はその断片である。
本明細書では、「HSV1 gI1」(又は「HSV1 gI」)とは、HSV1遺伝子US7によってコードされ且つ感染細胞の表面に提示されるHSV1 gI糖タンパク質であり、その表面でこれはHSV1 gE1と会合してヘテロ二量体を形成する。適切には、HSV1 gI1は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するHSV1系統17由来のgI(UniProtKB受託番号: P06487、配列番号4)、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントである。
一実施形態では、HSV FcR結合パートナーの断片が使用される。
本明細書で使用される場合、タンパク質又はペプチドに適用される「断片」という用語は、より大きなタンパク質又はペプチドのうちのサブシーケンスをいう。タンパク質又はペプチドの「断片」とは、長さが少なくとも約10個のアミノ酸である(連続したアミノ酸として天然に存在する複数のアミノ酸、例えば単一のリニアエピトープの場合)、例えば、長さが少なくとも約15、20、30、40、50、60、100、200、300個以上のアミノ酸(及び中間の任意の整数値)である。
好ましい実施形態では、HSV FcR結合パートナー断片は免疫原性断片である。
本明細書で使用される場合、「HSV FcR結合パートナーの断片」とは、少なくとも10、15、20、30、40、50、60、100、200、300個以上のアミノ酸を有する天然に存在するHSV FcR結合パートナーの断片、又は天然に存在するHSV FcR結合パートナーと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は99.5%の配列同一性のアミノ酸配列を有するペプチド(又は少なくとも約10、15、20、30、40、50、60個以上のアミノ酸を有する、天然に存在するHSV FcR結合パートナーの断片)をいう。したがって、HSV FcR結合パートナーの断片は、天然に存在するHSV FcR結合パートナーの、少なくとも10個のアミノ酸の断片とすることができ、且つ1以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を含むことができる。
コードされたHSV FcR結合パートナー断片のいずれもが、必要な場合に最初のメチオニン残基をさらに含むことができる。
膜貫通タンパク質は、通常の培養状態下で細胞膜を越えてまたがる能力を有する膜内在性タンパク質のタイプである。本明細書では、膜貫通ドメインとは、通常の培養状態下で細胞膜内にある膜貫通タンパク質の部分である。本明細書では、細胞質ドメインとは、通常の培養状態下で細胞膜の細胞質側にある膜貫通タンパク質の部分である。本明細書では、外部ドメインとは、通常の培養状態下で細胞膜の外側にある膜貫通タンパク質の部分である。
適切には、HSV FcR結合パートナー又はその断片は膜貫通ドメインを含まない。適切には、HSV FcR結合パートナー又はその免疫原性断片は細胞質ドメインを含まない。好ましくは、HSV FcR結合パートナー又はその免疫原性断片は膜貫通ドメインも細胞質ドメインも含まない。換言すれば、好ましい実施形態では、HSV FcR結合パートナー又は免疫原性断片はHSV FcR結合パートナー外部ドメイン(又は細胞外ドメイン)からなる。より好ましくは、HSV FcR結合パートナー又は免疫原性断片は、HSV2 gI2外部ドメイン及びHSV1 gI1外部ドメインから選択される。
好ましい実施形態では、HSV FcR結合パートナー外部ドメインは、配列番号8(配列番号2のアミノ酸残基1~256に対応する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gI2外部ドメインである。適切には、HSV FcR外部ドメインは、表2又は図78に示される配列から選択される配列を有する。好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインは、配列番号8と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV2 gE2外部ドメインである。
適切には、HSV FcR結合パートナーHSV2 gI2外部ドメインは、配列番号8に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、HSV FcR結合パートナーは、配列番号2のアミノ酸残基1~262に対応するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV2 gI2外部ドメインである。適切には、HSV FcR結合パートナーHSV2 gI2外部ドメインは、配列番号2のアミノ酸残基1~262に対応するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、HSV FcR結合パートナー外部ドメインは、配列番号10(配列番号4のアミノ酸残基1~270に対応する)で示されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV1 gI1外部ドメインである。好ましい実施形態では、HSV FcR外部ドメインは、配列番号10と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%又は100%同一であるHSV1 gE1外部ドメインである。
適切には、HSV FcR結合パートナーHSV1 gI1外部ドメインは、配列番号10に示されるアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
別の実施形態では、HSV FcR結合パートナーは、配列番号4のアミノ酸残基1~276に対応するアミノ酸配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一である配列を含むか又はそれらからなるHSV1 gI1外部ドメインである。適切には、HSV FcR結合パートナーHSV1 gI1外部ドメインは、配列番号4のアミノ酸残基1~276に対応するアミノ酸配列に対して、1個以上のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含むことができる。
HSVに感染した対象においてgD、gB及びgCに対する抗体が検出され、程度は低いがgH/gLに対する抗体が検出される。優性な中和応答はgDに対するものであった(Cairns, Tina M., et al. "Dissection of the antibody response against herpes simplex virus glycoproteins in naturally infected humans." Journal of virology 88.21 (2014): 12612-12622.)。
一実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、免疫優性HSV抗原(例えばgD1又はgD2)との組合せで対象に投与されない。
免疫優性とは、病原体によって産生される抗原ペプチドの部分集団に対してのみ免疫応答が開始される免疫学的現象である。免疫優性は抗体媒介性及び細胞媒介性免疫について証明されてきた。本明細書で使用される場合、「免疫優性抗原」とは免疫優性エピトープを含む抗原である。免疫優性ウイルス抗原は、ウイルス起源の免疫優性抗原である。対照的に、「準優性抗原」とは、免疫優性エピトープを含まない、又は換言すれば、準優性エピトープのみを含む抗原である。本明細書で使用される場合、「免疫優性エピトープ」とは、同じ病原体からの他のエピトープと比較して、同じ病原体への免疫応答過程で抗体を中和することによって、優性に標的化されるか又はより高度に標的化されるエピトープである。本明細書で使用される場合、「準優性エピトープ」とは、同じ病原体からの他のエピトープと比較して、同じ病原体への免疫応答過程で抗体を中和することによって、標的化されない又はより低い程度に標的化されるエピトープである。例えば、gD2はHSV2の免疫優性抗原であり、gD1はHSV1の免疫優性抗原である。対照的に、gB2、gC2、gE2/gI2及びgH2/gL2は、HSV2の準優性抗原であり、gB1、gCl、gE1/gI1及びgH1/gL1ヘテロ二量体はHSV1の準優性抗原である。
適切には、HSV Fc受容体がHSV2 gE2又はHSV1 gE1である場合、Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV2 gD2若しくはHSV1 gD1、又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒に対象に投与されない。HSV Fc受容体がHSV2 gE2である場合の特定の実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒に対象に投与されない。HSV Fc受容体がHSV1 gE1である場合の別の特定の実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒に対象に投与されない。
HSV1及びHSV2由来の糖タンパク質gCは、補体を阻害することによって免疫回避メカニズムにも関与している(Awasthi, Sita, et al. "Blocking herpes simplex virus 2 glycoprotein E immune evasion as an approach to enhance efficacy of a trivalent subunit antigen vaccine for genital herpes." Journal of virology 88.15 (2014): 8421-8432.)。
一実施形態では、HSV Fc受容体はHSV2 gE2であり、HSV2 gC2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと一緒に対象に投与される。
一実施形態では、HSV Fc受容体はHSV1 gE1であり、HSV1 gC1又はその免疫原性断片若しくはバリアントと一緒に対象に投与される。
一態様では、本発明は、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントを提供し、ここで、ヒト抗体Fcドメインに結合するHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントの能力は、対応する天然HSV Fc受容体と比較して減少又は消失している。
適切には、組換えHSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片の天然配列と比較して1個以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでおり、この置換、欠失又は挿入によって、天然HSV Fc受容体と比較してHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性が減少又は消失している。
好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkonよりも低い(遅いバインダー)。好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(速いリリーサー)。より好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkonは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkonよりも低く、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間のkoffは、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のkoffよりも高い(遅いバインダー/速いリリーサー)。
好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間のKDよりも高い。
好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然ウイルスFcRとヒトIgGとの間の親和性の100%未満、例えば90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%又は10%未満である。より好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の相対親和性は、対応する天然HSV FcRとヒトIgGとの間の親和性の15%未満、より好ましくはさらに10%未満である。
好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の平衡解離定数(KD)は、2×10-7Mより高く、好ましくは5×10-7Mより高く、より好ましくは1×10-6Mより高い。
或いは、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントがヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、バイオレイヤー干渉計法アッセイで応答(nmで表現して)を測定することによって評価することができる。
好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の結合に対応するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、対応する天然HSV FcRで得られた応答の80%未満、適切には、70%、60%、50%、40%未満である。好ましい実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントとヒトIgGとの間の結合に対応するバイオレイヤー干渉計法アッセイにおける応答は、0.4nmより低く、適切には0.3nm、0.2nm又は0.1nmより低い。
好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントである。適切には、組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、配列番号1に示されるHSV2 gE2配列のN241、H245、A246、A248、R314、P317、P318、P319、F322、R320、A337、S338又はV340から選択される位置に1以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の単一点置換突然変異(の例えば少なくとも1つ)が含まれる:
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
H245A、H245K、P317R、P319A、P319R、P319G、P319K、P319T、A337G、P319D、P319S、S338D、N241A、R320D、H245E、H245V、H245R、H245D、H245Q、H245G、H245I、H245K、H245S、H245T、A246W、A248K、A248T、A248G、R314A、R314N、R314D、R314Q、R314E、R314G、R314I、R314L、R314K、R314M、R314F、R314P、R314S、R314T、R314Y、R314V、P317N、P317G、P317I、P317L、P317K、P317F、P317S、P318R、P318D、P318Q、P318I、P318S、P318T、P318Y、P319L、R320A、R320S、R320N、R320Q、R320E、R320G、R320H、R320I、R320L、R320M、R320P、R320T、R320V、F322A、F322N、F322I、F322K、F322P、F322T、S338G、S338E、S338L、S338T、V340A、V340R、V340D、V340Q、V340M、V340F、V340P及びV340W。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号1に示される配列の二重点置換突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
H245A及びP319A;H245A及びP319R;H245A及びP319G;H245A及びP319K;H245A及びP319T;N241A及びR320D;N241A及びP319D;A246W及びP317K;A246W及びP317F;A246W及びP317S;A246W及びR320D;A246W及びR320G;A246W及びR320T;A248K及びV340R;A248K及びV340M;A248K及びV340W;A248T及びV340R;A248T及びV340M;A248T及びV340W;A248G及びV340R;A248G及びV340M;A248G及びV340W;A248K及びF322A;A248K及びF322I;A248K及びF322P;A248T及びF322A;A248T及びF322I;A248T及びF322P;A248G及びF322A;A248G及びF322I;A248G及びF322P;H245A及びR320D;H245A及びR320G;H245A及びR320T;H245G及びR320D;H245G及びR320G;H245G及びR320T;H245S及びR320D;H245S及びR320G;H245S及びR320T;H245A及びP319G;H245A及びP319L;H245G及びP319G;H245G及びP319L;H245S及びP319G;H245S及びP319L;R314G及びP318R;R314G及びP318D;R314G及びP318I;R314L及びP318R;R314L及びP318D;R314L及びP318I;R314P及びP318R;R314P及びP318D;R314P及びP318I;R314G及びF322A;R314G及びF322I;R314G及びF322P;R314L及びF322A;R314L及びF322I;R314L及びF322P;R314P及びF322A;R314P及びF322I;R314P及びF322P;R314G及びV340R;R314G及びV340M;R314G及びV340W;R314L及びV340R;R314L及びV340M;R314L及びV340W;R314P及びV340R;R314P及びV340M;R314P及びV340W;P317K及びV340R;P317K及びV340M;P317K及びV340W;P317F及びV340R;P317F及びV340M;P317F及びV340W;P317S及びV340R;P317S及びV340M;P317S及びV340W;P317K及びS338G;P317K及びS338H;P317K及びS338L;P317F及びS338G;P317F及びS338H;P317F及びS338L;P317S及びS338G;P317S及びS338H;P317S及びS338L;P318R及びS338G;P318R及びS338H;P318R及びS338L;P318D及びS338G;P318D及びS338H;P318D及びS338L;P318I及びS338G;P318I及びS338H;P318I及びS338L;P319G及びV340R;P319G及びV340M;P319G及びV340W;P319L及びV340R;P319L及びV340M;P319L及びV340W;P317R及びP319D;P317R及びR320D;P319D及びR320D。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、単独で又は置換突然変異との組合せで、配列番号1に示される配列の位置P319及び/又はR320での欠失突然変異、特に以下から選択される突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
P319欠失; R320欠失; P319欠失/R320欠失; P319欠失/R320欠失/P317G/P318G; P319欠失/R320欠失/P318E; P319欠失/R320欠失/P318G; P319欠失/R320欠失/P318K; P319欠失/R320欠失/P317R/P318E; P319欠失/R320欠失/P317R/P318G; P319欠失/R320欠失/P317R/P318K; P319欠失/R320欠失/P317G/P318K。
組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
・ 配列番号1のアミノ酸残基Y275とE276の間のペプチド配列LDIGEの挿入(275_インサート_LDIGE)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S289とP290の間のペプチド配列ADIGLの挿入(289_インサートADIGL)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基A337とS338の間のペプチド配列ARAAの挿入(337_インサート_ARAA)、
・ 配列番号1のアミノ酸残基S338とT339の間のペプチド配列ARAAの挿入(338_インサート_ARAA)、及び
・ 配列番号1のアミノ酸残基H346とA347の間のペプチド配列ADITの挿入(346_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントは、以下から選択される、配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:289_インサートADIGL;338_インサートARAA;H245K;P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320。
より好ましい実施形態では、HSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントは、338_インサートARAA;P317R;P319D;R320D;A248T_V340W;V340W;A248T;P318I及びA246Wから選択される配列番号1に示される配列に関して突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換、選択並びに突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV2 gE2配列、例えば、表1に列記されており図77に提供されるアラインメント上で示されている配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、本明細書に記載の組換えHSV2 gE2外部ドメインである。
別の実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントである。適切には、組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、配列番号3に示されるHSV1 gE1配列のH247、P319及びP321から選択される位置に1以上の突然変異(挿入、置換又は欠失)を含む。
組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される、配列番号3に示される配列の単一点置換突然変異: H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、並びに、以下から選択される、配列番号3に示される配列の二重点置換突然変異: H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G及びA340G/S341G/V342Gが含まれる。
組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントと抗体Fcドメインとの間の結合親和性を減少又は消失させるために本明細書で使用することができる例示的な突然変異には、以下から選択される挿入突然変異(の例えば少なくとも1つ)も含まれる:
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
・ 配列番号3のアミノ酸残基Y277とE278の間のペプチド配列LDIGEの挿入(277_インサート_LDIGE);
・ 配列番号3のアミノ酸残基S291とP292の間のペプチド配列ADIGLの挿入(291_インサート_ADIGL);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A339とA340の間のペプチド配列ARAAの挿入(339_インサート_ARAA);
・ 配列番号3のアミノ酸残基A340とS341の間のペプチド配列ARAAの挿入(340_インサート_ARAA); 及び
・ 配列番号3のアミノ酸残基D348とA349の間のペプチド配列ADITの挿入(348_インサート_ADIT)。
好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、以下から選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む:
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
P321K; P321D; R322D; N243A_R322D; N243A_P321D; A340G_S341G_V342G; H247G_P319G; P321R; H247A_P321K; 291_インサートADIGL; 339_インサートARAA; P319R; P319G_P321G及びH247A_P321R。
より好ましい実施形態では、HSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、P321D; R322D; A340G_S341G_V342G及びP319Rから選択される、配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む。
一実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントが提供され:
- ヒト抗体Fcドメインに結合するその前記バリアントの能力は、対応する天然HSV Fc受容体と比較して低減又は消失され、
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- ヒト抗体Fcドメインに結合するその前記バリアントの能力は、対応する天然HSV Fc受容体と比較して低減又は消失され、
- 前記使用は、HSV2 gD2又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
好ましくは、コードされるFc受容体は、gE2(場合により、その結合パートナーgI2と組み合わせた)であり、そのバリアントは、338_インサートARAA;P317R;P319D;R320D;A248T_V340W;V340W;A248T;P318I及びA246Wから選択される、配列番号1に示される配列に関して突然変異又は突然変異の組合せを含む。
さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントをコードする核酸が提供され:
- ヒト抗体Fcドメインに結合するその前記バリアントの能力は、対応する天然HSV Fc受容体と比較して低減又は消失され、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
- ヒト抗体Fcドメインに結合するその前記バリアントの能力は、対応する天然HSV Fc受容体と比較して低減又は消失され、及び
- 前記使用は、HSV1 gD1又は免疫優性エピトープを含むその断片と一緒の対象への投与を含まない。
好ましくは、コードされるFc受容体は、gE1(場合により、その結合パートナーgI1と組み合わせた)であり、そのバリアントは、H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G及びA340G/S341G/V342Gから選択される、配列番号3に示される配列に関して突然変異又は突然変異の組合せを含む。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異に対して、他のHSV1 gE1配列中の対応する突然変異も、本発明の範囲内である。
上に列記の例示的な単一及び二重置換突然変異並びに挿入突然変異の全ての可能な組合せもまた、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、本明細書に記載の組換えHSV1 gE1外部ドメインである。
好ましい実施形態では、組換えHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、前記ウイルス由来の結合パートナー又はその断片とのヘテロ二量体の一部である。
好ましい実施形態では、組換えHSV Fc受容体は組換えHSV2 gE2又はその免疫原性断片若しくはバリアントであり、結合パートナーは本明細書に記載のHSV2 gI2又はその断片である。
別の好ましい実施形態では、組換えHSV Fc受容体は組換えHSV1 gE1又はその免疫原性断片若しくはバリアントであり、結合パートナーはHSV1 gI1又はその断片又は本明細書に記載のその断片である。
別の実施形態では、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、前記HSVウイルス由来の結合パートナー又はその断片とのヘテロ二量体の一部である。さらなる実施形態では、HSV Fc受容体はHSV2 gE2であり、結合パートナーはHSV2 gI2である。別の実施形態では、HSV Fc受容体はHSV1 gE1であり、結合パートナーはHSV1 gI1である。
治療的使用及び組成物
別の態様では、本発明は、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物の一実施形態では、HSV2 Fc受容体はHSV2 gE2であり、結合パートナーはHSV2 gI2である。好ましくは、医薬組成物は、汎HSVワクチンとして使用するためのものである。
別の態様では、本発明は、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物の一実施形態では、HSV2 Fc受容体はHSV2 gE2であり、結合パートナーはHSV2 gI2である。好ましくは、医薬組成物は、汎HSVワクチンとして使用するためのものである。
本発明のさらなる態様では、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物の一実施形態では、HSV1 Fc受容体はHSV1 gE1であり、結合パートナーは、HSV1 gI1である。好ましくは、医薬組成物は、汎HSVワクチンとして使用するためのものである。
別の態様では、本発明は、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物を提供する。さらなる態様では、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物が提供される。適切には、免疫原性組成物は、薬学的に又は生理学的に許容される担体に懸濁又は溶解されることにより、投与向けに調製することができる。好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、治療用ワクチンとしての使用に適している。最も好ましくは、免疫原性組成物は、汎HSVワクチンとして使用するためのものである。
「薬学的に許容される担体」には、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しない任意の担体が含まれる。適切な担体は通常には、大型でゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ショ糖、トレハロース、乳糖及び脂質凝集体(例えば油滴又はリポソーム)である。そのような担体は当業者によく知られている。組成物はまた、薬学的に許容される希釈剤、例えば水、生理食塩水、グリセロール等を含有することができる。加えて、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質等が存在してもよい。無菌のパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水が通常の担体である。適当な担体は大部分が投与経路に依存し得る。
適切には、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、筋肉内、膣内、静脈内、腹腔内、皮下、経皮、皮内、鼻、腫瘍内又は経口の各投与を含む、当技術分野で知られている任意の経路によって対象に投与されることになる。
一実施形態では、対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、又は獣医学的哺乳動物(家畜又は愛玩動物)である。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
好ましい実施形態では、対象は、HSV(HSV1又はHSV2)FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントで治療される前に、ウイルス、例えばHSV2及び/又はHSV1によって感染している(すなわち血清陽性である)。HSVFcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントで治療される前にウイルスに感染した対象は、感染の臨床的兆候を示してもよく(症候性対象)、ウイルス感染の臨床的兆候を示さなくてもよい(無症候性対象)。一実施形態では、症候性対象は、臨床症状のない期間によって隔てられた経時的な感染の臨床症状を伴ういくつかのエピソード(再発)を示した。
一態様では、本発明は、i)対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答を誘導する際の、及びii)対象、好ましくは、ヒト対象において再発性ヘルペス感染を治療する際の、又は再発性ヘルペスウイルス感染の防止若しくはその頻度の低減のための方法での使用のための、HSV2 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント、又は前記HSV2 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供する。一実施形態では、HSV2 Fc受容体はHSV2 gE2又はその免疫原性断片又はバリアントである。別の実施形態では、HSV Fc受容体はHSV2 gE2/gI2ヘテロ二量体又はその免疫原性断片又はバリアントである。さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、汎HSVワクチンとして使用するためのものである。
さらなる態様では、本発明は、i)対象に投与された場合にHSV-2に対する交差反応性免疫応答を誘導する際の、及びii)対象、好ましくは、ヒト対象において再発性ヘルペス感染を治療する際の、又は再発性ヘルペスウイルス感染の防止若しくはその頻度の低減のための方法での使用のための、HSV1 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV1 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供する。一実施形態では、HSV1 Fc受容体はHSV1 gE1又はその免疫原性断片又はバリアントである。別の実施形態では、HSV Fc受容体はHSV1 gE1/gI1ヘテロ二量体又はその免疫原性断片又はバリアントである。さらなる実施形態では、本明細書において記載される使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、汎HSVワクチンとして使用するためのものである。
一態様では、本発明は、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導する免疫原性組成物の製造での使用のための、本明細書において記載の、HSV2 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV2 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供する。
さらなる態様では、本発明は、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導する免疫原性組成物の製造での使用のための、本明細書において記載の、HSV1 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV1 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、ヘルペス感染又はヘルペス関連疾患の防止又は治療のための医薬の製造における、本明細書において記載の、HSV2 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV2 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸の使用を提供し、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。
さらなる態様では、本発明は、ヘルペス感染又はヘルペス関連疾患の防止又は治療のための医薬の製造における、本明細書において記載の、HSV1 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV1 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸の使用を提供し、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。
一態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための、本明細書において記載の、HSV2 gE2若しくはgE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供し、免疫原性組成物は、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。
さらなる態様では、本発明は、免疫原性組成物の製造での使用のための、本明細書において記載の、HSV1 gE1若しくはgE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV1 gE1若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供し、免疫原性組成物は、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。
一態様では、本発明は、i)HSV2感染又はHSV2関連疾患及びii)HSV1感染又はHSV1関連疾患の防止又は治療のための医薬の製造における、本明細書において記載の、HSV2 gE2若しくはgE2/gI2ヘテロ二量体、その免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV2 gE2若しくはgE2/gI2ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸の使用を提供し、HSV2 gE2又はgE2/gI2ヘテロ二量体又はその免疫原性断片又はバリアントは、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。
さらなる態様では、本発明は、i)HSV1感染又はHSV1関連疾患及びii)HSV2感染又はHSV2関連疾患の防止又は治療のための医薬の製造における、本明細書において記載の、HSV1 gE1若しくはgE1/gI1ヘテロ二量体、その免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV1 gE1若しくはgE1/gI1ヘテロ二量体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸の使用を提供し、HSV1 gE1又はgE1/gI1ヘテロ二量体又はその免疫原性断片又はバリアントは、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる。
一態様では、本発明は、それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を防止又は治療する方法であって、免疫学的に有効量のHSV2 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV2 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を対象に投与することを含み、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる、方法を提供する。一実施形態では、ヘルペスウイルス感染はHSV1感染であり、ヘルペスウイルス関連疾患はHSV1関連疾患である。さらなる実施形態では、HSV2 Fc受容体は、HSV2 gE2又はgE2/gI2ヘテロ二量体又はその免疫原性断片又はバリアントである。
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を防止又は治療する方法であって、免疫学的に有効量のHSV1 Fc受容体若しくはその免疫原性断片若しくはバリアント又は前記HSV1 FcR若しくはその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を対象に投与することを含み、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントは、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる、方法を提供する。一実施形態では、ヘルペスウイルス感染はHSV2感染であり、ヘルペスウイルス関連疾患はHSV2関連疾患である。さらなる実施形態では、HSV1 Fc受容体は、HSV1 gE1又はgE1/gI1ヘテロ二量体又はその免疫原性断片又はバリアントである。
本発明のさらなる態様は、HSV1に感染した対象を治療する方法又は対象においてHSV1感染を防止する方法であって、免疫学的に有効量のHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントを対象に投与すること及びHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することを含む、方法を提供する。
本発明のなお更なる態様は、HSV2に感染した対象を治療する方法又は対象においてHSV2感染を防止する方法であって、免疫学的に有効量のHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントを対象に投与すること及びHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することを含む、方法を提供する。
また、対象にHSV2 gE2又はHSV1 gE1であるFc受容体を投与すること及び免疫優性ウイルス抗原(例えば、HSV2 gD2又はHVS1 gD1)と一緒に投与しないことを含む方法が提供される。
また、HSV2 gC2若しくはその免疫原性断片又はHSV1 gC1若しくはその免疫原性断片と一緒にHSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントを対象に有効な免疫学的量で投与することを含む方法が提供される。
HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を有効な免疫学的量で対象に投与すること、並びに対象に投与される場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することを含む方法も提供される。
また、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を有効な免疫学的量で対象に投与すること、並びに対象に投与される場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することを含む方法も提供される。
本明細書で使用される場合、「治療する」及び「治療」という用語並びにそれらに由来する単語は、全ての個体で状態が「治癒」されること、又は所与の任意の集団での100%効果的な治療を暗示することを意図したものではない。むしろ、当業者が有益な治療効果を有すると認める治療に関する様々な程度が存在する。この点で、本発明の方法及び使用は、そのような治療を必要とする対象におけるヘルペスウイルス感染、特にHSV2及び/又はHSV1関連疾患の治療に関する任意のレベルを提供することができるとともに、ヘルペスウイルス感染、特にHSV2及び/又はHSV1関連疾患の1以上の状態又は症状に関する重症度、期間又は経時的な再発の数の減少を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「治療的免疫化」又は「治療的ワクチン接種」とは、投与の時点でウイルス、例えばヘルペスウイルス、特にHSV2及び/又はHSV1に感染していることが知られている対象、好ましくはヒト対象へ本発明の免疫原性組成物を投与して、ウイルス感染又はウイルス関連疾患を治療することをいう。本明細書で使用される場合、「予防的免疫化」又は「予防的ワクチン接種」とは、投与の時点でウイルス、例えばヘルペスウイルス、特にHSV2及び/又はHSV1に感染していなかった対象、好ましくはヒト対象へ本発明の免疫原性組成物を投与して、ウイルス感染又はウイルス関連疾患を防止することをいう。
本発明では、HSV感染の治療とは、潜在性HSV感染状態からの再活性化イベントを防止すること、又は初期段階でのウイルス複製を制御して、一次HSV感染に続いて起こるウイルス排出及び臨床的発現、すなわち再発HSV感染を減少させることを目的とする。したがって、治療によって、無症候性ウイルス排出を含めて、HSVの症候性及び無症候性の再活性化(再発HSV感染とも呼ばれる)のいずれか又は両方が防止される。それ故、治療によって、症候性個体における再活性化の後の再発HSV感染の重症度、期間、及び/又はエピソードの数を減少させることができる。無症候性再活性化と粘膜部位からの排出を防止することで、HSVウイルス(すなわちHSV2、HSV1又はその両方)に無感作の個体への感染の伝播を減少させる又は防止することもできる。これには、性交を通してのHSVの伝播、特にHSV2の伝播の予防が含まれるが、性交を通してのHSV1の可能性のある伝播の予防も含まれる。したがって、本発明の免疫原性構築物は、以下の有用な目標のいずれかを達成することができる: 無症候性ウイルス排出の防止又は減少、症候性疾患再発の減少又は防止、症候性疾患の期間又は重症度の減少、再発の頻度の減少、再発までの時間の延長、所与の時点で無再発である対象の割合の向上、抗ウイルス剤の使用の減少、性的パートナーどうしの伝播防止。
特に、対象に投与された場合にHSV-1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、本明細書において記載されるHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び免疫原性組成物は、このような治療を必要とする対象において再発性ウイルス感染を治療又は防止するための治療用ワクチンとして有用である。好ましくは、治療用ワクチンは、汎HSV治療用ワクチンである。好ましくは、対象はヒトである。
また、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、本明細書において記載されるHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び免疫原性組成物は、このような治療を必要とする対象において再発性ウイルス感染を治療又は防止するための治療用ワクチンとして有用である。好ましくは、治療用ワクチンは汎HSV治療用ワクチンである。好ましくは、対象はヒトである。
汎HSVワクチンは、HSV1及びHSV2両方、すなわち、HSVの両血清型に対する体液性及び/又は細胞性免疫応答を示す。したがって、本明細書に記載されるようなHSV1又はHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントを、HSVの両方の種類、HSV1及びHSV2に対して使用するための汎HSVワクチンとして使用することができる。このようにして、1種類のみのHSVから調製された抗原の製造で、HSVのすべての血清型に対するワクチンを作製するのに十分であり、HSVの両血清型に由来する抗原を用いてワクチンを作製する更なる製造必要条件及び複雑性を伴わない。
適切には、本明細書に記載される使用のためのHSV1又はHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及び免疫原性組成物は、予防ワクチンの一部ではない。
本明細書で提供される使用の方法は、HSV2感染及びHSV1感染の両方に(したがって、HSV2及びHSV1の関連疾患の両方、すなわち、それぞれ、性器ヘルペス及び口唇ヘルペスに)、又はHSV2感染に(したがって、性器ヘルペスの治療を主として目的とする)若しくはHSV1感染に(したがって、口唇ヘルペスの治療を主として目的とする)方向付けることができる。
「免疫学的有効量」とは、この量の抗原(又は抗原を含有する免疫原性組成物)の対象への投与が、単回の用量で又はシリーズの一部としてのいずれかで、対象において投与された抗原に対して測定可能な免疫応答を誘導するのに効果的であることを意図する。この量は、治療される個体の健康及び身体状態、年齢、治療される個体の分類学的群(例えばヒト、非ヒト霊長類等)、個体の免疫システムの抗体を合成する能力、所望される予防の程度、組成物又はワクチンの製剤、治療する医者による医学的状況の評価、疾患の重症度、投与される化合物の効力、投与の様式、及び他の関連因子に応じて異なる。本明細書に開示のワクチンは典型的には治療用である。一部の実施形態では、本明細書に開示の免疫原性組成物は、ヘルペスウイルス感染に対する効果的な免疫応答、すなわち、ヘルペスウイルス感染、例えば再発HSV感染の治療又は予防に十分な応答を誘導することができる。本明細書に記載の核酸構築物を含む免疫原性組成物又はワクチンのさらなる使用が、明細書内で後述されて提供される。本明細書に記載のHSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント及び免疫原性組成物は、治療目的向けの経時的なHSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントの反復送達を含むレジメンでの使用に適していることが容易に理解されるであろう。適切には、プライムブーストレジメンを使用することができる。プライムブーストとは、同一個体において別々の2つの免疫応答を誘発することをいう: (i)免疫システムの第1のプライミング、これに続く(ii)一次免疫応答が樹立されて数週間又は数か月後の免疫システムの二次又はブースティング。好ましくは、ブースティング組成物は、プライミング組成物を対象に投与して約2~約12週間後、例えば、プライミング組成物を投与して約2、3、4、5又は6週間後に投与される。一実施形態では、ブースティング組成物は、プライミング組成物の1か月又は2か月後に投与される。一実施形態では、第1のブースティング組成物は、プライミング組成物の1か月又は2か月後に投与され、第2のブースティング組成物は、第1のブースティング組成物の1か月又は2か月後に投与される。
投薬量は、主として要因に、例えば投与経路、治療される状態、対象の年齢、体重及び健康等の要因に左右されることになり、したがって対象によって異なってもよい。例えば、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントの治療有効な成人投薬量は、1~250μg、例えば2~100μgのHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアント、例えば約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100μgのHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントを含有することができる。
HSV FcR結合パートナー又はその断片がHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントと一緒に対象に投与される場合、HSV FcR結合パートナー又はその断片の治療有効な成人投薬量は、5~250μg、例えば10~100μgのHSV FcR結合パートナー又はその断片、例えば、約10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100μgのHSV FcR結合パートナー又はその断片を含有することができる。
好ましい実施形態では、HSV FcR結合パートナー又はその断片がHSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアントと一緒に対象に投与される場合、HSV FcR免疫原性断片又はバリアントとHSV FcR結合パートナー又はその断片との用量は、化学量論的比約1:1である。
一般的に、ヒト用量は0.1mlから2mlの間の容積になる。したがって、本明細書に記載の組成物は、例えば、個々の成分又は組み合わされた免疫原性成分あたり約0.1、0.15、0.2、0.5、1.0、1.5又は2.0mlのヒト用量の容積で製剤化することができる。
当業者であれば、投与経路及び治療される対象に応じて、これらの用量を調整することができる。
HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントに対する治療的免疫応答をモニタリングして、もしあればブースターの必要性を決定することができる。免疫応答の(例えば、CD4+ T細胞応答、CD8+ T細胞応答、血清中の抗体価の)評価に続いて、場合によりブースター免疫化を投与することができる。
本発明によるHSV Fc受容体又はその断片に対する免疫応答を評価するのに適したin vitro又はin vivo試験方法は、当業者に知られている。例えば、HSV Fc受容体又はその断片若しくはバリアントは、目的の特定のリンパ球タイプ、例えばB細胞、T細胞、T細胞株及びT細胞クローンの増殖又はエフェクター機能の誘導に及ぼすその効果について試験することができる。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓細胞を単離することができ、本発明によるHSV Fc受容体又はその断片を含有する自己標的細胞を細胞傷害性Tリンパ球が溶解する能力を評価することができる。加えて、Tヘルパー細胞の分化を、細胞質サイトカイン染色及びフローサイトメトリー解析によってCD4+ T細胞中のTH1(IL-2、TNF-α及びIFN-γ)サイトカインの増殖又は産生を測定することによって、解析することができる。本発明によるHSV Fc受容体又はその断片若しくはバリアントを、例えば、流入領域リンパ節におけるB細胞の活性化を調べることによって、血清中の目的のHSV抗原に特異的な抗体のB細胞産生を測定することによって立証されるように、液性免疫応答を誘導する能力について試験することもできる。こういったアッセイは、例えば、免疫個体由来の末梢Bリンパ球を使用して行うことができる。
核酸
さらなる態様では、本発明は、本発明のHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明のHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントをコードする核酸を提供する。
「核酸」という用語は一般に、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び/又はそれらのアナログを含有する、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。これには、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドが含まれる。それにはまた、DNA又はRNAのアナログ、例えば、改変骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)又はホスホロチオエート)又は改変塩基を含有するものが含まれる。したがって、本開示の核酸には、mRNA、DNA、cDNA、組換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター等が含まれる。核酸がRNAの形態をとる場合、それは5'キャップを有しても有しなくともよい。本明細書に開示の核酸分子は、種々の形態をとることができる(例えば、一本鎖、二本鎖)。核酸分子は環状であっても分枝であってもよいが、一般的には直線状となる。
本明細書で使用される核酸は、精製又は実質的に精製された形態で、すなわち、他の核酸を実質的に含まずに(例えば、天然に存在する核酸を含まない)提供されるのが好ましく、一般に少なくとも約50%純粋(重量で)、通常は少なくとも約90%純粋である。
核酸分子は、組換え生成、化学合成、又は他の合成手段を含めて適切な任意の手段によって生成することができる。適切な生成技法は当業者によく知られている。典型的には、核酸は、組換え形態、すなわち天然に存在しない形態となる。例えば、核酸は、ウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体をコードする核酸配列に加えて、1以上の異種核酸配列(例えば、別の抗原をコードする配列及び/又は制御配列、例えばプロモーター若しくは内部リボソーム侵入部位)を含むことができる。核酸の配列又は化学構造は、ウイルスFc受容体若しくはその断片又はヘテロ二量体をコードする天然に存在する配列と比較して、改変することができる。核酸分子の配列は、例えば、核酸の発現又は複製の有効性を向上させるために、又は分解に対するさらなる安定性又は耐性をもたらすために改変することができる。
HSV Fc受容体又はその断片若しくはバリアントをコードする核酸分子は、コドン最適化することができる。本明細書において「コドン最適化」とは、核酸の翻訳有効性及び/又は半減期を向上させることができるコドン使用に対する改変をいうことを意図する。(例えば約30個以上のアデノシン残基の)ポリAテールを、RNAの3'末端に結合させてその半減期を向上させることができる。RNAの5'末端は、m7G(5')ppp(5')N(キャップ0構造)の構造を備える改変リボヌクレオチド又はその誘導体でキャップすることができ、この改変リボヌクレオチド又はその誘導体は、RNA合成中に組み込んでもよく、RNA転写後に酵素的に操作してもよい(例えば、mRNAトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ及びグアニン-7-メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素(VCE)を使用することによるが、このVCEが、N7-モノメチル化キャップ0構造の構築を触媒する)。キャップ0構造は、RNA分子の安定性及び翻訳有効性(実効性)を維持する上で重要な役割を担う。RNA分子の5'キャップは2'-O-メチルトランスフェラーゼによってさらに改変することができ、このことによってキャップ1構造(m7Gppp [m2'-O]N)の生成がもたらされ、これは翻訳有効性をさらに向上させることができる。
好ましい実施形態では、核酸は、HSV由来の結合パートナー又はその断片とのヘテロ二量体であるHSV2又はHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアントをコードし、ここでHSV2又はHSV1 FcR又はその免疫原性断片又はバリアントの発現は、サブゲノムプロモーター、適切には、配列番号126に示される26Sサブゲノムプロモーター又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75% 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントの制御下にある。
好ましい実施形態では、核酸は、i)HSV2又はHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片又はバリアント及びii)HSV由来の結合パートナー又はその断片を含むヘテロ二量体をコードし、ここで、HSV2又はHSV1 FcR又はその免疫原性断片又はバリアントの発現は、サブゲノムプロモーター、適切には、配列番号126に示される26Sサブゲノムプロモーター又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75% 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントの制御下にある。
好ましい実施形態では、HSV1又はHSV2 FcR又はその免疫原性断片又はバリアント及びその結合パートナー又はその断片は、内部リボソーム進入部位(IRES)配列によって隔てられる。好ましい実施形態では、IRES配列は、IRES EV71配列である。好ましい実施形態では、IRES配列は、配列番号127に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを含むか又はそれからなる。
別の実施形態では、HSV2若しくはHSV1 FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアント及びその結合パートナー又はその断片をコードする配列は、2A「自己切断」ペプチド配列によって隔てられる。一実施形態では、2A「自己切断」ペプチド配列は、配列番号124に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを適切には含むか又はそれらからなるGSG-P2A配列である。一実施形態では、2A「自己切断」ペプチド配列は、配列番号125に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを適切には含むか又はそれらからなる、F2A配列である。
さらに別の実施形態では、HSV2若しくはHSV1 FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアント及びその結合パートナー又はその断片をコードする配列は、サブゲノムプロモーターによって隔てられている。一実施形態では、サブゲノムプロモーターは、配列番号126に示される配列、又はそれと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを適切には含むか又はそれらからなる、26Sサブゲノムプロモーターである。
本発明の使用のための核酸分子は、例えば、RNAであってもDNA、例えばプラスミドDNAであってもよい。好ましい実施形態では、核酸分子はRNA分子である。
ベクター、宿主細胞
本発明に従う使用のための核酸を含むベクターが本明細書において記載される。
本発明に従う使用のための核酸を含むベクターが本明細書において記載される。
ベクターは、ネイキッドDNA又はRNA、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージベクター、例えばラムダベクター、人工染色体、例えばBAC(細菌人工染色体)又はエピソームを始めとする適切な任意の核酸分子とすることができる。或いは、ベクターは、無細胞のin vitro転写又は発現向けの転写ユニット及び/又は発現ユニット、例えばT7適合性システムとすることができる。ベクターは、単独で又は他のベクター、例えばアデノウイルス配列若しくは断片との組合せで、又は非アデノウイルス配列由来のエレメントとの組合せで使用することができる。適切には、ベクターは、野生型配列と比較して実質的に変更されており(例えば、遺伝子又は機能領域が欠失及び/又は不活性化されており)、宿主細胞に導入される場合、挿入されたポリヌクレオチド配列を複製及び発現する。
また、HSV2若しくはHSV1 Fc受容体若しくはその断片若しくはバリアント又はそれをコードする核酸若しくはベクターを含む細胞も本明細書において記載される。
本発明による使用のためのHSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、或いはHSV FcR結合パートナー又はその断片は、組換え技術によって適切に生成される。「組換え」とは、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限若しくはライゲーションのステップ、又は自然界に見られるポリヌクレオチドとは明確に異なるポリヌクレオチドをもたらす他の手順のうちの少なくとも1つの生成物であることを意味する。組換えベクターとは組換えポリヌクレオチドを含むベクターである。
一実施形態では、本発明に記載のヘテロ二量体は、マルチシストロン性ベクターから発現される。適切には、ヘテロ二量体は、HSV FcR又はその免疫原性断片若しくはバリアント及びその結合パートナー又はその断片をコードする核酸配列が内部リボソーム進入部位(IRES)配列によって隔てられている単一のベクターから発現される(Mokrejs, Martin, et al. "IRESite: the database of experimentally verified IRES structures (www. iresite. org)." Nucleic acids research 34.suppl_1 (2006): D125-D130.)。好ましい実施形態では、IRESはIRES EV71配列である。好ましい実施形態では、IRESは、配列番号127に示される配列又はそれに対して少なくとも60%、65%、70%、75% 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは99.5%同一であるそれ由来のバリアントを含むか又はそれらからなる。
或いは、2つの核酸配列は、ウイルス2A又は「2A様」の配列によって隔てることができ、これによって、別々の2つのポリペプチドの生成がもたらされる。2A配列は、口蹄疫ウイルス、ウマ鼻炎Aウイルス、トセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス及びブタスコウイルス-1を含めて、種々のウイルス由来のものが知られている。例えば、Szymczak et al., Nature Biotechnology 22:589-594 (2004)、Donnelly et al., J Gen Virol.; 82(Pt 5): 1013-25 (2001)を参照のこと。
場合により、発現及び回復を促進するために、HSV2若しくはHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント及び/或いはウイルスFcR結合パートナー又はその断片は、N末端にシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは、当技術分野で知られている多数のシグナルペプチドの内から選択することができ、通常は、組換え発現のために選択されたシステムでの生成及びプロセシングを促進するために選択される。一実施形態では、シグナルペプチドは、天然HSV Fcタンパク質又は結合パートナーに天然に存在するものである。系統SD90e由来のHSV2 gEのシグナルペプチドは、配列番号1の残基1~20に位置する。他のHSV系統由来のgEタンパク質向けのシグナルペプチドは、配列アラインメントによって特定することができる。系統SD90e由来のHSV2 gIのシグナルペプチドは、配列番号2の残基1~20に位置する。他のHSV系統由来のgIタンパク質向けのシグナルペプチドは、配列アラインメントによって特定することができる。
場合により、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント及び/或いはHSV FcR結合パートナー又はその断片は、タンパク質の検出(例えば、モノクローナル抗体による検出向けのエピトープタグ)及び/又は精製(例えば、ニッケルキレート樹脂上での精製を可能にするポリヒスチジンタグ)を容易にすることができるタグを構成するアミノ酸配列の付加を、含むことができる。ある特定の実施形態では、切断可能型リンカーを使用することができる。これにより、例えばリンカーを切断することができる作用剤の添加によって、タグを精製複合体から分離することが可能になる。いくつかの異なる切断可能型リンカーは、当業者にとって公知である。
本明細書の宿主細胞を適切な状態下で培養する場合、核酸は、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV FcR結合パートナー又はその断片、及び/或いはヘテロ二量体の両ペプチドを発現することができる。次いで、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV FcR結合パートナー又はその断片、及び/或いはヘテロ二量体を宿主細胞から分泌させることができる。適切な宿主細胞には、例えば以下が含まれる:
昆虫細胞(例えば、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、オートグラファ・カリフォルニアカ(Autographa californica)、カイコ(Bombyx mori)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))、哺乳動物細胞(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びげっ歯類(例えば、ハムスター))、鳥類細胞(例えば、ニワトリ、アヒル及びガチョウ)、細菌(例えば、大腸菌(E. coli))、枯草菌(Bacillus subtilis)及び連鎖球菌の種(Streptococcus spp.))、酵母細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenual polymorpha)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・ギリエルモンディ(Pichia guillerimondii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)及びヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))、テトラヒメナ(Tetrahymena)細胞(例えば、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila))、又はそれらの組合せ。適切には、宿主細胞は、グリコシル化を媒介する酵素を有するものであるべきである。細菌宿主は、宿主細胞がグリコシル化酵素を導入するように改変されていない限り、そのような改変タンパク質には一般には適しておらず、代わりに、真核生物宿主、例えば、昆虫細胞、鳥類細胞又は哺乳動物細胞を使用するべきである。
昆虫細胞(例えば、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、オートグラファ・カリフォルニアカ(Autographa californica)、カイコ(Bombyx mori)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)及びイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))、哺乳動物細胞(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ及びげっ歯類(例えば、ハムスター))、鳥類細胞(例えば、ニワトリ、アヒル及びガチョウ)、細菌(例えば、大腸菌(E. coli))、枯草菌(Bacillus subtilis)及び連鎖球菌の種(Streptococcus spp.))、酵母細胞(例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenual polymorpha)、クルイベロマイセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・ギリエルモンディ(Pichia guillerimondii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)及びヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica))、テトラヒメナ(Tetrahymena)細胞(例えば、テトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila))、又はそれらの組合せ。適切には、宿主細胞は、グリコシル化を媒介する酵素を有するものであるべきである。細菌宿主は、宿主細胞がグリコシル化酵素を導入するように改変されていない限り、そのような改変タンパク質には一般には適しておらず、代わりに、真核生物宿主、例えば、昆虫細胞、鳥類細胞又は哺乳動物細胞を使用するべきである。
適切な昆虫細胞発現システム、例えばバキュロウイルスシステムは当業者に知られており、例えば、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)に記載されている。適切な昆虫細胞には、例えば、Sf9細胞、Sf21細胞、Tn5細胞、シュナイダーS2細胞、及びHigh Five細胞(親のイラクサギンウワバBTI-TN-5B1-4細胞株(Invitrogen)に由来するクローン分離株)が含まれる。
鳥類細胞発現システムも当業者に知られており、例えば、米国特許第5,340,740号; 第5,656,479号; 第5,830,510号; 第6,114,168号; 及び第6,500,668号; 欧州特許第EP 0787180B号; 欧州特許出願第EP03291813.8号; WO 03/043415; 及びWO 03/076601に記載されている。適切な鳥類細胞には、例えば、ニワトリ胚性幹細胞(例えば、EBx(登録商標)細胞)、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性胚細胞、アヒル細胞(例えばAGE1.CR及びAGE1.CR.pIX細胞株(ProBioGen)、これらは、例えばVaccine 27:4975-4982 (2009)及びWO2005/042728に記載されている)、EB66細胞等が含まれる。
好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ及び齧歯動物(例えばハムスター))である。適切な哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓細胞(HEK-293細胞、通常には剪断アデノウイルス5型DNAによって形質転換されている)、NIH-3T3細胞、293-T細胞、Vero細胞、ヒーラ細胞、PERC.6細胞(ECACC寄託番号96022940)、Hep G2細胞、MRC-5(ATCC CCL-171)、WI-38(ATCC CCL-75)、胎児アカゲザル肺細胞(ATCC CL-160)、マディン-ダービーウシ腎臓(「MDBK」)細胞、マディン-ダービーイヌ腎臓(「MDCK」)細胞(例えば、MDCK(NBL2)、ATCC CCL34; 又はMDCK33016、DSM ACC 2219)、仔ハムスター腎臓(BHK)細胞、例えばBHK21-F、HKCC細胞等が含まれる。
特定の実施形態では、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV FcR結合パートナー又はその断片、及び/或いはヘテロ二量体をコードする組換え核酸は、選択された原核生物又は真核生物の宿主細胞における発現向けにコドン最適化される。
HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV FcR結合パートナー又はその断片、及び/或いはヘテロ二量体は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー(例えば、本明細書に記述のタグ付けシステムのいずれかを使用して)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含めて、当技術分野でよく知られるいくつかの方法のいずれかによって組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。タンパク質リフォールディングステップを、成熟タンパク質の立体配置を完成する上で、所望により使用することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を最終精製ステップで用いることができる。上述の参考文献に加えて、例えば以下に記載のものを含めて、様々な精製方法が当技術分野でよく知られる: Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; 及びBollag et al. (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, U.K.; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; 及びWalker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ。
「精製」又は「精製する」という用語は、組成物又は宿主細胞又は培養物から、その存在が所望ではない成分を除去するプロセスをいう。精製とは相対用語であり、望ましくない成分の全ての痕跡が組成物から除去されていることを必要とはしない。ワクチン生産の文脈では、精製には、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製又は沈殿などのプロセスが含まれる。したがって、「精製された」という用語は絶対的な純度を必要とせず、むしろ、それは相対用語として意図されている。実質的に純粋な核酸又はタンパク質の調製物は、所望の核酸又はタンパク質が調製物の総核酸含有量のうちの少なくとも50%を占めているように精製することができる。特定の実施形態では、実質的に純粋な核酸又はタンパク質は、調製物の総核酸又はタンパク質の含有量のうちの少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%以上を占めることになる。なんらの精製ステップにも供されなかった免疫原性分子又は抗原又は抗体(すなわち、自然界で見られるままの分子)は、医薬品(例えばワクチン)使用には適していない。
適切には、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV FcR結合パートナー又はその断片、及び/或いはヘテロ二量体の回収収率は、1リットルあたり2mgより高く、好ましくは1リットルあたり5、10、15又は20mgより高く、より好ましくは、1リットルあたり25mgよりさらに高い。
適切には、HSV Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV FcR結合パートナー又はその断片、及び/或いはヘテロ二量体の凝集レベルは、20%より低く、好ましくは15又は10%より低く、より好ましくは5%よりさらに低い。
アジュバント
好ましい実施形態では、HSV2若しくはHSV1 Fc受容体又はその断片若しくはバリアントは、アジュバントと一緒に対象に投与される。本明細書で使用される「アジュバント」とは、意図された対象、例えばヒト対象において抗原に対する免疫応答を増強する組成物をいう。
好ましい実施形態では、HSV2若しくはHSV1 Fc受容体又はその断片若しくはバリアントは、アジュバントと一緒に対象に投与される。本明細書で使用される「アジュバント」とは、意図された対象、例えばヒト対象において抗原に対する免疫応答を増強する組成物をいう。
適切なアジュバントの例には、それらに限定されないが、無機アジュバント(例えば無機金属塩、例えばリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム)、有機アジュバント(例えばサポニン、例えばQS21、又はスクアレン)、オイルベースのアジュバント(例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント)、水中油型エマルジョン、サイトカイン(例えばIL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS及びIFN-γ)粒子アジュバント(例えば免疫刺激複合体(ISCOMS)、リポソーム又は生分解性ミクロスフェア)、ビロソーム、細菌アジュバント(例えばモノホスホリルリピドA、例えば3-de-O-アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)、又はムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ又は合成リピドA)、合成ポリヌクレオチドアジュバント(例えばポリアルギニン又はポリリシン)、Toll様受容体(TLR)アゴニスト(TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-6、TLR-7、TLR-8及びTLR-9の各アゴニストを含む)及び非メチル化CpGジヌクレオチド(「CpG」)を含有する免疫賦活性オリゴヌクレオチドが含まれる。
好ましい実施形態では、アジュバントは、TLRアゴニスト及び/又は免疫学的に活性なサポニンを含む。好ましくはなおも、アジュバントは、リポソーム製剤中のTLRアゴニスト及びサポニンを含むか又はそれらからなることができる。TLRアゴニストとサポニンとの比は5:1、4:1、3:1、2:1又は1:1とすることができる。
アジュバントにおけるTLRアゴニストの使用は当技術分野でよく知られており、例えばLahiri et al. (2008) Vaccine 26:6777によってレビューされている。アジュバント効果を得るために刺激することができるTLRとしては、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8及びTLR9が挙げられる。TLR2、TLR4、TLR7及びTLR8の各アゴニスト、特にTLR4アゴニストが好ましい。
適切なTLR4アゴニストにはリポ多糖、例えばモノホスホリルリピドA(MPL)及び3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)が含まれる。米国特許第4,436,727号にはMPLとその製造が開示されている。米国特許第4,912,094号及び再審査証明書第B1 4,912,094号には、3D-MPL及びその製造方法が開示されている。別のTLR4アゴニストは、合成リピドA様分子であるグルコピラノシルリピドアジュバント(GLA)である(例えば、Fox et al. (2012) Clin. Vaccine Immunol 19:1633を参照のこと)。さらなる実施形態では、TLR4アゴニストは、合成TLR4アゴニスト、例えば構造においてMPL及び3D-MPLと類似する合成二糖分子であってもよく、又はTLR4アゴニストは、合成単糖分子、例えば、例えばWO9850399、WO0134617、WO0212258、WO3065806、WO04062599、WO06016997、WO0612425、WO03066065及びWO0190129に開示されるアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)化合物であってもよい。そのような分子もまた、リピドA模倣体として科学文献及び特許文献に記載されている。リピドA模倣体は適切には、リピドAと一部の機能的及び/又は構造的活性を共有しており、一態様では、TLR4受容体によって認識される。本明細書に記載のAGPは、当技術分野ではリピドA模倣体と呼ばれることもある。好ましい実施形態では、TLR4アゴニストは、3D-MPLである。TLR4アゴニスト、例えば3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)及びワクチンにおけるアジュバントとしてのその使用が、WO 96/33739及びWO2007/068907に例えば記載されており且つAlving et al. (2012) Curr Opin in Immunol 24:310でレビューされている。
適切には、アジュバントは、免疫学的に活性なサポニン、例えば免疫学的に活性なサポニン画分、例えばQS21を含む。
サポニンを含むアジュバントが当技術分野で記載されてきた。サポニンについては以下に記載されている: Lacaille-Dubois and Wagner (1996) A review of the biological and pharmacological activities of saponins, Phytomedicine vol 2:363。サポニンは、ワクチンにおけるアジュバントとして知られている。例えば、Quil A(南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する)は、アジュバント活性を有すると1974年にDalsgaardら("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, 243)に報告された。Quil Aと関連した無毒でアジュバント活性を保持するQuil Aの精製画分がHPLCによって単離された(Kensil et al. (1991) J. Immunol. 146: 431)。Quil A画分についてはまた、US 5,057,540及び"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55にも記載されている。
本発明での使用にとって適切な、そのような2つのQuil A画分が、QS7及びQS21(QA-7及びQA-21としても知られる)である。QS21は、本発明での使用のための免疫学的に活性な好ましいサポニン画分である。QS21はKensil (2000) In O'Hagan: Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols, Homana Press, Totowa, New Jersey, Chapter 15でレビューされている。Quil A、例えばQS21及びQS7の画分を含む粒子状アジュバントシステムが、例えば、WO 96/33739、WO 96/11711及びWO2007/068907に記載されている。
他の成分に加えて、アジュバントは好ましくはステロールを含む。ステロールの存在は、サポニンを含む組成物の反応原性をさらに低下させ得る。例えばEP0822831を参照のこと。適切なステロールとしては、ベータ-シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールが含まれる。コレステロールが特に適切である。適切には、免疫学的に活性なサポニン画分はQS21であり、QS21:ステロールの比は、1:100から1:1 w/w、例えば1:10から1:1 w/w、例えば1:5から1:1 w/wである。
好ましい実施形態では、アジュバントは、TLR4アゴニスト及び免疫学的に活性なサポニンを含む。より好ましい実施形態では、TLR4アゴニストは3D-MPLであり、免疫学的に活性なサポニンはQS21である。
一部の実施形態では、アジュバントは、例えば、スクアレン、アルファ-トコフェロール及び界面活性剤(例えば、WO95/17210を参照のこと)を含む水中油型エマルジョンの形態で、又はリポソームの形態で提供される。リポソームでの提供が好ましい。
本明細書で用いられる場合の「リポソーム」という用語は、水性の内部を囲む単層又は多層(特に、形成される脂質膜の数に応じて、2、3、4、5、6、7、8、9又は10層)の脂質構造をいう。リポソーム及びリポソーム製剤は、当技術分野でよく知られている。リポソームでの提供は、例えば、WO 96/33739及びWO2007/068907に記載されている。リポソームを形成することができる脂質には、脂肪又は脂肪様特性を有する全ての物質が含まれる。リポソーム中の脂質を構成することができる脂質は、グリセリド、グリセロリン脂質、グリセロホスフィノ脂質、グリセロホスホノ脂質、スルホリピド、スフィンゴ脂質、リン脂質、イソプレノリド、ステロイド、ステアリン、ステロール、アルケオリピド、合成カチオン性脂質及び炭水化物含有脂質を含む群から選択することができる。本発明の特定の実施形態では、リポソームはリン脂質を含む。適切なリン脂質には(限定されないが): ホスファチジルコリンの合成における中間体であるホスホコリン(PC); 天然リン脂質誘導体: 卵ホスホコリン、卵ホスホコリン、大豆ホスホコリン、水素化大豆ホスホコリン、天然リン脂質としてのスフィンゴミエリン; 及び合成リン脂質誘導体: ホスホコリン(ジデカノイル-L-a-ホスファチジルコリン[DDPC]、ジラウロイルホスファチジルコリン[DLPC]、ジミリストイルホスファチジルコリン[DMPC]、ジパルミトイルホスファチジルコリン[DPPC]、ジステアロイルホスファチジルコリン[DSPC]、ジオレオイルホスファチジルコリン[DOPC]、1-パルミトイル,2-オレオイルホスファチジルコリン[POPC]、ジエライドイルホスファチジルコリン[DEPC])、ホスホグリセロール(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DMPG]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DPPG]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[DSPG]、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール[POPG])、ホスファチジン酸(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸[DMPA]、ジパルミトイルホスファチジン酸[DPPA]、ジステアロイル-ホスファチジン酸[DSPA])、ホスホエタノールアミン(1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DMPE]、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DPPE]、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DSPE]、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン[DOPE])、ホスホセリン、ポリエチレングリコール[PEG]リン脂質が含まれる。
リポソームのサイズは、リン脂質の組成及びその調製のために使用される方法に応じて、30nmから数μmで変化してもよい。本発明の特定の実施形態では、リポソームのサイズは、50nm~500nmの範囲となり、さらなる実施形態では、50nm~200nmである。動的レーザー光散乱は、当業者であればよく知られているリポソームのサイズを測定するのに使用される方法である。
特に適切な実施形態では、本発明において用いられるリポソームは、DOPC及びステロール、特にコレステロールを含む。したがって、特定の実施形態では、本発明による使用のための組成物は、本明細書に記載の任意の量でリポソームの形態にあるQS21を含み、ここで、前記リポソームはDOPC及びステロール、特にコレステロールを含む。
より好ましい実施形態では、アジュバントはリポソーム製剤中に3D-MPL及びQS21を含む。
一実施形態では、アジュバントは、リポソーム製剤中に25~75、例えば35~65マイクログラム(例えば約又は正確に50マイクログラム)の3D-MPL、及び25~75、例えば35~65(例えば約又は正確に50マイクログラム)のQS21を含む。
別の実施形態では、アジュバントは、リポソーム製剤中に12.5~37.5、例えば20~30マイクログラム(例えば約又は正確に25マイクログラム)の3D-MPL、及び12.5~37.5、例えば20~30マイクログラム(例えば約又は正確に25マイクログラム)のQS21を含む。
本発明の別の実施形態では、アジュバントは水中油型エマルジョンを含むか又はそれからなる。適切には、水中油型エマルジョンは、代謝可能な油及び乳化剤を含む。特に適切な代謝可能な油はスクアレンである。スクアレン(2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン)は、サメ肝油に大量に、オリーブ油、小麦胚芽油、米糠油及び酵母では少量で見いだされる不飽和油である。一実施形態では、代謝可能な油は、免疫原性組成物中に組成物の総体積の0.5%~10%(v/v)の量で存在する。特に適切な乳化剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート80又はツイーン80)である。一実施形態では、乳化剤は、免疫原性組成物中に組成物の総体積の0.125~4%(v/v)の量で存在する。水中油型エマルジョンはトコールを場合により含むことができる。トコールは当技術分野でよく知られており、EP0382271 B1に記載されている。適切には、トコールは、アルファ-トコフェロール又はその誘導体、例えばアルファ-トコフェロールコハク酸エステル(ビタミンEコハク酸エステルとしても知られる)とすることができる。一実施形態では、トコールは、アジュバント組成物中に免疫原性組成物の総体積の0.25%~10%(v/v)の量で存在する。水中油型エマルジョンはまた場合によりソルビタントリオレエート(SPAN 85)を含むことができる。
水中油型エマルジョンでは、油と乳化剤は水性担体に含まれている必要がある。水性担体は、例えばリン酸緩衝生理食塩水又はクエン酸塩とすることができる。
特に、本発明で使用される水中油型エマルジョンシステムは、サブミクロンの範囲の小さい油滴サイズを有する。適切には液滴サイズは、直径が120~750nmの範囲となり、より具体的には120~600nmのサイズとなる。さらにより具体的には、水中油型エマルジョンは、強度でそのうちの少なくとも70%が直径500nm未満であり、より具体的には強度でそのうちの少なくとも80%が直径300nm未満であり、より具体的には強度でそのうちの少なくとも90%が直径120~200nmの範囲にある油滴を含有する。
HSV Fc受容体又はその断片若しくはバリアント及びアジュバントは、別々に保存され、対象に投与する前に(即席に、ex tempo)混合することができることが理解されるであろう。HSV Fc受容体又はその断片若しくはバリアント及びアジュバントはまた、個別でしかし同時に対象に投与することができる。
一態様では、本明細書に記載のHSV2若しくはHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント及びアジュバントを含むか又はそれらからなるキットを提供する。
配列比較
密接に関連する2つポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を比較する目的で、第1の配列と第2の配列との間の「配列同一性」又は「%同一性」は、アラインメントプログラム、例えば標準設定を使用したBLAST(登録商標)(blast.ncbi.nlm.nih.govで入手可能、最終アクセス日: 2016年9月12日)を使用して求めることができる。パーセンテージ同一性は、同一である残基の数をアラインメントの長さで除して、100を乗じたものである。同一性の代替の定義は、同一である残基の数をアラインメントをとった残基の数で除して、100を乗じたものである。代替の方法はギャップ法(gapped method)を使用することを含むが、この場合、アラインメントにおけるギャップ、例えば、他方の配列に対する一方の配列中の欠失が考慮される。ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列は、それらがそれらの全長にわたって100%の配列同一性を共有する場合、他方のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列と同一であると言われる。
密接に関連する2つポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を比較する目的で、第1の配列と第2の配列との間の「配列同一性」又は「%同一性」は、アラインメントプログラム、例えば標準設定を使用したBLAST(登録商標)(blast.ncbi.nlm.nih.govで入手可能、最終アクセス日: 2016年9月12日)を使用して求めることができる。パーセンテージ同一性は、同一である残基の数をアラインメントの長さで除して、100を乗じたものである。同一性の代替の定義は、同一である残基の数をアラインメントをとった残基の数で除して、100を乗じたものである。代替の方法はギャップ法(gapped method)を使用することを含むが、この場合、アラインメントにおけるギャップ、例えば、他方の配列に対する一方の配列中の欠失が考慮される。ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列は、それらがそれらの全長にわたって100%の配列同一性を共有する場合、他方のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列と同一であると言われる。
2つの配列間の「差異」とは、例えば、他方の配列と比較した、一方の配列のある位置における単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換をいう。
第1の参照ポリペプチド配列を第2の比較ポリペプチド配列と比較する目的で、第2の配列を作製するために第1の配列に対してなされた付加、置換及び/又は欠失の数を確認することができる。付加とは、第1のポリペプチドの配列への1個のアミノ酸残基の付加である(第1のポリペプチドのいずれかの末端での付加を含む)。置換とは、異なる1個のアミノ酸残基による第1のポリペプチドの配列中の1個のアミノ酸残基の置換である。欠失とは、第1のポリペプチドの配列からの1個のアミノ酸残基の欠失である(第1のポリペプチドのいずれかの末端での欠失を含む)。
適切には本発明の配列における置換は、保存的置換とすることができる。保存的置換は、置換されるアミノ酸と類似の物理化学的特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含む(例えば、Stryer et al, Biochemistry, 5th Edition 2002, pages 44-49を参照のこと)。好ましくは、保存的置換は以下からなる群から選択される置換である: (i)塩基性アミノ酸の別の異なる塩基性アミノ酸による置換、(ii)酸性アミノ酸の別の異なる酸性アミノ酸による置換、(iii)芳香族アミノ酸の別の異なる芳香族アミノ酸の置換、(iv)非極性脂肪族アミノ酸の別の異なる非極性脂肪族アミノ酸による置換、及び(v)極性非荷電アミノ酸の別の異なる極性非荷電アミノ酸による置換。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群から選択されることが好ましい。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であることが好ましい。芳香族アミノ酸は、好ましくは、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択されることが好ましい。極性非荷電アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換とは、上に概説の保存的置換(i)から(v)に該当しない任意のアミノ酸による1個のアミノ酸の交換である。
用語
「コードする」とは、生物学的プロセス、例えばペプチド又はタンパク質の合成における他のポリマー及び巨大分子の合成用の鋳型として機能する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性をいう。二本鎖ヌクレオチド分子のコード鎖(この配列は配列表で通常には提供される)と非コード鎖(遺伝子又はcDNAの転写用の鋳型として使用される)はどちらも、ペプチド又はタンパク質をコードするといいうる。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。
「コードする」とは、生物学的プロセス、例えばペプチド又はタンパク質の合成における他のポリマー及び巨大分子の合成用の鋳型として機能する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性をいう。二本鎖ヌクレオチド分子のコード鎖(この配列は配列表で通常には提供される)と非コード鎖(遺伝子又はcDNAの転写用の鋳型として使用される)はどちらも、ペプチド又はタンパク質をコードするといいうる。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。
本明細書で使用される「発現」又は「発現する」という用語は、その作動可能に連結されたプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び/又は翻訳として定義される。
本開示の文脈において特に説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 及びRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。
「a」、「an」及び「the」という単数形の用語は、文脈から明確に別義が示されていない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈から明確に別義が示されていない限り、「又は」という単語は「及び」を含むことが意図される。「複数」という用語は2以上のことをいう。核酸又はポリペプチドに対して与えられている全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ及び全ての分子量又は分子質量値は近似であり、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。加えて、物質、例えば抗原の濃度又はレベルに関して与えられている数値限定は近似であることが意図される。したがって、濃度が少なくとも(例えば)200pgであると指示されている場合は、濃度は少なくとも概ね(approximately)(又は「約(about)」又は「およそ(~)」)200pgであると理解されるべきであることが意図される。
「含む(comprises)」という用語は「包含する(includes)」を意味する。したがって、文脈から明確に別義が示されていない限り、「comprises」という単語及びその変化形、例えば「comprise」及び「comprising」は、表明された化合物若しくは組成物(例えば、核酸、ポリペプチド、抗原)若しくはステップ、又は化合物群若しくはステップ群を包含することを意味するが、他の任意の化合物、組成物、ステップ、又はこれらの群を排除することを意味しないと理解されるであろう。
本明細書で提供されるアミノ酸配列は、当技術分野で知られるように、一文字又は三文字の命名法のいずれかによって指定される(例えば、Eur. J. Biochem. 138:9-37(1984)を参照のこと)。
本開示の実行又は試験にあたっては、本明細書に記載するものと類似又は等価の方法及び材料を使用することができるが、適切な方法及び材料について下に記載する。
次に、本発明について以下の非限定的な例によってさらに説明する。
[実施例]
[実施例1]
本研究の一般的な目的は、ヒト免疫グロブリンG Fcに対する結合力を低下させる、gE Fc結合ドメイン中に突然変異を含有する5種の新規組換えHSV-2 gE/gIタンパク質を用いて免疫原性データを生成することであった。
[実施例1]
本研究の一般的な目的は、ヒト免疫グロブリンG Fcに対する結合力を低下させる、gE Fc結合ドメイン中に突然変異を含有する5種の新規組換えHSV-2 gE/gIタンパク質を用いて免疫原性データを生成することであった。
主な目的は、3回目の免疫化の14日後にアミノ酸配列中に突然変異を含有するいくつかのAS01アジュバント化組換えHSV-2 gE/gIタンパク質によって誘導された抗HSV-2 gE特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答を、NaCl対照群に対して比較することであった。
副次的目的として、3回目の免疫化の14日後、HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異体によって誘導された抗HSV-2 gI特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答及び抗HSV-2 gE/gI特異的CD4+T細胞応答を、NaCl対照群に対して比較した。さらに、抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的IgG抗体応答及びCD4+T細胞応答に関してすべてのワクチン候補の直接比較を3回目の免疫化の14日後に実施した。
最後に、探索的目的は、HSV-2 gE/gI突然変異体で免疫したマウスの異なる群において、1回及び2回の免疫化後の抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的抗体応答、3回の免疫化後の抗HSV-1 gE/gI交差反応性抗体応答、3回の免疫化後のワクチン特異的及びHSV-1 gE/gI交差反応性ポリクローナル抗体の機能並びに3回目の免疫化後の抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD8+T細胞応答のレベルを評価することであった。
導入
ヘルペスウイルスは、その天然宿主において生き残るために多様な免疫回避戦略を発達させた。ヒト単純ウイルス(HSV)は、すなわち体液性免疫機構を標的とする糖タンパク質E(gE)をコードする。gEは、免疫グロブリンG(IgG)Fc受容体(FcγR)として機能する糖タンパク質I(gI)との非共有結合ヘテロ二量体複合体を形成することができる。gEとgIの間の相互作用は、ヒトFc結合親和性を約100倍増大する。抗体結合によって、FcγRは、補体結合性及び抗体依存性細胞性細胞傷害性を含むIgG Fc媒介性活性を阻害する。
ヘルペスウイルスは、その天然宿主において生き残るために多様な免疫回避戦略を発達させた。ヒト単純ウイルス(HSV)は、すなわち体液性免疫機構を標的とする糖タンパク質E(gE)をコードする。gEは、免疫グロブリンG(IgG)Fc受容体(FcγR)として機能する糖タンパク質I(gI)との非共有結合ヘテロ二量体複合体を形成することができる。gEとgIの間の相互作用は、ヒトFc結合親和性を約100倍増大する。抗体結合によって、FcγRは、補体結合性及び抗体依存性細胞性細胞傷害性を含むIgG Fc媒介性活性を阻害する。
マウスで実施されたこれまでの実験によって、ヒトIgGは、非突然変異組換えHSV-2 gE/gIタンパク質のgE Fc結合ドメインに結合し、HSV-2 gE媒介性免疫回避メカニズムに関与する保護的エピトープをマスクできることが示された。これらの結果は、同様の状況は臨床において起こり、HSV-2ワクチン治療効力に負の影響を及ぼす可能性があることを示唆した。ヒトにおける負の免疫学的干渉を避けるために、hIgG Fcドメインに対する親和性を低減するためにHSV-2 gE/gIタンパク質のFc結合ドメイン内で点突然変異を実施し、HSV-2 gE-P317R/gI突然変異体構築物を生成した。gE Fc結合ドメイン中に突然変異を含有するさらなる構築物を生成し、その免疫原性を評価した。特に、AS01で製剤化された5つの異なる5-2 gE/gI突然変異体タンパク質のマウスにおける免疫原性を評価した。
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~5及びn=4/群6)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0、14及び28日目に、AS01(5μg)で製剤化した5μgの異なるHSV-2 gE/gI突然変異体タンパク質で、CB6F1マウス(群1~5)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群6)として使用した。
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~5及びn=4/群6)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0、14及び28日目に、AS01(5μg)で製剤化した5μgの異なるHSV-2 gE/gI突然変異体タンパク質で、CB6F1マウス(群1~5)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群6)として使用した。
血清試料を、プライム免疫化後14、28及び42日目(14PI、14PII、14PIII)に採取して、抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的及び抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答を測定し、ワクチン特異的及び交差反応性ポリクローナル抗体の機能を特徴付けた。HSV-2 gE及びgI抗原に対するex-vivoで全身性CD4+/CD8+T細胞応答を評価するために、3回目の免疫化後14日目(14PIII)に脾臓を採取した。各群の詳細は、表3に記載されている。
材料及び方法
この研究において使用された抗原は、精製組換えgE/gI突然変異体タンパク質の外部ドメインであった。材料はExpiCHO(商標)発現システムを使用することによって生成し、研究ロットとしてのみ使用した。
この研究において使用された抗原は、精製組換えgE/gI突然変異体タンパク質の外部ドメインであった。材料はExpiCHO(商標)発現システムを使用することによって生成し、研究ロットとしてのみ使用した。
AS01は、QS-21(キラヤ(Quillaja saponaria)の樹皮から精製されたトリテルペングリコシド)及びMPL(3-DモノホスホリルリピドA)を含有するリポソームベースのアジュバントシステム(AS)であり、これらの免疫増強剤の媒体としてリポソーム及び等張剤としてNaClを含む緩衝剤を有する。
AS01bアジュバントシステムの単回ヒト用量(0.5mL)は、50μgのQS-21及び50μgのMPLを含有する。この研究では、マウスに注射された容量は、用量あたり5μgのQS-21及び5μgのMPLに対応するヒト用量の1/10である。
動物モデル
小動物モデルが新規ワクチン候補の免疫原性プロファイルを研究するための有用なツールであることは広く受け入れられている。本発明者らのワクチン候補のT細胞免疫応答を誘導する能力の概要を把握するために、この研究ではCB6F1マウス(C57Bl/6とBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。
小動物モデルが新規ワクチン候補の免疫原性プロファイルを研究するための有用なツールであることは広く受け入れられている。本発明者らのワクチン候補のT細胞免疫応答を誘導する能力の概要を把握するために、この研究ではCB6F1マウス(C57Bl/6とBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。
CB6F1マウスは、アジュバント化タンパク質及びウイルスベクターを含む種々のタイプの免疫原を用いるワクチン接種後に、強力なCD4+/CD8+T細胞及び体液性免疫応答を生成することがわかっている。それにもかかわらずヒトにおける予測される応答と比較されるこれらのマウスにおいて生じたワクチン誘導性免疫応答のプロファイルは、TLR発現、HLAバックグラウンド及び抗原提示に関与するいくつかの相違によって影響を受けることがある。しかし、CD4+/CD8+T免疫応答を誘導する能力は、これらのマウス及びヒトの間で同等の傾向を示した。
ELISAによる総抗HSV-2 gE及びgI特異的IgG抗体の検出
総抗gE又はgI特異的IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-2由来の組換えgE(約51kDa)(BMP1049又はBMP1291)又はgIタンパク質(約46kDa)(BMP1052b又はBMP1292)をコーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して産生した。
総抗gE又はgI特異的IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-2由来の組換えgE(約51kDa)(BMP1049又はBMP1291)又はgIタンパク質(約46kDa)(BMP1052b又はBMP1292)をコーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して産生した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、100μL/ウェルの、炭酸/重炭酸50mM pH9.5緩衝剤で2μg/mLの濃度に希釈した抗原(gE)及び1μg/mL(gI)を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを、200μL/ウェルの、PBS(ブロッキング緩衝剤)(ref 232100、Becton Dickinson、USA)で希釈したDifkomilk 10%を用いて37℃で1時間ブロッキングした。インキュベーション後、ブロッキング溶液を除去し、各血清試料の3倍段階希釈(PBS+0.1% ツイーン20+1% BSA緩衝剤で)を実施し、コーティングされたプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS 0.1% ツイーン20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Peroxydase)がコンジュゲートしたAffiniPureヤギ抗マウスIgG(H+L)(ref 115-035-003、Jackson、USA)を二次抗体として使用した。ウェルあたり100マイクロリットルの、PBS+0.1% ツイーン20+1% BSA緩衝剤で1:500の濃度で希釈した二次抗体を各ウェルに添加し、プレートを37℃で45分間インキュベートした。
次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回及び脱イオン水を用いて2回洗浄し、100μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤で希釈した75%の単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)の溶液とともにRT(室温)で15分間インキュベートした。酵素的発色現像をウェルあたり100μLの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、Versamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度でプレートを読み出した。
光学密度(OD)をキャプチャし、SoftMaxPro GxP v5.3ソフトウェアを使用して分析した。標準曲線は、4パラメーターロジスティック回帰フィットを参照標準結果に適用することによって作成した(参照標準抗gE=20180011 14PIII-AS01/gE(5μgの各々/用量)で免疫したマウス1.1~1.20のプール;参照標準抗gI=20190021 14PII-AS01/gI(5μgの各々/用量)で免疫したマウス2.1~2.5のプール)。試料における抗体価は、標準曲線の補間によって算出した。試料の抗体価は、標準曲線の20~80%ダイナミックレンジ内に入った希釈物から得た値を平均化することによって得た。力価は、EU/mL(mL当たりのELISAユニット)で表された。
ELISAによる総抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体の検出
総HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-1由来の組換えgE/gIヘテロ二量体タンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。このタンパク質は、ExpiCHO(商標)発現システムを使用して産生した。
総HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-1由来の組換えgE/gIヘテロ二量体タンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。このタンパク質は、ExpiCHO(商標)発現システムを使用して産生した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、100μL/ウェルの、炭酸/重炭酸50mM pH9.5緩衝剤で2μg/mLの濃度に希釈した組換えHSV-1 gE/gIヘテロ二量体タンパク質でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを、200μL/ウェルの、PBS(ブロッキング緩衝剤)(ref 232100、Becton Dickinson、USA)で希釈したDifkomilk 10%を用いて37℃で1時間ブロッキングした。インキュベーション後、ブロッキング溶液を除去し、各血清試料の3倍段階希釈(PBS+0.1% ツイーン20+1% BSA緩衝剤で)を実施し、コーティングされたプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBS 0.1% ツイーン20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼでコンジュゲート化したAffiniPureヤギ抗マウスIgG(H+L)(ref 115-035-003、Jackson、USA)を二次抗体として使用した。ウェルあたり100マイクロリットルの、PBS+0.1% ツイーン20+1% BSA緩衝剤で1:500の濃度で希釈した二次抗体を各ウェルに添加し、プレートを37℃で45分間インキュベートした。
次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回及び脱イオン水を用いて2回洗浄し、100μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤で希釈した75%の単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)の溶液とともにRT(室温)で15分間インキュベートした。酵素的発色現像をウェルあたり100μLの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、Versamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度でプレートを読み出した。
光学密度(OD)をキャプチャし、SoftMaxPro GxP v5.3ソフトウェアを使用して分析した。標準曲線は、4パラメーターロジスティック回帰フィットを参照標準結果に適用することによって作成した(参照標準=20200023 14PIII-AS01-HSV-1/gI HEK(5μgの各々/用量)で免疫したマウス1.1~1.20のプール)。試料における抗体価は、標準曲線の補間によって算出した。試料の抗体価は、標準曲線の20~80%ダイナミックレンジ内に入った希釈物から得た値を平均化することによって得た。力価は、EU/mL(mL当たりのELISAユニット)で表された。
ICSアッセイによって測定された抗HSV-2 gE及びgI特異的CD4+/CD8+T細胞応答
HSV-2 gE又はgIペプチドプールを用いるex-vivo刺激後、3回目の免疫化後14日目に採取した脾細胞においてIL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生する抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD4+及びCD8+T細胞の頻度を評価した。
HSV-2 gE又はgIペプチドプールを用いるex-vivo刺激後、3回目の免疫化後14日目に採取した脾細胞においてIL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生する抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD4+及びCD8+T細胞の頻度を評価した。
脾細胞の単離
第3の免疫化後14日に個々のマウスから脾臓を採取し、RPMI添加剤(グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び2-メルカプトエタノール)を添加したRPMI1640培地(=RPMI/添加剤)に入れた。組織グラインダーを使用して各脾臓から細胞懸濁液を調製した。脾臓の細胞懸濁液を濾過し(セルストレーナー(cell stainer)100μm)、次いで、フィルターを40mLの冷PBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、4℃で10分間)後、細胞を7mLの冷PBS-EDTA 2mMに再懸濁した。第2の洗浄ステップをこれまでに記載されたように実施し、最後に、細胞を1mLの、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に再懸濁した(Capricorn scientific、FBS-HI-12A)。細胞懸濁液を次いで、細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のためにPBS緩衝剤(190μL)で20×(10μL)希釈した。計数後、細胞を遠心分離(335g、RTで10分間)し、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に107個細胞/mLで再懸濁した。
第3の免疫化後14日に個々のマウスから脾臓を採取し、RPMI添加剤(グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸及び2-メルカプトエタノール)を添加したRPMI1640培地(=RPMI/添加剤)に入れた。組織グラインダーを使用して各脾臓から細胞懸濁液を調製した。脾臓の細胞懸濁液を濾過し(セルストレーナー(cell stainer)100μm)、次いで、フィルターを40mLの冷PBS-EDTA 2mMを用いてすすいだ。遠心分離(335g、4℃で10分間)後、細胞を7mLの冷PBS-EDTA 2mMに再懸濁した。第2の洗浄ステップをこれまでに記載されたように実施し、最後に、細胞を1mLの、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に再懸濁した(Capricorn scientific、FBS-HI-12A)。細胞懸濁液を次いで、細胞計数(MACSQuantアナライザーを使用する)のためにPBS緩衝剤(190μL)で20×(10μL)希釈した。計数後、細胞を遠心分離(335g、RTで10分間)し、5% FCSを添加したRPMI/添加剤に107個細胞/mLで再懸濁した。
細胞調製
新鮮脾細胞を丸底96ウェルプレートに106個細胞/ウェル(100μL)で播種した。次いで、
- 15merの、HSV-2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-2由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA-それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)
のいずれかの100μLを含有する、ウェルあたり1μg/mLの抗CD28(BD Biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間刺激した(37℃、5% CO2)。
新鮮脾細胞を丸底96ウェルプレートに106個細胞/ウェル(100μL)で播種した。次いで、
- 15merの、HSV-2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-2由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- PMA-それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のイオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)
のいずれかの100μLを含有する、ウェルあたり1μg/mLの抗CD28(BD Biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間刺激した(37℃、5% CO2)。
ex vivo刺激の2時間後、5% FCSを添加したRPMI/添加剤で1/200希釈されたブレフェルジンA(Golgi plug ref 555029、BD Bioscience)をさらに4時間添加して、サイトカイン分泌を阻害した。次いで、プレートを、一晩インキュベーションのために4℃で移した。
細胞内サイトカイン染色
4℃で一晩インキュベートした後、細胞をV底96ウェルプレートに移し、遠心分離し(189g、4℃で5分間)、250μLの冷PBS+1% FCS(フロー緩衝剤)で洗浄した。第2の遠心分離(189g、4℃で5分間)後、細胞を50μLの、1/50希釈した抗CD16/32抗体(BD Biosciences、クローン2.4G2)を含有するフロー緩衝剤に再懸濁して、非特異的抗体結合をブロッキングした(4℃で10分間)。次いで、50μLの、マウス抗CD4-V450抗体(1/100に希釈したBD Biosciences、クローンRM4-5)、抗CD8-PerCp-Cy5.5抗体(1/50に希釈したBD Biosciences、クローン53-6.7)及びLive/Dead(商標)Fixable Yellow死滅細胞染色(1/500に希釈した、Molecular probes、L34959)を含有するフロー緩衝剤を、4℃で暗所で30分間添加した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離した(189g、4℃で5分間)。第2の洗浄ステップを、200μLのフロー緩衝剤を用いて実施し、遠心分離後、細胞を固定し、200μLのCytofix-Cytoperm溶液(BD Biosciences、554722)を暗所で4℃で20分間添加することによって透過処理した。プレート遠心分離(500g、4℃で5分間)後、細胞を200μLのPerm/Wash緩衝剤(BD Biosciences、554723)を用いて洗浄し、遠心分離し(500g、4℃で5分間)、50μLの、マウス 抗IL2-FITC(1/400に希釈したBD Biosciences、クローンJES6-5H4)、抗IFN-γ-APC(1/200に希釈したBD Biosciences、クローンXMG1.2)及び抗TNF-α-PE(1/700に希釈したBD Biosciences、クローンMP6-XT22)抗体を含有するPerm/Wash緩衝剤に、暗所で4℃で1時間再懸濁した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLの、フロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を、200μLのPerm/Wash緩衝剤を用いて最後に洗浄し(遠心分離500g、4℃で5分間)、220μLのPBSに再懸濁した。
4℃で一晩インキュベートした後、細胞をV底96ウェルプレートに移し、遠心分離し(189g、4℃で5分間)、250μLの冷PBS+1% FCS(フロー緩衝剤)で洗浄した。第2の遠心分離(189g、4℃で5分間)後、細胞を50μLの、1/50希釈した抗CD16/32抗体(BD Biosciences、クローン2.4G2)を含有するフロー緩衝剤に再懸濁して、非特異的抗体結合をブロッキングした(4℃で10分間)。次いで、50μLの、マウス抗CD4-V450抗体(1/100に希釈したBD Biosciences、クローンRM4-5)、抗CD8-PerCp-Cy5.5抗体(1/50に希釈したBD Biosciences、クローン53-6.7)及びLive/Dead(商標)Fixable Yellow死滅細胞染色(1/500に希釈した、Molecular probes、L34959)を含有するフロー緩衝剤を、4℃で暗所で30分間添加した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLのフロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を遠心分離した(189g、4℃で5分間)。第2の洗浄ステップを、200μLのフロー緩衝剤を用いて実施し、遠心分離後、細胞を固定し、200μLのCytofix-Cytoperm溶液(BD Biosciences、554722)を暗所で4℃で20分間添加することによって透過処理した。プレート遠心分離(500g、4℃で5分間)後、細胞を200μLのPerm/Wash緩衝剤(BD Biosciences、554723)を用いて洗浄し、遠心分離し(500g、4℃で5分間)、50μLの、マウス 抗IL2-FITC(1/400に希釈したBD Biosciences、クローンJES6-5H4)、抗IFN-γ-APC(1/200に希釈したBD Biosciences、クローンXMG1.2)及び抗TNF-α-PE(1/700に希釈したBD Biosciences、クローンMP6-XT22)抗体を含有するPerm/Wash緩衝剤に、暗所で4℃で1時間再懸濁した。インキュベーション後、各ウェル中に100μLの、フロー緩衝剤を添加し、次いで、細胞を、200μLのPerm/Wash緩衝剤を用いて最後に洗浄し(遠心分離500g、4℃で5分間)、220μLのPBSに再懸濁した。
細胞取得及び分析
染色された細胞を、LSRIIフローサイトメーターを使用するフローサイトメトリー及びFlowJoソフトウェアによって分析した。生細胞を、Live/Dead染色を用いて同定し、次いで、前方/側方散乱光(FSC/SSC)ゲーティングに基づいてリンパ球を単離した。約20,000のCD4+/CD8+T細胞事象で取得を実施した。IFN-γ+/-IL-2+/-及びTNF-α+/-産生細胞のパーセンテージをCD4+及びCD8+T細胞集団で算出した。各試料について、ペプチドプール刺激後に検出された特異的シグナルから培地刺激後に検出された非特異的シグナルを除去した。
染色された細胞を、LSRIIフローサイトメーターを使用するフローサイトメトリー及びFlowJoソフトウェアによって分析した。生細胞を、Live/Dead染色を用いて同定し、次いで、前方/側方散乱光(FSC/SSC)ゲーティングに基づいてリンパ球を単離した。約20,000のCD4+/CD8+T細胞事象で取得を実施した。IFN-γ+/-IL-2+/-及びTNF-α+/-産生細胞のパーセンテージをCD4+及びCD8+T細胞集団で算出した。各試料について、ペプチドプール刺激後に検出された特異的シグナルから培地刺激後に検出された非特異的シグナルを除去した。
HSV-2又はHSV-1 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後のマウスFcγRIIIに結合し、活性化するポリクローナル血清の能力の評価(ADCCバイオアッセイ-Promega)
Promega laboratoryによって開発されたマウスFcγRIII抗体依存性細胞細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、改変Jurkatリポーター細胞によって発現されたマウスFcγRIIIに特異的に結合し、活性化する抗体の能力を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。
Promega laboratoryによって開発されたマウスFcγRIII抗体依存性細胞細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、改変Jurkatリポーター細胞によって発現されたマウスFcγRIIIに特異的に結合し、活性化する抗体の能力を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。
概説すると、最初にATCC laboratoriesから購入した3T3細胞(クローンA31、ATCC ref CCL-163)をDMEM+10% 非補完性FBS+1% L-グルタミン2mM+1%ペニシリン/ストレプトマイシン培地で増殖させ、実験の0日目にT175フラスコ中に2×106個細胞で播種して、細胞が翌日の間、最適増殖期にあることを確実にした。
1日目に、各ウェル(エレクトロポレーションあたり1つのウェル)に2mLの増殖培地(DMEM (Prep Mil、Log377BA)、1% L-グルタミン2mM(Prep Mil、Log010D)、10%の超低IgG FBS(Gibco、A33819-01))を添加することによって6ウェルプレートを準備した。プレートを37℃インキュベーター(5% CO2)中で保温した。エレクトロポレーション装置(Gene Pulser、BIO-RAD)を325V、350μF電気容量、無限抵抗、4mmキュベットのために1パルスを送達するように準備した。増殖期の3T3細胞を増殖培地中に回収し、細胞計数機器(TC20、BIO-RAD)を使用して計数した。各エレクトロポレーションのために、5×105個の3T3細胞(1×106個細胞/mLで500μLの細胞)及び20μgのHSV-2 gE/gI又はHSV-1 gE/gIプラスミドDNA(1μg/μLで20μL)を使用した。陰性対照としては、10μLの水を使用した。細胞及びHSV-2又はHSV-1 gE/gIプラスミドDNA混合物を4mmキュベット(Gene Pulserエレクトロポレーションキュベット、BIO-RAD)に移し、直ちに、上記のパラメーターを使用するエレクトロポレーションの1パルスに付した。エレクトロポレーション後、すべてのキュベットをプールして、細胞懸濁液をホモジナイズし、500μLの細胞懸濁液/ウェルを6ウェルプレート中の2mLの予め加温した培地に移した。インキュベーションの前に、6ウェルプレートを前後左右に数回スライドさせて、細胞を均一に分配し、次いで、37℃、5% CO2で48時間インキュベートした。
48時間のインキュベーション後、異なる6ウェルプレートからHSV-2又はHSV-1 gE/gIをトランスフェクトされた3T3細胞(標的細胞(T))を採取し、プールした。細胞懸濁液を遠心分離(RTで10分間、340g)し、細胞計数(TC20、BIO-RAD)のためにPromegaアッセイ緩衝剤(96% RPMI(G7080)+4%の低IgG血清(G7110);Promega)に再懸濁した。次いで、Promegaアッセイ緩衝剤で96,000個/mLの3T3細胞の溶液を調製し、この懸濁液の25μL(24,000個細胞/25μL/ウェル)を96ウェルプレート中に添加した。丸底96ウェルプレート(Nunc、ref 168136)において、Promegaアッセイ緩衝剤で200μL中の各マウス血清試料の3倍段階希釈(HSV-2について開始希釈1/500及びHSV-1について1/200)を実施し、各希釈物の25μLをすでにHSV-2又はHSV-1 gE/gIでトランスフェクトされた3T3細胞を含有する対応するウェルに移した。最後に、各ウェルに、25μLの、240,0000個細胞/mL(60,000個細胞/25μL/ウェル)の濃度のマウスFcγRIIIを発現する遺伝子操作されたJurkat細胞(エフェクター細胞(E))を添加し(約E/T 2.5/1)、プレートを37℃-5% CO2で6時間インキュベートした。
インキュベーション後、プレートをRTに15分間静置し、各ウェルに75μLのBio-Glow試薬を添加した。最後にプレートをRTで20分間インキュベートし、ルミノメーター(BioTek Synergy H1)を使用して読み出した。
ワクチン特異的抗体の、HSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を評価するための競合的ELISA法
組換えHSV-2 gE/gIタンパク質によるin vitro hIgG抗体結合を減少させる、種々の群のマウスにおいて採取されたポリクローナル血清の能力を競合的ELISA法によって調べた。ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV-2 gE/gIタンパク質(BMP1063)を、コーティング抗原として使用した。
組換えHSV-2 gE/gIタンパク質によるin vitro hIgG抗体結合を減少させる、種々の群のマウスにおいて採取されたポリクローナル血清の能力を競合的ELISA法によって調べた。ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV-2 gE/gIタンパク質(BMP1063)を、コーティング抗原として使用した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、50μL/ウェルの、遊離カルシウム/マグネシウムPBS緩衝剤で4μg/mLの濃度に希釈したHSV-2 gE/gIタンパク質を用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを100μL/ウェルの、0.1% ツイーン-20+1% BSAを添加したPBS(ブロッキング緩衝剤)とともに37℃で1時間ブロッキングした。
96ウェル透明V底ポリプロピレンマイクロプレート(Falcon、ref 353263)において、60μL/ウェルで、各個々の血清についてブロッキング緩衝剤での2倍の段階希釈(希釈1/10で開始する)を調製し、60μL/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.7μg/mLで予め希釈されたビオチン化-hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C)と混合した。
次いで、ブロッキング緩衝剤とともに1時間のインキュベーション後、コーティングされたプレートからブロッキング溶液を除去し、100μLの、hIgG及びマウス両方の血清を含有する混合物を対応するHSV-2 gE/gIコーティングされたウェルに移し、37℃で24時間インキュベートした。アッセイの陽性対照は、これまでの研究からの抗HSV-2 gE/gI血清試料のプールであった。アッセイの陰性対照は、1/1000希釈され、hIgGとも混合された無関係のHPV血清試料のプールであった。
24時間のインキュベーション後、プレートをPBS 0.1%+ツイーン20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、2000×希釈されたストレプトアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Peroxydase)AMDEX(Amersham、ref RPN4401V)をウェルに添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤で希釈した75%の単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)を含有する溶液を室温で10分間添加した。酵素的発色現像を50μL/ウェルの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、プレートをVersamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度で読み出した。光学密度(OD)をキャプチャし、エクセルプログラムを用いて曲線にあてはめた。
力価は、試料希釈によってシグナルの50%(すなわち、ED50)が達成される有効希釈として表わされた。
各プレートについて、参照試料(すなわち、無関係の血清)を使用して、以下の式:
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
試料ED50力価を、プレート内のED50推定値に最も近い左右の測定値間の線形補間によってコンピュータによって計算した。非変換OD及び対数ベース10変換希釈で、stats R基本パッケージの近似関数を用いて近似が得られた。
以下の場合には試料に力価を割り当てなかった:
・ ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・ 曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
・ ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・ 曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
HSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させるHSV-1交差反応性抗体の能力を評価するための競合的ELISA法
組換えHSV-1 gE/gIタンパク質によるin-vitro hIgG抗体結合を減少させるマウスの異なる群において採取されたポリクローナル血清の能力を、競合的ELISA法によって調査した。ExpiCHO(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV-1 gE/gIヘテロ二量体タンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。
組換えHSV-1 gE/gIタンパク質によるin-vitro hIgG抗体結合を減少させるマウスの異なる群において採取されたポリクローナル血清の能力を、競合的ELISA法によって調査した。ExpiCHO(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV-1 gE/gIヘテロ二量体タンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、50μL/ウェルの、遊離カルシウム/マグネシウムPBS緩衝剤で2μg/mLの濃度に希釈したHSV-1 gE/gIタンパク質でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを100μL/ウェルの0.1% ツイーン-20+1% BSA(ブロッキング緩衝剤)を添加したPBSとともに37℃で1時間ブロッキングした。
別の96ウェル透明V底ポリプロピレンマイクロプレート(Falcon、ref 353263)において、各血清についてブロッキング緩衝剤で2倍段階希釈(希釈1/10で開始する)を60μl/ウェルで調製し、60μl/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.7μg/mLに予め希釈したビオチン化-hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C)と混合した。
次いで、ブロッキング緩衝剤とともに1時間のインキュベーション後、コーティングされたプレートからブロッキング溶液を除去し、100μLの、hIgG及びマウス血清の両方を含有する混合物を対応するウェルに移し、37℃で24時間インキュベートした。アッセイの陽性対照は、抗HSV-1 gE/gI血清試料のプールであった。アッセイの陰性対照は、1/1000希釈され、試料とともに使用されたものと同一の濃度のhIgGと混合された無関係のHPV血清試料のプールであった。
1時間のインキュベーション後、プレートをPBS 0.1% ツイーン20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、ウェルに2000x希釈された50μL/ウェルのストレプトアビジン-セイヨウワサビ(horsedish)ペルオキシダーゼAMDEX(Amersham、ref RPN4401V)を添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤で希釈された75%単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)を含有する溶液を室温で10分間添加した。酵素的発色現像を50μL/ウェルの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、プレートをVersamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度で読み出した。光学密度(OD)をキャプチャし、エクセルプログラムを用いて曲線にあてはめた。
力価は、試料希釈によってシグナルの50%(すなわち、ED50)が達成される有効希釈として表わされた。
各プレートについて、参照試料(すなわち、無関係の血清)を使用して、以下の式:
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
試料ED50力価を、プレート内のED50推定値に最も近い左右の測定値間の線形補間によってコンピュータによって計算した。非変換OD及び対数ベース10変換希釈で、stats R基本パッケージの近似関数を用いて近似が得られた。
以下の場合には試料に力価を割り当てなかった:
・ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた。
・ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた。
in vitro HSV-2 MS中和アッセイ
異なる動物種から得た血清試料においてHSV-2 MS中和抗体価を検出し、定量化するために、in vitro中和アッセイを開発した。平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)においてHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で2倍の段階希釈を実施することによって、血清(開始希釈1/10で50μL/ウェル)を希釈した。次いで、血清を、2%のモルモット血清補体を添加したHSV培地(Harlan、ref C-0006E)で予め希釈した400 TCID50/50μL/ウェルのHSV-2 MS系統(ref ATCC VR-540)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムをウイルス及び血清を含まずに(TC)又は、ウイルスを有するが血清を含まずに(TV)残し、それぞれ感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV-2 gD/AS01(2.5μg)で免疫されたマウスから得た、第2の(14PII)又は第3の(14PIII)免疫化の14日後に採取されたプールされた血清試料であった。抗体-ウイルス混合物のインキュベーション後、各プレートの各ウェルに10,000個Vero細胞/100μLを添加し、プレートを5% CO2下37℃で4日間インキュベートした。感染の4日後、プレートから上清を除去し、細胞をHSV顕色培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシン+2% FBSを添加したDMEM)で15×希釈したWST-1溶液(細胞生存力を測定するための試薬、Roche、ref 11644807001)とともに37℃(5% CO2)で5時間インキュベートした。
異なる動物種から得た血清試料においてHSV-2 MS中和抗体価を検出し、定量化するために、in vitro中和アッセイを開発した。平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)においてHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で2倍の段階希釈を実施することによって、血清(開始希釈1/10で50μL/ウェル)を希釈した。次いで、血清を、2%のモルモット血清補体を添加したHSV培地(Harlan、ref C-0006E)で予め希釈した400 TCID50/50μL/ウェルのHSV-2 MS系統(ref ATCC VR-540)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムをウイルス及び血清を含まずに(TC)又は、ウイルスを有するが血清を含まずに(TV)残し、それぞれ感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV-2 gD/AS01(2.5μg)で免疫されたマウスから得た、第2の(14PII)又は第3の(14PIII)免疫化の14日後に採取されたプールされた血清試料であった。抗体-ウイルス混合物のインキュベーション後、各プレートの各ウェルに10,000個Vero細胞/100μLを添加し、プレートを5% CO2下37℃で4日間インキュベートした。感染の4日後、プレートから上清を除去し、細胞をHSV顕色培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシン+2% FBSを添加したDMEM)で15×希釈したWST-1溶液(細胞生存力を測定するための試薬、Roche、ref 11644807001)とともに37℃(5% CO2)で5時間インキュベートした。
中和抗体の力価を算出するために、データのセットを、「ウイルスを含まない細胞」ウェル及び「血清を含まない細胞」ウェルにおけるWST-1光学濃度(O.D.)の平均に基づいて、それぞれ0及び100%細胞変性効果(CPE)に正規化した。次いで、希釈iでのCPEの阻害のパーセンテージは、以下によって与えられた:
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
次いで、CPEの50%低減を与える希釈の逆数を、Softmaxproソフトウェアを用い非線形回帰を使用して外挿した。
in-vitro HSV-1中和アッセイ
異なる動物種から得た血清試料においてHSV-1交差反応性中和抗体の力価を検出し、定量化するために、in-vitro中和アッセイを開発した。平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)においてHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で各血清の2倍の段階希釈を実施した(開始希釈1/10で50μL/ウェル)。次いで、血清を、2%のモルモット血清補体(Harlan、ref C-0006E)を添加したHSV培地で予め希釈した400 TCID50/50μL/ウェルのHSV-1系統(ref ATCC VR-1789)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムをウイルス及び血清を含まずに(TC)又は、ウイルスを有するが血清を含まずに(TV)残し、それぞれ感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV-2 gD/AS01(2.5μg)で免疫したマウスから得た、2回目(14PII)又は3回目(14PIII)の免疫化後14日目に採取されたプールされた血清試料である。抗体-ウイルス混合物のインキュベーション後、各プレートの各ウェルに10,000個のVero細胞/100μLを添加し、プレートを5% CO2下37℃で4日間インキュベートした。感染の4日後、プレートから上清を除去し、細胞をHSV顕色培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシン+25% FBSを添加したDMEM)で15×希釈したWST-1溶液(細胞生存力を測定するための試薬、Roche、ref 11644807001)とともに37℃(5% CO2)で5時間インキュベートした。
異なる動物種から得た血清試料においてHSV-1交差反応性中和抗体の力価を検出し、定量化するために、in-vitro中和アッセイを開発した。平底96ウェルプレート(Nunclon Delta Surface、Nunc、Denmark、ref 167008)においてHSV培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシンを添加したDMEM)で各血清の2倍の段階希釈を実施した(開始希釈1/10で50μL/ウェル)。次いで、血清を、2%のモルモット血清補体(Harlan、ref C-0006E)を添加したHSV培地で予め希釈した400 TCID50/50μL/ウェルのHSV-1系統(ref ATCC VR-1789)とともに37℃(5% CO2)で2時間インキュベートした。プレートのエッジは使用せず、各プレートの1つのカラムをウイルス及び血清を含まずに(TC)又は、ウイルスを有するが血清を含まずに(TV)残し、それぞれ感染の陰性又は陽性対照として使用した。アッセイの陽性対照血清は、異なる用量(0.22、0.66、2、6μg/用量)のHSV-2 gD/AS01(2.5μg)で免疫したマウスから得た、2回目(14PII)又は3回目(14PIII)の免疫化後14日目に採取されたプールされた血清試料である。抗体-ウイルス混合物のインキュベーション後、各プレートの各ウェルに10,000個のVero細胞/100μLを添加し、プレートを5% CO2下37℃で4日間インキュベートした。感染の4日後、プレートから上清を除去し、細胞をHSV顕色培地(1%ネオマイシン及び1%ゲンタマイシン+25% FBSを添加したDMEM)で15×希釈したWST-1溶液(細胞生存力を測定するための試薬、Roche、ref 11644807001)とともに37℃(5% CO2)で5時間インキュベートした。
中和抗体の力価を算出するために、データのセットを、「ウイルスを含まない細胞」ウェル及び「血清を含まない細胞」ウェルにおけるWST-1光学濃度(O.D.)の平均に基づいて、それぞれ0及び100%細胞変性効果(CPE)に正規化した。次いで、希釈iでのCPEの阻害のパーセンテージは、以下によって与えられた:
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
阻害%=(O.D.i-平均O.D.血清を含まない細胞)/(平均O.D.ウイルスを含まない細胞-平均O.D.血清を含まない細胞)
次いで、CPEの50%低減を与える希釈の逆数を、Softmaxproソフトウェアを用い非線形回帰を使用して外挿した。
統計的手法
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各ワクチン特異的IgG抗体応答(gE又はgI)について、群(NaCl群を除く全群)、時点(14日目(14PI)、28日目(14PII)、42日目(14PIII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は応答や変動が(ほとんど)見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
時点のgE特異的分散共分散は、不均一複合対称性(Heterogenous Compound Symmetry)によってモデル化された。
複合対称性は時点間の相関が同じであることを考慮し、不均一は各時点に異なる分散を仮定したことを表す。ワクチン群ごとに異なる分散共分散行列がモデル化され、群間で異なる分散と異なる時点の相関を示している。
時点のgI特異的分散共分散は、不均一1次自己回帰(Heterogenous First Order Autoregressive)ARH(1)構造によってモデル化された。
自己回帰構造では、相関は隣接する時間で最も高くなり、時点間の距離が長くなると系統的に相関が減少すると考えられる。不均一とは、時点ごとに異なる分散を仮定したことを表す。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこれらのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群が含まれていないという事実にもかかわらず、主要評価項目に関連する比較を以下のようにコンピュータによって計算した:上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、gEについてのすべてのNaClレシピエントに与えられた力価又はgIについてのNaCl群の幾何平均力価で除算した。結果として得られた比は、幾何平均比とそれに対応する95%CIとして理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI、PIII/PII、PIII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10力価に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は応答や変動が見られなかったため、含めなかった。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均及びその95%CIは、これらのモデルから導かれる。ワクチン接種群対NaCl群の比較のために、上記のモデルから導かれたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIをすべてのNaClレシピエントに与えられた力価で除算した。結果として得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均比として理解されるべきである。ワクチン接種群の直接比較のために、すべての幾何平均比及びその95%CIはモデルから導かれた。
gE又はgI特異的CD4+又はCD8+T細胞応答の%については、群(NaCl群を含む全群)を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づくものとした。gI特異的CD8+T細胞については、すべてのワクチン接種群で応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化は行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
pAbによるヒトIgG Fc結合の解離を評価するために、各試料についてED50応答を算出した。この応答については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。各群の異なる分散をモデル化した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
HSV-2 MS特異的中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。各群の異なる分散をモデル化した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。HSV-1交差反応性中和抗体の力価について、異なる群に同一分散を仮定した点を除いて(分散の明確な不均一性は検出されなかった)、同一方法を使用した。
結果
HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型を用いて、抗HSV-2 gE及びgI特異的並びに抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体を誘導した
抗HSV-2 gE及びgIワクチン特異的並びに抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答をELISAによって調べた。
HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型を用いて、抗HSV-2 gE及びgI特異的並びに抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体を誘導した
抗HSV-2 gE及びgIワクチン特異的並びに抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答をELISAによって調べた。
NaCl対照群と比較して、3回目の免疫後14日目にAS01アジュバント化HSV-2 gE/gIタンパク質のすべての突然変異型によって、高い抗HSV2 gE又はgIワクチン特異的IgG抗体応答が誘導された(gEについてすべてのGMR>34,000及びgIについてすべてのGMR>6000)(図1A、図1B、図2A、図2B)。予想通り、NaCl対照群では抗HSV-2 gE又はgI応答は見られなかった(HSV-2 gI応答において135EU/mLの値を有するものを除くすべてのマウスについて<30EU/ml)。
AS01アジュバント化HSV-2 gE/gI突然変異体タンパク質で免疫したマウスのすべての群において、抗HSV-2 gE及びgI特異的IgG抗体応答のレベルは、2回目の免疫化後(28日目(14PII))に1回目のもの(14日目(14PI))と比較して増大し、増大倍数は5~63の範囲であった(図3A、図3C)。
2回目のもの(28日目(14PII))と比較して3回目の免疫化(42日目(14PIII))後に、すべてのHSV-2 gE/gI突然変異体タンパク質について、抗HSV2 gE特異的抗体応答への追加免疫効果も認められ、その倍数は2~4倍であった(及び1を含有しないCI)(図3B)。
2回目のものと比較した3回目の免疫化後の抗HSV-2 gI特異的抗体応答への追加免疫効果は、AS01アジュバント化HSV-2 gE/gI A246W(群3)及びP318I(群4)突然変異体タンパク質で免疫したマウスの群においてのみ検出された。A248T(群3)において、2回の免疫化後に1匹の動物が他のものと比較して極めて低い抗HSV-2 gI応答を有していたが、3回の免疫化後は他のものと非常に類似していたことに留意されたい。これは、その群において見られた追加免疫効果を増幅した可能性がある。他の3群では、追加免疫効果は見られなかった(変化の倍数<2及び1を含有するCI)(図3D)。
全体として、これらの結果は、3回目の免疫化後14日目のHSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型間の同様の抗HSV-2 gE又は抗HSV-2 gI特異的抗体応答を示唆する。P318I突然変異体(群4)のみは、V340W突然変異体(群1)と比較してより高い抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的抗体応答を誘導すると考えられ、その倍数は、2に近かった(それぞれ2.09及び2.39のGMR及び1を含有しないCI)(図4A及び図4B)。P318I突然変異体(群4)もまた、A246W突然変異体(群3)と比較してより高い抗HSV-2 gI特異的抗体応答を誘導すると考えられ、2.42の増大倍数を有していた(1を含有しないCIを有する)(図4B)。突然変異体間の他の相違は見られなかった(GMRの変化の倍数<2及び/又は1を含有するCIを有する)。
NaCl対照群では、抗HSV-1 gE/gI交差反応性応答は見られなかった(すべてのマウスについて<20EU/mL)。3回目の免疫化後14日目に、NaCl対照群と比較して、AS01アジュバント化HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型によって免疫されたマウスのすべての群において高い抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答が誘導された(すべてのGMR>20,000)(図5、図6)。
3回目の免疫化後14日目にHSV-2 gE/gI突然変異体候補間のいくつかの相違が見られるようであった。実際、P318I(群4)及びA248T_V340W(群5)両突然変異体によって誘導された交差反応性応答は、V340W(群1)及びA248T(群3)突然変異体によって誘導されたものよりも約3倍高いようであった(群1に対する群4又は5について3.1のGMR及び1を含有しないCI、並びに群3に対する群4又は5について2.7及び1に等しいCIの下限)。突然変異体間の他の相違は見られないようであった(GMR変化の倍数<2及び/又は1を含有しないCI)(図7)。
すべての組換えHSV-2 gE/gI突然変異体タンパク質は、抗HSV-2機能的gE/gI特異的並びに抗HSV-1 gE/gI交差反応性抗体を誘導することができる
この研究では、3回目の免疫化後14日目に採取された血清において抗HSV-2特異的及び抗HSV-1交差反応性抗体機能のみを調べた。この関連で、pAbが、HSV-2 MS又はHSV-1 VR1789ウイルスを中和する能力、HSV-2又はHSV-1 gE/gIがトランスフェクトされた細胞の結合後Jurkatリポーター細胞系統によって発現されたマウスFcγRIIIに結合し、活性化する能力並びにin-vitroでHSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を調べた。
この研究では、3回目の免疫化後14日目に採取された血清において抗HSV-2特異的及び抗HSV-1交差反応性抗体機能のみを調べた。この関連で、pAbが、HSV-2 MS又はHSV-1 VR1789ウイルスを中和する能力、HSV-2又はHSV-1 gE/gIがトランスフェクトされた細胞の結合後Jurkatリポーター細胞系統によって発現されたマウスFcγRIIIに結合し、活性化する能力並びにin-vitroでHSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を調べた。
AS01アジュバント化HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型で免疫したマウスの全ての群において、HSV-2 MS及び HSV-1 VR1789系統に対して向けられた極めて低いが一貫した中和抗体(nAb)応答が検出された。抗HSV-2特異的nAb応答に関して、HSV-2 gE/gIタンパク質の突然変異型間の相違の明確なエビデンスは見られなかった(GMR変化の倍数≦2及びすべての1を含有するCI)。P318I(群4)対V340W(群1)及びA246W(群3)突然変異体間の比較は、有意性にかろうじて到達できない変化の倍数2を示す(かろうじて1を下回るCIの下限)(図8A、図8B)。HSV-1 VR1789系統に対して向けられた交差反応性nAb応答の側では、結果はまた、HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型間の同様の応答を示唆する。P318I突然変異体のみ(群4)は、A246W突然変異体(群3)と比較してより高い応答を誘導するようであり、増大倍数は2に近かった(2.06のGMR及び1を含有しないCI)。P318I(群4)対V340W(群1)突然変異体間の比較は、有意性にかろうじて到達できない変化の倍数1.8を示す(かろうじて1を下回るCIの下限)。突然変異体間の他の相違は見られなかった(GMR変化の倍数<2及び1を含有するCI)(図9A及び図9B)。
次いで、異なるHSV-2 gE/gI突然変異体候補で免疫したマウスからの血清の、HSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG結合に競合し、減少させる能力を、競合的ELISA法によってin-vitroで評価した。HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型は、HSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG結合と競合することができる、ワクチン特異的及びHSV-1交差反応性ポリクローナル抗体応答を誘発した(図10及び図71)。HSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線は、マウスのすべての群間で非常によく類似していた。しかし、A248T_V340W突然変異体で免疫したマウス(群5)からのポリクローナル抗体を用いた場合に、A248T突然変異体(群2)と比較して、HSV-2 gE/gIタンパク質に向けられたhIgG Fc結合のより高い阻害性応答の傾向が見られ、1.96の増大倍数(及び1をほぼ含有しないCI)を有していた(図11A、図11B)。
最後に、3回目の免疫化後14日目に誘導されたワクチン特異的又はHSV-1 gE/gI交差反応性抗体応答の、in-vitroでマウスFcγRIIIに結合し、活性化する能力を、HSV-2及びHSV-1 gE/gIがトランスフェクトされた細胞で調べた。図12A~E及び図72A~Eで示されるデータは、AS01-HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群が、FcγRIIIを発現するJurkatリポーター細胞に特異的に結合し、活性化することができるHSV-2 gE/gI特異的及びHSV-1 gE/gI交差反応性抗体応答を誘導する可能性があることを示唆した。予想通り、FcγRIIIの活性化は、ワクチン非接種マウスからの血清を用いた場合には検出されなかった。HSV-2又はHSV-1 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後のFcγRIII活性化に関して、マウスの異なる群間で大きな相違は見られなかった(図12F及び図72F)。
結論として、これらのデータは、AS01/HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型が、HSV-2又はHSV-1 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後にFcγRIIIに結合し、活性化し、HSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させ、低強度でHSV-2及びHSV-1ウイルスを中和することができる機能的ワクチン特異的及びHSV-1 gE/gI交差反応性抗体を誘導し得ることを示唆している。
組換えHSV-2 gE/gIタンパク質のすべての突然変異型は、ワクチン特異的CD4+及びCD8+T細胞応答を誘導することができる
AS01アジュバント化HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において3回目の免疫化後14日目に、NaCl対照群と比較して、より高い抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞応答及び抗HSV-2 gE特異的CD8+T細胞応答が検出された(ワクチン及びNaCl群間の変化の倍数>16及び1を含有しないCI)。NaCl対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいても、抗HSV-2 gI特異的CD8+T細胞応答は検出されなかった(図13及び図14)。
AS01アジュバント化HSV-2 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において3回目の免疫化後14日目に、NaCl対照群と比較して、より高い抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞応答及び抗HSV-2 gE特異的CD8+T細胞応答が検出された(ワクチン及びNaCl群間の変化の倍数>16及び1を含有しないCI)。NaCl対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいても、抗HSV-2 gI特異的CD8+T細胞応答は検出されなかった(図13及び図14)。
この研究では、異なるHSV-2 gE/gI突然変異体候補間で同様の抗HSV-2 gE又は抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞応答が検出された。A248T_V340W突然変異体(群5)のみが、A248T突然変異体(群2)と比較してより高い抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞応答を誘導するようであり、2に近い増大倍数を有していた(それぞれ1.93及び2.44のGMR及び1を含有しないCI)(図15A及び図15B)。
同様に、抗HSV-2 gE特異的CD8+T細胞応答について、A248T_V340W突然変異体(群5)は、A248T突然変異体(群2)と比較してより高い応答を誘導するようであり、2.66の増大倍数を有していた(CIは1を含まない)。さらに、応答は、A248T_V340W(群5)を用いた場合にA246W(群3)と比較して、及びP318I(群4)を用いた場合にA246W(群3)と比較してより高いようであり、それぞれ2.78及び2.11の増大倍数を有していた(及び1を含まないCI)。V340W(群1)を用いた場合にA248T(群2)又はA246W(群3)と比較して、及びP318I(群4)を用いた場合にA248T(群2)と比較してより高い応答の傾向があり、2の増大倍数を有していた(及び1をほぼ含まないCI)。突然変異体間の他の相違は見られなかった(GMR変化の倍数<2及び/又は1を含有するCIを有する)(図15C)。
全体的な結果は、ワクチン特異的T細胞応答は、A248T_V340W突然変異体で免疫したマウスの群において、A248T突然変異体で免疫したマウスの群と比較してわずかに高いことを示唆している。
[実施例2]
目的
この実験の一般的な目的は、HSV-2 gE/gI配列の新規突然変異型を発現する6種の異なる脂質ナノ粒子(LNP)製剤化自己増幅性mRNA(SAM)ベクターのマウスにおける免疫原性を評価することである。
目的
この実験の一般的な目的は、HSV-2 gE/gI配列の新規突然変異型を発現する6種の異なる脂質ナノ粒子(LNP)製剤化自己増幅性mRNA(SAM)ベクターのマウスにおける免疫原性を評価することである。
主な目的は、3回目の免疫化後21日目に、いくつかのLNP製剤化SAM HSV-2 gE/gI突然変異体によって誘導されたgE特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答を、NaCl対照群に対して比較することであった。3回目の免疫化後21日目に、いくつかのLNP製剤化SAM HSV-2 gE/gI突然変異体によって誘導された抗HSV-2 gI特異的ポリクローナル抗体応答並びに抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞応答を、NaCl対照群に対して比較した。さらに、抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的IgG抗体応答並びにCD4+T細胞応答に関してすべてのワクチン候補の直接比較を3回目の免疫化の21日後に実施した。
最後に、探索的目的は、異なるLNP製剤化SAM HSV-2 gE/gI突然変異体において、1回及び2回の免疫化後の抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的抗体応答、3回の免疫化後の抗HSV-1 gE/gI交差反応性抗体応答、ワクチン特異的又は抗HSV-1 gE/gI交差反応性ポリクローナル抗体の機能並びに抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的CD8+T細胞応答のレベルを評価することであった。最後に、この研究ではHSV-1 gE抗原と交差反応する、3回の免疫化後に誘導されたワクチン特異的T細胞の能力も調べた。
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~6及びn=4/群7)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0、21及び42日目に、0.8μgの脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化されたSAM HSV-2 gE/gI突然変異体の異なる型で、CB6F1マウス(群1~6)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群7)として使用した。研究全体のために合計40匹の動物を使用した。
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~6及びn=4/群7)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0、21及び42日目に、0.8μgの脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化されたSAM HSV-2 gE/gI突然変異体の異なる型で、CB6F1マウス(群1~6)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群7)として使用した。研究全体のために合計40匹の動物を使用した。
血清試料を、プライム免疫化後21、42及び63日目(21PI、21PII、21PIII)に採取して、抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的並びに抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答を測定し、ワクチン特異的及びHSV-1交差反応性ポリクローナル抗体の機能を特徴付けた。HSV-2 gE及びgI並びにHSV-1 gE抗原に対する全身性CD4+/CD8+T細胞応答をex-vivoで評価するために、プライム免疫化後63日目(21PIII)に脾臓を採取した。各群の詳細は、表4に記載されている。
材料及び方法
治験薬
SAM HSV-2 gE/gI突然変異体を確立されたプロトコールに従ってin vitro転写(IVT)によって生成した。SAMを用いるLNPの調製は確立された方法に従った。この方法では、SAM-LNPは、脂質のエタノール性溶液をSAMを含有する水性緩衝剤と迅速に混合することによって調製される。迅速混合は、SAMとイオン対形成していた疎水性成分の過飽和をもたらす。SAM/脂質複合体は、核形成媒介性沈殿によって凝縮し、沈殿し、小さい狭く分散したナノ粒子をもたらす。この混合ステップ後、脂質ナノ粒子は成熟してRNAを捕捉し、次いで、緩衝剤交換ステップによって最終Tris/スクロース保存緩衝剤に移される。次いで、LNP溶液を、サイズ、脂質含量、RNA捕捉、最終SAM濃度及びin vitro効力について特徴付けした。材料を5%(w/v)スクロースを添加した後、-80℃で6か月間凍結することができる。
治験薬
SAM HSV-2 gE/gI突然変異体を確立されたプロトコールに従ってin vitro転写(IVT)によって生成した。SAMを用いるLNPの調製は確立された方法に従った。この方法では、SAM-LNPは、脂質のエタノール性溶液をSAMを含有する水性緩衝剤と迅速に混合することによって調製される。迅速混合は、SAMとイオン対形成していた疎水性成分の過飽和をもたらす。SAM/脂質複合体は、核形成媒介性沈殿によって凝縮し、沈殿し、小さい狭く分散したナノ粒子をもたらす。この混合ステップ後、脂質ナノ粒子は成熟してRNAを捕捉し、次いで、緩衝剤交換ステップによって最終Tris/スクロース保存緩衝剤に移される。次いで、LNP溶液を、サイズ、脂質含量、RNA捕捉、最終SAM濃度及びin vitro効力について特徴付けした。材料を5%(w/v)スクロースを添加した後、-80℃で6か月間凍結することができる。
ELISAによって測定された総抗HSV-2 gE及びgI特異的IgG抗体
上記の実施例1について記載された通り。
上記の実施例1について記載された通り。
ELISAによって測定された総抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体
上記の実施例1について記載された通り。
上記の実施例1について記載された通り。
ICSアッセイによって測定されたHSV-2 gE及びgI特異的及びHSV-1 gE交差反応性CD4+/CD8+T細胞応答
HSV-1 gE抗原に対する交差反応性CD4+及びCD8+T細胞応答がHSV-1 gEペプチドプールを用いるex-vivo刺激後にさらに分析された点を除いて、上記の実施例1について記載された通り。これについては、細胞調製のセクションは、
- 15merの、HSV-2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)
- 15merの、HSV-2由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-1由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のPMA-イオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)
のいずれか100μLを含有し、ウェルあたり1μg/mLで抗CD28(BD Biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間(37℃、5%CO2)刺激した点で異なる。
HSV-1 gE抗原に対する交差反応性CD4+及びCD8+T細胞応答がHSV-1 gEペプチドプールを用いるex-vivo刺激後にさらに分析された点を除いて、上記の実施例1について記載された通り。これについては、細胞調製のセクションは、
- 15merの、HSV-2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)
- 15merの、HSV-2由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-1由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のPMA-イオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)
のいずれか100μLを含有し、ウェルあたり1μg/mLで抗CD28(BD Biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間(37℃、5%CO2)刺激した点で異なる。
ポリクローナル血清の、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞(ADCCバイオアッセイ-Promega)とのインキュベーション後のマウスFcγRIIIに結合し、活性化する能力の評価
実施例1について記載された通り。
実施例1について記載された通り。
ワクチン特異的抗体の、HSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を評価する競合的ELISA法
実施例1について記載された通り。
実施例1について記載された通り。
HSV-1交差反応性抗体の、HSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を評価するための競合的ELISA法
実施例1について記載された通り。
実施例1について記載された通り。
in-vitro HSV-2中和アッセイ
実施例1について記載された通り。
実施例1について記載された通り。
in-vitro HSV-1中和アッセイ
実施例1について記載された通り。
実施例1について記載された通り。
統計的手法
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各ワクチン特異的IgG抗体応答(gE又はgI)について、群(NaCl群を除く全群)、時点(21日目(21PI)、42日目(21PII)、63日目(21PIII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
各ワクチン特異的応答について、時点の分散共分散を複合対称性行列でモデル化した。
複合対称性は、時点間の同一の分散と同一の相関を考慮している。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこれらのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群が含まれていないにもかかわらず、主要評価項目に関連する比較を以下のように計算した。上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、NaCl投与群すべてに与えられた力価で除算した。結果として得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均比として理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI、PIII/PII、PIII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
gE/gI交差反応性IgG抗体応答について、群(NaCl群を除くすべて)を固定効果として含めることによってlog10力価に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は、応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散の明確な不均一性は検出されなかったので、異なる群に対して同一の分散を仮定した。幾何平均及びその95%CIは、このモデルから導かれている。NaCl群に対するワクチン接種群の比較のために、上記のモデルから導かれたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、すべてのNaClレシピエントの与えられた力価によって除算した。得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均比として理解されるべきである。ワクチン接種群の直接比較のために、すべての幾何平均比及びその95%CIは、モデルから導かれた。
CD4+/CD8+T細胞応答の各ワクチン特異的又は交差反応性%(gE又はgI)について、群(NaCl群を含むすべての群)を固定効果として含めることによってlog10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。HSV-2 gE特異的CD4+T細胞応答の%については明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。その他の応答については、異なる群で異なる分散をモデル化した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づいていた。HSV-1 gE交差反応性CD4+T細胞の%について、及びHSV-2 gI特異的CD8+T細胞の%について、すべてのワクチン群で応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化を行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
HSV-2 MS特異的中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均及び幾何平均比(その対応する95%CI)はこのモデルから導かれた。HSV-1交差反応性中和抗体の力価についても同一モデルを実施した。
結果
すべてのLNP/SAM HSV-2 gE/gI突然変異体は、ワクチン特異的IgG抗体応答を誘導した
LNP/SAM-HSV-2 gE/gI A248T_V340W群(試料4.5)中の1つの試料は、十分な血清が入手可能ではないために2回目の免疫化後21日目にELISAによって評価されなかったことに留意されたい。
すべてのLNP/SAM HSV-2 gE/gI突然変異体は、ワクチン特異的IgG抗体応答を誘導した
LNP/SAM-HSV-2 gE/gI A248T_V340W群(試料4.5)中の1つの試料は、十分な血清が入手可能ではないために2回目の免疫化後21日目にELISAによって評価されなかったことに留意されたい。
抗HSV-2 gE及びgIワクチン特異的並びに抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答をELISAによって調べた。
予測どおり、NaCl対照群では、抗HSV-2 gE特異的又は抗HSV-2 gI応答は見られなかった(すべてのマウスについて<20EU/mL)が、すべてのLNP製剤化SAM HSV-2 gE/gIワクチン接種マウスは、最後の時点で30,000EU/mLを上回る応答をもたらした(図16A及び図16B)。3回目の免疫化後21日目に、NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM HSV-2 gE/gIベクターの異なる型(突然変異されたもの及びアミノ酸挿入)で免疫したマウスのすべての群において高い抗HSV-2 gE又は抗HSV-2 gI特異的IgG抗体応答が誘導された(gEについて、すべてのGMR>17,000及びgIについて、すべてのGMR>1,800)(図17A及び図17B)。
LNP製剤化SAM HSV-2 gE/gI突然変異体で免疫したマウスのすべての群において、抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI特異的IgG抗体応答のレベルが、1回目のもの(21日目(21PI))と比較して2回目の免疫化(42日目(21PII))後に増大し、増大倍数は、2~8の範囲であった(図18A及び図18C)。
2回目のもの(42日目(21PII))と比較して3回目の免疫後21日目(63日目(21PIII))に、A248T突然変異体(群2)を除くすべてのHSV-2 gE/gI突然変異体について、HSV-2 gE特異的抗体応答への追加免疫効果も見られ、増大倍数は2.46~4.49の範囲であった(1を含有しないCIを有する)。A248T突然変異体について、1.77の増大倍数が見られた(1を含有しないCI)(図18B)。
2回目及び3回目のワクチン用量の間に、HSV-2 gI特異的抗体応答のレベルへの明確な追加免疫効果は、LNP製剤化SAM HSV-2 gE/gI V340W(群1)及び挿入ARAA(群6)突然変異体で免疫したマウスの群についてのみ検出された(2及び2.3の増大倍数及び1を含有しないCI)。他の突然変異体を用いた場合により小さい追加免疫効果も見られ、1.6~1.9の増大倍数を有していた(1を含有しないCI)(図18D)。
全体として、これらの結果は3回目の免疫化後21日目の異なるHSV-2 gE/gI突然変異体候補間の同様のHSV-2 gE特異的抗体応答を示唆する(増大倍数1に近いGMR及び1を含有するCIを有する)(図19A)。対照的に、HSV-2 gI特異的抗体応答について、3回目の免疫化後21日目にHSV-2 gE/gI突然変異体候補間でいくつかの相違が見られるようであった。実際、A248T(群2)及びA248T_V340W(群5)突然変異体の両方によって誘導された応答は、V340W(群1)、A246W(群3)及びP318I(群4)突然変異体によって誘導されたものよりも2倍高いと考えられた(GMR2及び効果を示す1を含有しないCI又は効果の傾向を示す1をほとんど含有しないCIのいずれか)。突然変異体間の他の相違は見られなかった(GMRの変化の倍数<2及び1を含有するCIを有する)(図19B)。
予想通り、NaCl対照群では抗HSV-1 gE/gI交差反応性応答は見られなかった(すべてのマウスについて11EU/mL)。3回目の免疫化後21日目に、NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM HSV-2 gE/gIベクターの異なる型(突然変異されたもの及びアミノ酸挿入)で免疫したマウスのすべての群において高い抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答が誘導された(すべてのGMR>11,000)(図20、図21)。全体として、ワクチン免疫群のマウスの直接比較は、3回目の免疫化後21日目に同様の抗HSV-1 gE/gI交差反応性IgG抗体応答を示唆する(ほとんどのGMRの変化の倍数<2及び1を含有するCIを有する)。A246W突然変異体(群3)のみが、V340W突然変異体(群1)と比較してより高い応答を誘導したようであり、2.28の増大倍数(1を含有しないCI)を有していた(図22)。
異なるLNP/SAM HSV-2 gE/gI突然変異体は、機能的ワクチン特異的及びHSV-1 gE/gI交差反応性抗体応答を誘導することができる
この研究では、ワクチンHSV-2 gE/gI特異的及びHSV-1 gE/gI交差反応性抗体の機能を、3回目の免疫化後21日目に採取した血清においてのみ調べた。これに関して、ワクチン誘導性pAbの、HSV-2 MS又はHSV-1 VR1789ウイルスを中和する能力、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とともにインキュベートされた後にJurkatリポーター細胞系統によって発現されたmFcγRIIIに結合し、活性化する能力、及び、HSV-2又はHSV-1gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fcのin-vitro結合を減少させる能力を調べた。
この研究では、ワクチンHSV-2 gE/gI特異的及びHSV-1 gE/gI交差反応性抗体の機能を、3回目の免疫化後21日目に採取した血清においてのみ調べた。これに関して、ワクチン誘導性pAbの、HSV-2 MS又はHSV-1 VR1789ウイルスを中和する能力、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とともにインキュベートされた後にJurkatリポーター細胞系統によって発現されたmFcγRIIIに結合し、活性化する能力、及び、HSV-2又はHSV-1gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fcのin-vitro結合を減少させる能力を調べた。
LNP製剤化SAM-HSV-2 gE/gIベクターの異なる型(突然変異されたもの及びアミノ酸挿入)で免疫したマウスのすべての群において、HSV-2 MS又はHSV-1 VR1789系統に対する極めて低い特異的中和(nAb)抗体応答が検出された。結果は、異なる突然変異体間でワクチン特異的又は交差反応性抗体中和活性に関して明確な相違がないこと(GMR変化の倍数≦2及びすべて1を含有するCI)を示唆する。2、3のワクチンの比較(特に、A248T_V340W(群5)対V340W(群1))は、2倍の変化を示したが、大きな変動のために有意性に到達できなかった(図23A及び図23B)。HSV-1 VR1789系統に対して向けられた交差反応性nAb応答の側では、異なる候補の間で相違は見られなかった(図24A及び図24Bを参照のこと)。
次いで、異なるLNP製剤化SAM-HSV-2 gE/gI突然変異体候補で免疫したマウスから得た血清の、HSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG結合と競合し、減少させる能力を競合的ELISA法によってin-vitroで評価した。すべてのLNP-SAM HSV-2 gE/gI突然変異体は、HSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合とin-vitroで競合することができるワクチン特異的ポリクローナル抗体応答を誘発した(図25及び図73)。HSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線は、マウスのすべての群間で非常によく類似しており、ED50の算出はマウスの群間で類似した応答を示した(図26)。さらに、HSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線も、マウスのすべての群間で非常によく類似しており、突然変異体間の有意な相違を示唆しなかった(図73)。
最後に、3回目の免疫化後14日目に誘導されたワクチン特異的抗体応答の、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後にin-vitroでマウスFcγRIIIに結合し、活性化する能力を調べた。図27A~Fに示されたデータは、異なるLNP-SAM HSV-2 gE/gI突然変異体で免疫したマウスのすべての群が、FcγRIIIを発現するJurkatリポーター細胞に特異的に結合し、活性化することができる抗HSV-2 gE/gI特異的抗体応答を誘導する可能性があることを示唆した。予想通り、FcγRIIIの活性化は、ワクチン非接種マウスからの血清を用いた場合には検出されなかった。FcγRIII活性化に関してマウスの異なる群間で大きな相違は見られなかった(図27G)。
結論として、これらのデータは、異なるLNP-SAM HSV-2 gE/gI突然変異体が、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後にFcγRIIIに結合し、活性化し、HSV-2又はHSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させ、低強度でHSV-2 MS及びHSV-1 VR1789ウイルスを中和することができるワクチン特異的抗体を誘導し得ることを示唆している。
すべてのLNP/SAM HSV-2 gE/gI突然変異体は、抗HSV-2 gE特異的及び抗HSV-1 gE交差反応性CD8+T細胞並びに低レベルの抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞を誘導した
異なるLNP-SAM HSV-2 gE/gI突然変異体を用いる3回目の免疫化後21日目に、低レベルの抗HSV-2 gE特異的CD4+T細胞応答(GM≦0.2%)は、NaCl対照群をベースとするP95閾値と比較した場合に、群3(A246W)からのすべてのマウス、群1(V340W)、2(A248T)及び4(P318I)からのマウスのほとんど、群6(挿入ARAA)からのマウスの半分において検出され、群5(A248T_V340W)からのマウスでは検出されなかった(図28A、図29A)。NaCl対照群と比較して、異なるLNP製剤化SAM HSV-2 gE/gI突然変異体で免疫したマウスのすべての群においてより高い抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞応答が検出された(P95閾値の又はそれを上回るすべてのマウスについて約0.4%、14~19の範囲のNaClを上回るGMR及び1を含有しないCI)(図28A及び図29B)。対照的に、NaCl陰性対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいてもHSV-1 gE交差反応性CD4+T細胞応答は検出されなかった(図28A)。
異なるLNP-SAM HSV-2 gE/gI突然変異体を用いる3回目の免疫化後21日目に、低レベルの抗HSV-2 gE特異的CD4+T細胞応答(GM≦0.2%)は、NaCl対照群をベースとするP95閾値と比較した場合に、群3(A246W)からのすべてのマウス、群1(V340W)、2(A248T)及び4(P318I)からのマウスのほとんど、群6(挿入ARAA)からのマウスの半分において検出され、群5(A248T_V340W)からのマウスでは検出されなかった(図28A、図29A)。NaCl対照群と比較して、異なるLNP製剤化SAM HSV-2 gE/gI突然変異体で免疫したマウスのすべての群においてより高い抗HSV-2 gI特異的CD4+T細胞応答が検出された(P95閾値の又はそれを上回るすべてのマウスについて約0.4%、14~19の範囲のNaClを上回るGMR及び1を含有しないCI)(図28A及び図29B)。対照的に、NaCl陰性対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいてもHSV-1 gE交差反応性CD4+T細胞応答は検出されなかった(図28A)。
NaCl対照群と比較してすべてのワクチン接種群において高レベルの抗HSV-2 gE特異的及び抗HSV-1 gE交差反応性CD8+T細胞応答が検出された(およそ100のGMR及び1を含有しないCI)(図28B及び図30)。抗HSV-2 gI特異的CD8+T細胞応答は、NaCl陰性対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいても検出されなかった(図28B)。
結果は、異なる突然変異型のLNP製剤化SAM-HSV-2 gE/gIベクターは、CD4+及びCD8+T細胞応答に関してすべて同等であったことを示唆している(GMRの変化の倍数<2及びほとんどのCIは全体的に[0.5,2]に含まれ、及び/又は1を含有する)(図31及び図32)。A248T_V340W突然変異体(群5)を用いた場合に抗HSV-2 gE特異的CD4+T細胞応答において検出された応答はないので、この群は、この応答でA246W(群3)及びP318I突然変異体(群4)と異なるようであった(減少倍数2及び1を含有しないCI)(図31A)。
[実施例3]
CB6F1マウスにおけるいくつかのAS01アジュバント化HSV-1 gE/gI抗原(非突然変異及び突然変異)の免疫評価
目的
この研究の一般的な目的は、gE Fc結合ドメイン中に、ヒト免疫グロブリンG Fcへの結合力を低下させる単一点突然変異を含有する異なるHSV-1 gE/gIタンパク質から免疫原性データを作成することであった。
CB6F1マウスにおけるいくつかのAS01アジュバント化HSV-1 gE/gI抗原(非突然変異及び突然変異)の免疫評価
目的
この研究の一般的な目的は、gE Fc結合ドメイン中に、ヒト免疫グロブリンG Fcへの結合力を低下させる単一点突然変異を含有する異なるHSV-1 gE/gIタンパク質から免疫原性データを作成することであった。
NaCl対照群と比較して、3回目の免疫化後14日目にいくつかのAS01アジュバント化HSV-1 gE/gI抗原(非突然変異又は突然変異)によって誘導された抗HSV-1gE/gI特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答の間で比較を実施した。
3回目の免疫化後14日目に、HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる突然変異体によって誘導されたワクチン特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答及び抗HSV-1 gE/gI特異的CD4+T細胞応答を、NaCl対照群に対して比較した。さらに、3回目の免疫化後14日目に、抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答及び抗HSV-1 gE及び抗HSV-1 gI特異的CD4+T細胞応答に関するすべてのワクチン候補の直接比較を実施した。
最後に、探索的目的は、HSV-1 gE/gI突然変異体で免疫したマウスの異なる群において、1回目及び2回目の免疫化後の抗HSV-1 gE/gI特異的抗体応答、3回目の免疫化後の抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性抗体応答、3回目の免疫化後のワクチン特異的及びHSV-2 gE/gI交差反応性ポリクローナル抗体の機能並びに3回目の免疫化後の抗HSV-1 gE、抗HSV-1 gI特異的CD8+T細胞応答及び抗HSV-2 gE交差反応性T細胞応答のレベルを評価することであった。
研究デザイン
0、14及び28日目に雌性CB6F1マウス(n=6 群1~6及びn=4/群7)を、AS01(5μg)に製剤化したHSV-1 gE/gIタンパク質の5μgの非突然変異HSV-1 gE/gI(群1)で、又は異なる突然変異型(群2-6)で筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群7)として使用した。
0、14及び28日目に雌性CB6F1マウス(n=6 群1~6及びn=4/群7)を、AS01(5μg)に製剤化したHSV-1 gE/gIタンパク質の5μgの非突然変異HSV-1 gE/gI(群1)で、又は異なる突然変異型(群2-6)で筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って、生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群7)として使用した。
血清試料を、プライム免疫化後13、27及び42日目(13PI、13PII、14PIII)に採取して、抗HSV-1 gE/gI特異的並びに抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答の両方を測定した。3回目の免疫化後14日目に採取した血清試料においてワクチン特異的及びHSV-2交差反応性抗体の機能も調べた。HSV-1 gE、HSV-1 gI及びHSV-2 gE抗原に対する全身性CD4+及びCD8+T細胞応答をex-vivoで評価するために、3回目の免疫化後14日目(14PIII)に脾臓を採取した。
背景及び科学的論拠
性器ヘルペスの世界的な有病率は、15歳から49歳の間の個体で4億1700万人と推定されるが、疾患の負担はアフリカにおいて不釣り合いに大きい。単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は、資源保有国における初回の性器ヘルペス感染の原因として、単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)とおよそ同じくらい一般的である。再発感染については、HSV-1後はHSV-2性器感染ほど一般的ではない。したがって、HSV-2は資源保有国において依然として再発性器ヘルペスの優勢な原因のままであり、HSV-2感染の負担は資源の乏しい国においてさらに大きい。重度で頻発の陰部潰瘍を有する感染個体もいれば、一方、軽度又は無症状感染を有する個体もいるが、全ての個体が性器ヘルペスをその親密なパートナーに伝染させるリスクがある。感染個体では、抗ウイルス剤療法によって、再発性性器病変の頻度及び感染症をパートナーに伝染させるリスクが低減される。しかし、ワクチン接種によって臨床的及び無症状性器再発の頻度を低減する代替アプローチが非常に要求されている。
性器ヘルペスの世界的な有病率は、15歳から49歳の間の個体で4億1700万人と推定されるが、疾患の負担はアフリカにおいて不釣り合いに大きい。単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)は、資源保有国における初回の性器ヘルペス感染の原因として、単純ヘルペスウイルス2型(HSV-2)とおよそ同じくらい一般的である。再発感染については、HSV-1後はHSV-2性器感染ほど一般的ではない。したがって、HSV-2は資源保有国において依然として再発性器ヘルペスの優勢な原因のままであり、HSV-2感染の負担は資源の乏しい国においてさらに大きい。重度で頻発の陰部潰瘍を有する感染個体もいれば、一方、軽度又は無症状感染を有する個体もいるが、全ての個体が性器ヘルペスをその親密なパートナーに伝染させるリスクがある。感染個体では、抗ウイルス剤療法によって、再発性性器病変の頻度及び感染症をパートナーに伝染させるリスクが低減される。しかし、ワクチン接種によって臨床的及び無症状性器再発の頻度を低減する代替アプローチが非常に要求されている。
初回性器HSV-2再発を防ぐために治療用ワクチン候補が開発されている。これまでの報告では、アジュバント化組換えHSV-2糖タンパク質D(gD)から構成されるワクチン組成物がモルモットモデルにおける、及び性器ヘルペス患者(HSV-2陽性)における性器ヘルペス再活性化のエピソードの50%を低減する可能性があることが示された。ヘルペスウイルスは、その天然宿主において生き残るために多様な免疫回避戦略を発達させた。HSVは、すなわち体液性免疫機構を標的とする糖タンパク質E(gE)をコードする。gEは、免疫グロブリンG(IgG)Fc受容体(FcγR)として機能する糖タンパク質I(gI)との非共有結合ヘテロ二量体複合体を形成し得る。gEとgIの間の相互作用は、ヒトFc結合親和性を約100倍増大する。抗体結合によって、FcγRは、補体結合及び抗体依存性細胞性細胞傷害性を含むIgG Fc媒介性活性を阻害する。
治療用HSV-2の文脈では、マウスにおいて実施されたこれまでの実験によって、ヒトIgGは、非突然変異組換えHSV-2 gE/gIタンパク質のgE Fc結合ドメインに結合し、HSV-2 gE媒介性免疫回避メカニズムに関与する保護的エピトープをマスクし得ることが示された。これらの結果は、同様の状況が臨床研究において起こり、HSV-2ワクチン治療効力に負の影響を及ぼす可能性があることを示唆した。ヒトにおける負の免疫学的干渉を避けるために、hIgG Fcドメインに対する親和性を低減するためにHSV-2 gE/gIタンパク質のFc結合ドメイン内で点突然変異を実施し、ワクチン候補としてHSV-2 gE_P317R/gI突然変異体構築物を選択した。
HSV-1及び2ウイルスの両方によってこの免疫回避メカニズムが使用されるので、組換えHSV-1 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型(gE Fc結合活性の強力な低減を伴う)を用いて免疫原性データを作成することも決定した。
この実験の目的は、AS01に製剤化された5つの異なるHSV-1 gE/gI突然変異体のマウスにおける免疫原性を評価することであった。
研究デザイン
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~6及びn=4/群7)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0、14及び28日目に、5μgのAS01(5μg)で製剤化した非突然変異(群1)又は異なる突然変異型のHSV-1 gE/gIタンパク質(群2-6)で、CB6F1マウス(群1~6)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群7)として使用した。
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~6及びn=4/群7)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0、14及び28日目に、5μgのAS01(5μg)で製剤化した非突然変異(群1)又は異なる突然変異型のHSV-1 gE/gIタンパク質(群2-6)で、CB6F1マウス(群1~6)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m.注射し、陰性対照群(群7)として使用した。
血清試料を、プライム免疫化後13、27及び42日目(13PI、13PII、14PIII)に採取して、抗HSV-1 gE/gI特異的並びに抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答の両方を測定した。3回目の免疫化後14日目に採取した血清試料において、ワクチン特異的及びHSV-2交差反応性抗体の機能も調べた。HSV-1 gE、HSV-1 gI及びHSV-2 gE抗原に対する全身性CD4+及びCD8+T細胞応答をex-vivoで評価するために、3回目の免疫化後14日目(14PIII)に脾臓を採取した。各群の詳細は、表5に記載されている。
材料及び方法
治験薬
この研究に使用される抗原は、精製組換えgE/gIタンパク質の異なる型(外部ドメインのみ)であった。材料は、研究ロットとしてのみExpiCHO(商標)細胞で発現された。
治験薬
この研究に使用される抗原は、精製組換えgE/gIタンパク質の異なる型(外部ドメインのみ)であった。材料は、研究ロットとしてのみExpiCHO(商標)細胞で発現された。
AS01は、QS-21(キラヤ(Quillaja saponaria)の樹皮から精製されたトリテルペングリコシド)及びMPL(3-DモノホスホリルリピドA)を含有するリポソームベースのアジュバントシステム(AS)であり、これらの免疫増強剤の媒体としてリポソーム及び等張剤としてNaClを含む緩衝剤を有する(バリアント3)。
AS01bアジュバントシステムの単回ヒト用量(0.5mL)は、50μgのQS-21及び50μgのMPLを含有する。この研究では、マウスに注射される容積は、ヒト用量の1/10であり、用量あたり5μg QS-21及び5μg MPLに相当する。
動物モデル
小さい動物モデルは、新規ワクチン候補の免疫原性プロファイルを研究するための有用なツールであるということは受け入れられている。ワクチン候補のT細胞免疫応答を誘導する能力の概要を把握するために、この研究ではCB6F1マウス(C57Bl/6とBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。
小さい動物モデルは、新規ワクチン候補の免疫原性プロファイルを研究するための有用なツールであるということは受け入れられている。ワクチン候補のT細胞免疫応答を誘導する能力の概要を把握するために、この研究ではCB6F1マウス(C57Bl/6とBalb/Cマウスのハイブリッド)を使用した。
CB6F1マウスは、アジュバント化タンパク質及びウイルスベクターを含む種々のタイプの免疫原を用いるワクチン接種後に、強力なCD4+/CD8+T細胞及び体液性免疫応答を生成することがわかっている。それにもかかわらず、ヒトにおける予測される応答と比較して、これらのマウスにおいて生成したワクチン誘導性免疫応答のプロファイルは、TLR発現、HLAバックグラウンド及び抗原提示に関する何らかの相違によって影響を受け得る。しかし、CD4+/CD8+T免疫応答を誘導する能力は、これらのマウスとヒトの間で同等の傾向を示した。
免疫学的読み出し情報
ELISAによって測定される総抗HSV-1 gE/gI特異的IgG結合抗体
総抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-1由来の組換えgE/gIヘテロ二量体タンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。このタンパク質は、ExpiCHO(商標)発現システムを使用して産生した。それ以外はELISAは、実施例1に記載されるように実施した。
ELISAによって測定される総抗HSV-1 gE/gI特異的IgG結合抗体
総抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-1由来の組換えgE/gIヘテロ二量体タンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。このタンパク質は、ExpiCHO(商標)発現システムを使用して産生した。それ以外はELISAは、実施例1に記載されるように実施した。
光学密度(OD)をキャプチャし、SoftMaxPro GxP v5.3ソフトウェアを使用して分析した。標準曲線は、4パラメーターロジスティック回帰フィットを参照標準結果に適用することによって作成した(参照標準=20200023 14PIII-AS01-HSV-1-1 gE/gI HEK(5μgの各々/用量)で免疫したマウス1.1~1.20のプール)。試料における抗体価は、標準曲線の補間によって算出した。試料の抗体価は、標準曲線の20~80%ダイナミックレンジ内に入った希釈物から得た値を平均化することによって得た。力価は、EU/mL(mL当たりのELISAユニット)で表された。
ELISAによって測定された総抗HSV-2 gE及びgI交差反応性IgG抗体
総抗HSV-2 gE又はgI交差反応性IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-2由来の組換えgE(約51kDa)(BMP1291)又はgIタンパク質(約46kDa)(BMP1292)をコーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して産生した。それ以外は間接ELISAは、実施例1においてこの方法について記載されたように実施した。
総抗HSV-2 gE又はgI交差反応性IgG抗体の定量化を、間接ELISAを使用して実施した。HSV-2由来の組換えgE(約51kDa)(BMP1291)又はgIタンパク質(約46kDa)(BMP1292)をコーティング抗原として使用した。これらのタンパク質は、ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して産生した。それ以外は間接ELISAは、実施例1においてこの方法について記載されたように実施した。
ICSアッセイによって測定される抗HSV-1 gE及びgI特異的並びにHSV-2 gE交差反応性CD4+/CD8+T細胞応答
IL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生する抗HSV-1 gE及び抗HSV-1 gI特異的並びに抗HSV-2 gE交差反応性CD4+及びCD8+T細胞の頻度を、HSV-1 gE若しくはgI又はHSV-2 gEペプチドプールを用いるex-vivo刺激後に3回目の免疫化後14日目に採取された脾細胞において評価した。
IL-2及び/又はIFN-γ及び/又はTNF-αを産生する抗HSV-1 gE及び抗HSV-1 gI特異的並びに抗HSV-2 gE交差反応性CD4+及びCD8+T細胞の頻度を、HSV-1 gE若しくはgI又はHSV-2 gEペプチドプールを用いるex-vivo刺激後に3回目の免疫化後14日目に採取された脾細胞において評価した。
脾細胞の単離
実施例1においてこの方法について記載された通り。
実施例1においてこの方法について記載された通り。
細胞調製
新鮮脾細胞を丸底96ウェルプレートに106個細胞/ウェル(100μL)で播種した。次いで、以下のいずれかを含有し、ウェルあたり1μg/mLで抗CD28(BD biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間(37℃、5% CO2)刺激した:
- 15merの、HSV-1由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)
- 15merの、HSV-1由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のPMA-イオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)。
新鮮脾細胞を丸底96ウェルプレートに106個細胞/ウェル(100μL)で播種した。次いで、以下のいずれかを含有し、ウェルあたり1μg/mLで抗CD28(BD biosciences、クローン37.51)及び抗CD49d抗体(BD Biosciences、クローン9C10(MFR4.B))を用いて細胞を6時間(37℃、5% CO2)刺激した:
- 15merの、HSV-1由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)
- 15merの、HSV-1由来のgIタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、HSV-2由来のgEタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)、
- 15merの、ヒトβ-アクチンタンパク質の配列をカバーする重複ペプチドプール(ウェルあたりペプチドあたり1μg/mL)(無関係の刺激)、
- RPMI/添加剤培地(アッセイの陰性対照として)、
- それぞれ、0.25μg/mL及び2.5μg/mLの作業濃度のPMA-イオノマイシン溶液(Sigma、P8139)(アッセイの陽性対照として)。
ex vivo刺激の2時間後、5% FCSを添加したRPMI/添加剤で1/200希釈されたブレフェルジンA(Golgi plug ref 555029、BD Bioscience)をさらに4時間添加して、サイトカイン分泌を阻害した。次いで、プレートを、一晩インキュベーションのために4℃で移した。
細胞内サイトカイン染色
実施例1においてこの方法について記載される通り。
実施例1においてこの方法について記載される通り。
細胞取得及び分析
実施例1においてこの方法について記載された通り。
実施例1においてこの方法について記載された通り。
ワクチン特異的抗体の、HSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を評価するための競合的ELISA法
組換えHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合をin-vitroで減少させる、マウスの異なる群において採取したポリクローナル血清の能力を、競合的ELISA法によって調べた。ExpiCHO(商標)発現システムを使用して産生された組換えHSV-1 gE/gIタンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。
組換えHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合をin-vitroで減少させる、マウスの異なる群において採取したポリクローナル血清の能力を、競合的ELISA法によって調べた。ExpiCHO(商標)発現システムを使用して産生された組換えHSV-1 gE/gIタンパク質(BMP1299)をコーティング抗原として使用した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、遊離カルシウム/マグネシウムPBS緩衝剤で2μg/mLの濃度に希釈した50μL/ウェルのHSV-1 gE/gIタンパク質でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを100μL/ウェルの0.1% ツイーン-20+1% BSA(ブロッキング緩衝剤)を添加したPBSとともに37℃で1時間ブロッキングした。
別の96ウェル透明V底ポリプロピレンマイクロプレート(Falcon、ref 353263)において、各血清についてブロッキング緩衝剤で2倍段階希釈(希釈1/10で開始する)を60μl/ウェルで調製し、60μl/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.7μg/mLに予め希釈したビオチン化hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C)と混合した。
次いで、ブロッキング緩衝剤とともに1時間のインキュベーション後、コーティングされたプレートからブロッキング溶液を除去し、100μLの、hIgG及びマウス血清の両方を含有する混合物を対応するHSV-1 gE/gIコーティングウェルに移し、37℃で24時間インキュベートした。アッセイの陽性対照は、これまでの研究からの抗HSV-2 gE/gI血清試料のプールであった。アッセイの陰性対照は、1/1000希釈され、試料と同一の濃度のhIgGと混合された無関係のHPV血清試料のプールであった。
24時間のインキュベーション後、プレートをPBS 0.1% ツイーン20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、ウェルに2000x希釈された50μL/ウェルのストレプトアビジン-セイヨウワサビ(horsedish)ペルオキシダーゼAMDEX(Amersham、ref RPN4401V)を添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤で希釈された75%単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)を含有する溶液を室温で10分間添加した。酵素的発色現像を50μL/ウェルの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、プレートをVersamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度で読み出した。光学密度(OD)をキャプチャし、エクセルプログラムを用いて曲線にあてはめた。
力価は、試料希釈によってシグナルの50%(すなわち、ED50)が達成される有効希釈として表わされた。
各プレートについて、参照試料(すなわち、無関係の血清)を使用して、以下の式:
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
試料ED50力価を、プレート内のED50推定値に最も近い左右の測定値間の線形補間によってコンピュータによって計算した。非変換OD及び対数ベース10変換希釈で、stats R基本パッケージの近似関数を用いて近似が得られた。
以下の場合には試料に力価を割り当てなかった:
・ ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・ 曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
・ ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・ 曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
HSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させるHSV-2交差反応性抗体の能力を評価するための競合的ELISA法
組換えHSV-2 gE/gIタンパク質によるin-vitro hIgG Fc結合を減少させるマウスの異なる群において採取されたポリクローナル血清の能力を、競合的ELISA法によって調査した。ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV-2 gE/gIタンパク質(BMP1063)をコーティング抗原として使用した。
組換えHSV-2 gE/gIタンパク質によるin-vitro hIgG Fc結合を減少させるマウスの異なる群において採取されたポリクローナル血清の能力を、競合的ELISA法によって調査した。ExpiHEK293F(商標)発現システムを使用して生成された組換えHSV-2 gE/gIタンパク質(BMP1063)をコーティング抗原として使用した。
ポリスチレン96ウェルELISAプレート(Nunc F96 Maxisorpカタログ439454)を、50μL/ウェルの、遊離カルシウム/マグネシウムPBS緩衝剤で4μg/mLの濃度に希釈したHSV-2 gE/gIタンパク質でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、コーティング溶液を除去し、プレートを100μL/ウェルの0.1% ツイーン-20+1% BSA(ブロッキング緩衝剤)を添加したPBSとともに37℃で1時間ブロッキングした。
コーティングされたプレートからブロッキング溶液を除去し、96ウェル透明V底ポリプロピレンマイクロプレート(Falcon、ref 353263)において、個々のマウス血清(ブロッキング緩衝剤で1/10で開始する)の2段階希釈の60μLを調製し、60μl/ウェルの、ブロッキング緩衝剤で0.7μg/mLに予め希釈したビオチン化hIgG抗体(Invitrogen、ref 12000C)と混合した。HSV-2 gE/gIコーティングプレートからブロッキング緩衝剤を除去し、次いで、37℃で24時間インキュベーションのために100μLの混合物を対応するウェルに移した。アッセイの陽性対照血清は、これまでの研究のHSV-2血清試料のプールであった。アッセイの陰性対照血清は、1/100希釈され、hIgGとも混合された無関係のHPV血清試料のプールであった。
インキュベーション後、プレートをPBS+0.1% ツイーン20(洗浄緩衝剤)を用いて4回洗浄し、ウェルに2000x希釈された50μL/ウェルのストレプトアビジン-セイヨウワサビ(horsedish)ペルオキシダーゼAMDEX(Amersham、ref RPN4401V)を添加し、プレートを37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝剤を用いて4回洗浄し、50μL/ウェルの、クエン酸ナトリウム0.1M pH5.5緩衝剤で希釈された75%単一成分TMBペルオキシダーゼELISA基質(ref 172-1072、Bio-Rad、USA)を含有する溶液を室温で10分間添加した。酵素的発色現像を50μL/ウェルの0.4N硫酸1M(H2SO4)を用いて停止させ、プレートをVersamax ELISAリーダーを使用して450/620nmの吸光度で読み出した。光学密度(OD)をキャプチャし、エクセルプログラムを用いて曲線にあてはめた。
力価は、試料希釈によってシグナルの50%(すなわち、ED50)が達成される有効希釈として表わされた。
各プレートについて、参照試料(すなわち、無関係の血清)を使用して、以下の式:
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
ED50=OD0%+0.5×(OD100%-OD0%)
[式中、OD100%は、同様の試料を用いて得られる最高ODであり、OD0%は、最低の到達可能なシグナルである]
を使用して参照ED50を推定した。各プレートについて、前者は6回の繰り返しを平均化する(平均する)ことによって得られ、後者はゼロに設定された。
試料ED50力価を、プレート内のED50推定値に最も近い左右の測定値間の線形補間によってコンピュータによって計算した。非変換OD及び対数ベース10変換希釈で、stats R基本パッケージの近似関数を用いて近似が得られた。
以下の場合には試料に力価を割り当てなかった:
・ ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・ 曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
・ ED50を上回る又は下回る測定値が入手可能ではなかった、
・ 曲線が少なくとも2回ED50と交差した、及び
・ ED50に最も近い希釈ステップのうち1つ(左又は右)が欠落していた
HSV-1-gE/gI特異的及びHSV-2 gE/gI交差反応性抗体の、HSV-1又はHSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後にmFcγRIIIに結合し、活性化する能力の評価(マウスFcγRIII ADCCバイオアッセイ-Promega)
Promega laboratoryによって開発された、マウスFcγRIII抗体依存性細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、改変Jurkatリポーター細胞によって発現されたマウスFcγRIIIに特異的に結合し、活性化する抗体の能力を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。使用した方法は、実施例1に記載される通りとした。
Promega laboratoryによって開発された、マウスFcγRIII抗体依存性細胞傷害性(ADCC)リポーターバイオアッセイ(カタログ番号M1201)は、改変Jurkatリポーター細胞によって発現されたマウスFcγRIIIに特異的に結合し、活性化する抗体の能力を測定するために使用できる生物発光細胞ベースアッセイである。使用した方法は、実施例1に記載される通りとした。
マウスADCC様アッセイにおける試料力価は、わずかに改変を加えてHuang and Pang (Assay Drug Dev Technol. 2012 10(1):88-96)に記載されるように曲線下面積(AUC)によってコンピュータによって計算した。手短には、対数変換した応答(すなわち、RLU)を、プレート上の各試料の5パラメータロジスティックモデルを用いてlog3変換試料段階希釈にあてはめた。陰性対照試料(すなわち、1/1000希釈した無関係のマウス血清)を使用して、各プレートにおいて、その幾何平均及び3標準偏差を用いて推定されるバックグラウンドシグナル閾値(すなわち、exp[mean(logRLU)+3×sd(logRLU)])評価した。「R」ソフトウェアの「integrate」機能を使用して、各試料のあてはめられた曲線の下でプレートのバックグラウンドより上の面積(すなわち、AUC)を計算した。
in-vitro HSV-1中和アッセイ
異なる動物種から得た血清試料においてHSV-1特異的中和抗体の力価を検出し、定量化するためにin-vitro中和アッセイを開発した。使用した方法は、実施例1に記載される通りとした。
異なる動物種から得た血清試料においてHSV-1特異的中和抗体の力価を検出し、定量化するためにin-vitro中和アッセイを開発した。使用した方法は、実施例1に記載される通りとした。
in-vitro HSV-2中和アッセイ
使用した方法は、実施例1に記載される通りとした。
使用した方法は、実施例1に記載される通りとした。
統計的手法
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
抗HSV-1 gE/gI特異的抗体(pAb)応答について、群(NaCl群を除く全群)、時点(13日目(13PI)、27日目(13PII)、42日目(14PIII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
時点の分散共分散を非構造化行列でモデル化した。
非構造化行列は、異なる分散を考慮し、時点の各ペアに固有の相関を推定する。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群が含まれていないにもかかわらず、主要評価項目に関連する比較を以下のように計算した。上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、NaCl投与群全員に与えられた力価で除算した。結果として得られた比は、幾何平均比とそれに対応する95%CIとして理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI、PIII/PII、PIII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
各HSV-2 gE及びgI交差反応性IgG抗体応答について、群(NaCl群を除くすべて)を固定効果として含めることによってlog10力価に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は、応答や変動が見られなかったため、含めなかった。gE交差反応性IgG抗体力価について、分散の不均一性が検出されたため、各群に対して異なる分散を仮定した。gI交差反応性IgG抗体力価について、明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均及びその95%CIは、これらのモデルから導かれる。ワクチン接種群対NaCl群の比較のために、幾何平均及び上記モデルから導かれたワクチン接種群の95%CIをすべてのNaClレシピエントに与えられた力価で除算した。結果として得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均として理解されるべきである。ワクチン接種群の直接比較のために、すべての幾何平均比及びその95%CIはモデルから導かれた。
CD4+/CD8+T細胞応答(gE又はgI)の各ワクチン特異的又は交差反応性%については、群(NaCl群を含む全群)を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づくものとした。HSV-1 gE特異的CD8+T細胞の%について、及びHSV-2 gE交差反応性CD8+T細胞の%について、すべてのワクチン群で応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化を行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CIを伴う)はこれらのモデルから導かれた。
pAbによるヒトIgG Fc結合の解離を評価するために、各試料についてED50応答を算出した。各応答(HSV-1又はHSV-2)については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
HSV-1特異的中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
結果
AS01-HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる型は、ワクチン特異的及び交差反応性IgG抗体を誘導することができる
抗HSV-1 gE/gIワクチン特異的及び抗HSV-2 gE又は抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答をELISAによって調べた。
AS01-HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる型は、ワクチン特異的及び交差反応性IgG抗体を誘導することができる
抗HSV-1 gE/gIワクチン特異的及び抗HSV-2 gE又は抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答をELISAによって調べた。
予想通り、NaCl対照群では抗HSV-1特異的gE/gI応答は見られなかった(すべてのマウスについて<30EU/ml)が、すべてのAS01アジュバント化HSV-1 gE/gIワクチン接種マウス(群2~6)は、最後の時点で2,000,000EU/mLを上回る応答をもたらした。3回目の免疫化後14日目でこの研究において、NaCl対照群と比較して、高い抗HSV-1 gE/gIワクチン特異的IgG抗体応答が、試験されたすべてのAS01アジュバント化HSV-1 gE/gIタンパク質(非突然変異及び突然変異型)によって誘導された(すべてのGMR>80,000)(図33及び図34)。
HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において、抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答は、1回目のもの(13日目(13PI))と比較して2回目の免疫化後(27日目(13PII))に増大し、増大倍数は68~145の範囲であった(図35A)。
すべてのHSV-1 gE/gI突然変異体候補について、2回目のもの(27日目(13PII))と比較して3回目の免疫化後14日目(42日目(14PIII))に同様の抗HSV-1 gE/gI特異的抗体応答が見られ、増大倍数は1に近く(1を含有するCIを有する)、3回目の用量の追加免疫効果を示さなかった(図35B)。
まとめると、結果は、3回目の免疫化後14日目にHSV-1 gE/gI突然変異体候補の異なる突然変異型の間(変化の倍数1に近いGMRを有し、ほとんどのCIは全体的に[0.5,2]に含まれる)及びHSV-1 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型と非突然変異のものの間の極めて類似した抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答を示唆している(図36)。
予想通り、NaCl対照群では抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性応答は見られなかった(すべてのマウスについて17EU/mL)。3回目の免疫化後14日目に、NaCl対照群と比較して、AS01アジュバント化HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる非突然変異型及び異なる突然変異型によって免疫したマウスの全ての群において高い抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答が誘導された(gEについて、すべてのGMR>9,000及びgIについて>2,000)(図37、図38)。
3回目の免疫化後14日目に抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性抗体応答の両方で、HSV-1 gE/gI非突然変異及び突然変異体候補の間でいくつかの相違が見られた。実際、非突然変異ワクチンタンパク質(群1)から誘導された抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性応答の両方は、P319R突然変異体(群2)及びN243A_R322D突然変異体(群5)によって誘導されたものよりも高いようであった(2~7の範囲の変化の倍数及び1を含有しないCI)。抗HSV-2 HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI応答の両方とも、A340G_S341G_V342G突然変異体(群6)を用いた場合に、P319R突然変異体(群2)を用いた場合よりも高いようであった(それぞれ、2.9及び2.7のGMR及び1を含有しない又はほとんど含有しないCI)。さらに、R322D突然変異体(群4)によって誘導された抗HSV-2 gE応答は、P319R突然変異体(群2)によって誘導されたものよりも2倍高いようであった(1を含有しないCIを有する)。最後に、P321D(群3)、R322D(群4)及びA340G_S341G_V342G(群6)突然変異体によって誘導された抗HSV-2 gI応答は、N243A_R322D突然変異体(群5)によって誘導されたものよりも高いようであった(2~5の範囲の変化の倍数及び1を含有しないCI)。突然変異体間の他の相違は見られないようであった(GMRの変化の倍数<2及び/又は1を含有するCIを有する)(図39)。
AS01-HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる型は、機能的ワクチン特異的及びHSV-2 gE/gI交差反応性抗体応答を誘導することができる
この研究では、HSV-1特異的及びHSV-2 gE/gI交差反応性抗体機能を、3回目の免疫化後14日目に採取した血清においてのみ調べた。これに関して、ワクチン誘導性pAbの、HSV-1及びHSV-2ウイルスを中和する能力、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fcのin-vitro結合を減少させる能力及びHSV-2又はHSV-1 gE/gI陽性3T3細胞とのインキュベーション後に改変Jurkat細胞で発現されるmFcγRIIIと交差反応し、活性化する能力を調べた。
この研究では、HSV-1特異的及びHSV-2 gE/gI交差反応性抗体機能を、3回目の免疫化後14日目に採取した血清においてのみ調べた。これに関して、ワクチン誘導性pAbの、HSV-1及びHSV-2ウイルスを中和する能力、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fcのin-vitro結合を減少させる能力及びHSV-2又はHSV-1 gE/gI陽性3T3細胞とのインキュベーション後に改変Jurkat細胞で発現されるmFcγRIIIと交差反応し、活性化する能力を調べた。
HSV-1 VR-1789系統に対する一貫した中程度のレベルの中和抗体(nAb)応答が、AS01アジュバント化HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる型で免疫したマウスのすべての群において検出された(図40A)。これらの結果は、マウスの異なる群間でHSV-1中和活性に関して相違がないことを示唆する(GMRの変化の倍数<2及び1を含有するすべてのCI)。しかし、P319R突然変異体と比較して非突然変異群においてより高い応答の傾向が見られた(GMR P319R/非突然変異=0.55及び1をかろうじて上回るCIの上限)(図40B)。対照的に、HSV-2 MS系統に対する抗HSV-2交差反応性nAb応答は、AS01アジュバント化HSV-1 gE/gIタンパク質で免疫した群のいずれにおいても検出されなかった(図41)。
次いで、HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる型で免疫したマウスからの血清の、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合と競合し、減少させる能力を、競合的ELISA法によってin-vitroで評価した。すべてのHSV-1 gE/gIタンパク質(突然変異及び非突然変異)が、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合を減少させることができるワクチン特異的及びHSV-2交差反応性ポリクローナル抗体を誘発した(図42、図44)。
同一血清希釈で、HSV-1 gE/gIタンパク質でのhIgG Fc結合のレベルは、HSV-1 gE/gIで免疫したマウスの異なる群間で非常に類似していた。ED50の算出は、R322D(群4)及びA340G_S341G_V342G(群6)突然変異体のみが、非突然変異群(群1)と比較してより高い応答を誘導し、それぞれ2.2及び2.4の増大倍数(及び1を含有しないCI)を有するようであることを示した。異なる群間で他の相違は見られなかった(GMRの変化の倍数<2及び1を含有しないCI)(図43A、図43B)。
同一血清希釈で、HSV-1 gE/gIで免疫したマウスの群間で2、3の相違が、HSV-2 gE/gIタンパク質でのhIgG Fc結合のレベルで見られるようであった。実際、非突然変異タンパク質(群1)から誘導された応答は、P319R(群2)、P321D(群3)、R322D(群4)及びN243A_R322D(群5)突然変異体によって誘導されたものよりも高いようであった(2~3の範囲の変化の倍数及び1を含有しないCI)。A340G_S341G_V342G突然変異体(群6)を用いた場合のP319R突然変異体(群2)を用いた場合よりも高い応答の傾向も見られるようであった(1.90のGMR及び1をほとんど含有しないCI)。群間の他の相違は見られないようであった(GMRの変化の倍数<2及び1を含有するCIを有する)(図45A及び図45B)。
最後に、3回目の免疫化後14日目に、HSV1-gE/gI特異的又はHSV-2 gE/gI交差反応性抗体の、HSV-1又はHSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた3T3細胞とのインキュベーション後にマウスFcγRIIIにin-vitroで結合し、活性化する能力を調べた。図46、図47及び図74に示されるデータは、異なるHSV-1 gE/gI突然変異体候補で免疫したすべてのマウスが、HSV-1又はHSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後にFcγRIIIを発現するJurkatリポーター細胞に結合し、活性化することができるワクチン特異的又はHSV-2 gE/gI交差反応性抗体を誘導する可能性があることを示唆した。予想通り、ワクチン非接種NaCl対照マウスからの血清を用いた場合にはFcγRIIIの活性化は検出されなかった(図46及び図74)。すべてのこれらのデータは、HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型は、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質に対する機能的ワクチン特異的又はHSV-2 gE/gI交差反応性抗体応答を誘導する可能性があることを示唆している。
AS01-HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる型は、抗HSV-1 gE/gI特異的及び抗HSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答を誘導した
AS01アジュバント化HSV-1 gE/gIタンパク質(非突然変異及び突然変異型)で免疫したマウスのすべての群において、3回目の免疫化後14日目に、NaCl対照群と比較して、より高い抗HSV-1 gE及びgI特異的及び抗HSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答が検出され(図48A)、ワクチン接種及びNaCl群の間で11~63の範囲の増大倍数を有していた(1を含有しないCI)(図49A、図49B及び図49C)。しかし、抗HSV-1 gI特異的CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較してすべてのワクチン接種群において一貫性なく検出されただけであった(5~7の範囲のGMR及び1を含有しないCI)。抗HSV-1 gI特異的CD8+T細胞応答は、生物学的観点から関連がないと考えられた(0.1~0.14%)(図49C及び図50)。抗HSV-1 gE特異的又は抗HSV-2 gE交差反応性CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいても検出されなかった(示されていないデータ)。
AS01アジュバント化HSV-1 gE/gIタンパク質(非突然変異及び突然変異型)で免疫したマウスのすべての群において、3回目の免疫化後14日目に、NaCl対照群と比較して、より高い抗HSV-1 gE及びgI特異的及び抗HSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答が検出され(図48A)、ワクチン接種及びNaCl群の間で11~63の範囲の増大倍数を有していた(1を含有しないCI)(図49A、図49B及び図49C)。しかし、抗HSV-1 gI特異的CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較してすべてのワクチン接種群において一貫性なく検出されただけであった(5~7の範囲のGMR及び1を含有しないCI)。抗HSV-1 gI特異的CD8+T細胞応答は、生物学的観点から関連がないと考えられた(0.1~0.14%)(図49C及び図50)。抗HSV-1 gE特異的又は抗HSV-2 gE交差反応性CD8+T細胞応答は、NaCl対照群と比較してワクチン接種群のいずれにおいても検出されなかった(示されていないデータ)。
全体的に、結果は、HSV-1 gE/gIタンパク質の異なる突然変異型間及び非突然変異HSV-1 gE/gI候補との間の非常に類似したワクチン特異的及び交差反応性CD4+T細胞応答を示唆する。P321D突然変異体(群3)のみが、非突然変異のもの(群1)と比較して、より高いCD4+T細胞応答を誘導したようであり、2に近い増大倍数を有していた(抗HSV-1 gE特異的CD4+T細胞について1.9のGMR、HSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞について2のGMR及び抗HSV-1 gI特異的CD4+T細胞について1.89のGMR及び1を含有しないCI)(図51A及び図52)。さらに、R322D突然変異体(群4)を用いた場合に、非突然変異タンパク質(群1)と比較してより高い抗HSV-1 gE特異的CD4+T細胞応答の傾向も見られた(1.96のGMR及び1を含有しないCI)(図51B)。最後に、P321D突然変異体(群3)を用いた場合にR322D突然変異体(群4)と比較してわずかに高い抗HSV-1 gI特異的CD4+T細胞応答が見られた(ほぼ2の増大倍数及び1を含有しないCI)(図52)。突然変異体間で他の相違は見られなかった(GMRの変化の倍数<2及び/又は1を含有するCIを有する)。
[実施例4]
CB6F1マウスにおけるいくつかのLNP製剤化SAM HSV-1 gE/gI突然変異体の免疫評価
目的
この研究の目的は、ヒト免疫グロブリンG Fcドメインに対する結合力を低下させる、gE Fc結合ドメイン中に突然変異(複数可)を含有する異なるLNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gI構築物から免疫原性データを作成することであった。
CB6F1マウスにおけるいくつかのLNP製剤化SAM HSV-1 gE/gI突然変異体の免疫評価
目的
この研究の目的は、ヒト免疫グロブリンG Fcドメインに対する結合力を低下させる、gE Fc結合ドメイン中に突然変異(複数可)を含有する異なるLNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gI構築物から免疫原性データを作成することであった。
2回目の免疫化後21日目に、LNP製剤化SAM HSV-1 gE/gI構築物の異なる突然変異体によって誘導されたワクチン特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答及び抗HSV-1 gE/gI特異的CD4+T細胞応答をNaCl対照群と比較した。さらに、2回目の免疫化後21日目に、抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答並びに抗HSV-1 gE及び抗HSV-1 gI特異的CD4+T細胞応答に関してすべてのワクチン候補の直接比較を実施した。
最後に、探索的目的は、LNP製剤化SAM HSV-1 gE/gI構築物の異なる突然変異型で免疫したマウスの異なる群において、1回目の免疫化後の抗HSV-1 gE/gI特異的抗体応答、2回目の免疫化後の抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性抗体応答、2回目の免疫化後のワクチン特異的及びHSV-2 gE/gI交差反応性ポリクローナル抗体の機能並びに2回目の免疫化後の抗HSV-1 gE特異的及び抗HSV-1 gI特異的CD8+T細胞応答及び抗HSV-2 gE交差反応性T細胞応答のレベルを評価することであった。
研究デザインの概要
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~5及びn=4/群6)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0日目及び28日目に、1μgの脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化したSAM-HSV-1 gE/gI突然変異体の異なる型でCB6F1マウス(群1~5)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m注射し、陰性対照群(群6)として使用した。
Harlan laboratory(OlaHsd)からの6~8週齢の雌性CB6F1近交系マウスを研究群(n=6 群1~5及びn=4/群6)に無作為に割り当て、所定の病原体不在条件で、組織内の動物施設で飼育した。0日目及び28日目に、1μgの脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化したSAM-HSV-1 gE/gI突然変異体の異なる型でCB6F1マウス(群1~5)を筋肉内(i.m.)に免疫した。さらなる群のマウスに免疫化の同じスケジュールに従って生理食塩水溶液(NaCl 150mM)をi.m注射し、陰性対照群(群6)として使用した。
血清試料を、プライム免疫化後28及び49日目(28PI、21PII)に採取して、抗HSV-1 gE/gI特異的並びに交差反応性抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI IgG抗体応答の両方を測定した。2回目の免疫化後21日目に採取した血清試料においてワクチン特異的及び抗HSV-1 gE/gI交差反応性抗体の機能も調べた。2回目の免疫化後21日目(21PII)に脾臓を採取して、HSV-1 gE、HSV-1 gI及びHSV-2 gE抗原に対する全身性CD4+及びCD8+T細胞応答をex-vivoで評価した。各群の詳細は、表6に記載されている。研究全体のために合計36匹の動物を使用した。
材料及び方法
治験薬
SAM HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型を確立されたプロトコールに従ってin vitro転写(IVT)によって生成した。SAMを用いるLNPの調製は、以下の通りの確立された方法に従った。この方法では、LNP-SAMは、脂質のエタノール性溶液をSAMを含有する水性緩衝剤と迅速に混合することによって調製される。迅速混合は、SAMとイオン対形成していた疎水性成分の過飽和をもたらす。
治験薬
SAM HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型を確立されたプロトコールに従ってin vitro転写(IVT)によって生成した。SAMを用いるLNPの調製は、以下の通りの確立された方法に従った。この方法では、LNP-SAMは、脂質のエタノール性溶液をSAMを含有する水性緩衝剤と迅速に混合することによって調製される。迅速混合は、SAMとイオン対形成していた疎水性成分の過飽和をもたらす。
SAM/脂質複合体は、核形成媒介性沈殿によって凝縮し、沈殿し、小さい狭く分散したナノ粒子をもたらす。この混合ステップ後、脂質ナノ粒子は成熟してRNAを捕捉し、次いで、緩衝剤交換ステップによって最終Tris/スクロース保存緩衝剤に移される。次いで、LNP溶液を、サイズ、脂質含量、RNA捕捉、最終SAM濃度及びin vitro効力について特徴付けした。材料を5%(w/v)スクロースを添加した後、-80℃で6か月間凍結し得る。
免疫学的読み出し情報
ELISAによって測定される総抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体
これは実施例3に記載される通りに実施した。
ELISAによって測定される総抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体
これは実施例3に記載される通りに実施した。
ELISAによって測定される総抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体
これは実施例3に記載される通りに実施した。
これは実施例3に記載される通りに実施した。
ICSアッセイによって測定された抗HSV-1 gE及び抗HSV-1 gI特異的及び抗HSV-2 gE交差反応性CD4+/CD8+T細胞応答
これは実施例3に記載される通りに実施した。
これは実施例3に記載される通りに実施した。
ワクチン特異的抗体の、HSV-1 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を評価するための競合的ELISA法
これは実施例3に記載される通りに実施した。
これは実施例3に記載される通りに実施した。
HSV-1交差反応性抗体の、HSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合を減少させる能力を評価するための競合的ELISA法
これは実施例3に記載される通りに実施した。
これは実施例3に記載される通りに実施した。
HSV-2交差反応性抗体の、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後にmFcγRIIIに結合し、活性化する能力の評価(マウスFcγRIII ADCCバイオアッセイ-Promega)
これは実施例3に記載される通りに実施した。
これは実施例3に記載される通りに実施した。
in-vitro HSV-1中和アッセイ
これは実施例3に記載される通りに実施した。
これは実施例3に記載される通りに実施した。
in-vitro HSV-2 MS中和アッセイ
これは実施例3に記載される通りに実施した。
これは実施例3に記載される通りに実施した。
統計的手法
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
各応答の分布は正規対数型であると仮定した。
抗HSV-1 gE/gI特異的ポリクローナル抗体(pAb)応答について、群(NaCl群を除く全群)、時点(28日目(28PI)、49日目(21PII))、及びそれらの相互作用を固定効果として含めることによって、log10力価に対して二元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめる。NaCl群は応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散共分散モデルの選択は、AICC基準と個々のデータプロットの検討に基づいて行った。
時点の分散共分散を複合対称性行列でモデル化した:
複合対称性は、時点間の同一の分散と同一の相関を考慮している。ワクチン群ごとに同一の分散共分散行列がモデル化され、群間で同一の分散を示している。
幾何平均とその95%CIはこのモデルから導かれる。
ANOVAモデルにNaCl群は含まれていなかったが、主要評価項目に関連する比較を以下のように計算した。上記のモデルから得られたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、最後の時点で、NaCl投与群全員に与えられた力価で除算した。結果として得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均比として理解されるべきである。
ワクチン接種群の直接比較(最後の時点)と、各群内の時点比較(PII/PI)については、すべての幾何平均比とその95%CIがモデルから導かれた。
各HSV-2交差反応性IgG抗体応答(gE又はgI)について、群(NaCl群を除くすべて)を固定効果として含めることによってlog10力価に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。NaCl群は、応答や変動が見られなかったため、含めなかった。分散の明確な不均一性は検出されなかったので、異なる群に対して同一の分散を仮定した。幾何平均及びその95%CIは、これらのモデルから導かれている。NaCl群に対するワクチン接種群の比較のために、上記のモデルから導かれたワクチン接種群の幾何平均及び95%CIを、すべてのNaClレシピエントの与えられた力価によって除算した。得られた比は、対応する95%CIを伴う幾何平均比として理解されるべきである。ワクチン接種群の直接比較のために、すべての幾何平均比及びその95%CIは、モデルから導かれた。
CD4+/CD8+T細胞応答(gE又はgI特異的)の各ワクチン特異的又は交差反応性%については、群(NaCl群を含む全群)を固定効果として含めることによって、log10頻度に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。HSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答の%について分散の明確な不均一性は検出されなかったため、異なる群に対して同一の分散を仮定した。他の応答について、異なる群に対して異なる分散をモデル化した。CD4+及びCD8+T細胞応答の両方の%について、NaCl閾値は、NaCl陰性対照群の刺激全体のデータのP95に基づいている。HSV-1 gE特異的又はHSV-2 gE交差反応性CD8+T細胞の%については、すべてのワクチン接種群でほとんどの応答がP95NaCl閾値を下回ったため、モデル化は行わなかった。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CIを伴う)はこれらのモデルから導かれた。
pAb(HSV-1又はHSV-2)によるヒトIgG Fc結合の解離を評価するために、各試料についてED50応答を算出した。各応答(HSV-1又はHSV-2)については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこれらのモデルから導かれた。
HSV-1特異的中和抗体の力価については、群(NaCl群を除く全群)を固定効果として含めることによって、log10値に対して一元配置分散分析(ANOVA)モデルをあてはめた。明確な分散の不均一性は検出されなかったため、異なる群間で同一の分散を仮定した。幾何平均と幾何平均比(対応する95%CI)はこのモデルから導かれた。
結果
異なるLNP/SAM HSV-1 gE/gI突然変異体は、ワクチン特異的並びに抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答を誘導した
ELISAによって抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答のレベルを調べた。NaCl群中の1つの試料(試料6.2)は血清が利用できないために2回目の免疫化後21日目に評価しなかったことに留意されたい。
異なるLNP/SAM HSV-1 gE/gI突然変異体は、ワクチン特異的並びに抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答を誘導した
ELISAによって抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答のレベルを調べた。NaCl群中の1つの試料(試料6.2)は血清が利用できないために2回目の免疫化後21日目に評価しなかったことに留意されたい。
2回目の免疫化後の21日目、全てのLNP/SAM-HSV-1 gE/gIワクチン接種群は、NaCl対照群と比較して強力な抗HSV-1 gE/gI特異的抗体応答を発達させた(600,000EU/mLを超える応答、全GMR>18,000)(図53及び図54)。予想通り、NaCl対照群では抗HSV-1 gE/gI特異的応答は観察されなかった(全てのマウスで<40EU/ml)。LNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gIベクターの様々な突然変異型で免疫されたマウスの全群において、抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答が、1回目の免疫化(28日目(28PI))と比較して、12から16の範囲の増加倍率で2回目の免疫化(49日目(21PII))後に向上した(図55)。
最後に、すべてのワクチン免疫群のマウスの直接比較によって、2回目の免疫化後21日目に、LNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型間での同様の抗HSV-1 gE/gI特異的IgG抗体応答の誘導が示唆される(倍数変化1に近いGMRを有し、ほとんどのCIは全体的に[0.5,2]に含まれ、1を含有する)(図56)。
予想通り、NaCl対照群では抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性応答は見られなかった(すべてのマウスについて<30EU/mL)。2回目の免疫化後21日目に、NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において高い抗HSV-2 gE及び抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答が誘導された(gEについてすべてのGMR>2,000及びgIについて>600)(図57、図58)。全体として、ワクチン免疫群のマウスの直接比較によって、2回目の免疫化後21日目に同様の抗HSV-2 gE又は抗HSV-2 gI交差反応性IgG抗体応答が示唆される(ほとんどのGMRの変化の倍数<2及び/又は1を含有するCIを有する)。A340G_S341G_V342G突然変異体(群5)のみが、R322D突然変異体(群3)と比較してより高いgE応答を誘導したようであり、2.47の増大倍数(1を含有しないCI)を有していた(図59)。
LNP/SAM HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型は、機能的HSV-1 gE/gI特異的及びHSV-2 gE/gI交差反応性抗体応答を誘導することができる
この研究では、HSV-1特異的及びHSV-2交差反応性抗体機能を、2回目の免疫化後21日目に採取した血清においてのみ調べた。これに関して、各群のマウスについて、ポリクローナルAbの、HSV-1又はHSV-2ウイルスを中和する能力、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合をin-vitroで減少させる能力及びHSV-2 gE/gI陽性3T3細胞とのインキュベーション後に改変Jurkat細胞で発現されたmFcγRIIIに結合し、活性化する能力を調べた。
この研究では、HSV-1特異的及びHSV-2交差反応性抗体機能を、2回目の免疫化後21日目に採取した血清においてのみ調べた。これに関して、各群のマウスについて、ポリクローナルAbの、HSV-1又はHSV-2ウイルスを中和する能力、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるヒトIgG Fc結合をin-vitroで減少させる能力及びHSV-2 gE/gI陽性3T3細胞とのインキュベーション後に改変Jurkat細胞で発現されたmFcγRIIIに結合し、活性化する能力を調べた。
NaCl群中の1つの試料(試料6.2)は、血清が利用できないためにHSV-1/HSV-2中和アッセイにおいて、及びHSV-1/HSV-2 gE/gIタンパク質でのhIgG競合的ELISA法において評価されなかったことに留意されたい。さらに、LNP/SAM-HSV-1 gE_P321D/gI群中の1つのさらなる試料(試料2.3)も、同じ理由のためにHSV-2中和アッセイ及びHSV-1/HSV-2 gE/gIタンパク質でのhIgG競合的ELISA法において評価されなかった。
LNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において、HSV-1 VR-1789系統に対して向けられた低いが一貫したワクチン特異的中和抗体(nAb)応答が検出された(図60A)。群比較後に異なる候補によって誘導された応答の強度において相違は検出されなかった(1に近いGMR及び1を含有するすべてのCI)(図60B)。しかし、いずれのワクチン接種群のマウスにおいてもHSV-2 MS系統に対して向けられる交差反応性nAb応答は検出されなかった(図61)。
次いで、様々なLNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gI突然変異体で免疫されたマウスからの血清が、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合と、in vitroで、競合しこれを減少させる能力について、競合ELISAによって評価した。全てのLNP/SAM HSV-1 gE/gI突然変異体が、HSV-1又はHSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合を減少させることができるワクチン特異的ポリクローナル抗体応答を誘発した。
異なるLNP/SAM HSV-1 gE/gI突然変異体で免疫したマウスにおいて採取されたポリクローナル血清を用いて、HSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線に明確な相違は見られず(1に近いGMR及び1を含有するすべてのCI)、これは、すべての候補がHSV-1 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合を阻害することができるワクチン特異的機能的抗体を誘導することを示唆する(図62及び図63)。さらに、異なるLNP/SAM HSV-1 gE/gI突然変異体で免疫したマウスにおいて採取したポリクローナル血清を用いて、HSV-2 gE/gIタンパク質によるhIgG Fc結合の解離曲線において有意差は見られなかった(ほとんどのGMRの変化倍数<2及び/又は1を含有するCIを有する)。A340G_S341G_V342G突然変異体(群5)のみが、N243A_R322D突然変異体(群4)と比較してより高い交差反応性HSV-2 hIgG FC結合応答を誘導したようであり、2.18の増大倍数(1を含有しないCI)を有していた。R322D突然変異体(群3)よりもA340G_S341G_V342G突然変異体(群5)を用いた場合、より高い応答の傾向も見られた(1.86のGMR及び1をほとんど含有しないCI)(図64、図65)。
最後に、2回目の免疫化の21日後に、ワクチン特異的pAbの、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた3T3細胞とのインキュベーション後にマウスFcγRIIIにin-vitroで結合し、活性化する能力を調べた。図66に示されたデータは、異なるLNP-SAM-HSV-1 gE/gI突然変異体候補で免疫したすべてのマウスが、HSV-2 gE/gIがトランスフェクトされた細胞とのインキュベーション後にFcγRIIIを発現するJurkatリポーター細胞に特異的に結合し、活性化することができるHSV-2交差反応性抗体を誘導する可能性があることを示唆した。予想通り、ワクチン非接種NaCl対照マウスからの血清を用いた場合FcγRIIIの活性化は検出されなかった(図66)。
まとめると、これらの結果は、LNP-SAM HSV-1 gE/gIのすべての突然変異型が、マウスにおいて2回目の免疫化後21日目に機能的ワクチン特異的及び交差反応性ポリクローナル抗体応答を誘導し得ることを示唆している。
LNP/SAM HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型は、ワクチン特異的及び交差反応性T細胞応答を誘導した
NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において2回目の免疫化の21日後に、より高い抗HSV-1 gE及び抗HSV-1 gI特異的並びにHSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答が検出された(図67A)。中程度のレベルの抗HSV-1 gE特異的CD4+T細胞応答のみが見られたことに留意されたい(約0.4%、およそ25のNaClに対するGMRを有する)(図67A、図68A)。NaCl対照群と比較してすべてのワクチン接種群において交差反応性HSV-2 gE CD4+T細胞応答も検出された(5~14の範囲のGMR及び1を含有しないCI)が、この応答は低かった(約0.15%)(図67A、図68B)。NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において高い抗HSV-1 gI特異的CD4+/CD8+T細胞応答が検出された(抗HSV-1 gI CD4+T細胞について約1%及び抗HSV-1 gI CD8+T細胞について3%、およそ100のNaClに対するGMRを有する)(図67A、図67B、図68C、図68D)。しかし、NaCl群と比較して、ワクチン群のいずれにおいても抗HSV-1 gE特異的又は抗HSV-2 gE交差反応性CD8+T細胞応答のいずれかが検出されたという明確なエビデンスはない(ワクチン接種動物のほとんどは、P95NaCl閾値未満の応答を有していた)(図67B)。
NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM-HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において2回目の免疫化の21日後に、より高い抗HSV-1 gE及び抗HSV-1 gI特異的並びにHSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答が検出された(図67A)。中程度のレベルの抗HSV-1 gE特異的CD4+T細胞応答のみが見られたことに留意されたい(約0.4%、およそ25のNaClに対するGMRを有する)(図67A、図68A)。NaCl対照群と比較してすべてのワクチン接種群において交差反応性HSV-2 gE CD4+T細胞応答も検出された(5~14の範囲のGMR及び1を含有しないCI)が、この応答は低かった(約0.15%)(図67A、図68B)。NaCl対照群と比較して、LNP製剤化SAM HSV-1 gE/gIベクターの異なる突然変異型で免疫したマウスのすべての群において高い抗HSV-1 gI特異的CD4+/CD8+T細胞応答が検出された(抗HSV-1 gI CD4+T細胞について約1%及び抗HSV-1 gI CD8+T細胞について3%、およそ100のNaClに対するGMRを有する)(図67A、図67B、図68C、図68D)。しかし、NaCl群と比較して、ワクチン群のいずれにおいても抗HSV-1 gE特異的又は抗HSV-2 gE交差反応性CD8+T細胞応答のいずれかが検出されたという明確なエビデンスはない(ワクチン接種動物のほとんどは、P95NaCl閾値未満の応答を有していた)(図67B)。
異なるLNP/SAM HSV-1 gE/gI突然変異体の直接比較は、同様のワクチン特異的及び抗HSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答並びに抗HSV-1 gI特異的CD4+/CD8+T細胞応答を示唆した。N243A_R322D突然変異体(群4)のみが、他の突然変異体と比較してより高い抗HSV-2 gE交差反応性CD4+T細胞応答を誘導したようであった(図69B)。しかし、この相違は、この群4中の1個体の極めて高い応答者によって主に引き起こされたようであった(0.82%)。異なる突然変異体間でワクチン特異的CD4+及びCD8+T細胞応答の強度に相違は見られなかった(GMRの変化の倍数<2並びに全体的に[0.5,2]に含まれ、及び/又は1を含有するほとんどのCI)(図69A、図70A、図70B)。
Claims (20)
- 対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のためのHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSVに感染した対象の治療において使用するために、又は対象におけるHSV感染の防止のために対象に投与され、場合により、Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV1及び/若しくはHSV2に感染した対象の治療において使用するために、又は対象におけるHSV1及び/若しくはHSV2感染の防止のために対象に投与される、請求項1又は2に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 交差反応性免疫応答は、機能的交差反応性免疫応答を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 機能的交差反応性免疫応答は、交差血清型細胞傷害性抗体応答、交差反応性T細胞応答及び/又はHSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体の生成を含み、場合により、HSVの免疫回避活性を阻害することができる抗体が、HSV Fc受容体へのヒトIgGの結合を阻害する、請求項4に記載のHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV2 gE2外部ドメインに由来する、請求項1又は3~5のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV1 gE1外部ドメインに由来する、請求項2~5のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部である、請求項1~7のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gE2外部ドメイン又はそれに対して少なくとも90%同一であるバリアントである、請求項1、3~6又は8のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、i)Fc受容体は、HSV2 gE2若しくはその免疫原性断片であり、結合パートナーは、HSV2 gI2若しくはその断片であり、及び/又はii)前記結合パートナー若しくはその断片は、HSV2 gI2外部ドメインである、請求項6に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV又はその断片由来の結合パートナーとのヘテロ二量体の一部であり、好ましくは、i)Fc受容体は、HSV1 gE1若しくはその免疫原性断片であり、結合パートナーは、HSV1 gI1若しくはその断片であり、及び/又はii)前記結合パートナー若しくはその断片は、HSV1 gI1外部ドメインである、請求項7に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- 前記結合パートナー又はその断片は、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するHSV2 gI2外部ドメイン、又はそれと少なくとも90%同一であるそのバリアントである、請求項10に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- i)前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、アジュバント、好ましくはTLR4アゴニスト及び免疫学的に活性なサポニンを含むアジュバント、より好ましくはリポソーム製剤中に3D-MPL及びQS21を含むアジュバントと一緒に対象に投与される、並びに/或いは
ii)前記使用は免疫優性ウイルス抗原の対象への投与を含まず、特にFc受容体がHSV2 gE2又はHSV1 gE1である場合、Fc受容体又はその免疫原性断片は、HSV2 gD2若しくはHSV1 gD1(それぞれ)又は免疫優性領域を含むその断片と一緒に対象に投与されない、並びに/或いは
iii)前記Fc受容体は、HSV2 gC2若しくはその免疫優性断片又はHSV1 gC1若しくはその免疫原性断片と一緒に対象に投与される、請求項1~12のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。 - Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、組換えFc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントであり、前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントのヒト抗体Fcドメインに結合する能力が対応する天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失している、請求項1から8又は10から13のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。
- (i)Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、組換えFc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントであり、
(ii)前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントのヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、対応する天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失しており、
(iii)前記組換えFc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV2 gE2又はその免疫原性断片であり、
(iv)前記HSV2 gE2又はその免疫原性断片は、289_インサートADIGL、338_インサートARAA、H245K、P317R;P319R;P319G;P319K;H245A_P319R;H245A_P319G;H245A_P319K;H245A_P319T;P319D;S338D;R320D;N241A_R320D;A248K_V340M;P318Y;A248K_V340R;A248T_V340W;A248K_V340W;A246W_R320G;A246W_P317K;A246W_R320D;A246W_R320T;V340W;A248G_V340W;H245G_R320D;P318D;A246W_P317F;P319G_V340W;A248T_V340M;P317K_V340W;V340F;V340D;H245A_R320D;P317F_V340W;A246W_P317S;H245S_R320D;R314G_P318D;A248T;P318S;P317K;P317S_V340W;H245D;R314P_V340W;R314L_318D;P319L_V340W;P317F;P318D_S338G;R314G_V340W;P317K_S338H;R314L_V340W;P318R;P318Q;P317F_S338G;R314G_P318I;H245G_P319G;P317L;P318I;A248T_F322A;H245E;P318T;P318R_S338G;P318D_S338H;P317F_S338H;A248T_V340R;A248T_F322I;H245A_R320G;P318R_S338H;H245S_R320G;P317K_S338G;A248T_F322P;V340R;R314L_P318R;H245S_R320T;R314G_P318R;R320E;H245G_R320G;H245A_R320T;A246W;P318I_S338G;P317K_V340M;P317I;R320H;R314P_P318I;P318I_S338H;P317F_V340M;H245A_P319G;H245A_P319L;R320P;H245G_R320T;R314L_V340R;P319G_V340R;R314G_F322I;R314L_P318I;R320A;R314N;P317F_V340R;P318D_S338L;A248G_V340R;R314E;R314P_P318D;H245S_P319G;V340Q;A248K_F322I;R320G;H245S_P319L;R314F;P319L;P317K_S338L;P319L_V340M;P317G;R320S;R320Q;R314P_V340R;V340A;H245G_P319L;R320T;R314P_P318R;A248G_F322I;R320N;P317N;R314D;R314Y;R314P_F322I;P319G_V340M;P317S_V340R;R314V;P317R_P319D;P317R_R320D;P319D_R320D;Δ319_Δ320;P317G_P318G_Δ319_Δ320;P318E_Δ319_Δ320;P318G_Δ319_Δ320;P318K_Δ319_Δ320;P317R_P318E_Δ319_320;P317R_P318G_Δ319_Δ320及びP317G_P318K_Δ319_Δ320から選択される配列番号1に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む、請求項1、3から6、8から10又は12のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。 - (i)Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、組換えFc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントであり、
(ii)前記Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントのヒト抗体Fcドメインに結合する能力は、対応する天然ウイルスFc受容体と比較して減少又は消失しており、
(iii)前記組換えFc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、HSV1 gE2又はその免疫原性断片であり、
(iv)前記HSV1 gE2又はその免疫原性断片は、H247A、H247K、P319R、P321A、P321R、P321G、P321K、P321T、A339G、P321D、P321S、A340D、N243A及びR322D、H247A/P321A、H247A/P321R、H247A/P321G、H247A/P321K、H247A/P321T、N243A/R322D、N243A/P321D、H247G/P319G、P319G/P321G、A340G/S341G/V342Gから選択される配列番号3に示される配列に関する突然変異又は突然変異の組合せを含む、請求項2から5、7、8、11又は13のいずれか一項に記載の使用のためのHSV1若しくはHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント。 - 対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV2由来の結合パートナー又はその断片及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答の誘導における使用のための、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアント、HSV1由来の結合パートナー又はその断片及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を治療する方法であって、免疫学的に有効量のHSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントを対象に投与することを含み、HSV2 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、対象に投与された場合にHSV1に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる、方法。
- それを必要とする対象においてヘルペスウイルス感染又はヘルペスウイルス関連疾患を治療する方法であって、免疫学的に有効量のHSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントを対象に投与することを含み、HSV1 Fc受容体又はその免疫原性断片若しくはバリアントは、対象に投与された場合にHSV2に対する交差反応性免疫応答を誘導することができる、方法。
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US5955088A (en) * | 1992-02-03 | 1999-09-21 | Cedars-Sinai Medical Center | Pharmaceutical compsition of herpes simplex virus type-1 (HSV-1), glycoproteins |
US5340740A (en) | 1992-05-15 | 1994-08-23 | North Carolina State University | Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process |
GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
AUPM873294A0 (en) | 1994-10-12 | 1994-11-03 | Csl Limited | Saponin preparations and use thereof in iscoms |
FR2726003B1 (fr) | 1994-10-21 | 2002-10-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires |
UA56132C2 (uk) | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
US6113918A (en) | 1997-05-08 | 2000-09-05 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors |
US6303347B1 (en) | 1997-05-08 | 2001-10-16 | Corixa Corporation | Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors |
ES2305086T3 (es) | 2000-05-19 | 2008-11-01 | Corixa Corporation | Tratamiento profilactico y terapeutico de enfermedades alergicas, autoinmunes e infecciosas con compuestos con base de monosacaridos. |
JP4843181B2 (ja) | 2000-08-04 | 2011-12-21 | コリクサ コーポレイション | 免疫エフェクター化合物 |
FR2832423B1 (fr) | 2001-11-22 | 2004-10-08 | Vivalis | Systeme d'expression de proteines exogenes dans un systeme aviaire |
HUP0500539A2 (en) | 2002-02-04 | 2006-09-28 | Corixa Corp | New immunoeffector 2-deoxi-2-amino-3-d glucopyranose derivatives |
WO2003066065A1 (en) | 2002-02-04 | 2003-08-14 | Corixa Corporation | Prophylactic and therapeutic treatment of infectious and other diseases with immunoeffector compounds |
FR2836924B1 (fr) | 2002-03-08 | 2005-01-14 | Vivalis | Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet |
US7288640B2 (en) | 2002-07-08 | 2007-10-30 | Corixa Corporation | Processes for the production of aminoalkyl glucosaminide phosphate and disaccharide immunoeffectors, and intermediates therefor |
US7960522B2 (en) | 2003-01-06 | 2011-06-14 | Corixa Corporation | Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use |
MXPA05007295A (es) | 2003-01-06 | 2005-09-30 | Corixa Corp | Ciertos compuestos de fosfato de aminoalquil glucosaminida y su uso. |
EP1528101A1 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-04 | ProBioGen AG | Immortalized avian cell lines for virus production |
US20080089910A1 (en) * | 2004-06-29 | 2008-04-17 | Visalli Et Al | Attenuated Herpes Simplex Virus Type-2, Vectors Thereof and Immunogenic Compositions Thereof |
TWI457133B (zh) | 2005-12-13 | 2014-10-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | 新穎組合物 |
US20130028925A1 (en) * | 2006-12-28 | 2013-01-31 | Harvey Friedman | Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof |
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